CN101564539A - 壳寡糖脂肪酸嫁接物键合阿霉素药物及制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供壳寡糖脂肪酸嫁接物键合阿霉素前体药物，将盐酸阿霉素溶于二甲基亚砜，加三乙胺搅拌，产物溶于吡啶；另将顺乌头酸酐溶于二氧己烷，滴加到阿霉素溶液中，搅拌，萃取，离心，沉淀物分散于水中，冷冻干燥，得阿霉素－顺乌头酸中间体；将壳寡糖脂肪酸嫁接物溶于水，另取霉素－顺乌头酸中间体加入二甲基亚砜溶液，滴加到嫁接物水溶液中，搅拌，透析，冷冻干燥即得，其中壳寡糖分子量1～200kDa，脱乙酰度为70％－100％，脂肪酸的碳链长度C12－C22，氨基取代度1％～50％。阿霉素与壳寡糖脂肪酸嫁接物化学键合后，具有显著的抗肿瘤治疗活性，并可逆转肿瘤细胞的耐药性，可在逆制备抗肿瘤和逆转肿瘤细胞耐药性药物中应用。
Description
技术领域
本发明属高分子前体药物的合成领域，涉及壳寡糖-脂肪酸酸嫁接物与抗肿瘤药物阿霉素的化学键合，以及所合成的壳寡糖-脂肪酸嫁接物键合阿霉素药物在制备抗肿瘤和逆转肿瘤细胞耐药性药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是一种严重威胁人类生命的重大疾病。阿霉素是临床常用的蒽环类抗肿瘤药物，能嵌入DNA中，阻止RNA转录过程，抑制RNA的合成，也能阻止DNA的复制。阿霉素药抗瘤谱广，疗效高，主要用于恶性淋巴肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、小细胞肺癌、胃癌、肝癌及膀胱癌等。然而小分子药物易于被身体所吸收，体内分布广泛，缺乏特异性；因此现有的盐酸阿霉素注射液，在杀伤肿瘤细胞的同时，也产生明显的全身不良反应，如：心肌退行性病变、心肌间质水肿、骨髓抑制等，临床应用受到限制。
药物的体内吸收随着药物的分子量的增高而降低，高分子前体药物可改变低分子药物体内分布的非特异性，同时通过化学键合键的缓慢水解，释放出药物，从而达到高效低毒的靶向治疗的目的。
有报道指出，化疗过程中，肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐受性，是肿瘤化疗失败的重要原因，也是肿瘤化疗急需解决的难题。有学者认为90％以上恶性肿瘤患者死亡在不同程度上与耐药因素有关。肿瘤产生耐药性的原因十分复杂，不同药物其耐药机制不同，同一种药物存在着多种耐药机制。研究表明，聚合物载体可在一定程度上逆转肿瘤的多药耐药性。聚合物载体可有效减少耐药细胞的ATP量，却不会引起敏感细胞的ATP量的变化。耐药细胞中ATP量的减少，直接减少了被耐药细胞泵出的肿瘤药物量，表现为对肿瘤耐药性的逆转。
合成高分子药物按其结构可分成下面三大类：1.本身带有药理活性的合成高分子，这种药物只有在聚合物形式才有活性，而构成这种聚合物的单体及低聚物却无活性。2.是把小分子药物制成聚合物的形式，得到的高分子药物与其母体小分子药物的活性相同或相似。这一类药物又可进一步分成下面二种：(1)高分子载体药物，即把分子药物通过其价键连接到高分子载体之上，作为侧基的一部分(2)聚合的药物把小分子药物(或稍加修改)作为单体或共单体，与另一种小分子一起缩聚成高分子，母体小分子药物成为高分子主链的一部分
高分子载体药物包括：1.高分子作为载体对药物进行物理包裹。2小分子药物与高分子载体的连接，后者可以先把小分子药物连接到单体之上然后聚合，也可以直接往高分子载体上连接。
由两亲嵌段共聚物分子在水性介质中自聚集形成的聚合物胶团(polymermicelles，PM)，是传递药物的新型纳米给药载体。因其具有一些特有的药物载体性质，如粒径小，在体内、外具有良好的稳定性和生物相容性，药物的控制释放以及生物膜通透性等特性，被认为是一种具有广阔前景的新型靶向给药系统。聚合物胶团通过“增强渗透与保留作用”(enhanced permeability and retentioneffect，EPR)，被动靶向肿瘤部位。
壳聚糖(Chitosan，CS)是一类由氨基葡萄糖组成的阳离子聚合物，能够通过碱或酶使甲壳素脱乙酰基而得到。这种天然的多糖是一种具有生物相容性、生物可降解性、低毒的聚阳离子天然高分子材料。壳聚糖的pKa值约为6.5，大分子量壳聚糖在生理条件下(7.2～7.4)不溶解；且消化道内也没有直接作用于壳聚糖分子结构中β糖苷降解的壳聚糖酶，导致作为药物载体的大分子量的壳聚糖难以被人体消化道吸收。壳聚糖经酶降解后，可得到低分子量壳聚糖，即壳寡糖(chitosan oligosaccharide，CSO)。研究发现，壳寡糖在水性介质中具有良好的溶解性能。但壳寡糖缺乏亲脂性，不易被细胞摄取即较难透过细胞膜。壳寡糖经脂肪酸修饰后，所得壳寡糖脂肪酸嫁接物在水性介质中可通过自组装形成嫁接物胶束，该嫁接物具有快速的肿瘤细胞摄取功能，并通过嫁接物的脂肪酸的接枝率(氨基取代度)的调控，分别实现细胞浆滞留和细胞核转运的特征，该嫁接物胶束物理包裹抗肿瘤药物后，可显著提高原有药物的抗肿瘤治疗活性和逆转肿瘤细胞耐药性的功能。
