CN114748424A - 一种脂质体递药体系及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脂质体递药体系及其制备方法和用途。本发明的脂质体递药体系能同时靶向legumain阳性的肿瘤细胞和M2型巨噬细胞，其特征在于，负载有肿瘤治疗药物和非必须的成像分子，其中，在脂质体表面修饰legumain响应的多肽和甘露糖。

Description

一种脂质体递药体系及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体而言，本发明涉及一种脂质体递药体系及其制备方法和用途。所述脂质体递药体系在体内和体外条件下均能将肿瘤相关巨噬细胞重编程，使其从抗炎促肿瘤的M2型转化为促炎抗肿瘤的M1型。

背景技术

现如今，恶性肿瘤依然是世界上最具毁灭性的疾病之一，每年都有新增超过1000万例。在男性病例中，病例数排名前三位的依次是前列腺癌、肺癌和结直肠癌；在女性中排名前三的分别是乳腺癌、肺癌和结直肠癌。结直肠癌是具有高死亡率的恶性肿瘤，尽管近年来结直肠癌的早期确诊和治疗有所改进，死亡率有所下降，但是其死亡率仍居于恶性肿瘤中的第三位，仍然是世界范围内的重要公共卫生问题。

雷公藤红素(Celastrol,Cela)是源自中药雷公藤根皮部位的一种三萜类天然药物，具有多种生物活性，是雷公藤片、雷公藤多苷片的有效成分，目前主要用于治疗类风湿病。Cela还具有多种抗肿瘤作用，如抗增殖、促凋亡、抗转移、抗血管生成等。此外，Cela可以通过抑制巨噬细胞的M2样极化来抑制肿瘤，下调STAT6磷酸化水平。

近年来以肿瘤免疫微环境为治疗靶点的肿瘤免疫疗法取得广泛关注。肿瘤免疫微环境是由多种肿瘤相关复合物(包括肿瘤细胞、免疫细胞、代谢产物等)组成的复杂组织，它会抑制肿瘤免疫，从而导致肿瘤细胞逃避免疫系统的监管。对细胞亚群的调节有助于肿瘤免疫微环境的重构和免疫的规范化。肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤免疫微环境中的含量非常丰富，是其中主要的天然免疫细胞群，占肿瘤体积的很大一部分。M1型表现出比较强的抗原呈递能力，具有细胞毒性和抗肿瘤能力，M2型巨噬细胞主要参与免疫调节和组织修复，促进肿瘤生长和免疫逃逸。肿瘤相关巨噬细胞从促肿瘤的M2型向抗肿瘤的M1型的再极化可以作为免疫治疗的一个有效靶点。

针对化疗药物水溶性差、特异性差等，药剂学上已经开展了广泛的研究，主要是通过纳米技术提高化疗药物在肿瘤细胞内的蓄积。由于肿瘤细胞的过度增殖需要大量的能量，因此肿瘤组织相比于正常组织血管丰富，血管内皮排列疏松，结构完整性差，淋巴回流缺失，利于更多的物质交换。而这一特点也造成了大分子物质和脂质颗粒具有选择地高通透性和滞留性，这一现象被称为是实体瘤组织的高通透性和滞留效应(EPR)。为了提高纳米颗粒在肿瘤细胞内的蓄积，提高纳米粒穿过细胞膜的效率，穿膜肽和特异性的靶向修饰介导作用也得到广泛的研究。但是对于以legumain为靶点并联用甘露糖作为靶头修饰于脂质体递药体系在肿瘤上的研究还未有人涉足。

发明内容

本发明人经过大量研究开发了一种脂质体递药体系，可以负载肿瘤治疗药物(如雷公藤红素)和非必须的成像分子(如DiR)，并在脂质体表面修饰legumain响应的多肽和甘露糖，可以同时靶向至legumain阳性的肿瘤细胞(如结肠癌细胞)和甘露糖受体(MR)阳性的M2型巨噬细胞，对巨噬细胞进行重编程，提高药物的治疗效率。

因此，本发明的一个目的是提供一种脂质体递药体系，其能同时靶向legumain阳性的肿瘤细胞和MR阳性的M2型巨噬细胞。所述递药体系是基于制备技术成熟、研究广泛的脂质体作为纳米尺寸的载体，通过在脂质体的表面修饰靶向legumain的多肽序列和靶向甘露糖受体的甘露糖以提高脂质体的主动靶向性，并介导脂质体被细胞摄取，提高药物的治疗效率，同时可以根据需要实现对肿瘤细胞(如结肠癌细胞)和M2型巨噬细胞的成像。

