CN104173282A - 基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束及其制备方法 - Google Patents

基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束及其制备方法。首先，采用“一锅法”开环制备两亲性聚磷酸酯嵌段共聚物；再将其末端羟基进行修饰，得到叶酸修饰的嵌段共聚物；随后，将四甘醇上羟基修饰为末端含有缩醛基及叠氮基的分子；最后，采用“CuAAC”点击反应制备得到酸敏感核交联载药胶束。本发明制备的核交联胶束可通过自组装包载疏水性抗癌药物，并且在酸性条件下，由于缩醛基的断裂，导致胶束结构破坏，释放出所包载药物，可以用作可控释放药物载体。本发明公开的核交联胶束可以用作高效可控释放药物载体，在生物材料及生物医药领域具有良好的应用价值。

Description

基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感生物可降解核交联载药胶束及其制备方法。
背景技术
两亲性共聚物一般由亲水和疏水链段组成，由于其在水溶液中可以自组装成多种形状纳米粒子，如胶束、囊泡、纳米棒及薄片等，在生物医药、超分子及纳米科技等领域具有广阔的应用前景。众所周知，多数的抗癌药物都具有很强的疏水性，而两亲性共聚物自组装形成的核-壳结构的胶束具有疏水性内核，可以用于包载疏水性抗癌药物，而亲水性的外壳可以起到稳定胶束、增加药物水溶性的作用，并极大地提高了载药胶束在体内的循环时间。
传统两亲性共聚物载药胶束主要通过物理包埋方式包载疏水性抗癌药物。当其注射到体内后存在一定的热力学不稳定性，在体内循环过程中，由于体液稀释（低于临界胶束浓度值）及体液的复杂环境等作用，胶束结构容易被破坏，使抗癌药物易从胶束内扩散出来，导致药物在癌变组织部位富集程度较低，严重影响治疗效果。同时，药物的毒性对人体带来很多不良反应。近年来，文献报道多采用交联方式来降低抗癌药物在体内循环过程中的扩散，增加药物在癌变组织部位的富集。
胶束交联的方法主要有两种：“物理交联法（Physical cross-links）”和“化学交联法（Chemical cross-links）”。物理交联胶束主要通过非共价键作用形成，例如：静电作用、氢键、配位键、疏水作用及超分子络合作用等；而化学交联胶束主要通过共价键作用形成，即功能性共聚物分子链间的相互反应或者添加功能性小分子交联剂与共聚物链发生化学反应。根据胶束交联位置的不同，交联胶束可以分为“核交联胶束（Core cross-linked micelle）”和“壳交联胶束（Shell cross-linked micelle）”，这种交联胶束作为药物载体在体内循环过程中可以稳定存在。
尽管药物载体的研究已经有了长足的进展，但是能够应用到临床试验的产品种类有限，药物载体到达体内后很难以预期的速度在特定的时间和特定的部位进行药物释放，这成为限制药物载体发展的最大障碍。具有良好稳定性的交联纳米粒子在体内循环过程中有效的延长了循环时间，但是进入癌细胞后，载药胶束将会面临以预期的速度在特定的时间和特定的部位进行药物释放问题，这成为限制药物载体发展的最大障碍。对此，研究者设计开发了智能响应性纳米粒子药物载体，这类药物载体受到来自外界环境的刺激（包括温度、氧化还原条件、光和pH值等）时，其性质会发生相应变化，利用这一点，研究者设计合成了多种刺激响应性纳米粒子药物载体。当受到外界刺激时，纳米粒子结构会被破坏，从而将其内部包载的药物释放出来，达到药物的可控释放。
一般而言，人体内不同组织及细胞器的pH值会有所差异，如：血液及正常组织部位的pH值一般为7.4，肿瘤及病变部位的pH值为6.5左右，而内涵体及溶酶体内的pH甚至达到5.0～5.5。利用这一特点，可以设计具有酸敏感的聚合物胶束，这些胶束在制备过程中可以包载疏水性药物，进入体内循环后，在正常组织及体液条件下载药胶束可以稳定存在，而到达肿瘤部位等酸性环境下，酸敏感基团会发生改变，导致胶束结构破坏，将包载的药物释放出来，达到可控药物释放目的。常用酸敏感基团主要包括两种：一种是可逆的酸敏感基团，包括-COOH、-NH2和-SO3H等，其主要是通过在不同pH环境下的质子化及去质子化来作用；另一种是不可逆的酸断裂键，包括缩醛基、缩酮基、腙键、肟键及原甲酸酯等，在酸性条件下，这些化学键会发生不可逆的化学键断裂。
传统的交联结构胶束大多使用具有良好生物相容性的聚乙二醇和聚酯，但是当聚乙二醇分子量较大时，难以通过代谢排出体内，而聚磷酸酯与生物大分子核酸的结构相似，有极好的生物相容性，而且，在体内磷酸二酯酶存在下，磷酸酯可以水解，具有良好的生物降解性；另外，传统的交联结构胶束多采用酯键或者还原敏感结构来控制药物释放，未见将酸敏感基团引入核交联胶束的报道。
理想的药物载体应当具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且，作为抗肿瘤药物的载体，还应当具有下列特征：在水溶液中可以形成稳定的聚合物胶束，其疏水性内核可以包载疏水性抗癌药物，亲水性外壳起到稳定胶束的作用；在体内循环过程中可以避免药物的扩散及载体的聚集，提高胶束在体内循环时间；当载药胶束到达肿瘤或病变组织时，能够利用主动或者被动靶向，高效进入癌细胞；同时，胶束进入癌细胞后应当具有“智能”响应性，在癌细胞特殊环境下，达到药物的控制释放。尽管对于药物载体的研究已经取得了长足的进展，但是药物载体的发展仍然面临巨大的挑战。
