CN105770912A - 具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药atp敏感脂质体及其制备方法 - Google Patents
具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药atp敏感脂质体及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105770912A CN105770912A CN201610254826.XA CN201610254826A CN105770912A CN 105770912 A CN105770912 A CN 105770912A CN 201610254826 A CN201610254826 A CN 201610254826A CN 105770912 A CN105770912 A CN 105770912A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- atp
- coupling
- nucleotide
- liposome
- sensitivity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 125
- 239000002502 liposome Substances 0.000 title claims abstract description 119
- 238000011161 development Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 112
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 112
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims abstract description 76
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 43
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims abstract description 38
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 36
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 31
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims abstract description 28
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims abstract description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 17
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 102
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 90
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 84
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 84
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 84
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 52
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 claims description 41
- 229930195573 Amycin Natural products 0.000 claims description 41
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 37
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 37
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 28
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 claims description 24
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 claims description 24
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 claims description 24
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 claims description 24
- 229960003511 macrogol Drugs 0.000 claims description 20
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 16
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 16
- 230000006837 decompression Effects 0.000 claims description 14
- JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 239000008347 soybean phospholipid Substances 0.000 claims description 13
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 12
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 10
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 10
- HVVJCLFLKMGEIY-UHFFFAOYSA-N 2,3-dioctadecoxypropyl 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCOCC(COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OCCCCCCCCCCCCCCCCCC HVVJCLFLKMGEIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 claims description 8
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 6
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical group NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 5
- 102000002070 Transferrins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010015865 Transferrins Proteins 0.000 claims description 4
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid group Chemical group C(C1=CC=CC=C1)(=O)O WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 claims description 4
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- SRLOHQKOADWDBV-NRONOFSHSA-M sodium;[(2r)-2,3-di(octadecanoyloxy)propyl] 2-(2-methoxyethoxycarbonylamino)ethyl phosphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCCNC(=O)OCCOC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC SRLOHQKOADWDBV-NRONOFSHSA-M 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 36
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 abstract description 22
