CN112569364A - 一种β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种β‑葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒及其制备方法和应用。一种β‑葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒，为表面偶联β‑葡聚糖的超顺磁纳米氧化铁颗粒。本发明基于SPIO纳米颗粒本身特性，将β‑葡聚糖和SPIO偶联形成新纳米颗粒，既可以通过磁共振成像技术对肿瘤进行诊断，又可以增强到达肿瘤部位的纳米颗粒对肿瘤细胞的杀伤作用，同时，到达其他部位的纳米颗粒对健康细胞没有显著的细胞毒性。本发明通过实验发现BSNPs能够活化巨噬细胞、促进肿瘤相关巨噬细胞向M1型极化，并缓解小鼠黑色素瘤，具有较大治疗黑色素瘤的潜力。

Description

一种β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是人类的头号杀手，被称为万疾之王，尽管近十年来新增了很多针对肿瘤治疗的方案，但并非所有的患者都能适用，即使是当下热门的肿瘤免疫疗法，也有治疗时间长、费用昂贵、不良反应严重等缺点。因此，迫切需要探寻更安全、有效的治疗方法和新的辅助治疗策略。
已有文献表明β-葡聚糖具有良好的抗肿瘤活性，口服β-葡聚糖能够缓解小鼠肉瘤，包括缩小肿瘤体积、降低肿瘤重量、促进肿瘤细胞凋亡等[1]。口服β-葡聚糖能够缓解大鼠乳腺癌，通过活化FOXO3通路促进肿瘤细胞凋亡[2]。此外，也有文献表明β-葡聚糖通过下调原癌基因c-Maf影响巨噬细胞分化功能基因CSF1R的表达，从而影响巨噬细胞极化[3]；腹腔注射β-葡聚糖通过促进肿瘤相关巨噬细胞向M1型极化从而缓解小鼠结肠癌[4]。尽管口服、腹腔注射、静脉注射都是β-葡聚糖常见的给药方式，但是药代动力学研究表明不同的给药方式会影响β-葡聚糖在不同组织器官的浓度，从而影响其生物学功能。那么，如何安全、有效的利用β-葡聚糖显得尤为重要。
磁共振成像技术是临床上常用的疾病诊断方法，其基本原理在于，使用特定频率的射频脉冲激发氢原子核，使其从基态变为激发态，停止射频脉冲后，激发态的氢原子核发生弛豫释放能量恢复基态，通过磁场辅助定位人体内的氢原子核，通过仪器检测弛豫状态并采集弛豫时间，经过特殊算法处理重现人体内部影像。根据影像中明暗比例、形状等信号可反映脑、肝、软骨、肌肉、韧带等等各个组织脏器的生理结构或病理变化，而造影剂可以通过对氢原子核弛豫时间的改变，可以提高核磁共振成像的对比度，使得图像明暗变化更为清晰，通过调整算法使肿瘤组织与健康人体组织的图像纹理差异更大，从而有利于发现体积较小、与正常组织脏器解剖结构完全不同的肿瘤因此,作为磁共振成像造影剂的物质并不一定具备肿瘤靶向性.
超顺磁纳米氧化铁(Superparamagnetic iron oxides,SPIO)是粒径在纳米级别的磁性纳米颗粒，在20世纪80年代SPIO就已经作为造影剂出现[5,6]。但SPIO作为显影剂并未见其具有肿瘤靶向性的相关报道。SPIO作为造影剂，其造影原理在于：注射进入人体后，可以快速分布到全身各组织，在核磁共振仪发射具有空间位置依赖性的梯度磁场并通过计算机软件经过特殊算法将采集的信号转化为影像，以此区别正常组织和肿瘤。SPIO不能特异性富集到肿瘤部位，SPIO作为造影剂只有结合核磁共振仪才能发挥辅助诊断作用，不经过特殊处理(包括尺寸、形状、修饰等)不具备抗肿瘤作用。
尽管合成SPIO时常使用羧甲基聚葡萄糖成壳包裹铁核，但羧甲基聚葡萄糖并不具有良好的生物学活性，我们前期的实验结果也显示单独SPIO没有抗肿瘤功能[7]。具有良好生物学活性的β-葡聚糖由于其分子构象不适合成壳因而不能直接用于合成纳米氧化铁。本发明还发现简单混合使用β-葡聚糖和SPIO疗效也不理想。
[1]Mo L,Chen Y,Li W,et al.Anti-tumor effects of(1→3)-β-d-glucan fromSaccharomyces cerevisiae in S180 tumor-bearing mice[J].International Journalof Biological Macromolecules,2017,95:385-392.