因此，需要研发新型的核交联胶束结构用于药物载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束及其制备方法，该核交联载药胶束具有良好的生物相容性、生物可降解性及酸敏感性，可以用作刺激响应性药物体系。
本发明的总体构思是：将开环聚合（ROP）和端炔基与叠氮的环加成反应（CuAAC）联用，合成叶酸靶向的酸敏感生物可降解核交联载药胶束。首先，以含羟基的小分子为引发剂，对环状磷酸酯类单体进行开环聚合，得到两亲性聚磷酸酯嵌段共聚物；随后，用叶酸对该嵌段共聚物末端羟基进行修饰，得到叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物；之后，从双羟基化合物制备得到末端含有叠氮基及缩醛基的小分子；最后，将疏水性抗癌药物、侧链含有炔基的叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物和末端含有叠氮基的小分子在水溶液中自组装，并进行“CuAAC”点击反应，得到具有酸敏感的核交联载药胶束。
为达到上述目的，本发明采取的技术方案是，一种基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束的制备方法，具体包括以下步骤：
(1) 制备聚磷酸酯嵌段共聚物：惰性气氛中，在1, 8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯的催化作用下，以二氯甲烷为溶剂，在10～50℃条件下，以异丙醇为引发剂，以环状磷酸酯                                                为单体进行开环聚合，反应30秒～60分钟；再加入环状磷酸酯单体，继续反应30秒～60分钟；得到聚磷酸酯嵌段共聚物；
环状磷酸酯单体结构式中，R1为CH2或CH2CH2；R2为甲基、乙基、异丙基、丁基或单甲基封端的聚环氧乙烷基中的一种；所述单甲基封端的聚环氧乙烷基的化学结构式为：(CH2CH2O)xCH3，式中x = 2～10；m = 20～90，n = 20～90；
所述引发剂、、及1, 8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯的摩尔比为1∶(20～90)∶(20～90)∶(0.1～2)；
上述反应式如下：
(2) 制备叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物：在二环己基碳二亚胺的催化作用下，以叶酸和N-羟基琥珀酰亚胺为原料，以二甲亚砜为溶剂，在4-二甲氨基吡啶的存在下，于10～40℃反应8～16小时，再加入步骤(1)制备的聚磷酸酯嵌段共聚物，搅拌，继续反应8～48小时，得到叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物；
所述聚磷酸酯嵌段共聚物、叶酸、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺及4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1∶(1～2)∶(1.2～3)∶(1.2～3)∶(0.1～1)；
上述反应式如下：
式中R1为CH2或CH2CH2；R2为甲基、乙基、异丙基、丁基或单甲基封端的聚环氧乙烷基中的一种；所述单甲基封端的聚环氧乙烷基的化学结构式为：(CH2CH2O)xCH3，式中x = 2～10；m = 20～90，n = 20～90；
(3) 制备叠氮基封端的酸敏感小分子：在4-甲基苯磺酸吡啶鎓的催化作用下，以HO-R3-OH和2-氯乙基乙烯基醚为原料，在冰水浴条件下，反应0.5～1小时，制备氯官能团封端的小分子；然后将上述氯官能团封端的小分子、叠氮化钠加入N, N-二甲基甲酰胺溶液中，于40～80℃反应30～50小时，得到叠氮基封端的酸敏感小分子；
所述HO-R3-OH中，R3为(CH2CH2O)yCH2CH2，其中y = 0～7；
所述氯官能团封端的小分子的结构式为；
所述HO-R3-OH、2-氯乙基乙烯基醚及4-甲基苯磺酸吡啶鎓的摩尔比为1∶(4～20)∶(0.1～0.5)；
所述氯官能团封端的小分子与叠氮化钠的摩尔比为1∶(4～40)；
上述反应式如下：
(4) 制备基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束：惰性气氛中，以疏水性抗癌药物、步骤(2)制备的叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物和步骤(3)制备的叠氮基封端的酸敏感小分子为原料，在端炔基与叠氮的环加成点击反应催化剂、催化剂配体及还原性物质存在下，以水/N, N-二甲基甲酰胺混合液为溶剂，于25～40℃反应18～30小时，得到基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束；
