CN111944204B - 一种Fe3O4磁性细菌纤维素及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公布了一种Fe3O4磁性细菌纤维素及其制备方法，利用酯化的方法，在双羧基PEG修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子一端接枝细菌纤维素膜，一端接枝RGD。在振动的磁场中，该Fe3O4磁性细菌纤维素对细胞的伸展粘附有明显的促进作用，可以调节细胞的生长。

Description

一种Fe3O4磁性细菌纤维素及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物纳米材料技术领域，尤其是一种天然生物高分子材料制备磁性材料的方法。
背景技术
细菌纤维素(BC)是一种由诸如木醋杆菌（Acetobacter xylinum）产生的三维天然生物纳米材料。具有化学成分纯度高、结晶度高、聚合度高（2000-8000）、良好的生物降解性和生物相容性等显著性能，是理想的生物医用材料。它可以模仿细胞外基质（ECM）更好地连接细胞使其成为生物支架从而用于生物医学和组织工程的研究。
细胞与材料的相互作用是组织工程研究的重要领域之一，细胞必须先进行吸附，然后才能迁移、分化、增值，因此粘附的差异性必将导致增值、分化等一系列的反应发生。细胞与外界作用都是靠细胞膜表面受体实现的，整联蛋白是第一个被确认的细胞外基质（ECM）受体，RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）序列是第一个被证明的整合素蛋白识别的最小结构。通过改变RGD的信号对细胞的吸附、增值、极化等有着重要的意义。
而之前人们利用促进细胞粘附的方法主要有电刺激、酶催化、光刺激等。在这些不同的刺激物中，在体内具有潜在应用价值的光被广泛用于通过光化学反应调节细胞粘附和脱离，例如细胞内分子的光裂解。然而，能够引发光化学反应的光很容易被活组织吸收，从而导致穿透深度有限，对活细胞产生潜在的有害影响。远程磁场控制可以穿透活体细胞，大大减少组织伤害等优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种磁性纤维素材料及其制备方法，所得材料具有纳米粒子分布均匀，可远程调控促进细胞生长粘附的特点。
实现本发明目的技术解决方案为：一种Fe3O4 磁性细菌纤维素及其制备方法，包括如下步骤：
（1）将双羧基PEG修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子和同等质量细菌纤维素膜（BC）置于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，加入1/2纤维素薄膜质量的二环己基碳二亚胺（DCC），1/10纤维素薄膜质量的4-二甲氨基吡啶（DMAP），110℃回流，清洗、冷冻干燥；
（2）将步骤（1）所得样品和2倍纤维素薄膜质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、1/3纤维素薄膜质量的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、RGD置于磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4）中，40-60℃反应2-4h，得到Fe3O4 磁性细菌纤维素（RMBC）。
较佳的，细菌纤维素膜厚度为1-2mm。
较佳的，双羧基PEG修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子通过如下步骤制备：将乙酰丙酮铁加入含有油胺和羧基聚乙二醇（HOOC-PEG2000-COOH）的二苯基醚中，在80-90℃氮气中活化4-5小时，在255-280℃条件下反应回流30-60分钟，洗涤、离心，冷冻干燥。
较佳的，RGD 在磷酸盐缓冲液中的浓度为100μg/ml。
较佳的，磷酸盐缓冲液的pH值为7.4。
本发明与现有技术相比有如下优点：
1）本发明材料来源广，自然界储量丰富，无毒无害，生物相容性好；
2）通过过化学键相结合，稳定不易脱落，通过乙二醇包覆，生物相容性优越；
3）可通过外界磁场的变化带动RGD的纳米级振动，对细胞的伸展粘附有明显的促进作用，可以调节细胞的生长。
附图说明
图1是本发明所述的双羧基PEG修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子的透射电子显微镜图。
图2a是BC、实施例1所述的RMBC的红外图, 图2b是放大图。
图3是实施例1所述的RMBC的扫描电子显微镜（SEM）图。
图4是BC和实施例1的RMBC的热重（TGA）图。
图5是有无振动磁场条件下BC与实施例1所述RMBC的激光共聚焦图。
图6是本发明构思的示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
本发明的构思是：在细菌纤维素膜上接上有PEG链的氧化铁磁性纳米粒子，纳米粒子另一端接上RGD（图6）。通过外界磁场的振动作用，调节RGD的振动，从而可以调节细胞的生长。
现有实验室的发酵培养基的配方(w/v，g/100ml)：葡萄糖2.25，蔗糖2.75，蛋白胨1.00，酵母浸粉0.75，硫酸铵0.10，磷酸二氢钾 0.50，硫酸镁0.07，乳酸钙0.02，冰乙酸0.15，柠檬酸 0.06，羧甲基纤维素钠0.04，调pH=6.0，高温灭菌后接种Acetobacter xylinum NUST 4.2。设定发酵静态培养温度30℃，培养时间24h，得到细菌纤维素膜。将发酵完的细菌纤维素膜浸入0.3%NaOH和0.3%H2O2的水溶液中，在80℃水浴中4h除菌除杂，在水浴的过程中，需要不定时的搅动，后用流水冲至中性。
262.5mg乙酰丙酮铁加入含有1ml油胺和3.0g羧基聚乙二醇（HOOC-PEG2000-COOH）的12.5ml的二苯基醚中，在80℃氮气中活化4小时，在255℃条件下回流30分钟，后用冰乙醚洗涤并离心，冷冻干燥，得到双羧基PEG修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子（简称纳米粒子），其TEM见图1，图1所示纳米粒子平均直径在20-30nm左右。
实施例1
将50mg纳米粒子溶解在10ml DMF中，加入50mg干重BC薄膜、 0.02g DCC/0.005gDMAP在110℃酯化回流6小时，酯化过程中尽量保证无水，可以用分子筛等除水。反应结束后，清洗样品、冷冻干燥。将所得样品和77mg EDC和11.5mg NHS 、RGD 溶解于PBS(pH=7.4)中反应过夜后清洗，其中，RGD 在PBS中的浓度为100μg/ml，RGD的序列为GRGDNP。
将实施例1制备的目标样品用于小鼠内皮细胞（C166）培养，在有外界振动磁场的条件下，磁性纳米粒子的振动会带动RGD的振动，最终影响细胞的粘附作用。
用傅里叶红外光谱（FTIR）、扫描电子显微镜（SEM）和热重（TGA）对磁性纤维素膜进行检测，图2a红外光谱图中1732cm-1处是-C=O的峰，1550cm-1和1640cm-1是酰胺键的峰。图2b是局部放大图，575cm-1处的峰是Fe-O键，说明纳米粒子已成功接枝到纤维素上。图3的SEM图显示纳米粒子均匀地分布在纤维素上，无团聚现象。图4的TGA图中BC在400℃时保持恒重，质量百分数约为10%，RMBC在450℃保持恒重，质量分数约为30%，由此可得出约有20%的纳米粒子负载到BC上。
图5是BC和 RMBC在有无磁场条件下小鼠内皮细胞（C166）的激光共聚焦显微镜图，磁场强度30-40mT，磁场频率为0.1HZ，培养时间24小时。免疫荧光染色为细胞核(DAPI)和细胞骨架（Actin）。图中可以看出有振动磁场对细胞的伸展粘附有明显的促进作用。

