CN103980365A - 一种表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子、其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子，其制备方法及其在富集人中性粒细胞多肽中的应用。本发明的炭疽致死因子磁性纳米粒子通过氨基-羧基偶联反应，将炭疽致死因子连接在表面具有氨基和/或羧基的超顺磁性纳米粒子表面而得；其可快速、特异地富集人中性粒细胞多肽，以便进行进一步的检测，从而方便了人中性粒细胞多肽作为肿瘤愈后生物标志物的应用，具有很好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及功能化磁性纳米粒子技术领域，尤其涉及一种表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子及其制备方法和用途。
背景技术
肿瘤的发生与发展与肿瘤微环境直接相关，所以关于肿瘤微环境的研究引起了科学家的广泛关注。肿瘤微环境中蛋白和多肽的表达通常是肿瘤相关的，很多肿瘤细胞或正常细胞分泌的蛋白和多肽类分子被作为潜在的肿瘤微环境生物标志物进行研究。
其中肿瘤细胞产生的生物标志物通常与肿瘤进展时的变异相关，而肿瘤微环境中源自炎症细胞的生物标志物通常是来自不会随着疾病发展发生变异且会与特殊类型的癌症紧密相关的正常细胞。在这些生物标志物中，我们最为关注的是潜在的愈后生物标志物人中性粒细胞多肽(human human neutrophil peptidesHNP1-3)。与其它复杂的癌症特异性生物标志物比较，HNP1-3已被明确提出作为很多癌症的特征标志物。它的丰度评价可以帮助人们从分子水平上理解疾病的发生，从而提供更有效的临床意义的信息。尽管如此，现有繁冗的分离技术如HPLC或昂贵且不能广泛应用的所有生物标志物的ELISA检测方法都大大阻碍了HNP1-3作为生物标志物的实际应用。因此，发展一种方便耐用而高效的HNP1-3分离方法值得我们为此付出努力。
近年来，分子纳米技术在生物医药领域的应用如火如荼。纳米粒子巨大的比表面积使其具有异常高效的吸附性，还可进一步对其表面进行修饰从而赋予其吸附的选择性。已经证实纳米粒子和生物分子巧妙的结合能够应用于设计新型纳米传感器。在众多的纳米粒子中，超顺磁性纳米粒子由于具有独特的理化性质而成为生物医药材料领域的研究热点。吸附在磁性纳米粒子表面的物质可以通过外磁场与磁性纳米粒子本身一起被方便地分离出来，大大提高样品富集的选择性和速率。
炭疽致死因子是一类相对稳定的金属蛋白，它们的结构和活性都是Zn2+依赖的。HNP1-3能够高亲度、特异性结合至炭疽致死因子的远离活性中心的一个区域位点，该结合过程不受炭疽致死因子的物理环境影响，即便是炭疽致死因子已经和保护性抗原结合形成炭疽毒素，仍无法阻挡体内外的炭疽致死因子与HNP1-3的结合。有趣的是，HNP1-3与炭疽致死因子的结合具有Zn2+的可逆性，当用EDTA螯合除去Zn2+时，炭疽致死因子会失活并释放结合到的HNP1-3；而当再加入Zn2+时，炭疽致死因子会被复性，再次具有结合HNP1-3的能力。
发明内容
本发明的目的在于提出一种表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子，其制备方法，以及其在富集人中性粒细胞多肽中的应用；本发明的表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子可快速、特异地富集人中性粒细胞多肽，以便进行进一步的检测，从而方便了人中性粒细胞多肽作为肿瘤愈后生物标志物的应用，具有很好的临床应用前景。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子，其通过氨基-羧基偶联反应，将炭疽致死因子连接在表面具有氨基和/或羧基的超顺磁性纳米粒子表面而得。
上述磁性纳米粒子中，作为优选，所述表面具有氨基和/或羧基的超顺磁性纳米粒子包括超顺磁性纳米粒子、保护层和表面修饰层；
优选地，所述超顺磁性纳米粒子为Fe3O4纳米粒子，Fe2O3纳米粒子或FePt纳米粒子，更优选为Fe3O4纳米粒子；
优选地，所述保护层为二氧化硅、二氧化钛或聚苯乙烯保护层，更优选为二氧化硅保护层；
优选地，所述表面修饰层具有裸露的氨基和/或羧基。
第二方面，本发明提供了第一方面所述磁性纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备Fe3O4、Fe2O3或FePt超顺磁性纳米粒子；
(2)将步骤(1)所得超顺磁性纳米粒子包覆二氧化硅、二氧化钛或聚苯乙烯保护层；
(3)将步骤(2)所得保护层包覆的超顺磁性纳米粒子进行氨基化和/或羧基化修饰；
