CN109701039A - 一种肝癌双重靶向磁性纳米颗粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝癌双重靶向磁性纳米颗粒的制备方法。本发明的制备方法包括超顺磁性纳米颗粒(SPIO)的制备，对超顺磁性纳米颗粒(SPIO)进行PEG修饰，以及利用DSPE‑PEG2000修饰SPIO交联双抗anti‑CD34&anti‑AFP步骤。本发明制备得到的纳米颗粒可靶向甲胎蛋白阳性的肝癌细胞和肝癌新生血管内皮细胞，磁共振MR成像可以活体动态示踪SPIO‑PEG‑BsAb，从分子水平实现评价靶向肝癌诊断的重要作用。本发明实现了肝癌细胞和肝癌血管双重分子成像的目的，将为肝癌及其它恶性肿瘤的分子水平诊断和抗血管生成靶向治疗的动态评价提供了新思路和新途径。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料制造技术领域，特别是涉及一种肝癌双重靶向磁性纳米颗粒的制备方法。
背景技术
肝细胞癌(HCC)是世界上第5大常见恶性肿瘤，为我国第3大常见恶性肿瘤。虽然手术治疗已取得了显著的疗效，但是，由于HCC发现时多为中晚期，手术切除率低，晚期患者即使行肝移植远期预后也欠佳。包括经肝动脉化疗栓塞术(TACE)、射频消融(RadioFrequency Ablation,FRA)在内的多种介入微创治疗方法已被广泛应用于临床，但5年生存率仍较低。
超顺磁性氧化铁(superparamagetic iron oxide，SPIO)类纳米粒子是目前较理想的磁共振示踪剂。研究者在多种器官损伤及疾病动物模型上，采用MR示踪SPIO标记的各种干细胞均取得成功。这一细胞标记示踪技术也已在临床上初步显示了其安全性和有效。Arbab等用MRI成功地活体示踪了标记SPIO的EPC在肿瘤血管形成中的表达。本发明人团队也已完成了间充质干细胞(MSC)、EPC的SPIO标记及活体示踪，采用MR成像观察到了归巢至损伤血管内皮的EPC，采用SPIO标记了内皮抑素基因修饰的EPC，建立了肝癌动物模型进行了相关研究。
基于以上理论和研究背景，并根据前期研究工作基础及发现的科学问题，本发明开发了一种肝癌双重靶向磁性纳米颗粒的制备方法，通过对超顺磁性纳米颗粒四氧化三铁(Fe3O4)表面进行PEG修饰，从而引入anti-AFP和anti-CD34抗体形成复合物SPIO-PEG-BsAb。该纳米颗粒可靶向甲胎蛋白阳性的肝癌细胞和肝癌新生血管内皮细胞，磁共振MR成像可以活体动态示踪SPIO-PEG-BsAb，从分子水平实现评价靶向肝癌诊断和肿瘤新生血管成像的双重作用。将有可能为提高肝癌及其它恶性肿瘤的分子水平诊断效果和抗血管生成靶向治疗的动态评价提供新思路和新途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肝癌双重靶向磁性纳米颗粒的制备方法。本发明具有制备方法简单，可同时靶向肝癌细胞和肿瘤新生血管等优点。
为了达到上述的目的，本发明采取以下技术方案：
一种肝癌双重靶向磁性纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)超顺磁性纳米颗粒(SPIO)的制备：
将乙酰丙酮铁、二苄醚、油酸和油胺混合均匀，然后加热反应，得到油酸修饰的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒；
(2)对超顺磁性纳米颗粒(SPIO)进行PEG修饰：
将DSPE-PEG2000和SPIO以一定质量比混合，加热超声混匀，然后加热反应一段时间，再经后处理步骤，得到黑色透明的PEG修饰的超顺磁性纳米颗粒；
(3)制备肝癌双重靶向磁性纳米颗粒：
将anti-CD34和anti-AFP两种抗体分别加入超滤管中离心，加入硼酸盐缓冲液进行吹打均匀，预处理后混合待用；取步骤(2)得到的PEG修饰的超顺磁性纳米颗粒，调节pH值至5-6，然后加入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)进行活化；最后用预处理后混合的抗体溶液重悬PEG修饰的超顺磁性纳米颗粒，置于摇床反应，反应结束后利用分子筛分离未反应的抗体，得到肝癌双重靶向磁性纳米颗粒。
进一步地，上述制备方法中，步骤(1)的乙酰丙酮铁、二苄醚、油酸和油胺的摩尔比为2：15：6：6～2：30：12：10。
进一步地，上述制备方法中，步骤(1)加热反应为先将混合物加热至180～220℃反应40～80min，然后再升温至280～300℃反应30～60min。相比一步法加热，采用分段加热法更利于纳米铁粒子的分散和粒径的均一性。
进一步地，上述制备方法中，步骤(2)DSPE-PEG2000和SPIO的质量比为2:1。
