CN108329404A - 一种ir-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物及制备与应用 - Google Patents

一种ir-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物及制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种IR‑780碘化物‑壳聚糖硬脂酸嫁接物，以三乙胺为缚酸剂，将IR‑780碘化物嫁接至壳聚糖硬脂酸嫁接物，得具有线粒体靶向功能的IR‑780碘化物‑壳聚糖硬脂酸嫁接物。通过透析法包封抗肿瘤药物阿霉素，得线粒体靶向IR‑780碘化物‑壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。本发明提供的载药胶束具备线粒体高效靶向的功能，包封的药物阿霉素，经近红外激光照射后，可在肿瘤细胞线粒体快速释放，减少阿霉素在正常组织及非靶部位的泄露，降低其毒副作用，增加阿霉素在肿瘤细胞线粒体的浓度，诱导肿瘤细胞凋亡，提高抗肿瘤疗效。

Description

一种IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物及制备与应用
技术领域
本发明属制药领域，涉及线粒体靶向及光热响应释放给药系统的构建，尤其涉及一种具有线粒体靶向及光热响应释放特性的IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束构建及其在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤细胞具有无限增殖潜力，对生长抑制信号的不敏感，凋亡的抑制，持续的增殖信号，诱导血管的发生，通过毛细血管壁和基底膜的侵袭和转移到其他位置等特征。目前，具备杀死肿瘤细胞潜力的化学治疗剂对正常组织也产生非特异性毒性。
药物分子可通过占位效应，作用于病灶细胞的受体、酶、离子通道。病灶细胞的细胞膜，胞浆中的线粒体、细胞核及核膜等亚细胞结构，是药物分子的主要作用位点。受其自身理化性质的限制，药物分子能够进入到作用位点的数量非常有限，是导致现有药物毒副作用大、疗效低的主要原因。
药物递释系统有可能将药物直接递释到其分子作用位点，提高靶点部位药物浓度，进而大幅度提高疗效。与传统药物递释系统相比，针对含药物分子作用位点的亚细胞结构靶向药物递释系统已成为解决上述难题的关键。
线粒体功能障碍与癌细胞发生、发展有很大的相关性，包括其无限增殖潜力，细胞凋亡受损，对抗生长信号的不敏感等。由线粒体介导的细胞凋亡在细胞死亡中扮演重要作用，线粒体是诱导肿瘤细胞凋亡的重要靶点。通过分子靶向技术，将促凋亡药物输送至肿瘤细胞线粒体，可大幅度降低脱靶效应，提高药物疗效与安全性。因此设计触发肿瘤细胞凋亡的线粒体靶向给药系统可能是有希望的癌症治疗策略。
线粒体内药物控制释放对于提高线粒体内药物浓度，刺激ROS爆发，产生更好的化疗效果非常重要。可以利用线粒体病理环境和外源性刺激设计线粒体内敏感释放的给药系统。然而，肿瘤线粒体与胞浆的环境参数太相似，给药系统到达线粒体前避免药物泄露较难。迫切发展一个智能线粒体靶向响应释放的给药系统，借助于外源性刺激，比如激光照射。
充分的亲脂性与离域正电荷结合是线粒体靶向的先决条件。线粒体通过氧化磷酸化途径在其脂双层中保持约-180至-200mV的恒定膜电位。这种高的负膜电位在其他任何细胞器中都不存在的，这为亲脂阳离子提供了选择性积累的条件。其中七甲川花菁荧光小分子IR-780碘化物选择性蓄积在肿瘤细胞的线粒体内，其亲脂性离域型阳离子特性与其靶向肿瘤细胞线粒体密切相关。且IR-780碘化物最大吸收和发射波长均在700-900nm近红外光谱区，具有近红外荧光显影特性和良好的光热特性。
将线粒体靶向敏感释放与胶束给药系统结合，一方面诱导肿瘤细胞凋亡，另一方面减少药物本身的副作用，可大幅度提高抗肿瘤疗效。由两亲嵌段共聚物分子在水性介质中自聚集形成的聚合物胶束，是传递药物的新型纳米给药载体。因其具有一些特有的药物载体性质，如粒径小，在体内、外具有良好的稳定性和生物相容性，药物的控制释放以及生物膜通透性等特性，被认为是一种具有广阔前景的新型靶向给药系统。
聚合物胶束通过“增强渗透与保留作用”，被动靶向肿瘤部位。壳聚糖硬脂酸嫁接物胶束是由聚阳离子天然高分子材料壳聚糖经脂肪酸修饰后所得，该嫁接物在水性介质中可通过自组装形成嫁接物胶束，具有快速的肿瘤细胞摄取功能。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物，其中壳聚糖的分子量为5～20kDa，脂肪酸的碳链长度为十八碳，壳聚糖的脱乙酰度为95％，氨基取代度为17.9～19.9％，IR-780碘化物的修饰比例为1.1～3.1％。其具有代表性的化学结构通式为：
其中，n为壳聚糖链上未被脂肪酸和IR-780碘化物化学嫁接的氨基葡萄糖和乙酰化氨基葡萄糖单元数。所述IR-780碘化物是七甲川花菁荧光小分子。
本发明的第二个目的是提供所述IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的制备方法，具体通过以下步骤实现。
(1)根据发明专利ZL200610051601.0提供的方法合成壳聚糖硬脂酸嫁接物：
取分子量为5～20kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备20mg/mL溶液。另按硬脂酸与壳聚糖的摩尔比为25:1取硬脂酸，按碳二亚胺与硬脂酸的摩尔比为6：1取碳二亚胺，混合，按乙醇与蒸馏水的体积比为1：2加入乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌50min。然后缓慢加入至60℃下预热的壳聚糖水溶液中，60℃下搅拌反应12小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000Da的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物；
(2)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取IR-780碘化物，溶于少量无水二甲亚砜中，超声使其溶解，制备10mg/mL溶液，另按三乙胺：IR-780碘化物的摩尔比为1：1～3：1取三乙胺，加入上述溶液中，60℃条件下搅拌1～12小时，得反应液1，按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：IR-780碘化物的摩尔比为5：1～20：1取壳聚糖硬脂酸，溶于去离子水中，加入到反应液1中，60℃条件下搅拌1～24小时，将终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48小时后，8000r离心10min，收集上清液，冷冻干燥，得IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸固体粉末；
合成路线为：
本发明所使用的壳聚糖脂肪酸嫁接物已为国家发明专利“荧光标记疏水改性壳聚糖聚合物及制备方法和应用”(专利号：ZL2005100507981)；和“表面修饰疏水改性壳聚糖聚合物给药胶团及其制备方法”(专利号：ZL200610051601.0)所涵盖。壳聚糖脂肪酸嫁接物中壳聚糖的分子量为5～20kDa；脂肪酸的碳链长度为十八碳；壳聚糖的脱乙酰度为95％；氨基取代度为16.8％。
本发明的第三个目的是提供一种IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的构建方法，载有的药物为阿霉素，通过以下方案实现：
(1)碱基阿霉素制备：称取盐酸阿霉素200mg，溶于20mL二甲基亚砜中，加入三乙胺，盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1:2，搅拌过夜，将反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时，收集透析袋中产物，于8000r下离心10min，收集沉淀，用水溶解，重复三次以除去残留的盐酸阿霉素，冷冻干燥，得碱基阿霉素；
(2)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的制备：称取IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于去离子水中，探头超声30次，功率为400w，工作2s停3s，制备得嫁接物胶束溶液，另取碱基阿霉素，加入二甲基亚砜，配成浓度为2mg/mL的溶液。按阿霉素：嫁接物的质量比为5％～15％的投药量加入含2mg/mL阿霉素的二甲亚砜溶液，在室温下避光搅拌0.5～2小时，反应结束后转移到截留分子量为3500Da的透析袋中，纯水透析24小时，收集透析好的产物于8000r下低温离心10min，以除去未被嫁接物胶束包封的阿霉素，收集上清液，得IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。
本发明的第四个目的是提供一种IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束在制备线粒体靶向抗肿瘤药物中的应用。研究显示，IR-780碘化物修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物具有高效的线粒体靶向能力，且IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束具有显著的抗肿瘤活性。
