CN107715121A - 一种磁共振成像纳米药物载体、纳米载药系统及其制备方法 - Google Patents

一种磁共振成像纳米药物载体、纳米载药系统及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种磁共振成像纳米药物载体、纳米载药系统及其制备方法。该载体为三嵌段聚合物纳米粒子；所述的三嵌段聚合物为PLGA‑PEI‑PEG，其表面具有活性基团；所述的活性基团包括氨基、羟基和羧基。本发明的药物载体可以同时高效负载核磁成像药物和抗肿瘤药物，使抗肿瘤药物专一到达肿瘤病灶部位，实现了超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的肿瘤区域核磁定位，同时实现了高选择性、低毒性的治疗效果；克服了传统细胞毒药物选择性差、毒副作用较强、易产生耐药性等缺点。本发明的制备方法简单易行，制得的三嵌段聚合物纳米粒子能在水溶液中稳定保存，利于储藏，同时，由于粒子表面存在各种功能基团，有利于对其进行表面修饰或表面功能化。

Description

一种磁共振成像纳米药物载体、纳米载药系统及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及一种磁共振成像纳米药物载体、纳米载药系统及其制备方法。
背景技术
肿瘤严重危害人类健康，阻碍社会及经济的发展。因此，如何有效地预防、诊断及治疗癌症已成为生物医学研究面临的当务之急。2002年J.Funkhouser首先提出并定义诊疗一体化(Theranostic)，诊疗一体化就是集疾病的诊断(Diagnosis)和治疗(Therapy)于一体，提高疾病的综合治疗效果。
诊疗一体化纳米试剂是同时提供肿瘤诊断和治疗的多功能平台。这可以提供大量快速核查疾病和病变组织准确的定位信息，并且能够迅速的对靶向的肿瘤组织传递药物进行治疗。为了达到以上诊疗一体化的概念，大多数的诊疗一体化纳米试剂包含四个基本组件[Mar Drugs,2014,12(12):6038-57]：信号发射器(signal emitter)、药物治疗载荷(therapeutic payload)、载荷的载体(payload carrier)和靶向配体(targetingligand)。
目前，用于肿瘤诊断和治疗的纳米材料有很多，主要包括：无机材料和有机材料。无机材料主要有：金属纳米材料，如纳米金、纳米银等；碳纳米材料，如碳纳米管、石墨烯和碳量子点等；硅和硅基纳米材料；磁纳米材料，如Fe、Mn等。有机材料主要有：合成高分子材料(多聚物、聚酸酐、聚酞胺、合成脂质体等)[Current Molecular Medicine,2010,10(7):640-52]天然高分子材料(核酸、蛋白、氨基酸、生物膜、类病毒等)[Theranostics,2015,5(11):1249-63]。
当前最常用的纳米材料在肿瘤诊疗一体化的应用简介：
①磁性纳米粒子是具有磁趋向性的纳米粒子，通常以磁性纳米材料为核心，通过表面功能化后获得良好的稳定性、磁靶向性和生物相容性等特点，表面功能化为纳米平台后，可在MR成像的指导下进行药物的磁场传输，并且可以通过磁热疗辅助治疗肿瘤，从而对肿瘤进行靶向诊断以及协同治疗。
②介孔二氧化硅粒子具有稳定的介孔结构、尺度可调的粒径及孔径、高比表面积和大孔容、可修饰性强的双功能化表面、生物相容性好等特点，易于同其他功能性纳米材料复合，集肿瘤靶向、多药共载、药物序贯释放、多模式成像、协同治疗等若干诊治手段于一体，实现肿瘤诊疗一体化。
③金/银纳米粒子是以金、银的金属盐为原料通过控制实验条件合成的具有不同性质的纳米尺度的金或银，具有可调的介电、光电特性，表面易功能化，良好的生物相容性。功能化为纳米平台后可实现CT和光声成像，亦可实现光热和光动力治疗，还可装载药物实现肿瘤靶向的递送，从而集多模式成像和协同治疗为一体，终而实现肿瘤诊疗一体化。
④量子点是一种半导体纳米晶粒，具有激发光谱宽且连续分布、发射光谱窄而对称、光稳定性强，且不易发生光漂白等特点。其作为纳米药物载体，可以实时示踪药物在体内的运输、分布和代谢的具体过程，亦可与药物偶联后通过荧光共振能量转移的形式实现对肿瘤部位药物释放的实时监测，并完成影像学介导的可视化治疗，实现肿瘤的诊疗一体化。
⑤碳纳米粒子是分散相尺度至少有一维的碳纳米材料，具有优异的电化学及表面化学特性、灵敏度高、响应时间短等优点，广泛的用于抗肿瘤药物的担载。功能化为纳米平台后可大量装载药物实现靶向运输和序贯释放，并集光声成像和光热/光动力治疗为一体，终而实现肿瘤诊疗一体化。
⑥有机纳米粒子是目前成功肿瘤临床治疗的药物载体，主要分为为脂质体和聚合物两大类，主要具有良好的药物呈递效率好、生物安全性高、循环稳定性强以及制备工艺简单等优点，功能化后可共载化疗药物或基因蛋白药物，并联合纳米影像学探针共同实现肿瘤的诊疗一体化。
