CN110964204B - 一种载电正性胶束/胰岛素复合物的plga微球及其制备方法 - Google Patents

一种载电正性胶束/胰岛素复合物的plga微球及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种载电正性胶束/胰岛素复合物的PLGA微球，其特征在于，其囊材为一种三“臂”状的高分子聚合物3‑s‑PLGA，制备过程中采用电正性3‑s‑PLGA‑b‑(PEI‑PEG)胶束/胰岛素复合物为内水相。电正性3‑s‑PLGA‑b‑(PEI‑PEG)胶束可显著增加胰岛素从3‑s‑PLGA微球持续释放的时间，进一步提高3‑s‑PLGA微球中胰岛素的生物利用度。

Description

一种载电正性胶束/胰岛素复合物的PLGA微球及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种药物制剂，具体涉及一种载电正性3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/胰岛素复合物的PLGA微球及其制备方法。
背景技术
聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)，是一类应用广泛的生物降解性合成高分子。PLGA在医学领域可用作骨修复材料、外科手术缝合线、眼科植入材料与药物缓控释体系的载体等，具有非常高的医学研究价值。
PLGA的生物降解性能高度可调且变化范围大，然而，其降解产物(乙醇酸与丙醇酸)使其微球制品的微环境酸化(pH 1.5～4)，进而导致所载胰岛素等蛋白类药物结构受到破坏而变性失活。
关于如何克服PLGA微球中所载蛋白类药物受酸性微环境的破坏，目前报道的方法不是很多，也不是很成熟，现有的方法主要是依靠阳离子聚合物，其中，高分子量(Mw>25kDa)的聚乙烯亚胺(PEI)具有强质子缓冲能力，很大程度上能保护PLGA微球中蛋白类药物免受酸性微环境的破坏。但众所周知的是：高分子量的PEI具有强细胞毒性，而对一般细胞而言，低分子量的PEI(Mw<2.0kDa)具有细胞毒性小的特点。由低分子量PEI(1800Da)与PEG(2000Da)通过酰胺键相互交联而成的水溶性交联物PEI-PEG被报道具有细胞毒性小的优点。然而直至目前，PEI-PEG与PLGA组成的两亲性嵌段共聚物及其应用方面的研究却未见报道。
发明内容
如何克服PLGA降解酸化的问题，制备更好的蛋白类药物载体是目前面临的迫切问题。本方法设计并合成了一种树枝状的两亲性嵌段共聚物3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)。其中，3-s-PLGA是以胆酸(CA)为引发剂，分别在其3，7，12位羟基上引发开环聚合反应合成的三“臂”PLGA；PEI-PEG是由低分子量PEI(Mw：1800Da)与PEG(Mw：2000Da)通过脱水缩合相互交联而成的水溶性交联共聚物。3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)通过在水中发生自组装而形成电正性胶束(粒径：99.5±2.61nm，Zeta电位：60.7±4.45mV)。在pH 7.4条件下，3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束可与胰岛素等带负电荷的蛋白药物以静电作用形成纳米尺寸的胶束/胰岛素复合物。进一步地，本方法以自制的3-s-PLGA为囊材，采用双乳化溶剂挥发法(W1/O/W2)法分别制备载胰岛素(INS-MS)与载胶束/胰岛素复合物的3-s-PLGA微球(MIC-MS)。
本发明一个方面涉及一种两亲性嵌段共聚物3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)；其中，3-s-PLGA是以胆酸(CA)为引发剂通过开环聚合反应合成的三“臂”PLGA；PEI-PEG是由低分子量PEI与PEG通过脱水缩合相互交联而成的水溶性交联共聚物。
在本发明的技术方案中，两亲性嵌段共聚物3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)中的3-s-PLGA分子量为10000～25000，优选为16085。
在本发明的技术方案中，两亲性嵌段共聚物3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)中的PEI-PEG的分子量为6000～10000，优选为7693。
本发明另一个方面涉及前述两亲性嵌段共聚物3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)的合成方法，其包含如下步骤：
1)合成羧基封端的3-s-PLGA-COOH；
首先以胆酸为引发剂，采用开环聚合法合成3-s-PLGA共聚物，然后通过DMAP催化丁二酸酐与3-s-PLGA反应合成3-s-PLGA-COOH；
2)合成水溶性聚乙二醇-聚乙烯亚胺交联共聚物(PEI-PEG)
将羧基化的PEG的羧基与PEI的氨基进行缩合，通过酰胺键相交联，生成交联聚合物PEI-PEG；
