CN105478087A - 一种基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法，将葡聚糖溶于超纯水中，加入高碘酸钠，在30℃的条件下避光反应2小时，然后用超纯水进行透析纯化，将透析后的溶液真空冷冻干燥，得到醛基葡聚糖，将醛基葡聚糖溶于PBS中，加入到氨基磁珠中，再向氨基磁珠中加入戊二醛，室温避光振荡4小时，利用共价嫁接的方法，使醛基葡聚糖和戊二醛共同嫁接到氨基磁珠表面制得醛基磁珠；将谷氨酸溶于PBS中，加入醛基磁珠中，室温振荡4小时，然后加入硼氢化钠，继续振荡反应2小时，获得羧基磁珠。本发明形成的单分散磁珠更有利于下游嫁接生物分子的顺利进行而不影响生物分子的活性，同时磁珠表面羧基密度的提高使嫁接生物分子的效率更高。

Description

一种基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于氨基磁珠表面涂覆葡聚糖的羧基磁珠制备方法及其应用。
背景技术
磁珠，即磁性微珠或磁性微球，它是一类具有超顺磁性，直径为纳米或微米级的球形复合物，可在外加磁场的作用下向磁场移动，从而达到分离目标产物的目的。磁珠的表面带有不同的功能团，根据表面功能团的不同可分为氨基磁珠，羧基磁珠，环氧基磁珠等。磁珠表面的功能团可以共价嫁接各种生物分子或小分子，可用于下游的生物实验。
葡聚糖是由葡萄糖单位组成的多聚糖，葡聚糖含有丰富的醇羟基使其改性后易于与其他化合物反应，并且葡聚糖与蛋白质的低作用性和细胞对其耐受性及其无毒性，使得以葡聚糖为生物材料的表面涂层成为研究热点。
谷氨酸，是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，分子内含有两个羧基。谷氨酸又分左旋体、右旋体和外消旋体。左旋体，即L-谷氨酸，它是一种鳞片状或粉末状晶体，呈微酸性，无毒。
一般表面含羧基功能团的磁珠与小分子、生物大分子或其他化合物的嫁接方法种类较多，嫁接方法易于操作，但嫁接之后存在的问题是嫁接率较低和嫁接后因磁珠表面的非特异吸附以及空间位阻的限制导致生物分子空间结构改变最终使生物分子失去活性，从而造成下游生物实验得率低和某些大分子无法发挥其活性作用等。本发明旨在解决目前一般羧基磁珠嫁接含氨基的化合物存在的上述问题，提供了一种新的羧基磁珠的制备方法以及羧基磁珠的各种应用。
专利公开号TW200702661公开了一种生物检测用之磁性奈米粒子及其制备方法BIO-COMPATIBLEMAGNETICNANOPARTICLESANDPREPARATIONMETHODTHEREFOR，该发明利用高碘酸钠氧化表面被覆有葡聚糖之磁性奈米粒子，以形成于该磁性奈米粒子上形成醛基，并进而使其与卵白素结合，因此可以采用经硷性磷酸标定之生物素，利用卵白素与生物素可于室温共价结合之特性，以酵素连结免疫吸附分析法检测之。可应用于将磁性奈米粒子与其他生物分子如去氧核糖核酸(deoxyribosenμcLeicacid，DNA)、抗体或抗原等相结合，并进一步应用于动物、植物及微生物病毒之检测，故极具产业应用价值。
专利公开号CN101143888公开了一种免疫纳米磁性葡聚糖微球的制备方法，共沉淀法制备纳米级的磁性氧化铁粒子；配成亚铁离子∶铁离子∶镍离子为1∶(1.0-4.0)∶(0.2-0.8)摩尔比溶液；葡聚糖包裹磁性氧化铁粒子；纳米磁性葡聚糖微球的蛋白的连接。优点在于，实现了粒径窄，重复性好，价格低廉，使免疫纳米葡聚糖磁性微球具有天然活性的。
专利公开号CN101759882A公开了一种交联葡聚糖磁性复合微粒及其制备方法及其使用，该复合微粒包括磁性纳米颗粒和具有交联结构的葡聚糖，其中磁性纳米颗粒分散在具有交联结构的葡聚糖中。该复合微粒的制备方法为：配制葡聚糖溶液、合成葡聚糖磁性复合微粒、合成交联葡聚糖磁性复合微粒。该复合微粒的使用步骤：制载抗癌药物的交联葡聚糖磁性复合微粒、在其中加入缓释液释药。本发明解决了现有葡聚糖磁性复合微粒的磁响应性弱、包载量小的技术问题，所制备的交联葡聚糖磁性复合微粒具有强的磁响应性，载药量大，能够高度浓集抗癌药物的特点，能够通过磁场的定位和药物的缓释作用于靶向细胞。