[2]Geraldelli D,Ribeiro M C,Medeiros T C,et al.Botryosphaeran,a(1→3)(1→6)-β-D-glucan,reduces tumor development and cachexia syndrome in obesemale rats by increasing insulin sensitivity and FOXO3a activity[J].International Journal of Biological Macromolecules,2020,165:985-994.
[3]Garcia J R C,Rodriguez P C.c-Maf:a bad influence in the educationof macrophages[J].J Clin Invest,2020,130(4):1629-1631.
[4]Cheng H,Sun L,Shen D,et al.Beta-1,6glucan converts tumor-associated macrophages into an M1-like phenotype[J].Carbohydr Polym.2020,247:116715.
[5]Dias M H M,Lauterbur P C.Ferromagnetic particles as contrastagents for magnetic resonance imaging of liver and spleen[J].MagneticResonance in Medicine,1986,3(2):328-330.
[6]Zheng B,Vazin T,Goodwill P W,et al.Magnetic Particle Imagingtracks the long-term fate of in vivo neural cell implants with high imagecontrast[J].Scientific Reports,2015,5:14055.
[7]Zhao J,Zhang Z,Xue Y,et al.Anti-tumor macrophages activated byferumoxytol combined or surface-functionalized with the TLR3 agonist poly(I:C)promote melanoma regression[J].Theranostics,2018,8(22):6307-6321.
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒。
本发明的另一目的是提供该β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒的制备方法。
本发明的又一目的是提供该β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒，为表面偶联β-葡聚糖的超顺磁纳米氧化铁颗粒。
作为本发明的一种优选，所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒是β-葡聚糖和超顺磁纳米氧化铁壳上的羧基在EDC的催化下耦合反应制得；其中β-葡聚糖和超顺磁纳米氧化铁的质量比为1-3:5。
本发明所述的β-葡聚糖的来源可为燕麦、酵母、解纤维热酸菌等，SPIO可为商品或自制纳米材料，只要外壳为羧甲基聚葡萄糖即可
作为本发明的进一步优选，所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒通过以下方法制备得到：
1)取超顺磁纳米氧化铁溶于双蒸水中，加EDC，混合均匀，加β-葡聚糖，容器封口后25-28℃搅拌14-20小时，搅拌速度为600-800rpm；
2)将步骤(1)所得溶液浓缩后加无水乙醇混合均匀，静置产生棕色沉淀；
3)分离出沉淀，于25-37℃静置10-20分钟以挥干剩余的乙醇；
4)用水重悬，配置需要浓度的溶液，超声处理15-30min以充分分散纳米颗粒，即得到所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒；
或者，其中的步骤2)和3)替换为：
2)将步骤1)所得溶液使用100000kDa分子量透析袋在100倍体积的双蒸水中透析2天，期间至少更换4次透析液；
3)取透析袋中的液体冻干成粉。
作为本发明的更进一步优选，所述的β-葡聚糖的浓度为0.2-0.6mg/mL，超顺磁纳米氧化铁的浓度为1mg/mL，EDC的浓度为1-1.5mg/mL。
本发明所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒的制备方法，利用EDC作为催化剂催化β-葡聚糖与超顺磁纳米氧化铁壳上的羧基反应从而将β-葡聚糖偶联到超顺磁纳米氧化铁壳上；其中β-葡聚糖和超顺磁纳米氧化铁的质量比为1-3:5。
作为本发明的一种优选，所述的制备方法包含以下步骤：
1)取超顺磁纳米氧化铁溶于双蒸水中，加EDC，混合均匀，加β-葡聚糖，容器封口后25-28℃搅拌14-20小时，搅拌速度为600-800rpm；
2)将步骤(1)所得溶液浓缩后加无水乙醇混合均匀，静置产生棕色沉淀；
3)分离出沉淀，于25-37℃静置10-20分钟以挥干剩余的乙醇；