本发明的另一个目的是提供一种能同时靶向legumain阳性的肿瘤细胞和甘露糖受体(MR)阳性的M2型巨噬细胞的脂质体递药体系，即双靶向载药纳米脂质体的制备方法。

本发明的再一个目的是提供所述双靶向脂质体递药体系的用于治疗legumain阳性的肿瘤(特别是结肠癌)的用途。该脂质体递药(给药)体系能够通过EPR效应实现在肿瘤部位的蓄积，肿瘤组织中的legumain切割肽段后，暴露出legumain响应的多肽中的具有穿膜能力的阳离子多肽，同时也可以通过甘露糖主动靶向于结肠癌组织中M2型巨噬细胞，调节其向M1型巨噬细胞极化，最终达到治疗肿瘤的目的。

本发明的又一个目的是提供肿瘤(如结肠癌)诊疗一体化的一种方法。

本发明的另一个目的是提供一种对肿瘤相关巨噬细胞重编程的方法。

本发明的又一个目的是提供所述对巨噬细胞重编程的方法在治疗肿瘤(如结肠癌)的应用。

根据一个方面，本发明提供了一种能同时靶向legumain阳性的肿瘤细胞和M2型巨噬细胞的脂质体递药体系，即双靶向载药脂质体，其特征在于，负载有肿瘤治疗药物和非必须的成像分子，其中，在脂质体表面修饰legumain响应的多肽和甘露糖。

本发明的双靶向载药脂质体中，优选地，所述脂质体的粒径小于200nm，优选小于100nm，更优选为95nm。

本发明的双靶向载药脂质体中，优选地，所述肿瘤治疗药物是指可诱导巨噬细胞由M2型向M1型极化的药物。在一个实施方式中，所述肿瘤治疗药物包括雷公藤红素。

本发明的双靶向载药脂质体中，优选地，所述成像分子是指在体内具有较好成像效率的荧光分子。在一个实施方式中，所述成像分子包括DiR。

本发明的双靶向载药脂质体中，“双靶向”是指在脂质体的表面修饰甘露糖和legumain响应的多肽，可同时靶向legumain阳性的肿瘤细胞和MR阳性的M2型巨噬细胞。

本发明的双靶向载药脂质体中，优选地，可共载肿瘤治疗药物(例如，雷公藤红素)和成像分子(例如，DiR)，表面为聚乙二醇修饰。在一个实施方式中，甘露糖和legumain响应的多肽通过聚乙二醇作为连接臂修饰到脂质体表面。

本发明的双靶向载药脂质体中，所述legumain阳性的肿瘤细胞包括但不限于CT26、HCT 116等。

本发明的双靶向载药脂质体中，所述legumain响应的多肽是指同时包含有legumain可裂解的氨基酸序列、穿膜肽序列，以及封闭穿膜肽功能的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述legumain响应的多肽可以是KC26。

本发明的双靶向载药脂质体中，对雷公藤红素(Cela)的包封率可为91.3％。

根据另一个方面，本发明提供了所述同时靶向肿瘤细胞和M2型巨噬细胞的递药体系，即双靶向载药脂质体的制备方法。

脂质体作为一种研究和应用比较广泛的一种纳米载体，常见的制备方法主要是薄膜分散水化法、乙醇注入法、反相蒸发法以及硫酸铵梯度法等，一般根据药物的理化性质选择合适的制备方法。

本发明采用薄膜分散水化法制备共载药脂质体。为了保持legumain响应多肽的活性，在脂质体的处方中引入DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal，在脂质体制备完成后将legumain响应多肽加入到脂质体中，通过Mal基团和巯基的反应将legumain响应多肽修饰于脂质体的表面。

多肽修饰采用Mal和巯基的反应，因此所述靶头修饰不限于legumain响应的多肽，也可以用于其他结构中包含巯基的多肽、蛋白质及单克隆抗体的脂质体表面修饰。

因此，本发明提供了所述同时靶向肿瘤细胞和M2型巨噬细胞的递药体系，即双靶向载药脂质体的制备方法，其特征在于，包括在脂质体内负载肿瘤治疗药物和非必须的成像分子以及在脂质体的表面修饰靶向legumain的多肽序列和靶向甘露糖受体的甘露糖的步骤。

具体地，本发明提供了所述同时靶向肿瘤细胞和M2型巨噬细胞的递药体系，即双靶向载药脂质体的制备方法，包括：

(a)称取蛋黄卵磷脂(PC 98T)、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀-Man、DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal(例如，质量比为20:1:1:1)溶于有机溶剂之中，加到圆底烧瓶中；称取肿瘤治疗药物(例如，Cela)(例如，与蛋黄卵磷脂的质量比为1:10)和非必须的成像分子(例如，DiR)(若存在例如，其与蛋黄卵磷脂的质量比为1:80)，用有机溶剂溶解并加入到圆底烧瓶中，混匀；使用旋转蒸发仪真空旋蒸除去有机溶剂，可见在圆底烧瓶底部形成薄膜；

