CN105037739B - 具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物及其制备方法，该聚合物在水性介质中能自组装形成核‑壳结构的胶束，该聚合物中含有聚精氨酸结构，该结构能加快所述聚合物穿透细胞膜进入癌细胞内部的速度，同时该聚合物中含有二硫键，可被癌细胞内较高的还原势能降解。本发明还提供了一种具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物作为药物载体的应用，该载体经增强渗透和滞留效应聚集在肿瘤组织后，能够快速地进入癌细胞内部，有利于提高药物的生物利用度和治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于医药材料领域，特别涉及具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物及其制备方法，以及所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物作为药物载体的应用。
背景技术
癌症已经成为人类健康的最大威胁之一，化疗是目前治疗癌症的重要手段，但传统的抗癌药物制剂在体内的选择性差，大多数抗癌药物在杀死癌细胞的同时也会对正常组织产生一定的毒性从而引起正常细胞的死亡。近年来，以药物安全、高效治疗为目的的抗肿瘤靶向给药系统，特别是聚合物胶束的抗肿瘤靶向给药系统的研究和开发成为了药物制剂工作者的研究热点之一。
聚合物胶束是由两亲性共聚物在水性介质中自组装形成，具有内部疏水、外部亲水的核-壳结构。聚合物胶束作为纳米级药物载体材料，具有粒径小、体内外稳定性高、提高难溶性药物的溶解度、通过增强渗透和滞留效应(EPR效应)达到被动靶向的优势。研究表明，纳米载药体系进入体内后可通过EPR效应相对选择性地聚集在肿瘤部位，粒径约为400nm的脂质体囊泡容易从血管渗入肿瘤组织(MacEwan SR,Callahan DJ，etal.Nanomedicine(Lond)2010.)，也有研究表明，直径小于200nm的纳米载药体系具有更好的治疗效果(Hobbs SK,Monsky WL,et al.Proc Natl Acad Sci,1998.)。
Y.Sun等合成了主链中含二硫键的还原敏感型聚胺-胺聚合物，该聚合物装载阿霉素后形成纳米载药胶束，载药胶束可通过EPR效应在肿瘤组织中聚集，载药胶束进入肿瘤细胞后，所述聚合物因其二硫键被癌细胞内的高度还原势能还原而降解，释放出阿霉素发挥抗癌作用(Y.Sun,W.Zou,S.Bian,et al.Biomaterials,2013,34,6818–6828.)。众所周知，载药胶束在肿瘤组织中聚集只是其发挥靶向抗癌作用的基础，更关键的是载药胶束能否顺利、快速地进入癌细胞内部并释放出药物。虽然上述载药胶束可通过EPR效应聚集在肿瘤组织中，但是，给药物小分子加上载体保护层，必然就给药物小分子扩散进入癌细胞增加了一层障碍，导致载药胶束进入癌细胞的速度较慢。然而，体内环境十分复杂，聚集在肿瘤组织中的载药胶束对于机体本身而言都是异物，若聚集在肿瘤组织的载药胶束未及时地进入癌细胞内部，它们又会随着血液的全身循环被机体自身的免疫系统清除掉，导致药物的生物利用度较低。因此，开发出能够有效在肿瘤组织聚集并快速进入癌细胞内部的药物载体，对于提高抗癌药物的生物利用度，进而提高抗癌药物的疗效具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物及其制备方法，本发明还提供了一种上述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物作为药物载体的应用，以加快药物载体进入癌细胞的速度，提高药物的生物利用度和治疗效果。
本发明提供的具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物，结构式如下：
上述结构式中，x、y、z、m、n为重复单元的个数，x≥1，y≥1，z≥1，m＝20～45，n＝20～45。
上述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物中，x，y，z的值可根据实际应用需求进行调整，例如，当所述聚合物作为疏水性药物载体时，z值应占主要比重，当所述聚合物作为带负电荷的基因或者带负电荷的蛋白质载体时，x、y的值应占主要比重；x，y，z的值优选为x＝1～5，y＝1～5，z＝4～8。
上述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物在水中自组装形成纳米胶束，所述纳米胶束的粒径不超过100nm。
本发明提供的具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的制备方法，步骤如下：
(1)胱胺双丙烯酰胺单体的制备
将丙烯酰氯与二氯甲烷的混合液与胱胺二盐酸盐水溶液混合形成反应体系，在搅拌下于0～5℃向反应体系中滴加除酸剂水溶液，滴加完毕后，在10～30℃搅拌反应16～24h，固液分离，将所得固相洗涤、重结晶并真空干燥，即得胱胺双丙烯酰胺单体；
所述丙烯酰氯与二氯甲烷的混合液中，丙烯酰氯与二氯甲烷的体积比为1:(0.1～10)，所述胱胺二盐酸盐水溶液中胱胺二盐酸盐的浓度为1～100mol/L，所述反应体系中，胱胺二盐酸盐、丙烯酰氯、除酸剂的摩尔比为1:(2～10):(4～10)；
(2)Boc保护的聚胺-胺的制备
将步骤(1)所得胱胺双丙烯酰胺单体、苯乙胺和一端Boc保护的乙二胺混合，在真空条件下于100～200℃反应36～48h即得固态产物，将该固态产物溶于第一溶剂形成溶液后滴加至乙醚中，收集沉淀物并真空干燥，即得Boc保护的聚胺-胺；
所述胱胺双丙烯酰胺单体与一端Boc保护的乙二胺的摩尔比为(5～9):(1～5)，一端Boc保护的乙二胺与苯乙胺的摩尔比为(6～9):(1～4)，所述第一溶剂的用量应使固态产物在所述溶液中的浓度为1～100g/L，第一溶剂与乙醚的体积比为1:(10～30)；
(3)聚胺-胺的制备