专利公开号CN102430130A公开了一种医药用改性葡聚糖包覆磁性纳米颗粒复合材料及其制备，该本发明的方法是在溶剂热条件下进行的反应过程，制备得到亲水性强、生物亲和性好、能用于抗体和细胞分离以及医学核磁共振成像对比剂的四氧化三铁及一系列铁酸盐纳米颗粒，得到的颗粒在水中有很好的稳定性，高浓度胶体至少5个月内不沉淀，且纳米颗粒粒径分布均匀，合成成本相对低廉。
专利公开号CN103347543A公开了涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒的制备方法和使用其的磁共振成像造影剂，该发明涉及通过用亲水材料涂覆氧化铁纳米颗粒以制备生物相容的氧化铁纳米颗粒的方法，以及包括由此制备的氧化铁纳米颗粒的磁共振成像(MRI)造影剂，所述氧化铁纳米颗粒通过使用盐粒进行退火处理而磁性提高。在亲水材料中，羧甲基葡聚糖(CM-葡聚糖)对稳定退火的氧化铁纳米颗粒和显示对比效果而言是最有效的。
以上发明多是将葡聚糖交联让磁性颗粒镶嵌其中，没有明显的葡聚糖与磁珠之间的键合反应；或者利用醛基葡聚糖作为终产物直接嫁接生物分子等，醛基本身易被氧化，不稳定，不易存放。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于氨基磁珠表面嫁接葡聚糖的羧基磁珠制备方法及其用途，以解决目前羧基磁珠在共价嫁接蛋白时存在的偶联效率低和非特异性吸附高等问题以及拓宽羧基磁珠的应用领域。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法，步骤如下：
（1）醛基葡聚糖的制备：将葡聚糖溶于超纯水中，加入高碘酸钠，在30℃的条件下避光反应2小时，然后用超纯水进行透析纯化，将透析后的溶液真空冷冻干燥，得到醛基葡聚糖；
（2）醛基磁珠的制备：将醛基葡聚糖溶于PBS中，加入到氨基磁珠中，再向氨基磁珠中加入戊二醛，室温避光振荡4小时，利用共价嫁接的方法，使醛基葡聚糖和戊二醛共同嫁接到氨基磁珠表面制得醛基磁珠；
（3）羧基磁珠的制备：将谷氨酸溶于PBS中，加入醛基磁珠中，室温振荡4小时，然后加入硼氢化钠，继续振荡反应2小时，获得羧基磁珠。
所述步骤（1）中葡聚糖分子量为10-70Kda，葡聚糖在超纯水中的浓度为50mg/mL。
所述步骤（1）中葡聚糖以其单糖为单位，高碘酸钠与葡聚糖的摩尔比1：2。
所述步骤（2）中，醛基葡聚糖与戊二醛的质量比为2：1至1:10，优选为1:5。
所述步骤（3）中谷氨酸与醛基磁珠的质量比是1：1。
所述步骤（3）中谷氨酸在PBS中的浓度为5mg/mL。
利用所述的基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法制备得到的涂覆葡聚糖的羧基磁珠共价偶联ProteinA蛋白后，从血浆、血清或腹水中纯化IgG。
本发明的有益效果：本发明方法所制得的羧基磁珠具有以下优点：1、增加了磁珠表面功能团（羧基基团）的密度；2、戊二醛的易反应性和葡聚糖的惰性两者的协同作用降低了磁珠表面的非特异性吸附作用；3、葡聚糖的支链和谷氨酸分子增加了磁珠与表面功能团之间的间隔臂长度，从而使蛋白、核酸、细胞、抗体或者一般化合物等更有效地嫁接到磁珠表面。4、嫁接蛋白、含氨基核酸、抗体等生物分子后的磁珠可用于生物分子富集、生物分离纯化、生物检测、细胞分选、免疫分析及检测等多个领域。5、本发明不仅是在磁珠上键合氧化葡聚糖，并且利用氧化葡聚糖与戊二醛混合形成交联致密的涂覆层，即利用了戊二醛的易反应性又利用了葡聚糖的惰性，两者的协同作用即增加了氨基的覆盖率又降低了磁珠表面的非特异性吸附作用。然后再嫁接谷氨酸从而获得羧基磁珠。这种制备羧基磁珠的方法不仅将葡聚糖更有效地包覆在磁珠表面，同时用谷氨酸延长了磁珠表面与羧基之间的间隔臂，增加了羧基含量，形成的单分散磁珠更有利于下游嫁接生物分子的顺利进行而不影响生物分子的活性，同时磁珠表面羧基密度的提高使嫁接生物分子的效率更高。
附图说明
图1为本发明羧基葡聚糖磁珠合成路线示意图。
图2为实施例1~4制得的ProteinA磁珠从血浆中纯化的IgG的聚丙烯酰胺凝胶电泳（1-实施例1；2-实施例2；3-实施例3；4-实施例4）。
具体实施方式
实施例1