发明内容
本发明的一个目的是提供壳寡糖脂肪酸嫁接物键合阿霉素前体药物，其具有代表性的结构通式为：
其中R为脂肪酸；x为壳寡糖中未被脂肪酸和阿霉素化学实施的氨基葡萄糖单元和乙酰化氨基葡萄糖单元数；n为脂肪酸的化学修饰比例；y与z之和与n的积表示阿霉素的化学修饰比例，其中y与z分别表示阿霉素-顺乌头酸中间体中两个羧基的反应比例，阿霉素-顺乌头酸中间体，含有两个羧基，壳寡糖上的氨基可与其中任何一个羧基反应。
本发明所使用的壳寡糖脂肪酸嫁接物已为国家发明专利“荧光标记疏水改性壳聚糖聚合物及制备方法和应用”(专利号：ZL2005100507981)；和“表面修饰疏水改性壳寡糖聚合物给药胶团及其制备方法”(专利号：ZL200610051601.0)所涵盖。壳寡糖脂肪酸嫁接物中壳寡糖的分子量1～200kDa；脂肪酸的碳链长度为：C12-C22；壳寡糖的脱乙酰度为70％-100％；氨基取代度为1％～50％。
本发明的第二个目的是提供壳寡糖脂肪酸嫁接物键合阿霉素前体药物的合成，通过以下方案实现：
(1)阿霉素碱制备：称取盐酸阿霉素200mg，溶于20ml二甲基亚砜中，加入一定量三乙胺(盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1∶2)，搅拌过夜，将反应液置透析袋中，蒸馏水透析24小时，冷冻干燥，得到阿霉素碱；
(2)阿霉素-顺乌头酸中间体制备：称取上述阿霉素碱50mg，溶于2ml吡啶中，另称取一定量的顺乌头酸酐(阿霉素与顺乌头酸酐的摩尔比为1∶5)溶于5ml二氧己烷中，缓慢滴加到阿霉素溶液中，低温下搅拌过夜，用25ml氯仿，25ml NaHCO3(5％)萃取，取水层，重复两次，用盐酸调节pH至有沉淀析出(pH约为3)，继续搅拌30min，低温离心分离(10000rpm，10min)，弃去上清液。加入少量蒸馏水，离心，弃去上清液。得到的沉淀产物分散于水中，冷冻干燥，得到阿霉素-顺乌头酸中间体；
(3)目的物制备：称取壳寡糖脂肪酸嫁接物100mg，溶于200ml水中，探头超声30次(400w，工作2s，间歇3s)，另称取5～50mg阿霉素-顺乌头酸中间体，加入二甲基亚砜溶液，使中间体浓度为1mg/ml。中间体溶液缓慢滴加到嫁接物水溶液中，加入过量碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺(中间体与碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺摩尔比为1∶10∶10)，室温下搅拌过夜。将反应液置透析袋中，二甲基亚砜水混合溶媒透析2天，蒸馏水继续透析1天，冷冻干燥，得到寡糖脂肪酸嫁接物键合阿霉素前体药物。
本发明的第三个目的是提供壳寡糖脂肪酸嫁接物键合阿霉素前体药物在制备抗肿瘤和逆转肿瘤细胞耐药性药物中的应用。结果表明，阿霉素与壳寡糖脂肪酸嫁接物化学键合后，仍具有显著的抗肿瘤治疗活性，并可逆转肿瘤细胞的耐药性，逆转倍数为47.89。
本发明的有益之处是：在前期的研究工作基础上，利用壳寡糖脂肪酸嫁接物上残留的氨基和抗肿瘤药物阿霉素上的氨基，通过顺乌头酸酐的化学交联，合成壳寡糖脂肪酸嫁接物化学键合阿霉素前体药物，有望解决抗肿瘤化疗药物在体内的靶向分布，降低化疗药物的毒性。本发明已在细胞水平证明壳寡糖脂肪酸嫁接物化学键合阿霉素仍可维持药物良好的抗肿瘤疗效，并通过壳寡糖脂肪酸嫁接物对阿霉素的细胞内转运实现肿瘤细胞耐药性的逆。
附图说明
图1为阿霉素-顺乌头酸中间体、壳寡糖硬脂酸嫁接物和壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物的核磁共振图谱。
图2为壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物在不同pH释放介质中的释放曲线(n＝3)。
具体实施方式
本发明通过实施例和附图作进一步的说明。
实施例1
(1)低分子量壳聚糖(壳寡糖)的制备
取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为95％)50g，加至1500mL1.2％(v/v)的盐酸水溶液中，55℃条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶涨后，缓慢加入2％的壳聚糖酶(w/w)溶液，在55℃温度条件下进行壳聚糖酶解反应。以凝胶渗透色谱法控制壳聚糖的降解程度。待反应结束后，在80℃下搅拌0.5h，加入0.3％(w/v)活性炭。将反应液稀释后，用布氏漏斗过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜处理，喷雾干燥得壳寡糖。经测定，所得壳寡糖的重均分子量为18.1kDa。