将步骤(2)所得Boc保护的聚胺-胺、二氯甲烷和脱保护剂混合形成混合液，在搅拌下于0～5℃反应1～6h，将所得反应液滴加到乙醚中，收集沉淀物并将其真空干燥，即得聚胺-胺；所述二氯甲烷与脱保护剂的体积比为1:(1～10)，Boc保护的聚胺-胺的用量应使所述混合液中Boc保护的聚胺-胺的浓度为0.01～10mg/mL，反应液与乙醚的体积比为1:(10～30)；
或者将步骤(2)所得Boc保护的聚胺-胺与二氯甲烷混合后，在通入氯化氢气体的条件下于0～5℃反应1～6h，将所得反应液减压蒸馏除去二氯甲烷，收集沉淀产物并真空干燥，即得聚胺-胺；
(4)两亲聚乙二醇接枝的聚胺-胺接枝共聚物的制备
将步骤(3)所得聚胺-胺、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺加入第二溶剂中形成混合液，在搅拌下于10～30℃反应2～10h，将所得反应液用pH值为7～9的磷酸盐缓冲溶液透析，将透析产物冷冻干燥或真空干燥，即得两亲聚乙二醇接枝聚胺-胺的接枝共聚物；
所述聚胺-胺、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺的摩尔比为10:(8～4):1，第二溶剂的用量应使混合液中聚胺-胺的浓度为1～100mmol/L；
(5)具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的制备
将步骤(4)所得两亲聚乙二醇接枝聚胺-胺的接枝共聚物与半胱氨酸修饰的八聚精氨酸加入pH值为7～9的磷酸盐缓冲溶液中形成混合液，在搅拌下于10～30℃反应1～6h，将所得反应液用去离子水透析，将透析产物冷冻干燥或真空干燥，即得具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物；
所述两亲聚乙二醇接枝聚胺-胺的接枝共聚物与半胱氨酸修饰的八聚精氨酸的摩尔比为(1～10):1，磷酸盐缓冲溶液的用量应使混合液中半胱氨酸修饰的八聚精氨酸的浓度为1～100mmol/L。
上述方法的步骤(4)和(5)中，采用截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋进行透析。
上述方法中，所述除酸剂为无机碱，除酸剂水溶液中除酸剂的浓度为1～25mol/L。
上述方法中，所述脱保护剂为三氟乙酸或者盐酸的乙酸乙酯饱和溶液。
上述方法中，所述第一溶剂为甲醇或者N,N-二甲基甲酰胺，第二溶剂为二甲基亚砜或者N,N-二甲基甲酰胺。
上述方法中，当步骤(2)采用通入氯化氢气体的技术方案时，氯化氢气体的流量为10～20mL/min。
上述方法的步骤(2)中，在真空条件下反应的目的是为了减少氧气的阻聚作用，以提高聚合产物的分子量，真空度越高，减少氧气的阻聚作用越明显，该步骤优选在-0.3～-0.1MPa的条件下进行。
本发明还提供了一种上述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物作为药物载体的应用，所述药物为疏水性抗肿瘤药物、带负电荷的蛋白质、带负电荷的基因中的至少一种。
实际应用时，可采用以下方法制备载药胶束：
将本发明所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物溶解于溶剂中形成聚合物溶液，将药物溶解于溶剂中形成药物溶液，然后将所述聚合物溶液和药物溶液混合均匀形成混合液，将所述混合液在超声条件下滴加到去离子水中，然后装入截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中置于去离子水中透析除去小分子杂质，将透析产物浓缩、干燥即得载药胶束。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供了一种具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物，该聚合物在水性介质中能自组装形成核-壳结构的胶束，由于该聚合物中含有聚精氨酸结构，该结构能加快聚合物穿透细胞膜进入癌细胞内部的速度，同时该聚合物中的二硫键可被癌细胞内较高的还原势能降解，上述特点都是靶向药物载体的重要特质，因此本发明提供的聚合物非常适合作为药物载体使用。
2.试验表明，本发明所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物装载疏水性药物后形成的载药胶束的粒径在100nm以内(见实施例9)，该粒径范围有利于其通过EPR效应快速地在肿瘤组织聚集，从而降低药物对正常组织的毒副作用。
3.由于本发明所述聚合物中含有聚精氨酸结构，该聚合物在水性介质中自组装形成胶束之后，亲水的精氨酸结构位于胶束的表面，一方面，由于精氨酸具有特殊的螺旋结构及胍基基团，精氨酸可与细胞膜表面所含有的大量富含电荷的多糖及磷脂作用，胍基与细胞膜表面的羧基、磷酰基、磺酰基形成较强的多重氢键，能有效跨膜内吞，从而更快地穿透细胞膜，加快载体的入胞速度，进而提高治疗效果(见实施例11、12)，另一方面，精氨酸结构中富含各级氨基，在肿瘤细胞的酸性条件下可携带大量正电荷，因而本发明所述聚合物在装载疏水性药物的同时还能负载带负电荷的蛋白质以及带负电荷的基因，用于疾病的协同治疗，载药方式更加多样化。
4.肿瘤细胞内部因含有高浓度的谷胱甘肽而具有较高的还原势能，本发明所述聚合物中的二硫键在肿瘤细胞内部高还原势能条件下会被还原而降解，当本发明所述聚合物装载药物形成载药胶束进入肿瘤细胞内部之后，载药胶束因二硫键被还原而降解，从而在癌细胞内部释放出药物而发挥治疗作用，由于正常细胞内不具还原降解二硫键的条件，因而载药胶束在正常细胞中不会被降解、也不会释放药物(见实施例7)，并且，在胶束的聚乙二醇等亲水性外壳能保护药物分子在传递的过程中不被降解，这不但有利于提高药物的利用率，还能降低药物对正常组织的毒副作用。
5.实验表明，本发明所述聚合物具有良好的生物相容性，无明显细胞毒性，是一种安全的药物载体材料(见实施例8)。
6.本发明还提供了一种上述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的制备方法，该方法操作简单，工艺条件温和，采用常规设备即可实现生产。
附图说明
图1是实施例1制备的具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的核磁氢谱图；