所述叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物的炔基、叠氮基封端的酸敏感小分子、端炔基与叠氮的环加成点击反应催化剂、催化剂配体及还原性物质的摩尔比为1∶0.5∶1∶(1～2)∶(1～2)。
上述技术方案中，所述惰性气氛为氮气或氩气气氛。
上述技术方案中，所述步骤(3)中制备氯官能团封端的小分子时以无水二氯甲烷为溶剂。
上述技术方案中，所述步骤(4)中疏水性抗癌药物与叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物的质量比为1∶(2～10)。
上述技术方案中，所述步骤(4)中疏水性抗癌药物选自阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、硼替佐米、阿柔比星、吡柔比星、盐酸柔红霉素、司莫司汀、普卡霉素、丝裂霉素、伊达比星或左旋咪唑中的一种；端炔基与叠氮的环加成点击反应催化剂选自氯化亚铜、溴化亚铜或碘化亚铜中的一种；催化剂配体选自联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种；还原性物质选自维生素C、抗坏血酸钠、抗坏血钙或柠檬酸中的一种。
上述技术方案中，所述步骤(1)～(4)完成后，分别对产物进行提纯处理，所述提纯过程包括以下步骤：
1)聚磷酸酯嵌段共聚物的提纯：开环聚合反应结束后，将反应产物旋蒸浓缩，再将浓缩液滴入甲醇/乙醚混合液中沉淀，倒出上清液，将剩余黏稠液体溶于甲醇溶液中，再转移到透析袋内，置于去离子水中透析24～72小时，然后冷冻干燥，得到聚磷酸酯嵌段共聚物；
2)叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物的提纯：反应结束后，将反应液抽滤、浓缩，将浓缩液转移到透析袋内，置于去离子水中透析24～72小时，取出，冷冻干燥，再用二氯甲烷溶解、过滤、浓缩，得到淡黄色黏稠液体，将所得淡黄色黏稠液体在真空烘箱中常温干燥24～36小时，得到叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物；
3)小分子的提纯：
(1)氯官能团封端的小分子的提纯：反应结束后，加入质量分数为5%的碳酸钠水溶液终止反应，用二氯甲烷稀释，再加入饱和氯化钠磷酸缓冲溶液，振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相溶液经干燥、过滤、浓缩，常压蒸馏，将蒸馏剩余产物在真空烘箱中常温干燥24～36小时，得到淡黄色液体，为氯官能团封端的小分子；
(2)叠氮基封端的酸敏感小分子的提纯：反应结束后，将反应产物过滤、浓缩，再将浓缩液溶于二氯甲烷溶液中，加入饱和氯化钠磷酸缓冲溶液，振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相溶液经干燥、过滤、浓缩，采用薄层层析法分离得到淡黄色液体，将所得产物在真空烘箱中常温干燥24～36小时，得到叠氮基封端的酸敏感小分子；
4)基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束的提纯：点击反应结束后，将反应产物转移到透析袋内，置于去离子水中透析24～72小时，定容，得到基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束。
上述技术方案中，所述饱和氯化钠磷酸缓冲溶液的pH值为10.0。
本发明还请求保护由上述制备方法制备得到的基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束。该载药胶束以酸敏感小分子的叠氮基与磷酸酯嵌段聚合物的炔基为交联点，形成交联结构。
本发明公开的核交联载药胶束中，叶酸修饰的两亲性聚磷酸酯嵌段共聚物具有良好的生物相容性及生物可降解性，其含有亲水和疏水链段，可通过自组装包载疏水性抗癌药物；所形成的载药胶束采用含有缩醛基的功能性分子将疏水部分进行化学交联，制备结构稳定的核交联载药胶束。在体内循环过程中，化学交联结构有效的延长了体内循环时间，而叶酸靶向介导进入癌细胞后，在细胞内酸性条件下，缩醛基断裂，载药胶束的化学交联点破坏，在溶酶体内水解酶的存在下，聚磷酸酯水解，导致胶束的核-壳结构破坏，释放出所包载药物，可以用作高效可控药物释放体系。
由于上述方案运用，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1．本发明首次采用“一锅法”思路，将开环聚合（ROP）和端炔基与叠氮的环加成反应（CuAAC）联用，合成了基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束；该胶束以具有良好生物相容性和生物可降解性的聚磷酸酯分别作为其亲水和疏水链段，在水溶液中可以自组装形成胶束，疏水性内核可以用于包载疏水性抗癌药物。
2．本发明将靶向分子叶酸键合到两亲性共聚物末端，在细胞内吞过程中介导载药胶束进入癌细胞，增加药物利用率。
3．本发明采用酸敏感分子对获得的叶酸靶向的两亲性聚磷酸酯嵌段共聚物进行化学交联，延长胶束在体内循环时间，而且核交联胶束含有的酸敏感缩醛基位点在酸性环境下断裂，聚磷酸酯主链在酶存在下可以水解，导致胶束结构破坏，释放出所包载药物，达到治疗肿瘤的目的；因此，本发明公开的核交联载药胶束可以用作高效可控释放药物体系，在生物材料及生物医药领域具有良好的应用价值。