(2)壳寡糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述壳寡糖800mg，加30ml蒸馏水超声溶解。另分别称取253mg的硬脂酸和1.0g的碳二亚胺SA 204.2mg(硬脂酸与碳二亚胺的摩尔比为1∶10)，混合，加入20ml乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌40min，然后缓慢注射到壳寡糖水溶液中(壳寡糖与硬脂酸的摩尔比为1∶20)，80℃下搅拌反应4h。冷却至室温。将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析3天。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳寡糖硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法测定壳寡糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同重量的壳寡糖(1～10mg)分别溶于2ml的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2ml和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2h，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，344nm处测定吸光度，制备标准曲线。取上述壳寡糖-硬脂酸4mg溶于2mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算壳寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度为6.47％。
(3)壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物的合成
称取盐酸阿霉素200mg，溶于20ml二甲基亚砜中，加入一定量三乙胺(盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1∶2)，搅拌过夜，将反应液置透析袋中，蒸馏水透析24小时，冷冻干燥，得到阿霉素。
称取上述阿霉素50mg，溶于2ml吡啶中，另称取一定量的顺乌头酸酐(阿霉素与顺乌头酸酐的摩尔比为1∶5)溶于5ml二氧己烷中，缓慢滴加到阿霉素溶液中，低温下搅拌过夜，用25ml氯仿，25ml NaHCO3(5％)萃取，取水层，重复两次，用盐酸调节pH至有沉淀析出(pH约为3)，继续搅拌30min，低温离心分离(10000rpm，10min)，弃去上清液。加入少量蒸馏水，离心，弃去上清液。得到的沉淀产物分散于水中，冷冻干燥，得到阿霉素-顺乌头酸中间体。
称取壳寡糖硬脂酸嫁接物100mg，溶于200ml水中，探头超声30次(400w，工作2s，间歇3s)，另称取20mg阿霉素-顺乌头酸中间体，加入二甲基亚砜溶液，使中间体浓度为1mg/ml。中间体溶液缓慢滴加到嫁接物水溶液中，加入过量碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺(中间体与碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺摩尔比为1∶10∶10)，室温下搅拌过夜。将反应液置透析袋中，二甲基亚砜水混合溶媒透析2天，蒸馏水继续透析1天，冷冻干燥，得到壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物。
利用紫外分光光度法测定阿霉素-壳寡糖-硬脂酸嫁接物中阿霉素的含量，阿霉素-顺乌头酸中间体溶于二甲基亚砜，蒸馏水稀释配成不同浓度的溶液，制备标准曲线。一定量阿霉素-壳寡糖-硬脂酸嫁接物溶于蒸馏水中，测定吸光度，通过标准曲线计算载体中阿霉素含量(重量百分比)为10.0％。
(4)壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物的理化性质
核磁共振光谱法测定壳寡糖硬脂酸嫁接物、阿霉素-顺乌头酸中间体和壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物。称取壳寡糖-硬脂酸嫁接物和阿霉素-壳寡糖-硬脂酸嫁接物各30mg，分别用0.5ml D2O溶解，另取阿霉素-顺乌头酸中间体5mg，溶于0.5ml DMSO-d6，用核磁共振1H-NMR测定，结果参见图1，图中A为阿霉素-顺乌头酸中间体，B为壳寡糖硬脂酸嫁接物，C为壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物。
采用芘荧光法测定壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物的临界胶束浓度。取芘12mg，精密称定，置100ml容量瓶，加丙酮溶解并定容。移取上述芘溶液1ml，置100ml容量瓶中稀释并定容。移取稀释后的芘溶液0.5ml分别置10ml玻璃试管中，50℃挥去丙酮。分别加入不同浓度的壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物溶液5ml，控制芘终浓度为7×10-7mol/l，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱(EX＝337nm，EM：I1＝374，I3＝384，狭缝＝2.5nm和10nm)，测定荧光强度，并计算临界胶束浓度，为73μg/ml。
