CN102266288A - 一种基于胆固醇修饰的还原敏感性肿瘤靶向脂质体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于胆固醇修饰的还原敏感性肿瘤靶向脂质体，所述的脂质体由磷脂、胆固醇、胆固醇衍生物（包括修饰有配体的胆固醇-聚乙二醇-配体嵌合物/Cho-PEG-X和具有二硫键的还原敏感性胆固醇-聚乙二醇嵌合物/Cho-S-S-PEG）组成，该脂质体既能够充分利用聚乙二醇延长脂质体循环时间和配体促进脂质体识别和进入肿瘤细胞的优势，又能够克服配体的非特异性结合和聚乙二醇妨碍入胞的缺点，是一种有很有潜力的用于肿瘤靶向治疗的载体。并且与在磷脂上进行修饰所得的脂质体相比，具有稳定性更好，成本更低，更易于产业化转化的优点。

Description

一种基于胆固醇修饰的还原敏感性肿瘤靶向脂质体

技术领域

本发明专利涉及药物制剂技术领域，主要涉及作为药物递送载体的一种基于胆固醇修饰衍生物制备的还原敏感性肿瘤靶向脂质体及其治疗用途。

背景技术

恶性肿瘤一直是困扰人类的重要疾病，目前尚无治愈癌症的方法。常用的化学药物疗法，由于其选择性差，毒副作用大，在应用上受到极大的限制。因此，开发一种能将化疗药物选择性地浓集在肿瘤组织，并且将其高效地载入肿瘤细胞的具有肿瘤靶向性的载体就具有十分重要的意义。

脂质体因具有良好的生物相容性，对被包载的药物具有保护作用以及良好的药动学特征被认为是非常有前途的肿瘤靶向载体。通常脂质体实现肿瘤靶向可以通过两种方式：被动靶向和主动靶向。在脂质体表面引入PEG后可以延长其循环时间，有利于其充分利用EPR效应蓄积在肿瘤组织，可实现被动靶向；在脂质体表面连接配体或抗体，可以使脂质体获得主动靶向性。

脂质体要实现高效的肿瘤靶向传递需在体内需要经历以下过程：脂质体在肿瘤组织蓄积→脂质体进入肿瘤细胞→进入细胞后的传递过程。传统的长循环材料PEG又像一道屏障，会妨碍脂质体与细胞的直接作用，降低其进入细胞的能力。所以PEG是一把双刃剑，能够增大脂质体在肿瘤组织的蓄积，赋予脂质体被动靶向性，但却不利于其进入肿瘤细胞。而一般修饰了配体的主动靶向脂质体，在血液循环中，难以避免非特异性结合，配体的暴露常常导致脂质体同血浆中的调理素结合，并最终被RES系统识别和清除。故一般的主动或被动靶向载体都存在一定的缺陷。

现有技术中，对于脂质体的表面修饰是在磷脂上进行的，如DOPE、DSPE等。由于磷脂大多带负电荷，会导致其与血浆中的蛋白结合，从而降低长循环效果。而相比于磷脂，作为脂质体另一主要材料的胆固醇具有其独有的优势，胆固醇是电中性，可以避免这一问题。同时，磷脂的化学稳定性较胆固醇差，可能在循环过程中氧化或降解。最重要的是，磷脂的价格如DSPE的价格是胆固醇的100倍。

因此，相对于磷脂修饰，对胆固醇进行修饰之后制备靶向脂质体是非常具有优势的。

发明内容

基于上述背景，为了克服一般被动或主动靶向脂质体的不足，本发明提供了一种基于胆固醇修饰衍生物制得的还原敏感性肿瘤靶向脂质体。

本发明所述的脂质体既能够充分利用聚乙二醇延长脂质体循环时间和配体促进脂质体识别和进入肿瘤细胞的优势，又能够克服配体的非特异性结合和聚乙二醇妨碍入胞的缺点。

本发明的目的之一，提供一种基于胆固醇修饰衍生物的还原敏感性肿瘤靶向脂质体，主要由磷脂、胆固醇、胆固醇衍生物制成；进一步优选地主要由磷脂、胆固醇、修饰有配体的胆固醇-聚乙二醇-配体嵌合物（Cho-PEG-X）和具有二硫键的还原敏感性胆固醇-聚乙二醇嵌合物（Cho-S-S-PEG）制得，其中基于总脂质的摩尔百分比计，磷脂10%～90%、胆固醇10%～90%、Cho-PEG-X 0.1%～10%和Cho-S-S-PEG2%～20%。

在某一实施方案中，优选地，其中基于总脂质的摩尔百分比计，磷脂30%～70%、胆固醇10%～35%、Cho-PEG-X 0.1%～5%和Cho-S-S-PEG 5%～10%。