3)合成树枝状两亲性嵌段共聚物3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)
将3-s-PLGA-COOH中的羧基与PEI-PEG的氨基进行缩合，得到3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)。
本发明所述的制备方法，其中步骤1)中采用开环聚合发合成3-s-PLGA共聚物的方法为，D,L-丙交酯和乙交酯在引发剂胆酸和催化剂辛酸亚硒的作用下在100℃-200℃条件下反应，获得3-s-PLGA共聚物。
本发明所述的制备方法，其中步骤1)中通过DMAP催化丁二酸酐与3-s-PLGA反应合成3-s-PLGA-COOH的方法为3-s-PLGA、丁二酸酐和DAMP在碱性条件下室温反应获得。
在本发明所述的制备方法，其中步骤2)中制备羧基化的PEG的羧基的方法为PEG、丁二酸酐、DMAP在碱性条件下室温反应获得。
在本发明所述的制备方法，其中步骤2)中羧基化的PEG的羧基与PEI在缩合剂的作用下进行缩合生成PEI-PEG，并进一步将mPEG接枝到PEI-PEG的末端羧基上。
在本发明所述的制备方法，其中步骤3)的反应条件为在缩合剂的条件性进行反应。
在本发明的技术方案中，所述的缩合剂选自EDC·HCl与HOBt的组合。
本发明另一个方面涉及一种电正性3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束，其特征在于，以上述两亲性嵌段共聚物3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)制备获得。
进一步地，所述电正性3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束的制备方法：将3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束溶解于DMSO中，再加入与DMSO等体积的水，以透析膜进行透析，并以0.22μm微孔滤膜滤过透析袋中的液体，制备电正性3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束。
本发明另一个方面涉及一种载电正性3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/多肽药物复合物的PLGA微球，其特征在于，其囊材为三臂高分子聚合物3-s-PLGA，3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/多肽药物复合物为内水相。
进一步地，所述PLGA微球采用双乳化溶剂挥发法(W1/O/W2)制备，包括如下步骤：
1)称取3-s-PLGA，加入有机溶剂至完全溶解，即为油相(O)；
2)将多肽药物溶液缓慢加入到3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束中，室温静置以获得3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/多肽药物复合物(W2)，然后离心，去上清，加入PBS使3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/多肽药物复合物重新分散，即为内水相(W1)；
3)将内水相(W1)加入到油相(O)中，涡旋震荡，形成油包水初乳(W1/O)，然后，分别加入10mL PVA溶液与500μL生理盐水于上述初乳(W1/O)中，冰水浴条件下，使用高速分散器处理，形成水包油包水(W1/O/W2)复乳，再加入DDW，冰水浴超声处理，干燥去除有机溶剂，离心微球，加入冻干保护剂，冷冻干燥。
本发明再一个方面提供了上述PLGA微球的作为多肽药物载体的用途，优选地，所述多肽药物选自胰岛素。
本发明再一个方面提供了上述PLGA微球在制备治疗糖尿病的药物中的用途，所述多肽药物为胰岛素。
在本发明的技术方案中，所述的英文缩写中文含义如下所示：
缩写及英文 含义
PLGA 聚(乳酸-乙醇酸)
3-s-PLGA 三“臂”聚(乳酸-乙醇酸)
PEI-PEG 聚乙二醇-聚乙烯亚胺交联共聚物
CA 胆酸
PEG 聚乙二醇
PEI 聚乙烯亚胺
mPEG 聚乙二醇单甲醚
DAMP 4-二甲氨基吡啶
INS 胰岛素
MS 微球
INS-MS 载胰岛素3-s-PLGA微球
MIC-MS 载电正性胶束/胰岛素复合物3-s-PLGA微球
<sup>1</sup>H-NMR 氢核磁共振
GPC 凝胶渗透色谱
TEM 透射电子显微镜
SEM 扫描电子显微镜
WR 重量比
IC<sub>50</sub> 半数抑制浓度
DDW 双蒸馏水
DLS 动态光散射
AAC 曲线上面积
附图说明
图1为两亲性嵌段共聚物3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)的合成步骤：
(A)为3-s-PLGA与3-s-PLGA-COOH的合成示意图。
(B)为水溶性嵌段PEI-PEG的合成示意图。