附图说明
图1为实施例一中聚磷酸酯嵌段共聚物（PBYP43-b-PEOP41-OH）的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿（CDCl3）；
图2为实施例二中叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物（PBYP43-b-PEOP41-FA）、实施例一中聚磷酸酯嵌段共聚物（PBYP43-b-PEOP41-OH）和叶酸（FA）的紫外光谱图，溶剂为乙醇；
图3为实施例三中氯官能团封端的酸敏感四甘醇（Cl-a-TEG-a-Cl）和叠氮基封端的酸敏感四甘醇（N3-a-TEG-a-N3）的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿（CDCl3）；
图4为实施例三中N3-a-TEG-a-N3的核磁共振碳谱图，溶剂为氘代氯仿（CDCl3）；
图5为实施例五中酸敏感核交联（ACCL）胶束的透射电镜照片和动态光散射曲线；
图6为实施例五中酸敏感核交联（ACCL）胶束的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿（CDCl3）；
图7为实施例七中叶酸靶向酸敏感核交联（ACCL-FA）载药胶束的透射电镜照片和动态光散射曲线；
图8为实施例十中叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束在不同pH值条件下的累计药物释放曲线；
图9为实施例十一中未交联胶束（A）和交联胶束（B）对L929细胞的毒性测试图及叶酸靶向交联胶束对KB细胞的毒性测试图（C）；
图10为实施例十一中游离的阿霉素（DOX）、叶酸靶向酸敏感核交联（ACCL-FA）载药胶束和酸敏感核交联（ACCL）载药胶束对KB细胞的细胞毒性曲线；
图11为实施例十二中KB细胞对有无叶酸靶向的酸敏感核交联载药胶束的内吞照片图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：聚磷酸酯嵌段共聚物（PBYP-b-PEOP-OH）的制备
将装有搅拌子的安瓿瓶放在120℃烘箱中干燥至少24小时，取出，将安培瓶连接到双排管上，用油泵抽冷至常温，重复抽充气三次，最后充满氮气，在氮气保护下，往安瓿瓶中依次加入1, 8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯（DBU，0.2738 g，0.18 mmol）、二氯甲烷（CH2Cl2，1.5 mL）、异丙醇（IPA，0.1121 g，0.12 mmol）和单体2-炔丁基-2-氧代-1, 3, 2-二氧磷杂环戊烷（BYP，0.8453 g，4.8 mmol），将反应瓶放入设定为25℃油浴内，搅拌下反应30分钟。反应结束后，再加入单体2-乙基-2-氧代-1, 3, 2-二氧磷杂环戊烷（EOP，0.73 g，4.8 mmol），继续于25℃油浴内反应30分钟。
开环反应结束后，将产物浓缩，再将浓缩液滴入体积比为1∶10的甲醇/乙醚混合液（100 mL）中沉淀两次，倾出上清液，将所得黏稠液体溶于甲醇溶液中，再转移到截留分子量为3500 g·mol-1透析袋内，置于去离子水中透析24小时，冷冻干燥，得到黏稠状液体，即为聚磷酸酯嵌段共聚物（PBYP43-b-PEOP41-OH），产率81.3%。采用核磁共振氢谱（1H NMR）对其进行表征，附图1为上述PBYP43-b-PEOP41-OH的核磁共振氢谱（1H NMR）图，验证了聚磷酸酯嵌段共聚物的化学结构。
实施例二：叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物（PBYP-b-PEOP-FA）的制备
将装有搅拌子的支管瓶及磨口玻璃塞按照实施例一方法处理后，充满氮气，在通氮气条件下，依次加入叶酸（FA，0.0159 g，0.036 mmol）、二甲亚砜（DMSO，10 mL）、二环己基碳二亚胺（DCC，0.0096 g，0.0468 mmol）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，0.0054 g，0.0468 mmol）和4-二甲氨基吡啶（DMAP，0.0057 g，0. 0468 mmol）。将反应瓶充满氮气，于25℃搅拌反应12小时。反应结束后，再称取PBYP43-b-PEOP41-OH（0.4161 g，0.0300 mmol）加至反应液中，继续反应24小时。
反应结束后，将产物转移到截留分子量为3500 g·mol-1透析袋内，在去离子水中透析24小时，冷冻干燥，得到淡黄色黏稠液体，再加入二氯甲烷（100 mL）溶解、过滤、浓缩，将所得黏稠液体在真空烘箱中常温干燥36小时，得到叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物（PBYP43-b-PEOP41-FA），产率77.8%。采用紫外分光光度计（UV-Vis）对其进行表征。附图2为叶酸、PBYP43-b-PEOP41-OH和PBYP43-b-PEOP41-FA的紫外光谱图。在波长220～400 nm范围内，叶酸的最大吸收峰在283 nm，PBYP43-b-PEOP41-OH在该范围内没有最大吸收峰，而PBYP43-b-PEOP41-FA的最大吸收峰在278 nm，这是由于叶酸上羧基与聚磷酸酯上羟基键合后助色基团发生改变，导致叶酸的吸收峰蓝移。
