CN103554508A

CN103554508A - 酸敏感两亲性星状嵌段共聚物、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN103554508A
Application number: CN201310512061.1A
Authority: CN
Inventors: 倪沛红; 胡健; 何金林; 张明祖
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2013-10-25
Filing date: 2013-10-25
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2033-10-25
Also published as: CN103554508B

Abstract

本发明公开了一种酸敏感两亲性星状嵌段共聚物、其制备方法及应用。首先，采用缩合反应制备苯环为核的三官能团炔基化合物；再以一端含羟基、另一端含炔基的小分子为引发剂对环状酯类单体进行开环聚合，得到聚酯分子链，并修饰成末端含有氯官能团的聚酯链；随后，将聚乙二醇单甲醚修饰为末端含有缩醛基及叠氮基的分子链；最后，采用两步“CuAAC”点击反应制备得到酸敏感两亲性星状嵌段共聚物，该聚合物结构及分子量可控，分子量分布较窄，具有良好生物相容性、生物可降解性。本发明制备的共聚物可通过自组装包载疏水性抗癌药物，并且在酸性条件下，由于缩醛基的断裂，导致胶束结构破坏，释放出所包载药物，可以用作可控释放药物载体。

Description

酸敏感两亲性星状嵌段共聚物、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种酸敏感两亲性星状嵌段共聚物、其制备方法以及作为药物载体的应用。

背景技术

两亲性聚合物一般由亲水和疏水链段组成，由于其在水溶液中可以自组装成多种形状纳米粒子，如胶束状、囊泡状、棒状及层状等，在生物医药、超分子及纳米科技等领域具有广阔的应用前景。众所周知，多数的抗癌药物都具有较强的疏水性，而两亲性聚合物自组装形成的核-壳结构胶束具有疏水性内核可以用于包载疏水性抗癌药物，而亲水性的外壳可以起到稳定胶束的作用，并可显著提高载药胶束在体内的循环时间。

在两亲性聚合物领域中，拓扑结构聚合物，包括线形、刷形、星状、环状及树枝状大分子，逐渐成为研究热点。其中，星状聚合物一般是指由多个线形聚合物链连接于同一中心核上构成的一类支化聚合物，与其它聚合物相比，它们具有低结晶度、低扩散系数、低熔体粘度和较小的流体动力学体积等独特性质。

当今阶段，刺激性响应聚合物逐渐成为药物载体领域的研究热点。当聚合物受到来自外界环境的刺激时（包括温度、氧化还原条件、光和pH值等），其性质会发生相应变化，利用这一点，研究者设计合成了多种刺激响应性纳米药物载体，当受到外界刺激时，纳米粒子结构会被破坏，从而将其内部包载的药物释放出来，达到药物的可控释放。

一般而言，人体内不同组织及细胞器的pH值会有所差异，如：血液及正常组织部位的pH值一般为7.4，肿瘤及病变部位的pH值为6.5左右，而内涵体及溶酶体内的pH值为5.0～5.5。利用这一特点，可以设计具有酸敏感的两亲性聚合物，这些两亲性聚合物与疏水性药物在水溶液中可以形成载药胶束，进入体内循环后，在正常组织及体液条件下载药胶束可以稳定存在，而到达肿瘤部位等酸性环境下，酸敏感基团会发生改变，导致胶束结构被破坏，将包载的药物释放出来，达到可控药物释放目的。常用酸敏感基团主要包括两种：一种是可逆的酸敏感基团，包括-COOH、-NH₂和-SO₃H等，其主要是通过在不同pH环境下的质子及去质子化来作用；另一种是不可逆的酸断裂键，包括缩醛基、缩酮基、腙键、肟键及原甲酸酯等，在酸性条件下，这些化学键常发生不可逆的化学键断裂。

随着活性离子聚合、“活性”/可控自由基聚合和高效有机化学反应的蓬勃发展，研究人员已经发展出“先臂后核法（Arm-first）”、“先核后臂法（Core-first）”和“偶联法（Coupling-onto）”等三种合成星状聚合物的主要路线。利用这些方法可以制备一些具有不对称结构、不同化学组成和复杂结构的星状聚合物，如星状-嵌段共聚物、杂臂星状共聚物以及不对称的星状聚合物。其中，“先臂后核法”是利用端基功能化的大分子单体自身或与小分子交联剂发生反应，形成星状聚合物；“先核后臂法”通过含多个功能基团的化合物为多官能团引发剂，引发单体聚合得到星状聚合物，例如：用多醇化合物引发环状内酯单体聚合得到星状聚酯、或者含多个原子转移自由基聚合（ATRP）或可逆加成-断裂链转移聚合（RAFT）等引发位点的化合物引发单体聚合得到星状聚合物；“偶联法”则是利用端基功能化的聚合物链与小分子偶联剂反应得到星状聚合物，由于聚合物链端基的活性比较低，用传统的化学反应很难通过该法获得纯的星状聚合物。

在现有技术中，采用聚乙二醇及聚酯来制备两亲性星状嵌段共聚物的研究主要有：

(1) Jo W. H.等人采用聚乙二醇单甲醚引发ɛ-己内酯开环聚合，再将其与均苯三甲酰氯进行缩合，得到星状聚合物，并对其自组装行为进行研究（参见：Kim K. H.; Cui G. H.; Lim H. J.; Huh J.; Ahn C. H.; Jo W. H. Macromol. Chem. Phys. 2004, 205, 1684-1692.）；

