CN112891339A - 包封青蒿素的血红素纳米囊泡、制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了包封青蒿素的血红素纳米囊泡、制备方法和用途。该囊泡包括内核层和外壳层，所述外壳层由磷脂‑氯高铁血红素结合物和其他磷脂组成，所述外壳层包覆在内核层的外表面，囊泡的直径为100‑200nm。本发明所制备的纳米囊泡可以靶向聚积在肿瘤部位，并且在肿瘤微环境下释放血红素，同时刺激青蒿素充分发挥抗肿瘤作用，达到治愈肿瘤的效果。另外，本文所述纳米囊泡具有较高的口服生物利用度，且可以使肿瘤细胞发生免疫源性细胞死亡(ICD)，激起机体免疫反应进一步杀死肿瘤细胞。由于其优异的靶向性和癌症治疗效果，可以作为一种新型无副作用的口服抗癌剂。

Description

包封青蒿素的血红素纳米囊泡、制备方法和用途
技术领域
本发明涉及纳米材料、制备方法和用途，特别涉及包封青蒿素的血红素纳米囊泡、制备方法和用途。
背景技术
癌症目前治疗方法有放射治疗、手术治疗和全身治疗等，其中全身治疗又包括化疗、激素治疗、免疫治疗和靶向治疗。化疗作为临床上最常用的治疗手段，其引起的毒副作用却成为阻碍其发展的重要因素，因此，迫切需要开发一种治疗效果好、生物安全性高以及成本低的天然药物及治疗方法。
有研究表明，青蒿素(artemisinin，ART)及其衍生物，除了极强的抗疟活性，也具有明显的抗癌活性，且无明显毒副作用。人们普遍认为其作用机制是由于其独特的过氧桥结构在还原性血红素(heme)和亚铁离子的环境中活化和断裂，诱发一系列化学反应，混杂地靶向细胞内多种蛋白，产生高毒性的活性氧。然而，最近研究人员发现，相对于亚铁离子来说，heme可能是更强的ART激活剂。主要表现为当抑制heme生物合成途径后，可以明显阻断ART的活化，而螯合亚铁离子并无此效果。因此，heme既是ART特异性激活的关键，也是肿瘤细胞生长繁殖所必需的营养物质。
另外，ART类药物还具有抗肿瘤免疫活性，可以增强T细胞在免疫原性肿瘤环境中的活化、增殖和浸润，进一步诱导癌细胞死亡。基于这一特点，将化疗和免疫治疗联合，可以进一步增强抗癌效果，且不会对其他正常组织造成损伤。然而，ART水溶性低，体内半衰期短，生物利用率不高。
现已有大量研究对ART化学结构进行改造来增强其水溶性，多种纳米载体包括脂质体、无机纳米粒在内也被用来更高效的递送ART。例如高治国等人研究发现用氧化铁纳米颗粒制备的磁性脂质体cRGD-AFePt@NPs，与其他对照组相比，实现了纳米颗粒的靶向递送，聚积在肿瘤位置后ART和顺铂高效地协同杀死肿瘤细胞。但是其缺乏在动物体内的进一步验证。此外，在WO 2011/044671中揭露了一种卟啉-磷脂结合物的双分子层囊泡(porphysome)的制备方法及应用，可用于光热治疗、光声成像和荧光成像。在其后续研究中，发现了其载药功能以及耐酸等物理特性。因此，寻找一种纳米载体，既能共同递送ART及其刺激物heme来增强对肿瘤的杀伤作用，又能实现较高的生物利用度和肿瘤靶向性，成为亟待解决的问题。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供一种装载ART、肿瘤靶向、可口服的磷脂-氯高铁血红素纳米囊泡，在实体肿瘤处实现更多的heme和ART药物聚积，具有更强的抗肿瘤效果。具体来说，本发明设计并成功合成磷脂-氯高铁血红素共价交联物(lipid-hemin)，并将其作为主要组成制备出具有靶向功能、包封ART的纳米囊泡(FA-Hemesome-ART NPs)。
技术方案：本发明提供一种包封青蒿素的血红素纳米囊泡，包括内核层和外壳层，所述外壳层由磷脂-氯高铁血红素结合物和磷脂组成，所述外壳层包覆在内核层的外表面，囊泡的直径为100-200nm。由于血红素纳米囊泡含有叶酸修饰的磷脂，因此具有肿瘤细胞靶向的能力，使更多纳米囊泡积聚在肿瘤处。纳米囊泡性状优选为球形。