图2是实施例7的胶束降解性能测试结果图；
图3是实施例8的细胞毒性测试结果图；
图4是实施例10中载药胶束和对照载药胶束对癌细胞的毒性测试结果图；
图5是实施例11中的流式细胞测试结果图；
图6是实施例12中各试剂的体内抗肿瘤效果测试结果图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物及其制备方法，以及所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物作为药物载体的应用作进一步说明。
下述各实施例中，所使用的各种原料和试剂均为市售商品，所述小鼠成纤维细胞(L929)、小鼠乳腺癌细胞(4T-1)、人肝癌细胞(HepG2)均购自中国科学院细胞库。所述磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)的配制方法为：(1)配制1/15mol/L的KH2PO4水溶液，即在每升水中溶解9.078g KH2PO4；(2)配制1/15mol/L的Na2HPO4·2H2O水溶液，即每升水中溶解11.876gNa2HPO4·2H2O；(3)将步骤(1)配制的溶液缓慢滴加到步骤(2)配制的溶液中，边搅拌边测pH值，当pH值达到下述各实施例要求的7～9时，停止滴加即得相应pH值的PBS溶液。
实施例1
本实施例中，具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的结构式为：
其制备方法如下：
(1)胱胺双丙烯酰胺单体(BCA)的制备
按照胱胺二盐酸盐、丙烯酰氯以及除酸剂氢氧化钠的摩尔比为1:.2.5:4.5计量胱胺二盐酸盐、丙烯酰氯以及氢氧化钠，将丙烯酰氯与二氯甲烷按照1:10的体积比混合形成混合液，将胱胺二盐酸盐溶于去离子水中形成胱胺二盐酸盐浓度为10mol/L的胱胺二盐酸盐水溶液，将氢氧化钠溶解在去离子水中形成氢氧化钠浓度为20mol/L为的氢氧化钠水溶液；
将丙烯酰氯与二氯甲烷的混合液与胱胺二盐酸盐水溶液混合形成反应体系，在搅拌下于5℃向反应体系中滴加上述氢氧化钠水溶液，滴加完毕后，在10℃搅拌反应24h，过滤，将所得固态产物用去离子水洗涤3次以除去未反应的原料和副产物，真空干燥得到粗产品，将所得粗产品用乙酸乙酯溶解并重结晶，过滤出重结晶产物并真空干燥，即得BCA；
(2)Boc保护的聚胺-胺(Boc-PAA)的制备
将步骤(1)所得BCA、苯乙胺和一端Boc保护的乙二胺混合，在-0.1MPa条件下于125℃反应48h即得固态产物，将该固态产物溶于甲醇形成溶液后滴加至乙醚中进行沉淀以除去未反应的原料和副产物，收集沉淀物并真空干燥，即得Boc-PAA；
所述胱胺双丙烯酰胺单体与一端Boc保护的乙二胺的摩尔比为7:3，一端Boc保护的乙二胺与苯乙胺的摩尔比为7:3，所述第甲醇的用量应使所述固态产物在溶液中的浓度为50g/L，甲醇与乙醚的体积比为1:20；
(3)聚胺-胺(PAA)的制备
将步骤(2)所得Boc-PAA、二氯甲烷和脱保护剂三氟乙酸混合形成混合液，在搅拌下于0℃反应2h，将所得反应液滴加到乙醚中进行沉淀，收集沉淀物并将其真空干燥，即得PAA；所述二氯甲烷与三氟乙酸的体积比为1:3，Boc-PAA的用量应使所述混合液中Boc-PAA的浓度为10mg/mL，反应液与乙醚的体积比为1:20；
(4)两亲聚乙二醇接枝的聚胺-胺接枝共聚物(PAA-g-PEG-MAL)的制备
将步骤(3)所得PAA、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇(NHS-PEG1K)、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(NHS-PEG2K-MAL)加入二甲基亚砜(DMSO)中形成混合液，在搅拌下于30℃反应4h，将所得反应液装入截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中，置于pH值为7.4的PBS溶液透析96h，将透析产物真空干燥，即得PAA-g-PEG-MAL；
所述PAA、NHS-PEG1K、NHS-PEG2K-MAL的摩尔比为10:6:1，DMSO的用量应使混合液中PAA的浓度为20mmol/L；
(5)具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物(PAA-g-PEG/PArg)的制备
将步骤(4)所得PAA-g-PEG-MAL与半胱氨酸修饰的八聚精氨酸(PArg-SH)加入pH值为7.4的PBS溶液中形成混合液，在搅拌下于30℃反应2h，将所得反应液装入截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中，置于去离子水透析96h，将透析产物冷冻干燥，即得具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物PAA-g-PEG/PArg；所述PAA-g-PEG-MAL与PArg-SH的摩尔比为10:1，PBS溶液的用量应使混合液中PArg-SH的浓度为10mmol/L。
本实施例制备的PAA-g-PEG/PArg的核磁氢谱图如图1所示，图1中，2.4、2.6、2.8ppm左右的峰是聚胺-胺聚合物主链上的氢的特征峰，三峰的比例约为2:1:2，说明在反应过程中主链结构保持完好未被破坏；3.1、3.3、3.5、3.7ppm左右的峰是聚乙二醇的特征峰，说明聚乙二醇也连接到了主链上；1.5、1.75、4.5ppm处的三个峰是精氨酸上的氢的特征峰，三峰的比例约为2:2:1，说明聚精氨酸接枝了到聚合物上。
实施例2
本实施例中，具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的结构式为：
其制备方法如下：
(1)胱胺双丙烯酰胺单体(BCA)的制备
按照胱胺二盐酸盐、丙烯酰氯以及除酸剂氢氧化钠的摩尔比为1:2:4计量胱胺二盐酸盐、丙烯酰氯以及氢氧化钠，将丙烯酰氯与二氯甲烷按照1:0.1的体积比混合形成混合液，将胱胺二盐酸盐溶于去离子水中形成胱胺二盐酸盐浓度为1moL/L的胱胺二盐酸盐水溶液，将氢氧化钠溶解在去离子水中形成氢氧化钠浓度为1moL/L为的氢氧化钠水溶液；