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 abstract description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 abstract description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 2
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 abstract 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 142
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 142
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 20
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 13
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 12
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 12
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 10
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- YBRBMKDOPFTVDT-UHFFFAOYSA-N tert-butylamine Chemical compound CC(C)(C)N YBRBMKDOPFTVDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 3
- 238000012632 fluorescent imaging Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 1
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 1
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002327 chloral hydrate Drugs 0.000 description 1
- 238000013267 controlled drug release Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012738 dissolution medium Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 125000001924 fatty-acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229910000664 lithium aluminum titanium phosphates (LATP) Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
- A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
- A61K49/0076—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form dispersion, suspension, e.g. particles in a liquid, colloid, emulsion
- A61K49/0084—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form dispersion, suspension, e.g. particles in a liquid, colloid, emulsion liposome, i.e. bilayered vesicular structure
- A61K49/0086—Polymersome, i.e. liposome with polymerisable or polymerized bilayered-forming substances
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
- A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
- A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
- A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1273—Polymersomes; Liposomes with polymerisable or polymerised bilayer-forming substances
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，为将载有阿霉素的ATP敏感核苷酸双链封装在偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜内形成的纳米囊泡，所述ATP敏感核苷酸双链由偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链和偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链根据碱基互补配对原则自组装形成，所述偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜由肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂和胆固醇组成。本发明还提供了上述脂质体的制备方法。该脂质体兼具主动瘤靶向性、ATP敏感的荧光发射和药物释放开关和体内长循环功能，实现将肿瘤近红外荧光显像肿瘤诊断和肿瘤治疗结合在同一脂质体上，且制备工艺简单易操作。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤诊断与治疗领域，具体涉及一种具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体及其制备方法。
背景技术
肿瘤已经成为威胁人类健康的重大疾病。目前肿瘤确诊时，绝大多数肿瘤患者处于中晚期，治疗方法主要以手术、放疗、化疗为主。而肿瘤中晚期患者治疗后极易出现复发、耐药、转移以及并发症，这是治疗失败和病人死亡的主要原因。近年来发展起来的“纳米诊治系统”将诊断和治疗整合于同一纳米探针上，同时实现肿瘤的高灵敏度检测与微创/无创治疗，操作简便、成像灵敏度更高、诊断和治疗同时进行，为癌症的早诊早治提供了新的思路和手段。荧光示踪技术是指将能发荧光的物质导入所要跟踪或显影的细胞或组织中，利用荧光特性提供被研究对象的信息。化疗是一种传统的肿瘤治疗方法，利用细胞毒性物质能有效抑制细胞生长。化疗药物没有细胞选择性、对正常组织存在严重的毒副作用，且容易使肿瘤细胞产生耐药性，造成治疗失败。因此，将荧光成像技术与化学药物治疗加以整合，并辅以靶向和“智能”荧光开关与可控药物释放将更有利于临床对癌症的早期检出率和治疗率的提高。
现有技术报道了一种ATP介导的脂质体药物传递系统，该系统由两部分组成：一是内容物为负载阿霉素的ATP敏感寡核酸双链的脂质体，其外层脂质体成分为卵磷脂、1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺、胆固醇和精氨酸6组氨酸4-烷烃18(精氨酸6组氨酸4为细胞穿膜肽)；二是内容物为ATP的脂质体，其外层脂质体成分为卵磷脂、DOTAP(一种阳离子类脂)和胆固醇。该脂质体药物传递系统可以将阿霉素高效递送到细胞内，脂质体与细胞膜融合，释放的ATP触发ATP敏感寡核苷酸双链解开，释放出阿霉素，从而发挥抗癌作用(EnhancedAnticancerEfficacybyATP-MediatedLiposomalDrugDelivery，RanMo等，Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,5815–5820)。但该脂质体药物传递系统只具有肿瘤治疗功能，而无荧光成像功能，无法实时监测药物释放和肿瘤治疗效果。此外，该脂质体药物传递系统虽可利用增强渗透与滞留效应(EPR效应)进入肿瘤组织，具有一定的肿瘤物理靶向性，但无主动肿瘤靶向性，所以靶向效率较低，导致部分药物分布在非肿瘤组织，造成毒副作用。