Claims (9)

1.一种Fe3O4 磁性细菌纤维素的制备方法，其特征在于，利用酯化的方法，在双羧基PEG修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子一端接枝细菌纤维素膜，一端接枝RGD；
其中，双羧基PEG修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子通过如下步骤制备：将乙酰丙酮铁加入含有油胺和二羧基聚乙二醇的二苯基醚中，在80-90℃氮气中活化4-5小时，在255-280℃条件下反应回流30-60分钟，洗涤、离心，冷冻干燥。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）将双羧基PEG修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子和同等质量细菌纤维素膜置于N,N-二甲基甲酰胺中，加入1/2纤维素薄膜质量的二环己基碳二亚胺，1/10纤维素薄膜质量的4-二甲氨基吡啶，110℃回流，清洗、冷冻干燥；
（2）将步骤（1）所得样品和2倍纤维素薄膜质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1/3纤维素薄膜质量的N-羟基琥珀酰亚胺、RGD置于磷酸盐缓冲液中，40-60℃反应2-4h。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，细菌纤维素膜厚度为1-2mm。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，RGD 在磷酸盐缓冲液中的浓度为100μg/ml。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液的pH值为7.4。
6.一种Fe3O4 磁性细菌纤维素，在双羧基PEG修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子一端接枝细菌纤维素膜，一端接枝RGD；
其中，双羧基PEG修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子通过如下步骤制备：将乙酰丙酮铁加入含有油胺和二羧基聚乙二醇的二苯基醚中，在80-90℃氮气中活化4-5小时，在255-280℃条件下反应回流30-60分钟，洗涤、离心，冷冻干燥。
7.如权利要求6所述的Fe3O4 磁性细菌纤维素的用途，其特征在于，在振动的磁场中，将该Fe3O4 磁性细菌纤维素用于控制细胞的生长与粘附。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，细胞是小鼠血管内皮细胞。
9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，磁场的振动频率为0.1Hz。
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