将丙烯酰氯与二氯甲烷的混合液与胱胺二盐酸盐水溶液混合形成反应体系，在搅拌下于0℃向反应体系中滴加上述氢氧化钠水溶液，滴加完毕后，在10℃搅拌反应16h，过滤，将所得固态产物用去离子水洗涤3次以除去未反应的原料和副产物，真空干燥得到粗产品，将所得粗产品用乙酸乙酯溶解并重结晶，过滤出重结晶产物并真空干燥，即得BCA；
(2)Boc保护的聚胺-胺(Boc-PAA)的制备
将步骤(1)所得BCA、苯乙胺和一端Boc保护的乙二胺混合，在-0.3MPa条件下于100℃反应36h即得固态产物，将该固态产物溶于甲醇形成溶液后滴加至乙醚中进行沉淀以除去未反应的原料和副产物，收集沉淀物并真空干燥，即得Boc-PAA；
所述胱胺双丙烯酰胺单体与一端Boc保护的乙二胺的摩尔比为9:1，一端Boc保护的乙二胺与苯乙胺的摩尔比为9:1，所述甲醇的用量应使所述固态产物在溶液中的浓度为1g/L，甲醇与乙醚的体积比为1:10；
(3)聚胺-胺(PAA)的制备
将步骤(2)所得Boc-PAA、二氯甲烷和脱保护剂三氟乙酸混合形成混合液，在搅拌下于0℃反应1h，将所得反应液滴加到乙醚中进行沉淀，收集沉淀物并将其真空干燥，即得PAA；所述二氯甲烷与三氟乙酸的体积比为1:1，Boc-PAA的用量应使所述混合液中Boc-PAA的浓度为0.01mg/mL，反应液与乙醚的体积比为1:10；
(4)两亲聚乙二醇接枝的聚胺-胺接枝共聚物(PAA-g-PEG-MAL)的制备
将步骤(3)所得PAA、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇(NHS-PEG1K)、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(NHS-PEG2K-MAL)加入二甲基亚砜(DMSO)中形成混合液，在搅拌下于10℃反应2h，将所得反应液装入截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中，置于pH值为7的PBS溶液透析48h，将透析产物真空干燥，即得PAA-g-PEG-MAL；
所述PAA、NHS-PEG1K、NHS-PEG2K-MAL的摩尔比为10:8:1，DMSO的用量应使混合液中PAA的浓度为1mmol/L；
(5)具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物(PAA-g-PEG/PArg)的制备
将步骤(4)所得PAA-g-PEG-MAL与半胱氨酸修饰的八聚精氨酸(PArg-SH)加入pH值为7的PBS溶液中形成混合液，在搅拌下于30℃反应1h，将所得反应液装入截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中，置于去离子水透析48h，将透析产物真空干燥，即得具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物PAA-g-PEG/PArg；所述PAA-g-PEG-MAL与PArg-SH的摩尔比为10:1，PBS溶液的用量应使混合液中PArg-SH的浓度为1mmoL/L。
本实施例制备的PAA-g-PEG/PArg的核磁氢谱图的特征峰与图1中的特征峰一致。
实施例3
本实施例中，具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的结构式为：
其制备方法如下：
(1)胱胺双丙烯酰胺单体(BCA)的制备
按照胱胺二盐酸盐、丙烯酰氯以及除酸剂氢氧化钾的摩尔比为1:10:8计量胱胺二盐酸盐、丙烯酰氯以及氢氧化钾，将丙烯酰氯与二氯甲烷按照1:10的体积比混合形成混合液，将胱胺二盐酸盐溶于去离子水中形成胱胺二盐酸盐浓度为100moL/L的胱胺二盐酸盐水溶液，将氢氧化钾溶解在去离子水中形成氢氧化钾浓度为25moL/L为的氢氧化钾水溶液；
将丙烯酰氯与二氯甲烷的混合液与胱胺二盐酸盐水溶液混合形成反应体系，在搅拌下于5℃向反应体系中滴加上述氢氧化钾水溶液，滴加完毕后，在30℃搅拌反应24h，过滤，将所得固态产物用去离子水洗涤3次以除去未反应的原料和副产物，真空干燥得到粗产品，将所得粗产品用乙酸乙酯溶解并重结晶，过滤出重结晶产物并真空干燥，即得BCA；
(2)Boc保护的聚胺-胺(Boc-PAA)的制备
将步骤(1)所得BCA、苯乙胺和一端Boc保护的乙二胺混合，在-0.1MPa条件下于125℃反应48h即得固态产物，将该固态产物溶于甲醇形成溶液后滴加至乙醚中进行沉淀以除去未反应的原料和副产物，收集沉淀物并真空干燥，即得Boc-PAA；
所述胱胺双丙烯酰胺单体与一端Boc保护的乙二胺的摩尔比为8:2，一端Boc保护的乙二胺与苯乙胺的摩尔比为8:2，所述第甲醇的用量应使所述固态产物在溶液中的浓度为100g/L，甲醇与乙醚的体积比为1:10；
(3)聚胺-胺(PAA)的制备
将步骤(2)所得Boc-PAA、二氯甲烷和脱保护剂三氟乙酸混合形成混合液，在搅拌下于0℃反应6h，将所得反应液滴加到乙醚中进行沉淀，收集沉淀物并将其真空干燥，即得PAA；所述二氯甲烷与三氟乙酸的体积比为1:10，Boc-PAA的用量应使所述混合液中Boc-PAA的浓度为10mg/mL，反应液与乙醚的体积应比为1:30；
(4)两亲聚乙二醇接枝的聚胺-胺接枝共聚物(PAA-g-PEG-MAL)的制备
将步骤(3)所得PAA、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇(NHS-PEG1K)、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(NHS-PEG2K-MAL)加入二甲基亚砜(DMSO)中形成混合液，在搅拌下于30℃反应10h，将所得反应液装入截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中，置于pH值为7.4的PBS溶液透析96h，将透析产物冷冻干燥，即得PAA-g-PEG-MAL；
所述PAA、NHS-PEG1K、NHS-PEG2K-MAL的摩尔比为10:7:1，DMSO的用量应使混合液中PAA的浓度为100mmol/L；
(5)具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物(PAA-g-PEG/PArg)的制备