进一步地，所述外壳层为双层结构，在外壳双层中包封了抗肿瘤药物青蒿素。
进一步地，包含85摩尔％的磷脂-氯高铁血红素结合物、15摩尔％的磷脂DSPE-PEG2000或包含85摩尔％的磷脂-氯高铁血红素结合物、13摩尔％的磷脂DSPE-PEG2000和2摩尔％DSPE-PEG2000-FA或包含73摩尔％的磷脂-氯高铁血红素结合物、15摩尔％的磷脂DSPE-PEG2000、2摩尔％DSPE-PEG2000-FA和10摩尔％的青蒿素。
进一步地，可在微酸以及富含磷脂酶(PLA2)的肿瘤微环境下，裂解，并释放出游离的青蒿素和氯高铁血红素，在肿瘤微环境响应释放青蒿素后，其同时释放的氯高铁血红素被还原成血红素，并与细胞内自生的血红素，共同刺激青蒿素过氧桥断裂，进而产生更多活性氧簇(ROS)。
进一步地，通过静脉施用或口服施用给药。通过灌胃方式时在胃肠道中有较好稳定性，且可通过肠道吸收入血液。
所述的包封青蒿素的血红素纳米囊泡的制备方法，包括如下步骤：
(1)向1-十六酰-SN-丙三醇-磷酸胆碱加入无水二氯甲烷溶解，再加入hemin，4-二甲氨基吡啶，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，在无水无氧黑暗条件下搅拌完成酯化反应，纯化后的lipid-hemin，反应步骤如下：
Figure BDA0002918466340000031
(2)将lipid-hemin：DSPE-PEG2000：DSPE-PEG2000-FA按比例混合，溶解在氯仿和甲醇的混合溶剂中，称取ART加入上述多种磷脂混合液中，旋蒸后真空干燥得到磷脂膜，加入磷酸缓冲盐溶液，水化，冻融，过聚碳酸酯膜挤出器挤出，过滤膜，超滤离心，得纯化后的FA-Hemesome-ART NPs。
进一步地，所述步骤(1)加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺后加入N，N-二甲基甲酰胺助溶。
所述的包封青蒿素的血红素纳米囊泡在制备可口服的靶向肿瘤、治疗癌症的药物中的用途。
所述的包封青蒿素的血红素纳米囊泡在制备毒副作用低、生物兼容性高的药物载体中的用途。
所述的包封青蒿素的血红素纳米囊泡在制备可与免疫检查点阻滞剂联合增强抗癌效果的药物中的用途。
本发明机理如下所述：
第一方面，由lipid-hemin共价交联物组成的Hemesome囊泡作为载体，具有较强的水溶性，较长的体内循环时间，以及胃肠吸收能力。
本发明所示的lipid-hemin交联物结构如式I所示：
Figure BDA0002918466340000041
第二方面，lipid-hemin共价结合的酯键，在肿瘤富含磷脂酶(phospholipase，PLA2)以及弱酸(pH 5.5)的条件下断裂，释放出的氯高铁血红素hemin被胞内还原性物质进一步还原成heme，并激活同时被释放出的ART，明显增强其抗癌活性。
第三方面，本发明提供所述纳米囊泡FA-Hemesome-ART NPs的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)按照lipid-hemin∶DSPE-PEG2000∶DSPE-PEG2000-FA＝85∶13∶2的摩尔比，溶解在氯仿∶甲醇＝2∶1(v∶v)的混合溶剂中；
(2)称量10摩尔％ART加入上述多种磷脂混合液中，真空干燥得到混合磷脂膜；
(3)加入3-5mL的磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH 7.4)，50℃水化1h，冻融循环5次；
(4)过0.1μm聚碳酸酯膜挤出器挤出，再过0.22μm滤膜，超滤离心3000转，20分钟，得纯化后的FA-Hemesome-ART NPs。