本发明的第五个目的是提供一种IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束在制备线粒体内光热响应释放抗肿瘤药物中的应用。研究显示，IR-780碘化物修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束经近红外激光照射后，包封的阿霉素在线粒体内大量释放，且IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束经近红外激光照射后抗肿瘤活性显著增强。
本发明提供一种七甲川花菁荧光小分子IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物，具备线粒体高效靶向的功能，进一步包封抗肿瘤药物阿霉素，获得的载药胶束经近红外激光照射后，可实现肿瘤细胞线粒体内药物快速释放，减少阿霉素在正常组织及非靶部位的泄露，增加阿霉素在肿瘤细胞线粒体的浓度，诱导肿瘤细胞凋亡，大幅度提高抗肿瘤疗效。
附图说明
图1为IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的核磁共振图谱，A为IR-780碘化物、B为壳聚糖硬脂酸嫁接物、C为IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物。
图2为IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的紫外吸收光谱。
图3为IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的光热曲线。
图4为IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物在乳腺癌MCF-7细胞上孵育1、4、12小时的定量摄取情况。
图5为IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物在MCF-7细胞线粒体共定位系数分析。
图6为IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束在pH 6.8释放介质中经近红外激光照射后阿霉素的释放曲线。
图7为IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束在MCF-7细胞内经近红外激光照射后阿霉素的释放量。
图8为IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束在近红外激光照射下释放的阿霉素与MCF-7细胞线粒体共定位系数分析。
图9为IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束经近红外激光照射后在MCF-7细胞上的抗肿瘤药效。
具体实施方式
本发明通过实施例和附图作进一步的说明。
实施例1
(1)低分子量壳聚糖的制备
取分子量为450kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖50g，加至1500mL体积比1.2％的盐酸水溶液中，55℃温度条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶胀后，缓慢加入重量比为2％的壳聚糖酶溶液，在55℃条件下进行壳聚糖酶解反应，以凝胶渗透色谱法控制壳聚糖的降解程度。待反应结束后，在80℃下搅拌0.5小时，加入重量/体积比为0.3％的活性炭，将反应液稀释后，用布氏漏斗过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜处理，冷冻干燥得低分子量壳聚糖，所得壳聚糖的重均分子量为5～20kDa。
(2)壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述分子量为5～20kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备20mg/mL溶液。另按硬脂酸与壳聚糖的摩尔比为25:1取硬脂酸，按碳二亚胺与硬脂酸的摩尔比为6:1取碳二亚胺，混合，按乙醇与蒸馏水的体积比为1：2加入乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌50min。然后缓慢加入至60℃下预热的壳聚糖水溶液中，60℃下搅拌反应12小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000Da的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物。
(3)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取IR-780碘化物，溶于少量无水二甲亚砜中，超声使其溶解，制备10mg/mL溶液，另按三乙胺：IR-780碘化物的摩尔比为2：1取三乙胺，加入上述溶液中，60℃条件下搅拌12小时，得反应液1，按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：IR-780碘化物的摩尔比为5：1取壳聚糖硬脂酸，溶于去离子水中，加入到反应液1中，60℃条件下搅拌24小时，将终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48小时后，8000r离心10min，收集上清液，冷冻干燥，得IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸固体粉末。
采用三硝基苯磺酸法测定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取1～10mg不同重量的壳聚糖分别溶于2mL的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2mL和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2小时，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，于344nm处测定吸光度，制备标准曲线。取上述IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸各6mg，分别溶于3mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算得，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为17.9％，壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为16.8％，IR-780碘化物修饰比例为1.1％。
实施例2
(1)低分子量壳聚糖的制备
取分子量为450kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖50g，加至1500mL体积比1.2％的盐酸水溶液中，55℃温度条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶胀后，缓慢加入重量比为2％的壳聚糖酶溶液，在55℃条件下进行壳聚糖酶解反应，以凝胶渗透色谱法控制壳聚糖的降解程度。待反应结束后，在80℃下搅拌0.5小时，加入重量/体积比为0.3％的活性炭，将反应液稀释后，用布氏漏斗过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜处理，冷冻干燥得低分子量壳聚糖，所得壳聚糖的重均分子量为5～20kDa。
(2)壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述分子量为5～20kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备20mg/mL溶液。另按硬脂酸与壳聚糖的摩尔比为25:1取硬脂酸，按碳二亚胺与硬脂酸的摩尔比为6:1取碳二亚胺，混合，按乙醇与蒸馏水的体积比为1：2加入乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌50min。然后缓慢加入至60℃下预热的壳聚糖水溶液中，60℃下搅拌反应12小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000Da的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物。
(3)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取IR-780碘化物，溶于少量无水二甲亚砜中，超声使其溶解，制备10mg/mL溶液，另按三乙胺：IR-780碘化物的摩尔比为2：1取三乙胺，加入上述溶液中，60℃条件下搅拌12小时，得反应液1，按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：IR-780碘化物的摩尔比为10：1取壳聚糖硬脂酸，溶于去离子水中，加入到反应液1中，60℃条件下搅拌24小时，将终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48小时后，8000r离心10min，收集上清液，冷冻干燥，得IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸固体粉末。