将步骤(4)所得PAA-g-PEG-MAL与半胱氨酸修饰的八聚精氨酸(PArg-SH)加入pH值为7.4的PBS溶液形成混合液，在搅拌下于10℃反应6h，将所得反应液装入截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中，置于去离子水透析96h，将透析产物冷冻干燥，即得具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物PAA-g-PEG/PArg；所述PAA-g-PEG-MAL与PArg-SH的摩尔比为10:1，PBS溶液的用量应使混合液中PArg-SH的浓度为100mmol/L。
本实施例制备的PAA-g-PEG/PArg的核磁氢谱图的特征峰与图1中的特征峰一致。
实施例4
本实施例中，具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的结构式为：
其制备方法如下：
(1)胱胺双丙烯酰胺单体(BCA)的制备
按照胱胺二盐酸盐、丙烯酰氯以及除酸剂氢氧化钠的摩尔比为1:.6:10计量胱胺二盐酸盐、丙烯酰氯以及氢氧化钠，将丙烯酰氯与二氯甲烷按照1:1的体积比混合形成混合液，将胱胺二盐酸盐溶于去离子水中形成胱胺二盐酸盐浓度为15mol/L的胱胺二盐酸盐水溶液，将氢氧化钠溶解在去离子水中形成氢氧化钠浓度为10mol/L为的氢氧化钠水溶液；
将丙烯酰氯与二氯甲烷的混合液与胱胺二盐酸盐水溶液混合形成反应体系，在搅拌下于5℃向反应体系中滴加上述氢氧化钠水溶液，滴加完毕后，在25℃搅拌反应16h，过滤，将所得固态产物用去离子水洗涤3次以除去未反应的原料和副产物，真空干燥得到粗产品，将所得粗产品用乙酸乙酯溶解并重结晶，过滤出重结晶产物并真空干燥，即得BCA；
(2)Boc保护的聚胺-胺(Boc-PAA)的制备
将步骤(1)所得BCA、苯乙胺和一端Boc保护的乙二胺混合，在-0.1MPa条件下于125℃反应48h即得固态产物，将该固态产物溶于甲醇形成溶液后滴加至乙醚中进行沉淀以除去未反应的原料和副产物，收集沉淀物并真空干燥，即得Boc-PAA；
所述胱胺双丙烯酰胺单体与一端Boc保护的乙二胺的摩尔比为6:4，一端Boc保护的乙二胺与苯乙胺的摩尔比为6:4，所述第甲醇的用量应使所述固态产物在溶液中的浓度为20g/L，甲醇与乙醚的体积比为1:15；
(3)聚胺-胺(PAA)的制备
将步骤(2)所得Boc-PAA、二氯甲烷和脱保护剂盐酸的乙酸乙酯饱和溶液混合形成混合液，在搅拌下于0℃反应3h，将所得反应液滴加到乙醚中进行沉淀，收集沉淀物并将其真空干燥，即得PAA；所述二氯甲烷与盐酸的乙酸乙酯饱和溶液的体积比为1:5，Boc-PAA的用量应使所述混合液中Boc-PAA的浓度为1mg/mL，反应液与乙醚的体积比为1:10；
(4)两亲聚乙二醇接枝的聚胺-胺接枝共聚物(PAA-g-PEG-MAL)的制备
将步骤(3)所得PAA、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇(NHS-PEG1K)、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(NHS-PEG2K-MAL)加入二甲基亚砜(DMSO)中形成混合液，在搅拌下于20℃反应6h，将所得反应液装入截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中，置于pH值为9的PBS溶液透析48h，将透析产物冷冻干燥，即得PAA-g-PEG-MAL；
所述PAA、NHS-PEG1K、NHS-PEG2K-MAL的摩尔比为10:5:1，DMSO的用量应使混合液中PAA的浓度为5mmol/L；
(5)具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物(PAA-g-PEG/PArg)的制备
将步骤(4)所得PAA-g-PEG-MAL与半胱氨酸修饰的八聚精氨酸(PArg-SH)加入pH值为9的PBS溶液形成混合液，在搅拌下于20℃反应3.5h，将所得反应液装入截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中，置于去离子水透析48h，将透析产物冷冻干燥，即得具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物PAA-g-PEG/PArg；所述PAA-g-PEG-MAL与PArg-SH的摩尔比为10:1，PBS溶液的用量应使混合液中PArg-SH的浓度为10mmol/L。
本实施例制备的PAA-g-PEG/PArg的核磁氢谱图的特征峰与图1中的特征峰一致。
实施例5
本实施例中，具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的结构式为：
其制备方法如下：
(1)胱胺双丙烯酰胺单体(BCA)的制备
按照胱胺二盐酸盐、丙烯酰氯以及除酸剂氢氧化钠的摩尔比为1:.4:8计量胱胺二盐酸盐、丙烯酰氯以及氢氧化钠，将丙烯酰氯与二氯甲烷按照1:10的体积比混合形成混合液，将胱胺二盐酸盐溶于去离子水中形成胱胺二盐酸盐浓度为10mol/L的胱胺二盐酸盐水溶液，将氢氧化钠溶解在去离子水中形成氢氧化钠浓度为20mol/L为的氢氧化钠水溶液；
将丙烯酰氯与二氯甲烷的混合液与胱胺二盐酸盐水溶液混合形成反应体系，在搅拌下于5℃向反应体系中滴加上述氢氧化钠水溶液，滴加完毕后，在10℃搅拌反应24h，过滤，将所得固态产物用去离子水洗涤3次以除去未反应的原料和副产物，真空干燥得到粗产品，将所得粗产品用乙酸乙酯溶解并重结晶，过滤出重结晶产物并真空干燥，即得BCA；
(2)Boc保护的聚胺-胺(Boc-PAA)的制备
将步骤(1)所得BCA、苯乙胺和一端Boc保护的乙二胺混合，在-0.1MPa条件下于125℃反应48h即得固态产物，将该固态产物溶于甲醇形成溶液后滴加至乙醚中进行沉淀以除去未反应的原料和副产物，收集沉淀物并真空干燥，即得Boc-PAA；
所述胱胺双丙烯酰胺单体与一端Boc保护的乙二胺的摩尔比为5:5，一端Boc保护的乙二胺与苯乙胺的摩尔比为7:3，所述第甲醇的用量应使所述固态产物在溶液中的浓度为1g/L，甲醇与乙醚的体积比为1:20；