本发明所述的磷脂包括中性磷脂及带电荷磷脂。

所述中性磷脂及带电荷磷脂，包括但不限于磷脂酰胆碱（卵磷脂）、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油。

在一个实施方案中，本发明的磷脂优选卵磷脂。

本发明的目的之一，提供一种基于胆固醇修饰衍生物的还原敏感性肿瘤靶向脂质体组合物，包含磷脂、胆固醇、Cho-PEG-X、Cho-S-S-PEG和活性剂，其中基于总脂质的摩尔百分比计，磷脂10%～90%、胆固醇10%～90%、Cho-PEG-X 0.1%～10%和Cho-S-S-PEG2%～20%，如本领域所知的，活性剂的剂量可以依据包含在载体中的活性剂来调整。

任何活性剂都可以包括在本发明的脂质体组合物中，例如，治疗剂和/或显像剂。

本发明的活性剂可以是抗肿瘤剂。适合的抗肿瘤剂的例子包括但不限于，烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、蒽环类抗生素、植物生物碱、紫杉醇的衍生物、拓扑异构酶抑制剂、单克隆抗体、光敏剂、激酶抑制剂和含铂化合物。

本发明所述的Cho-PEG-X是修饰有配体的胆固醇-聚乙二醇-配体嵌合物，该嵌合物是通过在胆固醇的3位羟基衍生一个游离的氨基后，利用该氨基与具有双功能基团的PEG链一端的活性酯基团反应生成酰胺键，再将配体X连接在PEG链另一端的马来酰亚胺基团上制备而成的。

其中，PEG分子量为约200-约50000，优选为约1000、约2000、约5000等。

其中，配体X包括TAT（人免疫缺陷病毒TAT蛋白转导肽）、R8（八聚精氨酸）、R9（九聚精氨酸），LHRHa（促黄体激素释放激素激动剂），整合素配体RGD肽及其类似物、氨肽酶配体NGR肽及其类似物、T7、Tf（转铁蛋白）、Lf(乳铁蛋白)、Folic acid（叶酸）、抗HER2等单克隆抗体。

本发明所述的Cho-S-S-PEG是具有二硫键的还原敏感性胆固醇-聚乙二醇嵌合物，该嵌合物是通过在胆固醇的3位羟基衍生一个游离的氨基后，利用该氨基同交联剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）形成含二硫键的中间产物，再加入PEG-SH发生二硫键的交换反应制备而成的。

研究表明，肿瘤可以提供还原性的微环境。至少包括以下三种途径：（1）肿瘤死细胞释放的谷胱苷肽(GSH)；（2）分泌于肿瘤微环境中的硫氧还蛋白还原酶；（3）许多肿瘤过表达的氧化还原酶，谷氧还蛋白，硫氧还蛋白及其相应的还原酶。此外，肿瘤细胞内的还原性水平可比正常细胞高100倍。

在还原性条件下Cho-S-S-PEG中的PEG链可以从脂质体表面断裂脱离，克服了传统PEG链修饰阻碍脂质体入胞的缺陷，并且可以充分暴露出特异性或非特异性配体，介导脂质体高效的进入细胞。

为了进一步提高其还原性条件，也可以在给予本发明的脂质体之后，再外源性给予还原性物质(L-半胱氨酸（L-cys）、二硫苏糖醇（DTT）、谷胱甘肽（GSH）)的刺激，促使Cho-S-S-PEG中的PEG链可以从脂质体表面断裂脱离。

Cho-S-S-PEG上-S-S-表示二硫键，该二硫键是通过交联剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)引入，再通过与PEG-SH发生的二硫键交换反应得到的。修饰于胆固醇上的聚乙二醇，其分子量在200-50000之间，且Cho-S-S-PEG中的PEG链比Cho-PEG-X中的长。

本发明的目的之一，提供了一种对脂质体的组成成分之一胆固醇进行衍生化的方法，制备出一系列功能化的脂质材料，包括修饰有配体的胆固醇-聚乙二醇-配体嵌合物/Cho-PEG-X和具有二硫键的还原敏感性胆固醇-聚乙二醇嵌合物/Cho-S-S-PEG。

本发明的目的之一，提供了一种制备修饰有配体的胆固醇-聚乙二醇-配体嵌合物/Cho-PEG-X的方法，包括通过在胆固醇的3位羟基衍生一个游离的氨基后，利用该氨基与具有双功能基团的PEG链一端的活性酯基团反应生成酰胺键，再将配体X连接在PEG链另一端的马来酰亚胺基团上制备而成的。