(2) Wang F.等人采用“先核后臂法”制备了十六臂星状嵌段共聚物，首先，采用含有十六个羟基的小分子引发ɛ-己内酯开环聚合物，再将其与末端含有羧基的聚乙二醇单甲醚进行酯化反应，可以用作药物载体（参见：Wang F.; Bronich T. K.; Kabanov A. V.; Rauh R. D.; Roovers J. Bioconjugate Chem. 2005, 16, 397-405.）；

(3) Lai P. S.等人采用聚乙二醇单甲醚引发ɛ-己内酯开环聚合，对其末端修饰后与含有四个氨基的小分子反应，得到四臂星状嵌段共聚物，用作药物载体（参见：Peng C. L.; Shieh M. J.; Tsai M. H.; Chang C. C.; Lai P. S. Biomaterials 2008, 29, 3599-3608.）；

(4) Dong C. M.等人采用“偶联法”制备了具有还原敏感的星状嵌段共聚物，其偶联过程采用了巯基-炔反应，可以用作药物载体（参见：Sun L.; Liu W.; Dong C. M. Chem. Commun. 2011, 47, 11282-11284.）。

现有星状嵌段共聚物大多使用具有良好生物相容性的聚乙二醇和聚酯，制备具有良好生物相容性的两亲性星状嵌段共聚物，但是现有的制备方法多数反应效率不高，难以精确控制聚合物的结构及分子量分布；而且未见将酸敏感基团引入两亲性星状嵌段共聚物的报道。

作为药物载体，应当具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且，作为抗肿瘤药物的载体，还应当具有下列特征：在水溶液中可以形成稳定的聚合物胶束，其疏水性内核可以装载疏水性抗癌药物，亲水性外壳起到稳定胶束、提高胶束血液循环时间的作用；当载药胶束到达肿瘤或病变组织时，能够利用局部组织的pH值较低的特点，使胶束解离，快速释放出抗癌药物；同时应当具有“智能”响应性，避免载体在体内循环过程中吸附聚集，达到定点释放药物的作用。

因此，需要研发新型的酸敏感两亲性星状嵌段共聚物。

发明内容

本发明的目的是提供一种酸敏感两亲性星状嵌段共聚物及其制备方法，该聚合物具有良好生物相容性及酸敏感性，可以用作刺激响应性药物载体。

为达到上述目的，本发明的总体构思是：将开环聚合（ROP）和端炔基与叠氮的环加成反应（CuAAC点击化学反应）联用，合成酸敏感两亲性星状嵌段共聚物。首先，利用一端含羟基、另一端含炔基的小分子和均苯三甲酰氯为原料，在4-二甲氨基吡啶催化下进行缩合反应，得到苯环为核的三官能团炔基化合物；之后，以一端含羟基、另一端含炔基的小分子为引发剂，在辛酸亚锡的催化作用下，对环状酯类单体进行开环聚合，得到聚酯分子链，并将该聚酯链末端羟基与2-氯乙基乙烯基醚反应，得到一端含有炔基、另一端含有氯的聚酯链；随后，采用2-氯乙基乙烯基醚对聚乙二醇单甲醚末端的羟基进行修饰，得到末端含有氯的聚乙二醇单甲醚，并将其与叠氮化钠反应，得到末端含有叠氮基及缩醛基的聚乙二醇单甲醚；接着，在“CuAAC”点击反应催化剂和催化剂配体存在下，将炔基封端的聚酯与叠氮基封端的聚乙二醇单甲醚反应，得到末端含有氯的两嵌段共聚物，并采用叠氮化钠进行修饰；最后，在“CuAAC”点击反应催化剂和催化剂配体存在下，将叠氮基封端的两嵌段共聚物与苯环为核的三官能团炔基化合物反应，得到具有酸敏感两亲性星状嵌段共聚物。

本发明的具体技术方案为：一种酸敏感两亲性星状嵌段共聚物，所述星状共聚物的化学结构式如下，

；

式中，R₁选自

；R₂为CH₂或CH₂CH₂；m = 20～90，n = 10～80。

优选的技术方案中，所述星状共聚物的数均分子量为6000～50000 g•mol^-1。上述酸敏感两亲性星状嵌段共聚物的制备方法，具体包括以下步骤：

(1) 制备三官能团炔基化合物：在惰性气氛中，以

和均苯三甲酰氯为原料，以4-二甲氨基吡啶（DMAP）为催化剂，以无水四氢呋喃为溶剂，在25～35℃条件下缩合反应8～16小时，得到三官能团炔基化合物；中R₂为CH₂或CH₂CH₂；