4)用水重悬，配置需要浓度的溶液，超声处理15-30min以充分分散纳米颗粒，即得到所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒；
或者，其中的步骤2)和3)替换为：
2)将步骤1)所得溶液使用100000kDa分子量透析袋在100倍体积的双蒸水中透析2天，期间至少更换4次透析液；
3)取透析袋中的液体冻干成粉。
作为本发明的进一步优选，所述的β-葡聚糖的浓度为0.2-0.6mg/mL，超顺磁纳米氧化铁的浓度为1mg/mL，EDC的浓度为1-1.5mg/mL。
本发明所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用，优选在制备具备肿瘤诊断和治疗双重功能的药物中的应用；进一步优选在制备具备黑色素瘤诊断和治疗双重功能的药物中的应用。
一种药物组合物，包含本发明所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒和药学上允许的载体。
有益效果：
本发明基于SPIO纳米颗粒本身特性，将β-葡聚糖和SPIO偶联形成新纳米颗粒，既可以通过磁共振成像技术对肿瘤进行诊断，又可以增强到达肿瘤部位的纳米颗粒对肿瘤细胞的杀伤作用，同时，到达其他部位的纳米颗粒对健康细胞没有显著的细胞毒性。本发明通过实验发现BSNPs能够活化巨噬细胞、促进肿瘤相关巨噬细胞向M1型极化，并缓解小鼠黑色素瘤，具有较大治疗黑色素瘤的潜力。
附图说明
图1.BSNPs表征
A为BSNPs水合粒径分布，B为BSNPs的Zeta电位，C为使用电子显微镜拍摄的BSNPs颗粒形态
图2.小鼠磁共振成像结果
图3.BSNPs对小鼠黑色素瘤的作用
A为生存曲线，B为肿瘤体积变化情况，C为小鼠体重变化情况，D为小鼠肿瘤重量变化情况
图4流式细胞术检测分析巨噬细胞上CD68(M1型巨噬细胞表面标志)和CD206(M2型巨噬细胞表面标志)的荧光强度
A为M1型巨噬细胞表面标志极化情况，B为M2型巨噬细胞表面标志极化情况
具体实施方式
实施例1
1.1原料：
β-葡聚糖(CAS:9041-22-9)、超顺磁纳米氧化铁(Superparamagnetic ironoxides,SPIO)、1-乙基-3-(3-二甲氨基)-碳二亚胺(EDC)。
1.2合成步骤：
1)取20mg SPIO溶于含有20mL双蒸水的玻璃锥形瓶中，加23mg EDC，室温搅拌5-10分钟，加4或8mgβ-葡聚糖，容器封口后室温搅拌过夜(14-20小时)，搅拌速度为800rpm；
2)将步骤(1)所得溶液浓缩至1mL左右；
3)将步骤(2)所得浓缩液加4倍体积无水乙醇混合均匀，此时溶液应为棕色混悬液，静置有棕色沉淀；
4)以12000rpm离心15分钟，离心结束时应有紧实的沉淀，上清无色透明；
5)弃上清，于室温或37℃静置10-20分钟以挥干剩余的乙醇；
6)用水重悬，配置需要浓度的溶液，超声处理20min以充分分散纳米颗粒，即得到β-葡聚糖偶联SPIO纳米颗粒(β-glucan-SPIO nano-particles,BSNPs)。
1.3BSNPs表征：
1.3.1纳米颗粒水合粒径检测：
取适量BSNPs溶于双蒸水中，配置成1mg/mL的溶液，置于动态光散射粒径分析仪配套样品槽中，上机检测，BSNPs平均水合粒径约为29nm。
1.3.2纳米颗粒Zeta电位检测：
取适量BSNPs溶于双蒸水中，配置成1mg/mL的溶液，置于Zeta纳米粒度电位仪配套样品槽中，插入电极，选择Zeta电位检测程序后上机检测，BSNPs平均Zeta电位为-31至-35mV。
1.3.3电子显微镜拍摄：
取适量BSNPs溶于双蒸水中，配置成20mg/mL的溶液，送样至南京大学现代分析中心检测，拍摄纳米颗粒形态照片。
使用动态光散射粒径分析仪分析BSNPs纳米材料粒径及Zeta电位，并使用电子显微镜拍摄BSNPs颗粒形态。结果显示BSNPs水合粒径约为29nm(图1A)，比SPIO水合粒径稍大一些，Zeta电位约为-34mV(图1B)，形态为球形(图1C)。
实施例2BSNPs生物学活性检测：
2.1细胞培养：
选取小鼠黑色素瘤细胞B16F10(购自中国科学院细胞库)细胞，将细胞培养于含10％胎牛血清和1％双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基(均购自上海基峰生物科技有限公司)中，37℃，5％CO2培养。待细胞长至80-90％汇合度时传代，用胰蛋白酶消化液室温消化半分钟后用培养基反复吹打，制备成细胞悬液，取适量铺到相应的培养皿进行传代，或铺至细胞培养板进行后续实验，每天用倒置显微镜观察细胞形态及其生长情况。
2.2动物模型验证BSNPs对黑色素瘤的治疗作用：
1)取2.1中制备得到的吹打均匀的小鼠黑色素瘤细胞B16F10的细胞悬液50μL，移至Countstar细胞计数板中，使用Countstar细胞计数仪进行细胞计数；
2)取足够量的细胞置于50mL离心管中，使用磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)补至50mL，1500rpm离心5min；
3)弃上清，使用2mL PBS重悬细胞，并再次加PBS补至50mL，1500rpm离心5min；
4)弃上清，根据步骤(1)所得细胞数，加适量PBS重悬细胞，配置成终浓度为2.5×106个/mL的细胞悬液；
5)每只鼠取200μL步骤(4)中所得细胞悬液，即5×105个B16F10细胞，经皮下注射构建小鼠黑色素瘤模型；