(4)步骤(3)所得氨基化和/或羧基化修饰的超顺磁性纳米粒子表面的氨基和/或羧基与炭疽致死因子表面的羧基和/或氨基发生偶联反应，得所述表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子。
上述制备方法中，作为优选，步骤(1)为采用共沉淀法制备Fe3O4超顺磁性纳米粒子，具体步骤包括：
(1’)分别将Fe3+盐和Fe2+盐溶于水中，通入氮气保护；
优选地，所述Fe3+盐为FeCl3或其各种水合物，优选为FeCl3·6H2O；
优选地，所述Fe2+盐为FeCl2、FeSO4或其各种水合物，优选为FeCl2·4H2O；
优选地，所述Fe3+与所述Fe2+的摩尔比为(1.3～2.5):1、优选为(1.9～2.1)：1、更优选为(2～2.05)：1；
(2’)氮气保护下，向步骤(1’)所得溶液中加入氨水至pH为8～14、优选为9～12、更优选为11，反应0.5～2h、优选0.5～1h、更优选为0.5h；
优选地，加入氨水的时间不超过3s；
优选地，加入氨水期间及反应期间，保持搅拌溶液；
(3’)对步骤(2’)所得反应液进行磁分离，对所分离产物进行洗涤，得Fe3O4超顺磁性纳米粒子；
优选地，以铷铁硼磁铁进行磁分离；
优选地，先以水、再以无水乙醇对分离产物进行洗涤，洗涤后真空干燥即得Fe3O4超顺磁性纳米粒子。
作为优选，步骤(2)为用二氧化硅包覆Fe3O4超顺磁性纳米粒子，具体包括：
将Fe3O4超顺磁性纳米粒子以10μg-50mg/mL、优选0.5mg-10mg/mL、更优选1mg/mL的浓度分散于水中，加入体积比为(2-3)：1、优选为2.5:1的水和正硅酸乙酯的混合溶液，反应(2-4)小时、优选为3小时后，加入体积比为(3-5)：1、优选为4:1的乙醇和正硅酸乙酯的混合溶液，氮气保护下反应12-16小时后，磁分离并洗涤所得产物，干燥后得二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子。
作为优选，步骤(3)为：使用氨基化硅烷偶联剂或羧基化硅烷偶联剂对二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子进行氨基化或羧基化修饰，得到表面带有氨基或羧基的二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子；
优选地，所述氨基化硅烷偶联剂YSiX3，其中Y为氨基，X为可水解基团；进一步优选地，所述X为Cl，OMe，OEt，OC2H4OCH3，OSiMe3或OAc；最优选地，所述氨基化硅烷偶联剂为氨丙基三乙氧基硅烷；
优选地，所述羧基化硅烷偶联剂为Y’SiX3，其中Y’为酯基或羧基，X为可水解基团；进一步优选地，所述X为Cl，OMe，OEt，OC2H4OCH3，OSiMe3或OAc；
进一步优选地，步骤(3)具体为：
(i)将二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子分散于水中，浓度为5μg-50mg/mL，优选为20μg-10mg/mL,更优选为0.5mg/mL；
(ii)每100mL步骤(i)所得二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子水溶液中加入氨基化或羧基化硅烷偶联剂5μL-5mL、优选为10μL-1mL、更优选为100μL，反应0-120小时、优选6-96小时、更优选24小时，磁分离并洗涤所得产物，得到表面带有氨基或羧基的二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子。
作为优选，步骤(3)为先对二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子进行氨基化修饰，再在修饰的氨基位点上接枝主链碳原子数为3到15的二元酸，得到表面带有羧基的二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子；
在具体实施方案中，所述二元酸为丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十一二酸、十二二酸、十三二酸、十四二酸或十五二酸。
在此类实施方案中，所述二元酸的用量相对于超顺磁性纳米粒子表面的氨基过量，并且，二元酸的其中一个羧基与超顺磁性纳米粒子表面的氨基反应，另一个羧基裸露，从而形成表面带羧基的二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子。
优选地，所述羧基化修饰是在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的存在下进行。
作为优选，步骤(4)具体包括：