采用三硝基苯磺酸法测定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取1～10mg不同重量的壳聚糖分别溶于2mL的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2mL和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2小时，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，于344nm处测定吸光度，制备标准曲线。取上述IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸各6mg，分别溶于3mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算得，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为19.1％，壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为16.8％，IR-780碘化物修饰比例为2.3％。
实施例3
(1)低分子量壳聚糖的制备
取分子量为450kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖50g，加至1500mL体积比1.2％的盐酸水溶液中，55℃温度条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶胀后，缓慢加入重量比为2％的壳聚糖酶溶液，在55℃条件下进行壳聚糖酶解反应，以凝胶渗透色谱法控制壳聚糖的降解程度。待反应结束后，在80℃下搅拌0.5小时，加入重量/体积比为0.3％的活性炭，将反应液稀释后，用布氏漏斗过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜处理，冷冻干燥得低分子量壳聚糖，所得壳聚糖的重均分子量为5～20kDa。
(2)壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述分子量为5～20kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备20mg/mL溶液。另按硬脂酸与壳聚糖的摩尔比为25:1取硬脂酸，按碳二亚胺与硬脂酸的摩尔比为6:1取碳二亚胺，混合，按乙醇与蒸馏水的体积比为1：2加入乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌50min。然后缓慢加入至60℃下预热的壳聚糖水溶液中，60℃下搅拌反应12小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000Da的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物。
(3)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取IR-780碘化物，溶于少量无水二甲亚砜中，超声使其溶解，制备10mg/mL溶液，另按三乙胺：IR-780碘化物的摩尔比为2：1取三乙胺，加入上述溶液中，60℃条件下搅拌12小时，得反应液1，按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：IR-780碘化物的摩尔比为20：1取壳聚糖硬脂酸，溶于去离子水中，加入到反应液1中，60℃条件下搅拌24小时，将终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48小时后，8000r离心10min，收集上清液，冷冻干燥，得IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸固体粉末。
采用三硝基苯磺酸法测定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取1～10mg不同重量的壳聚糖分别溶于2mL的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2mL和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2小时，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，于344nm处测定吸光度，制备标准曲线。取上述IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸各6mg，分别溶于3mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算得，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为19.9％，壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为16.8％，IR-780碘化物修饰比例为3.1％。
(4)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的理化性质
核磁共振光谱法测定IR-780碘化物、壳聚糖硬脂酸嫁接物、IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物。称取IR-780碘化物、壳聚糖硬脂酸嫁接物、IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物各10mg，分别用0.5mL D2O溶解，用核磁共振1H-NMR测定。结果参见图1，A为IR-780碘化物、B为壳聚糖硬脂酸嫁接物、C为IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物。由图可确定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成。
采用芘荧光法测定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的临界胶束浓度。取芘12mg，精密称定，置于100mL容量瓶，加丙酮溶解并定容。移取上述芘溶液1mL，置于100mL容量瓶中稀释并定容。移取稀释后的芘溶液0.5mL分别置10mL玻璃试管中，50℃挥去丙酮。分别加入不同浓度的壳聚糖硬脂酸嫁接物和IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液5mL，控制芘终浓度为7×10-7mol/L，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，其中Ex＝337nm，Em：I1＝374nm，I3＝384nm，狭缝＝2.5nm和10nm，测定荧光强度，经计算得，壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为29.2μg/mL，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为62.4μg/mL。
分别取IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物和壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶解于蒸馏水，探头超声30次，功率为400w，工作2s，间歇3s，得到1mg/mL的嫁接物胶束溶液。微粒粒度与表面电位分析仪测得，壳聚糖硬脂酸的粒径为85.0±3.8nm，Zeta电位为37.4±1.5mV。IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的粒径为149.7±2.5nm，Zeta电位为39.4±0.6mV。
取IR-780碘化物溶于二甲亚砜、壳聚糖硬脂酸嫁接物和IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶于蒸馏水中，紫外分光光度计测得，IR-780碘化物及IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物在795nm处有最大吸收，见图2。
取IR-780碘化物溶于二甲亚砜，得10μg/mL或1μg/mL溶液；取IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶于蒸馏水中，得含等量10μg/mL或1μg/mL IR-780碘化物的嫁接物水溶液，在808nm波长下照射5min，照射频率为1W/cm2。PBS作为对照组。温度探针测得，IR-780碘化物(10μg/mL)温度升高了26.3℃，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物(含等量IR-780碘化物：10μg/mL)从26.4℃升高到了55.8℃，具有较好的光热特性。IR-780碘化物浓度为1μg/mL时，IR-780碘化物与IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物具有相似的光热特性。见图3。