现有技术中还报道了一种三磷酸腺苷(ATP)触发荧光开关的胶束，可作为荧光探针用于活细胞分子影像。该胶束的分子结构为5’-Lipid-(PEG)2-Dabycl(荧光淬灭剂)-GACCTGGGGGAGTATTGCGGAAGGTT-(PEG)6-CCAGGTC-TMR(荧光分子)-3’，在细胞外低浓度ATP环境中呈环状，此时荧光分子和荧光猝灭剂距离很近，由于荧光共振能量转移(FRET)原理，荧光被淬灭，处于关闭状态；在细胞内高浓度ATP环境中，胶束分子构型变化，环状解开，荧光分子和荧光淬灭剂距离增大，使荧光复原，荧光信号开启，实现荧光显像(CuichenWuetal.ACSNANO,2013,7:5724-5731)。该胶束作为荧光探针可在体内有效传递，进入细胞，并具有高信号-低背景比值，优良的选择性和生物相容性，但存在以下问题：1、仅依靠纳米尺寸的增强渗透和滞留(EPR)效应达到肿瘤部位，无主动靶向性，靶向效率差，文章没有提供体内靶向实验数据；2、PEG链太短，难以实现延长体内循环的效果；3、需要合成含寡核苷酸、聚乙二醇和二脂肪酰基脂质的杂化分子，合成步骤多，合成难度大，纯化操作复杂。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体及其制备方法，该脂质体兼具主动瘤靶向性、ATP敏感的荧光发射和药物释放开关和体内长循环功能，实现将肿瘤近红外荧光显像肿瘤诊断和肿瘤治疗结合在同一脂质体上，且制备工艺简单易操作。
本发明所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，所述ATP敏感荧光探针脂质体为将载有阿霉素的ATP敏感核苷酸双链封装在偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜内形成的纳米囊泡，所述ATP敏感核苷酸双链由偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链和偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链根据碱基互补配对原则自组装形成，所述偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜由肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂和胆固醇组成，肿肿瘤靶向多肽偶联的聚二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂、胆固醇的摩尔比为(2～8)：(42～78)：(20～50)。
上述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，所述偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链为偶联荧光染料cy3、cy5、cy5.5、cy7中的一种的ATP敏感核苷酸单链。
上述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，所述ATP敏感核苷酸单链的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：1所述。
上述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，所述偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链为偶联荧光淬灭剂4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸的ATP敏感核苷酸互补单链。
上述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，所述肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺为末端氨基酸为半胱氨酸的含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸环状多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、末端氨基酸为半胱氨酸的人类表皮生长因子受体2多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、末端氨基酸为半胱氨酸的转铁蛋白偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺中的一种。
上述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，所述肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺为肿瘤靶向多肽偶联的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、肿瘤靶向多肽偶联的二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、肿瘤靶向多肽偶联的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、肿瘤靶向多肽偶联的二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000中的一种。
上述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，所述磷脂为卵磷脂、大豆磷脂、二硬脂酰磷脂胆碱中的一种。
上述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，所述磷脂为卵磷脂、大豆磷脂、二硬脂酰磷脂胆碱中的一种。
本发明所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体的制备方法，工艺步骤如下：
(1)将末端为半胱氨酸的肿瘤靶向多肽与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺按摩尔比1:1溶于甲醇中得到混合溶液，甲醇的用量以所述混合溶液中磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺的摩尔浓度为1～10mmol/L计，将所得混合溶液在室温下搅拌20～28小时进行反应，反应结束后除去反应液中的溶剂，即得肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺；
(2)将步骤(1)制备所得肿瘤靶向多肽偶联的聚二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂、胆固醇按摩尔比为(2～8)：(42～78)：(20～50)溶于氯仿和甲醇复合溶剂中得到混合溶液，复合溶剂的用量以所得混合溶液中胆固醇和磷脂总浓度为1～10mmol/L计，减压蒸馏除去混合溶液中的溶剂得到偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜；
(3)将偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链和偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链按摩尔比1:1加入去离子水得混合液，去离子水的用量以所述混合液中ATP敏感核苷酸单链的摩尔浓度为0.1～10mmol/L计，并搅拌10～60min，使偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链和偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链根据碱基互补配对原则自组装形成ATP敏感核苷酸双链；
(4)将步骤(3)所得ATP敏感核苷酸双链与阿霉素按照摩尔比1:(0.1～10)混合孵育10～30min，得到载阿霉素的ATP敏感核苷酸双链；
(5)将步骤(4)所得载阿霉素的ATP敏感核苷酸双链与步骤(2)所得偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜按照质量比1：(10～50)混合后置于40～60℃下水化一小时，得到磷脂和胆固醇总浓度为1～10mmol/L的悬液，将所得悬液水浴超声5～30分钟，再依次过400nm、200nm和100nm的多聚碳酸酯膜，采用凝胶排阻层析柱分离纯化后既得到具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体。
上述方法中，所述末端为半胱氨酸的肿瘤靶向多肽末端为半胱氨酸的含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的环状多肽(cRGD-cys)、末端为半胱氨酸的人类表皮生长因子受体2多肽(Her-2-cys)、末端为半胱氨酸的转铁蛋白(Transferrin-cys)中的一种；
所述磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺中的一种；
所述磷脂为卵磷脂、大豆磷脂、二硬脂酰磷脂胆碱中的一种；
所述偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链为偶联荧光染料cy3、cy5、cy5.5或cy7的ATP敏感核苷酸单链，所述ATP敏感核苷酸单链的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：1所述；