实施例三：叠氮基封端的酸敏感四甘醇（N3-a-TEG-a-N3）的制备
称取四甘醇（TEG，0.97 g，5 mmol）和4-甲基苯磺酸吡啶鎓（PPTS，0.2513 g，1 mmol）加至装有磁力搅拌子的100 mL支管瓶中，加入甲苯（20 mL），共沸除水两次，再将共沸混合物溶于无水二氯甲烷（30 mL），在冰水浴条件下，缓慢滴加2-氯乙基乙烯基醚（CEVE，2.5 mL，25 mmol）和无水二氯甲烷（10 mL）混合液至支管瓶中，滴加结束后，冰水浴搅拌反应0.5小时。
反应结束后，加入质量分数为5%的碳酸钠水溶液终止反应，用二氯甲烷（30 mL）稀释，再加入饱和氯化钠磷酸缓冲溶液（pH 10.0，10 mL），振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷（20 mL）萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，再加入甲苯（20 mL）共沸除去未反应的2-氯乙基乙烯基醚，将所得淡黄色液体在真空烘箱中常温干燥36小时，得到氯官能团封端的酸敏感四甘醇（Cl-a-TEG-a-Cl），产率74.9%。
将Cl-a-TEG-a-Cl（1.025 g，2.5 mmol）、叠氮化钠（NaN3，1.625 g，25 mmol）和N, N-二甲基甲酰胺（DMF，10 mL）依次加至50 mL圆底烧瓶中，将反应瓶移至60℃油浴中，搅拌反应40小时。
反应结束后，将产物过滤、浓缩，再将浓缩液溶于二氯甲烷（100 mL）中，加入饱和氯化钠磷酸缓冲溶液（pH 10.0，10 mL），振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷（20 mL）萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，采用薄层层析法分离得到淡黄色液体，将所得产物在真空烘箱中常温干燥36小时，得到叠氮基封端的酸敏感四甘醇（N3-a-TEG-a-N3），产率72.2%。采用核磁共振氢谱（1H NMR）和核磁共振碳谱（13C NMR）对产物进行表征，附图3中（A）和（B）分别为Cl-a-TEG-a-Cl和N3-a-TEG-a-N3的核磁共振氢谱（1H NMR）图，附图4为Cl-a-TEG-a-Cl的核磁共振碳谱（13C NMR）图，结果证明，成功制备了实施例三中两种功能性分子。
实施例四：未核交联（UCCL）胶束的制备
将PBYP43-b-PEOP41-OH（0.010 g）和N, N-二甲基甲酰胺（2 mL）加至装有搅拌子的圆底烧瓶中，在持续搅拌下，用微量进样器以缓慢速度（3 mL·h-1）加入去离子水（20 mL），待完全进样后，搅拌12小时。
反应结束后，将反应液转移到截留分子量为3500 g·mol-1的透析袋内，置于去离子水中透析24小时，将透析后的溶液定容至25 mL，得到未核交联（UCCL）胶束。
实施例五：酸敏感核交联（ACCL）胶束的制备
将PBYP43-b-PEOP41-OH（0.010 g，0. 72 mmol）、N3-a-TEG-a-N3（6.5 mg，0.0155 mmol）和N, N-二甲基甲酰胺（2 mL）加至装有搅拌子的圆底烧瓶中，在持续搅拌下，用微量进样器以缓慢速度（3 mL·h-1）加入去离子水（20 mL），待完全进样后，搅拌12小时，再依次加入溴化亚铜（CuBr， 4.4 mg，0.031 mmol）、五甲基二亚乙基三胺（PMDETA， 1.3 mL，0.062 mmol）和维生素C（5.5 mg，0.031 mmol），密封、抽充气三次。将反应瓶充满氮气并移至25℃油浴中，搅拌反应24小时。
反应结束后，将反应液转移到截留分子量为3500 g·mol-1的透析袋内，置于去离子水中透析24小时，将透析后的溶液用水定容至25 mL，得到酸敏感核交联（ACCL）胶束。分别采用透射电镜（TEM）和动态光散射仪（DLS）对胶束形貌和粒径大小进行表征，附图5为酸敏感核交联胶束在去离子水中的自组装的透射电镜照片（A）和动态光散射曲线（B），结果表明，酸敏感核交联胶束在水溶液中呈球形结构，粒径在160纳米左右。采用核磁共振氢谱（1H NMR）对核交联结构进行表征，附图6为酸敏感核交联胶束的核磁共振氢谱（1H NMR）图，交联反应后，PBYP链段和TEG分子上的质子峰强度很小，而PEOP链段质子峰强度基本没有变化，结果证明，成功制备了酸敏感核交联网状结构。
实施例六：叶酸靶向酸敏感核交联（ACCL-FA）胶束的制备
将PBYP43-b-PEOP41-FA（0.010 g，0.72 mmol）、N3-a-TEG-a-N3（6.5 mg，0.0155 mmol）和N, N-二甲基甲酰胺（2 mL）加至装有搅拌子的圆底烧瓶中，在持续搅拌下，用微量进样器以缓慢速度（3 mL·h-1）加入去离子水（20 mL），待完全进样后，搅拌12小时，再依次加入溴化亚铜（CuBr， 4.4 mg，0.031 mmol）、五甲基二亚乙基三胺（PMDETA，1.3 mL，0.062 mmol）和维生素C（5.5 mg，0.031 mmol），密封、抽充气三次。将反应瓶充满氮气并移至25℃油浴中，搅拌反应24小时。