(5)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的细胞摄取及线粒体共定位
采用糖脂嫁接物荧光标记胶束进行细胞摄取及线粒体共定位研究。以异硫氰基荧光素(FITC)标记壳聚糖硬脂酸嫁接物及IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物。分别取壳聚糖硬脂酸嫁接物或IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体，溶于去离子水中，配制成2mg/mL糖脂嫁接物载体溶液。另取FITC，溶于无水乙醇，配制成2mg/mL溶液。在400rpm条件下，将40μLFITC乙醇溶液，缓慢滴入糖脂嫁接物载体溶液，避光搅拌4小时。随后置于截留分子量为3500的透析袋中，去离子水透析8小时。透析纯化物8000rpm离心10min，取上清液，得到FITC标记的糖脂嫁接物载体。
取生长状态良好的乳腺癌MCF-7细胞，以2×105/mL密度接种于6孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养至贴壁，待融合度达到75％，加入FITC标记的壳聚糖硬脂酸嫁接物或IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体溶液。继续分别孵育1、4、12小时，收集细胞。流式细胞仪定量检测FITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物及FITC-IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体的细胞摄取情况。结果见图4。
取生长状态良好的MCF-7细胞，以5×104/mL密度接种于覆有玻片的24孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养至贴壁，待融合度达到75％，加入FITC标记的壳聚糖硬脂酸嫁接物或IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体溶液。继续分别孵育6、8、12小时，吸弃培养基，加入含线粒体探针的不含酚红DMEM培养液孵育30min，PBS冲洗三遍。盖玻片以4％多聚甲醛避光固定，20min后取出，甘油包埋于载玻片上，封片。激光共聚焦扫描显微镜观察FITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物及FITC-IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体的细胞摄取及线粒体共定位情况，用ImageJ软件分析共定位系数，结果见图5。
图5所示，经ImageJ软件分析计算得，与壳聚糖硬脂酸相比，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物与线粒体的共定位系数有明显的提高。结果说明IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物具有高效的线粒体靶向功能。
(6)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的制备
碱基阿霉素制备：称取盐酸阿霉素200mg，溶于20mL二甲基亚砜中，加入三乙胺，盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1:2，搅拌过夜，将反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时，收集透析袋中产物，于8000r下离心10min，收集沉淀，用水溶解，重复三次以除去残留的盐酸阿霉素，冷冻干燥，得碱基阿霉素。
称取IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于去离子水中，探头超声30次，功率为400w，工作2s停3s，制备2mg/mL的嫁接物胶束溶液。另取碱基阿霉素，加入二甲基亚砜，配成浓度为2mg/mL的溶液。按阿霉素:嫁接物的质量比为5％的投药量加入含2mg/mL阿霉素的二甲亚砜溶液，室温下避光搅拌2小时，反应结束后转移到截留分子量为3500的透析袋中，纯水透析24小时，收集透析好的产物于8000r下低温离心10min，以除去未被嫁接物胶束包封的阿霉素，收集上清液，得IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。
利用荧光分光光度法测定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束中阿霉素的含量。精密量取0.5mL含1mg/mL阿霉素的二甲基亚砜溶液于10mL容量瓶，用含二甲基亚砜：水＝9：1的溶媒稀释至刻度，混匀，作为母液待用。分别取适量母液，用溶媒进行稀释，获得0.05、0.08、0.1、0.3、0.5、0.8、1、2μg/mL的阿霉素溶液，荧光分光光度仪测定各个浓度溶液的荧光强度，其中Em＝565nm，Ex＝505nm，狭缝＝5.0nm，工作电压＝700V，以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标作图，即得标准曲线。
利用有机溶剂提取-超滤离心法分别测定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束和壳聚糖硬脂酸载药胶束中阿霉素载药量和包封率。取10μL的1mg/mL阿霉素载药纳米粒溶液，用含二甲基亚砜：水＝9:1的溶媒稀释至1000μL，水浴超声30分钟，荧光分光光度仪测定样品荧光强度，根据标准曲线计算载药纳米粒溶液中游离药物浓度。另取500μL阿霉素载药纳米粒溶液，置于超滤离心管中，10000rpm离心20分钟，取滤液测定未被包封的游离药物浓度。
包封率＝(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量)/阿霉素投药质量×100％
载药量＝(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量)/(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量+嫁接物胶束的质量)×100％
经计算得到IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为4.1％，包封率为85.6％；壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为3.8％，包封率为80.0％。
实施例4
(1)低分子量壳聚糖的制备
取分子量为450kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖50g，加至1500mL体积比1.2％的盐酸水溶液中，55℃温度条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶胀后，缓慢加入重量比为2％的壳聚糖酶溶液，在55℃条件下进行壳聚糖酶解反应，以凝胶渗透色谱法控制壳聚糖的降解程度。待反应结束后，在80℃下搅拌0.5小时，加入重量/体积比为0.3％的活性炭，将反应液稀释后，用布氏漏斗过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜处理，冷冻干燥得低分子量壳聚糖，所得壳聚糖的重均分子量为19.0kDa。
(2)壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述分子量为19.0kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备20mg/ml溶液。另按硬脂酸与壳聚糖的摩尔比为25:1取硬脂酸，按碳二亚胺与硬脂酸的摩尔比为6:1取碳二亚胺，混合，按乙醇与蒸馏水的体积比为1：2加入乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌50min。然后缓慢加入至60℃下预热的壳聚糖水溶液中，60℃下搅拌反应12小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000Da的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物。
(3)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取IR-780碘化物，溶于少量无水二甲亚砜中，超声使其溶解，制备10mg/mL溶液，另按三乙胺：IR-780碘化物的摩尔比为2：1取三乙胺，加入上述溶液中，60℃条件下搅拌12小时，得反应液1，按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：IR-780碘化物的摩尔比为20：1取壳聚糖硬脂酸，溶于去离子水中，加入到反应液1中，60℃条件下搅拌24小时，将终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48小时后，8000r离心10min，收集上清液，冷冻干燥，得IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸固体粉末。
