CN105106969A - 一种新型糖纳米胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型糖纳米胶束及其制备方法和应用，尤其是一种具有肿瘤细胞靶向性的糖纳米胶束，属于药物和药剂学领域。本发明利用来源丰富的环糊精作为自组装的构建单元，通过设计和改性环糊精分子制备两亲性分子，在环糊精初级羟基面通过甘露糖、半乳糖等具有靶向性以及亲水性好的单糖及寡糖分子修饰，在其次级羟基面用脂肪链修饰作为疏水部分。利用两亲性分子的亲水/疏水作用原理则可在一定程度上实现对其组装的调控，制备得到糖纳米材料。利用这种纳米材料制备的纳米胶束不仅低毒性，而且能靶向肿瘤细胞输送抗癌药物，可作为各类抗癌药物的输送载体。

Description

一种新型糖纳米胶束及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种新型糖纳米胶束及其制备方法和应用，尤其是一种具有肿瘤组织靶向性的糖纳米胶束，属于药物和药剂学领域。

背景技术

癌症(恶性肿瘤)是当今严重威胁人类健康的主要疾病之一。但是由于目前临床用于肿瘤治疗的大多数药物显示出低的溶解性、有限的稳定性、快速的血液清除和缺乏对肿瘤部位的靶向性，进入体内后会产生非特异性分布，即在肿瘤组织与正常组织都有分布，因此在杀伤肿瘤细胞的同时也损伤了人体正常组织细胞，从而导致疗效低、毒副作用强等缺点，且长期使用容易产生耐药性。

为了提高化疗效率，巨大的研究工作一直致力于开发具有肿瘤靶向性的纳米药物载体用于可控的抗癌药物输送。目前，许多纳米药物载体包括脂质体、聚合物纳米粒子、纳米胶束、树枝状大分子等已经被开发利用增强的渗透和保留(EPR)效应用于抗癌药物输送。EPR效应往往不能够有效消除细胞毒性药物的毒副作用以及在癌细胞里选择性的发挥抗癌作用。因此，增强化疗药物的抗肿瘤效果并减少其毒副作用成为目前临床亟待解决的问题，开发更好的靶向药物传输系统对于肿瘤的治疗已迫在眉睫。

目前应用广泛的靶向试剂主要包括抗体(单克隆抗体)以及多肽类(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD))。然而这些靶向试剂本身稳定性差，直接包覆或者修饰在纳米材料表面输送到体内容易被降解而无法发挥其靶向作用。近年来，糖化学的迅速发展使得糖类成为新型靶向试剂引入到纳米材料表面行使靶向功能，其良好的稳定性、水溶性以及生物相容性是其他靶向试剂无法比拟的。糖类是自然界最丰富的生物分子，也是生物体中一系列生命过程的基本元素。除了可以组成生命体的结构并为之提供能量，糖类还可以通过其与蛋白质、核酸、脂质和其他分子之间的相互作用来广泛介导生命体系中的识别过程，例如细胞通讯和迁移、肿瘤的产生和发展、免疫应答、受精、细胞凋亡和感染等。但是，单一的糖基与蛋白亲和力非常弱，受体蛋白对其的选择性也很低，远远达不到生理条件下识别作用对结合强度和特异性的要求。因此，多价糖基与蛋白受体的协同作用的效果远远高于单个糖基作用效果的加和，产生“多价效应”。糖类物质已经被广泛用于修饰磁性纳米材料、金纳米材料、量子点、聚合物等用于细菌检测、病原体检测以及生物医学成像等。然而，利用糖类物质的多价效应用于自组装胶束的靶向药物输送治疗癌症仍是一种挑战。

发明内容

本发明提出了通过自组装技术构建具有靶向功能的糖纳米药物载体的新方法，利用来源丰富的环糊精作为自组装的构建单元，通过在环糊精分子初级羟基面中引入靶向分子(如甘露糖、半乳糖等)，可实现组装体针对特定癌细胞或组织的靶向性，由于初级羟基面的七个羟基全部被靶向分子取代，靶向分子与环糊精分子的比例为7:1，因此为多价修饰；通过在环糊精分子次级羟基面中引入不同链段长度的脂肪链，可得到粒径大小可控的一系列糖纳米药物载体。