(C)为3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)的合成示意图。
图2为共聚物的核磁共振氢谱图：
(a)为3-s-PLGA的核磁共振氢谱图。
(b)为水溶性嵌段PEI-PEG的核磁共振氢谱图。
(c)为3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)的核磁共振氢谱图。
图3为共聚物的GPC色谱图。
图4为3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)及PEI-PEG对MCF7细胞的细胞毒性图(平均值±标准偏差，n＝6)。
图5为电正性3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/胰岛素复合物的粒径与Zeta电位图。
图6为电正性3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束及其胰岛素复合物的透射电镜。
(a)为空白3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束的透射电镜图。
(b)为3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/胰岛素复合物的透射电镜图(WR＝10)。
(c)为3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/胰岛素复合物的透射电镜图(WR＝5)。
图7为电正性3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束及其胰岛素复合物的质子缓冲能力测试图。
图8为两种3-s-PLGA微球的形貌(SEM图)与粒径分布：
(a)为MIC-MS的形貌与粒径分布。
(b)为INS-MS的形貌与粒径分布。
图9为MIC-MS与INS-MS在pH 7.4条件下的体外释药行为曲线。
图10皮下注射INS-MS与MIC-MS对糖尿病大鼠的降血糖作用(n＝4,*p＜0.05，**p＜0.01)。
具体实施方式
实施例1两亲性嵌段共聚物3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)的合成与表征
实施例1-1 3-s-PLGA(50：50)的合成
称取D,L-丙交酯(4.32g，30mmol)、乙交酯(3.48g，30mmol)，引发剂胆酸(0.10g，0.245mmol)，辛酸亚硒(0.024g，0.1％mol单体的量置于单颈圆底烧瓶中。装置通过真空油泵抽真空5min，然后通氮气，此步骤重复三次。氮气氛围下，将装置置于油浴锅中，150℃，反应10h。反应结束后，冷却至室温，用适量的二氯甲烷将产物溶解，在过量冷甲醇中沉淀，此步骤重复三次以纯化产物。过滤弃甲醇，将粘稠物倒于锡箔纸上，置于真空干燥箱中，40℃真空干燥24h。产物保存于4℃冰箱备用。
实施例1-2合成羧基化聚乙二醇(HOOC-PEG-COOH)
称取PEG(5.00g，2.5mmol)，丁二酸酐(0.75g，7.5mmol)，DMAP(0.40g，3.28mmol)，三乙胺(0.30g，2.9mmol)于一个单颈圆底烧瓶中，加入25mL无水四氢呋喃，抽真空，通氮气，室温搅拌反应24h，反应结束后，旋转蒸法去除反应溶剂，将剩余浓缩液溶解于少量的三氯甲烷中，过滤去除不溶性沉淀，滤液在过量冷乙醚中沉淀，抽滤，纯化，室温真空干燥48h。
实施例1-3水溶性聚乙二醇-聚乙烯亚胺交联共聚物(PEI-PEG)的合成
称取羧基化PEG(1.00g，0.46mmol)，HOBt·H2O(0.24g，1.56mmol)，过量的EDC·HCl(0.30g，1.56mmol)于一个烧杯中，加入二氯甲烷50mL，再加入三乙胺200μL，室温磁力搅拌1h，得羧基化PEG的活性中间体。将上述PEG活性中间体溶液转移至恒压滴液漏斗中，逐滴滴入50mL完全溶解于二氯甲烷的PEI(1.20g，0.67mmol)溶液中(滴加速度：约滴/4秒)，边剧烈搅拌边滴加，约2h滴加完毕，室温继续搅拌12h生成PEI-PEG。为了改善PEI-PEG产物的水溶性并进一步低其细胞毒性，我们将mPEG1.0kDa接枝到PEI-PEG的末端羧基上，操作如下：以上反应在室温反应12h后，接着在反应体系中继续加入mPEG1.0kDa(0.20g，0.20mmol)，EDC·HCl(0.10g，0.52mmol)，反应12h，反应结束后，室温减压旋转蒸发去除有机溶剂，所得浓缩产物加入适量蒸馏水溶解，室温继续减压旋转蒸发去除残留的二氯甲烷，所得淡黄色澄清水溶液通过蒸馏水透析24h(透析袋截留分子量：8～14kDa)，透析结束后，将透析袋中的溶液分装于50mL离心管中，冷冻干燥24h。
实施例1-4合成3-s-PLGA-COOH
称取3-s-PLGA(1.00g，约0.13mmol)，丁二酸酐(0.05g，0.50mmol)，DAMP(0.12g，0.98mmol)于一个单颈圆底烧瓶中，加入15mL无水四氢呋喃完全溶解，再加入50μL三乙胺，氮气氛围下，室温搅拌24h。反应结束后，旋转蒸发去除反应溶剂。将剩余粘稠液溶于二氯甲烷中，在冷甲醇中沉淀，此步骤重复三次以纯化产物。产物置于50℃真空干燥箱中干燥24h。
