CN105055315A - 一种交联线粒体靶向阿霉素脂质体及其制备方法 - Google Patents
一种交联线粒体靶向阿霉素脂质体及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体，由盐酸阿霉素、磷脂、胆固醇和可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料组成，所述盐酸阿霉素与磷脂的质量比为1：(5～20)，所述磷脂、胆固醇、可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的摩尔比为(50～90)：(2～47)：(3～8)，所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的结构式为
Description
技术领域
本发明属于药物及其制备技术领域，具体涉及一种抗肿瘤药物脂质体及其制备方法。
背景技术
化疗是治疗癌症的主要手段之一，但目前癌症患者化疗后的死亡率仍然居高不下。多药耐药(multidrugresistance，MDR)是临床上化疗失败的主要原因之一。阿霉素是癌症化疗常用的药物，但阿霉素等化疗药物的大量使用容易使细胞产生耐药性。肿瘤细胞的耐药性分为先天性与后天获得性两大类。研究表明，肿瘤细胞基因或基因表型发生变化引起细胞凋亡通路改变，最终导致肿瘤先天耐药性的出现。线粒体是细胞的“动力工厂”，同时也是“自杀武器库”，能启动细胞凋亡通路，因而肿瘤细胞先天性耐药与线粒体功能异常密切相关。以线粒体作为抗癌药物传递系统的靶点，将传统化疗药物递送到肿瘤细胞的线粒体、促使线粒体启动凋亡通路，释放细胞色素C，激活caspase9/3，从而实现肿瘤细胞“自杀”式死亡，这将是克服肿瘤先天性耐药性，提高肿瘤治疗效果的一种有效手段。
CN104523723A提供了一种由嵌段共聚物叶酸-聚乙二醇-聚天冬氨酸、线粒体靶向阿霉素、三苯基磷(TPP-DOX)和阿霉素构成的线粒体靶向胶束载药系统。该胶束载药系统具有线粒体靶向功能，但在将药物阿霉素递送到肿瘤细胞线粒体的过程中存在以下问题：(1)叶酸是疏水性分子，在水溶液环境中，根据亲疏水特性，叶酸分子更倾向于分布在胶束的疏水内核中而不是分布在胶束的亲水外层，从而导致细胞对叶酸修饰的载体摄取率低下，影响抗肿瘤效果；(2)三苯基磷是一种有机磷农药，对眼、上呼吸道、粘膜和皮肤有刺激性，且有神经毒性。毒理学研究资料显示，LD50700mg/kg(大鼠经口)，800～1600mg/kg(小鼠经口)，LC5012167mg/m3，4小时(大鼠吸入)。因此将三苯基磷用于药用材料存在安全隐患。目前未见有关具有线粒体靶向功能的阿霉素脂质体报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种交联线粒体靶向阿霉素脂质体及其制备方法，以使该脂质体不仅具有线粒体靶向性，而且肿瘤细胞摄取量大，安全性高。
本发明所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体，由盐酸阿霉素、磷脂、胆固醇和可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料组成，所述盐酸阿霉素与磷脂的质量比为1：(5～20)，所述磷脂、胆固醇、可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的摩尔比为(50～90)：(2～47)：(3～8)，所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的结构式为
所述结构式中，n＝10，12，14，16。
上述交联线粒体靶向阿霉素脂质体，所述磷脂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化卵磷脂中的一种。
本发明所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体的制备方法，工艺步骤如下：
(1)可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的制备
以脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、多肽D-(KLAKLAK)2-C5和有机碱为原料，多肽D-(KLAKLAK)2-C5、有机碱、脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺的摩尔比为(1～3)：(1～3)：1，所述多肽D-(KLAKLAK)2-C5的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO：1所述；