本发明首先提供了一种两亲性环糊精分子，是在环糊精分子的初级羟基面中引入单糖或寡糖类分子，在环糊精分子的次级羟基面中引入疏水脂肪链。

在本发明的一种实施方式中，所述两亲性环糊精分子的结构如式1所示：

式I中，

A为具有靶向功能的单糖或寡糖类分子，可以识别癌症细胞表面过度表达的受体；

B为如下连接键中的一种：酯键(—COO—)、酰胺键(—CONR—)、二硫键(—S—S—)、醚键(—O—)、碳氮键(—C—N(R)—)、1,4-三氮唑环

式I中包含脂肪链的结构，n表示脂肪链的碳链长度，n为1，2或4。

在本发明的一种实施方式中，所述单糖或寡糖类分子为甘露糖、半乳糖、乳糖、唾液酸及甘露聚糖等。

在本发明的一种实施方式中，所述单糖或寡糖类分子为甘露糖或半乳糖。

在本发明的一种实施方式中，所述疏水脂肪链为直链脂肪链。

在本发明的一种实施方式中，所述脂肪链为乙酸酐、丙酸酐或戊酸酐。

本发明还提供了一种制备所述两亲性环糊精分子的方法，首先将环糊精6号位全部羟基碘代、叠氮化，再与端基位用炔丙基修饰的单糖进行click环加成反应得到含有亲水端的环糊精，然后，将环糊精次级羟基面与酸酐进行酯化反应从而得到两亲性环糊精分子。

本发明还提供了应用上述的两亲性环糊精分子制备糖纳米胶束的方法，包括如下步骤:

1)所述的两亲性环糊精分子用DMSO溶解，搅拌5小时；

2)在双蒸水中透析48小时，每隔6小时换水一次，制得胶束溶液；

3)将胶束溶液经冷冻干燥机冻干，制得胶束。

所形成的纳米胶束的平均粒径为20-200nm。

本发明还提供了应用上述的两亲性环糊精分子制备载药糖纳米胶束的方法，包括如下步骤：

1)将两亲性环糊精分子和药物分别用DMSO溶解，将两种溶液混合搅拌5小时；

2)混合溶液在双蒸水中透析48小时，每隔6小时换水一次，制得载药胶束溶液；

3)将聚合物胶束溶液经过0.45μm的微膜过滤除去未负载的药物，经冷冻干燥机冻干，制得负载药物的胶束。

在本发明的一种实施方式中，所述抗癌药物为阿霉素。

本发明的另一个方面涉及所述的两亲性环糊精分子作为药物载体的用途。具体地，所述药物为抗癌药物、抗肿瘤药物，具体地，所述抗癌药物为阿霉素。

两亲性环糊精次级羟基面的脂肪链是为了提供疏水部分，与疏水性的抗癌药物，例如阿霉素，相互所用将其包裹在其输水内核。通过选择不同链段长度的脂肪链提供疏水部分，从而可以调节形成纳米胶束的大小，达到控制载药量和包封率的效果。两亲性环糊精初级羟基面的单糖或寡糖分子，具有好的生物相容性，并且这类分子具有很好的靶向性，能够携带抗癌药物阿霉素穿过细胞膜，甚至是核膜进入细胞核，可作为各类药物的输送载体。

本发明合成的两亲性环糊精胶束具有较低的细胞毒性，在实验的条件下，C₃-β-CD-Man₇胶束达到800μg/mL的浓度时和人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞以及人肾脏上皮细胞HEK293细胞共同孵育48小时，细胞存活率均高于91％。通过荧光共聚焦显微镜测试证明了表面键连甘露糖分子的载药胶束可以被细胞膜表面有过度表达的甘露糖受体的MDA-MB-231细胞内吞，而只有少量的载药胶束可以被细胞膜表面有低表达的甘露糖受体的HEK293细胞内吞，说明载药胶束对特定癌细胞或组织具有靶向性。

附图说明

图1：C₃-β-CD-Man₇胶束的粒径分布图。

图2：C₅-β-CD-Man₇胶束的粒径分布图。

图3：人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞与HEK293细胞在不同浓度DOX-C₃-β-CD-Man₇载药胶束存在条件下培养48小时后的相对存活率。

图4：(A)MDA-MB-231和(B)HKE293细胞的流式结果，(a)空白参照，(b)在含有甘露糖竞争条件下载药胶束被细胞内吞的实验结果，c)无甘露糖竞争条件下的载药胶束被细胞内吞的实验结果。