实施例1-5合成树枝状两亲性嵌段共聚物3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)
称取0.40g 3-s-PLGA-COOH(约含0.053mmol-COOH)，HOBt·H2O(0.03g，0.20mmol)，过量的EDC·HCl(0.04g，0.21mmol)于一个100mL的单颈圆底烧瓶中，加入10mLDMSO搅拌使完全溶解，再加入50μL三乙胺，室温继续搅拌2h，使3-s-PLGA-COOH羧基活化，再使用恒压滴液漏斗将其逐滴加入到剧烈搅拌的PEI-PEG的DMSO溶液中(5mL，80mg/mL)，约2h滴加完毕，室温搅拌24h后，粗产物通过蒸馏水透析48h(透析袋截留分子量：25000Da)。透析结束后，将透析袋中带蓝色乳光的液体分装于50mL离心管中，冷冻干燥24h。
实施例1-6聚合物结构与分子量的测定
聚合物结构分别由的核磁共振氢谱(1H-NMR)进行表征；3s-PLGA与PEI-PEG的分子量由凝胶渗透色谱(GPC)测定，以一系列单分散的聚苯乙烯与聚乙二醇分别作为标准品，以四氢呋喃或Na2SO4水溶液(0.1mol/L)分别作为流动相，流速均为0.5mL/min，检测温度：25℃，色谱柱型号：TSK G3000SWxl，检测器：示差折光检测器。
实施例1-6-1 3-s-PLGA的合成与表征
根据产物的核磁共振氢谱(图2a)可确定3-s-PLGA的结构，通过乳酸和羟基乙酸所属氢的积分比计算得二者的摩尔比(LA/GA)为50：49.3，这与理论值50：50十分接近。1H-NMR(CCl3D)：a(δ＝1.56ppm，LA：-CHCH3)，b(δ＝5.20ppm，LA：-CHCH3)，c(δ＝4.81ppm，GA：-CH2-)，d(δ＝1.19～2.40ppm，CA：-CH2-与-CH-)，e(δ＝3.75ppm，CA：-CHO-)，f(δ＝0.72ppm，CA：-CH3)，g(δ＝0.80ppm，CA：-CH3)，h(δ＝0.91ppm，CA：-CH3)，(δ＝4.26ppm，末端GA：-CH2OH)。为了确认所合成的3-s-PLGA具有三“臂”结构，我们发现属于末端GA的质子积分值与f峰的积分值之比接近于2：1，此外，属于CA(δ＝3.16ppm，-CHOH)的质子峰化学位移转移至3.75ppm(峰e)。通过GPC(图3)测得3-s-PLGA的数均分子量(Mn)为16085，小于其所设计的理论分子量(24937)，这可能是三“臂”3-s-PLGA与线型聚苯乙烯标准品分子之间的空间结构差异所导致。
实施例1-6-2 PEI-PEG的合成与表征
由1H-NMR(D2O)确定PEI-PEG的结构(图2b)。质子信号峰(δ＝2.20～3.04ppm)归属于PEI的-CH2CH2NH-，质子信号峰(δ＝3.60ppm)归属于PEG的-CH2CH2O-，此外，化学位移位于3.30ppm处的单信号峰归属于mPEG的甲氧基(CH3O-)。由-CH2CH2NH-与-CH2CH2O-质子积分值的比值计算PEI与PEG在交联物PEI-PEG分子中的重量比(PEI/PEG)为0.93。如图3所示，由GPC测得PEI-PEG的重均分子量(MW)分别为7493。
实施例1-6-3两亲性嵌段化合物3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)的合成与表征
通过1H-NMR可确定其3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)的结构与嵌段比(图2c)。1H-NMR(d6-DMSO)：a(δ＝1.47ppm，LA：-CHCH3)，b(δ＝5.19ppm，LA：-CHCH3)，c(δ＝4.91ppm，GA：-CH2-)，d(δ＝3.51ppm，PEG：-CH2CH2O-)，PEI(δ＝0.98～1.37ppm；2.61～4.19ppm)。根据1H-NMR计算得PEI在3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)中所占重量比分别为：26.2％。在3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)中，乳酸与羟基乙酸的摩尔比接近1：0.90，与3-s-PLGA的1：1.03非常接近。
实施例1-7 MTT法测定3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)的细胞毒性