(b)向圆底烧瓶中加入适量PBS缓冲液作为水化液，形成橙黄色透明溶液；

(c)采用脂质体挤出仪，将制备的脂质体先后过不同尺寸的聚碳酸酯膜，各挤出数次；

(d)向(c)所制备的脂质体中加入legumain响应的多肽，室温搅拌反应过夜；

(e)(例如，通过凝胶柱)除去游离药物，即得双靶向载药脂质体。

上述制备的双靶向载药脂质体可以在4℃下保存。

本发明制备方法步骤(a)中，所述有机溶剂可以是具有较低沸点的有机溶剂，例如，同温同压下，沸点低于纯水的有机溶剂，其具体实例包括但不限于氯仿、乙醇、丙酮、二氯甲烷、甲醇等。

优选地，靶向legumain的多肽序列和甘露糖分别靶向至肿瘤细胞和M2型巨噬细胞，按照上述制备方法，可以得到双靶向载药脂质体。

上述制备方法中，优选地，所述多肽作为靶头靶向至legumain过表达的legumain阳性的肿瘤(特别是结肠癌)，甘露糖靶向于M2型巨噬细胞，按照上述制备方法，可以制备双靶向载药脂质体。

上述制备方法中，优选地，采用聚乙二醇进行表面修饰，可提高脂质体的稳定性、延长半衰期。

根据又一个方面，本发明提供一种调控巨噬细胞极化的方法，其特征在于：Cela能够下调M2型巨噬细胞的标志分子的表达，上调M1型巨噬细胞的标志分子，即调控巨噬细胞向M1型极化。

根据再一个方面，本发明提供了上述同时靶向肿瘤细胞和M2型巨噬细胞的载药体系即双靶向载药脂质体的用途。所述用途包括：治疗legumain阳性的肿瘤。

根据再一个方面，本发明提供了上述同时靶向肿瘤细胞和M2型巨噬细胞的脂质体递药体系在制备用于治疗legumain阳性的肿瘤的药物中的用途。

在一个实施方式中，所述legumain阳性的肿瘤包括结肠癌。

根据再一个方面，本发明提供所述对巨噬细胞重编程的方法在治疗legumain阳性的肿瘤(特别是结肠癌)上的应用。通过调节M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞分化，实现对legumain阳性的肿瘤(特别是结肠癌)的治疗。

经过筛选，本发明所使用的CT26细胞系在小鼠的移植瘤中高表达MR和legumain，而在肿瘤组织中，巨噬细胞多呈M2型分布，基于此，本发明将legumain响应的多肽和甘露糖修饰至脂质体表面，用于靶向肿瘤细胞和M2型巨噬细胞。

本发明人发现，在体外细胞系和荷瘤小鼠体内，将legumain响应的多肽和甘露糖修饰至脂质体表面，均能显著提高脂质体在肿瘤细胞和M2型巨噬细胞内的分布及在肿瘤部位的蓄积，对巨噬细胞重编程，实现肿瘤治疗和成像同步进行的目的。同时本发明也为药物和成像分子的同时应用提供在制剂上的思路。

本发明所述双靶向载药脂质体表面修饰甘露糖，能特异性识别其受体MR，并通过MR介导脂质体进入肿瘤细胞，在体外和体内条件下均能靶向调节M2型巨噬细胞向M1型分化，实现在体外和体内条件对MR高表达的肿瘤主动靶向作用。同时，本发明所述双靶向载药脂质体表面修饰legumain响应的多肽，在体外和体内条件下均能被legumain切割，原本用来封闭穿膜肽的肽段脱去，具有穿膜能力的阳离子多肽暴露出来，从而更好的进入肿瘤微环境深处以及肿瘤细胞内部。

附图说明

图1为根据本发明制备实施例1中所制备的双靶向载药脂质体的粒径分布。

图2为显示根据本发明实验实施例1中双靶向载药脂质体的粒径变化的图。

图3显示根据本发明实验实施例2中双靶向载药脂质体在M2型巨噬细胞上的摄取情况。其中，左图为M2型巨噬细胞摄取不同脂质体的流式图；右图为与未处理的细胞相比，不同处理的细胞的平均荧光强度的图。

图4为显示根据本发明实验实施例3中双靶向载药脂质体对小鼠结肠癌细胞CT26的细胞毒性的图。

图5显示根据本发明实验实施例4中双靶向载药脂质体对M2型巨噬细胞的调控作用。其中，左图为M2型巨噬细胞经过不同处理后的F4/80和CD206双阳性细胞比例的图；右图为M2型巨噬细胞经过不同处理后的F4/80和CD86双阳性细胞比例的图。