其中，所述

、均苯三甲酰氯和催化剂的摩尔比为(3.15～4.5)∶1∶3；

上述反应式如下：

(2) 制备酸敏感聚酯中间体：首先在惰性气氛中，在辛酸亚锡的催化作用下，以甲苯为溶剂，在80～110℃条件下，以

为引发剂引发脂肪族环状酯类单体开环聚合2～8小时，得到可降解聚酯；

中R₂为CH₂或CH₂CH₂；

所述

、脂肪族环状酯类单体及辛酸亚锡的摩尔比为1∶(10～80)∶0.5；

所述脂肪族环状酯类单体为己内酯、丙交酯或者环状碳酸酯；

然后以上述可降解聚酯与2-氯乙基乙烯基醚为反应物，以4-甲基苯磺酸吡啶鎓（PPTS）为催化剂，以二氯甲烷为溶剂，在冰水浴条件下，经过0.5～1小时的反应得到酸敏感聚酯中间体；

所述可降解聚酯、2-氯乙基乙烯基醚及4-甲基苯磺酸吡啶鎓的摩尔比为1∶(2～10)∶0.1；

上述反应式如下：

其中，R₁为

；R₂为CH₂或CH₂CH₂；n = 10～80；

(3) 制备酸敏感聚乙二醇单甲醚：首先在4-甲基苯磺酸吡啶鎓的催化下，以聚乙二醇单甲醚和2-氯乙基乙烯基醚为原料，在冰水浴条件下，反应0.5～1小时，制备末端修饰缩醛基的聚乙二醇单甲醚；然后将上述末端修饰缩醛基的聚乙二醇单甲醚与叠氮化钠在N, N-二甲基甲酰胺溶液中，于40～80℃反应30～50小时，得到酸敏感聚乙二醇单甲醚；

所述聚乙二醇单甲醚、2-氯乙基乙烯基醚及4-甲基苯磺酸吡啶鎓的摩尔比为1∶(2～10)∶0.1；

所述末端修饰缩醛基的聚乙二醇单甲醚与叠氮化钠的摩尔比为1∶(2～20)；

上述反应式如下：

其中，m = 20～90；

(4) 制备酸敏感两亲性嵌段共聚物：惰性气氛中，首先以上述步骤(2)制备的酸敏感聚酯中间体和步骤(3)制备的酸敏感聚乙二醇单甲醚为原料，在端炔基与叠氮的环加成点击反应催化剂和催化剂配体存在下，于25～40℃反应18～30小时，制备具有酸敏感的两嵌段共聚物；

所述酸敏感聚酯中间体、酸敏感聚乙二醇单甲醚、端炔基与叠氮的环加成点击反应催化剂及催化剂配体的摩尔比为1∶(1.05～1.5)∶1∶(1～2)；

然后将上述具有酸敏感的两嵌段共聚物与叠氮化钠在N, N-二甲基甲酰胺溶液中，于40～80℃反应30～50小时，得到酸敏感两亲性嵌段共聚物；

所述具有酸敏感的两嵌段共聚物与叠氮化钠的摩尔比为1∶(2～20)；

上述反应式如下：

；

(5) 制备酸敏感两亲性星状嵌段共聚物：惰性气氛中，以步骤(1)制备的三官能团炔基化合物和步骤(4)制备的酸敏感两亲性嵌段共聚物为原料，在端炔基与叠氮的环加成点击反应催化剂和催化剂配体存在下，于25～40℃反应18～30小时，得到所述的酸敏感两亲性星状嵌段共聚物；

所述酸敏感两亲性嵌段共聚物、三官能团炔基化合物、端炔基与叠氮的环加成点击反应催化剂及催化剂配体的摩尔比为(3.15～4.5)∶1∶3∶(3～6)；

上述反应式如下：

。

优选的技术方案中，所述惰性气氛为氩气气氛。

上述技术方案中，所述步骤(4)和(5)中端炔基与叠氮的环加成点击反应催化剂分别选自氯化亚铜、溴化亚铜或碘化亚铜中的一种；催化剂配体分别选自联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种。

优选的技术方案中，上述步骤(2) 中可降解聚酯与2-氯乙基乙烯基醚反应前进行甲苯共沸除水处理；步骤(3)中聚乙二醇单甲醚与2-氯乙基乙烯基醚反应前进行甲苯共沸除水处理。PEG及PCL中常含有水分，这对其与2-氯乙基乙烯基醚反应有很大影响，甲苯共沸除水可以有效提高对聚合物的修饰率。

上述技术方案中，所述聚乙二醇单甲醚属于现有物质，其分子式为

，m = 20～90。

上述技术方案中，所述步骤(1)～(5)中，反应完成后，分别对产物进行提纯处理，所述纯化过程包括以下步骤：

1）三官能团炔基化合物的提纯处理：反应结束后，将反应液抽滤，下清液用旋转蒸发仪浓缩，再将浓缩产物溶于二氯甲烷溶液中，之后加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液，振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相溶液经干燥、过滤、浓缩，得到固体粉末，将所得固体粉末在真空烘箱中常温干燥24～36小时，得到白色固体粉末；

2）酸敏感聚酯中间体的提纯处理：开环聚合反应结束后，将反应产物用旋转蒸发仪浓缩，在乙醚中沉淀两次、抽滤，将所得产物在真空烘箱中常温干燥24～36小时，得到白色固体粉末；可降解聚酯与2-氯乙基乙烯基醚反应结束后，加入质量分数为5%的碳酸钠水溶液终止反应，并加入二氯甲烷稀释，再加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液，振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相溶液经干燥、过滤、浓缩，在乙醚中沉淀两次、抽滤，得到固体粉末，将所得固体粉末在真空烘箱中常温干燥24～36小时，得到白色固体粉末；

