CN110522928B - 一种mri造影剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种MRI造影剂，其包括氧化钆纳米颗粒和介孔碳纳米颗粒，氧化钆纳米颗粒装载于介孔碳纳米颗粒的孔洞中，介孔碳纳米颗粒表面修饰有PEG等生物亲和性物质。本发明还公开了所述MRI造影剂的制备方法及其应用。较之现有技术，本发明MRI造影剂的制备方法简单，具有高弛豫率、较好的亲水性和生物相容性，并具有更长的血液循环时间和优异的肿瘤靶向性能。

Description

一种MRI造影剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医学临床磁共振成像技术，具体的涉及一种磁共振成像造影用并基于限域效应的高弛豫率MRI造影剂及其制备方法。
背景技术
造影剂是医学临床中核磁共振成像时用来缩短成像时间、提高成像对比度和清晰度的一种成像增强对比剂，它能改变体内局部组织中水质子的弛豫速率，提高正常与患病部位的成像对比度，从而显示体内器官的功能状态。在诊断磁共振成像中，接近50％的检测要用到MRI造影剂。造影剂主要分为两类：顺磁剂，即T1类；铁磁性或超顺性造影剂，即T2类。其中临床应用较为广泛的小分子非靶向的Gd基造影剂属于T1类，这类小分子造影剂应用于生物体尚存在一些缺点，如血液循环时间短、弛豫率低、无靶向性，具有一定的毒性，甚至会引起生物体肾细胞的纤维化。因此高弛豫率，低毒，具有组织或肿瘤靶向性成为MRI造影剂发展的焦点。
现有技术中，利用含Gd的纳米颗粒具有较高的弛豫性能，同时提高血液循环时间。最近，有研究人员提出了一种简单的提高弛豫性能的方法，具体通过将造影材料限制于纳米孔洞进而通过限制造影材料的旋转和水分子的扩散，但此种方案对于弛豫性能的提升有限，而且在应用中，上述造影剂仍存在生物相容性差和靶向性能差等缺点。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种MRI造影剂及其制备方法与应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种MRI造影剂，其包括氧化钆纳米颗粒和介孔碳纳米颗粒，所述氧化钆纳米颗粒装载于所述介孔碳纳米颗粒的孔洞中，并且至少在所述介孔碳纳米颗粒表面还修饰有生物亲和性物质。
在一些较为优选的实施方案中，至少在所述介孔碳纳米颗粒表面还修饰有靶向物质。
本发明实施例还提供一种MRI造影剂的制备方法，包括以下步骤：
1)提供氧化钆纳米颗粒和介孔碳纳米颗粒，所述氧化钆纳米颗粒的粒径小于所述介孔碳纳米颗粒所含的至少部分孔洞的孔径；
2)将所述氧化钆纳米颗粒装载于所述介孔碳纳米颗粒的至少部分孔洞中；
3)至少在装载有氧化钆纳米颗粒的介孔碳纳米颗粒的表面修饰生物亲和性物质。
在一些较为优选的实施方案中，所述的制备方法还包括：
4)在步骤3)完成后，至少在装载有氧化钆纳米颗粒的介孔碳纳米颗粒表面修饰靶向物质。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
1)本发明实施例提供的MRI造影剂通过将氧化钆纳米颗粒装载于介孔碳纳米颗粒的孔洞中，通过限域效应限制氧化钆的旋转和水分子的扩散，达到弛豫率5.3倍的提高(约62.01mM-1·s-1)，弛豫性能高；
2)本发明实施例提供的MRI造影剂通过表面修饰PEG，还具有较好的亲水性和生物相容性；
3)本发明实施例提供的MRI造影剂通过表面同时修饰PEG和RGD，还具有更长的血液循环时间和优异的肿瘤靶向性能，且制备方法简单，生物相容性好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一典型实施方案中一种造影剂制备工艺原理图；
图2a是本发明实施例中介孔碳纳米颗粒的透射电镜图；
图2b是本发明实施例中介孔碳纳米颗粒的孔径分布图；
图2c是本发明实施例中氧化钆纳米颗粒的透射电镜图；
图2d是本发明实施例中氧化钆纳米颗粒的HR-TEM图片；
图3是本发明实施例造影剂制备过程中的电势变化图；