图5：MDA-MB-231细胞摄取载药纳米胶束的相对荧光强度。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

下面的实施例中所用缩写为：DMF，N,N’-二甲基甲酰胺；β-CD，β-环糊精；β-CD-I，六号位全碘代的环糊精；β-CD-N₃，六号位全叠氮化的环糊精；C₃-β-CD-N₃，2,3号位全丙酰化，6号位全叠氮化的环糊精；C₂-β-CD-N₃，2,3号位全乙酰化，6号位全叠氮化的环糊精；C₅-β-CD-N₃，2,3号位全戊酰化，6号位全叠氮化的环糊精；DMAP，4-二甲氨基吡啶；C₂-β-CD-Man₇，一端乙酰基修饰，另一端甘露糖修饰的环糊精；C₃-β-CD-Man₇，一端丙酰基修饰，另一端甘露糖修饰的环糊精；C₅-β-CD-Man₇，一端戊酰基修饰，另一端甘露糖修饰的环糊精；C₃-β-CD-Gal₇，一端丙酰基修饰，另一端半乳糖修饰的环糊精；C₃-β-CD-Lac₇，一端丙酰基修饰，另一端乳糖修饰的环糊精；C₃-β-CD-SA₇，一端丙酰基修饰，另一端唾液酸修饰的环糊精；C₃-β-CD-Mannan₇，一端丙酰基修饰，另一端甘露聚糖修饰的环糊精；DOX-C₃-β-CD-Man₇，载有阿霉素药物的C₃-β-CD-Man₇胶束；C₃-β-CD-Gal₇，载有阿霉素药物的C₃-β-CD-Gal₇胶束；DMSO，二甲亚砜；DAPI,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚；DMEM，高糖培养基；MTT，3-4,5-二甲基噻唑-2-2,5-二苯基四氮唑溴盐，噻唑蓝，一种染料。MDA-MB-231细胞，人乳腺癌细胞，细胞表面过度表达甘露糖受体；HEK293，人肾脏上皮细胞，细胞表面甘露糖受体及去唾液酸蛋白受体呈低表达状态；HepG2细胞，人肝癌细胞，细胞表面过度表达去唾液酸糖蛋白受体。

实施例1β-CD-I的制备

将40.1g三苯基膦溶于150mLDMF中，然后缓慢加入40.5g碘，15分钟添加完毕。然后加入干燥的β-CD，加热至70℃，在氮气环境下搅拌。反应18小时冷却至室温后，减压蒸馏除去100mLDMF，在冰浴上冷却后，再加入冷却的60mL3M的甲醇钠的甲醇溶液，在0℃条件下反应半小时。将反应液倒入800mL甲醇中，产生大量沉淀，静置10分钟后抽滤，获得的滤饼用索氏提取20小时，或直到溶剂不再变色为止。将索氏提取得到的产物真空干燥后，即得到β-CD-I。具体方法可参考文献(JournalofOrganicChemistry,1996,61,903–908)。

实施例2β-CD-N₃的制备

将1.5gβ-CD-I和0.5g叠氮化钠溶于25mLDMF中，反应液在60℃下反应20小时。反应结束后冷却至室温，减压蒸出溶剂DMF，加入200mL水，抽滤，滤饼用水洗得到β-CD-N₃。具体方法可参考文献(JournalofOrganicChemistry,1996,61,903–908)。

实施例3C₃-β-CD-N₃的制备

将1gβ-CD-N₃与3.92gDMAP置于反应瓶中，加入35mL吡啶，再将10mL丙酸酐加入到反应瓶中，加热至60℃，在氮气保护下搅拌24小时。反应结束后，萃取，旋蒸除去溶剂，经硅胶柱分离得到C₃-β-CD-N₃。

实施例4其它链段长度脂肪链C_n-β-CD-N₃的制备

分别用C₂、C₅等不同链段长度的酸酐如乙酸酐、戊酸酐代替实施例3中的C₃丙酸酐，执行相同的操作，分别制得相应脂肪链段长度的C_n-β-CD-N₃，即C₂-β-CD-N₃，C₅-β-CD-N₃等。