3）酸敏感聚乙二醇单甲醚的提纯处理：聚乙二醇单甲醚和2-氯乙基乙烯基醚反应结束后，加入质量分数为5%的碳酸钠水溶液终止反应，用二氯甲烷稀释，再加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液，振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相溶液经干燥、过滤、浓缩，在正己烷中沉淀两次、抽滤，得到固体粉末，将所得产物在真空烘箱中常温干燥24～36小时，得到白色固体粉末；修饰后的聚乙二醇单甲醚与叠氮化钠反应结束后，将反应产物过滤、浓缩，再将浓缩液溶于二氯甲烷溶液中，加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液，振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相溶液经干燥、过滤、浓缩，在正己烷/乙醚混合液中沉淀两次、抽滤，得到固体粉末，将所得产物在真空烘箱中常温干燥24～36小时，得到白色固体粉末；

4）酸敏感两亲性嵌段共聚物的提纯处理：点击反应结束后，将反应产物用旋转蒸发仪浓缩，再将浓缩产物溶于二氯甲烷溶液中，加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液，振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相溶液经干燥、过滤、浓缩，在甲醇/乙醚混合液中沉淀两次、抽滤，将所得固体粉末溶于四氢呋喃溶液中，再转移到透析袋内，在去离子水中透析48～72小时，冷冻干燥，得到白色固体粉末，即为具有酸敏感的两嵌段共聚物；具有酸敏感的两嵌段共聚物与叠氮化钠反应后，将反应产物过滤、浓缩，再将浓缩液溶于二氯甲烷溶液中，加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液，振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相溶液经干燥、过滤、浓缩，在乙醚中沉淀两次、抽滤，将所得固体粉末在真空烘箱中常温干燥24～36小时，得到酸敏感两亲性嵌段共聚物；

5）酸敏感两亲性星状嵌段共聚物的提纯处理：反应结束后，将反应产物用旋转蒸发仪浓缩，再将浓缩产物溶于二氯甲烷溶液中，加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液，振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相溶液经干燥、过滤、浓缩，然后在不断搅拌下将乙醚以2～4滴/秒滴加至浓缩液中，直至浓缩液变浑浊，继续搅拌0.5～2小时，停止搅拌后倒出上清液，将沉淀物质溶于二氯甲烷溶液中，重复上述操作两遍，最后将沉淀物质在真空烘箱中常温干燥24～36小时，得到酸敏感两亲性星状嵌段共聚物。

上述技术方案中，所述饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液的pH值为10.0。

上述技术方案中，所述正己烷/乙醚混合液中两者的体积比为1∶1；所述甲醇/乙醚混合液中甲醇、乙醚的体积比为1∶10。

本发明还公开了上述酸敏感两亲性星状嵌段共聚物作为刺激响应性药物载体的应用。

本发明中，酸敏感两亲性星状嵌段共聚物既含有疏水性的生物可降解聚酯，又含有亲水性生物相容性聚乙二醇，可通过自组装包载疏水性抗癌药物，而且该共聚物又含有六个在酸性条件下可断裂的缩醛基位点，其化学结构式为：

，这些位点位于亲水-疏水及疏水-疏水链段之间。在酸性条件下，由于缩醛基的断裂，载药胶束的亲水性壳脱落，并伴随着胶束疏水部分的解离，导致胶束结构破坏，释放出所包载药物，可以用作高效可控释放药物载体。

由于上述方案的实施，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1．本发明首次以一种高效模块化组合思路，结合开环聚合与“CuAAC”点击化学方法制备了一种结构可控、分子量分布较窄的具有酸敏感的两亲性星状嵌段共聚物；

2．本发明获得的星状嵌段共聚物以具有良好生物相容性的聚乙二醇和生物可降解性的聚酯分别作为两亲性聚合物的亲水和疏水链段；并且通过在酸性条件下可发生水解的缩醛基将聚合物的亲水-疏水链段以及疏水-疏水链段连接；

3．本发明获得的两亲性星状嵌段共聚物在水溶液中可以自组装形成胶束，生物可降解的聚酯链段可以用于包载疏水性抗癌药物；而且该共聚物含有的缩醛基位点在酸性环境下断裂，导致胶束结构破坏，释放出所包载药物，达到治疗肿瘤的目的。因此，本发明公开的酸敏感两亲性星状嵌段共聚物可以用作高效可控释放药物载体，在生物材料及生物医药领域具有良好的应用价值。

附图说明

图1为实施例一中TAPE的核磁共振碳谱图，溶剂为氘代氯仿（CDCl₃）；

图2为实施例二中PA-PCL₂₇-OH和PA-PCL₂₇-a-Cl及实施例四中mPEG₄₅-a-PCL₂₇-a-Cl的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿（CDCl₃）；

图3为实施例三中mPEG₄₅-OH、mPEG₄₅-a-Cl和mPEG₄₅-a-N₃的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿（CDCl₃）；

图4为实施例三中mPEG₄₅-OH、mPEG₄₅-a-Cl和mPEG₄₅-a-N₃的红外光谱图；

图5为实施例二中PA-PCL₂₇-a-Cl、实施例三中mPEG₄₅-a-N₃和实施四中mPEG₄₅-a-PCL₂₇-a-Cl的红外光谱图；

图6为实施例一中TAPE、实施例四中mPEG₄₅-a-PCL₂₇-a-N₃和实施例五中(mPEG₄₅-a-PCL₂₇)₃的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿（CDCl₃）；