图4a是本发明实施例造影剂与Gd2O3弛豫率对比图；
图4b是本发明实施例造影剂与Gd2O3的T1加权成像对比图；
图5是单独Gd2O3纳米颗粒、本发明实施例无靶向造影剂和本发明实施例高弛豫率造影剂在U87MG细胞中的细胞毒性；
图6是PBS、单独Gd2O3纳米颗粒、本发明实施例无靶向造影剂和本发明实施例高弛豫率造影剂与U87MG细胞孵育1h后细胞T1加权成像对比图；
图7是将马根维显、无靶向的本发明实施例造影剂及RGD修饰的本发明实施例造影剂注射入荷瘤小鼠后不同时间点活体成像效果对比图。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明实施例提供的一种MRI造影剂是基于限域效应的，并具有高弛豫率，其包括氧化钆纳米颗粒和介孔碳纳米颗粒，所述氧化钆纳米颗粒装载于所述介孔碳纳米颗粒的孔洞中，并且至少在所述介孔碳纳米颗粒表面还修饰有生物亲和性物质。
其中，通过将作为造影剂主体的氧化钆纳米颗粒装载于介孔碳纳米颗粒孔洞中，可以利用限域效应使得造影剂的弛豫率得到大幅度提高。
在一些实施方案中，所述生物亲和性物质包括PEG(聚乙二醇)，红细胞薄膜和牛血清白蛋白中的任意一种或两种以上的组合，但并不限于以上三种。
其中，通过在介孔碳纳米颗粒表面修饰PEG等生物亲和性物质，可以提高造影剂的生物相容性和稳定性。
在一些较为优选的实施方案中，至少在所述介孔碳纳米颗粒表面还修饰有靶向物质。
在一些实施方案中，所述靶向物质包括RGD。
其中，通过在介孔碳纳米颗粒表面修饰RGD等靶向物质，可以修饰赋予造影剂优越的靶向性能。
在一些实施方案中，所述氧化钆纳米颗粒的粒径为2.3-2.6nm，其具有较高的弛豫率。
在一些实施方案中，所述介孔碳纳米颗粒所含孔洞的孔径为2.8-3.2nm。
在一些实施方案中，所述介孔碳纳米颗粒的粒径为90-100nm。
在一些实施方案中，所述氧化钆纳米颗粒与介孔碳纳米颗粒的质量比为1:3-1:5。
本发明实施例提供的一种MRI造影剂的制备方法包括以下步骤：
1)提供氧化钆纳米颗粒和介孔碳纳米颗粒，所述氧化钆纳米颗粒的粒径小于所述介孔碳纳米颗粒所含的至少部分孔洞的孔径；
2)将所述氧化钆纳米颗粒装载于所述介孔碳纳米颗粒的至少部分孔洞中；
3)至少在装载有氧化钆纳米颗粒的介孔碳纳米颗粒的表面修饰生物亲和性物质。
在一些实施方案中，所述氧化钆纳米颗粒的粒径为2.3-2.6nm。
在一些实施方案中，所述介孔碳纳米颗粒所含孔洞的孔径为2.8-3.2nm，孔体积为1.41-1.52cm3g-1。
在一些实施方案中，所述介孔碳纳米颗粒的粒径为90-100nm。
在一些实施方案中，所述氧化钆纳米颗粒与介孔碳纳米颗粒的质量比为1:3-1:5。
在一些实施方案中，所述氧化钆纳米颗粒选自采用通过多元醇法合成的氧化钆纳米颗粒。
例如，在一些较为具体的实施方案中，可以首先在110℃将氯化钆和二乙二醇搅拌过夜，然后加入NaOH并升高温度到140℃持续1h，最后将温度稳定在180℃、4h，从而得到超小的氧化钆纳米颗粒。
在一些实施方案中，步骤1)包括：对介孔碳纳米颗粒进行氧化处理，从而至少在所述介孔碳纳米颗粒表面形成羧基。
在一些实施方案中，步骤1)具体包括：采用体积比为2:1-3:1的硫酸和硝酸的混合物对所述介孔碳纳米颗粒进行氧化处理。
例如，采用体积比为3:1的硫酸和硝酸的混合物对所述介孔碳纳米颗粒进行氧化处理。
在一些实施方案中，步骤2)包括：对包含有氧化钆纳米颗粒和介孔碳纳米颗粒的液相分散体系进行超声处理，使所述氧化钆纳米颗粒被装载于所述介孔碳纳米颗粒的孔洞中。
在一些更为具体的实施方案中，步骤2)可以包括：对氧化钆纳米颗粒的分散液与介孔碳纳米颗粒的分散液混合，形成液相分散体系，之后进行超声处理一定时间，使所述氧化钆纳米颗粒被装载于所述介孔碳纳米颗粒的孔洞中，之后通过高速离心进行清洗若干次(例如3次)。
优选的，步骤2)中，所述超声处理的功率为30-60KW，时间为2-4h。
在一些实施方案中，步骤3)具体包括：利用EDC对装载有氧化钆纳米颗粒的介孔碳纳米颗粒表面的羧基进行活化，然后与过量的NH2-PEG-COOH等反应，从而至少在装载有氧化钆纳米颗粒的介孔碳纳米颗粒表面修饰PEG。进一步地，通过类似的反应，也可以将红细胞薄膜和牛血清白蛋白等生物亲和性物质修饰至介孔碳纳米颗粒表面。