优选的具体方法步骤如下。

1. 胆固醇对甲苯磺酸酯的制备

在一密闭容器中，氩气保护下，对甲苯磺酰氯、胆固醇以摩尔比例为1-2的投料量在无水吡啶中室温反应6-24小时，得到胆固醇对甲苯磺酸酯初产物，初产物经减压除去反应溶剂后，加入水终止反应，以氯仿萃取三次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压旋干后，石油醚重结晶得到白色晶状固体。

2. 胆固醇-醚键-二甘醇的制备

于密闭容器中，氩气保护下，二甘醇、胆固醇对甲苯磺酸酯以摩尔比例为1-10的投料量在干燥1，4-二氧六环中，加热回流反应6-24小时，得到胆固醇-醚键-二甘醇初产物，初产物减压除去反应溶剂后，加入二氯甲烷溶解，饱和氯化钠洗3次，5-10%碳酸氢钠洗3次，分离有机层，无水硫酸钠干燥，减压抽干后过硅胶柱纯化后得浅黄色油状物。

3. 胆固醇-醚键-二甘醇-邻苯二甲酰亚胺的制备

于密闭容器中，氩气保护下，以干燥的N,N-二甲酰亚胺为溶剂，依次加入胆固醇-醚键-二甘醇、邻苯二甲酰亚胺、三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯，且摩尔比例为1:5:5:5,室温下反应2-6小时，生成胆固醇-醚键-二甘醇-邻苯二甲酰亚胺初产物，加入水终止反应，氯仿萃取3次，饱和食盐水洗3次，5-10%碳酸氢钠洗3次，分离有机层，无水硫酸钠干燥，减压旋干后过硅胶柱纯化得到白色晶体状固体。

4. 胆固醇-醚键-二甘醇胺的制备

于密闭容器中，氩气保护下，胆固醇-醚键-二甘醇-邻苯二甲酰亚胺、一水合肼以摩尔比例为0.2-1的投料量在吡啶中室温反应6-24小时，得到胆固醇-醚键-二甘醇胺初产物，用氯仿-水萃取分液，有机层用无水硫酸钠干燥，减压旋干后过硅胶柱纯化得到浅黄色油状固体。

5.胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺/ Cho-PEG-MAL的制备

于密闭容器中，氮气保护下，胆固醇-醚键-二甘醇胺、马来酰亚胺聚乙二醇乙酸琥珀酰亚胺NHS酯/NHS-PEG-MAL以摩尔比例为1-3的投料量在干燥二氯甲烷中，室温避光反应6-24小时，得到胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺初产物，过滤后减压旋干，乙腈沉淀，滤液旋干后得到无色油状物。

6. Cho-PEG-X的制备

于密闭容器中，氮气保护下，胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺、配体X以摩尔比例为0.2-1的投料量在氯仿-甲醇（2:1）混合溶剂中，室温下避光反应2天，得到修饰有配体的胆固醇-聚乙二醇-配体初产物，过滤后减压旋干，加入氯仿溶解后过滤，再减压旋干得到无色油状物。

本发明的目的之一是提供了一种制备具有二硫键的还原敏感性胆固醇-聚乙二醇嵌合物/Cho-S-S-PEG的方法，包括通过在胆固醇的3位羟基衍生一个游离的氨基后，利用该氨基同交联剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）形成含二硫键的中间产物，再加入巯基化的聚乙二醇（PEG-SH）发生二硫键的交换反应制备而成的。

优选的具体方法步骤如下。

1.中间产物胆固醇-醚键-二甘醇胺的制备

其具体制备方法参照胆固醇-聚乙二醇-配体嵌合物制备方法1-4。

2. Cho-S-S-PEG的制备

于密闭容器中，氩气保护下，胆固醇-醚键-二甘醇胺、交联剂SPDP以摩尔比例为1-3的投料量在氯仿中，室温下反应2-6小时，再加入PEG-SH，其与SPDP的摩尔比例为0.2-1，室温下继续反应3天，得到具有二硫键的还原敏感性胆固醇-聚乙二醇初产物，过硅胶柱纯化得到白色粉末状固体。

上述这些材料制备出的脂质体在血液循环中，能通过链长较长的Cho-S-S-PEG将特异性或非特异性配体充分屏蔽，保证其长循环效果，充分利用EPR效应蓄积于肿瘤组织之后，通过适当的还原性刺激，Cho-S-S-PEG中的PEG链从脂质体表面断裂脱离，暴露出配体，介导脂质体高效进入肿瘤细胞。该系统是将聚乙二醇和配体修饰于脂质体材料之一的胆固醇上，制备的一种稳定性好，成本低，适于产业化生产的具有肿瘤靶向性的新型脂质体。