另取壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物10mg，精密称定，溶解于10ml蒸馏水，探头超声30次(400w，工作2s，间歇3s)，得到1mg/ml的聚合物溶液。微粒粒度与表面电位分析仪测定壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物胶团的粒径为80.2nm，Zeta电位为43.1mV。
(5)壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物体外释放行为的考察
分别取浓度为2mg/ml壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物1ml，放入透析袋(MWCO＝7000)中，将透析袋放入10ml不同pH的磷酸缓冲液(分别为pH 5.0和pH 7.4)中。在37℃的摇床中振荡。于不同时间点取样，取样后弃去全部释放介质，加入新鲜介质10ml，连续取样7天。荧光分光光度法测定样品中的药物浓度(EX＝505nm，EM＝565nm，狭缝＝5nm)。释放曲线见图2，图中◇：pH 5.0释放介质，□：pH 7.4释放介质。
(6)壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物的抗肿瘤药效及逆转耐药肿瘤细胞的耐药性
本发明以肿瘤细胞抑制率(IC50值)，评价壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物的抗肿瘤药效，以及对耐药肿瘤细胞耐药性的逆转效率。细胞存活率试验采用四唑盐比色法(MTT Assay)测定。以乳腺癌细胞MCF-7细胞及其耐药细胞MCF-7/Adr细胞为模型，在96孔细胞培养板中，每孔加入200μl含1×104个MCF-7细胞或MCF-7/Adr细胞的培养液，置37℃、5％CO2孵箱培养24小时，待细胞完全贴壁后，细胞孔中分别加入不同浓度的阿霉素溶液、壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物溶液，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设复孔；孵育72小时后，每孔加入5mg/ml噻唑兰(MTT)溶液20μl，继续孵育4小时后弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜200μl，用酶联检测仪测定吸光度，按下式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝实验组吸光度/对照组吸光度×100％
经计算，阿霉素和壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物对MCF-7细胞和MCF-7/Adr细胞的IC50值结果，参见表1。
表1阿霉素溶液和壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物，对MCF-7敏感和耐药细胞的细胞毒性
研究结果表明，壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物仍具有显著的抗肿瘤活性，并可逆转MCF-7耐药细胞的耐药性。
实施例2
(1)低分子量壳聚糖(壳寡糖)的制备方法
取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为95％)50g，加至1500mL1.2％(v/v)的盐酸水溶液中，55℃条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶涨后，缓慢加入2％的壳聚糖酶(w/w)溶液，在55℃温度条件下进行壳聚糖酶解反应。以凝胶渗透色谱法控制壳聚糖的降解程度。待反应结束后，在80℃下搅拌0.5h，加入0.3％(w/v)活性炭。将反应液稀释后，用布氏漏斗过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜处理，喷雾干燥得壳寡糖。经测定，所得壳寡糖的重均分子量为18.1kDa。