在氮气保护下，将脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、有机碱和第一溶剂混合均匀得到第一溶液，所述第一溶剂的用量应使第一溶液中脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺的浓度为100～300mmol/L；
在氮气保护下，将多肽D-(KLAKLAK)2-C5溶于第二溶剂中得到第二溶液，第二溶剂的用量应使第二溶液中多肽D-(KLAKLAK)2-C5的浓度为100～900mol/L；
将第一溶液和第二溶液混合，在避光、搅拌下于20～40℃反应12～48小时，反应结束后除去溶剂得到固态物质，将所得固态物质用氯仿或二甲亚砜溶解后过滤掉不溶物，收集滤液，除去滤液中的溶剂即得到可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料；
(2)交联线粒体靶向阿霉素脂质体的制备
将磷脂、胆固醇和步骤(1)制备的可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料溶于第三溶剂中得到第三溶液，所述磷脂、胆固醇、可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的摩尔比为(50～90)：(2～47)：(3～8)，所述第三溶剂用量应使所得第三溶液中磷脂浓度为1～10mmol/L，去除第三溶剂得到脂膜，将所得脂膜与浓度为250～350mmol/L的硫酸氨缓冲液混合并经超声分散均匀得到脂质体悬液，所述硫酸氨缓冲液的用量应使脂质体悬液中磷脂浓度为0.1～10mmol/L，将所得脂质体悬液装入半透膜中，将半透膜浸入去离子水中透析4～12小时，透析结束后，将透析后的脂质体悬液与浓度为1～10mg/mL的阿霉素盐酸盐水溶液混合均匀得到混合悬液，所述阿霉素盐酸盐水溶液的用量应使所得混合悬液中盐酸阿霉素与磷脂的质量比为1：(5～20)，然后在持续通入氧气和搅拌的条件下向所得混合悬液中加入乙二硫醇并反应0.5～24小时，加入的乙二硫醇与混合悬液中可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的摩尔比为(1～5)：1，反应时间届满后，将游离药物和未反应的乙二硫醇去除，即得到交联线粒体靶向阿霉素脂质体。
上述方法中，所述脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺为脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺中的一种。
上述方法中，步骤(1)中所述有机碱为三乙胺、4-二甲氨基吡啶或者N、N-二异丙基乙胺中的任一种。
上述方法中，步骤(1)中所述第一溶剂为二氯甲烷或氯仿。
上述方法中，第二溶剂为甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种。
上述方法中，步骤(2)中所述第三溶剂为三氯甲烷，或二氯甲烷与甲醇以体积比(1～3)：1组合得到的组合溶剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种新的具有交联结构和线粒体靶向功能的阿霉素脂质体。
2、本发明所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体中的药用材料可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂具有聚乙二醇链，从而具有长循环功能功能(实施例6)，并具有可交联结构巯基，脂质体在加入乙二硫醇并通氧气条件下以共价键的形式形成二硫键交联结构，使得脂质体进入人体后在血液循环中具有良好的稳定性，不容易解体，有利于脂质体跨越血管屏障递送药物。同时由于肿瘤血管壁上皮细胞间隙比正常血管壁的上皮细胞间隙大，稳定的载药脂质体在体内的循环时间长有利于载药脂质体从肿瘤血管渗出，通过增强渗透与滞留效应(EPR效应)使更多的载药脂质体进入肿瘤组织，因此具有更好的肿瘤组织靶向性，有利于提高耐药肿瘤治疗效果。
3、本发明所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体进入肿瘤组织间隙后，由于该载药脂质体zeta电位为正，更容易通过静电作用吸引显负电荷的肿瘤细胞摄取，加之载药脂质体具有交联结构，稳定性高，能避免脂质体解体，避免药物提前释放，顺利穿透肿瘤细胞外基质和肿瘤细胞膜的质膜屏障，将药物递送至肿瘤细胞内，因此细胞摄取量大(见实施例7)，有利于提高耐药肿瘤治疗效果。