例如，在一些具体实施方案中，可以在pH值为5～7的条件下，使用EDC活化介孔碳纳纳米颗粒0.5h，然后加入NH2-PEG-COOH进行反应24h，通过离心清洗掉未反应的物质。
在一些实施方案中，所述的制备方法还包括：
4)在步骤3)完成后，至少在装载有氧化钆纳米颗粒的介孔碳纳米颗粒表面修饰靶向物质。
在一些实施方案中，所述的制备方法还包括：
4)通过EDC对经步骤3)处理后的装载有氧化钆纳米颗粒的介孔碳纳米颗粒表面的羧基进行活化，然后与带有活性氨基的靶向物质反应，从而至少在装载有氧化钆纳米颗粒的介孔碳纳米颗粒表面修饰靶向物质。
在一些实施方案中，所述靶向物质可以采用带氨基的RGD。
例如，在一些较为具体的实施方案中，可以使用EDC活化表面PEG的羧基，然后加入带氨基的RGD反应过夜。离心清洗后冷冻干燥后保存备用。
显然的，前述步骤3)、4)的修饰反应过程优选在液相环境中进行，例如缓冲液中进行，而相应的反应条件等是本领域技术人员已知的。
请参阅图1所示是本发明一较为典型的实施方案中一种MRI造影剂的制备工艺原理图，其包括：先合成氧化钆纳米颗粒和介孔碳纳米颗粒；然后通过超声等方式将氧化钆纳米颗粒装载于表面氧化成羧基的介孔碳纳米颗粒；之后，利用一端带有氨基的PEG对介孔碳纳米颗粒进行修饰，进而提高造影剂的稳定性和生物相容性；最后，将带氨基的RGD多肽修饰在介孔碳纳米颗粒表面，进而赋予造影剂优异的靶向性能。
在一些更为具体的实施方案中，一种制备所述造影剂的方法可以包括如下步骤：
(1)将六水合氯化钆分散在二乙二醇中，加入氢氧化钠，在180℃条件下反应4h得到氧化钆纳米颗粒；
(2)反应得到的氧化钆纳米颗粒与表面氧化成羧基的介孔碳纳米颗粒在超声条件下混合4h，然后离心收集；
(3)通过加入EDC活化介孔碳表面羧基，然后加入过量的NH2-PEG-COOH反应24h，通过离心清洗掉未反应的物质；
(4)将RGD修饰到装载氧化钆的介孔碳纳米颗粒表面，得到所述的靶向性高弛豫率MRI造影剂。
藉由上述技术方案，使得本发明实施例提供的MRI造影剂不仅具有高的弛豫率，还具有较好的亲水性和生物相容性，以及具有比现有技术更长的血液循环时间和更为优异的肿瘤靶向性能。
相应的，本发明实施例还提供了所述MRI造影剂的用途，例如在核磁共振成像领域的应用。
例如，本发明实施例提供了一种产品，其应用于核磁共振成像方法，所述产品包括所述的MRI造影剂。
例如，本发明实施例提供了一种核磁共振成像系统，包括核磁共振成像装置以及所述的MRI造影剂。
以下通过实施例并结合附图进一步详细说明本发明的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的范围。
该实施例提供的一种基于限域效应的高弛豫率MRI造影剂包括氧化钆纳米颗粒和介孔碳纳米颗粒，氧化钆纳米颗粒装载于所述介孔碳纳米颗粒的孔洞中，介孔碳纳米颗粒表面修饰有PEG。该MRI造影剂的一种制备方法包括如下具体步骤：
(1)氧化钆纳米颗粒制备：首先在110℃将0.03mol氯化钆和20mL二乙二醇搅拌过夜，然后加入5mL 1mol L-1NaOH并升高温度到140℃持续1h，最后将温度稳定在180℃4h，得到超小的氧化钆纳米颗粒(如下简单命名为Gd2O3)，其粒径为2.6nm。
(2)介孔碳纳米颗粒的制备：将0.6g苯酚、2.1mL福尔马林(37wt％)和15mL0.1mol/L的氢氧化钠溶液混合,在70℃搅拌0.5h得到低分子量的树脂，之后加入0.96g三嵌段共聚物Pluronic F127的水溶液15mL，体系在66℃以(340±40)r/min的转速搅拌2h,之后加入50mL水,搅拌16～18h后,17.7mL的上述溶液被转移到水热釜中,并用56mL水稀释,之后在130℃水热24h。得到粒径在90-100nm，孔径在2.8nm的介孔碳纳米颗粒(如下简单命名为OMCN)，然后通过体积比为3:1的H2SO4和HNO3的混合溶液对介孔碳纳米颗粒进行表面氧化形成羧基，所获材料可简单命名为OMCN。