图6为显示根据本发明实验实施例5中双靶向载药脂质体诱导小鼠结肠癌细胞CT26细胞凋亡的图。

图7为根据本发明实验实施例6中双靶向载药脂质体在小鼠结肠癌细胞CT26的小鼠皮下移植瘤模型的体内经时分布。其中，上图为不同时间点时小鼠体内荧光的分布的图；下左图为实验终点时，小鼠的肿瘤和主要脏器内的荧光分布的图；下右图为实验终点时，小鼠肿瘤组织中的平均荧光强度的差异图。其中**代表两组之间的t检验的0.01<p<0.05，具有显著差异。

图8A-B为根据本发明实验实施例7中双靶向载药脂质体在小鼠结肠癌细胞CT26的小鼠皮下移植瘤模型给药期间瘤体积(A)和体重(B)的变化。

图9显示根据本发明实验实施例8中双靶向载药脂质体在治疗小鼠结肠癌细胞CT26的小鼠皮下移植瘤时对巨噬细胞的调控情况。其中，左图为给药后小鼠肿瘤内的巨噬细胞中CD206阳性细胞的比例变化的图；右图为给药后小鼠肿瘤内的巨噬细胞中TGFβ阳性的细胞比例变化的图。

图10显示根据本发明实验实施例8中双靶向载药脂质体在治疗小鼠结肠癌细胞CT26的小鼠皮下移植瘤时对DC细胞的激活情况。其中，左图为DC细胞中CD80阳性的细胞比例变化的图；右图为DC细胞中CD86阳性的细胞比例变化的图。

图11显示根据本发明实验实施例8中双靶向载药脂质体在治疗小鼠结肠癌细胞CT26的小鼠皮下移植瘤时对T细胞和Treg的作用情况。其中，左图为CD8⁺阳性T细胞中Granzyme B的比例变化的图；右图为CD4⁺阳性T细胞中Foxp3和CD25双阳性细胞的比例变化的图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明加以进一步的说明，以下实施方式只以举例的方式描述本发明。但这些实例并不意味着对本发明加以任何限制。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修饰。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所述权利要求书中包括的变通和修饰。

试剂和药品

蛋黄卵磷脂PC-98T、DSPE-PEG₂₀₀₀、DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal购置于上海艾伟拓医药科技有限公司；DSPE-PEG₂₀₀₀-Man购自西安瑞禧生物科技有限公司；legumain响应的多肽(KC26，keeeeeNeeeeGPTNNRRRRRRRRRC，其中小写的“k”和“e”分别代表D型赖氨酸和谷氨酸，大写代表L型氨基酸)订购于合肥国肽生物科技有限公司；DiR、香豆素-6购自大连美仑生物技术有限公司；Cela购自上海毕得医药有限公司；色谱级甲醇和乙腈购自百灵威科技有限公司；其他所用到的试剂均来自于国药集团(上海)化学试剂公司。CT26细胞系购自中国科学院上海生科院细胞库。RPMI 1640细胞培养基干粉、胎牛血清购自Gibco。胰蛋白酶和双抗(penicillin-streptomycin)购自于上海碧云天生物科技有限公司。

制备实施例1：双靶向载药脂质体的制备

(a)称取蛋黄卵磷脂(PC 98T)、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀-Man、DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal(质量比为20:1:1:1)溶于氯仿之中，加到圆底烧瓶中。称取Cela(与蛋黄卵磷脂的质量比为1:10)和DiR(与蛋黄卵磷脂的质量比为1:80)，用乙醇溶解并加入到圆底烧瓶中混匀。使用旋转蒸发仪真空旋蒸除去有机溶剂，可见在圆底烧瓶底部形成薄膜。

(b)向圆底烧瓶中加入适量PBS缓冲液作为水化液，水浴下水化10min，形成橙黄色透明溶液。

(c)采用Avanti脂质体挤出仪，将制备的脂质体先后过400nm和200nm的聚碳酸酯膜，各挤出20次。

(d)向(c)所制备的脂质体中加入legumain响应的多肽(KC26)(与DSPE-PEG2000-Mal的摩尔比为1:1.2)，室温搅拌反应过夜。

(e)通过凝胶柱除去游离药物，4℃保存制备得到的脂质体(Target-lipo)。

制备实施例2：双靶向载药脂质体阳性对照的制备

(a)称取蛋黄卵磷脂(PC 98T)、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀-Man、DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal(质量比为20:1:1:1)溶于氯仿之中，加到圆底烧瓶中。称取Cela(与蛋黄卵磷脂的质量比为1:10)和DiR(与蛋黄卵磷脂的质量比为1:80)，用乙醇溶解并加入到圆底烧瓶中混匀。使用旋转蒸发仪真空旋蒸除去有机溶剂，可见在圆底烧瓶底部形成薄膜。