(2)壳寡糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述壳寡糖800mg，加30ml蒸馏水超声溶解。另分别称取253mg的硬脂酸和1.0g的碳二亚胺SA 204.2mg(硬脂酸与碳二亚胺的摩尔比为1∶10)，混合，加入20ml乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌40min，然后缓慢注射到壳寡糖水溶液中(壳寡糖与硬脂酸的摩尔比为1∶20)，80℃下搅拌反应4h。冷却至室温。将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析3天。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳寡糖硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法测定壳寡糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同重量的壳寡糖(1～10mg)分别溶于2ml的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2ml和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2h，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，344nm处测定吸光度，制备标准曲线。取上述壳寡糖-硬脂酸4mg溶于2mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算壳寡糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度为6.47％。
(3)壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物的合成
称取盐酸阿霉素200mg，溶于20ml二甲基亚砜中，加入一定量三乙胺(盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1∶2)，搅拌过夜，将反应液置透析袋中，蒸馏水透析24小时，冷冻干燥，得到阿霉素。
称取上述阿霉素50mg，溶于2ml吡啶中，另称取一定量的顺乌头酸酐(阿霉素与顺乌头酸酐的摩尔比为1∶5)溶于5ml二氧己烷中，缓慢滴加到阿霉素溶液中，低温下搅拌过夜，用25ml氯仿，25ml NaHCO3(5％)萃取，取水层，重复两次，用盐酸调节pH至有沉淀析出(pH约为3)，继续搅拌30min，低温离心分离(10000rpm，10min)，弃去上清液。加入少量蒸馏水，离心，弃去上清液。得到的沉淀产物分散于水中，冷冻干燥，得到阿霉素-顺乌头酸中间体。
称取壳寡糖硬脂酸嫁接物100mg，溶于200ml水中，探头超声30次(400w，工作2s，间歇3s)，另称取5mg阿霉素-顺乌头酸中间体，加入二甲基亚砜溶液，使中间体浓度为1mg/ml。中间体溶液缓慢滴加到嫁接物水溶液中，加入过量碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺(中间体与碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺摩尔比为1∶10∶10)，室温下搅拌过夜。将反应液置透析袋中，二甲基亚砜水混合溶媒透析2天，蒸馏水继续透析1天，冷冻干燥，得到壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物。
利用紫外分光光度法测定壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物中阿霉素的含量，阿霉素-顺乌头酸中间体溶于二甲基亚砜，蒸馏水稀释配成不同浓度的溶液，制备标准曲线。一定量壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物溶于蒸馏水中，测定吸光度，通过标准曲线计算载体中阿霉素含量(重量百分比)为3.0％。
(4)壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物的理化性质
采用芘荧光法测定壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物的临界胶束浓度。取芘12mg，精密称定，置100ml容量瓶，加丙酮溶解并定容。移取上述芘溶液1ml，置100ml容量瓶中稀释并定容。移取稀释后的芘溶液0.5ml分别置10ml玻璃试管中，50℃挥去丙酮。分别加入不同浓度的壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物溶液5ml，控制芘终浓度为7×10-7mol/l，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱(EX＝337nm，EM：I1＝374，I3＝384，狭缝＝2.5nm和10nm)，测定荧光强度，并计算临界胶束浓度，为94μg/ml。