本实施例的羧基磁珠（葡聚糖与戊二醛共同偶联到氨基磁珠）的制备方法如下：
（1）醛基葡聚糖的制备：称取葡聚糖（分子量为70KDa）1g，溶于20mL超纯水中，向溶液加入0.1MNaIO4使其与葡聚糖摩尔比为1：2，30℃避光震荡2小时，获得醛基葡聚糖；用超纯水透析8小时或更长时间以除去未反应的NaIO4，将透析后的溶液真空冷冻干燥，获得白色固体即为醛基葡聚糖，避光于2-8℃冷藏；
（2）将步骤（1）获得的醛基葡聚糖与戊二醛以质量比1:5的比例共同嫁接到氨基磁珠表面制得醛基磁珠，将氨基磁珠充分混匀，这里的氨基磁珠为MagpearLNH2，其平均粒径为1μm，内核为四氧化三铁，外壳为聚乙烯醇，表面有修饰的游离氨基基团（伯胺），吸取1mL（10mg/mL）氨基磁珠，磁分离，用超纯水清洗磁珠2-3次，磁分离，弃去清液，称取醛基葡聚糖20mg，溶于1900μL0.2MPB（PH9.0）中，加入到氨基磁珠中，再向氨基磁珠中加入100μL戊二醛，室温避光震荡4小时，反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于适量PBS（PH7.4）中，即为制备好的醛基磁珠；
（3）羧基磁珠制备：将醛基磁珠磁分离，弃去清液，用超纯水清洗磁珠3次，称取10mg谷氨酸，溶于2mLPBS（PH7.4）中，加入含醛基磁珠的离心管中，室温震荡4小时，然后将磁珠进行磁分离，弃去清液，向磁珠中加入硼氢化钠2mL（5mg/mL，溶入PBS，PH7.4），震荡2小时，反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于1mLPBS（PH7.4）中，即为制备好的羧基磁珠。
本实施例制备得到的羧基磁珠共价偶联蛋白后，从血浆、血清或腹水中纯化IgG：
（a）利用EDC/NHS方法将生物分子共价偶联到羧基磁珠表面：分别称取EDC20mg、NHS2mg，各溶于1mLMES（PH5.0）中，将步骤3制备获得的羧基磁珠磁分离，弃去清液，分别用500μLPBS（PH7.4）清洗磁珠2-3次，弃去清液，把溶好的EDC和NHS分别加入羧基磁珠中，室温震荡1.5小时后，磁分离，弃去清液。称取ProteinA（生物分子以ProteinA为例）1mg，溶于2mLPBS（PH7.4）中，加入到已活化的羧基磁珠中，室温震荡4小时，之后加入2mL1M甘氨酸反应1小时。反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于1mL贮存液（含0.1%BSA、0.02%（v/v）Tween-20、0.05%（w/v）NaN3的PBS（PH7.4））中，即为制备好的ProteinA磁珠（免疫磁珠）；
（b）ProteinA磁珠从血浆中纯化IgG：取1mgProteinA磁珠到新的离心管中，弃去上清，分别用500μLPBS（PH7.4）清洗磁珠2-3次，弃去清液，加入450μLPBS和50μL血浆，涡旋均匀，室温孵育30min，然后磁分离，弃去上清，用加入500μLPBST（含0.02%（v/v）Tween-20的PBS（PH7.4）），涡旋均匀，磁分离，弃上清，重复两次，加入50-100μL0.1M柠檬酸钠（PH3.0），涡旋均匀，室温解离2-3min，磁分离转移上清至已经事先加入10μL1MTris-HcL（PH8.0）的新离心管中。所得溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
实施例2
本实施例的羧基磁珠（使用羧基化葡聚糖氧化实验）的制备方法如下：
（1）葡聚糖羧基化：称取葡聚糖（分子量为70KDa）5g，溶于10g超纯水中，向溶液中加入0.08g硼氢化钠及50%NaOH0.1g,避光不超过25℃搅拌4h，之后加入3.9g50%NaOH及1.24g溴乙酸，室温不超过25℃震荡16h，之后用稀释了一倍的浓盐酸调PH至中性，加入乙醇使二者的比例为1:1，沉淀羧基化的葡聚糖，将沉淀用12mL超纯水溶解，并加入0.04gNaCL，加入乙醇使二者的比例为1:1，沉淀羧基化的葡聚糖，重复上述操作2次，将沉淀溶于12mL超纯水中，加入乙醇沉淀羧基化的葡聚糖，将沉淀于50℃烘干24h，收集，即得羧基化的葡聚糖；