有益效果：
1、lipid-hemin作为纳米囊泡的磷脂骨架结构，极大地提高了其同时作为药物对heme的包封率。
2、磷脂中混入DSPE-PEG2000-FA，极大地增加了纳米材料的靶向性，使更多的药物积聚在实体瘤部位。
3、lipid-hemin特异性响应肿瘤微环境，自身供应ART的刺激物heme，显著增强ART的抗癌效果。
4、具有较高的口服生物利用度以及极弱的药物全身性毒性。
5、与免疫检查点阻滞剂联合用药，甚至可以达到根除肿瘤的效果。
6、本文所述纳米囊泡具有较高的口服生物利用度，且可以使肿瘤细胞发生免疫源性细胞死亡(ICD)，激起机体免疫反应进一步杀死肿瘤细胞。由于其优异的靶向性和癌症治疗效果，可以作为一种新型无副作用的口服抗癌剂。
附图说明
图1：lipid-hemin的质谱；
图2：lipid-hemin的红外光谱表征；
图3：FA-Hemesome-ART NPs的TEM扫描电镜图；
图4：FA-Hemesome-ART NPs在PBS、模拟胃液(simulated gastric fluid，SGF)、模拟肠液(simulated intestinal fluid，SIF)、培养基(DMEM，含10％血清)、含200U PLA2的pH 5.5的PBS条件下孵育48小时过程中的粒径分布；
图5：FA-Hemesome-ART NPs在PBS、SGF、SIF、培养基(DMEM，含10％血清)、含200UPLA2的pH 5.5的PBS条件下的ART释放曲线；
图6：紫外法测hemin的吸光度-浓度标准曲线；
图7：不同给药组处理小鼠乳腺癌4T1细胞后，细胞内hemin含量；
图8：不同给药组对4T1细胞的毒性结果图；
图9：不同给药组在4T1细胞中ROS产生情况；
图10：不同给药组处理人结肠癌Caco-2细胞后的表观渗透系数(Papp)；
图11：4T1细胞表面的钙网蛋白(calreticulin，CRT)表达荧光图，scale bar：100μm；
图12：FA-Hemesome-ART NPs口服给药后，在BALB/c小鼠的(A)体内肠道中分布情况，(B)肿瘤分布情况；
图13：FA-Hemesome-ART NPs和ART口服后体内药物浓度-时间曲线；
图14：活体治疗实验，4T1细胞-BALB/c小鼠模型中，不同组的肿瘤生长曲线；
图15：活体治疗实验，各治疗组荷瘤小鼠的体重变化情况；
图16：口服后第一天和第七天的小鼠(A)生化指标及(B)血常规，(C)苏木精和曙红(HE)染色；
图17：MC38细胞-C57BL/6小鼠模型中各给药组的肿瘤生长曲线；
图18：MC38细胞-C57BL/6小鼠模型中，给药治疗后，肿瘤内各免疫蛋白指标含量变化，(A)杀伤性T细胞，(B)调节性T细胞；
图19：MC38细胞-C57BL/6小鼠模型，给药治疗后，再次皮下注射肿瘤，该肿瘤生长趋势；
图20：MC38细胞-C57BL/6小鼠模型中，给药预处理后的MC38细胞注射到小鼠皮下七天后，给予未给药处理过的MC38细胞，观察其成瘤情况；
图21：本发明的反应机理图。
具体实施方式
实施例1：lipid-hemin的合成和表征
1、方法：
1-十六酰-SN-丙三醇-磷酸胆碱(Lyso 16∶0)加入到50mL圆底烧瓶中，加入无水二氯甲烷溶解，再加入0.5当量的hemin，0.75当量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，3当量的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，必要时可加1mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)助溶。在无水无氧黑暗条件下搅拌48小时以完成酯化反应。反复洗涤干燥。再通过柱层析色谱法，以二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，得到纯化后的lipid-hemin。
