CN106061496A - Cd44结合肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蛋白质,其结合至由人类CD44基因外显子9(CD44ex9)编码的区域,以融合蛋白质并与所述蛋白质偶联,尤其涉及偶联到所述蛋白质的纳米颗粒。本发明还涉及一种生产所述蛋白质和相应的偶联纳米颗粒的方法,以及本发明所述的蛋白质在治疗和诊断癌症方面的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质,其结合至由人类CD44基因外显子9(CD44ex9)编码的区域,以融合蛋白质并与所述蛋白质偶联,尤其涉及偶联到所述蛋白质的纳米颗粒。本发明还涉及一种生产所述蛋白质和相应的偶联纳米颗粒的方法,涉及CD44V5衍生肽,以及本发明所述的蛋白质和肽在治疗和诊断各种疾病方面的应用,尤其是在治疗和诊断癌症方面的应用。
背景技术
癌症转录模式的大量研究已经导致了分子靶标的发现,以从良性肿瘤中区分出恶性肿瘤,从那些不太具备侵略性的肿瘤中区分出最具侵略性的肿瘤。癌症往往过度表达一些蛋白质,包括某些细胞表面抗原,例如,细胞表面受体。结合到这些过表达的细胞表面抗原的抗体可促进此类癌症的检测和治疗。目前已经使用了许多方法来产生针对癌细胞表面受体的抗体,所述癌细胞表面受体可用作潜在的诊断或疗法。过度表达的细胞表面受体和结合在其上的抗体的识别,为癌症疗法的发展提供了有效的途径,尤其是对那些具有不良预后且对传统疗法产生抵抗的癌症亚型而言。CD44,CA19-9和CEA均是这种过度表达的细胞表面受体,它们均被认为与肿瘤恶化和恶性肿瘤相关。
CD44,是胞外基质的一种主要的粘附分子,已广泛涉及多种生理过程,包括:白细胞归位和激活,伤口愈合和细胞迁移,以及肿瘤细胞的侵袭和转移(Gijnthert et al.,1991;Nagano and Saya,2004;Ponta et al.,2003)。
CD44是一种单链分子,包含一个保守的N-末端细胞外结构区,一个非保守的近膜区,一个表达变体外显子的各种组合的可变区,一个跨越区域的保守的跨膜区,以及一个保守的胞质尾。CD44基因组图谱包括在5'末端的5个恒定的外显子与在3'末端的5个恒定的外显子。小鼠CD44基因还在分子指定的V1-V10的中间包括10个外显子变体,导致共有20个外显子。人类CD44基因仅包含这10个外显子变体中的9个(V2-V10),因而总共包含19个外显子。不同的选择性剪接生成表达外显子变体的各种组合的CD44的许多亚型(指定的外显子Vx中,x=1-10),所述外显子变体插在近膜区中,并构成了该分子的可变区。这些分子被指定为CD44变体(CD44v)。迄今为止,已经发现了CD44的20种亚型。
然而,标准CD44亚型(CD44s)主要表达于造血细胞和普通上皮细胞的亚群中,在膜-近端胞外区插入的CD44变体被发现富含于多种人类肿瘤中,包括:结肠肿瘤,乳腺肿瘤,胃肿瘤,膀胱肿瘤,前列腺肿瘤和各种造血肿瘤。其它报道提出CD44变体表达与肿瘤恶化尤其是肿瘤细胞的淋巴扩散之间有着密切的联系。
一并考虑这些观察结果,可发现它们指出了CD44变体除了在细胞粘附和迁移中更常规的功能外,还在肿瘤起始阶段和癌细胞保持阶段中具有重要功能。
除了CD44在癌症中的作用外,CD44也被建议作为自身免疫性疾病中的潜在靶标。据报道(Hale et al.,1992),CD44蛋白质或肽或衍生物的给药可被用于治疗各种自身免疫疾病。
基于已经确立的CD44在癌症和自身免疫疾病中作用,直接针对CD44的各种变种区域的单克隆抗体也已经得以生产,作为用于CD44相关病症的诊断和治疗的潜在试剂。
Seiter等人报道了直接针对大鼠腺癌的CD44表面蛋白质的特定转移变体的mAbs(Seiter et al.,1993)。这些抗体拟被用于生产用于免疫调节紊乱的治疗性处理的免疫抑制,所述免疫调节紊乱包括,例如,风湿性类型的疾病。与CD44反应的单克隆抗体,其抑制T细胞增殖,也被提供用于治疗各种自身免疫病。连接至含有外显子v6肽的CD44形式的单克隆抗体也被报道为适用于诊断炎症性疾病(Jalkanen et al.,1986)。