(b)向圆底烧瓶中加入适量PBS缓冲液作为水化液，水浴下水化10min，形成橙黄色透明溶液。

(c)采用Avanti脂质体挤出仪，将制备的脂质体先后过400nm和200nm的聚碳酸酯膜，各挤出20次。

(d)向(c)所制备的脂质体中加入legumain响应的多肽(KC26)(与DSPE-PEG2000-Mal的摩尔比为1:1.2)，室温搅拌反应过夜。

(e)通过凝胶柱除去游离药物，4℃保存制备得到的靶向脂质体(Target-lipo)。

(f)用小鼠骨髓来源诱导的M2型巨噬细胞的裂解液(制备方法见制备实施例7)预处理靶向脂质体(Target-lipo)后作为后续细胞实验的阳性对照，标记为Target-lipo+M2。

制备实施例3：无靶向载药脂质体的制备

(a)称取蛋黄卵磷脂(PC 98T)、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀(质量比为20:1:2)溶于氯仿之中，加到圆底烧瓶中。称取Cela(与蛋黄卵磷脂的质量比为1:10)和DiR(与蛋黄卵磷脂的质量比为1:80)，用乙醇溶解并加入到圆底烧瓶中混匀。使用旋转蒸发仪真空旋蒸除去有机溶剂，可见在圆底烧瓶底部形成薄膜。

(b)向圆底烧瓶中加入适量PBS缓冲液作为水化液，水浴下水化10min，形成橙黄色透明溶液。

(c)采用Avanti脂质体挤出仪，将制备的脂质体先后过不同孔径的聚碳酸酯膜，各挤出数次。

(d)通过G25凝胶柱除去游离药物，4℃保存制备得到的脂质体(lipo)。

制备实施例4：负载香豆素6(C6)的靶向脂质体

(a)靶向脂质体的制备：称取蛋黄卵磷脂(PC 98T)、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀-Man、DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal(质量比为20:1:1:1)溶于氯仿之中，加到圆底烧瓶中。称取C6(与蛋黄卵磷脂的质量比为1:10000)，用乙醇溶解并加入到圆底烧瓶中混匀。使用旋转蒸发仪真空旋蒸除去有机溶剂，可见在圆底烧瓶底部形成薄膜。

(b)向圆底烧瓶中加入适量PBS缓冲液作为水化液，水浴下水化10min，形成橙黄色透明溶液。

(c)采用Avanti脂质体挤出仪，将制备的脂质体先后过不同孔径的聚碳酸酯膜，各挤出数次。

(d)向(c)所制备的靶向脂质体中加入legumain响应的多肽(KC26)(与DSPE-PEG2000-Mal的摩尔比为1:1.2)，室温搅拌反应过夜，获得负载C6的靶向脂质体(C6-Target-lipo)。

制备实施例5：负载C6的无靶向脂质体

(a)称取蛋黄卵磷脂(PC 98T)、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀(质量比为20:1:2)溶于氯仿之中，加到圆底烧瓶中。称取C6(与蛋黄卵磷脂的质量比为1:10000)，用乙醇溶解并加入到圆底烧瓶中混匀。使用旋转蒸发仪真空旋蒸除去有机溶剂，可见在圆底烧瓶底部形成薄膜。

(b)向圆底烧瓶中加入适量PBS缓冲液作为水化液，水浴下水化10min，形成橙黄色透明溶液。

(c)采用Avanti脂质体挤出仪，将制备的脂质体先后过400nm和200nm的聚碳酸酯膜，各挤出20次。

(d)通过凝胶柱G25除去游离药物，4℃保存制备得到的脂质体。获得的无靶向的负载C6的脂质体标记为(C6-lipo)

制备实施例6：

按照制备实施例1-3中的方法，制备新鲜的脂质体，三种脂质体中均不加入DiR，靶向脂质体标记为Cela-Target-lipo，无靶向的脂质体标记为Cela-lipo，用小鼠骨髓来源诱导的M2型巨噬细胞的裂解液(制备方法见制备实施例7)预处理靶向脂质体标记为Cela-Target-lipo+M2。

制备实施例7：制备M2型巨噬细胞的裂解液

取Balb/C小鼠，安乐死后，分离股骨和胫骨，剪开骨头两端，用无血清的高糖DMEM培养基冲出骨髓。离心后弃上清，收集骨髓细胞。将获得的骨髓细胞重悬在含有M-CSF的高糖DMEM完全培养基中，在37℃、5％CO₂条件下培养三到四天。采用IL-4诱导24h，使巨噬细胞极化为M2型。24h后，消化收集M2型巨噬细胞后用裂解液(称取0.84g一水合柠檬酸、4.333g十二水合磷酸氢二钠、0.0372g二水合已二酸四乙胺二钠和1g辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷溶解至90mL超纯水中，定容至100mL)冰上裂解细胞后，于-80℃和4℃反复冻融5次后，10000rpm离心20min，吸取上清，即为M2型巨噬细胞的裂解液。