另取壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物10mg，精密称定，溶解于10ml蒸馏水，探头超声30次(400w，工作2s，间歇3s)，得到1mg/ml的聚合物溶液。微粒粒度与表面电位分析仪测定壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物胶团的粒径为62.3nm，Zeta电位为39.6mV。
实施例3
(1)低分子量壳聚糖(壳寡糖)的制备方法
取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为95％)50g，加至1500mL1.2％(v/v)的盐酸水溶液中，55℃条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶涨后，缓慢加入2％的壳聚糖酶(w/w)溶液，在55℃温度条件下进行壳聚糖酶解反应。以凝胶渗透色谱法控制壳聚糖的降解程度。待反应结束后，在80℃下搅拌0.5h，加入0.3％(w/v)活性炭。将反应液稀释后，用布氏漏斗过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜处理，喷雾干燥得壳寡糖。经测定，所得壳寡糖的重均分子量为18.1kDa。
(2)壳寡糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述壳寡糖800mg，加30ml蒸馏水超声溶解。另分别称取253mg的硬脂酸和1.0g的碳二亚胺SA 204.2mg(硬脂酸与碳二亚胺的摩尔比为1∶10)，混合，加入20ml乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌40min，然后缓慢注射到壳寡糖水溶液中(壳寡糖与硬脂酸的摩尔比为1∶20)，80℃下搅拌反应4h。冷却至室温。将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析3天。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳寡糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法测定壳寡糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同重量的壳寡糖(1～10mg)分别溶于2ml的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2ml和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2h，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，344nm处测定吸光度，制备标准曲线。取上述壳寡糖-硬脂酸4mg溶于2mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算壳寡糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为6.47％。
(3)壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物的合成
称取盐酸阿霉素200mg，溶于20ml二甲基亚砜中，加入一定量三乙胺(盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1∶2)，搅拌过夜，将反应液置透析袋中，蒸馏水透析24小时，冷冻干燥，得到阿霉素。
称取上述阿霉素50mg，溶于2ml吡啶中，另称取一定量的顺乌头酸酐(阿霉素与顺乌头酸酐的摩尔比为1∶5)溶于5ml二氧己烷中，缓慢滴加到阿霉素溶液中，低温下搅拌过夜，用25ml氯仿，25ml NaHCO3(5％)萃取，取水层，重复两次，用盐酸调节pH至有沉淀析出(pH约为3)，继续搅拌30min，低温离心分离(10000rpm，10min)，弃去上清液。加入少量蒸馏水，离心，弃去上清液。得到的沉淀产物分散于水中，冷冻干燥，得到阿霉素-顺乌头酸中间体。
称取壳寡糖硬脂酸嫁接物100mg，溶于200ml水中，探头超声30次(400w，工作2s，间歇3s)，另称取1mg阿霉素-顺乌头酸中间体，加入二甲基亚砜溶液，使中间体浓度为1mg/ml。中间体溶液缓慢滴加到嫁接物水溶液中，加入过量碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺(中间体与碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺摩尔比为1∶10∶10)，室温下搅拌过夜。将反应液置透析袋中，二甲基亚砜水混合溶媒透析2天，蒸馏水继续透析1天，冷冻干燥，得到壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物。