4、本发明所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体进入肿瘤细胞后，因肿瘤细胞内的谷胱甘肽浓度高于血液和组织间隙，脂质体因二硫键形成的交联结构在谷胱甘肽还原作用下断裂，有利于脂质体进入线粒体后药物释放，有更多的药物释放到线粒体中，因此线粒体摄取量大，线粒体靶向性好，从而促使线粒体启动凋亡通路，更有效的抑制多药耐药肿瘤的生长(实施例8)，有利于提高耐药肿瘤治疗效果。
5、本发明所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体以无毒副作用的多肽D-(KLAKLAK)2-C5为线粒体靶向分子，同时稳定性高，不容易解体，在血液循环中药物释放缓慢，因此对正常组织的毒副作用小很小，从而保证了脂质体的使用安全性。
6、本发明所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体制备方法操作简单，工艺条件温和，采用常规设备即可实现。
附图说明
图1是实施例1制备的可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的质谱图。
图2是实施例1制备的可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的核磁氢谱图。
图3是实施例1～4制备的可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的细胞毒性测试结果。
图4是实施例1制备的交联线粒体靶向脂质体和普通脂质体的细胞摄取实验结果图。
图5是实施例1制备的交联线粒体靶向脂质体和普通脂质体的线粒体摄取实验结果图。
图6为荷瘤小鼠尾静脉注射实施例2制备的交联线粒体靶向阿霉素脂质体后肿瘤体积变化曲线(**表示P<0.01)。
图7为荷瘤小鼠尾静脉注射实施例2制备的交联线粒体靶向阿霉素脂质体后体重变化曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体及其制备方法做进一步说明。
以下实施例中，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺(DSPE-PEG2000-Mal)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺(DMPE-PEG2000-Mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺(DPPE-PEG2000-Mal)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺(DLPE-PEG2000-Mal)购自美国Nanocs公司。D-(KLAKLAK)2-C5多肽购自中科亚光科技有限公司。盐酸阿霉素购自大连美仑生物技术有限公司。大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化卵磷脂、胆固醇购自西安瑞禧生物科技有限公司。
实施例1
本实施例所述阿霉素脂质体由阿霉素、大豆卵磷脂、胆固醇和可交联线粒体靶向聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000-KLA)组成。所述盐酸阿霉素与大豆卵磷脂质量比为1：5。大豆卵磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000-KLA的摩尔比为50:47:3，所述DSPE-PEG2000-KLA的结构式为
制备方法如下：
(1)DSPE-PEG2000-KLA的制备
以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG2000-Mal)、多肽D-(KLAKLAK)2-C5和三乙胺为原料，多肽D-(KLAKLAK)2-C5、三乙胺、DSPE-PEG2000-Mal的摩尔比为1:1:1；
在氮气保护下，将DSPE-PEG2000-Mal、三乙胺和氯仿混合均匀得到第一溶液，所述氯仿的用量为使第一溶液中DSPE-PEG2000-Mal的浓度为100mmol/L，三乙胺的浓度为100mmol/L；