实施例5炔丙基-α-D-吡喃甘露糖的制备

将6.2g全乙酰甘露糖溶解于75mL无水二氯甲烷中，加入1.05mL炔丙醇，冷却到0℃搅拌5分钟，在15分钟内逐滴加入3mL三氟化硼乙醚。继续在0℃搅拌10分钟后,室温反应10小时。用饱和碳酸钾溶液终止反应，用二氯甲烷萃取有机相，用饱和食盐水洗涤有机相三次，有机相用无水硫酸镁干燥过滤，旋蒸除去溶剂，经硅胶柱分离得到炔丙基-α-D-吡喃甘露糖。具体方法可参考文献(BioconjugateChemistry,2012,23,1166-1173)。

实施例6其他炔丙基修饰的糖分子的制备

分别用半乳糖、乳糖、唾液酸以及甘露聚糖等不同糖分子代替实施例5中的甘露糖，执行相同的操作，分别制得相应炔丙基修饰的糖分子。

实施例7C₃-β-CD-Man₇的制备

将200mgC₃-β-CD-N₃与350mg炔丙基-α-D-吡喃甘露糖溶于5mLDMF中，然后再将98mg硫酸铜与242mg抗坏血酸钠溶于5mL水中后，再滴加入上面的反应液中，反应液在60℃下搅拌48小时。将反应液过滤，蒸干，经凝胶柱分离得到C₃-β-CD-Man₇。

实施例8其它单糖或寡糖修饰的的两亲性环糊精分子的制备

分别用实施例4中的C_n-β-CD-N₃替代实施例7的C₃-β-CD-N₃，再用实施例6中的炔丙基修饰的不同的糖分子如半乳糖、乳糖、唾液酸以及甘露聚糖等替代实施例7中的炔丙基-α-D-吡喃甘露糖，其它操作同实施例7，分别制得不同组合的两亲性环糊精分子，如C₃-β-CD-Gal₇，C₃-β-CD-Lac₇，C₃-β-CD-SA₇以及C₃-β-CD-Mannan₇等。

实施例9胶束的制备

将实施例7中的C₃-β-CD-Man₇用DMSO溶解，搅拌5小时。在双蒸水中透析48小时，每隔6小时换水一次，制得胶束溶液。之后将胶束溶液经冷冻干燥机冻干，制得胶束。

实施例10其他胶束的制备

分别用实施例8中的两亲性环糊精分子代替实施例9中的C₃-β-CD-Man₇，其它操作同实施例9。分别制备得到相应的胶束。

实施例11DOX-C₃-β-CD-Man₇载药胶束的制备

将实施例7中的C₃-β-CD-Man₇和阿霉素盐酸盐标准品分别用DMSO溶解，在阿霉素盐酸盐标准品DMSO溶液中加入三乙胺。将两种溶液混合搅拌5小时。混合溶液在双蒸水中透析48小时，每隔6小时换水一次，制得负载阿霉素的胶束溶液。之后将聚合物胶束溶液经过0.45μm的微膜过滤除去未负载的阿霉素，经冷冻干燥机冻干，制得负载阿霉素的胶束。得到的载药胶束的载药量为12.3±2.1％，包封率为59.1±3.2％

实施例12DOX-C₃-β-CD-Gal₇载药胶束的制备

将实施例8中的C₃-β-CD-Gal₇和阿霉素盐酸盐标准品分别用DMSO溶解，在阿霉素盐酸盐标准品DMSO溶液中加入三乙胺。将两种溶液混合搅拌5小时。混合溶液在双蒸水中透析48小时，每隔6小时换水一次，制得负载阿霉素的胶束溶液。之后将聚合物胶束溶液经过0.45μm的微膜过滤除去未负载的阿霉素，经冷冻干燥机冻干，制得负载阿霉素的胶束。得到的载药胶束的载药量为10.6±1.1％，包封率为55.4±4.5％

实施例13其它载药胶束的制备

分别用实施例8中的两亲性环糊精分子代替实施例11中的C₃-β-CD-Man₇，其它操作同实施例11。分别制备得到相应的载药胶束。

实施例14胶束粒径的表征

将实施例7、8中的制得的C₃-β-CD-Man₇，C₅-β-CD-Man₇通过动态光散射技术测得其粒径分布，比较在不同疏水链段的条件下制备得到的不同粒径的自组装胶束。