图7为实施例一中TAPE、实施例四中mPEG₄₅-a-PCL₂₇-a-N₃和实施例五中(mPEG₄₅-a-PCL₂₇)₃的红外光谱图；

图8为实施例二中PA-PCL₂₇-a-Cl、实施例三中mPEG₄₅-a-N₃、实施四中mPEG₄₅-a-PCL₂₇-a-Cl和实施例五中(mPEG₄₅-a-PCL₂₇)₃的聚合物凝胶渗透色谱流出曲线；

图9为实施例六中(mPEG₄₅-a-PCL₂₇)₃载药胶束的透射电镜照片和动态光散射粒径分布曲线；

图10为实施例七中三种共聚物载药胶束在不同pH值条件下的累计药物释放曲线；

图11为实施例八中三种共聚物对HeLa细胞的细胞毒性图；

图12为实施例八中游离抗癌药物阿霉素（DOX）及(mPEG₄₅-a-PCL₂₇)₃载药胶束对HeLa细胞的细胞毒性曲线。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：均苯三甲酸炔丙酯（TAPE）的制备

将装有搅拌子的支管瓶及磨口玻璃塞放在120℃烘箱中干燥至少24小时，取出，将支管瓶塞上磨口玻璃塞后连接到双排管上，用油泵抽冷至常温，重复抽充气三次，最后充满氩气，在通氩气条件下，往支管中依次加入四氢呋喃（THF，50 mL）、炔丙醇（PA，0.5000 g，8.92 mmol）和4-二甲氨基吡啶（DMAP，0.9078 g，7.44 mmol），搅拌至溶液澄清透明，快速称取均苯三甲酰氯（BTT，0.6577 g，2.48 mmol）加至装有四氢呋喃（10 mL）的滴液漏斗内，在冰水浴条件下，缓慢滴加至混合液，将反应瓶放入设定为25℃油浴内，搅拌下反应12小时。

反应结束后，将产物抽滤，浓缩下清液，再将浓缩液溶于二氯甲烷（DCM，60 mL），加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液（pH 10.0，10 mL），振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷（30 mL）萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩，得到白色固体粉末，将所得固体粉末在真空烘箱中常温干燥36小时，得到纯度较高的TAPE，产率59.4%。经核磁共振氢谱（¹H NMR）、核磁共振碳谱（¹³C NMR）和红外光谱（FT-IR）对其进行了表征，附图1、附图6（A）和附图7（A）分别为上述TAPE的核磁共振碳谱（¹³C NMR）图、核磁共振氢谱（¹H NMR）图和红外光谱（FT-IR）图，验证了TAPE的化学结构。

实施例二：单炔基封端的酸敏感聚己内酯中间体（PA-PCL₂₇-a-Cl）的制备

将装有搅拌子的支管瓶及磨口玻璃塞按照实施例一方法处理后，充满氩气，在通氩气条件下，迅速称取辛酸亚锡[Sn(Oct)₂，0.4050 g，1 mmol] 加至支管瓶中，抽充气三次，最后充满氩气，从支管处依次加入无水甲苯（20 mL）、ɛ-己内酯（ɛ-CL，4.5656 g，40 mmol）和炔丙醇（0.1121 g，2 mmol）。将反应瓶充满氩气并移至90℃油浴中，搅拌反应4小时。

反应结束后，将产物浓缩，在乙醚（150 mL）中沉淀两次、抽滤，得到白色固体，将所得固体粉末在真空烘箱中常温干燥36小时，得到聚己内酯（PA-PCL₂₇-OH），产率93.4%。

称取PA-PCL₂₇-OH（3.1300 g，1 mmol）和4-甲基苯磺酸吡啶鎓（PPTS，0.0251 g，0.1 mmol）加至装有磁力搅拌子的100 mL支管瓶中，加入甲苯（30 mL），共沸除水两次，再将共沸混合物溶于无水二氯甲烷（50 mL），在冰水浴条件下，缓慢滴加2-氯乙基乙烯基醚（CEVE，0.5 mL，5 mmol）和无水二氯甲烷（10 mL）混合液至支管瓶中，滴加结束后，冰水浴搅拌反应0.5小时。

反应结束后，加入质量分数为5%的碳酸钠水溶液终止反应，用二氯甲烷稀释（40 mL），再加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液（pH 10.0，10 mL），振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷（20 mL）萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩，在乙醚（150 mL）中沉淀两次、抽滤，将所得固体在真空烘箱中常温干燥36小时，得到PA-PCL₂₇-a-Cl，产率64.1%。

实施例三：叠氮基封端的聚乙二醇单甲醚（mPEG₄₅-a-N₃）的制备

称取聚乙二醇单甲醚（mPEG₄₅-OH，4.0800 g，2 mmol）和4-甲基苯磺酸吡啶鎓（0.0503 g，0.2 mmol）加至装有磁力搅拌子的100 mL支管瓶中，加入甲苯（30 mL），共沸除水两次，再将共沸混合物溶于无水二氯甲烷（50 mL），在冰水浴条件下，缓慢滴加2-氯乙基乙烯基醚（1.0 mL，10 mmol）和无水二氯甲烷（10 mL）混合液至支管瓶中，滴加结束后，冰水浴搅拌反应0.5小时。