采用三硝基苯磺酸法测定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取1～10mg不同重量的壳聚糖分别溶于2mL的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2mL和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2小时，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，于344nm处测定吸光度，制备标准曲线。取上述IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸各6mg，分别溶于3mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算得，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为19.9％，壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为16.8％，IR-780碘化物修饰比例为3.1％。
(4)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的理化性质
核磁共振光谱法测定IR-780碘化物、壳聚糖硬脂酸嫁接物、IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物。称取IR-780碘化物、壳聚糖硬脂酸嫁接物、IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物各10mg，分别用0.5mL D2O溶解，用核磁共振1H-NMR测定。结果参见图1，A为IR-780碘化物、B为壳聚糖硬脂酸嫁接物、C为IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物。由图可确定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成。
采用芘荧光法测定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的临界胶束浓度。取芘12mg，精密称定，置于100mL容量瓶，加丙酮溶解并定容。移取上述芘溶液1mL，置于100mL容量瓶中稀释并定容。移取稀释后的芘溶液0.5mL分别置10mL玻璃试管中，50℃挥去丙酮。分别加入不同浓度的壳聚糖硬脂酸嫁接物和IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液5mL，控制芘终浓度为7×10-7mol/L，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，其中Ex＝337nm，Em：I1＝374nm，I3＝384nm，狭缝＝2.5nm和10nm，测定荧光强度，经计算得，壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为29.2μg/mL，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为62.4μg/mL。
分别取IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物和壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶解于蒸馏水，探头超声30次，功率为400w，工作2s，间歇3s，得到1mg/mL的嫁接物胶束溶液。微粒粒度与表面电位分析仪测得，壳聚糖硬脂酸的粒径为85.0±3.8nm，Zeta电位为37.4±1.5mV。IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的粒径为149.7±2.5nm，Zeta电位为39.4±0.6mV。
取IR-780碘化物溶于二甲亚砜、壳聚糖硬脂酸嫁接物和IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶于蒸馏水中，紫外分光光度计测得，IR-780碘化物及IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物在795nm处有最大吸收，见图2。
取IR-780碘化物溶于二甲亚砜，得10μg/mL或1μg/mL溶液；取IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶于蒸馏水中，得含等量10μg/mL或1μg/mL IR-780碘化物的嫁接物水溶液，在808nm波长下照射5min，照射频率为1W/cm2。PBS作为对照组。温度探针测得，IR-780碘化物(10μg/mL)温度升高了26.3℃，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物(含等量IR-780碘化物：10μg/mL)从26.4℃升高到了55.8℃，具有较好的光热特性。IR-780碘化物浓度为1μg/mL时，IR-780碘化物与IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物具有相似的光热特性。见图3。
(5)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的细胞摄取及线粒体共定位
采用糖脂嫁接物荧光标记胶束进行细胞摄取及线粒体共定位研究。以异硫氰基荧光素(FITC)标记壳聚糖硬脂酸嫁接物及IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物。分别取壳聚糖硬脂酸嫁接物或IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体，溶于去离子水中，配制成2mg/mL糖脂嫁接物载体溶液。另取FITC，溶于无水乙醇，配制成2mg/mL溶液。在400rpm条件下，将40μLFITC乙醇溶液，缓慢滴入糖脂嫁接物载体溶液，避光搅拌4小时。随后置于截留分子量为3500的透析袋中，去离子水透析8小时。透析纯化物8000rpm离心10min，取上清液，得到FITC标记的糖脂嫁接物载体。
取生长状态良好的MCF-7细胞，以2×105/mL密度接种于6孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养至贴壁，待融合度达到75％，加入FITC标记的壳聚糖硬脂酸嫁接物或IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体溶液。继续分别孵育1、4、12小时，收集细胞。流式细胞仪定量检测FITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物及FITC-IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体的细胞摄取情况。结果见图4。
取生长状态良好的MCF-7细胞，以5×104/mL密度接种于覆有玻片的24孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养至贴壁，待融合度达到75％，加入FITC标记的壳聚糖硬脂酸嫁接物或IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体溶液。继续分别孵育6、8、12小时，吸弃培养基，加入含线粒体探针的不含酚红DMEM培养液孵育30min，PBS冲洗三遍。盖玻片以4％多聚甲醛避光固定，20min后取出，甘油包埋于载玻片上，封片。激光共聚焦扫描显微镜观察FITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物及FITC-IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体的细胞摄取及线粒体共定位情况，用ImageJ软件分析共定位系数，结果见图5。
图5所示，经ImageJ软件分析计算得，与壳聚糖硬脂酸相比，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物与线粒体的共定位系数有明显的提高。结果说明IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物具有高效的线粒体靶向功能。
(6)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的制备
碱基阿霉素制备：称取盐酸阿霉素200mg，溶于20mL二甲基亚砜中，加入三乙胺，盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1:2，搅拌过夜，将反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时，收集透析袋中产物，于8000r下离心10min，收集沉淀，用水溶解，重复三次以除去残留的盐酸阿霉素，冷冻干燥，得碱基阿霉素。