本发明的还原敏感性肿瘤靶向脂质体可以包含一种或多种活性剂。本发明使用的“活性剂”包括期望被递送到受试者的肿瘤部位的任何化合物。任何活性剂都可以用于实施本发明。

抗肿瘤剂可以用作本发明脂质体中的活性剂，适合的例子包括：

烷化剂，例如，氮芥类(例如，苯丁酸氮芥、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥)，亚硝基脲类(例如，卡莫司汀、福莫司汀、洛莫司汀、链脲佐菌素)，含铂化合物(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂、BBR3464)，白消安，达卡巴嗪，双氯乙基甲胺(Mechlorethamine)，甲基苄肼，替莫唑胺，塞替派和尿嘧啶氮芥；

抗代谢物，以例如，叶酸(例如氨基蝶呤、氨甲蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞)，嘌呤代谢(例如克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨、巯基嘌呤、喷司他丁、硫鸟嘌呤)，嘧啶代谢(例如卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨)为靶点；

纺锤体毒素植物生物碱，例如，紫杉烷(例如多烯紫衫醇、紫杉醇)和长春花(例如长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞宾)；

细胞毒性/抗肿瘤抗生素，例如，蒽环类抗生素(例如柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、戊柔比星、洋红霉素、nacetyladriamycin、柔红霉素苯腙、5-亚氨基柔红霉素(5-imidodaunomycin)、N30乙酰柔红霉素(acetyldaunomycin)和表柔比星)，博来霉素，丝裂霉素和放线菌素；

拓扑异构酶抑制剂，例如，喜树碱类(例如喜树碱、拓扑替康、伊立替康)，鬼臼(例如依托泊苷、替尼泊苷)；

单克隆抗体或其片段，例如阿仑单抗(Alemtuzumab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、吉妥单抗(Gemtuzumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、托西莫单抗(Tositumomab)和曲妥珠单抗(Trastuzumab)；

光敏剂，例如氨基乙酰丙酸、氨基乙酰丙酸甲酯、卟吩姆钠和维替泊芬；

激酶抑制剂，例如达沙替尼(Dasatinib)、埃罗替尼(Erlotinib)、吉非替尼(Gefitinib)、伊马替尼(Imatinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、尼罗替尼(Nilotinib)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)和凡德他尼(Vandetanib)；

酶，例如天冬酰胺酶、培门冬酶，和酶抑制剂，如羟基脲；

细胞凋亡诱导剂，例如三氧化二砷、万珂(Velcade)和奥利默森钠(Genasense)；

生物反应调节剂，例如地尼白介素(Denileukin Diftitox)；

抗激素，例如醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、双羟萘酸曲普瑞林、醋酸甲地孕酮、他莫昔芬(Tamoxiifen)、托瑞米芬、氟维司群、睾内酯、阿那曲唑、依西美坦和来曲唑；以及类视黄醇，如9-顺-视黄酸和全-反-视黄酸。

在其它实施方案中，本发明的脂质体可包含多于一种的抗肿瘤剂，其中每种脂质体包含不同的活性剂，例如不同的抗肿瘤剂。

本发明的目的之一，提供一种还原敏感性肿瘤靶向脂质体的组合物，包含磷脂、胆固醇、Cho-PEG-X、Cho-S-S-PEG和活性剂，其中，按重量百分比计算，活性剂占总脂质的1%~50%。

在某一实施方案中，优选地，提供一种还原敏感性肿瘤靶向脂质体的组合物，包含磷脂、胆固醇、Cho-PEG-X、Cho-S-S-PEG和活性剂，其中基于总脂质摩尔百分比计，磷脂30%～70%、胆固醇10%～35%、Cho-PEG-X 0.1%～5%和Cho-S-S-PEG 5%～10%；其中，按重量百分比计算，活性剂占总脂质的1%~50%。

本发明的目的之一是提供了一种制备基于胆固醇修饰衍生物的还原敏感性肿瘤靶向脂质体组合物的方法，包括薄膜分散-超声/过膜法，胶束插入法。

本发明优选地具体步骤如下。

（1）薄膜分散-超声/过膜法制备空白脂质体

使用磷脂、胆固醇、Cho-PEG-X和Cho-S-S-PEG为制备脂质体的原料，将上述材料置于茄形瓶中，加入有机溶剂溶解后，于旋转蒸发仪上将有机溶剂抽干，再将茄形瓶放在真空干燥器中1-6小时，充分除去有机溶剂，向茄形瓶中加入磷酸盐缓冲液、葡萄糖、硫酸铵溶液等水化液，在37~60℃下，于摇床上水化1小时，用挤压过膜或者超声等方法将脂质体粒径控制在100nm左右，得空白脂质体；