目前常用的影像学方法主要有：电子计算机断层扫描(Computed Tomography，CT)、超声成像(Ultrasound,US)、磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)、光学成像(Optical imaging,OI)、光声成像(Photoacoustic Imaging,PAI)、单光子发射计算机断层成像术(Single Photon Emission CT，SPECT)、SPECT/CT、正电子发射计算机断层扫描(Positron Emission Tomography,PET)和PET/CT等方法，具有不同的优点、缺点[ChemicalSociety Reviews,2012,41(7):2656-72]。电子计算机断层扫描，单光子发射计算机断层成像术和正电子发射计算机断层扫描对病人的健康有一定损害，此外光学成像和光声成像的技术还不成熟。而磁共振成像技术对脑组织无放射性损害，也无生物学损害，可以直接做出横断面、矢状面、冠状面和各种斜面的体层图像，不受骨像干扰，对后颅凹底和脑干等处的小病变能满意显示，对颅骨顶部和矢状窦旁、外侧裂结构和广泛转移的肿瘤有很高的诊断价值。但是磁共振成像造影剂代谢快，缺乏靶向性等特点，影响磁共振成像在临床上的应用。因此，联合并交叉多学科的不同优势，通过优化材料构建高效、稳定及安全的纳米体系平台，并利用该平台装载高效的抗肿瘤药物、高灵敏度的肿瘤诊断探针和高亲和力的肿瘤靶向基元，组成集合靶向肿瘤药物运输、释放、治疗以及预后监测等功能于一体的多功能化的纳米体系平台，为肿瘤诊疗一体化的研究奠定坚实基础。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种磁共振成像纳米药物载体。
本发明的另一目的在于提供所述磁共振成像纳米药物载体的应用。
本发明的又一目的在于提供一种磁共振成像纳米载药系统。
本发明的再一目的在于提供所述磁共振成像纳米载药系统的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种磁共振成像纳米药物载体，该载体为三嵌段聚合物纳米粒子。
所述的三嵌段聚合物为PLGA-PEI-PEG，其生物相容性良好，表面具有活性基团；优选为由聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙烯亚胺(PEI)和羧基化聚乙二醇(PEG-COOH)组成。
所述的PLGA-PEI-PEG的尺寸大小为50～300纳米。
所述的活性基团包括氨基、羟基和羧基。
所述的磁共振成像纳米药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的肿瘤包括肝癌、肺癌、恶性黑色瘤、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、胃癌、食管癌、前列腺癌和结肠癌。
一种磁共振成像纳米载药系统，通过包括以下步骤的制备方法制得：
(1)将PLGA、核磁成像药物和抗肿瘤药物加入到丙酮中，得到PLGA丙酮溶液；
(2)将步骤(1)中的得到的PLGA丙酮溶液滴加到吐温水溶液中，搅拌，得到PLGA水溶液；
(3)向步骤(2)中的得到的PLGA水溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，活化PLGA上的羧基，再加入PEI，搅拌，得到PLGA-PEI嵌段；
(4)向步骤(3)中的得到的PLGA-PEI嵌段中加入PEG-COOH和靶向分子，搅拌，得到PLGA-PEI-PEG嵌段聚合物纳米粒子，即形成磁共振成像纳米载药系统。
步骤(1)中所述的核磁成像药物包括超小超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)和钆喷酸葡胺注射液。
步骤(1)中所述的抗肿瘤药物为脂溶性抗肿瘤药物；优选为柔红霉素、阿霉素(DOX)、去甲氧柔红霉素、表阿霉素、紫杉醇、香菇多糖、长春花碱、长春新碱、三苯氧胺、福美司坦、阿那曲唑、氟他胺、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、顺铂、卡铂、奥沙利铂、卡莫司汀、托瑞米芬、替加氟、姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素和塞替派中的至少一种；更优选为阿霉素(DOX)。
步骤(1)中所述的肿瘤为肝癌、肺癌、恶性黑色瘤、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、胃癌、食管癌、前列腺癌或结肠癌。
步骤(1)中所述的PLGA丙酮溶液中PLGA的浓度为1～10mg/mL，核磁成像药物的浓度为1～20mg/mL，抗肿瘤药物的浓度为10～500μM。