在氮气保护下，将多肽D-(KLAKLAK)2-C5溶于甲醇中得到第二溶液，甲醇的用量为使第二溶液中多肽D-(KLAKLAK)2-C5浓度为100mol/L；
将第一溶液和第二溶液混合，在避光、20℃条件下搅拌反应48小时，反应结束后采用减压旋转干燥法蒸除溶剂，将所得固态物质用氯仿溶解，并用滤纸过滤掉不溶物，收集滤液，采用减压旋转干燥法蒸除滤液中的溶剂，即得到DSPE-PEG2000-KLA，其质谱图见图1，氢核磁谱图见图2。
(2)交联线粒体靶向阿霉素脂质体的制备
将磷脂、胆固醇和步骤(1)制备的DSPE-PEG2000-KLA溶于二氯甲烷与甲醇以体积比1:1组合所得的组合溶剂中得到第三溶液，所述大豆卵磷脂、胆固醇与DSPE-PEG2000-KLA的摩尔比为50:47:3，所述组合溶剂的用量以使所得溶液中磷脂浓度为8mmol/L为限，减压蒸馏去除所述组合溶剂后得到脂膜，将所得脂膜与300mmol/L硫酸氨缓冲液混合并经探头超声分散均匀得到脂质体悬液，所述硫酸氨缓冲液的用量以所得脂质体悬液中磷脂浓度为0.1mmol/L计，将所得脂质体悬液装入半透膜中，并将半透膜浸入去离子水中透析4小时，透析结束后，将透析后的脂质体悬液与1mg/ml阿霉素盐酸盐水溶液混合搅拌1小时得到混合悬液，其中盐酸阿霉素与磷脂质量比为1：5。然后在持续通入氧气和搅拌的条件下向所得混合悬液中加入乙二硫醇并反应0.5小时，加入的乙二硫醇与混合悬液中DSPE-PEG2000-KLA的摩尔比为2：1，再通过凝胶渗透柱分离除去游离药物和未反应的乙二硫醇，即得到交联线粒体靶向阿霉素脂质体。
实施例2
本实施例所述阿霉素脂质体由阿霉素、蛋黄卵磷脂、胆固醇和线粒体靶向聚乙二醇化二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE-PEG2000-KLA)组成。所述盐酸阿霉素与蛋黄卵磷脂质量比为1：20。蛋黄卵磷脂、胆固醇和DMPE-PEG2000-KLA的摩尔比为90:2:8，DMPE-PEG2000-KLA的结构式为
所述脂质体的制备方法如下：
(1)DMPE-PEG2000-KLA的制备
以二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DMPE-PEG2000-Mal)、多肽D-(KLAKLAK)2-C5和4-二甲氨基吡啶为原料，多肽D-(KLAKLAK)2-C5、4-二甲氨基吡啶、DMPE-PEG2000-Mal的摩尔比为2:2:1；
在氮气保护下，将DMPE-PEG2000-Mal、4-二甲氨基吡啶、二氯甲烷混合均匀得到第一溶液，二氯甲烷的用量为使第一溶液中DMPE-PEG2000-Mal的浓度为200mmol/L，4-二甲氨基吡啶的浓度为400mmol/L；
在氮气保护下，将多肽D-(KLAKLAK)2-C5溶于N，N-二甲基甲酰胺中得到第二溶液，N，N-二甲基甲酰胺的用量为使第二溶液中多肽D-(KLAKLAK)2-C5浓度为400mol/L；
将第一溶液和第二溶液混合，在避光、40℃条件下搅拌反应24小时，反应结束后采用减压旋转干燥法蒸除溶剂，将所得固态物质用二甲亚砜溶解，并用滤纸过滤掉不溶物，收集滤液，采用减压旋转干燥法蒸除滤液中的溶剂，即得到DMPE-PEG2000-KLA。
(2)交联线粒体靶向阿霉素脂质体的制备
将蛋黄卵磷脂、胆固醇和步骤(1)制备的DMPE-PEG2000-KLA溶于二氯甲烷与甲醇以体积比3:1组合得到的组合溶剂中得到第三溶液，所述蛋黄卵磷脂、胆固醇与DMPE-PEG2000-KLA的摩尔比为90:2:8，所述组合溶剂用量以使所得溶液中磷脂浓度为5mmol/L为限，减压蒸馏去除所述组合溶剂后得到脂膜，将所得脂膜与250mmol/L硫酸氨缓冲液混合并经探头超声分散均匀得到脂质体悬液，所述硫酸氨缓冲液的用量以所得脂质体悬液中磷脂浓度为1mmol/L计，将所得脂质体悬液装入半透膜中，并将半透膜浸入去离子水中透析12小时，透析结束后，将透析后的脂质体悬液与10mg/ml的阿霉素盐酸盐水溶液混合搅拌1小时得到混合悬液，其中盐酸阿霉素与磷脂质量比为1：20。然后在持续通入氧气和搅拌的条件下向所得混合悬液中加入乙二硫醇并反应24小时，加入的乙二硫醇与混合悬液中DMPE-PEG2000-KLA的摩尔比为3：1，再通过凝胶渗透柱分离除去游离药物和未反应的乙二硫醇，即得到交联线粒体靶向阿霉素脂质体。
实施例3
本实施例所述阿霉素脂质体由阿霉素、氢化卵磷脂、胆固醇和线粒体靶向聚乙二醇化二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE-PEG2000-KLA)组成。所述盐酸阿霉素与氢化卵磷脂质量比为1：10。氢化卵磷脂、胆固醇和DPPE-PEG2000-KLA的摩尔比为70:25:5，DPPE-PEG2000-KLA的结构式为