反应步骤如下：
Figure BDA0002918466340000061
2、结果
对纯化后的lipid-hemin进行HPLC-MS表征，结果如图1所示，其中1130.06为lipid-hemin+H+，表明了lipid-hemin的成功合成。在红外光谱中，通过lipid游离羟基的伸缩振动(宽峰，3500～4000cm-1)、hemin中羧酸的伸缩振动(宽峰，2200～3500cm-1)以及lipid-hemin中磷氧双键的伸缩振动(尖峰，1150～1250cm-1)的特征峰，可以确认符合目标化合物的结构，同时与质谱相互印证。
实施例2：FA-Hemesome-ART的制备方法及表征
1、方法：
按照lipid-hemin∶DSPE-PEG2000∶DSPE-PEG2000-FA＝85∶13∶2的摩尔比，溶解在氯仿∶甲醇＝2∶1(v∶v)的混合溶剂中；称取10摩尔％ART加入上述多种磷脂混合液中，旋蒸后真空干燥得到磷脂膜；加入5mL的磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH 7.4)，50℃水化1h，冻融循环5次；过0.1μm聚碳酸酯膜挤出器挤出，过0.22μm滤膜，超滤离心3000转，20分钟，得纯化后的FA-Hemesome-ART NPs。
2、结果
其TEM形貌观测如图3所示，呈大小均一的球形结构。
实施例3：FA-Hemesome-ART纳米囊泡的稳定性
1、方法
在PBS、SGF、SIF和培养基(DMEM，含10％血清)条件下，孵育48h过程中，在相应的时间点对FA-Hemesome-ART纳米囊泡的水合粒径进行测量(LitesizerTM 500，Anton Paar，Austria)。
2、结果
不同环境条件下，FA-Hemesome-ART NPs的粒径随着孵育时间的变化如图4所示。在以上所述条件下，粒径大小均无明显改变，证明该纳米囊泡在胃肠道以及血液中的稳定性。另外，在SIF和SGF中粒径略大，可能由于纳米囊泡与介质中蛋白相互作用使其粒径增大，但在可接受范围内，对纳米囊泡的摄取以及体内吸收影响不大。
实施例4：FA-Hemesome-ART纳米囊泡的释放情况
1、方法
将1mL FA-Hemesome-ART NPs样品溶液装入透析袋(3500Da)，浸没在不同释放环境中，持续搅拌48h，于不同时间点取透析外液1mL，再补充1mL新鲜介质。最后对收集的透析外液进行ART含量测定。
2、结果
FA-Hemesome-ART纳米囊泡中ART在48小时内的释放曲线如图5所示。表明在模拟肿瘤微环境的条件下(PLA2+pH 5.5)，ART大约有90％的释放量，相反，在模拟的胃肠道环境下，仅有约20％的释放量，因此，该纳米囊泡可以选择性响应肿瘤微环境，来释放ART药物。
实施例5：FA-Hemesome-ART纳米囊泡的细胞摄取
1、方法
主要是验证在细胞摄入FA-Hemesome-ART NPs后，是否可以增加胞内的hemin含量。受试对象为4T1细胞。
胞内hemin含量通过紫外方法检测，具体步骤如下：
(1)细胞用DMEM(凯基)培养基培养至对数期后，胰酶消化，稀释后接种到6孔板中，放置培养箱中培养；
(2)将hemin、Hemesome、FA-Hemesome-ART分别按照一定的比例稀释，使hemin的终浓度均为36μM，并设置空白对照组以及复孔，与细胞共培养24小时；
(3)PBS清洗细胞，并收集PBS洗液，不同给药组取等量细胞进行超声破碎后离心，得到澄清溶液；
(4)对每个样本溶液中400nm波长下的吸光度进行测量，根据标准样品浓度-吸光度的模拟曲线，计算hemin浓度。
2、结果