反应结束后，加入质量分数为5%的碳酸钠水溶液终止反应，用二氯甲烷稀释（40 mL），再加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液（pH 10.0，10 mL），振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷（20 mL）萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩，在正己烷（200 mL）中沉淀两次、抽滤，得到白色固体粉末，将所得固体在真空烘箱中常温干燥36小时，得到氯官能团封端的含有缩醛基的聚乙二醇单甲醚（mPEG₄₅-a-Cl），产率87.7%。

将mPEG₄₅-a-Cl（3.2250 g，1.5 mmol）、叠氮化钠（NaN₃，0.4875 g，7.5 mmol）和N, N-二甲基甲酰胺（DMF）依次加至50 mL圆底烧瓶中，将反应瓶移至60℃油浴中，搅拌反应40小时。

将反应产物过滤，除去未反应的叠氮化钠固体颗粒，浓缩，再将浓缩液溶于二氯甲烷（100 mL）中，加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液（pH 10.0，10 mL），振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷（20 mL）萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩，在体积比为1:1的正己烷/乙醚混合液（200 mL）中沉淀两次、抽滤，得到白色固体粉末，将所得样品在真空烘箱中常温干燥36小时，得到mPEG₄₅-a-N₃，产率87.7%。

实施例四：叠氮基封端的两亲性嵌段共聚物（mPEG₄₅-a-PCL₂₇-a-N₃）的制备

将mPEG₄₅-a-N₃（0.3386 g，0.1575 mmol）、PA-PCL₂₇-a-Cl（0.4860 g，0.15 mmol）和四氢呋喃（20 mL）加至装有搅拌子的支管瓶中，抽充气三次，最后充满氩气，搅拌至溶液澄清透明，再依次加入溴化亚铜（CuBr，0.0215 g，0.15 mmol）和五甲基二亚乙基三胺（PMDETA，0.063 ml，0.30 mmol），密封、抽充气三次。将反应瓶充满氩气并移至25℃油浴中，搅拌反应24小时。

将反应产物浓缩，再溶于二氯甲烷（100 mL）中，加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液（pH 10.0，20 mL），振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷（20 mL）萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩，在体积比为1:10的甲醇/乙醚混合液（100 mL）中沉淀两次、抽滤，得到白色固体粉末，将所得固体粉末溶于四氢呋喃（5 mL）中，再转移到截留分子量为5000 g•mol^-1透析袋内，在去离子水中透析48小时，冷冻干燥，得到白色固体粉末，即为氯官能团封端的两亲性嵌段共聚物（mPEG₄₅-a-PCL₂₇-a-Cl），产率76.3%。

将mPEG₄₅-a-PCL₂₇-a-Cl（0.5390 g，0.1 mmol）、叠氮化钠（0.0650 g，1.0 mmol）和N, N-二甲基甲酰胺加至50 mL圆底烧瓶中，将反应瓶移至60℃油浴中，搅拌反应40小时。

将反应产物过滤，除去未反应的叠氮化钠固体颗粒，浓缩，再将浓缩液溶于二氯甲烷（50 mL）中，加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液（pH 10.0，10 mL），振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷（20 mL）萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩，在乙醚（100 mL）中沉淀两次、抽滤，得到白色固体粉末，将所得样品在真空烘箱中常温干燥36小时，得到mPEG₄₅-a-PCL₂₇-a-N₃，产率81.5%。

实施例五：具有酸敏感的两亲性星状嵌段共聚物[(mPEG₄₅-a-PCL₂₇)₃]的制备

将mPEG₄₅-a-PCL₂₇-a-N₃（0.3288 g，0.061 mmol）、TAPE（0.0065 g，0.02 mmol）和四氢呋喃（20 mL）加至装有搅拌子的支管瓶中，抽充气三次，最后充满氩气，搅拌至溶液澄清透明，在通氩气条件下，再依次加入溴化亚铜（0.0086 g，0.06 mmol）和五甲基二亚乙基三胺（0.025 ml，0.12 mmol），密封、抽充气三次。将反应瓶充满氩气并移至25℃油浴中，搅拌反应24小时。

将反应产物浓缩，再将浓缩产物溶于二氯甲烷（50 mL）中，加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液（pH 10.0，10 mL），振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷（20 mL）萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩至10 mL，再转移到烧杯中，在不断搅拌下将乙醚缓慢滴加至混合液中，直至溶液变浑浊，继续搅拌0.5小时，有粘稠状液滴沉到烧杯底部，倒出上清液，将沉淀物质溶于二氯甲烷（10 mL）中，重复上述操作两遍，将最终产物在真空烘箱中常温干燥36小时，得到(mPEG₄₅-a-PCL₂₇)₃，产率56.1%，该共聚物的化学结构式为：