(1)DPPE-PEG2000-KLA的制备
以二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DPPE-PEG2000-Mal)、多肽D-(KLAKLAK)2-C5和N，N-二异丙基乙胺为原料，多肽D-(KLAKLAK)2-C5、N，N-二异丙基乙胺、DPPE-PEG2000-Mal的摩尔比为3:3:1；
在氮气保护下，将DPPE-PEG2000-Mal、N，N-二异丙基乙胺、二氯甲烷混合均匀得到第一溶液，所述二氯甲烷的用量为使第一溶液中DPPE-PEG2000-Mal的浓度为300mmol/L，N，N-二异丙基乙胺的浓度为900mmol/L；
在氮气保护下，将多肽D-(KLAKLAK)2-C5溶于N，N-二甲基甲酰胺中得到第二溶液，N，N-二甲基甲酰胺的用量为使第二溶液中多肽D-(KLAKLAK)2-C5浓度为900mol/L；
将第一溶液和第二溶液混合，在避光、25℃条件下搅拌反应12小时，反应结束后采用减压旋转干燥法蒸除溶剂，将所得固态物质用二甲亚砜溶解，并用滤纸过滤掉不溶物，收集滤液，采用减压旋转干燥法蒸除滤液中的溶剂，即得到DPPE-PEG2000-KLA。
(2)交联线粒体靶向阿霉素脂质体的制备
将氢化卵磷脂、胆固醇和步骤(1)制备的DPPE-PEG2000-KLA溶于二氯甲烷中得到第三溶液，所述氢化卵磷脂、胆固醇与DPPE-PEG2000-KLA的摩尔比为70:25:5，所述二氯甲烷的用量以使所得溶液中磷脂浓度为1mmol/L为限，减压蒸馏去除二氯甲烷后得到脂膜，将所得脂膜与350mmol/L硫酸氨缓冲液混合并经探头超声分散均匀得到脂质体悬液，所述硫酸氨缓冲液的用量以所得脂质体悬液中磷脂浓度为10mmol/L计，将所得脂质体悬液装入半透膜中，并将半透膜浸入去离子水中透析10小时，透析结束后，将透析后的脂质体悬液与5mg/ml阿霉素盐酸盐水溶液混合搅拌1小时得到混合悬液，其中盐酸阿霉素与磷脂质量比为1：10。然后在持续通入氧气和搅拌的条件下向所得混合悬液中加入乙二硫醇并反应12小时，加入的乙二硫醇与混合悬液中DPPE-PEG2000-KLA的摩尔比为4：1，再通过凝胶渗透柱分离除去游离药物和未反应的乙二硫醇，即得到交联线粒体靶向阿霉素脂质体。
实施例4
本实施例所述阿霉素脂质体由阿霉素、大豆卵磷脂、胆固醇和线粒体靶向聚乙二醇化二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE-PEG2000-KLA)组成。所述阿霉素与大豆卵磷脂质量比为1：15。大豆卵磷脂、胆固醇和DLPE-PEG2000-KLA的摩尔比为60:35:5，DLPE-PEG2000-KLA的结构式为
(1)DLPE-PEG2000-KLA的制备
以二月桂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DLPE-PEG2000-Mal)、多肽D-(KLAKLAK)2-C5和三乙胺为原料，多肽D-(KLAKLAK)2-C5、三乙胺、DLPE-PEG2000-Mal的摩尔比为3:3:1；
在氮气保护下，将DLPE-PEG2000-Mal、三乙胺、氯仿混合均匀得到第一溶液，所述氯仿的用量为使第一溶液中DLPE-PEG2000-Mal的浓度为100mmol/L，三乙胺的浓度为300mmol/L；
在氮气保护下，将多肽D-(KLAKLAK)2-C5溶于甲醇中得到第二溶液，甲醇的用量为使第二溶液中多肽D-(KLAKLAK)2-C5浓度为100mol/L；
将第一溶液和第二溶液混合，在避光、20℃条件下搅拌反应48小时，反应结束后采用减压旋转干燥法蒸除溶剂，将所得固态物质用氯仿溶解，并用滤纸过滤掉不溶物，收集滤液，采用减压旋转干燥法蒸除滤液中的溶剂，即得到DLPE-PEG2000-KLA。
(2)线粒体靶向交联阿霉素脂质体的制备
将大豆卵磷脂、胆固醇和步骤(1)制备的DLPE-PEG2000-KLA溶于二氯甲烷与甲醇以体积比2：1组合所得的组合溶剂中得到第三溶液，所述大豆卵磷脂、胆固醇与DLPE-PEG2000-KLA的摩尔比为60:35:5，所述组合溶剂用量以使所得溶液中磷脂浓度为10mmol/L为限，减压蒸馏去除所述组合溶剂后得到脂膜，将所得脂膜与300mmol/L硫酸氨缓冲液混合并经探头超声分散均匀得到脂质体悬液，所述硫酸氨缓冲液的用量以所得脂质体悬液中磷脂浓度为0.5mmol/L计，将所得脂质体悬液装入半透膜中，并将半透膜浸入去离子水中透析6小时，透析结束后，将透析后的脂质体悬液与7mg/ml阿霉素盐酸盐水溶液混合搅拌1小时得到混合悬液，其中盐酸阿霉素与磷脂质量比为1：15。然后在持续通入氧气和搅拌的条件下向所得混合悬液中加入乙二硫醇并反应4小时，加入的乙二硫醇与混合悬液中DLPE-PEG2000-KLA的摩尔比为5：1，再通过凝胶渗透柱分离除去游离药物和未反应的乙二硫醇，即得到交联线粒体靶向阿霉素脂质体。