在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的存在下，将氨基化和/或羧基化修饰的二氧化硅包覆的超顺磁性纳米粒子、优选Fe3O4超顺磁性纳米粒子与炭疽致死因子进行接枝反应；
优选地，在所述接枝反应前、后或同时，优选地，在所述接枝反应后，用2-2-氨基乙氧基乙醇封闭所述超顺磁性纳米粒子上的多余的羧基位点。
第三方面，本发明提供了一种表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子，由第二方面任一项所述制备方法制得。
第四方面，本发明提供了一种富集人中性粒细胞多肽的方法，使用第一方面或第三方面所述表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子进行富集。
使用本发明所述表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子富集人中性粒细胞多肽及后续检测的流程如图1所示。
本发明所述表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子可从PBS缓冲液、去离子水、唾液、眼泪、血清、胎牛血清中富集人中性粒细胞多肽，但不限于这些样品。所获得的磁性纳米粒子上的特异性结合的中性粒细胞多肽不仅可以进行MALDI-TOF分析检测，而且经EDTA处理后，被释放进入溶液，可以进一步进行HPLC等定量分析。释放中性粒细胞多肽后的炭疽致死因子磁性纳米粒子，可以经Zn2+复性后再次应用于中性粒细胞多肽的富集分离。
本发明利用炭疽致死因子与HNP1-3之间的特异性、可逆性结合，将其与磁分离技术有机结合，再借助传统的MALDI-TOF-MS技术和HPLC技术，实现了HNP1-3的富集和富集后的进一步检测；所提供的表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子可快速、特异地富集HNP1-3，大大简化了人中性粒细胞多肽HNP1-3的富集分离检测过程，具有很好的临床引用前景。
附图说明
图1是实施例1所得炭疽致死因子磁性纳米粒子富集人中性粒细胞多肽及后续检测的流程示意图；
图2是Fe3O4磁性纳米粒子(a)及SiO2包覆的Fe3O4磁性纳米粒子(b)的透射电镜照片；
图3实施例1各步骤所得磁性纳米粒子在pH中性的水溶液中的表面电位变化图谱；
图4是实施例1各步骤所得磁性纳米粒子的红外吸收光谱；
图5是实施例1中所得Fe3O4、Fe3O4SiO2以及Fe3O4APS磁性纳米粒子的磁回滞曲线；
图6是实施例1所得炭疽致死因子磁性纳米粒子(即AMNP)在磁场中5秒和非磁场作用下的光学照片；
图7是MALDI-TOF分析AMNP与HNP1的可逆性结合；
图8是AMNP从人血清溶液中富集HNP1后的MALDI-TOF检测图；
图9是AMNP、Fe3O4COOH从溶液中富集HNP1的MALDI-TOF检测图；
图10是AMNP从GSH(即谷胱甘肽)和TCEP HCl(即三(2-羰基乙基)磷盐酸盐)的溶液中富集还原态HNP1的MALDI-TOF检测图，如下面两条线所示；上面第一条线为：TCEP HCl溶液中的还原态HNP1的MALDI-TOF检测图；
图11是AMNP从胎牛血清样品中富集HNP1后的MALDI-TOF检测图；
图12是AMNP从人血清样品中富集HNP1后的MALDI-TOF检测图；
图13是AMNP从人唾液样品中富集HNP1后的MALDI-TOF检测图；
图14是AMNP从人泪液样品中富集HNP1后的MALDI-TOF检测图。
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1表面固载炭疽致死因子磁性纳米粒子的制备
(1)Fe3O4超顺磁性纳米粒子的制备
称量54.0毫克FeCl3·6H2O和212.72毫克FeCl2·4H2O混合溶于52毫升水中，700rpm搅拌至完全溶解，向其中加入5毫升NH3·H2O与43毫升水的混合溶液，(3S内加入完毕)，氮气保护下反应30分钟后停止反应，将产物磁吸、水洗澄清后，向其中加入100毫升水分散，备用。
所得Fe3O4磁性纳米粒子的透射电镜照片如图2a所示，其尺寸在10纳米左右。
(2)二氧化硅包覆Fe3O4超顺磁性纳米粒子(本文简称Fe3O4SiO2)
取50毫升步骤(1)所得Fe3O4纳米粒子溶液，向其中加入50毫升水和20微升正硅酸乙酯(Na2SiO3)的混合溶液，反应3小时后，向其中加入80微升正硅酸乙酯与20微升乙醇的混合溶液，氮气保护下反应过夜，24小时后，水洗至上清澄清。加入50毫升水分散沉淀，得Fe3O4SiO2超顺磁性纳米粒子储备液，备用。
所得Fe3O4SiO2超顺磁性纳米粒子的透射电镜照片如图2b所示，其尺寸在100纳米左右。
(3)Fe3O4SiO2超顺磁性纳米粒子的氨基化修饰