所述偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链为偶联荧光淬灭剂4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸的ATP敏感核苷酸互补单链。
上述方法中，氯仿和甲醇组成的复合溶剂的配比：氯仿与甲醇的体积比可以是任意比例，氯仿与甲醇的体积比优选3:1。
本发明制备的具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体粒径范围为50～150nm。
上述方法中，偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链和偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链，可通过固相亚磷酰胺化学方法，利用DNA合成仪(ABI3400synthesizer)制备ATP敏感核苷酸单链或ATP敏感核苷酸互补单链，再将制备得到的ATP敏感核苷酸单链或ATP敏感核苷酸互补单链分别从固相树脂上断裂下来并脱去保护基后，分散于含荧光染料或荧光淬灭剂的甲醇、叔丁胺和水以体积比1：1：2混合所得的混合溶液中，使混合溶液中荧光染料与ATP敏感核苷酸单链，或荧光淬灭剂与ATP敏感核苷酸互补单链的摩尔比为1:(1～10)，于65℃反应4小时，即得偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链或偶联荧光淬灭剂的ATP敏感寡核苷酸互补单链。也可通过市场购买。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明为提供了一种能同时实现肿瘤诊断与肿瘤治疗的新型诊治脂质体。
2、本发明所述具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体平均粒径约为100nm，不仅能通过物理靶向，即肿瘤微血管增强渗透和滞留效应(EPR效应)到达肿瘤组织，并且由于偶联了具有高特异性和高稳定性的肿瘤靶向多肽，可以通过主动靶向到达肿瘤组织。通过双重靶向作用，显著提高肿瘤靶向效率，实现肿瘤的高特异性显像。
3、本发明所述具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体利用胞内高浓度ATP作为荧光开关，静脉注射进入人体后在血液循环过程中探针信号处于“沉默”状态，药物吸附在核苷酸双链上不释放，进入肿瘤细胞后在高浓度ATP环境中寡核酸双链解开，荧光信号“开启”，荧光强度显著提高，大幅度提高肿瘤/正常组织以及血液间的信噪比，同时药物大量快速释放，进而实现早期/小体积肿瘤的准确示踪与治疗作用。
4、本发明所述具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体由于含有聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺，具有长循环功能，能实现延长体内循环的效果。
5、本发明所述具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体的制备方法工艺简单，制备成本低。
6、该脂质体中的核苷酸可以偶联具有不同发射波长的荧光分子，从而实现体内/体外肿瘤显像，满足不同荧光检测要求。
附图说明
图1为实施例1制备的具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体荧光强度在ATP加入条件下的变化图。
图2为实施例1制备的具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体阿霉素累计释放曲线图。
图3为实施例1制备的具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体透射电子显微镜图。
图4为实施例1制备的具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体粒径分布图。
图5为实施例1～4制备的具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体细胞毒性图。
图6为各脂质体的体外肿瘤细胞显像图(A为实施例1的ATP敏感脂质体阿霉素荧光；B为普通阿霉素脂质体阿霉素荧光；C为实施例1的ATP敏感脂质体cy5荧光；D为普通荧光脂质体cy5荧光)。
图7为活体荧光成像图(B1为注射实施例1的ATP敏感脂质体组，B2为普通荧光脂质体+普通阿霉素脂质体组)。
图8为小鼠肿瘤体积随给药后时间的变化图。
图9为小鼠体重随给药后时间的变化图。
图10为本发明所述具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体的结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明所述具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体及制备方法作进一步说明。
以下实施例中，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺(DSPE-PEG2000-Mal)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺(DMPE-PEG2000-Mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺(DPPE-PEG2000-Mal)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺(DLPE-PEG2000-Mal)购自美国Nanocs公司。cRGD-cys，Her2-cys和Transferrin-CYS购自中科亚光科技有限公司。cy3、cy5、cy5.5和cy7，荧光淬灭剂dabcyl购自武汉博士德生物技术有限公司。卵磷脂、大豆磷脂、DOPC、胆固醇购自西安瑞禧生物科技有限公司。
实施例1
本实施例中所述具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体的制备方法如下：
(1)将cRGD-Cys与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺(DSPE-PEG2000-Mal)按摩尔比1:1溶于甲醇中得到混合溶液，甲醇用量以所述混合溶液中DSPE-PEG2000-Mal摩尔浓度为1mmol/L计。将所得混合溶液在室温下磁力搅拌12小时进行反应，反应结束后减压旋转蒸发除去反应液中的溶剂，即得环状RGD偶联的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(cRGD-DSPE-PEG2000)；
(2)将步骤(1)制备所得cRGD-DSPE-PEG2000、卵磷脂和胆固醇，按摩尔比为5：65：35溶于氯仿和甲醇以体积比3:1混合所得的复合溶剂中得到混合溶液，复合溶剂的用量以所得混合溶液中胆固醇和卵磷脂总浓度为1mmol/L计，减压旋转蒸发除去混合溶液中的溶剂得到脂质体薄膜；
(3)通过固相亚磷酰胺化学法，利用DNA合成仪(ABI3400synthesizer)制备ATP敏感核苷酸单链，再将制备得到的核苷酸链从固相树脂上断裂下来并脱去保护基后，分散于含cy3的甲醇、叔丁胺和水以体积比1：1：2混合所得的混合溶液中，使混合溶液中cy3与ATP敏感核苷酸单链的摩尔比为1:2，于65℃反应4小时，即得偶联荧光染料cy3的ATP敏感核苷酸单链。同法制备ATP敏感核苷酸互补单链，将制备得到的核苷酸链从固相树脂上断裂下来并脱去保护基后，分散于含dabcyl的甲醇、叔丁胺和水以体积比1：1：2混合所得的混合溶液中，使混合溶液中dabcyl与ATP敏感核苷酸互补单链的摩尔比为1:2，于65℃反应4小时，即得偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链。将制得的偶联荧光染料cy3的ATP敏感核苷酸单链和偶联荧光淬灭剂dabcyl的ATP敏感核苷酸互补单链按照摩尔比1:1加入去离子水得混合液，去离子水的用量以所述混合液中ATP敏感核苷酸单链摩尔浓度为10mmol/L为限，磁力搅拌10min，使二者根据碱基互补配对原则自组装形成ATP敏感核苷酸双链；
(4)将步骤(3)所得ATP敏感核苷酸双链与阿霉素按照摩尔比1:1混合孵育15min，得到载阿霉素的ATP敏感核苷酸双链；
(5)将步骤(4)所得载阿霉素的ATP敏感核苷酸双链与步骤(2)所得脂质体薄膜按照质量比1：10混合后置于40℃下水化一小时，得到卵磷脂和胆固醇总浓度为1mmol/L的脂质体悬液，将所得脂质体悬液水浴超声5分钟，再依次过400nm、200nm和100nm的多聚碳酸酯膜，采用SephadexG-50凝胶排阻层析柱，PBS作为洗脱液，分离除去游离药物，既得到平均粒径约100nm的具有肿瘤近红外荧光显像诊断和治疗作用的ATP敏感脂质体。
检测ATP敏感性荧光开关
取100μL步骤(3)所得ATP敏感核苷酸双链加入石英比色皿中，置于荧光分光光度计中监测荧光强度，激发光波长为650纳米，发射光波长为670纳米。监测50秒后，加入等量8mmol/L的ATP溶液与上述ATP敏感核苷酸双链中混合均匀，继续在相同条件下监测荧光强度。结果如图1所示。从图1可知，未加入ATP时，ATP敏感核苷酸双链荧光强度很弱，加入ATP溶液后，荧光信号瞬间增强，随着时间推移，荧光信号逐渐增强，说明阿霉素释放增多。