通过动态光散射粒径检测，两亲性环糊精分子C₃-β-CD-Man₇形成的胶束粒径在112nm，而两亲性环糊精分子C₅-β-CD-Man₇形成的胶束粒径在154nm左右(图1)，相对于C₃-β-CD-Man₇形成的胶束粒径较大，可见由于疏水部分的增大，使得胶束粒径增大。接下来的实验将选用C₃-β-CD-Man₇进行表征与应用。

实施例15胶束细胞毒性的实验

将实施例9胶束加入到培养液中进行细胞培养实验，然后用MTT方法测定细胞的相对存活率。具体实验方法可参考(Langmuir,2014,30,6151–6161)。将MDA-MB-231细胞和HEK293细胞以每孔5×10³的密度种植在96孔板上，细胞经过24小时的孵育在孔板中稳定生长后，分别加入实施例9胶束，每种材料加入的浓度包括0，50，100，200，400，600，800μg/mL。材料与细胞共孵育48小时后，将培养基移除，用PBS洗三遍，然后在每个孔中加入100μL未添加酚红的含有0.5mg/mLMTT的培养基。将加好显色剂的96孔板放入孵育箱中作用4h，然后取出，小心吸出含有MTT的培养基，然后每个孔中加入100μL，DMSO。已显色的96孔板，用酶标仪检测板中所有孔的吸光度值(λ＝490nm)。每种样品重复做6组平行实验。其中，将没有经过材料作用的细胞组定义为100％细胞活性，将只有DMSO溶液而没有细胞的孔定义为空白对照组，用以校正各孔中的吸光值。细胞存活情况计算如下：

细胞存活率％＝(ODsample/ODcontrol)×100％

式中，ODsample是实验样品组的吸光度值，ODcontrol是没有经过材料作用的细胞组的吸光度值。

图3为C₃-β-CD-Man₇胶束细胞毒性的结果图，结果显示，在实施例9胶束的浓度从0-800μg/mL浓度范围内，两种细胞的存活率都大于91％，显示这些胶束具有较低的毒性和很好的生物相容性。

实施例16激光共聚焦成像实验证明C₃-β-CD-Man₇胶束能特异性靶向识别MDA-MB-231细胞表面的甘露糖受体

实施例11中所得的载药胶束加入到培养液中进行细胞培养实验，然后用DAPI染细胞核。在激光共聚焦显微镜下，可以看出，C₃-β-CD-Man₇胶束只有少量进入HEK293细胞内。

实施例11中所得的载药胶束加入到培养液中进行细胞培养实验，然后用DAPI染细胞核。在激光共聚焦显微镜下，可以看出，C₃-β-CD-Man₇胶束能够进入MDA-MB-231细胞内，并且药物释放并进入细胞核内。

实施例17流式细胞仪检测证明C₃-β-CD-Man₇胶束能特异性靶向识别MDA-MB-231细胞表面的甘露糖受体

在流式细胞仪的检测实验中，取用DMEM培养基培养良好的MDA-MB-231和HEK293细胞进行种板，将细胞悬液稀释至细胞浓度为5×10⁴个/mL。之后在每个孔中加入2mLDMEM培养基，然后向各个孔中分别加入200μL稀释好的细胞悬液。根据样品数量和实验需要，确定种板数量。将种好的12孔板放入孵育箱中培养。24小时后，其中一组添加终浓度为2mmol/L的甘露糖，继续培养24小时后细胞密度超过90％，小心吸出孔中的培养基，并用pH7.4的PBS溶液小心洗涤细胞两次。向孔中加入DOX-C₃-β-CD-Man₇纳米胶束的培养基溶液，溶液中载药纳米粒子的浓度为50μg/mL。与载药胶束，添加甘露糖及载药胶束和空白对照样品组共孵化1小时后，用胰酶将细胞消化下来，以1000rpm的转速离心3分钟，倒掉上清液，将聚集的细胞用PBS重悬，吹散。这一离心过程重复三遍，以除去残留的培养基和药物溶液，减少对荧光检测的干扰。最后，将细胞用PBS分散，置于流式管中，用流式细胞仪的检测各组细胞的荧光强度。