（2）氧化羧酸葡聚糖：称取步骤（1）获得的羧酸葡聚糖1g，溶于20mL超纯水中，向溶液加入0.1MNaIO4使其与葡聚糖摩尔比为1：2，30℃避光震荡2小时，获得醛基葡聚糖；用超纯水透析8小时或更长时间以除去未反应的NaIO4，将透析后的溶液真空冷冻干燥，获得白色固体即为醛基羧酸葡聚糖，避光于2-8℃冷藏；
（3）将步骤（2）获得的醛基羧酸葡聚糖嫁接到氨基磁珠表面制得羧基磁珠：氨基磁珠充分混匀，吸取1mL（10mg/mL）磁珠，磁分离，用超纯水清洗磁珠2-3次，磁分离，弃去清液。称取醛基羧酸葡聚糖，溶于0.2MPB（PH9.0）中，终浓度为20mg/mL，加入2mL到氨基磁珠中，室温避光震荡4小时，然后将磁珠进行磁分离，弃去清液，向磁珠中加入硼氢化钠2mL（5mg/mL，溶入PBS，PH7.4），震荡2小时，反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于1mLPBS（PH7.4）中，即为制备好的羧基磁珠。
本实施例制备得到的羧基磁珠共价偶联蛋白后，从血浆、血清或腹水中纯化IgG：
（a）利用EDC/NHS方法将生物分子共价偶联到羧基磁珠表面：分别称取EDC20mg、NHS2mg，各溶于1mLMES（PH5.0）中，将步骤3制备获得的羧基磁珠磁分离，弃去清液，分别用500μLPBS（PH7.4）清洗磁珠2-3次，弃去清液，把溶好的EDC和NHS分别加入羧基磁珠中，室温震荡1.5小时后，磁分离，弃去清液。称取ProteinA（生物分子以ProteinA为例）1mg，溶于2mLPBS（PH7.4）中，加入到已活化的羧基磁珠中，室温震荡4小时，之后加入2mL1M甘氨酸反应1小时。反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于1mL贮存液（含0.1%BSA、0.02%（v/v）Tween-20、0.05%（w/v）NaN3的PBS（PH7.4））中，即为制备好的ProteinA磁珠（免疫磁珠），可用于从血浆、血清或腹水中等纯化IgG；
（b）ProteinA磁珠从血浆中纯化IgG：取1mgProteinA磁珠到新的离心管中，弃去上清，分别用500μLPBS（PH7.4）清洗磁珠2-3次，弃去清液，加入450μLPBS和50μL血浆，涡旋均匀，室温孵育30min，然后磁分离，弃去上清，用加入500μLPBST，涡旋均匀，磁分离，弃上清，重复两次，加入50-100μL0.1M柠檬酸钠（PH3.0），涡旋均匀，室温解离2-3min，磁分离转移上清至已经事先加入10μL1MTris-HcL（PH8.0）的新离心管中。所得溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
实施例3
本实施例的羧基磁珠（醛基葡聚糖单独嫁接到氨基磁珠上）的制备方法，步骤如下：
（1）氧化葡聚糖：称取葡聚糖（分子量为70KDa）1g，溶于20mL超纯水中，向溶液加入0.1MNaIO4使其与葡聚糖摩尔比为1：2，30℃避光震荡2小时，获得醛基葡聚糖；用超纯水透析8小时或更长时间以除去未反应的NaIO4，将透析后的溶液真空冷冻干燥，获得白色固体即为醛基葡聚糖，避光于2-8℃冷藏；
（2）将步骤（1）获得的醛基葡聚糖嫁接到氨基磁珠表面制得醛基磁珠：氨基磁珠充分混匀，吸取1mL（10mg/mL）磁珠，磁分离，用超纯水清洗磁珠2-3次，磁分离，弃去清液。称取醛基葡聚糖，溶于0.2MPB（PH9.0）中，终浓度为20mg/mL，加入2mL到氨基磁珠中，室温避光震荡4小时，反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于适量PBS（PH7.4）中，即为制备好的醛基磁珠；
（3）羧基磁珠制备：将醛基磁珠磁分离，弃去清液，用超纯水清洗磁珠3次，称取10mg谷氨酸，溶于2mLPBS（PH7.4）中，加入含醛基磁珠的离心管中，室温震荡4小时，然后将磁珠进行磁分离，弃去清液，向磁珠中加入硼氢化钠2mL（5mg/mL，溶入PBS，PH7.4），震荡2小时，反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于1mLPBS（PH7.4）中，即为制备好的羧基磁珠。
本实施例制备得到的羧基磁珠共价偶联蛋白后，从血浆、血清或腹水中纯化IgG：
（a）利用EDC/NHS方法将生物分子共价偶联到羧基磁珠表面：分别称取EDC20mg、NHS2mg，各溶于1mLMES（PH5.0）中，将步骤（3）制备获得的羧基磁珠磁分离，弃去清液，分别用500μLPBS（PH7.4）清洗磁珠2-3次，弃去清液，把溶好的EDC和NHS分别加入羧基磁珠中，室温震荡1.5小时后，磁分离，弃去清液。称取ProteinA（生物分子以ProteinA为例）1mg，溶于2mLPBS（PH7.4）中，加入到已活化的羧基磁珠中，室温震荡4小时，之后加入2mL1M甘氨酸反应1小时。反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于1mL贮存液（含0.1%BSA、0.02%（v/v）Tween-20、0.05%（w/v）NaN3的PBS（PH7.4））中，即为制备好的ProteinA磁珠（免疫磁珠）；
（b）ProteinA磁珠从血浆中纯化IgG：取1mgProteinA磁珠到新的离心管中，弃去上清，分别用500μLPBS（PH7.4）清洗磁珠2-3次，弃去清液，加入450μLPBS和50μL血浆，涡旋均匀，室温孵育30min，然后磁分离，弃去上清，用加入500μLPBST，涡旋均匀，磁分离，弃上清，重复两次，加入50-100μL0.1M柠檬酸钠（PH3.0），涡旋均匀，室温解离2-3min，磁分离转移上清至已经事先加入10μL1MTris-HcL（PH8.0）的新离心管中。所得溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
实施例4
未涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法，步骤如下：
将环氧基磁珠充分混匀，吸取1mL（10mg/mL）磁珠，磁分离，用超纯水清洗磁珠2-3次，磁分离，弃去清液。称取6-氨基己酸10mg，溶于2mL0.1MNaOH中，加入到环氧基磁珠中，35℃震荡8小时，反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于1mL贮存液（含0.1%BSA、0.02%（v/v）Tween-20、0.05%（w/v）NaN3的PBS（PH7.4））中，即为制备好的羧基磁珠。
本实施例的未涂覆葡聚糖的羧基磁珠共价偶联蛋白后，从血浆、血清或腹水中纯化IgG：
（a）利用EDC/NHS方法将生物分子共价偶联到羧基磁珠表面：分别称取EDC20mg、NHS2mg，各溶于1mLMES（PH5.0）中，将步骤1制备获得的羧基磁珠磁分离，弃去清液，分别用500μLPBS（PH7.4）清洗磁珠2-3次，弃去清液，把溶好的EDC和NHS分别加入羧基磁珠中，室温震荡1.5小时后，磁分离，弃去清液。称取ProteinA（生物分子以ProteinA为例）1mg，溶于2mLPBS（PH7.4）中，加入到已活化的羧基磁珠中，室温震荡4小时。反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于1mL贮存液（含0.1%BSA、0.02%（v/v）Tween-20、0.05%（w/v）NaN3的PBS（PH7.4））中，即为制备好的ProteinA磁珠（免疫磁珠），可用于从血浆、血清或腹水中等纯化IgG；
（b）ProteinA磁珠从血浆中纯化IgG：取1mgProteinA磁珠到新的离心管中，弃去上清，分别用500μLPBS（PH7.4）清洗磁珠2-3次，弃去清液，加入450μLPBS和50μL血浆，涡旋均匀，室温孵育30min，然后磁分离，弃去上清，用加入500μLPBST，涡旋均匀，磁分离，弃上清，重复两次，加入50-100μL0.1M柠檬酸钠（PH3.0），涡旋均匀，室温解离2-3min，磁分离转移上清至已经事先加入10μL1MTris-HcL（PH8.0）的新离心管中。所得溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
如图2所示，实验结果表明，不同的嫁接方案，嫁接的ProteinA提取IgG的能力是不同的，实验结果从好到坏等顺序是：实施例1-实施例2-实施例3-实施例4（标注泳道1，2，3，4分别对应实施例1，实施例2，实施例3，实施例4）。
利用甲苯胺蓝（TBO）法检测羧基密度：根据1moLTBO结合1moL羧基基团的原理推算羧基密度，结果如表1所示。
表1实施例1~4制备得到的羧基磁珠中羧基密度测定结果
名称 OD值 稀释倍数 羧基密度(μmoL/g)
实施例1磁珠 1.2202 15 152
实施例2磁珠 0.9975 15 123
实施例3磁珠 0.8206 15 100
实施例4磁珠 0.7194 15 87
由表1的数据可以看出，实施例一得到的羧基磁珠的羧基密度要高于其他实施例所得到羧基磁珠的羧基密度，实施例一所得到的羧基磁珠是在偶联了葡聚糖后又嫁接了谷氨酸，其羧基基团与磁珠之间的间隔臂也长于其他实施例所得到的羧基磁珠，以上优势奠定了该羧基磁珠在进行生物分子嫁接时能有更高的键合量以及为生物分子发挥其活性提供了充足的空间。
图2分别是实施例1~4所得到的羧基磁珠分别嫁接了ProteinA后，从相同的血浆中所提取IgG的量。由图可以看出泳道1的IgG量高于2、3和4，且4的非特异性吸附很多，目的抗体少。
表1和图2展示的结果反应出，葡聚糖与戊二醛包覆在磁珠表面不仅改善了一般羧基磁珠表面的非特异性吸附作用，同时也提高了磁珠上的羧基密度，使得羧基磁珠嫁接生物分子的效率更高，从而提取更高量的抗体。
实施例5
本实施例的基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法，步骤如下：
（1）醛基葡聚糖的制备：分别称取不同分子量（分子量分别为10kd，40kd和70KDa）的葡聚糖各1g，分别溶于20mL超纯水中，分别向溶液加入0.1MNaIO4使其与葡聚糖摩尔比为1：2，30℃避光震荡2小时，获得3种（10kd，40kd和70kd）醛基葡聚糖；用超纯水透析8小时或更长时间以除去未反应的NaIO4，将透析后的溶液真空冷冻干燥，获得白色固体即为醛基葡聚糖，避光于2-8℃冷藏；
（2）将步骤（1）获得的3种醛基葡聚糖分别与戊二醛以质量比1:5的比例共同嫁接到氨基磁珠表面制得醛基磁珠，将氨基磁珠充分混匀，这里的氨基磁珠为MagpearLNH2，其平均粒径为1μm，内核为四氧化三铁，外壳为聚乙烯醇，表面有修饰的游离氨基基团（伯胺），吸取1mL（10mg/mL）氨基磁珠，磁分离，用超纯水清洗磁珠2-3次，磁分离，弃去清液，称取醛基葡聚糖20mg，溶于1900μL0.2MPB（PH9.0）中，加入到氨基磁珠中，再向氨基磁珠中加入100μL戊二醛，室温避光震荡4小时，反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于适量PBS（PH7.4）中，即为制备好的醛基磁珠；
（3）羧基磁珠制备：将3种醛基磁珠磁分离，弃去清液，分别用超纯水清洗磁珠3次，称取10mg谷氨酸，溶于2mLPBS（PH7.4）中，分别加入含醛基磁珠的离心管中，室温震荡4小时，然后将磁珠进行磁分离，弃去清液，分别向3种磁珠中加入硼氢化钠2mL（5mg/mL，溶入PBS，PH7.4），震荡2小时，反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，分别将磁珠悬浮于1mLPBS（PH7.4）中，即为制备好的3种羧基磁珠。
实施例6
本实施例的羧基磁珠（葡聚糖与戊二醛以质量比为2:1的比例共同偶联到氨基磁珠）的制备方法如下：
（1）醛基葡聚糖的制备：称取葡聚糖（分子量为70KDa）1g，溶于20mL超纯水中，向溶液加入0.1MNaIO4使其与葡聚糖摩尔比为1：2，30℃避光震荡2小时，获得醛基葡聚糖；用超纯水透析8小时或更长时间以除去未反应的NaIO4，将透析后的溶液真空冷冻干燥，获得白色固体即为醛基葡聚糖，避光于2-8℃冷藏；
（2）将步骤（1）获得的醛基葡聚糖与戊二醛以质量比2:1的比例共同嫁接到氨基磁珠表面制得醛基磁珠，将氨基磁珠充分混匀，这里的氨基磁珠为MagpearLNH2，其平均粒径为1μm，内核为四氧化三铁，外壳为聚乙烯醇，表面有修饰的游离氨基基团（伯胺），吸取1mL（10mg/mL）氨基磁珠，磁分离，用超纯水清洗磁珠2-3次，磁分离，弃去清液，称取醛基葡聚糖20mg，溶于1900μL0.2MPB（PH9.0）中，加入到氨基磁珠中，再向氨基磁珠中加入100μL戊二醛，室温避光震荡4小时，反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于适量PBS（PH7.4）中，即为制备好的醛基磁珠；
（3）羧基磁珠制备：将醛基磁珠磁分离，弃去清液，用超纯水清洗磁珠3次，称取10mg谷氨酸，溶于2mLPBS（PH7.4）中，加入含醛基磁珠的离心管中，室温震荡4小时，然后将磁珠进行磁分离，弃去清液，向磁珠中加入硼氢化钠2mL（5mg/mL，溶入PBS，PH7.4），震荡2小时，反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于1mLPBS（PH7.4）中，即为制备好的羧基磁珠。
实施例7
本实施例的羧基磁珠（葡聚糖与戊二醛以质量比为1:2的比例共同偶联到氨基磁珠）的制备方法如下：
（1）醛基葡聚糖的制备：称取葡聚糖（分子量为70KDa）1g，溶于20mL超纯水中，向溶液加入0.1MNaIO4使其与葡聚糖摩尔比为1：2，30℃避光震荡2小时，获得醛基葡聚糖；用超纯水透析8小时或更长时间以除去未反应的NaIO4，将透析后的溶液真空冷冻干燥，获得白色固体即为醛基葡聚糖，避光于冰箱冷藏；
（2）将步骤（1）获得的醛基葡聚糖与戊二醛以质量比1:2的比例共同嫁接到氨基磁珠表面制得醛基磁珠，将氨基磁珠充分混匀，这里的氨基磁珠为MagpearLNH2，其平均粒径为1μm，内核为四氧化三铁，外壳为聚乙烯醇，表面有修饰的游离氨基基团（伯胺），吸取1mL（10mg/mL）氨基磁珠，磁分离，用超纯水清洗磁珠2-3次，磁分离，弃去清液，称取醛基葡聚糖20mg，溶于1900μL0.2MPB（PH9.0）中，加入到氨基磁珠中，再向氨基磁珠中加入100μL戊二醛，室温避光震荡4小时，反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于适量PBS（PH7.4）中，即为制备好的醛基磁珠；
（3）羧基磁珠制备：将醛基磁珠磁分离，弃去清液，用超纯水清洗磁珠3次，称取10mg谷氨酸，溶于2mLPBS（PH7.4）中，加入含醛基磁珠的离心管中，室温震荡4小时，然后将磁珠进行磁分离，弃去清液，向磁珠中加入硼氢化钠2mL（5mg/mL，溶入PBS，PH7.4），震荡2小时，反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于1mLPBS（PH7.4）中，即为制备好的羧基磁珠。
实施例8
本实施例的羧基磁珠（葡聚糖与戊二醛以质量比为2:1的比例共同偶联到氨基磁珠）的制备方法如下：
（1）醛基葡聚糖的制备：称取葡聚糖（分子量为70KDa）1g，溶于20mL超纯水中，向溶液加入0.1MNaIO4使其与葡聚糖摩尔比为1：2，30℃避光震荡2小时，获得醛基葡聚糖；用超纯水透析8小时或更长时间以除去未反应的NaIO4，将透析后的溶液真空冷冻干燥，获得白色固体即为醛基葡聚糖，避光于2-8℃冷藏；
（2）将步骤（1）获得的醛基葡聚糖与戊二醛以质量比2:1的比例共同嫁接到氨基磁珠表面制得醛基磁珠，将氨基磁珠充分混匀，这里的氨基磁珠为MagpearLNH2，其平均粒径为1μm，内核为四氧化三铁，外壳为聚乙烯醇，表面有修饰的游离氨基基团（伯胺），吸取1mL（10mg/mL）氨基磁珠，磁分离，用超纯水清洗磁珠2-3次，磁分离，弃去清液，称取醛基葡聚糖20mg，溶于1900μL0.2MPB（PH9.0）中，加入到氨基磁珠中，再向氨基磁珠中加入100μL戊二醛，室温避光震荡4小时，反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于适量PBS（PH7.4）中，即为制备好的醛基磁珠；
（3）羧基磁珠制备：将醛基磁珠磁分离，弃去清液，用超纯水清洗磁珠3次，称取10mg谷氨酸，溶于2mLPBS（PH7.4）中，加入含醛基磁珠的离心管中，室温震荡4小时，然后将磁珠进行磁分离，弃去清液，向磁珠中加入硼氢化钠2mL（5mg/mL，溶入PBS，PH7.4），震荡2小时，反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于1mLPBS（PH7.4）中，即为制备好的羧基磁珠。
实施例9
本实施例的羧基磁珠（葡聚糖与戊二醛以质量比为1:10的比例共同偶联到氨基磁珠）的制备方法如下：
（1）醛基葡聚糖的制备：称取葡聚糖（分子量为70KDa）1g，溶于20mL超纯水中，向溶液加入0.1MNaIO4使其与葡聚糖摩尔比为1：2，30℃避光震荡2小时，获得醛基葡聚糖；用超纯水透析8小时或更长时间以除去未反应的NaIO4，将透析后的溶液真空冷冻干燥，获得白色固体即为醛基葡聚糖，避光于冰箱冷藏；
（2）将步骤（1）获得的醛基葡聚糖与戊二醛以质量比1:10的比例共同嫁接到氨基磁珠表面制得醛基磁珠，将氨基磁珠充分混匀，这里的氨基磁珠为MagpearLNH2，其平均粒径为1μm，内核为四氧化三铁，外壳为聚乙烯醇，表面有修饰的游离氨基基团（伯胺），吸取1mL（10mg/mL）氨基磁珠，磁分离，用超纯水清洗磁珠2-3次，磁分离，弃去清液，称取醛基葡聚糖20mg，溶于1900μL0.2MPB（PH9.0）中，加入到氨基磁珠中，再向氨基磁珠中加入100μL戊二醛，室温避光震荡4小时，反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于适量PBS（PH7.4）中，即为制备好的醛基磁珠；
（3）羧基磁珠制备：将醛基磁珠磁分离，弃去清液，用超纯水清洗磁珠3次，称取10mg谷氨酸，溶于2mLPBS（PH7.4）中，加入含醛基磁珠的离心管中，室温震荡4小时，然后将磁珠进行磁分离，弃去清液，向磁珠中加入硼氢化钠2mL（5mg/mL，溶入PBS，PH7.4），震荡2小时，反应结束后用PBS（PH7.4）淋洗磁珠3次，将磁珠悬浮于1mLPBS（PH7.4）中，即为制备好的羧基磁珠。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）醛基葡聚糖的制备：将葡聚糖溶于超纯水中，加入高碘酸钠，在30℃的条件下避光反应2小时，然后用超纯水进行透析纯化，将透析后的溶液真空冷冻干燥，得到醛基葡聚糖；
（2）醛基磁珠的制备：将醛基葡聚糖溶于PBS中，加入到氨基磁珠中，再向氨基磁珠中加入戊二醛，室温避光振荡4小时，利用共价嫁接的方法，使醛基葡聚糖和戊二醛共同嫁接到氨基磁珠表面制得醛基磁珠；
（3）羧基磁珠的制备：将谷氨酸溶于PBS中，加入醛基磁珠中，室温振荡4小时，然后加入硼氢化钠，继续振荡反应2小时，获得羧基磁珠。
2.根据权利要求1所述的基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中葡聚糖分子量为10-70Kda，葡聚糖在超纯水中的浓度为50mg/mL。
3.根据权利要求1所述的基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中葡聚糖以其单糖为单位，高碘酸钠与葡聚糖的摩尔比1：2。
4.根据权利要求1所述的基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，醛基葡聚糖与戊二醛的质量比为2：1至1:10。
5.根据权利要求1所述的基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中谷氨酸与醛基磁珠的质量比是1：1。
6.根据权利要求1所述的基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中谷氨酸在PBS中的浓度为5mg/mL。
7.利用权利要求1~6任一所述的基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法制备得到的涂覆葡聚糖的羧基磁珠共价偶联ProteinA蛋白后，从血浆、血清或腹水中纯化IgG。
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