或者（1）胶束插入法制备空白脂质体

使用磷脂、胆固醇、Cho-S-S-PEG为制备脂质体的原料，将上述材料置于茄形瓶中，加入有机溶剂溶解后，于旋转蒸发仪上将有机溶剂抽干，再将茄形瓶放在真空干燥器中1-6小时，充分除去有机溶剂，向茄形瓶中加入磷酸盐缓冲液、葡萄糖、硫酸铵溶液等水化液，在37~60℃下，于摇床上水化1小时，用挤压过膜或者超声等方法将脂质体粒径控制在100nm左右，得到母脂质体。再将Cho-PEG-X制备成胶束后插入到母脂质体中孵育即得。

（2）空白的脂质体的载药

若为包载紫杉醇等脂溶性药物，则需将药物和脂质材料一同置于茄形瓶中，其余步骤同空白脂质体的制备，或者；

若为包载盐酸阿霉素等水溶性药物，则应在水化过程中，加入100~500mM的硫酸铵水化液水化脂质体，得到空白或母脂质体后，过G50葡聚糖凝胶柱，收集空白脂质体悬液，再同含药物的水溶液孵育即得。

本发明所述的脂质体可制备成口服给药、透皮给药、粘膜给药、皮下注射、肌肉注射及静脉注射的药物制剂形式。

本发明的脂质体可以使用任何适当的途径向受试者给药，例如，静脉内给药、动脉内给药、肌内给药、腹膜内给药、皮下给药、皮内给药、关节内给药、鞘内给药、侧脑室内给药、鼻腔喷雾、肺吸入，口服给药以及本领域技术人员已知的其它适合的给药途径。可以利用本发明的方法治疗的组织包括但不限于，鼻、肺、肝、肾、骨骼、软组织、肌肉、肾上腺组织和乳房。可以被治疗的组织包括癌组织、其它患病或受损组织(compromised tissue)，以及如果需要健康组织也可以被治疗。也可以在给予本发明脂质体治疗剂6-72h之后，再外源性给予还原性物质(L-半胱氨酸（L-cys）、二硫苏糖醇（DTT）、谷胱甘肽（GSH）)的刺激。

本领域技术人员很容易确定利用本发明的脂质体向受试者给予活性剂的剂量，并且该剂量适于在延长的时间周期内经静脉内给药，例如在大约1分钟至几小时，例如，2、3、4、6、24或更多小时。本发明所使用的“大约”表示当其用于修饰数值时有10％的变化量。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案。

图1本发明结构示意图。图中1-为Cho-S-S-PEG，2-为Cho-PEG-X。 

图2本发明的产品到达肿瘤组织后，在还原性条件下，Cho-S-S-PEG中的二硫键断裂，PEG从脂质体表面脱落后的结构示意图。

图3 小鼠结肠癌C26细胞对各处方脂质体的摄取情况比较

图3中 1-为Blank组，2-为L-LIP组，3-为NC-LIP组，4-为CL-LIP(-)组，5-为小鼠结肠癌CL-LIP+10 mM L-cys组，6-为CL-LIP+10 mM DTT组。

图4 各处方脂质体在荷瘤小鼠中的肿瘤分布情况比较。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1.  Cho-S-S-PEG₅₀₀₀的具体制备实施。

1. 胆固醇对甲苯磺酸酯的制备

在500ml的圆底烧瓶中,加入350ml无水吡啶，再分别加入对甲苯磺酰氯35.0g(184mmol)、胆固醇38.0g(98mmol)，氩气保护下，室温反应16小时，得到胆固醇对甲苯磺酸酯初产物，初产物经减压除去反应溶剂后，加入100ml水终止反应，以氯仿萃取三次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压旋干后，石油醚重结晶得到42.5g(79.9%)标题化合物，为白色晶状固体。

2. 胆固醇-醚键-二甘醇的制备

在500ml的圆底烧瓶中，加入200ml的干燥1，4-二氧六环，再分别加入胆固醇对甲苯磺酸酯42.5g(78.7mmol)、二甘醇60ml(632.4mmol)，氩气保护下，加热回流反应24小时，得到胆固醇-醚键-二甘醇初产物，初产物减压除去反应溶剂后，加入二氯甲烷溶解，饱和氯化钠洗3次，5%碳酸氢钠洗3次，分离有机层，无水硫酸钠干燥，减压抽干后过硅胶柱纯化后得到标题化合物30.9g(75.0%)，为浅黄色油状物。