用标准样品制得的标准曲线如图6所示，其线性关系式为Y＝0.3253×x+0.0908，R2＝0.9998；4T1细胞在被不同给药组处理后，胞内hemin含量如图7所示，在FA-Hemesome-ART NPs处理后，可以明显增加胞内的hemin含量。Hemesome由于没有靶向基团，进入细胞的数量有限；hemin水溶性较差，作为小分子进入细胞后，其代谢较快，在胞内停留时间较短。
实施例6：FA-Hemesome-ART纳米囊泡对4T1细胞的毒性试验
1、方法
采用国际通用的MTT法对材料毒性进行分析。受试对象4T1细胞。将ART、Hemesome、Hemesome-ART、FA-Hemesome-ART、FA+FA-Hemesome-ART纳米囊泡分别按照一定的倍数稀释，使各给药组的ART最终浓度为36μM，设置空白组及复孔，与细胞共培养24h；
将预配制好的MTT溶液(5mg/mL)加入到各孔中，每孔20uL，继续置于培养箱中孵育4h；小心除去MTT溶液，每孔加150μL二甲基亚砜(DMSO)，充分震荡10min，用酶标仪检测各孔在570nm处的吸光度OD值，将三个复孔的平均OD值作为目标样品的OD值，计算细胞存活率：
细胞存活率＝样品OD/空白对照组OD×100％
2、结果
FA-Hemesome-ART NPs及其对照组的细胞毒性试验结果如图8所示，在ART药物36μM的条件下，单独使用ART由于其水溶性差等原因，对4T1细胞的毒性较小；作为载体的Hemesome几乎无毒性，但在FA-Hemesome-ART NPs中，细胞存活率明显降低至30％，主要是由于叶酸(FA)的靶向能力以及胞内增加的heme刺激ART而发挥作用。若预先用叶酸孵育细胞，则FA-Hemesome-ART NPs的毒性明显降低，也可表明叶酸的靶向作用对于纳米囊泡进入细胞至关重要。
实施例7：FA-Hemesome-ART纳米囊泡在细胞内的活性氧(ROS)水平
1、方法
受试对象为4T1细胞。将ART、Hemesome-ART、FA-Hemesome-ART纳米囊泡分别按照一定的倍数稀释，使ART药物的最终浓度为36μM，设置空白组及复孔，放置培养箱中孵育6h；PBS清洗细胞后，含DCFH-DA(10μM)的新鲜DMEM培养基加入到各孔中，37℃培养20min后，再次用PBS清洗，放置在荧光显微镜下观察。
2、结果
FA-Hemesome-ART纳米囊泡在与细胞孵育6h后，其荧光图如图9所示，与其他对照组相比，有明显的绿色荧光效果，表明在此给药浓度下，可以在细胞内产生较多的ROS，进而杀死癌细胞。
实施例8：FA-Hemesome-ART纳米囊泡的Caco-2细胞跨膜转运试验
1、方法
(1)构建Caco-2细胞跨膜转运模型：
受试对象为人结肠癌Caco-2细胞，用DMEM(凯基)培养基培养。首先将处于对数生长期的Caco-2细胞以6×104/mL细胞接种于Transwell 24孔板中，Transwell滤膜的顶侧(apical side，AP)加入细胞悬液，基地侧(basolateral side，BL)加入无细胞培养基。此后一周每隔一天更换新鲜培养基，第二周开始每天更换新鲜培养基，直到用跨膜电阻抗(Transepithelial electrical resistance，TEER)测得电阻大于500Ω·cm2时，表明此细胞模型建立成功，Caco-2细胞已成功分化出微绒毛等结构。
(2)FA-Hemesome-ART的跨膜转运
在模型建立成功的基础上，吸取AP侧和BL侧培养基，加入空白Hank′s平衡盐溶液(HBSS)放入培养箱中培养平衡30min后，分别吸出AP侧和BL侧的溶液，作为空白对照；在AP端加入FA-Hemesome-ART NPs溶液，BL侧加入HBSS，37℃培养4h后，吸取100μL BL侧溶液，对ART含量进行测定，并计算表观渗透系数Papp(cm/s)＝ART渗透量/(聚碳酸酯膜表面积×ART初浓度×时间)。