(3)将介孔碳纳米颗粒水溶液(5mL)和氧化钆纳米颗粒水溶液(5mL)进行混合，然后利用功率为30kw超声清洗仪超声4h，进而通过高速离心(14000rpm)清洗三次以上，获得，其可简单命名为Gd2O3@OMCN。
(4)在pH值为5～7的条件下，使用EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)活化经步骤(3)处理后的介孔碳纳纳米颗粒0.5h，然后加入NH2-PEG-COOH进行反应24h，通过离心清洗掉未反应的物质，所获产物可简单命名为Gd2O3@OMCN-PEG。
(5)使用EDC活化修饰于介孔碳纳纳米颗粒表面的PEG的羧基，然后加入带氨基的RGD反应过夜。离心清洗后，冷冻干燥，获得MRI造影剂(可命名为Gd2O3@OMCN-PEG-RGD)，保存备用。
通过透射电镜表征该实施例所获的前述介孔碳纳米颗粒(MCN)和氧化钆纳米颗粒(Gd2O3)的形貌和粒径。如图2a所示，介孔碳纳米颗粒粒径为90-100nm的球形结构，通过BET数据得到材料的孔径分布图(孔径大约2.8nm)。而氧化钆纳米颗粒的粒径大约为2.6nm(图2b)。
通过马尔文激光粒度仪测定该实施例所获各材料(MCN、OMCN、OMCN-PEG、OMCN-PEG-RGD)电势的变化，如图3所示。结果显示每步表面修饰过程都伴随着材料表面电势的变化，充分表明PEG和RGD成功修饰在材料表面。
在1.5T的MRI测试仪上测试该实施例所获造影剂与Gd-DTPA弛豫时间T1及T1加权成像，包括：
分别配制浓度为0.00625、0.0125、0.025、0.05、0.1mM的上述两种物质的溶液，测试后，以浓度为横坐标，弛豫时间的倒数为纵坐标进行线性拟合得到该实施例造影剂和Gd2O3的弛豫率分别为62.01mM-1·s-1和12.74mM-1·s-1(图4a)。可见，该实施例的造影剂弛豫率明显高于Gd2O3。通过两者在不同浓度下的T1加权成像(图4b)可以看出，随浓度的增加，两者均有变亮的趋势，但该实施例造影剂的造影效果明显亮于Gd2O3。
用WST法来测定Gd2O3纳米颗粒、无靶向Gd2O3@OMCN-PEG和靶向造影剂Gd2O3@OMCN-PEG-RGD在U87MG细胞中的细胞毒性(图5)。在96孔板中以每孔8000细胞的密度种入U87MG细胞悬液100μL，将96孔板置于CO2培养箱中，在37℃中培养24h。将造影剂溶于完全培养基中，过滤除菌，用完全培养基将聚合物溶液稀释成0.01～0.2mM不同的浓度。然后再将不同浓度的聚合物溶液加入到96孔板中，每孔加100μL，对照组加入100μL完全培养基，继续培养24h。最后移出培养基，每孔加入100μL新鲜培养基，然后每孔加入10μL WST，置于培养箱中培养2h，用酶标仪测定450nm处的吸收值OD450nm。每个聚合物浓度及对照组做4个平行样。根据吸光值计算细胞的相对存活率。空白组即不加细胞及聚合物溶液，对照组即不加聚合物溶液。
细胞相对存活率(％)＝100×(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)
如图5所示，U87MG细胞与该实施例造影剂孵育后的存活率有浓度依赖性，至0.2mM时仍在95％以上，表明该实施例造影剂分子的生物毒性很低。另外，单独氧化钆纳米颗粒在浓度为0.2mM时，存活率大约80％。本结果证明该实施例造影剂可以有效包覆氧化钆纳米颗粒，提高弛豫性能，增加其生物相容性。
细胞水平的T1加权成像测试：将U87MG细胞培养在4个培养皿中，分别标记为ABCD皿，当细胞的汇合度达到60～70％时。A皿更换新鲜培养基作为空白对照，B皿用Gd2O3纳米颗粒孵育、C皿用无靶向Gd2O3@OMCN-PEG孵育、D皿靶向造影剂Gd2O3@OMCN-PEG-RGD孵育。可以看出靶向造影剂图像的亮度要明显高于无靶向材料、单独氧化钆纳米颗粒以及对照样(图6)。以上实验表明该实施例造影剂成像效果要明显优于单独氧化钆纳米颗粒，且还具有主动靶向效果。