将MCF7单细胞悬液接种于96孔板，1×104个/孔，每孔培养基总量为100μL(培养基：RPMI-1640细胞培养基)，37℃，5％CO2培养箱中预培养24h。精密称取冷冻干燥后的3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)及PEI-PEG适量，加入DMSO完全溶解，使其浓度均为20mg/mL，分别加培养基稀释成浓度梯度范围：25～1000μg/mL，每孔加上述梯度浓度的样品100μL，继续培养24h后加MTT处理，每孔加5mg/mL MTT溶液10μL(避光操作)，继续孵育4h。吸尽孔内培养液，尽量做到结晶物(甲臜)的不损失，加入DMSO(200μL/孔)。室温下，平板置微孔板振荡器上震荡10min，使结晶物(甲臜)溶解。用酶标仪在波长570nm处检测各孔吸光值(OD值)，计算细胞存活率及IC50值。细胞存活率的计算如公式1-1所示：
Figure BDA0001816869550000081
其中，实验组OD：加入不同梯度浓度样品干预的细胞孔OD值；对照组OD：不加样品干预，其他条件与实验组一致的细胞孔OD值；空白组OD：无细胞与样品，只加与实验组一致的培养液、MTT与DMSO的培养孔OD值。实验结果参见图4，实验结果表明：运用SPSS 22.0软件probit回归法计算得3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)与PEI-PEG的半数细胞抑制浓度(IC50)分别为1390.5μg/mL与277.1μg/mL。通过单向方差分析，当浓度大于50μg/mL时，同一浓度条件下，3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)对于MCF-7的细胞毒性显著性低于PEI-PEG。
实施例2电正性3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束的制备与表征
实施例2-1电正性3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束的制备
采用标准透析法制备3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)电正性胶束。称取0.60g3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)冻干产物，加入10mL DMSO使完全溶解，再加入10mL蒸馏水，溶液随即呈现强蓝色乳光，室温条件下磁力搅拌2h。将上述溶液转移至透析袋中(透析袋截留分子量：25000Da)，通过1000mL蒸馏水室温透析48h。透析结束后，用0.22μm微孔滤膜滤过透析袋中的液体，即得3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束。所得胶束于4℃冰箱中保存或冷冻干燥备用。
实施例2-2电正性3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束的粒径与形貌
使用马尔文激光粒度仪，通过动态光散射(DLS)技术测定3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)电正性胶束的粒径分布，采用激光多普勒微量电泳法测定其在蒸馏水与PBS中的Zeta电位。光源：He-Ne激光器(633nm)，散射角：90°，检测温度：25℃。胶束的形貌由透射电子显微镜(TEM)进行表征，取一滴胶束样品滴于碳涂层铜网上，用滤纸从液珠边缘吸去多余的液体，滴上3％磷钨酸水溶液负染2min，然后用滤纸吸去染液，室温条件自然风干后进行观察。
实施例3电正性3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/胰岛素复合物的制备与表征
实施例3-1电正性3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/胰岛素复合物的制备
采用简单混合法，制备胶束/胰岛素复合物。取3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束(1mL，5mg/mL)于安瓿瓶中，加入200μL PBS(pH7.4，25mM)调节pH至7.4，平行准备六份样品，分别加入5mg/mL胰岛素溶液(PBS 7.4，25mM)，使胶束与胰岛素的重量比(WR)分别为：8、6、4、2、1，用移液枪将混合液吹打均匀，室温静置30min。使用马尔文粒度仪对胶束/胰岛素复合物的粒径及Zeta电位进行测定。实验结果参见图5，实验结果表明：通过静电作用，电正性3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束与胰岛素在PBS(pH 7.4，25mM)中可形成胶束/蛋白复合物，并随着胶束/蛋白重量比的减小，即蛋白含量的增大，胶束/蛋白复合物的粒径呈现增大趋势，而Zeta电位呈现降低趋势。
实施例3-2电正性胶束及其胰岛素复合物的质子缓冲能力测定