2、结果
Caco-2细胞是一种人克隆结肠腺癌细胞，其结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，并具有与小肠刷状缘上皮相关的酶系，因此选用该细胞模型用于模拟体内肠道微环境。ART含量通过紫外方法测定后，计算表观渗透系数(Papp)＝6.23×10- 6cm/s，相比于对照组有明显提高，表明FA-Hemesome-ART纳米囊泡吸收良好，(图10)。
实施例9：FA-Hemesome-ART纳米囊泡对细胞膜上钙网蛋白(CRT)表达的影响
1、方法：
受试对象4T1细胞。细胞密度达到70％左右时，FA-Hemesome-ART NPs给药孵育6-8h；5％BSA封闭，37℃，1-2小时；一抗孵育(Calreticulin Rabbit PolyAb，稀释100倍)，加到皿中，确保可以润到细胞表面，37℃孵育2h；用PBS洗2遍，二抗(Alexa Fluor 488GoatAnti-Rabbit IgG(H+L)，稀释100倍)37℃孵育1h；细胞核染色，PBS洗2遍，加4％多聚甲醛，室温孵育15-20min，PBS洗细胞，加DAPI后37℃孵育15-20min。
荧光显微镜观察：上机前，把多余染料洗干净，并加PBS润到细胞表面，用荧光显微镜观察。
2、结果
如图11所示，通过在荧光显微镜下观察，可以清晰地看到FA-Hemesome-ART NPs组的绿色荧光明显强于空白组，表明FA-Hemesome-ART NPs增加细胞膜上钙网蛋白的表达，即FA-Hemesome-ART NPs具有诱导肿瘤细胞发生免疫源性细胞死亡的能力。
实施例10：FA-Hemesome-ART纳米囊泡口服给药后在BALB/c小鼠体内的分布情况
1、方法：
用PpIX替换掉hemin，合成出lipid-PpIX，制备得FA-PpIXsome-ART NPs，用于荷瘤小鼠活体成像实验。每组3只小鼠，分别于灌胃后3、12、24、36h对小鼠进行解剖，取胃肠道及肿瘤进行荧光成像。
2、结果：
FA-PpIXsome-ART NPs给小鼠灌胃后，36h体内分布情况如图12(A)所示，可以明确地看出该药物在胃肠道的下移轨迹，以及逐渐在肿瘤部位积聚的过程，在36h时，展现出最强的肿瘤荧光效果，即较多的药物由于FA的靶向作用积聚在肿瘤部位(图12B)。
实施例11：FA-Hemesome-ART纳米囊泡的体内药代动力学参数分析
1、方法：
(1)设置给药组分别为：ART、FA-Hemesome-ART NPs口服给药。按照不同给药组对小鼠处理后，分别于不同时间点取血350μL装入抗凝管中；
(2)取血样离心，12000转，10分钟，得上层血浆样品；
(3)甲醇提取ART药物，涡旋5min，分离出有机层溶液，再次离心，11000转，5min；
(4)上清液干燥后，用100μL甲醇复溶，过0.22μm滤膜，准备HPLC进样，HPLC条件如下：乙腈∶水＝6∶4，含0.1％三氟乙酸，流速0.5mL/min，检测波长210nm。
2、结果
为了验证FA-Hemesome-ART纳米囊泡的体内吸收、代谢等情况，与ART进行对比，得到如图13所示体内药物浓度-时间曲线，FA-Hemesome-ART NPs作为一种囊泡类纳米材料，与游离ART药物相比，灌胃给药方式有较长的体内循环时间以及较高的生物利用率，极大地缓解了ART水溶性差，体内代谢快的缺点。
实施例12：FA-Hemesome-ART纳米囊泡及其对照组在体内抗肿瘤效果
1、方法
(1)4T1-BALB/c荷瘤小鼠模型建立：1×106个4T1细胞皮下注射到BALB/c小鼠，5-7天小鼠肿瘤长至60mm3左右开始治疗；
(2)设置给药组分别为：ART口服/静脉给药，FA-Hemesome-ART口服/静脉给药，每隔1天给药一次(ART 5mg/kg)；对小鼠的体重和肿瘤大小进行称重和测量，肿瘤大小计算公式如下：