检测阿霉素释放
取步骤5制备的ATP敏感脂质体2ml分别于2个透析袋中(截留分子量6000-8000)，每个透析袋里脂质体体积为1ml。将透析袋分别浸入盛装50ml不含ATP和ATP浓度为4mmol/L的PBS缓冲液(释放介质)的EP管中。将EP管置于37℃水浴中，于0.5、1、2、4、6、8、12、24小时，从EP管中吸取0.5ml释放介质，用于检测阿霉素浓度，另补充0.5ml空白新鲜释放介质于EP管中。阿霉素浓度采用荧光分光光度计检测，激发波长为488纳米，发射波长为580纳米。计算阿霉素累计释放量，绘制累计释放曲线，见图2。由图2可见，在含4mmol/LATP的释放介质中，阿霉素释放迅速；在不含ATP的释放介质中，阿霉素释放极缓慢，说明本发明所述方法制备的ATP敏感脂质体能可控释放阿霉素。
用透射电子显微镜观察步骤(4)水化所得脂质体悬液，结果如图2所示，脂质体为圆形且粒径均一。用激光粒度仪检测步骤(4)水化所得脂质体悬液中脂质体的粒径，结果如图3所示，平均粒径为100nm。
实施例2
本实施例中所述具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体的制备方法如下：
(1)将Her2-cys与二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺(DMPE-PEG2000-Mal)按摩尔比1:1溶于甲醇中得到混合溶液，甲醇用量以所述混合溶液中DMPE-PEG2000-Mal的摩尔浓度为10mmol/L计。将所得混合溶液在室温下磁力搅拌24小时进行反应，反应结束后减压旋转蒸发除去反应液中的溶剂，即得Her2偶联的二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(Her2-DMPE-PEG2000)；
(2)将步骤(1)制备所得Her2-DMPE-PEG2000、大豆磷脂和胆固醇按摩尔比为2：78：20溶于氯仿和甲醇以体积比3:1混合所得的复合溶剂中得到混合溶液，复合溶剂的用量以所得混合溶液中胆固醇和大豆磷脂总浓度为10mmol/L计，减压旋转蒸发除去混合溶液中的溶剂得到脂质体薄膜；
(3)通过固相亚磷酰胺化学法，利用DNA合成仪(ABI3400synthesizer)制备ATP敏感核苷酸单链，再将制备得到的核苷酸链从固相树脂上断裂下来并脱去保护基后，分散于含cy5.5的甲醇、叔丁胺和水以体积比1：1：2混合所得的混合溶液中，使混合溶液中cy5.5与ATP敏感核苷酸单链的摩尔比为1:10，于65℃反应4小时，即得偶联荧光染料cy5.5的ATP敏感核苷酸单链。同法制备ATP敏感核苷酸互补单链，将制备得到的核苷酸链从固相树脂上断裂下来并脱去保护基后，分散于含dabcyl的甲醇、叔丁胺和水以体积比1：1：2混合所得的混合溶液中，使混合溶液中dabcyl与ATP敏感核苷酸互补单链的摩尔比为1:10，于65℃反应4小时，即得偶联荧光淬灭剂dabcyl的ATP敏感核苷酸互补单链。将制得的偶联荧光染料cy5.5的ATP敏感核苷酸单链和偶联荧光淬灭剂dabcyl的ATP敏感核苷酸互补单链按照摩尔比1:1加入去离子水得混合液，去离子水的用量以所述混合液中ATP敏感核苷酸单链摩尔浓度为5mmol/L为限，磁力搅拌60min，使二者根据碱基互补配对原则自组装形成ATP敏感核苷酸双链；
(4)将步骤(3)所得ATP敏感核苷酸双链与阿霉素按照摩尔比1:1混合孵育15min，得到载阿霉素的ATP敏感核苷酸双链；
(5)将步骤(4)所得载阿霉素的ATP敏感核苷酸双链与步骤(2)所得脂质体薄膜按照质量比1：50混合后置于60℃下水化一小时，得到大豆磷脂和胆固醇总浓度为1mmol/L的脂质体悬液，将所得脂质体悬液水浴超声30分钟，再依次过400nm、200nm和100nm的多聚碳酸酯膜，采用SephadexG-50凝胶排阻层析柱，PBS作为洗脱液，分离除去游离药物，既得到粒径约100nm的具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体。
实施例3
本实施例中所述具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体的制备方法如下：
(1)将Her2-cys与二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺(DPPE-PEG2000-Mal)按摩尔比1:1溶于甲醇中得到混合溶液，甲醇用量以所述混合液DPPE-PEG2000-Mal摩尔浓度为5mmol/L计。将所得混合溶液在室温下磁力搅拌16小时进行反应，反应结束后减压旋转蒸发除去反应液中的溶剂，即得Her2偶联的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(Her2-DPPE-PEG2000)；
(2)将步骤(1)制备所得Her2-DMPE-PEG2000、大豆磷脂和胆固醇按摩尔比为8：42：50溶于氯仿和甲醇以体积比3:1混合所得的复合溶剂中得到混合溶液，复合溶剂的用量以所得混合溶液中胆固醇和大豆磷脂总浓度为5mmol/L计，减压旋转蒸发除去混合溶液中的溶剂得到脂质体薄膜；
(3)将从赛默飞世尔科技(中国)有限公司订购的偶联荧光染料cy5的ATP敏感核苷酸单链和偶联荧光淬灭剂dabcyl的ATP敏感核苷酸互补单链按摩尔比1:1加入去离子水得混合液，去离子水的用量以所述混合液中ATP敏感核苷酸单链摩尔浓度为3mmol/L为限，磁力搅拌60min，使二者根据碱基互补配对原则自组装形成ATP敏感核苷酸双链；
(4)将步骤(3)所得ATP敏感核苷酸双链与阿霉素按照摩尔比1:5混合孵育30min，得到载阿霉素的ATP敏感核苷酸双链；
(5)将步骤(4)所得载阿霉素的ATP敏感核苷酸双链与步骤(2)所得脂质体薄膜按照质量比1：50混合后置于50℃下水化一小时，得到大豆磷脂和胆固醇总浓度为1mmol/L的脂质体悬液，将所得脂质体悬液水浴超声20分钟，再依次过400nm、200nm和100nm的多聚碳酸酯膜，采用SephadexG-50凝胶排阻层析柱，PBS作为洗脱液，分离除去游离药物，既得到粒径约100nm的具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体。
实施例4
本实施例中所述具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体的制备方法如下：
(1)将Her2-cys与二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰胺(DLPE-PEG2000-Mal)按摩尔比1:1溶于甲醇中得到混合溶液，甲醇用量以所述混合液DLPE-PEG2000-Mal摩尔浓度为5mmol/L计。将所得混合溶液在室温下磁力搅拌24小时进行反应，反应结束后减压旋转蒸发除去反应液中的溶剂，即得Her2偶联的二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(Her2-DLPE-PEG2000)；
(2)将步骤(1)制备所得Her2-DLPE-PEG2000、二硬脂酰磷脂胆碱和胆固醇按摩尔比为5：65：35溶于氯仿和甲醇以体积比3:1混合所得的复合溶剂中得到混合溶液，复合溶剂的用量以所得混合溶液中胆固醇和二硬脂酰磷脂胆碱的总浓度为5mmol/L计，减压旋转蒸发除去混合溶液中的溶剂得到脂质体薄膜；
(3)将从赛默飞世尔科技(中国)有限公司订购的偶联荧光染料cy7的ATP敏感核苷酸单链和偶联荧光淬灭剂dabcyl的ATP敏感核苷酸互补单链按摩尔比1:1加入去离子水得混合液，去离子水的用量以所述混合液中ATP敏感核苷酸单链摩尔浓度为1mmol/L为限，磁力搅拌60min，使二者根据碱基互补配对原则自组装形成ATP敏感核苷酸双链；
(4)将步骤(3)所得ATP敏感核苷酸双链与阿霉素按照摩尔比1:10混合孵育10min，得到载阿霉素的ATP敏感核苷酸双链；
(5)将步骤(4)所得载阿霉素的ATP敏感核苷酸双链与步骤(2)所得脂质体薄膜按照质量比1：30混合后置于50℃下水化一小时，得到二硬脂酰磷脂胆碱和胆固醇总浓度为1mmol/L的脂质体悬液，将所得脂质体悬液水浴超声20分钟，再依次过400nm、200nm和100nm的多聚碳酸酯膜，采用SephadexG-50凝胶排阻层析柱，PBS作为洗脱液，分离除去游离药物，既得到粒径约100nm的具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体。
实施例5细胞毒性实验