步骤(2)中所述的PLGA丙酮溶液与吐温水溶液的体积比为1～5:10；体积比优选为3:10。
步骤(2)中所述的吐温水溶液优选为吐温-80水溶液；更优选为浓度5～50mg/mL的吐温-80水溶液。
步骤(2)中所述的PLGA丙酮溶液的滴加速度为每滴间隔15秒。
步骤(2)中所述的搅拌的条件优选为：200～800r/min搅拌过夜。
步骤(2)中所述的PLGA水溶液中抗肿瘤药物的浓度为10～200μM。
步骤(3)中所述的EDC与所述PLGA的摩尔比优选为1～3：1。
步骤(3)中所述的NHS与所述PLGA的摩尔比优选为1～3：1。
步骤(3)中所述的活化的时间优选为2～12小时。
步骤(3)中所述的PEI的分子量优选为5000～20000。
步骤(3)中所述的PEI的添加量为按每毫升PLGA水溶液配比0.3～0.6mgPEI计算。
步骤(3)中所述的搅拌的时间优选为14小时。
步骤(4)中所述的PEG-COOH的添加量按PEG-COOH与所述PEI的质量比为1：1配比计算。
步骤(4)中所述的靶向分子为环形RGD多肽(cRGD)、叶酸、整合素、转铁蛋白、穿膜肽、MUC-1附膜蛋白、半乳糖胺、新生血管靶向肽和粒细胞巨噬细胞刺激因子中的一种；优选为cRGD。
步骤(4)中所述的靶向分子的添加量按靶向分子与所述PEI的质量比为1～10：1配比计算。
步骤(4)中所述的搅拌的条件优选为：搅拌过夜。
步骤(4)中所述的PLGA-PEI-PEG嵌段聚合物纳米粒子的保存方式为：1～30℃下以溶胶或粉末形态保存。
所述的磁共振成像纳米载药体系的制备方法还包括收集步骤(4)中得到PLGA-PEI-PEG嵌段聚合物纳米粒子的步骤。
所述的收集包括离心和重悬。
所述的离心的条件优选为：8000～20000rpm离心5～30分钟；更优选为：5000rpm离心10分钟。
所述的离心的次数优选为2～5次。
所述的重悬优选为用二次蒸馏水重悬。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明提供一种核磁成像抗肿瘤药物载体及其使用方法，解决肿瘤诊断及在化学治疗过程中局部用药浓度低、全身毒性反应剧烈等问题；克服传统细胞毒药物的选择性差、毒副作用较强、易产生耐药性等缺点。本发明制备方法简单易行，且制备的产物可在水溶液中稳定保存，利于储藏。
2、本发明基于正常细胞和肿瘤细胞之间的差异，使用低毒、生物相容性良好的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)作为抗肿瘤药物载体，并在PLGA末端修饰聚乙烯亚胺(PEI)和羟基化聚乙二醇(PEG-COOH)，并且赋予其靶向肿瘤的能力，同时高效负载核磁成像药物和抗肿瘤药物，使抗肿瘤药物专一到达肿瘤病灶部位，实现了四氧化三铁纳米粒子的肿瘤区域核磁定位，同时实现高选择性、低毒性的治疗效果。
3、本发明的优点在于作为核磁成像抗肿瘤药物载体的三嵌段聚合物纳米粒子在水溶液中稳定性好、方便储存、生物相容性好，同时，粒子表面存在各种功能基团，有利于对其进行表面修饰或表面功能化，如在三嵌段聚合物纳米粒子表面接合靶向分子，使其具有主动靶向能力。
4、本发明中采用了新型材料SPIO，由于SPIO具有超顺磁性，更有利于药物的体内核磁成像。
5、本发明中PLGA-PEI-PEG由于其PEI分子具有高的正电荷，所以具有更好的稳定性，更有利于药物进入肿瘤细胞，并且PEI带有大量氨基，便于纳米粒子的表面修饰。利用该载体(PLGA-PEI-PEG)负载核磁成像药物和抗肿瘤药物，获得的磁共振成像纳米载药体系可实现对肿瘤的同步诊断与治疗。
附图说明
图1是本发明实施例1所得三嵌段聚合物纳米粒子的结构图。
图2是本发明实施例1所得三嵌段聚合物纳米粒子的红外谱图。
图3是本发明实施例1所得三嵌段聚合物纳米粒子的透射电镜图。
图4是本发明实施例1所得三嵌段聚合物纳米粒子的粒径分布图。
图5是本发明实施例1所得三嵌段聚合物纳米粒子的电位分布图。
图6是本发明实施例1所得三嵌段聚合物纳米粒子的药物释放图。
图7是本发明实施例1所得三嵌段聚合物纳米粒子与单独SPIO的1/T2值变化图。
图8是本发明实施例2中三嵌段聚合物纳米粒子抑制人肺癌细胞或人宫颈癌细胞的细胞存活率图。
图9是本发明实施例2中三嵌段聚合物纳米粒子孵育人肺癌细胞的细胞周期分布图。
图10是本发明实施例2中三嵌段聚合物纳米粒子和单独阿霉素在人肺癌细胞的细胞吸收图。
图11是本发明实施例2中三嵌段聚合物纳米粒子和单独阿霉素在人正常肝细胞的细胞吸收图。
图12是本发明实施例2中人肺癌细胞，人黑色素瘤细胞，人宫颈癌细胞和人正常肝细胞对整合素的蛋白表达结果图。
图13本发明实施例2中三嵌段聚合物纳米粒子在经cRGD封闭后作用于人肺癌细胞的细胞吸收图。
图14是本发明实施例2中三嵌段聚合物纳米粒子在经cRGD封闭后作用于人肺癌细胞的细胞存活率图。