V＝长×宽×宽/2。
2、结果
小鼠在不同组处理后肿瘤生长曲线如图14所示，可以看到口服FA-Hemesome-ART纳米囊泡的治疗效果显著，在第十四天时，肿瘤仅增长了1.5倍，而口服ART组虽然剂量一致，但由于其水溶性差以及较快的体内代谢导致治疗效果较差，生物利用度低。然而，在FA-Hemesome-ART NPs的静脉给药组，抑瘤效果更佳，主要是由于静脉注射后药物在全身代谢损失较小，亦可以看到口服效果同静脉注射相差无几。
如果15所示，小鼠体重无明显降低的趋势，表明此材料对小鼠身体无明显损伤。
实施例13：小鼠生化指标、血常规变化以及各脏器的苏木精和曙红(HE)染色情况
1、方法：
给正常BALB/c小鼠灌胃FA-Hemesome-ART纳米囊泡后，分别于给药前、给药后第一天和第七天眼眶取血，进行血常规和生化指标分析。另外，将实施例12中口服治疗后小鼠的心、肝、脾、肺、肾解剖出来，用于苏木精和曙红(H&E)染色。
2、结果
为了评价本专利构建的纳米囊泡具有良好的生物安全性，因此对给药前后小鼠进行一次生物安全性评价。将小鼠给药前各指标作为空白对照，各指标做成柱状图结果如图16(A)(B)所示，各项指标在给药后均在正常范围内波动。HE染色处理后的图片可以看出各脏器的细胞均无明显损伤(图16C)。综上，FA-Hemesome-ART NPs有良好的生物安全性。
实施例14：体内免疫相关蛋白指标分析
1、方法
(1)MC38-C57BL/6荷瘤小鼠模型：1×106个MC38细胞皮下注射到C57BL/6小鼠，5-7天小鼠肿瘤长至60mm3左右开始治疗；
(2)设置给药组分别为PBS、aPD-L1、ART、FA-Hemesome-ART NPs以及FA-Hemesome-ART NPs与aPD-L1联用组；
(3)治疗14天后，解剖小鼠，制备肿瘤单细胞悬液；
(4)根据各抗体说明书对单细胞悬液的相关免疫蛋白染色，包括杀伤性T细胞的CD3、CD4、CD8以及调节性T细胞的CD25、Foxp3最终流式上机检测。
2、结果
为了探究FA-Hemesome-ART纳米囊泡在小鼠体内诱发机体免疫应答的情况，采用MC38-C57BL/6荷瘤小鼠模型，主要是由于相比于4T1-BALB/c荷瘤小鼠模型，此模型的化疗和免疫治疗结合后抗肿瘤效果增强更明显。各组治疗结果如图17所示，FA-Hemesome-ARTNPs联合anti-PD-L1治疗效果更强，14天后可以达到根除肿瘤的效果。
小鼠肿瘤内各免疫蛋白指标含量情况如图18所示，FA-Hemesome-ART NPs明显提高杀伤性T细胞(CD3+CD8+)，减少调节性T细胞(CD25+Foxp3+)，联合anti-PD-L1后效果更加显著。验证了FA-Hemesome-ART纳米囊泡可以增强肿瘤特异性T细胞的激活、增殖以及浸润，最终诱发全身免疫反应。
实施例15：小鼠抗肿瘤再复发实验
1、方法
按照实施例14构建MC38-C57BL/6荷瘤小鼠模型，设置分组：PBS和FA-Hemesome-ART NPs和FA-Hemesome-ART NPs联合aPD-L1组，灌胃给药治疗，14天后，在已有肿瘤对侧，再次皮下注射1×106个MC38细胞，观察新肿瘤的增长趋势。
2、结果
为了验证FA-Hemesome-ART NPs对小鼠肿瘤再复发的抑制能力，在荷瘤小鼠治疗后，再次重新接种肿瘤细胞，第二个肿瘤生长情况如图19所示，清晰表明在FA-Hemesome-ART NPs联合免疫阻断剂aPD-L1治疗14天后，第二个肿瘤在此后30天内几乎没有长起来；相反，PBS组肿瘤增长迅速。由此可以表明，FA-Hemesome-ART纳米囊泡具有较强的诱导全身免疫的能力，并且有记忆效应，再次接种同种肿瘤细胞，可以明显抑制其生长繁殖。