取25毫升步骤(2)所得Fe3O4SiO2储备液，向其中加入75毫升水搅拌均匀后，向其中加入氨丙基三乙氧基硅烷(APS)100微升，氮气保护下，搅拌均匀并充分反应48小时和20微升后，停止反应，并反复水洗产物，将沉淀分散于25毫升体系，获得氨基化修饰的二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子(本文简称Fe3O4APS)储备液，备用。
(4)Fe3O4APS超顺磁性纳米粒子的羧基化修饰
将121.84毫克(过量的)辛二酸溶于45毫升PBS缓冲液中，向其中加入26.84毫克1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，搅拌15分钟获得澄清透明溶液，向其中加入58毫克N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和5毫升步骤(3)所得氨基化修饰的二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子储备液，搅拌均匀，继续反应24小时后终止反应，磁洗数次后，将产物分散于5毫升水中，获得表面带裸露羧基的二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子(本文简称Fe3O4COOH)分散液，备用。
该步骤中，辛二酸的一个羧基与Fe3O4APS表面的氨基接枝，另一个羧基裸露，从而形成表面带羧基的二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子。
(5)炭疽致死因子的固载
取10微升步骤(4)所得Fe3O4COOH超顺磁性纳米粒子分散液，向其中加入7.72微升(8.10微克)2-2-氨基乙氧基乙醇和0.08微摩尔(即35.34微克)EDC，作用15分钟后，向其中加入0.2微摩尔(即23微克)NHS，反应15分钟后，向其中加入10微克炭疽致死因子(ALF，商购获得)，继续反应24小时后，磁吸水洗产物，获得本发明的表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子(本文简称AMNP，又称为Fe3O4ALF)，将产物分散于10微升水中，备用于中性粒细胞多肽的富集和检测。
对上述各步所得磁性纳米粒子分别进行如下检测：
(i)在pH中性的水溶液中的表面电位变化
上述各步所得磁性纳米粒子的表面电位变化图谱如图3所示，图3显示：磁性纳米粒子在pH中性的水溶液中的表面电位从Fe3O4纳米粒子时的-7.8mV，到Fe3O4SiO2时的-35mV，再到Fe3O4APS时的16mV和Fe3O4COOH时的-10mV，表明每一步化学修饰的成功实现。
(ii)红外吸收光谱检测
上述各步所得磁性纳米粒子的红外吸收光谱如图4所示，图4显示：与未经任何修饰的Fe3O4磁性纳米粒子相比，Fe3O4SiO2在1047cm–1处出现了新的对应于v Si–O–Si的振动，继而Fe3O4APS在1511cm–1和1468cm–1处出现了分别对应于δNH和v CH2的振动，然后Fe3O4COOH样品在1528,1406cm–1处出现了酰胺带和v C–O振动，这些也表明每一步化学修饰的成功实现。
(iii)磁回滞曲线
Fe3O4、Fe3O4SiO2以及Fe3O4APS的磁回滞曲线如图5所示，图5显示：Fe3O4、Fe3O4SiO2以及Fe3O4APS磁性纳米粒子保持了超顺磁性质和较高的饱和磁化率。
(iv)表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子(AMNP)的超顺磁性检测
AMNP在磁场中5秒和非磁场作用下的光学照片如图6所示，图6结果表明：AMNP具有良好的超顺磁性。
实施例2AMNP与HNP1的可逆性结合
采用MALDI-TOF分析AMNP与HNP1的可逆性结合，结果如图7所示：
将实施例1所得AMNP(活化的)与HNP1结合后，经EDTA螯合除去表面炭疽致死因子中的Zn2+致其失活，失活的AMNP会释放所有的HNP1(图7，通道1)，致使AMNP颗粒上没有可以检测到的HNP1(图7，通道2)。向失活的AMNP加入Zn2+，失活的AMNP将重新复活，并可以第二次用于HNP1的选择性吸附，MALDI-TOF可以分析检测到结合的HNP1(图7，通道3)；这些新结合的HNP1会由于AMNP再次失去Zn2+而(EDTA螯合除去炭疽致死因子中的Zn2+)而被释放，得到的失活AMNP上没有MALDI-TOF可检测到的HNP1(图7，通道4)；再次加入Zn2+，会伴随着AMNP的第二次复性，并可应用于HNP1的第三次检测(图7，通道5)，但是第三次检测所结合的HNP1无法通过EDTA的再次螯合灭活AMNP而被完全释放(图7，通道6)，上述各MALDI-TOF分析的检测体积均为1微升。
实施例3AMNP对HNP1的富集实例