图15本发明实施例2中三嵌段聚合物纳米粒子在经不同包吞抑制剂封闭后的人肺癌细胞的细胞吸收图。
图16本发明实施例2中三嵌段聚合物纳米粒子在人肺癌细胞中的荧光细胞定位图。
图17本发明实施例3中三嵌段聚合物纳米粒子在接种人肺癌细胞的荷瘤裸鼠中的体内MRI定位图。
图18本发明实施例3中三嵌段聚合物纳米粒子在接种人肺癌细胞的荷瘤裸鼠中的体内T2变化百分比图。
图19本发明实施例3中三嵌段聚合物纳米粒子在接种人肺癌细胞的荷瘤裸鼠中的各器官的铁含量图。
图20本发明实施例3中三嵌段聚合物纳米粒子在大鼠中阿霉素的血药浓度图。
图21本发明实施例4中三嵌段聚合物纳米粒子治疗接种人肺癌细胞的荷瘤裸鼠的肿瘤照片图。
图22本发明实施例4中三嵌段聚合物纳米粒子治疗接种人肺癌细胞的荷瘤裸鼠的肿瘤体积图。
图23本发明实施例4中三嵌段聚合物纳米粒子治疗接种人肺癌细胞的荷瘤裸鼠的肿瘤重量图。
图24本发明实施例4中三嵌段聚合物纳米粒子治疗接种人肺癌细胞的荷瘤裸鼠的体重图。
图25是本发明实施例4中三嵌段聚合物纳米粒子治疗接种人肺癌细胞的荷瘤裸鼠的T2核磁成像图。
图26是本发明实施例4中三嵌段聚合物纳米粒子治疗接种人肺癌细胞的荷瘤裸鼠的血液指标参数图。
图27是本发明实施例4中三嵌段聚合物纳米粒子治疗接种人肺癌细胞的荷瘤裸鼠的H&E染色图。
图28是本发明实施例4中三嵌段聚合物纳米粒子治疗接种人肺癌细胞的荷瘤裸鼠经H&E染色后CD31阳性染色率统计图。
图29是是本发明实施例4中三嵌段聚合物纳米粒子治疗接种人肺癌细胞的荷瘤裸鼠经H&E染色染色后Ki-67阳性染色率统计图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明提供了一种核磁成像抗肿瘤药物载体，所述核磁成像抗肿瘤药物载体为三嵌段聚合物纳米粒子。优选的，所使用的聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙烯亚胺和羧基化聚乙二醇。所使用的三嵌段聚合物纳米粒子通过一种简单快捷廉价的方式分离得到，具体为：使用含有乳化溶剂蒸发法，用PLGA，阿霉素，SPIO丙酮溶液，滴加入吐温溶液中，搅拌挥发有机溶剂。
本发明所使用的三嵌段聚合物的上述原料是聚合物，为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，聚乙烯亚胺和羧基化聚乙二醇，三者皆具有低毒的优点，且具有良好的生物相容性，是抗肿瘤药物载体的理想来源；将其制成尺寸为50～300纳米的纳米粒子，不仅可以通过静电或氢键等相互作用高效负载各类抗肿瘤药物，具有普遍适用性，而且由于纳米粒子表面具有亲水性基团，可以显著提高癌细胞对载药三嵌段聚合物纳米粒子的摄取量，且利于发挥药物的被动靶向作用，提高局部组织的药物浓度，亲水性基团还有利于对其进行表面修饰或表面功能化，如在三嵌段聚合物纳米粒子表面接合靶向分子，使其具有主动靶向能力。
上述的三嵌段聚合物为PLGA-PEI-PEG，表面具有活性基团；所述的三嵌段聚合物纳米粒子表面的活性基团包括氨基、羧基和羟基，其中氨基、羟基等亲水性基团的存在可以显著提高上述的被动靶向作用，氨基、羧基、羟基等功能基团可以为修饰基团或者功能化基团，表面修饰或表面功能化后负载抗肿瘤药物的三嵌段聚合物纳米粒子可以具备主动靶向能力。
将上述三嵌段聚合物制成本发明核磁成像抗肿瘤药物载体的三嵌段聚合物纳米粒子，制备方法包括如下步骤：
S1、制备PLGA、核磁成像药物、脂溶性抗肿瘤药物的丙酮溶液；其中，所述PLGA的浓度为1～10mg/mL、超小超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)的浓度为1～20mg/mL、阿霉素(DOX)的浓度为10～500μM；所述的核磁成像药物包括超小超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)和钆喷酸葡胺注射液；所述的抗肿瘤药物为柔红霉素、阿霉素、去甲氧柔红霉素、表阿霉素、紫杉醇、香菇多糖、长春花碱、长春新碱、三苯氧胺、福美司坦、阿那曲唑、氟他胺、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、顺铂、卡铂、奥沙利铂、卡莫司汀、托瑞米芬、替加氟、姜黄素、去甲氧基姜黄素、双曲甲氧基姜黄素和塞替派中的至少一种；
S2、将丙酮溶液逐滴加入吐温水溶液中，速度为每滴间隔为1～5秒，磁力搅拌，获得PLGA水溶液；
S3、在PLGA水溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，常温下磁力搅拌，活化PLGA上的羧基；其中，加入的EDC和NHS与PLGA的摩尔比都为1～3:1；
S4、加入PEI溶液，搅拌1小时，合成PLGA-PEI嵌段；