实验实施例1：制备实施例1的双靶向载药脂质体的表征

(1)粒径形态表征

采用动态光散射法测定制备实施例1所制备的双靶向载药脂质体的粒径，其粒径分布如图1所示，粒径为95nm。

(2)双靶向载药脂质体的稳定性

将制备实施例1所制备的双靶向载药脂质体加入到含有血清的PBS缓冲液中，置于37℃保存，检测脂质体的粒径变化。实验结果如图2所示，24h内脂质体的粒径没有明显变化，表明双靶向载药脂质体具有良好的稳定性。

(3)包封率

本发明采用高效液相色谱仪和荧光酶标仪对制备实施例1所制备的脂质体中包载的分子进行定量分析。

所用液相方法具体如下：

本发明所使用的高效液相色谱仪购自于安捷伦科技(中国)有限公司，仪器型号为1200，所使用的色谱柱为安捷伦的Zorbax Elipse XDB C₁₈柱(5μm，4.6x150 mm)，柱温设置为40℃，采用紫外检测器。

A相为水(含0.1％三氟乙酸)；B相为甲醇(含0.1％三氟乙酸)。流动相比例A/B为5/95，流速1mL/min，检测波长254nm。出峰时间大约为7.1min。

取20μL上述所制备的双靶向共载药脂质体，向其中加入180μL甲醇，涡旋5min，15000rpm离心5min，取上清置于液相进样瓶中定量检测Cela含量。经检测双靶向载药脂质体对Cela的包封率为91.3％。

实验实施例2

将上述制备实施例4和5分别制备的负载C6的靶向脂质体(C6-Target-lipo)和负载C6的无靶向的脂质体(C6-lipo)，采用荧光酶标仪在激发波长466nm、发射波长504nm条件下对脂质体中负载的C6定量，以细胞摄取C6的量表征脂质体的入胞效率。具体如下：

取Balb/C小鼠，安乐死后，分离股骨和胫骨，剪开骨头两端，用无血清的高糖DMEM培养基冲出骨髓。离心后弃上清，收集骨髓细胞。将获得的骨髓细胞重悬在含有M-CSF的高糖DMEM完全培养基中，在37℃、5％CO₂条件下培养三到四天。采用IL-4诱导24h，使巨噬细胞极化为M2型。

取上述小鼠骨髓来源的M2型巨噬细胞以每孔8×10⁴个细胞接种在十二孔细胞培养板内，37℃、5％CO₂条件下培养24h，按照每孔0.1μg C6加入双靶向脂质体(C6-Target-lipo)或无靶向脂质体(C6-lipo)，给药一定时间后收集细胞，并用流式细胞仪检测。为了检测靶向脂质体的legumain响应性，在给药前用M2型巨噬细胞的裂解液预处理靶向脂质体，以暴露具有穿膜性能的多肽序列，作为阳性对照(C6-Target-lipo+M2)，给药剂量和时间不变。为了检测双靶向脂质体对MR的靶向性，在给药前用游离甘露糖处理细胞，作为对照(C6-Target-lipo+Man)，给药剂量和时间不变。无任何处理的空白细胞作为空白对照(blank)。

实验结果如图3所示，双靶向脂质体可显著提高C6在细胞内的摄取。M2型巨噬细胞裂解液预处理增加了细胞摄取C6的量。预先用甘露糖处理的细胞摄取C6的量较低。

实验实施例3

体外抗肿瘤活性

通过CCK-8法检测制备实施例1中的双靶向载药脂质体在MR阳性的CT26细胞的体外毒性，以表征靶向修饰及药物负载。具体实验如下：

以每孔5×10³个细胞接种CT26细胞于九十六孔板，37℃、5％CO₂条件下培养24h后将不同浓度的药物(Cela、制备实施例6中的Cela-Target-lipo、Cela-lipo和Cela-Target-lipo+M2)处理细胞，每个浓度设置六个复孔。24h后，更换成含有CCK-8的新鲜培养基，再培养2h，用酶标仪(540nm)检测每孔的吸光度值，以每个给药组的吸光度值与空白组平均吸光度值的比值计算每个给药组的细胞存活率。实验结果如图4所示，双靶向载药脂质体的作用效果强于无靶向的载药脂质体。

实验实施例4

小鼠骨髓来源巨噬细胞的极化与调控

(1)小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)的培养与诱导

取Balb/C小鼠，安乐死后，分离股骨和胫骨，剪开骨头两端，用无血清的高糖DMEM培养基冲出骨髓。离心后弃上清，收集骨髓细胞。将获得的骨髓细胞重悬在含有M-CSF的高糖DMEM完全培养基中，在37℃、5％CO₂条件下培养三到四天。采用IL-4诱导24h，使巨噬细胞极化为M2型。