通过传统的酸碱滴定实验，室温条件下，用0.0925mol/L的HCl溶液分别滴定等体积(5mL)的由0.10mol/L NaOH溶液调节至pH 10的NaCl溶液(150mM)、胰岛素溶液(5mg/mL)、3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束(5mg/mL)、3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/胰岛素复合物(6mg/mL，WR＝5)、PEI-PEG(1.5mg/mL)与PEI1.8kDa(1mg/mL)溶液。用移液枪以每次10～50μL的速度逐渐加入HCl溶液，所有pH值及其变化过程均由pH计测定，HCl溶液加入待测溶液中充分混匀后读数。通过比较pH值由7.4滴定至4.0范围内各种物质所需盐酸的量，评价3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束及其胰岛素复合物的质子缓冲性。质子缓冲性的计算如公式3-1所示：
Figure BDA0001816869550000101
其中，CHCl为盐酸的浓度(0.0925mol/L)；ΔVHCl为各物质溶液的pH值由7.0滴定至4.0范围内所需盐酸的体积；m为各物质的质量。实验结果参见图7，实验结果表明：通过计算，3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束与3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/胰岛素复合物的质子缓冲能力分别为2.96μmol/mg与2.74μmol/mg。3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束的质子缓冲能力分别约为PEI1.8kDa(9.98μmol/mg)与PEI-PEG(5.18μmol/mg)的29.6％与57.1％。结果表明，在一定程度上，3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束与3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/胰岛素复合物具有较强的质子缓冲能力。
实施例4载胶束/胰岛素复合物3-s-PLGA微球(MIC-MS)的制备与表征
实施例4-1载胶束/胰岛素复合物3-s-PLGA微球的制备与表征
采用W1/O/W2乳化溶剂挥发法制备MIC-MS。称取3-s-PLGA(0.10g)，加入1mL二氯甲烷涡旋震荡使完全溶解，即为油相(O)；
将1.2mL胰岛素溶液(5mg/mL，PBS 7.4)缓慢加入到2mL的3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束(6mg/mL，DDW)中，室温静置30min以获得3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/胰岛素复合物(WR＝2)，然后离心(8000rpm，4℃，10min)，去上清(保留50μL上清液用于测定在此过程的胶束与胰岛素的复合率)，加入100μL PBS(pH 7.4，25mM)使3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/胰岛素复合物重新分散，即为内水相(W1)。在此过程中，以BCA试剂盒测定3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束与胰岛素的复合率(CR％)，计算公式为：CR％＝(1–上清液中胰岛素的量/胰岛素总投入量)×100％，测定结果为91.9±0.57％(平均值±标准偏差，n＝6)。
将内水相(W1)加入到油相(O)中，涡旋震荡2min，形成油包水初乳(W1/O)，然后，分别加入10mL PVA溶液(4％，w/w)与500μL NaCl(0.9％，w/w)水溶液于上述初乳(W1/O)中，冰水浴条件下，使用高速分散器处理1min(转速：10000rpm/min)，形成水包油包水(W1/O/W2)复乳，再加入20mL DDW，冰水浴超声处理5s(功率：250W)以增加微球间的距离并防止聚集，置于真空干燥箱中(0.09MPa)室温条件下放置过夜以去除有机溶剂。随后将微球离心(5000rpm/min，10min)，用DDW洗涤三次以上，加入10％F68与10％甘露醇各20μL作为冻干保护剂，冷冻干燥24h，所得MIC-MS于-20℃冰箱保存备用。
以100μL 20mg/mL胰岛素溶液为内水相(W1)，以相同方法制备载胰岛素的3-s-PLGA微球(INS-MS)
实施例4-2 MIC-MS与INS-MS的形貌与粒径的表征
MIC-MS与INS-MS的形貌与粒径分布均由扫描电子显微镜(SEM)进行观察与表征。将冷冻干燥后的微球用双面胶固定于SEM的特制金属底座上，真空条件下对微球进行喷金处理后观察。MIC-MS与INS-MS的粒径分布由粒度分析软件(Nano Measurer 1.2.5)进行测量与分析，分别计数200个微球以计算MIC-MS与INS-MS的平均粒径与粒径分布。实验结果参见图8，实验结果表明：MIC-MS与INS-MS两种微球均呈典型球状，且粒径分布较均匀。通过分别计数200个微球的粒径，分析得MIC-MS的平均粒径约为12.0±3.1μm，而INS-MS的平均粒径约为9.1±2.3μm。
实施例4-3包封率与载药率测定