将密度为1×105个/mL的L929细胞(购自中国科学院细胞库)悬液接种于96孔培养板内，每孔接种0.1mL，并向每孔加入0.1mL完全培养基(DMEM培养基+10％胎牛血清+100μg/mL链霉素)，然后置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中孵育24h。分别将按照实施例1～4所述方法制备的具有肿瘤近红外荧光显像的ATP敏感脂质体(不载阿霉素)用完全培养基稀释作为四组试验组，各实验组有脂质体浓度分别为0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.30mg/mL、1.0mg/mL的样品。以完全培养基为阴性对照组。各试验组和阴性对照组均设平行样品3个。将各试验组和阴性对照组置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞恒温培养箱中继续培养，培养48h后弃去每孔中的上清液，用PBS缓冲液(135mMNaCl，2.7mMKCl，1.5mMKH2PO4,，8mMK2HPO4，pH＝7.4)洗涤2次，然后每孔加入200μLPBS缓冲液，再加入20μL5mg/mL的MTT溶液(将0.5gMTT溶于100mLPBS缓冲液中得到)继续培养4h，继后吸尽上清液，加入100μL二甲基亚砜(DMSO)振荡10min，用酶联免疫检测仪测定波长为570nm处的光密度值(OD)，通过与阴性对照组的OD值比较得到各试验组的细胞存活率。
细胞毒性试验结果见图3，从图中可以看出，实施例1～4制备的脂质体均无明显细胞毒性。
实施例6体外荧光显像与阿霉素摄取
按照以下方法制备普通荧光脂质体：将DSPE-PEG2000、卵磷脂和胆固醇按摩尔比5：65：35的溶于氯仿和甲醇以体积比3:1混合所得的复合溶剂中得到混合溶液，向所得溶液中加入cy3，复合溶剂的用量以所得混合溶液中卵磷脂和胆固醇的总浓度为1mmol/L计。利用旋转蒸发仪减压旋转蒸发除尽复合溶剂，形成脂质体薄膜。将磷酸缓冲液加入上述脂质体薄膜中，置于40℃水化一小时得到脂质体悬液，并使所得脂质体悬液中卵磷脂和胆固醇的总浓度为1mmol/L，Cy5的浓度为10μg/ml。水浴超声30分钟，使脂质体悬液形成微小的脂质体囊泡，再依次过400nm、200nm和100nm的多聚碳酸酯膜，即得粒径在100nm左右的均一普通荧光脂质体。
按照以下方法制备普通阿霉素脂质体：将DMPE-PEG2000、卵磷脂和胆固醇按摩尔比5：65：35的溶于氯仿和甲醇以体积比3:1混合所得的复合溶剂中得到混合溶液，复合溶剂用量以所述混合溶液中胆固醇和卵磷脂的总浓度为1mmol/L计。利用旋转蒸发仪减压旋转蒸发除尽溶剂，形成脂质体薄膜。将浓度300mmol/L的硫酸铵缓冲液加入上述脂质体薄膜中，并置于60℃水化一小时得到脂质体悬液，并使所得脂质体悬液中卵磷脂和胆固醇的总浓度为1mmol/L。水浴超声30分钟，使脂质体悬液形成微小的脂质体囊泡，再依次过400nm、200纳米和100纳米的多聚碳酸酯膜，即得粒径在100nm左右的均一普通脂质体。将上述脂质体加入透析袋(截止分子量6000-8000)中置于1L质量浓度为0.9％的氯化钠溶液中透析6小时。然后取出透析袋中脂质体，与等体积阿霉素溶液(阿霉素浓度为10g/L)混后并在60℃下磁力搅拌1小时。搅拌结束后采用凝胶排阻色谱柱分离游离阿霉素，得到粒径为100纳米的普通阿霉素脂质体。采用荧光分光光度法检测阿霉素浓度，加入适量0.9％的氯化钠溶液，使阿霉素脂质体中阿霉素终浓度为2g/L。
将对数生长期的MDA-MB-435肿瘤细胞(人乳腺癌细胞)用胰蛋白酶消化，用培养基稀释成3×104/ml的细胞悬液，将该悬液按100μl/孔均匀加入直径为20mm的三个玻底皿中。将装有细胞悬液的玻底皿置于37℃孵箱中孵育24h，显微镜下观察可见细胞融合贴壁生长。将普通荧光脂质体样品(对照组)和普通阿霉素脂质体样品(对照组)和实施例1制备的具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体样品(实验组)分别加入上述已培养有细胞的三个玻底皿中，使Cy3的终浓度分别为0.25μg/ml，阿霉素终浓度为0.5μg/ml，继续培养4小时后，吸去各组培养基，用新鲜磷酸盐缓冲液清洗两次。然后加入10μL10mg/ml的Hoechst33258试剂，再加入200μL磷酸盐缓冲液共同孵育15分钟。时间届满，弃去溶液，用新鲜磷酸盐洗涤一次，加入200μL新鲜磷酸盐缓冲液保持细胞润湿备测。观察阿霉素采用激光共聚焦488nm激发，检测采用640nm发射光，结果见图6A和图6B。观察cy5采用激光共聚焦650nm激发，检测采用670nm发射光，结果见图图6C图6D。由图6可见，实验组细胞内荧光强于普通荧光脂质体组，说明本发明制备的ATP敏感脂质体具有更好的肿瘤靶向性，能够输送更多的阿霉素和cy5进入肿瘤细胞，因而显示出更强的荧光，具有更好的肿瘤细胞显像能力和递送阿霉素的能力。
实施例7活体荧光显像与肿瘤治疗
按以下方法制备普通荧光探针脂质体：将DMPE-PEG2000、卵磷脂和胆固醇按摩尔比5：65：35的溶于氯仿和甲醇以体积比3:1混合所得的复合溶剂中得到混合溶液，向所得混合溶液中加入cy5.5,复合溶剂用量以所述混合溶液中卵磷脂和胆固醇的总浓度为10mmol/L计。利用旋转蒸发仪减压旋转蒸发除尽复合溶剂，形成脂质体薄膜。将磷酸缓冲液加入上述脂质体薄膜中，置于60℃水化一小时得到脂质体悬液，并使所得脂质体悬液中卵磷脂和胆固醇的总浓度为1mmol/L，荧光分子浓度为10μg/ml。水浴超声30分钟，使脂质体悬液形成微小的脂质体囊泡，再依次过400nm、200nm和100nm的多聚碳酸酯膜，即得粒径在100nm左右的均一普通荧光脂质体。
按照以下方法制备普通阿霉素脂质体：将DMPE-PEG2000、卵磷脂和胆固醇按摩尔比5：65：35的溶于氯仿和甲醇以体积比3:1混合所得的复合溶剂中得到混合溶液，复合溶剂用量以胆固醇和卵磷脂的总浓度为10mmol/L计。利用旋转蒸发仪减压旋转蒸发除尽溶剂，形成脂质体薄膜。将300mmol/L硫酸铵缓冲液加入上述脂质体薄膜中，并置于60℃水化一小时得到脂质体悬液，并使所得脂质体悬液中卵磷脂和胆固醇的总浓度为1mmol/L。水浴超声30分钟，使脂质体悬液形成微小的脂质体囊泡，再依次过400nm、200纳米和100纳米的多聚碳酸酯膜，即得粒径在100nm左右的均一普通脂质体。将上述普通脂质体加入透析袋(截止分子量6000-8000)中置于1L质量浓度为0.9％的氯化钠溶液中透析6小时。然后取出透析袋中脂质体，与等体积阿霉素溶液(阿霉素浓度为10g/L)混后并在60℃下磁力搅拌1小时。搅拌结束后采用凝胶排阻色谱柱分离游离阿霉素，得到粒径为100纳米的普通阿霉素脂质体。采用荧光分光光度法检测阿霉素浓度，加入适量0.9％的氯化钠溶液，使阿霉素脂质体中阿霉素终浓度为2g/L。
将对数生长期的HER2阳性SKOV3肿瘤细胞(人卵巢癌细胞)用胰蛋白酶消化后用PBS(磷酸盐缓冲液)稀释成1X107个/mL。取12只BLB/C裸鼠，对每只BLB/C裸鼠于右后肢皮下注射100ul细胞悬液，制作小鼠乳腺癌模型。当肿瘤体积增长至50～100mm3时，将小鼠分为两组，每组6只。其中一组每只尾静脉注射普通荧光脂质体50uL和普通阿霉素脂质体50uL作为对照组；另一组尾静脉注射实施例2制备的具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体样品100uL，作为实验组。给药剂量为Cy5.5浓度为2.5umol/Kg，阿霉素5mg/Kg。间隔两天给药一次，一共给药4次。最后一次给药后24h，裸鼠腹腔注射水合氯醛，利用Maestroin-vivoimagingsystem活体成像仪观察荧光物质的分布和在肿瘤部位的聚集，激发波长670，发射波长690，结果见图7；采用游标卡尺测量肿瘤体积，记录随时间肿瘤体积变化，结果见图8；称量小鼠体重，记录随时间的体重变化，结果见图9。从图7可以看出，相比对照组，实验组肿瘤荧光强度更强，其他组织荧光更弱，说明本发明制备的具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体肿瘤显像效果更好；从图8可以看出，实验组肿瘤体积小于对照组，说明本发明制备的具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药ATP敏感脂质体肿瘤治疗效果更好；从图9可以看出，实验组小鼠体重保持不变，没有减轻，说明本发明制备的具有肿瘤近红外荧光显像诊断功能的载药ATP敏感脂质体安全性更好。
Claims (10)
1.具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，其特征在于所述ATP敏感荧光探针脂质体为将载有阿霉素的ATP敏感核苷酸双链封装在偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜内形成的纳米囊泡，所述ATP敏感核苷酸双链由偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链和偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链根据碱基互补配对原则自组装形成，所述偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜由肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂和胆固醇组成，肿肿瘤靶向多肽偶联的聚二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂、胆固醇的摩尔比为(2～8)：(42～78)：(20～50)。
2.根据权利要求1所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，其特征在于所述偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链为偶联荧光染料cy3、cy5、cy5.5、cy7中的一种的ATP敏感核苷酸单链。