进一步地，上述制备方法中，步骤(2)具体为将DSPE-PEG2000溶于氯仿，再将分散于正己烷的SPIO与DSPE-PEG2000的氯仿溶液混合，并于60～80℃下超声仪超声混匀5～20分钟，再缓慢加入去离子水，置于旋转蒸发仪下于60～80℃水浴作用15～30min，待反应体系冷却至室温后，经超声处理15～30min使颗粒分散均匀，再将其多次离心，得到上层黑色透明的PEG修饰的超顺磁性纳米颗粒。
进一步地，上述制备方法中，步骤(3)超滤管为30KD超滤管，离心速度为2000-4000rpm。
进一步地，上述制备方法中，步骤(3)中硼酸盐缓冲液的pH值为8～9。
进一步地，上述制备方法中，步骤(3)中anti-CD34、anti-AFP、PEG修饰的超顺磁性纳米颗粒、EDC和NHS的质量比为1:1:3:1:0.5～1:1:6:2:1。
进一步地，上述制备方法中，步骤(3)活化温度为20～30℃，反应时间为20～30min。
进一步地，上述制备方法中，步骤(3)摇床反应时间为1～3小时。
本发明具有以下技术特点：
1)本发明在超顺磁性纳米颗粒四氧化三铁(Fe3O4)表面进行PEG修饰，从而引入anti-AFP和anti-CD34抗体形成复合物SPIO-PEG-BsAb。该纳米颗粒可靶向甲胎蛋白阳性的肝癌细胞和肝癌新生血管内皮细胞，磁共振MR成像可以活体动态示踪SPIO-PEG-BsAb，从分子水平实现评价靶向肝癌诊断的重要作用。
2)本发明实现了肝癌细胞与肿瘤新生血管双重靶向成像及活体动态监测的双重目的，将为肝癌分子影像学诊断和抗血管生成治疗的动态评价提供了新思路和新途径，具有较大的临床应用前景。
附图说明
图1超顺磁纳米Fe3O4颗粒扫描电镜照片。
图2PEG修饰的超顺磁纳米Fe3O4颗粒动态光散射图。
图3PEG修饰的超顺磁纳米Fe3O4颗粒zeta电位图。
图4SPIO-PEG-BsAb的扫描电镜图片。
图5SPIO-PEG-BsAb的动态光散射图。
图6SPIO-PEG-BsAb的zeta电位图。
图7不同浓度的PEG化磁性纳米颗粒交联双抗和PEG化磁性纳米颗粒MR分析(T2值)。
图8不同浓度的PEG化磁性纳米颗粒MR分析(T2值)线性分析图。
图9不同浓度的PEG化磁性纳米颗粒连接抗体后MR分析(T2值)线性分析图。
具体实施方式
以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。
实施例1：肝癌双重靶向磁性纳米颗粒的制备
1.超顺磁性纳米颗粒(SPIO)的制备(高温热解法)：
将2mmol乙酰丙酮铁(Fe(acac)3)加入200mL斜三口烧瓶中，继续向瓶中加入20mL的二苄醚，先后加入油酸(6mmol)和油胺(6mmol)。在氮气氛围保护下，将混合物加热至200℃，并在该温度下反应60min，之后再升温至280℃，在该温度下反应30min。中断加热并冷却至室温后，加入乙醇40ml磁分离洗涤，重复多次以去除体系中残留的二苄醚、油酸和油胺，最后将制备出油酸修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒，将其保存于正己烷溶液中，其扫描电镜图片参见图1，粒径大小约为10nm，粒径均匀，形态成球形或椭球形。
2.PEG化SPIO的合成
将DSPE-PEG2000(50mg)溶于氯仿(5mL)，再将已制备的分散于正己烷的SPIO与DSPE-PEG2000以1：2的质量比(铁含量：DSPE-PEG2000)混合于50ml圆底烧瓶，并于70℃下超声仪超声混匀10分钟，再缓慢加入去离子水5ml，置于旋转蒸发仪下于70℃水浴作用20min，通过疏水作用，颗粒表面修饰的油酸烷基链上包裹了单层具有较好水溶性的磷脂分子，从而获得水溶性的材料。待反应体系冷却至室温后，经超声处理20min使颗粒分散均匀，再将其多次离心去除多余磷脂胶束，将上层黑色透明的PEG化SIPO的溶液保存于4℃环境中。PEG化SPIO的动态光散射图参见图2，从图2可以看出水动力尺寸为16.57nm，zeta电位检测结果见图3，zeta电位为-21.4mV。
3.利用DSPE-PEG2000修饰SPIO并交联双抗anti-CD34&anti-AFP
通过30KD超滤管将抗体缓冲液替换为pH8.5的0.02M硼酸盐缓冲液。两种抗体各取1mg，分别加入到30KD超滤管中，3500rpm，8min离心3次，每次加入1mL硼酸盐缓冲液吹打均匀，减少抗体损失。最终将两种抗体混合并定容到5mL。取3mg PEG化纳米颗粒(1mg/mL)，用pH计调pH至5-6。然后加入1mg EDC分子，0.5mg NHS分子，于恒温摇床反应25min(25℃，180rpm)。活化结束后采用30KD超滤管去除EDC/NHS，3000rpm，5min离心2次。用预处理好的抗体溶液重悬PEG化纳米颗粒，然后置于摇床反应结合2h。反应结束后，利用分子筛分离未反应的抗体，制备得到肝癌双重靶向磁性纳米颗粒SPIO-PEG-BsAb。本实施例制备得到的SPIO-PEG-BsAb的扫描电镜图片参见图4，动态光散射图参见图5，从图5可以看出水动力尺寸为25.6nm，说明纳米颗粒表面成功连接了抗体，从而使水动力尺寸变大，增大的尺寸与IgG抗体的水动力尺寸相近，从PDI(单分散系数)数据可知颗粒分散性良好，可排除由于纳米颗粒聚集导致尺寸变大的可能性。SPIO-PEG-BsAb的zeta电位图参见图6，zeta电位为-40.7mV。