测试该实施例造影剂在活体中的成像效果：将荷瘤小鼠分为三组，分别注射等量的马根维显(Magnevist)、无靶向的造影剂及RGD修饰的造影剂。在不同时间点用1.5T的MRI成像仪进行活体测试(图7)，实验结果说明注射RGD修饰的造影剂组图像的亮度要明显高于无靶向和马根维显组。说明该实施例造影剂不仅提高了成像对比度，还能很好的靶向肿瘤部位，在肿瘤部位富集，增强造影效果。
应当理解，以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (13)

1.一种MRI造影剂，其特征在于，包括氧化钆纳米颗粒和介孔碳纳米颗粒，所述氧化钆纳米颗粒装载于所述介孔碳纳米颗粒的孔洞中，并且至少在所述介孔碳纳米颗粒表面还修饰有生物亲和性物质和靶向物质；其中，所述介孔碳纳米颗粒的粒径为90-100nm、所含孔洞的孔径为2.8-3.2nm，所述氧化钆纳米颗粒的粒径为2.3-2.6nm，所述氧化钆纳米颗粒与介孔碳纳米颗粒的质量比为1:3-1:5。
2.根据权利要求1所述的MRI造影剂，其特征在于：所述靶向物质包括RGD。
3.根据权利要求1所述的MRI造影剂，其特征在于：所述生物亲和性物质包括PEG，红细胞薄膜和牛血清白蛋白中的任意一种或两种以上的组合。
4.一种MRI造影剂的制备方法，包括以下步骤：
1)提供氧化钆纳米颗粒和介孔碳纳米颗粒，所述介孔碳纳米颗粒的粒径为90-100nm、所含孔洞的孔径为2.8-3.2nm、孔体积为1.41-1.52cm3g-1，所述氧化钆纳米颗粒的粒径为2.3-2.6nm；
2)将所述氧化钆纳米颗粒装载于所述介孔碳纳米颗粒的至少部分孔洞中，使氧化钆纳米颗粒与介孔碳纳米颗粒的质量比为1:3-1:5；
3)至少在装载有氧化钆纳米颗粒的介孔碳纳米颗粒的表面修饰生物亲和性物质和靶向物质。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述氧化钆纳米颗粒选自采用通过多元醇法合成的氧化钆纳米颗粒。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)包括：对介孔碳纳米颗粒进行氧化处理，从而至少在所述介孔碳纳米颗粒表面形成羧基。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1)具体包括：采用体积比为2:1-3:1的硫酸和硝酸的混合物对所述介孔碳纳米颗粒进行氧化处理。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)包括：对包含有氧化钆纳米颗粒和介孔碳纳米颗粒的液相分散体系进行超声处理，超声处理的功率为30-60KW、时间为2-4h，使所述氧化钆纳米颗粒被装载于所述介孔碳纳米颗粒的孔洞中。
9.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，步骤3)具体包括：利用EDC对装载有氧化钆纳米颗粒的介孔碳纳米颗粒表面的羧基进行活化，然后与过量的NH2-PEG-COOH反应，从而至少在装载有氧化钆纳米颗粒的介孔碳纳米颗粒表面修饰PEG。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于还包括：
4) 在步骤3)完成后，至少在装载有氧化钆纳米颗粒的介孔碳纳米颗粒表面修饰靶向物质。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于还包括：
4)通过EDC对经步骤3)处理后的装载有氧化钆纳米颗粒的介孔碳纳米颗粒表面的羧基进行活化，然后与带有活性氨基的靶向物质反应，从而至少在装载有氧化钆纳米颗粒的介孔碳纳米颗粒表面修饰靶向物质。
12.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述靶向物质为带氨基的RGD。
13.一种产品，其应用于核磁共振成像方法，其特征在于：所述产品包括权利要求1-3中任一项所述的MRI造影剂。
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