实施例16：抗肿瘤疫苗实验
1、方法
(1)用PBS和FA-Hemesome-ART NPs分别孵育MC38细胞，放置37℃培养箱中24小时，纳米囊泡组细胞已处于将死状态；
(2)将处理过的细胞消化下来制备成单细胞悬液，取1×106个MC38细胞，皮下注射于C57BL/6小鼠；
(3)七天之后，在空白对侧皮下注射2×105个正常MC38细胞，观察此肿瘤生长情况。
2、结果
将给药处理过的将死细胞以疫苗形式注射入小鼠皮下，七天后再次注射正常细胞，FA-Hemesome-ART NPs组对于第二个肿瘤有免疫效果，30天内四只小鼠的肿瘤均无生长趋势，而PBS组在第20天已有小鼠长出肿瘤(图20)。综上所述，FA-Hemesome-ART纳米囊泡处理过的细胞可以诱发全身抗肿瘤免疫，对于第二次注射肿瘤，机体有较强的对抗能力。

Claims (10)

1.一种包封青蒿素的血红素纳米囊泡，其特征在于：包括内核层和外壳层，所述外壳层由磷脂-氯高铁血红素结合物和磷脂组成，所述外壳层包覆在内核层的外表面，囊泡的直径为100-200nm。
2.根据权利要求1所述的包封青蒿素的血红素纳米囊泡，其特征在于：所述外壳层为双层结构，在外壳双层中包封了抗肿瘤药物青蒿素。
3.根据权利要求1所述的包封青蒿素的血红素纳米囊泡，其特征在于：包含85摩尔％的磷脂-氯高铁血红素结合物、15摩尔％的磷脂DSPE-PEG2000或包含85摩尔％的磷脂-氯高铁血红素结合物、13摩尔％的磷脂DSPE-PEG2000和2摩尔％DSPE-PEG2000-FA或包含73摩尔％的磷脂-氯高铁血红素结合物、15摩尔％的磷脂DSPE-PEG2000、2摩尔％DSPE-PEG2000-FA和10摩尔％的青蒿素。
4.根据权利要求1所述的包封青蒿素的血红素纳米囊泡，其特征在于：可在微酸以及富含磷脂酶(PLA2)的肿瘤微环境下，裂解，并释放出游离的青蒿素和氯高铁血红素，在肿瘤微环境响应释放青蒿素后，其同时释放的氯高铁血红素被还原成血红素，并与细胞内自生的血红素，共同刺激青蒿素过氧桥断裂，进而产生更多活性氧簇(ROS)。
5.一种包封青蒿素的血红素纳米囊泡，其特征在于：通过静脉施用或口服施用给药。
6.权利要求1所述的包封青蒿素的血红素纳米囊泡的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)向1-十六酰-SN-丙三醇-磷酸胆碱加入无水二氯甲烷溶解，再加入hemin，4-二甲氨基吡啶，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，在无水无氧黑暗条件下搅拌完成酯化反应，纯化后的lipid-hemin，反应步骤如下：
Figure FDA0002918466330000021
(2)将lipid-hemin：DSPE-PEG2000：DSPE-PEG2000-FA按比例混合，溶解在氯仿和甲醇的混合溶剂中，称取ART加入上述多种磷脂混合液中，旋蒸后真空干燥得到磷脂膜，加入磷酸缓冲盐溶液，水化，冻融，过聚碳酸酯膜挤出器挤出，过滤膜，超滤离心，得纯化后的FA-Hemesome-ART NPs。
7.根据权利要求6所述的包封青蒿素的血红素纳米囊泡的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺后加入N，N-二甲基甲酰胺助溶。
8.权利要求1所述的包封青蒿素的血红素纳米囊泡在制备可口服的靶向肿瘤、治疗癌症的药物中的用途。
9.权利要求1所述的包封青蒿素的血红素纳米囊泡在制备毒副作用低、生物兼容性高的药物载体中的用途。
10.权利要求1所述的包封青蒿素的血红素纳米囊泡在制备可与免疫检查点阻滞剂联合增强抗癌效果的药物中的用途。
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