6)注射肿瘤细胞14天后，肿瘤体积约为100mm3时，隔日尾静脉注射生理盐水(Control)200μL/只、β-葡聚糖(BG)40μg/只、β-葡聚糖和SPIO的混合液(BG+SPIO，β-葡聚糖40μg/只与SPIO 200μg/只)或者BSNPs(实验采用β-葡聚糖和SPIO比例为1:5制备而得的BSNPs)200μg/只，隔日注射一次，并记录小鼠体重、肿瘤体积变化；
7)注射肿瘤16天后，注射BSNPs 24h时麻醉小鼠，于磁共振成像仪下进行活体检测，拍摄肿瘤部位成像照片；
8)注射肿瘤细胞26天时，称重后处死小鼠，取肿瘤组织称重。
小鼠磁共振成像结果显示，BSNPs组和BG+SPIO组小鼠磁共振成像均更清晰，两组之间并未有显著差异(图2)，可见，本发明制备的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁(BSNPs)仍可以作为MRI肿瘤诊断的工具。生存曲线显示BSNPs组小鼠生存率显著提高(图3A)、肿瘤体积增长缓慢(图3B)、小鼠体重不受影响(图3C)，26日时统一处死小鼠，剥离瘤体并称重，结果显示，BSNPs组小鼠肿瘤重量显著降低，明显低于混合液组(图3D)，可见，本发明制备的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁(BSNPs)较之单独使用β-葡聚糖、β-葡聚糖和SPIO的混合液能显著缓解小鼠黑色素瘤。
2.3动物模型验证BSNPs对巨噬细胞极化的影响：
1)取4.3.2中步骤(7)所述肿瘤组织，使用眼科剪尽量剪取相同大小的组织块；
2)将组织块置于12孔板中，使用5mL注射器尾部研磨组织块，制备组织匀浆；
3)组织匀浆过200目滤布以除去未磨碎的组织，滤液滤至流式管中；
4)4℃，1500rpm离心5min；
5)弃上清，使用1mL ACK红细胞裂解液重悬细胞，室温静置1min；
6)加3mL PBS终止裂解，4℃，1500rpm离心5min；
7)弃上清，使用1mL PBS重悬细胞，再次过200目滤布以除去粘连的细胞团块，滤液滤至新流式管中；
8)同4.3.2步骤(1)所述进行细胞计数，调整细胞密度至1-5×106个/管；
9)4℃，1500rpm离心5min；
10)弃上清，按照说明书要求使用PBS稀释小鼠CD11b、F4/80、CD86和CD206的流式抗体至合适浓度，每管100μL，涡旋混匀后4℃避光孵育15min；
11)每管加1mL PBS，涡旋混匀；
12)4℃，1500rpm离心5min；
13)弃上清，并用200μL PBS重悬细胞，涡旋混匀后使用流式细胞仪检测；
14)检测结束后，使用Flow Jo软件分析检测巨噬细胞(CD11b+，F4/80+细胞群)上CD68(M1
型巨噬细胞表面标志)和CD206(M2型巨噬细胞表面标志)的荧光强度。
结果显示，BSNPs组肿瘤相关巨噬细胞向M1型极化增高最为显著(图4A)，M2型极化基本不变(图4B)，可见β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁(BSNPs)较之单独使用β-葡聚糖、β-葡聚糖和SPIO的混合液能显著促进肿瘤相关巨噬细胞向M1型极化。

Claims (10)

1.一种β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒，其特征在于为表面偶联β-葡聚糖的超顺磁纳米氧化铁颗粒。
2.根据权利要求1所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒，其特征在于所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒是β-葡聚糖和超顺磁纳米氧化铁壳上的羧基在EDC的催化下耦合反应制得；其中β-葡聚糖和超顺磁纳米氧化铁的质量比为(1-3):5。
3.根据权利要求1所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒，其特征在于所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒通过以下方法制备得到：
1)取超顺磁纳米氧化铁溶于双蒸水中，加EDC，混合均匀，加β-葡聚糖，容器封口后25-28℃搅拌14-20小时，搅拌速度为600-800rpm；
2)将步骤1)所得溶液浓缩后加无水乙醇混合均匀，静置产生棕色沉淀；
3)分离出沉淀，于25-37℃静置10-20分钟以挥干剩余的乙醇；
4)用水重悬，配置需要浓度的溶液，超声处理15-30min以充分分散纳米颗粒，即得到所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒；
或者，其中的步骤2)和3)替换为以下步骤：
2)将步骤1)所得溶液使用100000kDa分子量透析袋在100倍体积的双蒸水中透析2天，期间至少更换4次透析液；
3)取透析袋中的液体冻干成粉。
4.根据权利要求3所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒，其特征在于步骤1)的反应体系中β-葡聚糖的浓度为0.2-0.6mg/mL，超顺磁纳米氧化铁的浓度为1mg/mL，EDC的浓度为1-1.5mg/mL。