3. 胆固醇-醚键-二甘醇-邻苯二甲酰亚胺的制备

在500ml的圆底烧瓶中，加入220ml的干燥N,N-二甲酰亚胺，再分别加入胆固醇-醚键-二甘醇8.3g(17.4mmol)、邻苯二甲酰亚胺12.8g(87.1mmol)、三苯基磷22.8g(86.9mmol)、偶氮二甲酸二乙酯13.7g(86.9mmol)，氩气保护下，室温反应4小时, 生成胆固醇-醚键-二甘醇-邻苯二甲酰亚胺初产物，加入水终止反应，氯仿萃取3次，饱和食盐水洗3次，5%碳酸氢钠洗3次，分离有机层，无水硫酸钠干燥，减压旋干后过硅胶柱纯化得到标题化合物9.8g(90.6%),为白色晶体状固体。

4. 胆固醇-醚键-二甘醇胺的制备

在100ml的圆底烧瓶中，加入40ml的吡啶，再分别加入胆固醇-醚键-二甘醇-邻苯二甲酰亚胺1.4g(1.9mmol)、一水合肼460ul(9.5mmol)，氩气保护下，室温反应24小时，得到胆固醇-醚键-二甘醇胺初产物，用氯仿-水萃取分液，有机层用无水硫酸钠干燥，减压旋干后过硅胶柱纯化得到标题化合物0.79g(85.0%)，为浅黄色油状固体。

5. Cho-S-S-PEG₅₀₀₀的制备

在25ml圆底烧瓶中，加入12ml氯仿，再分别加入胆固醇-醚键-二甘醇胺47.3mg(0.1mmol)、三乙胺109ul (0.65mmol)、交联剂SPDP 25mg(0.07mmol)，氩气保护下，室温反应6小时后，加入PEG₅₀₀₀-SH 165mg(0.03mmol)，室温下继续反应3天，得到Cho-S-S-PEG₅₀₀₀初产物，过硅胶柱纯化得到标题化合物114.9mg(63.9%)，为白色粉末状固体。(TOF MS ES⁺(m/z):5772.0)

类似方法制得，Cho-S-S-PEG₂₀₀₀、Cho-S-S-PEG₃₀₀₀、Cho-S-S-PEG₄₀₀₀。

实施例2.   Cho-PEG-X的具体制备实例

1. 胆固醇-醚键-二甘醇胺的制备

具体制备过程同实施例1

2. Cho-PEG₂₀₀₀-MAL的制备

在25ml圆底烧瓶中，加入5ml二氯甲烷，再分别加入胆固醇-醚键-二甘醇胺28.4mg(0.06mmol)、干燥三乙胺65ul（0.39mmol）、NHS-PEG₂₀₀₀-MAL 80mg(0.04mmol,)氩气保护下，避光室温反应24小时，得到Cho-PEG₂₀₀₀-MAL初产物，过滤后减压旋干，乙腈沉淀，滤液旋干后得到标题化合物86.3mg(87.5%)，为无色油状物。 

3. Cho-PEG₂₀₀₀-R₈的制备

在25ml圆底烧瓶中，加入4ml氯仿，再加入Cho-PEG₂₀₀₀-MAL 20.0mg(7.1umol)、干燥三乙胺6ul(35.8mmol)，再将R₈ 14.7mg(10.7umol)溶解于2ml甲醇后加入圆底烧瓶中，室温下避光反应2天，得到Cho-PEG₂₀₀₀-R₈初产物，过滤后减压旋干，加入氯仿溶解后过滤，再减压旋干得到标题化合物28.2mg(94.6%)。为无色油状物。(TOF MS ES⁺(m/z):4170.0)

基于实施例2的相同方法，PEG选自200-50000时，当X选自TAT、RGD等时，类似制得以下实施例所用的各个具体的Cho-PEG-X。

实施例3 . TAT修饰的还原敏感性脂质体的制备

以磷脂、胆固醇、修饰了细胞穿膜肽TAT的胆固醇-聚乙二醇/Cho-PEG₁₀₀₀-TAT，Cho-S-S-PEG₅₀₀₀为材料，制备肿瘤靶向脂质体。分别称取磷酯1.5mg、胆固醇0.3mg、Cho-PEG₁₀₀₀-TAT 0.1mg、Cho-S-S-PEG₅₀₀₀ 1.1mg溶于适量二氯甲烷，37℃水浴下，减压旋转蒸发出二氯甲烷，形成均匀脂质膜，加入1mlPBS缓冲液水化1小时，探头超声（10s,10s,15次）。再依次挤压通过400nm,200nm和100nm聚碳脂膜，得TAT修饰的还原敏感性脂质体。