WO91/17248涉及抗-CD44V抗体在治疗和诊断肿瘤中的应用。WO95/00851涉及直接针对CD44的可变的外显子的抗体在诊断肿瘤中的应用。WO95/04547公开了出于免疫治疗和免疫成像的目的的特别直接针对外显子v5序列内的表位的抗-CD44抗体的应用。直接针对外显子v6的一种抗-CD44抗体被WO 95/33771所公开。进一步地,EP0538754教导了直接针对CD44变体的抗体在免疫抑制方面的应用。
现有技术所述的抗-CD44抗体显示出多个缺点。它们代表了庞大而复杂的分子,这些分子不得不通过重组生产方法而被制备。因此,所述生产方法过于复杂、代价高昂且不得不严格履行监管要求。进一步地,降低免疫原性的潜力的必要性需要人类抗体或人源化抗体的产生。
因此,仍然需要CD44变体结合分子。因而本发明的目的是提供一种CD44变体结合物质,其克服了上述缺点中的至少一种。
该问题通过依据权利要求1所述的一种CD44变体结合蛋白质的提供,并通过所述结合蛋白质在诊断和治疗中的应用,特别是通过涂覆有所述蛋白质的纳米颗粒的使用,得以解决。本发明所述的特定实施例为进一步的独立权利要求或从属权利要求的主题。
发明内容
在第一方面,本发明提供了一种结合至由人类CD44基因的外显子9(CD44ex9)编码的多肽的蛋白质,所述蛋白质包含以下物质或者由以下物质组成:
a)根据SEQ ID NO:ID NO:1-5所示的氨基酸序列;或
b)与SEQ ID NO:ID NO:1-5所给出的氨基酸序列具有至少80%一致性的,优选85%一致性的,更优选90%一致性的,且最优选95%一致性的氨基酸序列;或
c)与由以下序列所限定的CD44结合基序具有至少90%一致性的,优选至少95%一致性的或100%一致性的氨基酸序列:
"PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQX10-14AIE",如SEQ ID NO:ID NO:6-10所示,其中,X表示任意的氨基酸;并且
其中所述的蛋白质具有100个氨基酸或更小的长度。
通过实施酵母双杂交筛选,发明人能够借助于特异性结合到被CD44的外显子9编码的多肽来识别五种不同的肽。所述氨基酸序列如图3和下表中所示,并且指定为SEQ IDNO:ID NO:1-5。
一个进一步的分析表明,一个共有序列可源自具有以下氨基酸序列的这些序列:
PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQX10-14AIE。
这些共有序列被指定为SEQ ID NO:6-10,如下表所示,由此这五个序列在任意序列X10-14的长度上不同;请注意,“X”被定义为任意氨基酸。
衍生出唯一的共有序列的能力进一步验证了双杂交筛选方法的结果,其中所述的共有序列包括所有独立分离的CD44相互作用多肽。
在随后的两个独立的亲和力检测中,SEQ ID NO:1-5的多肽被分析用于向被CD44的外显子9编码的多肽结合,并允许一个多肽亲和力的排名,由此多肽命名如下:
序列号1的肽:肽A
序列号2的肽:肽C
序列号3的肽:肽B
序列号4的肽:肽D
序列号5的肽:肽E
这两种亲和力检测,即伪样品挑选检测与基于荧光素-二-β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)的检测揭示了同样的排名顺序:
B>A,C,D,E
C>A,D,E
D>A,E
E>A
A>
总之,肽B(=序列号3的多肽)对CD44的外显子9编码的多肽具有最高的亲和力并且应当被视为本发明中优选的肽。为了此肽而实施表位定位,由此实施了缺失分析和丙氨酸扫描。
此外,肽A,C,D和E也在缺失检测中进行了分析,确认共有序列的有效性。
基于这些分析,本发明在另一方面提供了一种结合至被人类CD44基因的外显子9(CD44ex9)所编码的多肽的蛋白质,实施蛋白质包含以下物质或者由以下物质组成:
a)根据SEQ ID NO:39-52所示的氨基酸序列;或
b)与SEQ ID NO:39-52所给出的氨基酸序列具有至少80%一致性的,优选85%一致性的,更优选90%一致性的,且最优选95%一致性的氨基酸序列;或
c)与由以下序列所限定的CD44结合基序具有至少90%一致性的,优选至少95%一致性的或100%一致性的氨基酸序列:
"PGLQPSFAVQVX2 S/AXQX10-14AIE",如SEQ ID NO:53-62所示,其中,X表示任意的氨基酸;并且