实施例二、三、四和五中的产物，分别采用核磁共振氢谱（¹H NMR）、红外光谱（FT-IR）和凝胶渗透色谱（GPC）对聚合物结构、分子量和分子量分布进行表征。附图2中（A）、（B）和（C）分别为PA-PCL₂₇-OH、PA-PCL₂₇-a-Cl和mPEG₄₅-a-PCL₂₇-a-Cl的核磁共振氢谱（¹H NMR）图；附图3中（A）、（B）和（C）分别为mPEG₄₅-OH、mPEG₄₅-a-Cl和mPEG₄₅-a-N₃的核磁共振氢谱（¹H NMR）图；附图4中（A）、（B）和（C）分别为mPEG₄₅-OH、mPEG₄₅-a-Cl和mPEG₄₅-a-N₃的红外光谱（FT-IR）图；附图5中（A）、（B）和（C）分别为PA-PCL₂₇-a-Cl、mPEG₄₅-a-N₃和mPEG₄₅-a-PCL₂₇-a-Cl的红外光谱（FT-IR）图；附图6中（B）和（C）分别为mPEG₄₅-a-PCL₂₇-a-N₃和(mPEG₄₅-a-PCL₂₇)₃的核磁共振氢谱（¹H NMR）图，附图7中（B）和（C）分别为mPEG₄₅-a-PCL₂₇-a-N₃和(mPEG₄₅-a-PCL₂₇)₃的红外光谱（FT-IR）图；附图8为上述四种聚合物的凝胶渗透色谱（GPC）流出曲线（mPEG₄₅-a-N₃， = 3600 g•mol^-1，

= 1.06；PA-PCL₂₇-a-Cl，

= 5360 g•mol^-1， = 1.16； mPEG₄₅-a-PCL₂₇-a-Cl，

= 7080 g•mol^-1，

= 1.15；(mPEG₄₅-a-PCL₂₇)₃， = 20590 g•mol^-1，

= 1.07）。分析附图结果证明，成功制备了实施例中每一步聚合物，而且，聚合物结构可控、分子量分布较窄。

实施例六：采用透析法制备含抗癌药物的聚合物胶束

称取实施例五制备的聚合物(mPEG₄₅-a-PCL₂₇)₃（10 mg）加至圆底烧瓶中，加入2 mL四氢呋喃，量取0.2 mL抗癌药物阿霉素（DOX）的二甲基亚砜（DMSO）溶液（5 mg•mL^-1）加至四氢呋喃溶液中，在持续搅拌下，用微量进样器以缓慢速度（1 mL•h^-1）加入二次水（2 mL），待完全进样后，搅拌12小时，转移到截留分子量为3500 g•mol^-1的透析袋内，搅拌下透析24小时。将透析后的溶液定容至10 mL，得到聚合物(mPEG₄₅-a-PCL₂₇)₃载药胶束。分别采用透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）对聚合物载药胶束形貌和粒径大小进行表征，附图9分别为(mPEG₄₅-a-PCL₂₇)₃载药胶束在二次水中的透射电镜照片（A）和动态光散射曲线（B），结果表明，抗癌药物的聚合物胶束在水溶液中呈球形结构，粒径在160纳米左右。

实施例七：聚合物胶束装载抗癌药物阿霉素的的体外释放实验

取1 mL实施例六制备的载药胶束溶液于截留分子量为3500 g•mol^-1的透析袋中，将该透析袋放入容量为30 mL的离心管内，外部加入不同pH值的缓冲溶液（20 mL），将离心管置于37℃恒温振荡器中进行释放实验。每隔一段时间取5 mL透析袋外部溶液，同时补充5 mL相同pH值的缓冲溶液。采用荧光分光光度计检测释放阿霉素的含量。载有阿霉素的三种聚合物载药胶束在不同pH条件下的累计释放曲线如附图10所示，结果表明，药物在pH 5.0条件下释放速率明显快于pH 7.4，可见载药胶束具有一定的酸敏感性，可以达到药物可控释放效果。

实施例八：细胞毒性测试

人宫颈癌细胞（HeLa cells）培养在加有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基中，放于37℃，5% CO₂，相对湿度为90%的培养箱中培养。选择处于生长活跃期的细胞接种于每孔含100 μL RPMI-1640培养基的96孔板中，培养24小时。配置一定浓度的待测样品溶液（mPEG₄₅-a-PCL₂₇-a-Cl，1000 mg•L^-1；(mPEG₄₅-a-PCL₂₇)₃，1000 mg•L^-1；(mPEG₄₅-a-PCL₁₈)₃，1000 mg•L^-1；阿霉素，10 mg•L^-1；(mPEG₄₅-a-PCL₂₇)₃载药胶束，阿霉素浓度为10 mg•L^-1），将一系列不同浓度样品溶液加入到96孔板中，继续培养48小时；接着加入25 μL的MTT试剂，进一步培养0.5小时后，用酶标仪（Bio-Rad model 680）在490纳米下测量对应的吸光度。按照如下公式计算细胞存活率：

细胞存活率（Cell viability）（%）= [A]_test/[A]_control × 100

式中，[A]_test为加有待测样品条件下测得的吸光度，而[A]_control为不加样品空白对照条件下测得的吸光度。每个样品测试三次，取其平均值。

附图11为三种聚合物溶液对HeLa细胞的毒性测试，结果表明，本发明的最终产物以及中间产物都具有较低的毒性和良好的生物相容性；附图12为游离的阿霉素和(mPEG₄₅-a-PCL₂₇)₃载药胶束对HeLa细胞的毒性测试结果，表明随着阿霉素浓度的增加，样品杀死癌细胞的能力不断增强，而且，在相同阿霉素浓度下，载药胶束比游离阿霉素具有更强杀死癌细胞的能力。