称取IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于去离子水中，探头超声30次，功率为400w，工作2s停3s，制备2mg/mL的嫁接物胶束溶液。另取碱基阿霉素，加入二甲基亚砜，配成浓度为2mg/mL的溶液。按阿霉素:嫁接物的质量比为10％的投药量加入含2mg/mL阿霉素的二甲亚砜溶液，室温下避光搅拌2小时，反应结束后转移到截留分子量为3500的透析袋中，纯水透析24小时，收集透析好的产物于8000r下低温离心10min，以除去未被嫁接物胶束包封的阿霉素，收集上清液，得IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。
利用荧光分光光度法测定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束中阿霉素的含量。精密量取0.5mL含1mg/mL阿霉素的二甲基亚砜溶液于10mL容量瓶，用含二甲基亚砜：水＝9：1的溶媒稀释至刻度，混匀，作为母液待用。分别取适量母液，用溶媒进行稀释，获得0.05、0.08、0.1、0.3、0.5、0.8、1、2μg/mL的阿霉素溶液，荧光分光光度仪测定各个浓度溶液的荧光强度，其中Em＝565nm，Ex＝505nm，狭缝＝5.0nm，工作电压＝700V，以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标作图，即得标准曲线。
利用有机溶剂提取-超滤离心法分别测定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束和壳聚糖硬脂酸载药胶束中阿霉素载药量和包封率。取10μL的1mg/mL阿霉素载药纳米粒溶液，用含二甲基亚砜：水＝9：1的溶媒稀释至1000μL，水浴超声30分钟，荧光分光光度仪测定样品荧光强度，根据标准曲线计算载药纳米粒溶液中游离药物浓度。另取500μL阿霉素载药纳米粒溶液，置于超滤离心管中，10000rpm离心20分钟，取滤液测定未被包封的游离药物浓度。
包封率＝(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量)/阿霉素投药质量×100％
载药量＝(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量)/(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量+嫁接物胶束的质量)×100％。
经计算得到IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为7.7％，包封率为83.9％；壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为7.2％，包封率为77.5％。
实施例5
(1)低分子量壳聚糖的制备
取分子量为450kDa、脱乙酰度为95％的壳聚糖50g，加至1500mL体积比1.2％的盐酸水溶液中，55℃温度条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶胀后，缓慢加入重量比为2％的壳聚糖酶溶液，在55℃条件下进行壳聚糖酶解反应，以凝胶渗透色谱法控制壳聚糖的降解程度。待反应结束后，在80℃下搅拌0.5小时，加入重量/体积比为0.3％的活性炭，将反应液稀释后，用布氏漏斗过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜处理，冷冻干燥得低分子量壳聚糖，所得壳聚糖的重均分子量为19.0kDa。
(2)壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述分子量为19.0kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备20mg/mL溶液。另按硬脂酸与壳聚糖的摩尔比为25:1取硬脂酸，按碳二亚胺与硬脂酸的摩尔比为6:1取碳二亚胺，混合，按乙醇与蒸馏水的体积比为1：2加入乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌50min。然后缓慢加入至60℃下预热的壳聚糖水溶液中，60℃下搅拌反应12小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000Da的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物。
(3)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取IR-780碘化物，溶于少量无水二甲亚砜中，超声使其溶解，制备10mg/mL溶液，另按三乙胺：IR-780碘化物的摩尔比为2：1取三乙胺，加入上述溶液中，60℃条件下搅拌12小时，得反应液1，按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：IR-780碘化物的摩尔比为20：1取壳聚糖硬脂酸，溶于去离子水中，加入到反应液1中，60℃条件下搅拌24小时，将终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48小时后，8000r离心10min，收集上清液，冷冻干燥，得IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸固体粉末。
(4)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的理化性质
核磁共振光谱法测定IR-780碘化物、壳聚糖硬脂酸嫁接物、IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物。称取IR-780碘化物、壳聚糖硬脂酸嫁接物、IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物各10mg，分别用0.5mL D2O溶解，用核磁共振1H-NMR测定。结果参见图1，A为IR-780碘化物、B为壳聚糖硬脂酸嫁接物、C为IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物。由图可确定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成。
采用芘荧光法测定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的临界胶束浓度。取芘12mg，精密称定，置于100mL容量瓶，加丙酮溶解并定容。移取上述芘溶液1mL，置于100mL容量瓶中稀释并定容。移取稀释后的芘溶液0.5mL分别置10mL玻璃试管中，50℃挥去丙酮。分别加入不同浓度的壳聚糖硬脂酸嫁接物和IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶液5mL，控制芘终浓度为7×10-7mol/L，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，其中Ex＝337nm，Em：I1＝374nm，I3＝384nm，狭缝＝2.5nm和10nm，测定荧光强度，经计算得，壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为29.2μg/mL，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸的临界胶束浓度为62.4μg/mL。
采用三硝基苯磺酸法测定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取1～10mg不同重量的壳聚糖分别溶于2mL的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2mL和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2小时，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，于344nm处测定吸光度，制备标准曲线。取上述IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物及壳聚糖硬脂酸各6mg，分别溶于3mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算得，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为19.9％，壳聚糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为16.8％，IR-780碘化物修饰比例为3.1％。
分别取IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物和壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶解于蒸馏水，探头超声30次，功率为400w，工作2s，间歇3s，得到1mg/mL的嫁接物胶束溶液。微粒粒度与表面电位分析仪测得，壳聚糖硬脂酸的粒径为85.0±3.8nm，Zeta电位为37.4±1.5mV。IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的粒径为149.7±2.5nm，Zeta电位为39.4±0.6mV。