(2)流式细胞术表征BMDM的极化及其调控

按照1×10⁵个细胞的密度将BMDM细胞接种于十二孔细胞培养板中，24h后用含有诱导因子IL-4的高糖DMEM培养基(含有胎牛血清和双抗)处理24h后给药(Cela-lipo和Cela-Target-lipo)处理24h，未给药的对照组细胞标记为control组。用胰蛋白酶消化、离心后获得细胞，加入提前配制好的封闭液，封闭30min后1800rpm、4℃离心5min，弃封闭液，加入100μL含有表面蛋白抗体的PBS，置于冰上染色30min后离心加入100μL固定破膜液，冰上固定破膜30min后离心加入100μL破膜液洗涤一次，随后加入破膜液稀释的抗体，冰上染色30min后，加入400μL PBS终止染色，然后上机检测。

实验结果如图5所示，双靶向载药脂质体增加了M2型巨噬细胞中CD86的表达量，降低了CD206表达量，说明双靶向载药脂质体能促使巨噬细胞向抗肿瘤的M1型分化。

实验实施例5

流式细胞术检测双靶向载药脂质体对肿瘤细胞的凋亡作用

按照8×10⁴个细胞的密度将CT26接种于十二孔细胞培养板中，24h后给予药物处理24h，消化收集细胞，用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒染色，用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。

实验结果如图6所示，双靶向载药脂质体提高了CT26细胞凋亡比例。

实验实施例6

双靶向载药脂质体的体内靶向效率

按照制备实施例1和3中的方法制备新鲜的脂质体(Target-lipo和lipo)。通过DiR的体内经时分布表征脂质体在体内的过程。

将5×10⁵个CT26细胞种植到小鼠背部，待肿瘤体积达到200mm³后进行活体成像。具体如下：

尾静脉注射Target-lipo和lipo，分别在给药后的第1h、2h、4h、8h、12h、24h将小鼠麻醉后置于活体成像仪下拍照，记录脂质体在体内的分布。24h小鼠安乐死，取其心、肝、脾、肺、肾、瘤在小动物活体成像仪下拍照，以各组织器官的荧光的辐射效率均值定量指示脂质体的分布情况，检测脂质体在各主要器官内的蓄积情况。

实验结果如图7所示，与无靶向的脂质体相比，双靶向载药脂质体显著提高脂质体在肿瘤部位的蓄积，表明甘露糖和legumain响应的多肽显著提高脂质体的主动靶向性。

实验实施例7

双靶向载药脂质体的体内抗肿瘤活性

将3×10⁵个CT26细胞种植到Balb/C小鼠背部，待肿瘤体积达到100mm³后用于制备实施例1所制备的双靶向载药脂质体的体内抗肿瘤活性研究。具体如下：

随机将荷瘤小鼠分成四组，每组5只，分别尾静脉注射PBS、Cela(2mg/mL)、双靶向载药脂质体和无靶向的载药脂质体，隔天给药，共给药6次，每次给药记录小鼠的体重变化，并测量瘤的长径(L，单位：mm)、短径(S，单位：mm)，计算肿瘤体积：V(单位：mm³)＝L×S²/2。给药结束后，将小鼠安乐死，剖出肿瘤，小心去除瘤表面的血迹及包膜，称重。

实验结果如图8所示，游离的Cela具有一定的抗肿瘤效果，未修饰脂质体一定程度上提高了Cela的效果，而双靶向载药脂质体以其良好的主动靶向性进一步提高了抗肿瘤效果，抑瘤效率达到61％。

实验实施例8

双靶向载药脂质体的体内免疫学分析

按照制备实施例1和3中的方法，制备新鲜的脂质体，两种脂质体中均不加入DiR，靶向脂质体标记为Cela-Target-lipo，无靶向的脂质体标记为Cela-lipo。

将3×10⁵个CT26细胞种植到Balb/C小鼠背部，待肿瘤体积达到100mm³后随机分组，每组三只，给药(PBS、Cela、Cela-Target-lipo、Cela-lipo)三次，第三次给药后的第二天安乐死小鼠，剖出肿瘤，进行免疫学分析，具体如下：

称取300mg瘤组织，加入含有3mL透明质酸酶和IV型胶原酶的无血清培养基，置于37℃、150rpm的摇床上裂解1h；然后用尼龙网过滤，2500rpm离心10min，弃上清，加入红细胞裂解液2mL，裂解15min，加入等体积PBS终止裂解，尼龙网过滤，离心后弃上清，随后加入适量PBS，分装样品，分别用于巨噬细胞、DC细胞和T细胞的检测。