通过测定未包裹进入3-s-PLGA微球中胰岛素的量间接测定胰岛素的包封率。取3-s-PLGA微球样品离心(4℃，13000rpm，15min)，用DDW洗涤三次，用BCA试剂盒测定上清液中胰岛素的浓度，即可计算微球对胰岛素的包封率。
通过直接提取法测定胰岛素的载药量，精密称取10mg冷冻干燥后的3-s-PLGA微球样品于2mL离心管中，加入200μL乙腈使其完全溶解，再加入1.3mL HCl溶液(0.1mol/L)使3-s-PLGA沉淀同时提取微球中的胰岛素，于4℃冰箱中静置过夜后离心处理(4℃，13000rpm，15min)，收集上清液，测定上清液中胰岛素的浓度，即可计算载药率。上清中胰岛素的浓度测定均采用BCA试剂盒法，严格按照BCA试剂盒的说明书操作，由酶标仪在波长562nm处测定吸光值，将吸光值转换成浓度即可计算包封率与载药率。胰岛素的包封率与载药率的计算分别如公式4-1与4-2所示。通过BCA试剂盒测得MIC-MS中胰岛素包封率为73.68±4.02％，载药率为3.57±0.38％。而INS-MS的包封率为59.76±2.15％，载药率为1.90±0.21％(平均值±标准偏差，n＝3)。结果表明：MIC-MS的包封率与载药率均高于INS-MS。
Figure BDA0001816869550000121
Figure BDA0001816869550000122
实施例4-4 INS-MS与MIC-MS的体外释药行为考察
在体外实验条件下，对INS-MS与MIC-MS两种微球的体外释药行为进行考察，分别称取INS-MS与MIC-MS两种微球的冻干样品各35mg，各加入1mL PBS(pH7.4，10mM)作为溶出介质，均匀分散后，将样品置于恒温培养振荡器中，37℃恒温孵育，于一定时间间隔取样，将样品取出，涡旋分散后离心处理(8000rpm，2min)，取上清液0.5mL，同时补加0.5mL新鲜溶出介质使总体积保持恒定。采用BCA试剂盒测定上清液中胰岛素的浓度，依照各个时间段所释放出胰岛素的量计算其释放量及累积释放百分率(％)，以时间(h)为横坐标对累积释放百分率(％)作图，分析INS-MS与MIC-MS两种微球的突释效应与累积释药行为。
实验结果见图9，实验结果表明：这两种微球均存在一定程度的突释效应，MIC-MS的突释效应显著低于INS-MS，在前12h，MIC-MS的累计释药量为21.92±1.57％，而INS-MS为36.69±2.51％。24h之后，MIC-MS的释放行为接近零级动力学，并以每天3.6％的速率平缓而持续的释放，可累积持续释药10天以上。在相同的时间间隔内，MIC-MS的累积释放量显著低于INS-MS(P＜0.01)，因此，MIC-MS的体外释药行为显著优于INS-MS。
实施例4-5 INS-MS与MIC-MS在糖尿病大鼠体内的药理作用
为研究INS-MS与MIC-MS两种微球在大鼠体内的药理作用，将糖尿病模型SD大鼠(209±7.6g)随机分为四组，每组4只。第一组，皮下注射胰岛素的生理盐水溶液，剂量：5IU/kg；第二组，皮下注射以0.5％CMC-Na分散的INS-MS混悬液，剂量：约96IU/kg；第三组，皮下注射以0.5％CMC-Na分散的INS-MS混悬液，剂量：约96IU/kg。第一组使用1mL无菌注射器(配针：0.45×16RWLB)，其他实验组均采用5mL无菌注射器(配针：0.7×16RWLB)对大鼠进行皮下(颈背侧皮肤)注射给药；采用断尾取血法，于预先设定好的时间间隔测定大鼠空腹的血糖值。采用相同方法，分别测定正常SD大鼠与糖尿病模型SD大鼠(无给药处理)的空腹血糖值作为对照。以时间(h)为横坐标，大鼠血糖水平为纵坐标绘制血糖-时间曲线，按血糖-时间曲线的曲线上面积(AAC)计算各给药组的相对生物利用度。相对生物利用度的计算如公式4-3所示：
Figure BDA0001816869550000131
其中，AAC代表血糖-时间曲线的曲线上面积；a代表皮下注射INS-MS或MIC-MS悬浮液；b代表皮下注射胰岛素溶液。
实验结果见图10，实验结果表明：在给药后第10h，第二组与第三组大鼠的血糖值急剧下降，分别为2.3±0.33mmol/L与8.4±3.59mmol/L，二者存在统计学显著性差异(P<0.05)，由此可知，INS-MS在体内的突释效显著强于MIC-MS。在第14h，第二组与第三组大鼠的血糖值均略低于正常大鼠的血糖值，但两组糖尿病大鼠在整个试验过程均未表现出较严重的低血糖反应；在第14～26h，第二组大鼠的血糖值急剧上升至糖尿病大鼠血糖水平(21.40±2.08mmol/L)，而第三组的血糖值则表现为平缓回升，并维持在相对较低血糖水平(10.7±5.32mmol/L)。在接下来的1天，第三组仍然保持在11.80±3.47mmol/L，结果表明第三组具有更平缓持久的降血糖作用(P<0.01)。在第50～98h，第二组大鼠血糖值出现一定的下降，但在接下来的24h，其血糖值又重新恢复至较高水平。而第三组的血糖值逐渐回升至22.60±5.57mmol/L。在整个实验过程中，除第6h，第14h与第98h三个时间点之外，第三组大鼠的血糖值均显著性低于第二组(P<0.05)。按血糖-时间曲线，分别计算得INS-MS与MIC-MS的相对生物利用度为311.6％与485.4％。