实施例4.  R₈修饰的还原敏感性脂质体的制备 

以磷脂、胆固醇、修饰了细胞穿膜肽R₈的胆固醇-聚乙二醇/Cho-PEG₂₀₀₀-R₈，Cho-S-S-PEG₅₀₀₀为材料，制备肿瘤靶向脂质体。分别称取磷酯1.7mg、胆固醇0.34mg、Cho-PEG₂₀₀₀-R₈ 0.15mg、Cho-S-S-PEG₅₀₀₀ 1.6mg溶于适量二氯甲烷，水浴下，减压旋转蒸发出去二氯甲烷，形成均匀脂质膜，加入1mlPBS缓冲液水化1小时，探头超声（10s,10s,15次）。再依次挤压通过400nm,200nm和100nm聚碳脂膜，得R₈修饰的还原敏感性脂质体。

实施例5.  RGD修饰的还原敏感性脂质体的制备

以磷脂、胆固醇、修饰了RGD的胆固醇-聚乙二醇/Cho-PEG₂₀₀₀-RGD，Cho-S-S-PEG₅₀₀₀为材料，制备肿瘤靶向脂质体。分别称取磷酯1.5mg、胆固醇0.3mg、Cho-PEG₂₀₀₀-RGD 0.4mg、Cho-S-S-PEG₅₀₀₀ 1.6mg溶于适量二氯甲烷，水浴下，减压旋转蒸发出去二氯甲烷，形成均匀脂质膜，加入1mlPBS缓冲液水化1小时，探头超声（10s,10s,15次）。再依次挤压通过400nm,200nm和100nm聚碳脂膜，得RGD修饰的还原敏感性脂质体。

实施例6.  Tf修饰的还原敏感性脂质体的制备

以磷脂、胆固醇、修饰了Tf的胆固醇-聚乙二醇/Cho-PEG₂₀₀₀-Tf，Cho-S-S-PEG₅₀₀₀为材料，制备肿瘤靶向脂质体。分别称取磷酯3.4mg、胆固醇0.7mg,Cho-S-S-PEG₅₀₀₀ 3.2mg溶于适量二氯甲烷，水浴下，减压旋转蒸发出去二氯甲烷，形成均匀脂质膜，加入1mlPBS缓冲液水化1小时，探头超声（10s,10s,15次）得到脂质体A。Cho-PEG₂₀₀₀-Tf 5.26mg 溶于适量二氯甲烷，水浴下减压旋转蒸发除去二氯甲烷，形成均匀脂质膜，加入1mlPBS缓冲液于37℃水化1小时得到胶束B。将胶束B与脂质体A混合，60℃下孵育30分钟，即得Tf修饰的还原敏感性脂质体。

实施例7.  包载水溶性抗癌药物盐酸阿霉素的脂质体的制备及小鼠结肠癌C26细胞摄取

表1 脂质体处方

按表1所示处方制备各种载盐酸阿霉素的脂质体。称取处方量的脂质材料，溶于适量二氯甲烷，水浴下，减压旋转蒸发除去二氯甲烷，形成均匀脂质膜，加入适量300mM硫酸铵水溶液于60℃水化1小时，再依次挤压通过400nm,200nm和100nm聚碳脂膜，过G50葡聚糖凝胶柱，收集脂质体。按药脂比1：10加入盐酸阿霉素水溶液，于50℃下，孵育20min，即得不同类型的脂质体。

将小鼠结肠癌C26细胞按照1×10⁵细胞/孔接种于6孔板中，培养24h后，每孔加入160μL不同处方的脂质体样品，另外每种不同处方的脂质体加入一定量的L-Cys, DTT,并使其终浓度为10mM，在37℃，5%CO₂条件下孵育4h后，用冷的PBS洗3次，最后重悬于新鲜的PBS中，用流式细胞仪定量测定载阿霉素的脂质体的入胞水平。从结果可以看出，在没有还原性条件存在下，细胞对CL-LIP的摄取情况与NC-LIP和L-LIP没有明显差异，但在给予外源性还原物质L-Cys和DTT后，细胞对还CL-LIP的摄取情况大大增加。说明Cho-S-S-PEG5000能够将R8较好的屏蔽，在还原性物质的作用下，Cho-S-S-PEG₅₀₀₀发生断裂，暴露出R₈配体介导载阿霉素的脂质体高效入胞。在该体外细胞试验中外源性的加入了还原性物质，为Cho-S-S-PEG₅₀₀₀的断裂提供了还原性环境，而在动物体内，本身存在一定的内源性还原物质，则可以给予也可以不给予外源性的还原物质。

实验例8 .  脂质体在荷瘤小鼠体内的肿瘤分布

按表1所示处方制备各种载钙黄绿素的脂质体。称取处方量的脂质材料溶于适量二氯甲烷，加入DiR荧光染料，水浴下，减压旋转蒸发出去二氯甲烷，形成均匀脂质膜，用PBS缓冲液水化1小时，探头超声（10s,10s，15次）。依次挤压通过400nm,200nm和100nm聚碳脂膜即得DiR标记的脂质体。