实施例5：可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材细胞毒性实验
将密度为1×105个/mL的L929细胞(购自中国科学院细胞库)悬液接种于96孔培养板内，每孔接种0.1mL，并向每孔加入0.1mL完全培养基(DMEM培养基+10％胎牛血清+100g/mL链霉素)，然后置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中孵育24h。分别将实施例1～4所制备的可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料用完全培养基稀释作为试验组，终浓度分别为0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.30mg/mL、1.0mg/mL。以完全培养基为阴性对照组。各试验组和阴性对照组均设平行样品3个。将各试验组和阴性对照组置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中继续培养，培养48h后弃去每孔中的上清液，用PBS缓冲液(135mMNaCl，2.7mMKCl，1.5mMKH2PO4,，8mMK2HPO4，pH＝7.4)洗涤2次，然后每孔加入200LPBS缓冲液，再加入20L5mg/mL的MTT溶液(将0.5gMTT溶于100mLPBS缓冲液中得到)，继续培养4h，继后吸尽上清液，加入100L二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，用酶联免疫检测仪测定波长为570nm处的光密度值(OD)，通过与阴性对照组的OD值比较得到各试验组的细胞存活率。
细胞毒性试验结果见图3，从图3中可以看出，实施例1～4制备的可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料均无明显细胞毒性。
实施例6：阿霉素脂质体长循环实验
以实施例1制备的交联线粒体靶向阿霉素脂质体和普通阿霉素脂质体进行长循环实验，所述普通阿霉素脂质体的制备方法如下：以等摩尔量胆固醇替换实施例1中的DSPE-PEG2000-KLA，按照实施例1中步骤(2)的方法制备得到普通阿霉素脂质体。
将12只Wistar大鼠(购自四川大学动物实验中心)随机分为两组，每组分别尾静脉注射线粒体靶向阿霉素脂质体和普通阿霉素脂质体，给药剂量为5mg/kg。分别于尾静脉注射给药后的5min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h通过尾静脉取血。采用高效液相法检测药物浓度，采用DAS3.0药动学软件计算药物生物半衰期(t1/2)。交联线粒体靶向阿霉素脂质体的t1/2为20.9h，普通阿霉素脂质体的t1/2为0.8h，可见本发明所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体具有长循环的特点。
实施例7：细胞摄取与线粒体摄取实验
以实施例1制备的交联线粒体靶向阿霉素脂质体和普通阿霉素脂质体进行细胞摄取与线粒体摄取实验，所述普通阿霉素脂质体按照实施例1步骤(2)的方法，不加可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料制得。
将耐药细胞株MCF-7/DOX细胞(购自中国科学院细胞库)以4×105个/孔的浓度悬液接种于6孔培养板内，培养基体积为2mL。然后置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中孵育24h。将实施例1制备的交联线粒体靶向阿霉素脂质体用完全培养基稀释作为试验组，以普通阿霉素脂质体同法稀释作为对照组，再以完全培养基为阴性对照组。各组均设平行样品3个。将各组置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中继续培养2小时。培养时间届满后弃去上清液，接着以0.25％胰酶消化细胞，并用冷的PBS洗涤两次，收集细胞。用流式细胞仪测定细胞摄取率，收集数为每个样品1×104个细胞，荧光强度表示细胞摄取量的大小，实验结果见图4。由图4可见交联线粒体靶向脂质体在耐药肿瘤细胞中有更强的荧光强度，说明交联线粒体靶向脂质体能促进耐药肿瘤细胞对药物的摄取。