取IR-780碘化物溶于二甲亚砜、壳聚糖硬脂酸嫁接物和IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶于蒸馏水中，紫外分光光度计测得，IR-780碘化物及IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物在795nm处有最大吸收，见图2。
取IR-780碘化物溶于二甲亚砜，得10μg/mL或1μg/mL溶液；取IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物溶于蒸馏水中，得含等量10μg/mL或1μg/mL IR-780碘化物的嫁接物水溶液，在808nm波长下照射5min，照射频率为1W/cm2。PBS作为对照组。温度探针测得，IR-780碘化物(10μg/mL)温度升高了26.3℃，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物(含等量IR-780碘化物：10μg/mL)从26.4℃升高到了55.8℃，具有较好的光热特性。IR-780碘化物浓度为1μg/mL时，IR-780碘化物与IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物具有相似的光热特性。见图3。
(5)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的细胞摄取及线粒体共定位
采用糖脂嫁接物荧光标记胶束进行细胞摄取及线粒体共定位研究。以异硫氰基荧光素(FITC)标记壳聚糖硬脂酸嫁接物及IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物。分别取壳聚糖硬脂酸嫁接物或IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体，溶于去离子水中，配制成2mg/mL糖脂嫁接物载体溶液。另取FITC，溶于无水乙醇，配制成2mg/mL溶液。在400rpm条件下，将40μLFITC乙醇溶液，缓慢滴入糖脂嫁接物载体溶液，避光搅拌4小时。随后置于截留分子量为3500的透析袋中，去离子水透析8小时。透析纯化物8000rpm离心10min，取上清液，得到FITC标记的糖脂嫁接物载体。
取生长状态良好的MCF-7细胞，以2×105/mL密度接种于6孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养至贴壁，待融合度达到75％，加入FITC标记的壳聚糖硬脂酸嫁接物或IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体溶液。继续分别孵育1、4、12小时，收集细胞。流式细胞仪定量检测FITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物及FITC-IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体的细胞摄取情况。结果见图4。
取生长状态良好的MCF-7细胞，以5×104/mL密度接种于覆有玻片的24孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养至贴壁，待融合度达到75％，加入FITC标记的壳聚糖硬脂酸嫁接物或IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体溶液。继续分别孵育6、8、12小时，吸弃培养基，加入含线粒体探针的不含酚红DMEM培养液孵育30min，PBS冲洗三遍。盖玻片以4％多聚甲醛避光固定，20min后取出，甘油包埋于载玻片上，封片。激光共聚焦扫描显微镜观察FITC-壳聚糖硬脂酸嫁接物及FITC-IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载体的细胞摄取及线粒体共定位情况，用ImageJ软件分析共定位系数，结果见图5。
图5所示，经ImageJ软件分析计算得，与壳聚糖硬脂酸相比，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物与线粒体的共定位系数有明显的提高。结果说明IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物具有高效的线粒体靶向功能。
(6)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的制备
碱基阿霉素制备：称取盐酸阿霉素200mg，溶于20mL二甲基亚砜中，加入三乙胺，盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1:2，搅拌过夜，将反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时，收集透析袋中产物，于8000r下离心10min，收集沉淀，用水溶解，重复三次以除去残留的盐酸阿霉素，冷冻干燥，得碱基阿霉素。
称取IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于去离子水中，探头超声30次，功率为400w，工作2s停3s，制备2mg/mL的嫁接物胶束溶液。另取碱基阿霉素，加入二甲基亚砜，配成浓度为2mg/mL的溶液。按阿霉素：嫁接物的质量比为15％的投药量加入含2mg/mL阿霉素的二甲亚砜溶液，室温下避光搅拌2小时，反应结束后转移到截留分子量为3500的透析袋中，纯水透析24小时，收集透析好的产物于8000r下低温离心10min，以除去未被嫁接物胶束包封的阿霉素，收集上清液，得IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。
利用荧光分光光度法测定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束中阿霉素的含量。精密量取0.5mL含1mg/mL阿霉素的二甲基亚砜溶液于10mL容量瓶，用含二甲基亚砜：水＝9：1的溶媒稀释至刻度，混匀，作为母液待用。分别取适量母液，用溶媒进行稀释，获得0.05、0.08、0.1、0.3、0.5、0.8、1、2μg/mL的阿霉素溶液，荧光分光光度仪测定各个浓度溶液的荧光强度，其中Em＝565nm，Ex＝505nm，狭缝＝5.0nm，工作电压＝700V，以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标作图，即得标准曲线。
利用有机溶剂提取-超滤离心法分别测定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束和壳聚糖硬脂酸载药胶束中阿霉素载药量和包封率。取10μL的1mg/mL阿霉素载药纳米粒溶液，用含二甲基亚砜：水＝9:1的溶媒稀释至1000μL，水浴超声30分钟，荧光分光光度仪测定样品荧光强度，根据标准曲线计算载药纳米粒溶液中游离药物浓度。另取500μL阿霉素载药纳米粒溶液，置于超滤离心管中，10000rpm离心20分钟，取滤液测定未被包封的游离药物浓度。
包封率＝(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量)/阿霉素投药质量×100％
载药量＝(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量)/(载药嫁接物胶束样品中的阿霉素质量-未被包封的游离阿霉素质量+嫁接物胶束的质量)×100％。
经计算得到IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为10.9％，包封率为81.1％；壳聚糖硬脂酸载药胶束的载药量为10.1％，包封率为74.8％。
制备1mg/mL的IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束和壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束溶液，用微粒粒度与表面电位测定仪分别测定载药胶束的粒径及表面电位。经测定得，壳聚糖硬脂酸载药胶束的粒径为48.4±1.1nm，Zeta电位为36.1±0.7mV。IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束的粒径为119.0±7.6nm，Zeta电位为37.8±0.9mV。
(7)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束体外释放行为的考察
分别取浓度为1mg/mL IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束和壳聚糖硬脂酸载药胶束溶液1mL，放入分子截留量为7000的透析袋中，将透析袋放入装有20mL pH6.8磷酸缓冲液的离心管中，置于37℃的摇床中振荡。孵育4h后，在808nm波长下照射3min，照射频率为1W/cm2。于不同时间点取样，取样后弃去全部释放介质，加入新鲜介质20mL，连续取样2天。未经激光照射组作为对照组。荧光分光光度法测定样品中的药物浓度，其中Ex＝505nm，Em＝565nm，狭缝＝5nm，电压为700v。释放曲线见图6，结果显示，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束和壳聚糖硬脂酸载药胶束在前4小时未经激光照射具有相似的释放行为，而IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束在4小时激光照射后，药物释放加快，并持续至48小时，累计释放量为92.65％。壳聚糖硬脂酸载药胶束经激光照射前后释放均较缓慢，并持续至48小时，累计释放量为59.38％。