将小鼠结肠癌C26细胞消化后离心，将细胞沉淀重悬于新鲜的1640培养基中，然后将2×10⁶C26细胞（100μL）皮下注射接种到雄性BALB/c小鼠的背部，在肿瘤接种第14天，待肿瘤直径达到约10mm左右时，使用非侵入式光学成像方式对体内分布进行研究。先彻底刮除荷瘤动物的毛发以排除对成像的干扰，然后按照20mg lipids/kg的剂量从尾静脉注射不同处方的脂质体。在给药后第12，24，48，72h腹腔注射8%水合氯醛（400mg/kg）麻醉，然后使用Fluobeam活体成像仪 (Fluoptics，France)  进行拍照。从照片可看出，R₈-LIP组主要蓄积于肝脏，在肿瘤的蓄积较少，而CL-LIP组的肿瘤蓄积明显。说明CL-LIP具有显著地肿瘤靶向性。

对于相关领域技术人员将是非常明显的是，不脱离本发明或其任何实施方案的范围，可以对本发明所述的方法和应用作出的其它适当的修改和改进。现在已经详细地描述了本发明，通过参考以上实施例将更加清楚地理解本发明，本发明包括实施例的目的仅用于阐释本发明，而不意在限制本发明。

Claims (10)

1.一种基于胆固醇修饰衍生物的还原敏感性肿瘤靶向脂质体，其特征在于主要由磷脂、胆固醇、胆固醇衍生物制成；进一步优选地主要由磷脂、胆固醇、修饰有配体的胆固醇-聚乙二醇-配体嵌合物（Cho-PEG-X）和具有二硫键的还原敏感性胆固醇-聚乙二醇嵌合物（Cho-S-S-PEG）制得，其中基于总脂质的摩尔百分比计，磷脂10%～90%、胆固醇10%～90%、Cho-PEG-X 0.1%～10%和Cho-S-S-PEG2%～20%。

2.根据权利要求1所述的脂质体，其特征在于，其中基于总脂质的摩尔百分比计，磷脂30%～70%、胆固醇10%～35%、Cho-PEG-X 0.1%～5%和Cho-S-S-PEG 5%～10%。

3.根据权利要求1或2所述的脂质体，其特征在于，所述磷脂选自中性磷脂及带电荷磷脂，包括但不限于磷脂酰胆碱（卵磷脂）、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油；所述磷脂优选卵磷脂。

4.一种Cho-PEG-X化合物，其特征在于其是修饰有配体的胆固醇-聚乙二醇-配体嵌合物，该嵌合物是通过在胆固醇的3位羟基衍生一个游离的氨基后，利用该氨基与具有双功能基团的PEG链一端的活性酯基团反应生成酰胺键，再将配体X连接在PEG链另一端的马来酰亚胺基团上制备而成的。

5.一种Cho-S-S-PEG化合物，其特征在于其是具有二硫键的还原敏感性胆固醇-聚乙二醇嵌合物，该嵌合物是通过在胆固醇的3位羟基衍生一个游离的氨基后，利用该氨基同交联剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）形成含二硫键的中间产物，再加入PEG-SH发生二硫键的交换反应制备而成的。

6.一种基于胆固醇修饰衍生物的还原敏感性肿瘤靶向脂质体组合物，其特征在于包含权利要求1所述的脂质体和活性剂。

7.根据权利要求4所述的脂质体组合物，其特征在于所述活性剂可以是抗肿瘤剂；包括但不限于，烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、蒽环类抗生素、植物生物碱、紫杉醇的衍生物、拓扑异构酶抑制剂、单克隆抗体、光敏剂、激酶抑制剂和含铂化合物。

8.根据权利要求6或7所述的脂质体的组合物，其特征在于，包含磷脂、胆固醇、Cho-PEG-X、Cho-S-S-PEG和活性剂，其中基于总脂质摩尔百分比计，磷脂30%～70%、胆固醇10%～35%、Cho-PEG-X 0.1%～5%和Cho-S-S-PEG 5%～10%；其中，按重量百分比计算，活性剂占总脂质的1%~50%。

9.根据权利要求6所述的脂质体组合物，进一步包含外源性的还原性物质如L-半胱氨酸（L-cys）、二硫苏糖醇（DTT）、谷胱甘肽（GSH）)，促使Cho-S-S-PEG中的PEG链可以从脂质体表面断裂脱离。

10.一种制备权利要求6所述的基于胆固醇修饰衍生物的还原敏感性肿瘤靶向脂质体组合物的方法，包括薄膜分散-超声/过膜法，胶束插入法。

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