反应结束后，将反应液转移到截留分子量为3500 g·mol-1的透析袋内，置于去离子水中透析24小时，将透析后的溶液用水定容至25 mL，得到叶酸靶向酸敏感核交联（ACCL-FA）胶束。
实施例七：采用透析法制备包载抗癌药物的核交联胶束
将PBYP43-b-PEOP41-OH或PBYP43-b-PEOP41-FA（0.010 g，0. 72 mmol）、N3-a-TEG-a-N3（6.5 mg，0.0155 mmol）和N, N-二甲基甲酰胺（2 mL）加至装有搅拌子的圆底烧瓶中，量取0.4 mL抗癌药物阿霉素（DOX）的二甲基亚砜（DMSO）溶液（5 mg·mL-1）加至混合溶液中，在持续搅拌下，用微量进样器以缓慢速度（3 mL·h-1）加入去离子水（20 mL），待完全进样后，搅拌12小时，再依次加入溴化亚铜（4.4 mg，0.031 mmol）、五甲基二亚乙基三胺（1.3 mL，0.062 mmol）和维生素C（5.5 mg，0.031 mmol），密封、抽充气三次。将反应瓶充满氮气并移至25℃油浴中，搅拌反应24小时。
反应结束后，将反应液转移到截留分子量为3500 g·mol-1的透析袋内，在去离子水中透析24小时，将透析后的溶液定容至25 mL，分别得到酸敏感核交联（ACCL）载药胶束和叶酸靶向酸敏感核交联（ACCL-FA）载药胶束。分别采用透射电镜和动态光散射对载药胶束形貌和粒径大小进行表征，附图7为叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束在去离子水中的自组装的透射电镜照片（A）和动态光散射曲线（B），结果表明，载药胶束在水溶液中呈球形结构，粒径在165纳米左右。 
实施例八：采用透析法制备包载抗癌药物的核交联胶束
将PBYP43-b-PEOP41-FA（0.010 g，0. 72 mmol）、N3-a-TEG-a-N3（6.5 mg，0.0155 mmol）和N, N-二甲基甲酰胺（2 mL）加至装有搅拌子的圆底烧瓶中，量取1 mL抗癌药物紫杉醇（PTX）的二甲基亚砜（DMSO）溶液（5 mg·mL-1）加至混合溶液中，在持续搅拌下，用微量进样器以缓慢速度（3 mL·h-1）加入去离子水（20 mL），待完全进样后，搅拌12小时，再依次加入溴化亚铜（4.4 mg，0.031 mmol）、五甲基二亚乙基三胺（1.3 mL，0.062 mmol）和维生素C（5.5 mg，0.031 mmol），密封、抽充气三次。将反应瓶充满氮气并移至25℃油浴中，搅拌反应24小时。
反应结束后，将反应液转移到截留分子量为3500 g·mol-1的透析袋内，在去离子水中透析24小时，将透析后的溶液定容至25 mL，得到叶酸靶向酸敏感核交联（ACCL-FA）载药胶束。
实施例九：采用透析法制备包载抗癌药物的核交联胶束
将PBYP43-b-PEOP41-FA（0.010 g，0. 72 mmol）、N3-a-TEG-a-N3（6.5 mg，0.0155 mmol）和N, N-二甲基甲酰胺（2 mL）加至装有搅拌子的圆底烧瓶中，量取0.2 mL抗癌药物左旋咪唑（LMS）的二甲基亚砜（DMSO）溶液（5 mg·mL-1）加至混合溶液中，在持续搅拌下，用微量进样器以缓慢速度（3 mL·h-1）加入去离子水（20 mL），待完全进样后，搅拌12小时，再依次加入溴化亚铜（4.4 mg，0.031 mmol）、五甲基二亚乙基三胺（1.3 mL，0.062 mmol）和维生素C（5.5 mg，0.031 mmol），密封、抽充气三次。将反应瓶充满氮气并移至25℃油浴中，搅拌反应24小时。
反应结束后，将反应液转移到截留分子量为3500 g·mol-1的透析袋内，在去离子水中透析24小时，将透析后的溶液定容至25 mL，分别得到酸敏感核交联（ACCL）载药胶束和叶酸靶向酸敏感核交联（ACCL-FA）载药胶束。
实施例十：酸敏感核交联胶束包载抗癌药物阿霉素的体外释放实验
取5 mL实施例五制备的叶酸靶向核交联载药胶束溶液于截留分子量为12000～14000 g·mol-1的透析袋中，将该透析袋放入容量为30 mL的离心管内，外部加入不同pH值的缓冲溶液（20 mL），将离心管置于37℃恒温振荡器中进行释放实验。每隔一段时间取5 mL透析袋外部溶液，同时补充5 mL相同pH值的缓冲溶液。采用荧光分光光度计检测释放阿霉素的含量。载有阿霉素的叶酸靶向酸敏感核交联胶束在不同pH条件下的累计释放曲线如附图8所示，结果表明，药物在pH 5.0条件下释放速率明显快于pH 7.4，可见载药胶束具有一定的酸敏感性，可以达到药物可控释放效果。
实施例十一：细胞毒性测试
细胞毒性测试选用人体成纤维细胞（L929 cells）和人鼻咽癌细胞（KB cells）进行，L929细胞培养在加有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，放于37℃，5% CO2，相对湿度为90%的培养箱中培养。选择处于生长活跃期的细胞接种于每孔含100 μL DMEM培养基的96孔板中，培养24小时。KB细胞在不含叶酸的RPMI-1640(-)FA培养基中培养两周以上，再进行实验。