Claims

1.一种酸敏感两亲性星状嵌段共聚物，其特征在于：该共聚物的化学结构式为：

；

式中，R₁选自

；R₂为CH₂或CH₂CH₂；m = 20～90，n = 10～80。

2.根据权利要求1所述的酸敏感两亲性星状嵌段共聚物，其特征在于，所述星状嵌段共聚物的数均分子量为6000～50000 g•mol^-1。

3.一种权利要求1所述的酸敏感两亲性星状嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 制备三官能团炔基化合物：在惰性气氛中，以

和均苯三甲酰氯为原料，以4-二甲氨基吡啶为催化剂，以无水四氢呋喃为溶剂，在25～35℃条件下缩合反应8～16小时，得到三官能团炔基化合物；

中R₂为CH₂或CH₂CH₂；

其中，所述

、均苯三甲酰氯和催化剂的摩尔比为(3.15～4.5)∶1∶3；

中R₂为CH₂或CH₂CH₂；

所述

然后以上述可降解聚酯与2-氯乙基乙烯基醚为反应物，以4-甲基苯磺酸吡啶鎓为催化剂，以二氯甲烷为溶剂，在冰水浴条件下，经过0.5～1小时反应得到酸敏感聚酯中间体；

(3) 制备酸敏感聚乙二醇单甲醚：首先在4-甲基苯磺酸吡啶鎓的催化下，以聚乙二醇单甲醚和2-氯乙基乙烯基醚为原料，在冰水浴条件下，经过0.5～1小时的反应制备末端修饰缩醛基的聚乙二醇单甲醚；然后将上述末端修饰缩醛基的聚乙二醇单甲醚与叠氮化钠在N, N-二甲基甲酰胺溶液中，于40～80℃反应30～50小时，得到酸敏感聚乙二醇单甲醚；

所述酸敏感两亲性嵌段共聚物、三官能团炔基化合物、端炔基与叠氮的环加成点击反应催化剂及催化剂配体的摩尔比为(3.15～4.5)∶1∶3∶(3～6)。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)和(5)中端炔基与叠氮的环加成点击反应催化剂分别选自氯化亚铜、溴化亚铜或碘化亚铜中的一种；催化剂配体分别选自联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述惰性气氛为氩气气氛。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)～(5)中，反应完成后，分别对产物进行提纯处理，所述纯化过程包括以下步骤：

2）酸敏感聚酯中间体的提纯处理：开环聚合反应结束后，将反应产物用旋转蒸发仪浓缩，再将浓缩液滴入乙醚中沉淀两次、抽滤，将所得产物在真空烘箱中常温干燥24～36小时，得到白色固体粉末；可降解聚酯与2-氯乙基乙烯基醚反应结束后，加入质量分数为5%的碳酸钠水溶液终止反应，并加入二氯甲烷稀释，再加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液，振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相溶液经干燥、过滤、浓缩，在乙醚中沉淀两次、抽滤，得到固体粉末，将所得固体粉末在真空烘箱中常温干燥24～36小时，得到白色固体粉末；

4）酸敏感两亲性嵌段共聚物的提纯处理：点击反应结束后，将反应产物用旋转蒸发仪浓缩，再将产物溶于二氯甲烷溶液中，加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液，振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相溶液经干燥、过滤、浓缩，在甲醇/乙醚混合液中沉淀两次、抽滤，将所得固体粉末溶于四氢呋喃溶液中，再转移到透析袋内，在去离子水中透析48～72小时，冷冻干燥，得到白色固体粉末，即为具有酸敏感的两嵌段共聚物；具有酸敏感的两嵌段共聚物与叠氮化钠反应后，将反应产物过滤、浓缩，再将浓缩液溶于二氯甲烷溶液中，加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液，振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相溶液经干燥、过滤、浓缩，在乙醚中沉淀两次、抽滤，得到固体粉末，将所得固体粉末在真空烘箱中常温干燥24～36小时，得到酸敏感两亲性嵌段共聚物；

5）酸敏感两亲性星状嵌段共聚物的提纯处理：反应结束后，将反应产物用旋转蒸发仪浓缩，再将浓缩产物溶于二氯甲烷溶液中，加入饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液，振荡后静置，分出下层有机相，水相再用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相溶液经干燥、过滤、浓缩，然后在不断搅拌下将乙醚以2～4滴/秒滴加至浓缩液中，直至浓缩液变浑浊，继续搅拌0.5～2小时，停止搅拌后倒出上清液，将沉淀物质溶于二氯甲烷溶液中，重复上述操作两遍，最后将沉淀物在真空烘箱中常温干燥24～36小时，得到酸敏感两亲性星状嵌段共聚物。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述饱和氯化钠磷酸盐缓冲溶液的pH值为10.0。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述正己烷/乙醚混合液中两者的体积比为1∶1；所述甲醇/乙醚混合液中甲醇、乙醚的体积比为1∶10。

9.权利要求1或2所述的酸敏感两亲性星状嵌段共聚物作为刺激响应性药物载体的应用。