图8为使用1微升实施例1所得AMNP溶液，从650微升人血清溶液(HNP1浓度为0.8微克/毫升)中富集获得的AMNP-HNP1的MALDI-TOF谱，图8显示：AMNP能够从溶液中富集到HNP1。
图9为AMNP从溶液中富集HNP1的另一个实例，图9显示：AMNP能够从溶液中富集到HNP1形成AMNP-HNP1复合物，但是Fe3O4COOH无法富集到溶液中的HNP1。
图10是AMNP从GSH(即谷胱甘肽)和TCEP HCl(即三(2-羰基乙基)磷盐酸盐)的溶液中富集还原态HNP1的MALDI-TOF检测图。其中，上面第一条线为TCEP HCl溶液中的还原态HNP1的MALDI-TOF检测图；下面两条线分别显示AMNP从GSH和TCEP HCl的溶液中富集还原态HNP1的结果，结果表明：AMNP无法富集还原态的HNP1。
实施例4AMNP应用于胎牛血清样品中的HNP1的富集和MALDI检测
取1微升上述AMNP磁性纳米粒子溶液，加至7.5微升含有40微克/毫升HNP1的胎牛血清溶液中，作用半小时后，磁吸分离获得吸附有中性粒细胞多肽的磁性颗粒，再用MALDI-TOF进行检测，结果如图11所示。
图11显示了1微升AMNP溶液与7.5微升含40微克/毫升HNP1的胎牛血清溶液作用后形成的AMNP-HNP1复合物的MALDI-TOF分析(上面的线)；对比而言，在同样的检测条件下，单纯使用MALDI-TOF分析技术却无法分析出上述胎牛血清溶液中的HNP1(下面的线)，再次表明了AMNP对胎牛血清溶液中HNP1的特异性富集作用。
实施例5AMNP应用于人血清样品中的HNP1的富集和MALDI检测
取1微升上述AMNP磁性纳米粒子溶液，加至5微升含有100微克/毫升HNP1的人血清溶液中，作用半小时后，磁吸分离获得吸附有中性粒细胞多肽的磁性颗粒，再用MALDI-TOF进行检测，结果如图12所示。
图12显示了上述1微升AMNP溶液与5微升含100微克/毫升HNP1的胎牛血清溶液作用后形成的AMNP-HNP1复合物的MALDI-TOF分析(上面的线)；对比而言，在同样的检测条件下，单纯使用MALDI-TOF分析技术却无法分析出上述人血清溶液中的HNP1(下面的线)，再次表明了AMNP对人血清溶液中HNP1的特异性富集作用。
实施例6AMNP应用于人唾液样品中的HNP1的富集和MALDI检测
取1微升上述AMNP磁性纳米粒子溶液，加至400微升健康人唾液中，作用半小时后，磁吸分离获得吸附有中性粒细胞多肽的磁性颗粒，再用MALDI-TOF进行检测，结果如图13所示。
实施例7AMNP应用于人泪液样品中的HNP1的富集和MALDI检测
取1微升上述AMNP磁性纳米粒子溶液，加至280微升健康人泪液中，作用半小时后，磁吸分离获得吸附有中性粒细胞多肽的磁性颗粒，再用MALDI-TOF进行检测，结果如图14所示。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明，但本发明并不局限于上述，即不意味着本发明必须依赖上述才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子，其特征在于，通过氨基-羧基偶联反应，将炭疽致死因子连接在表面具有氨基和/或羧基的超顺磁性纳米粒子表面而得。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米粒子，其特征在于，表面具有氨基和/或羧基的超顺磁性纳米粒子包括超顺磁性纳米粒子、保护层和表面修饰层；
优选地，所述超顺磁性纳米粒子为Fe3O4纳米粒子，Fe2O3纳米粒子或FePt纳米粒子，更优选为Fe3O4纳米粒子；
优选地，所述保护层为二氧化硅、二氧化钛或聚苯乙烯保护层，更优选为二氧化硅保护层；
优选地，所述表面修饰层具有裸露的氨基和/或羧基。
3.根据权利要求1或2所述的磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备Fe3O4、Fe2O3或FePt超顺磁性纳米粒子；
(2)将步骤(1)所得超顺磁性纳米粒子包覆二氧化硅、二氧化钛或聚苯乙烯保护层；
(3)将步骤(2)所得保护层包覆的超顺磁性纳米粒子进行氨基化和/或羧基化修饰；
(4)步骤(3)所得氨基化和/或羧基化修饰的超顺磁性纳米粒子表面的氨基和/或羧基与炭疽致死因子表面的羧基和/或氨基发生偶联反应，得所述表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)为采用共沉淀法制备Fe3O4超顺磁性纳米粒子，具体步骤包括：
(1’)分别将Fe3+盐和Fe2+盐溶于水中，通入氮气保护；
优选地，所述Fe3+盐为FeCl3或其各种水合物，优选为FeCl3·6H2O；
优选地，所述Fe2+盐为FeCl2、FeSO4或其各种水合物，优选为FeCl2·4H2O；