配置一定浓度的待测样品溶液：未核交联（UCCL）胶束，1000 mg·L-1；酸敏感核交联（ACCL）胶束，1000 mg·L-1；叶酸靶向酸敏感核交联（ACCL-FA）胶束，1000 mg·L-1；阿霉素，30 mg·L-1；叶酸靶向酸敏感核交联（ACCL-FA）载药胶束，阿霉素浓度为30 mg·L-1；酸敏感核交联（ACCL）载药胶束，阿霉素浓度为30 mg·L-1。将一系列不同浓度样品溶液加入到96孔板中，继续培养48小时；接着加入25 μL的MTT试剂，进一步培养4小时后，用酶标仪（Bio-Rad 680）在570纳米下测量对应的吸光度。按照如下公式计算细胞存活率：
细胞存活率（Cell viability）（%）= [A]test/[A]control × 100
式中，[A]test为加有待测样品条件下测得的吸光度，[A]control为不加样品空白对照条件下测得的吸光度。每个样品测试三次，取其平均值。
附图9中（A）、（B）和（C）分别为未核交联（UCCL）胶束及叶酸靶向酸敏感核交联（ACCL-FA）胶束对L929细胞的毒性测试以及叶酸靶向酸敏感核交联（ACCL-FA）胶束对KB细胞的毒性测试，结果表明，两种聚合物胶束具有较低的毒性和良好的生物相容性；
附图10为游离的阿霉素（DOX）、叶酸靶向酸敏感核交联（ACCL-FA）载药胶束和酸敏感核交联（ACCL）载药胶束对KB细胞的毒性测试结果，表明随着阿霉素浓度的增加，样品杀死癌细胞的能力不断增强，而且，在相同阿霉素浓度下，载药胶束比游离阿霉素具有更强杀死癌细胞的能力，且叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束具有最强的抗癌效果。
实施例十二：细胞内吞测试
KB细胞培养在加有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640(-)FA培养基中，放于37℃，5% CO2，相对湿度为90%的培养箱中培养。选择处于生长活跃期的细胞接种于底厚为0.17 mm的玻璃底培养皿中，培养12小时使其贴壁。将培养皿转移到活细胞工作站的细胞培养系统中，采用含有10 mL载药胶束溶液（叶酸靶向酸敏感核交联（ACCL-FA）载药胶束、酸敏感核交联（ACCL）载药胶束，阿霉素浓度：30 mg·L-1）的培养基（1 mL）置换出培养皿中的培养基（最终阿霉素浓度：0.3 mg·L-1），采用活细胞工作站检测细胞对载药胶束的内吞过程。附图11为KB细胞对有无叶酸靶向的酸敏感核交联载药胶束的内吞照片，结果表明，叶酸靶向的酸敏感核交联载药胶束比没有叶酸修饰的载药胶束进入KB细胞的速度更快。

Claims (10)

1.一种基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 制备聚磷酸酯嵌段共聚物：惰性气氛中，在1, 8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯的催化作用下，以二氯甲烷为溶剂，在10～50℃条件下，以异丙醇为引发剂，以环状磷酸酯                                                为单体进行开环聚合，反应30秒～60分钟；再加入环状磷酸酯单体，继续反应30秒～60分钟；得到聚磷酸酯嵌段共聚物；
环状磷酸酯单体结构式中，R1为CH2或CH2CH2；R2为甲基、乙基、异丙基、丁基或单甲基封端的聚环氧乙烷基中的一种，所述单甲基封端的聚环氧乙烷基的化学结构式为：(CH2CH2O)xCH3，式中x = 2～10；m = 20～90，n = 20～90；
所述引发剂、、及1, 8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯的摩尔比为1∶(20～90)∶(20～90)∶(0.1～2)；
(2) 制备叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物：在二环己基碳二亚胺的催化作用下，以叶酸和N-羟基琥珀酰亚胺为原料，以二甲亚砜为溶剂，在4-二甲氨基吡啶的存在下，于10～40℃反应8～16小时，再加入步骤(1)制备的聚磷酸酯嵌段共聚物，搅拌，继续反应8～48小时，得到叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物；
所述聚磷酸酯嵌段共聚物、叶酸、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺及4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1∶(1～2)∶(1.2～3)∶(1.2～3)∶(0.1～1)；
(3) 制备叠氮基封端的酸敏感小分子：在4-甲基苯磺酸吡啶鎓的催化作用下，以HO-R3-OH和2-氯乙基乙烯基醚为原料，在冰水浴条件下，反应0.5～1小时，制备氯官能团封端的小分子；然后将上述氯官能团封端的小分子、叠氮化钠加入N, N-二甲基甲酰胺溶液中，于40～80℃反应30～50小时，得到叠氮基封端的酸敏感小分子；
所述HO-R3-OH中，R3为(CH2CH2O)yCH2CH2，其中y = 0～7；