利用紫外分光光度法测定壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物中阿霉素的含量，阿霉素-顺乌头酸中间体溶于二甲基亚砜，蒸馏水稀释配成不同浓度的溶液，制备标准曲线。一定量壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物溶于蒸馏水中，测定吸光度，通过标准曲线计算载体中阿霉素含量(重量百分比)为0.62％。
(4)壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物的理化性质
采用芘荧光法测定的壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物de临界胶束浓度。取芘12mg，精密称定，置100ml容量瓶，加丙酮溶解并定容。移取上述芘溶液1ml，置100ml容量瓶中稀释并定容。移取稀释后的芘溶液0.5ml分别置10ml玻璃试管中，50℃挥去丙酮。分别加入不同浓度的壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物溶液5ml，控制芘终浓度为7×10-7mol/l，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱(EX＝337nm，EM：I1＝374，I3＝384，狭缝＝2.5nm和10nm)，测定荧光强度，并计算临界胶束浓度，为100μg/ml。
另取壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物10mg，精密称定，溶解于10ml蒸馏水，探头超声30次(400w，工作2s，间歇3s)，得到1mg/ml的聚合物溶液。微粒粒度与表面电位分析仪测定壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物胶团的粒径为24.8nm，及Zeta电位为36.8mV。
实施例4
(1)低分子量壳聚糖(壳寡糖)的制备方法
取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为95％)50g，加至1500mL1.2％(v/v)的盐酸水溶液中，55℃条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶涨后，缓慢加入2％的壳聚糖酶(w/w)溶液，在55℃温度条件下进行壳聚糖酶解反应。以凝胶渗透色谱法控制壳聚糖的降解程度。待反应结束后，在80℃下搅拌0.5h，加入0.3％(w/v)活性炭。将反应液稀释后，用布氏漏斗过滤，滤液用0.45μm微孔滤膜处理，喷雾干燥得壳寡糖。经测定，所得壳寡糖的重均分子量为18.1kDa。
(2)壳寡糖硬脂酸嫁接物的合成
取上述壳寡糖800mg，加30ml蒸馏水超声溶解。另分别称取253mg的硬脂酸和1.0g的碳二亚胺SA 204.2mg(硬脂酸与碳二亚胺的摩尔比为1∶10)，混合，加入20ml乙醇，水浴超声溶解，于60℃下搅拌40min，然后缓慢注射到壳寡糖水溶液中(壳寡糖与硬脂酸的摩尔比为1∶20)，80℃下搅拌反应4h。冷却至室温。将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析3天。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得到壳寡糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法测定壳寡糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度。取不同重量的壳寡糖(1～10mg)分别溶于2ml的蒸馏水，加入4％碳酸氢钠2ml和0.1％三硝基苯磺酸2mL，37℃下孵育2h，加入2mol/L盐酸2mL，摇匀，344nm处测定吸光度，制备标准曲线。取上述壳寡糖-硬脂酸4mg溶于2mL蒸馏水中，同法操作，按标准曲线计算壳寡糖硬脂酸嫁接物的氨基取代度为6.47％。
(3)壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物的合成
称取盐酸阿霉素200mg，溶于20ml二甲基亚砜中，加入一定量三乙胺(盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1∶2)，搅拌过夜，将反应液置透析袋中，蒸馏水透析24小时，冷冻干燥，得到阿霉素。
称取上述阿霉素50mg，溶于2ml吡啶中，另称取一定量的顺乌头酸酐(阿霉素与顺乌头酸酐的摩尔比为1∶5)溶于5ml二氧己烷中，缓慢滴加到阿霉素溶液中，低温下搅拌过夜，用25ml氯仿，25ml NaHCO3(5％)萃取，取水层，重复两次，用盐酸调节pH至有沉淀析出(pH约为3)，继续搅拌30min，低温离心分离(10000rpm，10min)，弃去上清液。加入少量蒸馏水，离心，弃去上清液。得到的沉淀产物分散于水中，冷冻干燥，得到阿霉素-顺乌头酸中间体。