优选地，所述Fe3+与所述Fe2+的摩尔比为(1.3～2.5):1、优选为(1.9～2.1)：1、更优选为(2～2.05)：1；
(2’)氮气保护下，向步骤(1’)所得溶液中加入氨水至pH为8～14、优选为9～12、更优选为11，反应0.5～2h、优选0.5～1h、更优选为0.5h；
优选地，加入氨水的时间不超过3s；
优选地，加入氨水期间及反应期间，保持搅拌溶液；
(3’)对步骤(2’)所得反应液进行磁分离，对所分离产物进行洗涤，得Fe3O4超顺磁性纳米粒子；
优选地，以铷铁硼磁铁进行磁分离；
优选地，先以水、再以无水乙醇对分离产物进行洗涤，洗涤后真空干燥即得Fe3O4超顺磁性纳米粒子。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)为用二氧化硅包覆Fe3O4超顺磁性纳米粒子，具体步骤包括：
将Fe3O4超顺磁性纳米粒子以10μg-50mg/mL、优选0.5mg-10mg/mL、更优选1mg/mL的浓度分散于水中，加入体积比为(2-3)：1、优选为2.5:1的水和正硅酸乙酯的混合溶液，反应(2-4)小时、优选为3小时后，加入体积比为(3-5)：1、优选为4:1的乙醇和正硅酸乙酯的混合溶液，氮气保护下反应12-16小时后，磁分离并洗涤所得产物，干燥后得二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子。
6.根据权利要求3-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)为：使用氨基化硅烷偶联剂或羧基化硅烷偶联剂对二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子进行氨基化或羧基化修饰，得到表面带有氨基或羧基的二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子；
优选地，所述氨基化硅烷偶联剂YSiX3，其中Y为氨基，X为可水解基团；进一步优选地，所述X为Cl，OMe，OEt，OC2H4OCH3，OSiMe3或OAc；最优选地，所述氨基化硅烷偶联剂为氨丙基三乙氧基硅烷；
优选地，所述羧基化硅烷偶联剂为Y’SiX3，其中Y’为酯基或羧基，X为可水解基团；进一步优选地，所述X为Cl，OMe，OEt，OC2H4OCH3，OSiMe3或OAc；
进一步优选地，步骤(3)包括以下步骤：
(i)将二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子分散于水中，浓度为5μg-50mg/mL，优选为20μg-10mg/mL,更优选为0.5mg/mL；
(ii)每100mL步骤(i)所得二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子水溶液中加入氨基或羧基硅烷偶联剂5μL-5mL、优选为10μL-1mL、更优选为100μL，反应0-120小时、优选6-96小时、更优选24小时，磁分离并洗涤所得产物，得到表面带有氨基或羧基的二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子。
7.根据权利要求3-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)为：先对二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子进行氨基化修饰，再在修饰的氨基位点上接枝主链碳原子数为3到15的二元酸，得到表面带有羧基的二氧化硅包覆的Fe3O4超顺磁性纳米粒子；
优选地，所述羧基化修饰是在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的存在下进行。
8.根据权利要求3-7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)为：
在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的存在下，将氨基化和/或羧基化修饰的二氧化硅包覆的超顺磁性纳米粒子、优选Fe3O4超顺磁性纳米粒子与炭疽致死因子进行接枝反应；
优选地，在所述接枝反应前、后或同时，优选地，在所述接枝反应后，用2-2-氨基乙氧基乙醇封闭所述超顺磁性纳米粒子上的多余的羧基位点。
9.一种表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子，由权利要求3-8任一项所述制备方法制得。
10.一种富集人中性粒细胞多肽的方法，其特征在于，使用权利要求1、2或8所述表面固载炭疽致死因子的磁性纳米粒子进行富集。
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