(3)聚胺-胺(PAA)的制备
将步骤(2)所得Boc-PAA与二氯甲烷混合后，在通入氯化氢气体的条件下于0℃反应2h，氯化氢气体的流量为10mL/min，将所得反应液用旋转蒸发仪旋干，旋转蒸发的温度为50℃、旋转速度为70r/min，收集沉淀产物并真空干燥，即得PAA；
(4)两亲聚乙二醇接枝的聚胺-胺接枝共聚物(PAA-g-PEG-MAL)的制备
将步骤(3)所得PAA、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇(NHS-PEG1K)、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(NHS-PEG2K-MAL)加入二甲基亚砜(DMSO)中形成混合液，在搅拌下于30℃反应4h，将所得反应液装入截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中，置于pH值为7.4的PBS溶液透析96h，将透析产物冷冻干燥，即得PAA-g-PEG-MAL；
所述PAA、NHS-PEG1K、NHS-PEG2K-MAL的摩尔比为10:4:1，DMSO的用量应使混合液中PAA的浓度为20mmol/L；
(5)具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物(PAA-g-PEG/PArg)的制备
将步骤(4)所得PAA-g-PEG-MAL与半胱氨酸修饰的八聚精氨酸(PArg-SH)加入pH值为7.4的PBS溶液形成混合液，在搅拌下于30℃反应2h，将所得反应液装入截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中，置于去离子水透析96h，将透析产物冷冻干燥，即得具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物PAA-g-PEG/PArg；所述PAA-g-PEG-MAL与PArg-SH的摩尔比为10:1，PBS溶液的用量应使混合液中PArg-SH的浓度为10mmol/L。
本实施例制备的PAA-g-PEG/PArg的核磁氢谱图的特征峰与图1中的特征峰一致。
实施例6：制备空白胶束
取实施例1～5制备的具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物各10mg，分别溶于5mLDMSO中形成5种具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物溶液，然后分别取5个盛有20mLPBS溶液(pH＝7.4)的容器置于超声波清洗器中，在功率为200W的条件下，将所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物溶液分别滴加至上述5个盛有PBS溶液的容器中，滴加完毕后，将5个容器中的液相分别装入5个截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中，置于3L PBS溶液(pH＝7.4)透析，每隔4h更换一次新鲜的PBS溶液，共透析48h。将透析后的溶液浓缩至具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的浓度为1mg/mL得到5个空白胶束，按照实施例1～5的顺序依次记作1～5#空白胶束，分别取1～5#空白胶束进行动态光散射(Dynamic Light Scattering,DLS)测试，测得各空白胶束的平均粒径和多分散性系数(PDI)如表1所示。
表1空白胶束的平均粒径和多分散性系数
由表1可知，本实施例制备的具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物在模拟生理条件下能形成稳定的纳米胶束，胶束的粒径均在100nm以内，这有利于通过EPR效应聚集在肿瘤部位。
实施例7：胶束降解性能测试
取实施例6制备的1#空白胶束15mL并将其平均分配在3个锥形瓶中，向3个锥形瓶中分别加入二硫苏糖醇(DTT)，使DTT在上述3个锥形瓶中的终浓度分别为0mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L，然后将3个锥形瓶置于37℃的摇床中以100r/min的速度摇晃，每间隔一定时间测定锥形瓶中胶束的粒径，结果如图2所示。由图2可知，本发明所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物形成的纳米胶束在正常的生理条件下可保持其胶束状态，但在还原剂存在的状态下，纳米胶束会被降解，且还原势能越高，纳米胶束的降解速度越快。
实施例8：细胞毒性测试
分别将小鼠成纤维细胞(L929)、小鼠乳腺癌细胞(4T-1)、人肝癌细胞(HepG2)与实施例6制备的1#空白胶束共培养，通过MTT实验检测具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的胶束的细胞毒性。
L929和4T-1培养在RPMI-1640培养基中，HepG2培养在DMEM培养基中，在两种基础培养基中分别加入10％的澳大利亚小牛血清和1％的双抗(100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素)，将细胞培养在37℃,5％CO2的培养箱中。当培养皿中的细胞长到85％～90％满时，以6×103cells/well的密度接种到96孔板中，待细胞重新贴壁之后，弃去培养基，将预先配制好的含有不同浓度(浓度分别为0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、10、100μg/mL)的3#空白胶束的新鲜培养基加入相应的孔中，培养48h后，在每个孔中加入20μL MTT的PBS溶液(5mg/mL)，在37℃的环境中孵育4h，弃去培养基，每孔加入200μL的DMSO，震荡10min，用酶联免疫检测仪测定波长490nm处的光密度值(OD)，通过与阴性对照组的OD值比较得到各实验组的细胞存活率，结果如图3所示。由图3可知，由本发明所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物制备的胶束无明显的细胞毒性。