实验中我们用了两种方式培养了MDA-MB-231和HEK293细胞，分别是用含有甘露糖的培养基培养的MDA-MB-231和HEK293细胞(表面受体提前被甘露糖饱和)和用不含甘露糖的培养基培养的MDA-MB-231和HEK293细胞(表面甘露糖受体正常表达)。两种细胞在经同样的载药胶束溶液作用1小时后，用流式细胞仪检测了细胞的荧光强度，荧光强度与进入细胞的纳米粒子数量成正比。图4.(A)为没有经过任何处理的对照组HEK293细胞(a)，表面受体被饱和的HEK293细胞(b)和表面受体正常表达的HEK293细胞(c)经载药胶束作用1h后的流式结果。从图4.(A)中可以看出在不同细胞环境下，载药胶束进入细胞的速度基本没有差别，与未经过载药胶束处理的对照组基本无差别。这是由于HEK293细胞表面只有低表达的甘露糖受体，因此载药胶束无法通过表面甘露糖配体—受体靶向介导的内吞作用快速进入细胞内。图4.(B)为没有经过任何处理的对照组MDA-MB-231细胞(a)，表面受体被饱和的MDA-MB-231细胞(b)和表面受体过度表达的MDA-MB-231细胞(c)经载药胶束作用1h后的流式结果。从图4.(B)中可以看出在两种细胞环境下，载药胶束进入细胞的速度明显不同，对于表面甘露糖受体被提前饱和的MDA-MB-231细胞(b)，纳米粒子无法通过表面键连的甘露糖识别肿瘤细胞，只能通过非靶向的内吞作用进入到肿瘤细胞中，而对于表面受体过度表达的MDA-MB-231细胞(c)，纳米粒子可以通过表面键连的甘露糖快速地与肿瘤细胞表面过度表达的受体结合，然后通过内吞作用进入到肿瘤细胞中。对比图4.(B)中b和c曲线，c曲线右移，对应的荧光强度变大，即载药胶束在表面受体过度表达的细胞环境下进入细胞的速度较快，表明甘露糖配体—受体靶向介导的内吞作用明显快于非靶向的内吞作用，纳米胶束在键连甘露糖后具癌细胞特异靶向功能，可以更快速的进入到肿瘤细胞中。

并且我们对载药糖纳米胶束进入MDA-MB-231细胞进行了定量分析，图5为MDA-MB-231细胞在有游离甘露糖竞争和无甘露糖竞争时摄取载药纳米胶束后的平均荧光强度的比值。当2mmol/L的甘露糖存在时，细胞的相对荧光强度较没有甘露糖竞争时降低了40％，这表明该糖纳米胶束具癌细胞特异靶向功能，可以更快速的进入到肿瘤细胞中。

实施例18激光共聚焦成像实验证明C₃-β-CD-Gal₇胶束能特异性靶向识别HepG2细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体

实施例12中所得的载药胶束加入到培养液中进行细胞培养实验，然后用DAPI复染细胞核。在激光共聚焦显微镜下，可以看出，C₃-β-CD-Gal₇胶束能够少量进入HEK293细胞内。

实施例11中所得的载药胶束加入到培养液中进行细胞培养实验，然后用DAPI复染细胞核。在激光共聚焦显微镜下，可以看出，C₃-β-CD-Gal₇胶束能够进入HepG2细胞内，并且药物可以释放进入细胞核内。

实施例19流式细胞仪检测证明C₃-β-CD-Gal₇胶束能特异性靶向识别HepG2细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体

在流式细胞仪的检测实验中，取用DMEM培养基培养良好的HepG2和HEK293细胞进行种板，将细胞悬液稀释至细胞浓度为5×10⁴个/mL。之后在每个孔中加入2mLDMEM培养基，然后向各个孔中分别加入200μL稀释好的细胞悬液。根据样品数量和实验需要，确定种板数量。将种好的12孔板放入孵育箱中培养。24小时后，其中一组添加终浓度为2mmol/L的半乳糖，继续培养24小时后细胞密度超过90％，小心吸出孔中的培养基，并用pH7.4的PBS溶液小心洗涤细胞两次。向孔中加入负载阿霉素C₃-β-CD-Gal₇纳米胶束的培养基溶液，溶液中载药纳米粒子的浓度为50μg/mL。与载药胶束，添加半乳糖及载药胶束和空白对照样品组共孵化1小时后，用胰酶将细胞消化下来，以1000rpm的转速离心3min，倒掉上清液，将聚集的细胞用PBS重悬，吹散。这一离心过程重复三遍，以除去残留的培养基和药物溶液，减少对荧光检测的干扰。最后，将细胞用PBS分散，置于流式管中，流式细胞仪检测各组细胞的荧光强度。