S5、加入PEG和靶向分子，常温下磁力搅拌过夜，合成PLGA-PEI-PEG三嵌段聚合物纳米粒子，其中所述靶向分子为cRGD多肽、叶酸、整合素、转铁蛋白、穿膜肽、MUC-1附膜蛋白、半乳糖胺、新生血管靶向肽、粒细胞巨噬细胞刺激因子中的一种。
上述步骤结束后，三嵌段聚合物纳米粒子即已经制备完成，三嵌段聚合物纳米粒子的收集可以采用离心、重悬的方式获得，优选为5轮离心，离心转数为5000～20000rpm，每轮持续10分钟，离心完成后使用二次蒸馏水重悬得到三嵌段聚合物纳米粒子的胶体混悬液，记为cRGD-PLGA-SPIO@DOX。
所述负载核磁成像抗肿瘤药物的三嵌段聚合物纳米粒子的保存方式是在1～30℃下以溶胶或粉末形态保存。
上述核磁成像药物可以为超顺磁性四氧化三铁纳米粒子(SPIO)，根据其自身脂溶性质，通过疏水作用进入三嵌段聚合物纳米粒子亲脂性的核壳内，实现三嵌段聚合物载体对核磁成像药物的负载。功能上，超顺磁性氧化铁(SPIO)是目前最灵敏的MR造影剂之一，其可显著缩短T2弛豫时间，使得T2加权图像变暗，因此，称为T2阴性对比剂。
上述核抗肿瘤药物可以为阿霉素(DOX)，根据其自身性质，通过亲水作用进入三嵌段聚合物纳米粒子亲水性的壳中，实现三嵌段聚合物载体对抗肿瘤药物的负载。功能上，阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，从而使细胞的组成发生变异，影响细胞分裂，致使细胞死亡。因此，此类抗生素药物可高效抑制肿瘤生长，三嵌段聚合物纳米粒子与此类抗生素药物结合可发挥其良好抗肿瘤活性。
实施例1三嵌段聚合物纳米粒子cRGD-PLGA-SPIO@DOX的制备及表征
(1)常温常压(15～35℃，1标准大气压)下，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、超小超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)(购买于Sigma公司)和阿霉素(DOX)加入到丙酮溶液中，配置聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)质量浓度为5mg/mL，超小超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)质量浓度为1mg/mL，阿霉素(DOX)浓度为10mM的丙酮溶液。
(2)将3mL配置好的丙酮溶液逐滴加入到10mL的吐温-80水溶液(5mg/mL)中，滴入速度为每滴间隔为1～5秒，400转磁力搅拌过夜，得到阿霉素浓度0.3mg/mL为PLGA水溶液。
(3)向PLGA水溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)粉末，常温下磁力搅拌，活化PLGA上的羧基，活化时间为2小时，其中，EDC和NHS与所述PLGA的摩尔比都为1.5:1；再加入5mg聚乙烯亚胺(PEI，分子量为5000～20000)反应，搅拌1小时，生成PLGA-PEI嵌段。
(4)向生成的PLGA-PEI嵌段中加入5mg的PEG-COOH(NM＝5000，购买于Sigma公司)和5mg的cRGD多肽靶向分子(购买于Sigma公司)，常温下搅拌过夜，生成PLGA-PEI-PEG三嵌段聚合物纳米粒子。反应结束后，三嵌段聚合物纳米粒子经过2轮离心(离心速度为5000rpm，每轮持续10分钟)，再用8mL二次蒸馏水重悬，得到藻红蓝蛋白纳米粒子的胶体混悬液，记为cRGD-PLGA-SPIO@DOX。
上述所得cRGD-PLGA-SPIO@DOX具有较好性能，置于4℃冰箱保存。现cRGD-PLGA-SPIO@DOX为例表征其特性，具体为，cRGD-PLGA-SPIO@DOX的组成结构(图1)；用傅里叶变换红外光谱仪表征cRGD-PLGA-SPIO@DOX的化学结构(图2)；用Hitachi H-7650型透射电子显微镜表征PCNPs的形貌图(见图3)，结果可见cRGD-PLGA-SPIO@DOX纳米粒子具有良好的分散性；用Nano-ZS(Malvern Insruments Limited)表征cRGD-PLGA-SPIO@DOX水溶液的粒度变化(图4)及其电动电位(zeta)(图5)，cRGD-PLGA-SPIO@DOX纳米粒子的粒径与电镜结果相符，并且具有高的表面电位，有利于肿瘤细胞的吸收；cRGD-PLGA-SPIO@DOX纳米粒子的药物释放结果(图6)，可见，cRGD-PLGA-SPIO@DOX纳米粒子在pH为5.3的酸性环境下药物释放较快，在3小时释放50％以上；用GE1.25T Sigma HDxt磁共振成像仪表征cRGD-PLGA-SPIO@DOX纳米粒子的1/T2信号(图7)，结果可见cRGD-PLGA-SPIO@DOX的1/T2信号跟铁浓度成剂量依赖性。
实施例2三嵌段聚合物纳米粒子cRGD-PLGA-SPIO@DOX的体外抗人肺癌细胞活性研究
本实施例子使用的是cRGD-PLGA-SPIO@DOX(实施例1制得)。在A549细胞和HeLa细胞(购买于美国模式培养物保藏所，ACTT)分别培养24h后，再分别加入0.0625～2μM的药物(cRGD-PLGA-SPIO@DOX)预处理72h，以阿霉素(DOX)为对照。结果如图8所示，可见，cRGD-PLGA-SPIO@DOX在A549细胞中的IC50为0.19μM，是单独DOX活性的3倍以上。
通过PI染色固定后，再用流式细胞术分析经过DOX，cRGD-PLGA-SPIO@DOX处理的A549的细胞周期。结果如图9所示，可知，1μM浓度cRGD-PLGA-SPIO@DOX处理引起了凋亡峰，即凋亡峰从对照组的2.5％增加至36.2％，高于同等剂量的DOX组。流式细胞周期分析的结果提示cRGD-PLGA-SPIO@DOX可能是通过诱导细胞凋亡的方式抑制A549细胞的增殖。
在A549细胞、HeLa细胞和人正常肝细胞L02细胞分别培养24h后，再分别加入10μM的药物(cRGD-PLGA-SPIO@DOX)预处理不同时间(0、0.5、1、2、4、6h)，以阿霉素(DOX)为对照，通过测定A549细胞和L02细胞内DOX浓度。结果如图10和11所示，从图10可以看出，cRGD-PLGA-SPIO@DOX在A549内的细胞吸收在6小时达到150μg/106细胞，是单独DOX组的三倍；从图11可以看出，在人正常肝细胞L02细胞中，cRGD-PLGA-SPIO@DOX的细胞吸收与单独DOX组无明显差异。
我们又通过Western blotting检测了A549，A375(购买于美国模式培养物保藏所，ACTT)，HeLa和L02细胞的对整合素的受体表达，结果如图12所示，可见，A549细胞对整合素蛋白(integrin)高表达，有利于cRGD对A549细胞的主动靶向。
A549细胞培养24h后，加入0.25，0.5和1mg/mL的cRGD封闭后，再分别加入10μM的药物(cRGD-PLGA-SPIO@DOX)预处理不同时间(0、0.5、1、2、4、6h)，以阿霉素(DOX)为对照，测定A549细胞内DOX浓度和A549细胞吸收情况。A549细胞经cRGD封闭后，cRGD-PLGA-SPIO@DOX在A549细胞中的细胞吸收明显下降(图13)。
A549细胞培养24h后，加入0.25，0.5和1mg/mL的cRGD封闭后，再分别加入0.625、1.25、2.5、5、10μM的药物(cRGD-PLGA-SPIO@DOX)进行预处理2小时，以不添加cRGD为对照，测定A549细胞的存活率。细胞存活率随着cRGD-PLGA-SPIO@DOX浓度上升而降低(图14)，并且与cRGD的浓度呈剂量依赖效应。
A549细胞培养24h后，加入不同的包吞抑制剂孵育(脱氧葡萄糖(DOG，50mM)加叠氮化钠(NaN3，10mM)，蔗糖(Sur，0.45mM)，Dynasore(80μg/mL)和制霉菌素(nystatin，10μg/mL)，再分别加入10μM的药物(cRGD-PLGA-SPIO@DOX)预处理2小时，以阿霉素(DOX)为对照，测定A549细胞内DOX浓度。从图15可见，细胞经包吞抑制剂封闭后，cRGD-PLGA-SPIO@DOX的细胞吸收量下降到对照组的一半。接着通过细胞荧光定位实验(图16)，证明了cRGD-PLGA-SPIO@DOX定位于A549细胞的溶酶体。
实施例3三嵌段聚合物纳米粒子cRGD-PLGA-SPIO@DOX的体内定位及药代动力学实验
制备模型
收集体外培养的人肺癌细胞A549，计数，调整细胞悬液浓度为1×107个/ml，接种0.1ml细胞悬液于裸鼠(BALB/c-nu裸鼠，2～4周龄，体重约18～22mg，北京华阜康生物科技有限公司)右侧腋窝皮下；
分组与给药：
裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至75-100mm3后将动物随机分组，每组3只。同时开始给药，给药组分SPIO(2mg/只)，cRGD-PLGA-SPIO(2mg/只)和cRGD-PLGA-SPIO@DOX组(2mg/只)，利用核磁成像技术动态观察被试动物的核磁信号。
给药后0h(base)、1h、4h和24h的体内药物定位实验图如图17所示，可见cRGD-PLGA-SPIO@DOX明显地影响核磁的T2成像。给药后1h、4h和24h的T2变化百分比如图18所示，从T2值定量可以看出cRGD-PLGA-SPIO@DOX累积与肿瘤组织的量是单独SPIO的2倍以上。给药三天后，通过对裸鼠主要器官内铁浓度进行定量(图19)，在肝脏和脾脏中单独SPIO组的铁浓度明显高于cRGD-PLGA-SPIO和cRGD-PLGA-SPIO@DOX组，而在肿瘤组织中，cRGD-PLGA-SPIO和cRGD-PLGA-SPIO@DOX组的铁浓度是SPIO组的两倍。cRGD-PLGA-SPIO@DOX聚合物体系能有效地提高SPIO在肿瘤区域的累积和停留时间，有利于SPIO的体内核磁成像。
我们又通过药代动力学实验检测了cRGD-PLGA-SPIO@DOX的血药浓度(给药0～50h内，每隔5h记录一次)。结果表明(图20)，单独阿霉素组在经脉注射5小时后，阿霉素的血药浓度迅速下降到300μg/L。而cRGD-PLGA-SPIO@DOX组能维持较高的血药浓度，在50小时，血药浓度高于600μg/L，具有较高的体内循环时间，有利于药物的肿瘤治疗。
实施例4三嵌段聚合物纳米粒子cRGD-PLGA-SPIO@DOX的体内抗人肺癌细胞A549裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用
制备模型
收集体外培养的人肺癌细胞A549，计数，调整细胞悬液浓度为1×107个/ml，接种0.1ml细胞悬液于裸鼠(BALB/c-nu裸鼠，2～4周龄，体重约18～22mg，北京华阜康生物科技有限公司)右侧腋窝皮下；
分组与给药：
裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至75-100mm3后将动物随机分组，每组10只。同时开始给药，给药组分为2mg的DOX组，1mg的cRGD-PLGA-SPIO@DOX组和2mg的cRGD-PLGA-SPIO@DOX组，以生理盐水组作为对照组，使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应，给药24天后小鼠处死，手术剥取瘤块称重。
观测指标
肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b2；其中a、b分别表示长宽。
根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)计算公式为：
RTV＝Vt/V0，其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。
抗肿瘤活性的评价指标：相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：
T/C(％)＝(TRTV/CRTV)×100；其中，TRTV：治疗组RTV；CRTV：模型对照组RTV。
抗肿瘤活性的评价指标：肿瘤生长抑制率(％)，计算公式如下：
肿瘤生长抑制率＝【(给药组平均瘤重-模型对照组平均瘤重)/模型对照组平均瘤重】×100％。
本实验我们研究了三嵌段聚合物纳米粒子cRGD-PLGA-SPIO@DOX治疗人肺癌细胞A549裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用。结果如图8所示，可见21天后对照组肿瘤体积最大，相同浓度下cRGD-PLGA-SPIO@DOX组的肿瘤体积明显小于单独DOX组。通过游标卡尺测量肿瘤体积，从图22可见，高浓度cRGD-PLGA-SPIO@DOX的肿瘤体积最少，并且低浓度cRGD-PLGA-SPIO@DOX组的肿瘤体积也小于高浓度DOX组。图23肿瘤重量也符合上述结果，高浓度和低浓度组cRGD-PLGA-SPIO@DOX均低于高浓度DOX组。并且通过检测裸鼠体重发现(图24)，DOX处理组给药9天内体重与对照组相比开始出现明显下降，到24天体重大约下降到18g，表明DOX对裸鼠的正常生长产生明显的影响。而cRGD-PLGA-SPIO@DOX处理组的裸鼠在接受给药24天体重与对照组无明显差别，表明cRGD-PLGA-SPIO@DOX对裸鼠的正常生长没有产生明显的影响，其毒副作用较小。通过核磁成像技术检测裸鼠肿瘤体积，从图25可见，给药24天后cRGD-PLGA-SPIO@DOX的肿瘤体积最小，远远小于对照组。
本实验我们研究了cRGD-PLGA-SPIO@DOX对裸鼠正常生长的影响。从图26裸鼠血液指标图可见，DOX给药组明显地上调肾功能指标尿素氮(BUN)，肌酐(CREA)，尿酸(UA)，肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，心功能指标肌酸激酶(CK)有可能是DOX的给药造成了裸鼠肾功能，肝功能和心功能的损伤。
通过免疫组织化学法检测结果(图27)，H&E染色可以发现，治疗组出现明显的坏死区，其中cRGD-PLGA-SPIO@DOX 2mg/kg组最为明显。其中cRGD-PLGA-SPIO@DOX 2mg/kg组中(图28)，CD31阳性染色率(平均值为18.8％，P<0.001)明显低于其他各组。Ki-67是一种核蛋白质，由MKI-67基因编码，在细胞增殖的各期，如G1，S，G2和M期中均有表达，但在静止期G0期不表达，因此，Ki-67一般用于细胞增殖活性的标志物。其中图29中，cRGD-PLGA-SPIO@DOX2mg/kg组中Ki-67阳性染色率(平均值为41.9％，P<0.05)显著低于其他各组。Caspase-3(半胱天冬酶-3)，属于半胱氨酸蛋白酶家族，是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶之一，Cleaved-Caspase-3是剪切活化的Caspase-3，可以用作反应细胞凋亡的水平。cRGD-PLGA-SPIO@DOX 2mg/kg组中Cleaved-Caspase-3阳性染色显著高于其他各组。本结果进一步证明了cRGD-PLGA-SPIO@DOX能够有抑制肿瘤细胞的生长，是一种高效低毒的纳米系统。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种磁共振成像纳米药物载体，其特征在于：该载体为三嵌段聚合物纳米粒子；所述的三嵌段聚合物为PLGA-PEI-PEG，其表面具有活性基团。
2.根据权利要求1所述的磁共振成像纳米药物载体，其特征在于：所述的PLGA-PEI-PEG的尺寸大小为50～300纳米；所述的活性基团为氨基、羟基或羧基。
3.根据权利要求1所述的磁共振成像纳米药物载体，其特征在于：所述的三嵌段聚合物由聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙烯亚胺和羧基化聚乙二醇组成。
4.权利要求1所述的磁共振成像纳米药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.一种磁共振成像纳米载药系统，其特征在于，通过包括以下步骤的制备方法制得：
(1)将PLGA、核磁成像药物和抗肿瘤药物加入到丙酮中，得到PLGA丙酮溶液；
(2)将步骤(1)中的得到的PLGA丙酮溶液滴加到吐温水溶液中，搅拌，得到PLGA水溶液；
(3)向步骤(2)中的得到的PLGA水溶液中加入NHS和EDC，活化PLGA上的羧基，再加入PEI，搅拌，得到PLGA-PEI嵌段；
(4)向步骤(3)中的得到的PLGA-PEI嵌段中加入PEG-COOH和靶向分子，搅拌，得到PLGA-PEI-PEG嵌段聚合物纳米粒子。
6.根据权利要求5所述的磁共振成像纳米载药系统，其特征在于：
步骤(1)中所述的核磁成像药物为超小超顺磁性氧化铁纳米粒子或钆喷酸葡胺注射液；
步骤(1)中所述的抗肿瘤药物为脂溶性抗肿瘤药物；
步骤(4)中所述的靶向分子为环形RGD多肽、叶酸、整合素、转铁蛋白、穿膜肽、MUC-1附膜蛋白、半乳糖胺、新生血管靶向肽和粒细胞巨噬细胞刺激因子中的一种。
7.根据权利要求5所述的磁共振成像纳米载药系统，其特征在于：
步骤(1)中所述的抗肿瘤药物为柔红霉素、阿霉素、去甲氧柔红霉素、表阿霉素、紫杉醇、香菇多糖、长春花碱、长春新碱、三苯氧胺、福美司坦、阿那曲唑、氟他胺、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、顺铂、卡铂、奥沙利铂、卡莫司汀、托瑞米芬、替加氟、姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素和塞替派中的至少一种。
8.根据权利要求5所述的磁共振成像纳米载药系统，其特征在于：
步骤(1)中所述的肿瘤为肝癌、肺癌、恶性黑色瘤、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、胃癌、食管癌、前列腺癌或结肠癌。
9.根据权利要求5所述的磁共振成像纳米载药系统，其特征在于：
步骤(1)中所述的PLGA丙酮溶液中PLGA的浓度为1～10mg/mL，核磁成像药物的浓度为1～20mg/mL，抗肿瘤药物的浓度为10～500μM；
步骤(2)中所述的PLGA丙酮溶液与吐温水溶液的体积比为1～5:10；
步骤(2)中所述的吐温水溶液为浓度5～50mg/mL的吐温-80水溶液；
步骤(3)中所述的EDC与所述PLGA的摩尔比为1～3：1；
步骤(3)中所述的NHS与所述PLGA的摩尔比为1～3：1；
步骤(3)中所述的PEI的添加量为按每毫升PLGA水溶液配比0.3～0.6mg PEI计算；
步骤(4)中所述的靶向分子的添加量按靶向分子与所述PEI的质量比为1～10：1配比计算。
10.根据权利要求5所述的磁共振成像纳米载药系统，其特征在于：
步骤(2)中所述的搅拌的条件为：200～800r/min搅拌过夜；
步骤(3)中所述的活化的时间为2～12小时；
步骤(3)中所述的PEI的分子量为5000～20000；
步骤(4)中所述的PLGA-PEI-PEG嵌段聚合物纳米粒子的保存方式为：1～30℃下以溶胶或粉末形态保存。
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