所述氯官能团封端的小分子的结构式为；
所述HO-R3-OH、2-氯乙基乙烯基醚及4-甲基苯磺酸吡啶鎓的摩尔比为1∶(4～20)∶(0.1～0.5)；
所述氯官能团封端的小分子与叠氮化钠的摩尔比为1∶(4～40)；
(4) 制备基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束：惰性气氛中，以疏水性抗癌药物、步骤(2)制备的叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物和步骤(3)制备的叠氮基封端的酸敏感小分子为原料，在端炔基与叠氮的环加成点击反应催化剂、催化剂配体及还原性物质存在下，以水/N, N-二甲基甲酰胺混合液为溶剂，于25～40℃反应18～30小时，得到基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束；
所述叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物的炔基、叠氮基封端的酸敏感小分子、端炔基与叠氮的环加成点击反应催化剂、催化剂配体及还原性物质的摩尔比为1∶0.5∶1∶(1～2)∶(1～2)。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中制备氯官能团封端的小分子时以无水二氯甲烷为溶剂。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中疏水性抗癌药物与叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物的质量比为1∶(2～10)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中端炔基与叠氮的环加成点击反应催化剂选自氯化亚铜、溴化亚铜或碘化亚铜中的一种；催化剂配体选自联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中疏水性抗癌药物选自阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、硼替佐米、阿柔比星、吡柔比星、盐酸柔红霉素、司莫司汀、普卡霉素、丝裂霉素、伊达比星或左旋咪唑中的一种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中还原性物质选自维生素C、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙或柠檬酸中的一种。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述惰性气氛为氮气或氩气气氛。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)～(4)反应完成后，分别对产物进行提纯处理，所述提纯过程包括以下步骤：
1)聚磷酸酯嵌段共聚物的提纯：开环聚合反应结束后，将反应产物旋蒸浓缩，再将浓缩液滴入甲醇/乙醚混合液中沉淀，倒出上清液，将剩余黏稠液体溶于甲醇溶液中，再转移到透析袋内，置于去离子水中透析24～72小时，然后冷冻干燥，得到聚磷酸酯嵌段共聚物；
2)叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物的提纯：反应结束后，将反应液抽滤、浓缩，将浓缩液转移到透析袋内，置于去离子水中透析24～72小时，取出，冷冻干燥，再用二氯甲烷溶解、过滤、浓缩，得到淡黄色黏稠液体，将所得淡黄色黏稠液体在真空烘箱中常温干燥24～36小时，得到叶酸修饰的聚磷酸酯嵌段共聚物；
3)小分子的提纯：
(1)末端修饰缩醛基的小分子的提纯：反应结束后，加入质量分数为5%的碳酸钠水溶液终止反应，用二氯甲烷稀释，再加入饱和氯化钠磷酸缓冲溶液，振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相溶液经干燥、过滤、浓缩，常压蒸馏，将蒸馏剩余产物在真空烘箱中常温干燥24～36小时，得到淡黄色液体，为末端修饰缩醛基的小分子；
(2)叠氮基封端的酸敏感小分子的提纯：反应结束后，将反应产物过滤、浓缩，再将浓缩液溶于二氯甲烷溶液中，加入饱和氯化钠磷酸缓冲溶液，振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相溶液经干燥、过滤、浓缩，采用薄层层析法分离得到淡黄色液体，将所得产物在真空烘箱中常温干燥24～36小时，得到叠氮基封端的酸敏感小分子；
4)基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束的提纯：点击反应结束后，将反应产物转移到透析袋内，置于去离子水中透析24～72小时，定容，得到基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述饱和氯化钠磷酸缓冲溶液的pH值为10.0。
10.根据权利要求1～9所述的任意一种制备方法制备得到的基于聚磷酸酯的叶酸靶向酸敏感核交联载药胶束。
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