实施例2：不同浓度的PEG化磁性纳米颗粒交联双抗和PEG化磁性纳米颗粒MR分析，制备方法同实施例1。
Fe的浓度分别采用0.00625、0.0125、0.025、0.05、0.1mM。结果如图7所示。从图7可以看出随着SPIO-PEG和SPIO-PEG-BsAb的浓度升高，二者的T2信号均明显降低，说明SPIO-PEG连接双抗后并未降低MR显像敏感度。
不同浓度的PEG化磁性纳米颗粒MR分析(T2值)线性分析图如图8，从图8可以看出随着浓度升高，T2信号明显降低，呈线性关系。不同浓度的PEG化磁性纳米颗粒连接抗体后MR分析(T2值)线性分析图如图9，随着浓度升高，T2信号明显降低，呈线性关系。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。
Claims (10)
1.一种肝癌双重靶向磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)超顺磁性纳米颗粒(SPIO)的制备：
将乙酰丙酮铁、二苄醚、油酸和油胺混合均匀，然后加热反应，得到油酸修饰的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒；
(2)对超顺磁性纳米颗粒(SPIO)进行PEG修饰：
将DSPE-PEG2000和SPIO以一定质量比混合，加热超声混匀，然后加热反应一段时间，再经后处理步骤，得到黑色透明的PEG修饰的超顺磁性纳米颗粒；
(3)制备肝癌双重靶向磁性纳米颗粒：
将anti-CD34和anti-AFP两种抗体分别加入超滤管中离心，加入硼酸盐缓冲液进行吹打均匀，预处理后混合待用；取步骤(2)得到的PEG修饰的超顺磁性纳米颗粒，调节pH值至5-6，然后加入EDC和NHS进行活化；最后用预处理后混合的抗体溶液重悬PEG修饰的超顺磁性纳米颗粒，置于摇床反应，反应结束后利用分子筛分离未反应的抗体，得到肝癌双重靶向磁性纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的乙酰丙酮铁、二苄醚、油酸和油胺的摩尔比为2：15：6：6～2：30：12：10。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)加热反应为先将混合物加热至180～220℃反应40～80min，然后再升温至260～300℃反应30～60min。相比一步法加热，采用分段加热法更利于纳米铁粒子的分散和粒径的均一性。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)DSPE-PEG2000和SPIO的质量比为2:1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为将DSPE-PEG2000溶于氯仿，再将分散于正己烷的SPIO与DSPE-PEG2000的氯仿溶液混合，并于60～80℃下超声仪超声混匀5～20分钟，再缓慢加入去离子水，置于旋转蒸发仪下于60～80℃水浴作用15～30min，待反应体系冷却至室温后，经超声处理15～30min使颗粒分散均匀，再将其多次离心，得到上层黑色透明的PEG修饰的超顺磁性纳米颗粒。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)超滤管为30KD超滤管，离心速度为2000-4000rpm。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中硼酸盐缓冲液的pH值为8～9。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中anti-CD34、anti-AFP、PEG修饰的超顺磁性纳米颗粒、EDC和NHS的质量比为1:1:3:1:0.5～1:1:6:2:1。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)活化温度为20～30℃，反应时间为20～30min。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)摇床反应时间为1～3小时。
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