3.根据权利要求2所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，其特征在于所述ATP敏感核苷酸单链的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：1所述。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，其特征在于所述偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链为偶联荧光淬灭剂4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸的ATP敏感核苷酸互补单链。
5.根据权利要求1至3中任一权利要求所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，其特征在于所述肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺为末端氨基酸为半胱氨酸的含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸环状多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、末端氨基酸为半胱氨酸的人类表皮生长因子受体2多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺、末端氨基酸为半胱氨酸的转铁蛋白偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺中的一种。
6.根据权利要求5所述具有肿瘤靶向和示踪作用的ATP敏感荧光探针脂质体，其特征在于所述肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺为肿瘤靶向多肽偶联的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、肿瘤靶向多肽偶联的二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、肿瘤靶向多肽偶联的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、肿瘤靶向多肽偶联的二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000中的一种。
7.根据权利要求1至3中任一权利要求所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，其特征在于所述磷脂为卵磷脂、大豆磷脂、二硬脂酰磷脂胆碱中的一种。
8.根据权利要求4所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体，其特征在于所述磷脂为卵磷脂、大豆磷脂、二硬脂酰磷脂胆碱中的一种。
9.一种具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体的制备方法，其特性在于工艺步骤如下：
(1)将末端为半胱氨酸的肿瘤靶向多肽与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺按摩尔比1:1溶于甲醇中得到混合溶液，甲醇的用量以所述混合溶液中磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺的摩尔浓度为1～10mmol/L计，将所得混合溶液在室温下搅拌20～28小时进行反应，反应结束后除去反应液中的溶剂，即得肿瘤靶向多肽偶联的聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺；
(2)将步骤(1)制备所得肿瘤靶向多肽偶联的聚二醇化磷脂酰乙醇胺、磷脂、胆固醇按摩尔比为(2～8)：(42～78)：(20～50)溶于氯仿和甲醇复合溶剂中得到混合溶液，复合溶剂的用量以所得混合溶液中胆固醇和磷脂总浓度为1～10mmol/L计，减压蒸馏除去混合溶液中的溶剂得到偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜；
(3)将偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链和偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链按摩尔比1:1加入去离子水得混合液，去离子水的用量以所述混合液中ATP敏感核苷酸单链摩尔浓度为0.1～10mmol/L计，并搅拌10～60min，使偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链和偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链根据碱基互补配对原则自组装形成ATP敏感核苷酸双链；
(4)将步骤(3)所得ATP敏感核苷酸双链与阿霉素按照摩尔比1:(0.1～10)混合孵育10～30min，得到载阿霉素的ATP敏感核苷酸双链；
(5)将步骤(4)所得载阿霉素的ATP敏感核苷酸双链与步骤(2)所得偶联有肿瘤靶向多肽的脂质双分子层膜按照质量比1：(10～50)混合后置于40～60℃下水化一小时，得到磷脂和胆固醇总浓度为1～10mmol/L的悬液，将所得悬液水浴超声5～30分钟，再依次过400nm、200nm和100nm的多聚碳酸酯膜，采用凝胶排阻层析柱分离纯化后既得到具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体。
10.根据权利要求9所述具有肿瘤近红外荧光显像和治疗作用的ATP敏感脂质体的制备方法，其特征在于：
所述末端为半胱氨酸的肿瘤靶向多肽为末端为半胱氨酸的含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的环状多肽、末端为半胱氨酸的人类表皮生长因子受体2多肽、末端为半胱氨酸的转铁蛋白中的一种；
所述磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺中的一种；
所述磷脂为卵磷脂、大豆磷脂、二硬脂酰磷脂胆碱中的一种；
所述偶联荧光染料的ATP敏感核苷酸单链为偶联荧光染料cy3、cy5、cy5.5或cy7的ATP敏感核苷酸单链，所述ATP敏感核苷酸单链的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：1所述；
所述偶联荧光淬灭剂的ATP敏感核苷酸互补单链为偶联荧光淬灭剂4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸的ATP敏感核苷酸互补单链。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610254826.XA CN105770912B (zh) | 2016-04-21 | 2016-04-21 | 具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药atp敏感脂质体及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610254826.XA CN105770912B (zh) | 2016-04-21 | 2016-04-21 | 具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药atp敏感脂质体及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105770912A true CN105770912A (zh) | 2016-07-20 |
| CN105770912B CN105770912B (zh) | 2019-03-19 |
Family
ID=56398263
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610254826.XA Active CN105770912B (zh) | 2016-04-21 | 2016-04-21 | 具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药atp敏感脂质体及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105770912B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110559262A (zh) * | 2019-09-18 | 2019-12-13 | 青岛大学 | 一种功能性纳米脂质体及其制备方法 |
| CN111363822A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-07-03 | 深圳市鲲鹏未来科技有限公司 | 包含血液稳定性纳米颗粒的溶液、其制备方法及miRNA标志物的检测方法 |