实验中我们用了两种方式培养了HepG2和HEK293细胞，分别是用含有半乳糖的培养基培养的HepG2和HEK293细胞(表面受体提前被半乳糖饱和)和用不含半乳糖的培养基培养的HepG2和HEK293细胞(表面去唾液酸蛋白受体正常表达)。两种细胞在经同样的载药胶束溶液作用1小时后，用细胞流式仪检测了细胞的荧光强度，荧光强度与进入细胞的纳米粒子数量成正比。结果显示HEK293细胞在不同环境下，载药胶束进入细胞的速度基本没有差别，与未经过载药胶束处理的对照组基本无差别。这是由于HEK293细胞表面只有低表达的去唾液酸蛋白受体，因此载药胶束无法通过表面半乳糖配体—去唾液酸蛋白受体靶向介导的内吞作用快速进入细胞内。然而HepG2细胞在不同环境下，载药胶束进入细胞的速度明显不同，对于表面去唾液酸蛋白受体被提前饱和的HepG2细胞，载药胶束无法通过表面键连的半乳糖识别HepG2细胞，只能通过非靶向的内吞作用进入到肿瘤细胞中，而对于表面受体过度表达的HepG2细胞，载药胶束能通过表面键连的半乳糖快速地与肿瘤细胞表面过度表达的受体结合，然后通过受体介导的内吞作用进入到肿瘤细胞中。该实验证明了C₃-β-CD-Gal₇胶束能特异性靶向识别HepG2细胞表面的糖受体。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种两亲性环糊精分子，其特征在于，是在环糊精分子的初级羟基面中引入单糖或寡糖类分子，在环糊精分子的次级羟基面中引入疏水脂肪链。

2.根据权利要求1所述的一种两亲性环糊精分子，其特征在于，所述两亲性环糊精分子的结构如式1所示：

式I中，

A为具有靶向功能的单糖或寡糖类分子，识别癌症细胞表面过度表达的受体；

B为如下连接键中的一种：酯键、酰胺键、二硫键、醚键、碳氮键、1,4-三氮唑环；

n为1，2或4。

3.根据权利要求1或2所述的一种两亲性环糊精分子，其特征在于，所述单糖或寡糖类分子为甘露糖、半乳糖、乳糖、唾液酸或甘露聚糖。

4.根据权利要求1所述的一种两亲性环糊精分子，其特征在于，所述疏水脂肪链为直链脂肪链。

5.一种制备权利要求1所述的一种两亲性环糊精分子的方法，其特征在于，首先将环糊精6位羟基碘代、叠氮化，再与端基位用炔丙基修饰的单糖进行click环加成反应得到含有亲水端的环糊精，然后，将环糊精次级羟基面与酸酐进行酯化反应从而得到两亲性环糊精分子。

6.一种制备糖纳米胶束的方法，其特征在于，包括如下步骤:

1)将两亲性环糊精分子用DMSO溶解、搅拌均匀；

2)在双蒸水中透析48小时，每隔6小时换水一次，制得胶束溶液；

3)将胶束溶液冻干，制得胶束；

所述两亲性环糊精分子，是在环糊精分子的初级羟基面中引入单糖或寡糖类分子，在环糊精分子的次级羟基面中引入疏水脂肪链。

7.一种制备载药糖纳米胶束的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将两亲性环糊精分子和药物分别用DMSO溶解，将两种溶液混合搅拌均匀；

2)混合溶液在双蒸水中透析48小时，每隔6小时换水一次，制得载药胶束溶液；

3)将载药胶束溶液经过滤除去未负载的药物，冻干制得负载药物的胶束；

所述两亲性环糊精分子，是在环糊精分子的初级羟基面中引入单糖或寡糖类分子，在环糊精分子的次级羟基面中引入疏水脂肪链。

8.根据权利要求7所述方法制备得到的载药糖纳米胶束。

9.权利要求1所述的两亲性环糊精分子在作为药物载体中的应用方法。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述药物为抗癌药物、抗肿瘤药物。