将耐药细胞株MCF-7/DOX细胞(购自中国科学院细胞库)以4×105个/孔的浓度悬液接种于6孔培养板内，培养基体积为2mL。然后置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中孵育24h。将实施例1制备的交联线粒体靶向阿霉素脂质体用完全培养基稀释作为试验组，以普通阿霉素脂质体同法稀释作为对照组，再以完全培养基为阴性对照组。各组均设平行样品3个。将各组置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中继续培养2小时。培养时间届满后弃去上清液，接着以0.25％胰酶消化细胞，并用冷的PBS洗涤两次，收集细胞，提取线粒体，其步骤根据细胞线粒体提取试剂盒(碧云天生物技术研究所，产品编号C3601)的说明书进行操作：将细胞加入线粒体提取试剂中反应15分钟，用玻璃匀浆器搅拌，得到悬液用离心力600g离心10min，收集上清液，再以离心力11000g离心10min，沉淀即为细胞线粒体。用流式细胞仪测定线粒体的药物摄取量，收集数为每个样品1×104个线粒体，荧光强度表示摄取量的大小，实验结果见图5。由图5可见交联线粒体靶向脂质体在耐药肿瘤细胞的线粒体中有更强的荧光强度，说明交联线粒体靶向脂质体能提高耐药肿瘤细胞线粒体对药物的摄取。
实施例8：肿瘤治疗实验
以实施例2制备的交联线粒体靶向阿霉素脂质体和普通阿霉素脂质体进行肿瘤治疗实验，所述普通阿霉素脂质体的制备方法如下：以等摩尔量胆固醇替换实施例2中的DMPE-PEG2000-KLA，按照实施例2中步骤(2)的方法制备得到普通阿霉素脂质体。
对18只BALB/c裸鼠(购自四川大学动物实验中心，体重18～22g)皮下接种人源阿霉素耐药乳腺癌细胞MCF-7/DOX(购自中国科学院细胞库)，接种量为5×106细胞/只。皮下接种MCF-7/DOX的一周后，将12只BALB/c小鼠随机分为三组，每组6只，分别命名为第一组、第二组、第三组。对第一组BALB/c裸鼠尾静脉注射交联线粒体靶向阿霉素脂质体，对第二组BALB/c裸鼠尾静脉注射普通阿霉素脂质体，给药剂量均为5mg/kg、第三组BALB/c裸鼠尾静脉注射生理盐水。每隔3天给药一次，即分别于第1、4、7、10天给药，给药剂量均为5mg/kg，共计给药4次。期间每隔一天称量裸鼠体重，测量肿瘤尺寸。于第25天处死小鼠。裸鼠肿瘤体积和体重变化曲线分别见图6、图7。肿瘤体积＝(长×宽2)/2。
从图6、图7可知，注射本发明所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体组的治疗组肿瘤体积更小，体重减轻幅度更小，说明本发明所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体具有更好的抗肿瘤效果，特别是对耐药性肿瘤具有更好的治疗效果，并具有更高的安全性。
Claims (10)
1.一种交联线粒体靶向阿霉素脂质体，其特征在于所述脂质体由盐酸阿霉素、磷脂、胆固醇和可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料组成，所述盐酸阿霉素与磷脂的质量比为1：(5～20)，所述磷脂、胆固醇、可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的摩尔比为(50～90)：(2～47)：(3～8)，所述可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的结构式为：
所述结构式中，n＝10，12，14，16。
2.根据权利要求1所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体，其特征在于所述磷脂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化卵磷脂中的一种。
3.权利求要1或2所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于工艺步骤如下：
(1)可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的制备
以脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、多肽D-(KLAKLAK)2-C5和有机碱为原料，多肽D-(KLAKLAK)2-C5、有机碱、脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺的摩尔比为(1～3)：(1～3)：1，所述多肽D-(KLAKLAK)2-C5的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO：1所述；
在氮气保护下，将脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、有机碱和第一溶剂混合均匀得到第一溶液，所述第一溶剂的用量应使第一溶液中脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺的浓度为100～300mmol/L；
在氮气保护下，将多肽D-(KLAKLAK)2-C5溶于第二溶剂中得到第二溶液，第二溶剂的用量应使第二溶液中多肽D-(KLAKLAK)2-C5的浓度为100～900mol/L；
将第一溶液和第二溶液混合，在避光、搅拌下于20～40℃反应12～48小时，反应结束后除去溶剂得到固态物质，将所得固态物质用氯仿或二甲亚砜溶解后过滤掉不溶物，收集滤液，除去滤液中的溶剂即得到可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料；
(2)交联线粒体靶向阿霉素脂质体的制备
将磷脂、胆固醇和步骤(1)制备的可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料溶于第三溶剂中得到第三溶液，所述磷脂、胆固醇、可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的摩尔比为(50～90)：(2～47)：(3～8)，所述第三溶剂用量应使所得第三溶液中磷脂浓度为1～10mmol/L，去除第三溶剂得到脂膜，将所得脂膜与浓度为250～350mmol/L的硫酸氨缓冲液混合并经超声分散均匀得到脂质体悬液，所述硫酸氨缓冲液的用量应使脂质体悬液中磷脂浓度为0.1～10mmol/L，将所得脂质体悬液装入半透膜中，将半透膜浸入去离子水中透析4～12小时，透析结束后，将透析后的脂质体悬液与浓度为1～10mg/mL的阿霉素盐酸盐水溶液混合均匀得到混合悬液，所述阿霉素盐酸盐水溶液的用量应使所得混合悬液中盐酸阿霉素与磷脂的质量比为1：(5～20)，然后在持续通入氧气和搅拌的条件下向所得混合悬液中加入乙二硫醇并反应0.5～24小时，加入的乙二硫醇与混合悬液中可交联线粒体靶向聚乙二醇化磷脂药用材料的摩尔比为(1～5)：1，反应时间届满后，将游离药物和未反应的乙二硫醇去除，即得到交联线粒体靶向阿霉素脂质体。
4.根据权利要求3所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于所述脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺为脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺中的一种。
5.根据权利要求3或4所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述有机碱为三乙胺、4-二甲氨基吡啶或者N、N-二异丙基乙胺中的任一种。
6.根据权利要求3或4所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述第一溶剂为二氯甲烷或氯仿。
7.根据权利要求5所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述第一溶剂为二氯甲烷或氯仿。
8.根据权利要求3或4所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述第二溶剂为甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种。
9.根据权利要求5所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述第二溶剂为甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中的一种。
10.根据权利要求3或4所述交联线粒体靶向阿霉素脂质体的制备方法，步骤(2)中所述第三溶剂为三氯甲烷，或二氯甲烷与甲醇以体积比(1～3)：1组合得到的组合溶剂。
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