实施例9：制备载药胶束
1、取4mg实施例1制备的具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物(PAA-g-PEG/PArg)，并将其溶解于400μL DMSO中，取1mg阿霉素(DOX)溶解于100μL DMSO中，然后将二者混合均匀得到混合液，然后取盛有10mL去离子水的容器置于超声波清洗器中，在功率为200W的条件下，将所述混合液滴加至所述去离子水中，滴加完毕后，继续超声30min，将容器中的液相装入截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中，置于大量的去离子水中透析，前6h每隔1h更换一次新鲜的去离子水，此后每隔4h更换一次新鲜的去离子水，共透析48h，将透析后的溶液浓缩至PAA-g-PEG/PArg的浓度为1mg/mL，即得载有阿霉素的载药胶束。
2、分别取实施例2～5制备的PAA-g-PEG/PArg，按照步骤1的操作，制备载药胶束。
3、取上述载有阿霉素的胶束进行动态光散射(Dynamic Light Scattering,DLS)测试，测得各载药胶束的平均粒径和多分散性系数(PDI)如表2所示。
4、取各载药胶束测定载药量，载药量＝所载阿霉素质量/阿霉素与胶束的总质量×100％，具体测定方法为：先利用紫外分光光度法测出1mL载药胶束溶液中阿霉素的质量，记为O，放入一个质量为M的西林瓶中，冷冻干燥后称总质量，记为N，载药量计算公式为O/(N-M)×100％，结果如表2所示。
表2载药胶束的平均粒径、多分散性系数和载药量
由表2可知，上述载药胶束的平均粒径仍然维持在100nm以内，这有利于通过EPR效应聚集在肿瘤部位。
对比例1
本对比例中，首先制备未经精氨酸修饰的还原敏感型聚合物，然后使用其制备载有阿霉素的胶束
1、按照实施例2的步骤(1)～(4)的操作，制备得到未经精氨酸修饰的还原敏感型聚合物；
2、按照实施例9步骤1的操作，使用上述未经精氨酸修饰的还原敏感型聚合物制备载有阿霉素的对照载药胶束。
3、按照实施例6的操作，使用上述未经精氨酸修饰的还原敏感型聚合物制备对照空白胶束。
实施例10
将小鼠乳腺癌细胞(4T-1)培养在RPMI-1640培养基中，在基础培养基中分别加入10％的澳大利亚小牛血清和1％的双抗(100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素)，将细胞培养在37℃,5％CO2的培养箱中。当培养皿中的细胞长到85％～90％满时，以6×103cells/well的密度接种到96孔板中，待细胞重新贴壁之后，弃去培养基，将预先配制好的含有不同浓度的实施例9中以实施例1的PAA-g-PEG/PArg为基础制备的载药胶束和对比例1制备的对照载药胶束的新鲜培养基(其中阿霉素的浓度分别为0、0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、10、100μg/mL)加入相应的孔中，培养48h之后，进行MTT测试，结果如图4所示。由图4可知，同样经过48小时，经实施例9制备的载药胶束处理后的4T-1细胞的存活率较对比例1制备的对照载药胶束处理后的4T-1的细胞存活率更低，说明基于本发明所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物载药胶束能更快地进入细胞内并释放药物，具有更强的抗癌效果。
实施例11
将人肝癌细胞(HepG2)培养在RPMI-1640培养基中，在基础培养基中分别加入10％的澳大利亚小牛血清和1％的双抗(100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素)，将细胞培养在37℃,5％CO2的培养箱中。当培养皿中的细胞长到85％～90％满时，将HepG2以4×105cells/well的密度接种到6孔板中，待细胞重新贴壁之后，弃去培养基，将预先配置好的含有不同浓度的实施例9中以实施例4的PAA-g-PEG/PArg为基础制备的载药胶束、对比例1制备的对照载药胶束以及盐酸阿霉素的新鲜培养基加入相应的孔中，分别培养0.5h和2h之后，进行流式细胞测试，测试结果如图5所示，图5中，横坐标表示阿霉素的荧光强度，纵坐标表示细胞个数，图5(A)(B)分别为盐酸阿霉素与HepG2作用0.5h和2h的测试结果，图5(C)(D)分别为对比例1制备的对照载药胶束与HepG2作用0.5h和2h的测试结果，图5(E)(F)分别为实施例9制备的载药胶束与HepG2作用0.5h和2h的测试结果。由图5可知，与盐酸阿霉素及对比例1制备的对照载药胶束相比，实施例9制备的载药胶束能在短时间内更快地进入细胞释放药物。
实施例12
1、实验用试剂
试剂A为pH值为7.4的PBS溶液；
试剂B为对比例1的步骤3制备的对照空白胶束；
试剂C为对比例1的步骤2制备的对照载药胶束；
试剂D为实施例6制备的3#空白胶束；
试剂E为实施例9制备的以实施例1所述PAA-g-PEG/PArg为基础的载药胶束；
试剂B～E均用pH值为7.4的PBS溶液配制成所需浓度；
试剂F为盐酸阿霉素水溶液，由盐酸阿霉素与去离子水配制而成。
2、将6周大的Balb/c小鼠(购自四川大学实验动物中心)48只随机分为6组，在SPF级环境下正常饲养1周之后，通过给每只小鼠皮下注射入2×1064T-1细胞建立肿瘤模型，当肿瘤长到黄豆大小时，分别给6组小鼠以每只125μL的量，将试剂A～F通过尾静脉注射入小鼠体内，载药胶束和盐酸阿霉素的给药剂量为10mg(阿霉素)/kg(小鼠体重)。
在注射后的第3、5、7、9、11天用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长度与宽度，按照肿瘤体积V＝0.5×长度×宽度2计算各只小鼠的肿瘤体积。最终的抗肿瘤活性以相对肿瘤体积来体现，相对肿瘤体积(％)＝(测量当天肿瘤体积/第一次给药前的肿瘤体积)×100％。本实施例中，各试剂对小鼠的抗肿瘤效果如图6所示，由图6可知，基于本发明所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的载药胶束(试剂E)比对比例1制备的对照载药胶束(试剂C)和自由阿霉素(试剂F)均具有更强的抑制肿瘤的效果。