| CN113274538A (zh) * | 2021-05-28 | 2021-08-20 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料及其制备方法和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1846691A (zh) * | 2005-04-11 | 2006-10-18 | 北京大学 | 注射用的整合素配体修饰的载抗癌药的长循环脂质体 |
| CN103341180A (zh) * | 2013-05-08 | 2013-10-09 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 用于肿瘤成像的靶向脂质体递药系统及制备方法和应用 |
| CN103371975A (zh) * | 2012-04-16 | 2013-10-30 | 上海现代药物制剂工程研究中心有限公司 | 靶向长循环脂质体制剂及其制备方法 |
| CN105055315A (zh) * | 2015-08-03 | 2015-11-18 | 四川大学 | 一种交联线粒体靶向阿霉素脂质体及其制备方法 |
-
2016
- 2016-04-21 CN CN201610254826.XA patent/CN105770912B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1846691A (zh) * | 2005-04-11 | 2006-10-18 | 北京大学 | 注射用的整合素配体修饰的载抗癌药的长循环脂质体 |
| CN103371975A (zh) * | 2012-04-16 | 2013-10-30 | 上海现代药物制剂工程研究中心有限公司 | 靶向长循环脂质体制剂及其制备方法 |
| CN103341180A (zh) * | 2013-05-08 | 2013-10-09 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 用于肿瘤成像的靶向脂质体递药系统及制备方法和应用 |
| CN105055315A (zh) * | 2015-08-03 | 2015-11-18 | 四川大学 | 一种交联线粒体靶向阿霉素脂质体及其制备方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CUICHEN WU ET AL.: "Engineering of Switchable Aptamer Micelle Flares for Molecular Imaging in Living Cells", 《ACSNANO》 * |
| LI LI ET AL.: "Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy", 《JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE》 * |
| RAN MO ET AL.: "ATP-triggered anticancer drug delivery", 《NATURE COMMUNICATIONS》 * |
| RAN MO ET AL.: "Enhanced Anticancer Efficacy by ATP-Mediated Liposomal Drug Delivery", 《ANGEW. CHEM. INT. ED.》 * |
| 苏志桂 等.: "克服肿瘤生理病理屏障的纳米药物递送系统的研究进展", 《中国药科大学学报》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110559262A (zh) * | 2019-09-18 | 2019-12-13 | 青岛大学 | 一种功能性纳米脂质体及其制备方法 |
| CN111363822A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-07-03 | 深圳市鲲鹏未来科技有限公司 | 包含血液稳定性纳米颗粒的溶液、其制备方法及miRNA标志物的检测方法 |
| CN111363822B (zh) * | 2019-11-20 | 2024-03-19 | 深圳市鲲鹏未来科技有限公司 | 包含血液稳定性纳米颗粒的溶液、其制备方法及miRNA标志物的检测方法 |
| CN113274538A (zh) * | 2021-05-28 | 2021-08-20 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种具有创面主动修复功能的bFGF缓释纳米敷料及其制备方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105770912B (zh) | 2019-03-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101816629B (zh) | 一种双重靶向脂质体及其制备方法和应用 | |
| Lu et al. | A biocompatible reconstituted high-density lipoprotein nano-system as a probe for lung cancer detection | |
| CN108578711B (zh) | 一种乙酰化糖酯-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺共轭物及其制备方法与应用 | |
| US20200392296A1 (en) | Nano coordination polymer and preparation method and application thereof | |
| Wu et al. | Biocompatible AIEgen/p-glycoprotein siRNA@ reduction-sensitive paclitaxel polymeric prodrug nanoparticles for overcoming chemotherapy resistance in ovarian cancer | |
| KR20180120220A (ko) | 난소암을 특이적으로 표적하는 생분해성 양친성 폴리머, 이로부터 제조된 폴리머 배시클 및 용도 | |
| CN105287383A (zh) | 新型米托蒽醌脂质体联合化疗药物在抗肿瘤治疗中的应用 | |
| CN104288784A (zh) | 纳米羟基磷灰石-基因-药物复合物及制备方法和应用 | |
| CN108164584B (zh) | Vap多肽及其在制备靶向诊疗肿瘤药物中的应用 | |
| CN105770912A (zh) | 具有肿瘤近红外荧光显像功能的载药atp敏感脂质体及其制备方法 | |
| CN104490786A (zh) | 一种靶向多功能双载药脂质体的制备方法和应用 | |
| CN110960688A (zh) | 用于提高胰腺癌疗效的低毒仿生化纳米系统及制备方法 | |
| CN110772645A (zh) | 功能化穿膜肽修饰的药物递送系统 | |
| Zhang et al. | Highly stable near-infrared dye conjugated cerasomes for fluorescence imaging-guided synergistic chemo-photothermal therapy of colorectal cancer | |
| CN108329404A (zh) | 一种ir-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物及制备与应用 | |
| CN103830739A (zh) | 配体多肽ph1形成的药物输送系统及其用途 | |
| Li et al. | Preparation and pharmacokinetics of glycyrrhetinic acid and cell transmembrane peptides modified with liposomes for liver targeted-delivery | |
| CN108653743A (zh) | 一种心脑双靶向脂质体及其制备方法和应用 | |
| CN105055315A (zh) | 一种交联线粒体靶向阿霉素脂质体及其制备方法 | |
| CN105287612B (zh) | 共载盐霉素钠与阿霉素纳米脂质体及其制备方法与应用 | |
| CN105797172B (zh) | 具有肿瘤靶向和示踪作用的atp敏感荧光探针脂质体及其制备方法与应用 | |
| CN110200916A (zh) | 一种双重酸敏性脂质体、以其为载体的药物及其制备方法 | |
| CN111298116B (zh) | 多肽载药温敏脂质体及其制备方法和应用 | |
| CN105055318B (zh) | 一种具有man和wga修饰的双重靶向脂质体及其制备方法和应用 | |
| CN110037989B (zh) | 一类自裂解多功能脂质体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |