CN101843907A - SPIO@SiO2-WGA肠壁靶向造影剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是一种生物医学诊断用的麦胚凝聚素(WGA)包裹二氧化硅超顺磁性(SPIO@SiO₂-WGA)磁共振纳米造影剂的制备方法。利用十六烷基三甲基溴化胺实现油溶性SPIO的水溶性转化；采用正硅酸乙酯和氨丙基三乙氧基硅实现SPIO的二氧化硅包裹和表面氨基化；利用EDC/NHS在PBS溶液中实现了对肠壁有吸附作用的麦胚凝聚素和超顺磁性二氧化硅球的连接。所得SPIO@SiO₂-WGA磁共振纳米造影剂的粒径均一、稳定，毒性低，细胞靶向效果明显。

Description

SPIO@SiO2-WGA肠壁靶向造影剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种超顺磁性四氧化三铁(SPIO：superparamagnetic iron oxide)磁共振纳米造影剂的制备方法，特别涉及一种SPIO@SiO2-WGA肠壁靶向造影剂的制备方法。

背景技术

磁共振成像技术在肿瘤疾病的诊断中有着非常重要的作用，广泛应用于临床检测。其成像效果很大一方面取决于其使用的造影剂，好的造影剂或具有特异靶向的造影剂能提高诊断信号对比度，从而更早地发现肿瘤。而按目前的医疗水平，早期癌症病人约有80％～90％以上可以治愈。因此，开发性能优异的磁共振造影剂，从而提早发现肿瘤，是恶性治疗肿瘤的关键。

随着造影剂制备理论和技术、材料临床基础研究以及磁共振成像的不断发展和完善和发展，部分磁共振造影剂在临床上获得较广泛应用，且发展迅猛。用于疾病诊断的磁共振造影剂材料主要包括以下几类：(1)阳性造影剂：常规诊断剂量的顺磁性造影剂如常规剂量的含钆造影剂，使病灶组织的信号增强，如Gd-DTPA、Gd-DTPA-BMA等。(2)阴性造影剂：是病灶组织的信号减弱，超顺磁性四氧化三铁造影剂就属于此类，如Feridex(菲立磁)、Resovist等。超顺磁性造影剂相比含钆造影剂具有组织特异性高、更安全的特点，已成为近年来磁共振造影剂的研究热点。

肠壁的损伤是很多肠道疾病如肠炎肠癌的诊断依据之一，但目前临床上的磁共振造影剂对粘膜损伤成像效果差，很难在肠粘膜局部损失的情况下实现清晰的造影成像。麦胚凝集素(Wheat germ agglutinin，WGA)是从谷物中提取出来的、能与糖结合的蛋白质，在细胞识别和粘着反应中起重要作用，主要是促进细胞间的粘着。麦胚凝集素凝集素具有一个以上同糖结合的位点，因此能够参与细胞的识别和粘着，将细胞及与WGA修饰的药物相联接。采用WGA修饰经SiO2包裹的超顺磁性四氧化三铁，实现肠粘膜细胞与阴性造影剂的连接，对提高肠道疾病如肠炎肠癌的诊断精度具有重要的意义。

对专利文献调研发现，目前已有不少关于超顺磁性氧化铁的专利，如专利《采用超顺磁性硅壳纳米颗粒静电吸附分离蛋白质的方法》(公开号：CN1876673)制备了二氧化硅包裹的Fe3O4球及表面氨基化的二氧化硅包裹的Fe₃O₄球，表面分别带正电和负电，前者可实现对目标碱性蛋白质(细胞色素C)的分离提取，后者可实现对目标酸性蛋白质(牛血清白蛋白)的分离提取。专利《一种两亲超顺磁性磁共振造影剂及其制备方法》(公开号：CN101518656)制备了一种多元醇分子包覆的MnFe₂O₄纳米粒子。专利《氨基硅烷偶联剂与葡聚糖共修饰的超顺磁性纳米颗粒及其制备方法》(公开号：CN101554574)公开了一种氨基硅烷偶联剂与葡聚糖共修饰的超顺磁性纳米颗粒及其制备方法，该超顺磁性纳米颗粒具有核壳型结构，其内核为磁性四氧化三铁，内核表面为葡聚糖包覆层，葡聚糖包覆层外表面连接氨基硅烷偶联剂。总结目前已有的专利，但大多数专利仅涉及到超顺磁性粒子的制备、二氧化硅包裹及表面氨基化和聚合物表面修饰，很少有专利涉及到超顺磁性氧化铁表面包裹蛋白质实现功能化。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的磁共振造影剂对肠壁的吸附性不好、成像效果不佳等不足，提供一种WGA包裹的SPIO@SiO2磁共振纳米造影剂的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种SPIO@SiO2-WGA肠壁靶向造影剂的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.超顺磁性四氧化三铁水溶性转化：配置质量百分比浓度为3～4％的十六烷基三甲基溴化胺水溶液；搅拌下，将超顺磁性四氧化三铁氯仿溶液加入到上述的十六烷基三甲基溴化胺溶液中，搅拌均匀后去除氯仿，得到SPIO@CTAB溶液；其中十六烷基三甲基溴化胺的质量和铁元素质量比例为：30∶1～40∶1；

b.CTAB包裹超顺磁性四氧化三铁的表面氨基化：将步骤a所得SPIO@CTAB溶液用去离子水稀释10～13倍后，加入氨水使反应在pH为9～14的条件下进行，搅拌下加热至40-70℃，将正硅酸乙酯缓慢加入到上述反应液中，加入速度为1ml/h～2ml/h，搅拌反应1小时后，再缓慢加入氨丙基三乙氧基硅，搅拌反应4小时后停止；调节反应液的pH为5～7，在13000r/min的转速下离心10min，沉淀用pH＝6.0的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤，最后得到SPIO@SiO₂的磷酸盐缓冲溶液；其中正硅酸乙酯、氨丙基三乙氧基硅和溶液中铁元素的质量比为：96∶25∶1；

c.SPIO@SiO₂-WGA的制备：在步骤c所得SPIO@SiO₂的磷酸盐缓冲溶液中，加入麦胚凝集素、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温下搅拌反应24小时；产物用pH＝6.0的磷酸盐缓冲溶液在13000r/min下离心清洗3次后，再分散在pH＝6.0的磷酸盐缓冲溶液中，得到SPIO@SiO2-WGA肠壁靶向造影剂；其中铁元素与麦胚凝集素的质量比为1∶1～2，1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐与N-羟基硫代琥珀酰亚胺的质量比为5∶1，且1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐在溶液中的浓度为5mM。

本发明方法利用WGA对肠壁良好的亲和性和吸附性，突破了包裹蛋白质中颗粒稳定性、提纯及蛋白质保护等技术难点，得到SPIO@SiO2-WGA细胞靶向造影剂，用于肠壁细胞MRI成像造影，提高MRI检测信号对比，实现了在氨基化的磁性硅球表面连接蛋白质。

利用本发明制备得到的SPIO颗粒分布非常均一，包裹二氧化硅球粒径在40-60nm之间，分布均一，不粘连且包裹率在90％以上。选择Ph＝6.0的PBS溶液作为WGA蛋白质连接的反应液，在保证蛋白质活性的同时，也显著提高了反应体系的稳定性。该发明所得的SPIO@SiO2-WGA造影剂具很好的生物相容性，无毒且能对肠壁产生识别吸附，可提高和增强肠壁的磁共振成像作用，从而有望在肠癌、肠粘膜炎症等疾病的诊断方面得到应用。

附图说明

图1为本发明的SPIO颗粒的透射电镜图。

图2为本发明的SPIO@SiO2-WGA微球的透射电镜图。

具体实施方式

以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，为优选实施例，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明所采用的铁元素含量为20mg/ml的SPIO氯仿溶液的具体制备方法，请参见：

1.Feng Chen，Wenbo Bu，Yu Chen，Yuchi Fan，A Sub-50-nm Monosized SuperparamagneticFe3O4@SiO2T2-Weighted MRI Contrast Agent：Highly Reproducible Synthesis of UniformSingle-Loaded Core-Shell Nanostructures，Chem.Asian J.2009，4(12)，1809-1816.2.J.Park，K.J.An，Y.S.Hwang，J.G.Park，H.J.Noh，J.Y.Kim，J.H.Park，N.M.Hwang，T.Hyeon，Nat.Mater.2004，3，891-895.。

以下各实施例所用的SPIO氯仿溶液的具体制备步骤如下：12mmol 4.848g Fe(NO3)3.9H2O，40mL甲醇溶解，加入36mmol，12mL油酸；36mmol，1.44gNaOH，用40ml甲醇溶解；然后用分液漏斗逐滴加入上述硝酸铁-甲醇-油酸混合溶液中，磁力搅拌一夜。静置后，烧杯下层出现粘稠固体不溶物，除去上层甲醇和水清洗收集红褐色粘稠产物置于250mL三口烧瓶中，加入40mL1-十八烯，4mL油酸，120℃除水2h，氮气气氛下升温到320℃，保温2h。反应结束后，用酒精、氯仿清洗5次，所得产物分散在氯仿中，配制成铁元素含量为20mg/ml的SPIO氯仿溶液备用。

实施例1：具体步骤如下：

1.配置质量百分比为3％的CTAB水溶液，置于100ml三口烧瓶中机械搅拌，取2ml SPIO的氯仿溶液加入CTAB溶液中机械搅拌30min。将产物置于100ml的烧杯中在70度下搅拌15钟后得到SPIO@CTAB溶液冷却备用。

2.在50ml的锥形瓶中加入去离子水37ml，SPIO@CTAB溶液3ml，25％的氨水0.3ml，磁力搅拌加热至60度。取0.30ml TEOS用乙醇稀释至1ml，并采用微流泵以2ml/h的速度缓慢加入反应液中，1小时后，缓慢加入0.1ml氨丙基三乙氧基硅(APTES)(20μl/min)，再反应4小时后停止。将反应液pH调到5-7，在13000r/min的转速下离心10min，沉淀用pH＝6.0的PBS溶液分散，再次离心，重复3次，分散在10ml的PBS溶液中，装于25ml的样品瓶中备用。

3.加入1mg麦胚凝集素(WGA)50mg EDC和20mg NHS，在室温下磁力搅拌反应24小时。产物用PBS在13000r/min下离心清洗3次后分散在10ml PBS(Ph＝6.0)溶液中。所得产物为WGA包裹的超顺磁性二氧化硅球。

实施例2：具体步骤如下：

1.配置质量百分比为4％的CTAB水溶液，置于100ml三口烧瓶中机械搅拌，取2ml SPIO的氯仿溶液加入CTAB溶液中机械搅拌30min。将产物置于100ml的烧杯中在70度下搅拌15钟后得到SPIO@CTAB溶液，冷却备用。

2.在50ml的锥形瓶中加入去离子水37ml，SPIO@CTAB溶液3ml，25％的氨水0.3ml，磁力搅拌加热至60度。取0.40ml TEOS用乙醇稀释至1ml，并采用微流泵以1ml/h的速度缓慢加入反应液中，1小时后，缓慢加入0.1ml氨丙基三乙氧基硅(APTES)(20μl/min)，再反应4小时后停止。将反应液pH调到5-7，在13000r/min的转速下离心10min，沉淀用pH＝6.0的PBS溶液分散，再次离心，重复3次，分散在10ml的PBS溶液中，装于25ml的样品瓶中备用。

3.加入2mg麦胚凝集素(WGA)50mg EDC和20mg NHS，在室温下磁力搅拌反应24小时。产物用PBS在13000r/min下离心清洗3次后分散在10ml PBS(Ph＝6.0)溶液中。所得产物为WGA包裹的超顺磁性二氧化硅球。

实施例3：具体步骤如下：

1.配置质量百分比为3.6％的CTAB水溶液，置于100ml三口烧瓶中机械搅拌，取2ml SPIO的氯仿溶液加入CTAB溶液中机械搅拌30min。将产物置于100ml的烧杯中在70度下搅拌15钟后得到SPIO@CTAB溶液，冷却备用。

2.在50ml的锥形瓶中加入去离子水37ml，SPIO@CTAB溶液3ml，25％的氨水0.3ml，磁力搅拌加热至60度。取0.36ml TEOS用乙醇稀释至1ml，并采用微流泵以1.5ml/h的速度缓慢加入反应液中，1小时后，缓慢加入0.1ml氨丙基三乙氧基硅(APTES)(20μl/min)，再反应4小时后停止。将反应液pH调到5-7，在13000r/min的转速下离心10min，沉淀用pH＝6.0的PBS溶液分散，再次离心，重复3次，分散在10ml的PBS溶液中，装于25ml的样品瓶中备用。

3.加入3mg麦胚凝集素(WGA)50mg EDC和20mg NHS，在室温下磁力搅拌反应24小时。产物用PBS在13000r/min下离心清洗3次后分散在10ml PBS(Ph＝6.0)溶液中。所得产物为WGA包裹的超顺磁性二氧化硅球。

Claims (1)

1.一种SPIO@SiO2-WGA肠壁靶向造影剂的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.超顺磁性四氧化三铁水溶性转化：配置质量百分比浓度为3～4％的十六烷基三甲基溴化胺水溶液；搅拌下，将超顺磁性四氧化三铁氯仿溶液加入到上述的十六烷基三甲基溴化胺溶液中，搅拌均匀后去除氯仿，得到SPIO@CTAB溶液；其中十六烷基三甲基溴化胺的质量和铁元素质量比例为：30∶1～40∶1；

b.CTAB包裹超顺磁性四氧化三铁的表面氨基化：将步骤a所得SPIO@CTAB溶液用去离子水稀释10～13倍后，加入氨水使反应在pH为9～14的条件下进行，搅拌下加热至40-70℃，将正硅酸乙酯缓慢加入到上述反应液中，加入速度为1ml/h～2ml/h，搅拌反应1小时后，再缓慢加入氨丙基三乙氧基硅，搅拌反应4小时后停止；调节反应液的pH为5～7，在13000r/min的转速下离心10min，沉淀用pH＝6.0的磷酸盐缓冲溶液离心洗涤，最后得到SPIO@SiO₂的磷酸盐缓冲溶液；其中正硅酸乙酯、氨丙基三乙氧基硅和溶液中铁元素的质量比为：96∶25∶1；

c.SPIO@SiO₂-WGA的制备：在步骤c所得SPIO@SiO₂的磷酸盐缓冲溶液中，加入麦胚凝集素、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温下搅拌反应24小时；产物用pH＝6.0的磷酸盐缓冲溶液在13000r/min下离心清洗3次后，再分散在pH＝6.0的磷酸盐缓冲溶液中，得到SPIO@SiO2-WGA肠壁靶向造影剂；其中铁元素与麦胚凝集素的质量比为1∶1～2，1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐与N-羟基硫代琥珀酰亚胺的质量比为5∶1，且1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐在溶液中的浓度为5mM。

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