Claims (10)
1.具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物，其特征在于结构式如下：
上述结构式中，x、y、z、m、n为重复单元的个数，x≥1，y≥1，z≥1，m＝20～45，n＝20～45。
2.根据权利要求1所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物，其特征在于：x＝1～5，y＝1～5，z＝4～8。
3.根据权利要求1或2所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物，其特征在于该聚合物在水中自组装形成纳米胶束，所述纳米胶束的粒径不超过100nm。
4.具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)胱胺双丙烯酰胺单体的制备
将丙烯酰氯与二氯甲烷的混合液与胱胺二盐酸盐水溶液混合形成反应体系，在搅拌下于0～5℃向反应体系中滴加除酸剂水溶液，滴加完毕后，在10～30℃搅拌反应16～24h，固液分离，将所得固相洗涤、重结晶并真空干燥，即得胱胺双丙烯酰胺单体；
所述丙烯酰氯与二氯甲烷的混合液中，丙烯酰氯与二氯甲烷的体积比为1:(0.1～10)，所述胱胺二盐酸盐水溶液中胱胺二盐酸盐的浓度为1～100mol/L，所述反应体系中，胱胺二盐酸盐、丙烯酰氯、除酸剂的摩尔比为1:(2～10):(4～10)；
(2)Boc保护的聚胺-胺的制备
将步骤(1)所得胱胺双丙烯酰胺单体、苯乙胺和一端Boc保护的乙二胺混合，在真空条件下于100～200℃反应36～48h即得固态产物，将该固态产物溶于第一溶剂形成溶液后滴加至乙醚中，收集沉淀物并真空干燥，即得Boc保护的聚胺-胺；
所述胱胺双丙烯酰胺单体与一端Boc保护的乙二胺的摩尔比为(5～9):(1～5)，一端Boc保护的乙二胺与苯乙胺的摩尔比为(6～9):(1～4)，所述第一溶剂的用量应使固态产物在所述溶液中的浓度为1～100g/L，第一溶剂与乙醚的体积比为1:(10～30)；
(3)聚胺-胺的制备
将步骤(2)所得Boc保护的聚胺-胺、二氯甲烷和脱保护剂混合形成混合液，在搅拌下于0～5℃反应1～6h，将所得反应液滴加到乙醚中，收集沉淀物并将其真空干燥，即得聚胺-胺；所述二氯甲烷与脱保护剂的体积比为1:(1～10)，Boc保护的聚胺-胺的用量应使所述混合液中Boc保护的聚胺-胺的浓度为0.01～10mg/mL，反应液与乙醚的体积比为1:(10～30)；
或者将步骤(2)所得Boc保护的聚胺-胺与二氯甲烷混合后，在通入氯化氢气体的条件下于0～5℃反应1～6h，将所得反应液减压蒸馏除去二氯甲烷，收集沉淀产物并真空干燥，即得聚胺-胺；
(4)两亲聚乙二醇接枝的聚胺-胺接枝共聚物的制备
将步骤(3)所得聚胺-胺、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺加入第二溶剂中形成混合液，在搅拌下于10～30℃反应2～10h，将所得反应液用pH值为7～9的磷酸盐缓冲溶液透析，将透析产物冷冻干燥或真空干燥，即得两亲聚乙二醇接枝聚胺-胺的接枝共聚物；
所述聚胺-胺、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇、N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺的摩尔比为10:(8～4):1，第二溶剂的用量应使混合液中聚胺-胺的浓度为1～100mmol/L；
(5)具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的制备
将步骤(4)所得两亲聚乙二醇接枝聚胺-胺的接枝共聚物与半胱氨酸修饰的八聚精氨酸加入pH值为7～9的磷酸盐缓冲溶液中形成混合液，在搅拌下于10～30℃反应1～6h，将所得反应液用去离子水透析，将透析产物冷冻干燥或真空干燥，即得具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物；
所述两亲聚乙二醇接枝聚胺-胺的接枝共聚物与半胱氨酸修饰的八聚精氨酸的摩尔比为(1～10):1，磷酸盐缓冲溶液的用量应使混合液中半胱氨酸修饰的八聚精氨酸的浓度为1～100mmol/L。
5.根据权利要求4所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的制备方法，其特征在于步骤(4)和(5)中，采用截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋进行透析。
6.根据权利要求4或5所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的制备方法，其特在于所述除酸剂为无机碱，除酸剂水溶液中除酸剂的浓度为1～25mol/L。
7.根据权利要求4或5所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的制备方法，其特征在于所述脱保护剂为三氟乙酸或者盐酸的乙酸乙酯饱和溶液。
8.根据权利要求4或5所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物的制备方法，其特征在于所述第一溶剂为甲醇或者N,N-二甲基甲酰胺，第二溶剂为二甲基亚砜或者N,N-二甲基甲酰胺。
9.权利要求1至3中任一权利要求所述具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物作为药物载体的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于所述药物为疏水性抗肿瘤药物、带负电荷的蛋白质、带负电荷的基因中的至少一种。
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2015
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