(8)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束在线粒体内药物释放情况
取生长状态良好的MCF-7细胞，以5×104/mL密度接种于覆有玻片的24孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养至贴壁，待融合度达到75％，加入壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束或IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束溶液。分别孵育4小时，吸弃培养基，换至新鲜的培养基，在808nm波长下照射3min，照射频率为1W/cm2。未经激光照射组作为对照组。继续孵育4、8小时后，加入100nM线粒体绿色探针孵育30min，PBS冲洗三遍。盖玻片以4％多聚甲醛避光固定，20min后取出，甘油包埋于载玻片上，封片。激光共聚焦扫描显微镜观察壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束及IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束在MCF-7细胞线粒体内阿霉素的释放情况，用ImageJ软件分析平均荧光强度及共定位系数，结果见图7，图8。
图7所示，经ImageJ软件分析计算得，与壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束相比，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束在MCF-7细胞内释放的阿霉素较多。图8所示，经ImageJ软件分析计算得，与壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束相比，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束在MCF-7细胞内释放的阿霉素，更多的分布在线粒体。结果说明IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束经激光照射后，实现了线粒体内药物敏感释放。
(9)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的抗肿瘤药效评价
本发明以细胞存活率试验，采用四唑盐比色法测定IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束的抗肿瘤药效。以MCF-7细胞为模型，在96孔细胞培养板中，每孔加入200μL含4×103个MCF-7细胞的培养液，置37℃、5％CO2孵箱培养24小时，待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸溶液、游离药物溶液、壳聚糖硬脂酸载药胶束、IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔；孵育4小时后，在808nm波长下照射3min，照射频率为1W/cm2。继续孵育45小时后，每孔加入5mg/mL噻唑兰溶液20μL，继续孵育4小时后弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜200μL，用酶联检测仪测定吸光度，按下式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝实验组吸光度/对照组吸光度×100％
IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸溶液、游离药物、壳聚糖硬脂酸载药胶束、IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束对MCF-7细胞的细胞存活率见图9。经计算，当阿霉素浓度为3μg/mL时，游离药物、壳聚糖硬脂酸载药胶束、IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束对MCF-7细胞的细胞存活率分别为61.1％，59.2％，51.3％。经激光照射后，IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束对MCF-7细胞的抑制效果明显增强，细胞存活率为18.3％。研究结果表明IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸载药胶束经激光照射后对MCF-7细胞的抑制效果最显著，具有较好的抗肿瘤效果。

Claims (6)

1.一种IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物，其特征在于，其中壳聚糖的分子量为5～20kDa，脂肪酸的碳链长度为十八碳，壳聚糖的脱乙酰度为95％，脂肪酸取代壳聚糖的氨基比例为17.9～19.9％，IR-780碘化物嫁接壳聚糖氨基的比例为1.1～3.1％，其具有代表性的化学结构通式为：
其中，n为壳聚糖链上未被脂肪酸和IR-780碘化物化学嫁接的氨基葡萄糖和乙酰化氨基葡萄糖单元数。
2.一种IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的制备方法，通过以下步骤实现：
(1)根据发明专利ZL200610051601.0提供的方法合成壳聚糖硬脂酸嫁接物：
取分子量为5～20kDa的壳聚糖，加蒸馏水超声溶解，制备20mg/mL溶液。另按硬脂酸与壳聚糖的摩尔比为25:1取硬脂酸，按碳二亚胺与硬脂酸的摩尔比为6：1取碳二亚胺，混合，按乙醇与蒸馏水的体积比为1：2加入乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌50min。然后缓慢加入至60℃下预热的壳聚糖水溶液中，60℃下搅拌反应12小时，冷却至室温，将终反应液置于分子截留量为7000Da的透析袋中，蒸馏水透析72小时，透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳聚糖硬脂酸嫁接物；
其特征在于，
(2)IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的合成
取IR-780碘化物，溶于少量无水二甲亚砜中，超声使其溶解，制备10mg/mL溶液，另按三乙胺：IR-780碘化物的摩尔比为1：1～3：1取三乙胺，加入上述溶液中，60℃条件下搅拌1～12小时，得反应液1，按壳聚糖硬脂酸上游离氨基：IR-780碘化物的摩尔比为5：1～20：1取壳聚糖硬脂酸，溶于去离子水中，加入到反应液1中，60℃条件下搅拌1～24小时，将终反应液置于截留分子量为7000的透析袋中，纯水透析48小时后，8000转离心10min，收集上清液，冷冻干燥，得IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸固体粉末；合成路线：
3.一种IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束的制备方法，其特征在于，该嫁接物包封的药物为阿霉素，通过以下步骤实现：
称取IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物，溶于去离子水中，探头超声30次，功率为400w，工作2s停3s，制备得嫁接物胶束溶液，取2mg/mL的IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物胶束溶液，按阿霉素：IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物的质量比为5％～15％，加入含2mg/mL碱基阿霉素的二甲亚砜溶液，在室温下避光搅拌0.5～2小时，转移到截留分子量为3500Da的透析袋中，纯水透析24小时，收集透析好的产物于8000转下低温离心10min，除去未被嫁接物胶束包封的阿霉素，收集上清液，得到目的物IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束中，阿霉素的重量百分含量为：3.8～10.9％。
5.根据权利要求3所述方法制备的IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束在制备线粒体靶向抗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求3所述方法制备的IR-780碘化物-壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束在制备线粒体内光热响应释放抗肿瘤药物中的应用。
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