称取壳寡糖硬脂酸嫁接物100mg，溶于200ml水中，探头超声30次(400w，工作2s，间歇3s)，另称取50mg阿霉素-顺乌头酸中间体，加入二甲基亚砜溶液，使中间体浓度为1mg/ml。中间体溶液缓慢滴加到嫁接物水溶液中，加入过量碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺(中间体与碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺摩尔比为1∶10∶10)，室温下搅拌过夜。将反应液置透析袋中，二甲基亚砜水混合溶媒透析2天，蒸馏水继续透析1天，冷冻干燥，得到壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物。
利用紫外分光光度法测定壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物中阿霉素的含量，阿霉素-顺乌头酸中间体溶于二甲基亚砜，蒸馏水稀释配成不同浓度的溶液，制备标准曲线。一定量壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物溶于蒸馏水中，测定吸光度，通过标准曲线计算载体中阿霉素含量(重量百分比)为30％。
(4)壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物的理化性质
采用芘荧光法测定的壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物de临界胶束浓度。取芘12mg，精密称定，置100ml容量瓶，加丙酮溶解并定容。移取上述芘溶液1ml，置100ml容量瓶中稀释并定容。移取稀释后的芘溶液0.5ml分别置10ml玻璃试管中，50℃挥去丙酮。分别加入不同浓度的壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物溶液5ml，控制芘终浓度为7×10-7mol/l，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱(EX＝337nm，EM：I1＝374，I3＝384，狭缝＝2.5nm和10nm)，测定荧光强度，并计算临界胶束浓度，为25μg/ml。
另取壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物10mg，精密称定，溶解于10ml蒸馏水，探头超声30次(400w，工作2s，间歇3s)，得到1mg/ml的聚合物溶液。微粒粒度与表面电位分析仪测定壳寡糖硬脂酸嫁接物键合阿霉素前体药物胶团的粒径为120.5nm，及Zeta电位为31.2mV。
Claims (3)
1.一种壳寡糖脂肪酸嫁接物键合阿霉素前体药物，具有代表性的结构通式为：
其中R为脂肪酸；x为壳寡糖中未被脂肪酸和阿霉素化学实施的氨基葡萄糖单元和乙酰化氨基葡萄糖单元数；n为脂肪酸的化学修饰比例；y与z之和与n的积表示阿霉素的化学修饰比例，其中y与z分别表示阿霉素-顺乌头酸中间体中两个羧基的反应比例，阿霉素-顺乌头酸中间体，含有两个羧基，壳寡糖上的氨基可与其中任何一个羧基反应；所述壳寡糖脂肪酸嫁接物中壳寡糖的分子量小于1～200kDa；脂肪酸的碳链长度为：C12-C22；壳寡糖的脱乙酰度为70％-100％；氨基取代度为1％～50％。
2.根据权利要求1所述的一种壳寡糖脂肪酸嫁接物键合阿霉素前体药物的制备方法，其特征在于通过以下步骤实现：
(1)阿霉素碱制备：称取盐酸阿霉素，溶于二甲基亚砜中，加入三乙胺，盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1∶2，搅拌过夜，将反应液置透析袋中，蒸馏水透析，冷冻干燥，得到阿霉素碱；
(2)阿霉素-顺乌头酸中间体制备：称取上述阿霉素碱50mg，溶于吡啶中，另称取顺乌头酸酐，阿霉素与顺乌头酸酐的摩尔比为1∶5，溶于二氧己烷中，缓慢滴加到阿霉素溶液中，低温下搅拌过夜，用氯仿和5％NaHCO3萃取，取水层，重复两次，用盐酸调节pH至有沉淀析出，继续搅拌，低温离心分离，弃去上清液，加入少量蒸馏水，离心，弃去上清液，得到的沉淀产物分散于水中，冷冻干燥，得到阿霉素-顺乌头酸中间体；
(3)目的物制备：称取壳寡糖脂肪酸嫁接物，溶于水中，探头超声30次，另称取阿霉素-顺乌头酸中间体，加入二甲基亚砜溶液，使中间体浓度为1mg/ml，中间体溶液缓慢滴加到嫁接物水溶液中，加入过量碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，中间体与碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺摩尔比为1∶10∶10，室温下搅拌过夜，将反应液置透析袋中，二甲基亚砜水混合溶媒透析2天，蒸馏水继续透析，冷冻干燥，得到寡糖脂肪酸嫁接物键合阿霉素前体药物。
3.根据权利要求1所述的一种壳寡糖脂肪酸嫁接物键合阿霉素前体药物在制备抗肿瘤和逆转肿瘤细胞耐药性药物中的应用。
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