(1)巨噬细胞的检测

取适量样品，离心后弃上清，加入提前配制好的封闭液，封闭30min后1800rpm、4℃离心5min，弃封闭液，加入100μL含有表面蛋白抗体的PBS，置于冰上染色30min后离心加入100μL固定破膜液，冰上固定破膜30min后离心加入100μL破膜液洗涤一次，随后加入破膜液稀释的抗体，冰上染色30min后，加入400μL PBS终止染色，然后上机检测。

结果如图9所示，双靶向载药脂质体给药组的CD206阳性、TGFβ阳性巨噬细胞(M2)比例降低，说明在肿瘤微环境中，双靶向载药脂质体能够促使M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞分化。

(2)DC细胞的检测

取适量样品，离心后弃上清，加入提前配制好的封闭液，封闭30min后1800rpm、4℃离心5min，弃封闭液，加入100μL含有表面蛋白抗体的PBS，置于冰上染色30min后，加入400μL PBS终止染色，上机检测。

结果如图10所示，与空白对照组相比，双靶向载药脂质体给药组的CD80和CD86阳性的DC细胞比例增加，说明双靶向载药脂质体能有效激活DC细胞。

(3)T细胞的检测

取适量样品至15mL离心管中，加入4mL淋巴细胞分离液，混匀细胞后加入1mL无血清的1640培养基，使用水平转子离心，设置离心机加速度和减速度均为3档，800g，30min。离心结束后吸取两层液面中间的T细胞层至15mL离心管中，加入无血清1640培养基混匀重悬，250g离心10min后弃上清，加入提前配制好的封闭液，封闭30min后1800rpm、4℃离心5min，弃封闭液，加入100μL含有表面蛋白抗体的PBS，置于冰上染色30min后离心加入100μL固定破膜液，冰上固定破膜30min后离心加入100μL破膜液洗涤一次，随后加入破膜液稀释的抗体，冰上染色30min后，加入400μL PBS终止染色，然后上机检测。

结果如图11所示，在双靶向载药脂质体给药组中，Granzyme B阳性的T细胞的比例明显增加，而免疫抑制型Treg+T细胞的数量明显下降，提示双靶向载药脂质体能通过调节T细胞的免疫应答，通过增强杀伤型T细胞的比例，下调免疫抑制性T细胞的比例增强肿瘤的免疫应答，从而实现抑制肿瘤生长的效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院上海药物研究所

<120> 一种脂质体递药体系及其制备方法和用途

<130> DI20-1913-XC37

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KC26

<400> 1

Lys Glu Glu Glu Glu Glu Asn Glu Glu Glu Glu Gly Pro Thr Asn Asn

1 5 10 15

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys

20 25

Claims (10)

1.一种脂质体递药体系，其特征在于，所述脂质体递药体系负载有肿瘤治疗药物和非必须的成像分子，其中，在脂质体表面修饰legumain响应的多肽和甘露糖。

2.根据权利要求1所述的脂质体递药体系，其中，脂质体的粒径小于200nm，优选小于100nm，更优选为95nm。

3.根据权利要求1所述的脂质体递药体系，其中，所述肿瘤治疗药物包括雷公藤红素。

4.根据权利要求1所述的脂质体递药体系，其中，所述成像分子包括DiR。

5.根据权利要求1所述的脂质体递药体系，其中，甘露糖和legumain响应的多肽通过聚乙二醇作为连接臂修饰到脂质体表面。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的脂质体递药体系，其中，所述legumain响应的多肽包括KC26。

7.如权利要求1-6中任一项所述的脂质体递药体系的制备方法，其特征在于，包括在脂质体内负载肿瘤治疗药物和非必须的成像分子以及在脂质体的表面修饰靶向legumain的多肽序列和靶向甘露糖受体的甘露糖的步骤。

8.如权利要求1-6中任一项所述的脂质体递药体系的制备方法，包括：

(a)称取蛋黄卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀-Man、DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal溶于有机溶剂之中，加到圆底烧瓶中；称取肿瘤治疗药物和非必须的成像分子，用有机溶剂溶解并加入到所述圆底烧瓶中，混匀；使用旋转蒸发仪真空旋蒸除去有机溶剂，在圆底烧瓶底部形成薄膜；

(b)向圆底烧瓶中加入适量PBS缓冲液作为水化液，形成橙黄色透明溶液；

(c)采用脂质体挤出仪，将制备的脂质体先后过不同尺寸的聚碳酸酯膜，各挤出数次；

(d)向(c)所制备的脂质体中加入legumain响应的多肽，室温搅拌反应过夜；

(e)除去游离药物，即得脂质体递药体系。

9.如权利要求1-6中任一项所述的脂质体递药体系在制备用于治疗legumain阳性的肿瘤的药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述legumain阳性的肿瘤包括结肠癌。

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