5.权利要求1所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒的制备方法，其特征在于利用EDC作为催化剂催化β-葡聚糖与超顺磁纳米氧化铁壳上的羧基反应从而将β-葡聚糖偶联到超顺磁纳米氧化铁壳上；其中β-葡聚糖和超顺磁纳米氧化铁的质量比为1-3:5。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的制备方法包含以下步骤：
1)取超顺磁纳米氧化铁溶于双蒸水中，加EDC，混合均匀，加β-葡聚糖，容器封口后25-28℃搅拌14-20小时，搅拌速度为600-800rpm；
2)将步骤(1)所得溶液浓缩后加无水乙醇混合均匀，静置产生棕色沉淀；
3)分离出沉淀，于25-37℃静置10-20分钟以挥干剩余的乙醇；
4)用水重悬，配置需要浓度的溶液，超声处理15-30min以充分分散纳米颗粒，即得到所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒。
或者，其中的步骤2)和3)替换为：
2)将步骤1)所得溶液使用100000kDa分子量透析袋在100倍体积的双蒸水中透析2天，期间至少更换4次透析液；
3)取透析袋中的液体冻干成粉。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤1)的反应体系中β-葡聚糖的浓度为0.2-0.6mg/mL，超顺磁纳米氧化铁的浓度为1mg/mL，EDC的浓度为1-1.5mg/mL。
8.权利要求1-4中任一项所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于权利要求1-4中任一项所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒在制备具备肿瘤诊断和治疗双重功能的药物中的应用；优选在制备对黑色素瘤具有诊断和治疗双重功能的药物中的应用。
10.一种药物组合物，其特征在于包含权利要求1-4中任一项所述的β-葡聚糖偶联超顺磁纳米氧化铁颗粒和药学上允许的载体。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19917744A1 (de) * 1999-04-20 2000-10-26 Cognis Deutschland Gmbh Dekorative kosmetische Zubereitungen
JP2007297322A (ja) * 2006-04-28 2007-11-15 Toyobo Co Ltd サイトカイン産生の促進方法
CN101843907A (zh) * 2010-04-20 2010-09-29 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 SPIO@SiO2-WGA肠壁靶向造影剂的制备方法
CN105478087A (zh) * 2016-01-06 2016-04-13 郑州英诺生物科技有限公司 一种基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法及其应用
CN111330023A (zh) * 2020-03-23 2020-06-26 中国科学院宁波工业技术研究院慈溪生物医学工程研究所 一种磁性纳米复合材料及其制备方法与应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19917744A1 (de) * 1999-04-20 2000-10-26 Cognis Deutschland Gmbh Dekorative kosmetische Zubereitungen
JP2007297322A (ja) * 2006-04-28 2007-11-15 Toyobo Co Ltd サイトカイン産生の促進方法
CN101843907A (zh) * 2010-04-20 2010-09-29 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 SPIO@SiO2-WGA肠壁靶向造影剂的制备方法
CN105478087A (zh) * 2016-01-06 2016-04-13 郑州英诺生物科技有限公司 一种基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法及其应用
CN111330023A (zh) * 2020-03-23 2020-06-26 中国科学院宁波工业技术研究院慈溪生物医学工程研究所 一种磁性纳米复合材料及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIEU VU-QUANG: "Immune cell-specific delivery of beta-glucan-coated iron oxide nanoparticles for diagnosing liver metastasis by MR imaging", 《CARBOHYDRATE POLYMERS》 *
刘琳等: "基于EDC／sulfo-NHS 的羧基化SPIO表面抗体耦联", 《南京医科大学学报》 *
潘启超、胥彬: "《肿瘤药理学及化学治疗学》", 31 December 1989, 广东高等教育出版社 *

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