Claims (13)

1.一种载电正性3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/多肽药物复合物的PLGA微球，其特征在于，其囊材为三臂高分子聚合物3-s-PLGA，3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/多肽药物复合物为内水相；所述3-s-PLGA是以胆酸(CA)为引发剂通过开环聚合反应合成的三“臂”PLGA；PEI-PEG是由低分子量PEI与PEG通过脱水缩合相互交联而成的水溶性交联共聚物，所述PEI为聚乙烯亚胺，所述PEI分子量为1800Da；
3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)的合成方法，其包含如下步骤：
a)合成羧基封端的3-s-PLGA-COOH；
首先以胆酸为引发剂，采用开环聚合法合成3-s-PLGA共聚物，然后通过DMAP催化丁二酸酐与3-s-PLGA反应合成3-s-PLGA-COOH；
b)合成水溶性聚乙二醇-聚乙烯亚胺交联共聚物(PEI-PEG)
将羧基化的PEG的羧基与PEI的氨基进行缩合，通过酰胺键相交联，生成交联聚合物PEI-PEG；
c)合成树枝状两亲性嵌段共聚物3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)
将3-s-PLGA-COOH中的羧基与PEI-PEG的氨基进行缩合，得到3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)；
所述PLGA微球采用双乳化溶剂挥发法的制备方法制备，其包括如下步骤：
1)称取3-s-PLGA，加入有机溶剂至完全溶解，即为油相(O)；
2)将多肽药物溶液缓慢加入到3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束中，室温静置以获得3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/多肽药物复合物(W2)，然后离心，去上清，加入PBS使3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束/多肽药物复合物重新分散，即为内水相(W1)；
3)将内水相(W1)加入到油相(O)中，分散后形成油包水初乳(W1/O)，然后，分别加入PVA溶液与生理盐水于上述初乳(W1/O)中，冰水浴条件下，使用高速分散器处理，形成水包油包水(W1/O/W2)复乳，再加入DDW，冰水浴超声处理，干燥去除有机溶剂，离心微球，加入冻干保护剂，冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的PLGA微球，其特征在于，所述3-s-PLGA数均分子量为10000～25000。
3.根据权利要求2所述的PLGA微球，其特征在于，所述3-s-PLGA数均分子量为16085。
4.根据权利要求1所述的PLGA微球，其特征在于，所述PEI-PEG的重均分子量为6000～10000。
5.根据权利要求4所述的PLGA微球，其特征在于，所述PEI-PEG的重均分子量为7693。
6.根据权利要求1所述的PLGA微球，其特征在于，步骤a)中采用开环聚合发合成3-s-PLGA共聚物的方法为，D,L-丙交酯和乙交酯在引发剂胆酸和催化剂辛酸亚硒的作用下在100℃-200℃条件下反应，获得3-s-PLGA共聚物。
7.根据权利要求1所述的PLGA微球，其特征在于，步骤a)中通过DMAP催化丁二酸酐与3-s-PLGA反应合成3-s-PLGA-COOH的方法为3-s-PLGA、丁二酸酐和DAMP在碱性条件下室温反应获得。
8.根据权利要求1所述的PLGA微球，其特征在于，步骤b)中制备羧基化的PEG的羧基的方法为PEG、丁二酸酐、DMAP在碱性条件下室温反应获得。
9.根据权利要求1所述的PLGA微球，其特征在于，步骤b)中羧基化的PEG的羧基与PEI在缩合剂的作用下进行缩合生成PEI-PEG，并进一步将mPEG接枝到PEI-PEG的末端羧基上。
10.根据权利要求1所述的PLGA微球，其特征在于，步骤c)的反应条件为在缩合剂的条件下进行反应。
11.根据权利要求10所述的PLGA微球，其特征在于，所述的缩合剂是EDC·HCl与HOBt的组合。
12.根据权利要求1所述的PLGA微球，其特征在于，所述电正性3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束的制备方法：将3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束溶解于DMSO中，再加入与DMSO等体积的水，以透析膜进行透析，并以0.22μm微孔滤膜滤过透析袋中的液体，制备电正性3-s-PLGA-b-(PEI-PEG)胶束。
13.根据权利要求1所述的PLGA微球在制备治疗糖尿病的药物中的用途，所述糖尿病的药物为胰岛素。
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