其中所述的蛋白质具有100个氨基酸或更小的长度。
基于所述肽的这种表位定位,上面所讨论的共有序列总体上得到了证实。然而,一个更加优选的共有序列可源自具有下列氨基酸序列的这些序列:
PGLQPSFAVQVX2 S/AXQX10-14AIE。
这些共有序列所述被指定为如下表所示的SEQ ID NO:53-62,因而,这些序列在14位的氨基酸(Ser-Ala)交换方面和所述任意序列X10-14的长度方面存在不同。请注意,“X”被定义为任意氨基酸。
必须强调的是,本发明所述的肽第一次表明,不仅大分子抗体能够被生成以针对CD44表位,而且具有32至66个氨基酸长度的小分子肽也能够能够被生成以针对CD44表位,其中所述小分子肽特异性地且选择性地结合至临床相关的CD44区域。
与现有技术所述的(单克隆的)CD44v5抗体形成对比的是,这些肽显示出多个优点。
由于它们表示不需要形成复合物或分子内二硫桥键的短肽,它们更容易被生产和纯化。
由于这些肽具有32至66个氨基酸的长度,所以甚至可能通过固相合成法合成它们(根据Merrifield)。考虑到与重组蛋白表达相关的严格的监管要求,这种体外蛋白质合成具有特别的优势。
另外,作为小分子肽,为了用于治疗或诊断,它们可被有利地偶联至或融合至不同的蛋白质,特定化合物甚至纳米颗粒。
作为小分子肽,它们能够穿过血脑屏障和细胞膜以将化合物传递至不能被抗体所处理的部位。
由于它们的小尺寸,本发明所述的蛋白质引发免疫应答的风险被显著降低。必须指出的是,抗体所固有的免疫原性风险明显阻碍了其临床应用。
必须强调的是,本发明所述CD44ex9结合蛋白质仅通过变体区域v5的干扰就使得普通CD44的功能保持不变,并因而允许一个特定干预。
总之,本发明所述的CD44ex9结合蛋白质为副作用风险降低的治疗和诊断癌症的新方法推开了大门。
具体实施方式
在本发明的一个实施例中,本发明提供了一种结合至被人类CD44基因的外显子9(CD44ex9)所编码的多肽的蛋白质,所述蛋白质包含以下物质或者由以下物质组成:与SEQID NO:1-5和SEQ ID NO:39-52所给出的氨基酸序列具有至少80%一致性的,优选85%至少一致性的,更优选至少90%一致性的,最优选至少95%一致性的且具体地至少97.5%一致性的氨基酸序列。
在一个进一步的实施例中,本发明提供了一种结合至被人类CD44基因的外显子9(CD44ex9)所编码的多肽的蛋白质,所述蛋白质包含以下物质或者由以下物质组成:与由以下序列所限定的CD44结合基序具有至少90%一致性的,优选至少95%一致性的,更优选至少97.5%一致性的并甚至更优选至少100%一致性的氨基酸序列:
如SEQ ID NO:6-10所示的"PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQX10-14AIE"和如SEQ ID NO:53-62所示的"PGLQPSFAVQVX2 S/AXQX10-14AIE",其中,X表示任意的氨基酸。
如本文所要求保护的蛋白质具有300个氨基酸或更小的长度,优选200个氨基酸或更小的长度,更优选100个氨基酸或更小的长度,并且甚至更优选90,85,80,75,70或66个氨基酸或更小的长度。
在本发明的一个进一步的实施例中,所述CD44ex9结合蛋白质对被外显子9所编码的多肽具有高的亲和力,具有小于10μΜ的ki值,优选小于1μΜ,更优选小于100nM,并且最优选小于10nM。
在本发明的一个进一步的实施例中,所述CD44ex9结合蛋白质选择性地结合至被外显子9编码的所述多肽,考虑到当其结合至其它任意蛋白质的时候,所述其它任意蛋白质具有比用于CD44ex9结合的ki值至少小10倍的ki值,并且进一步优选小100倍。
在一个实施例中,本发明所述的CD44ex9结合蛋白质能够结合至每种CD44亚型,所述CD44亚型含有被外显子9所编码的区域,其也被指定为“变体5”(v5)。
在一个优选的实施例中,本发明所述的CD44ex9结合蛋白质结合至选自以下名单的CD44亚型,所述名单包括:CD44v5,CD44v5-v6,CD44v3-v6,CD44v3-v6,CD44v2-v10,CD44v3-v10,CD44V4-v7以及CD44v4-v10。
值得注意的是,本发明所述的CD44ex9结合蛋白质还结合至既包含V5区域,也包含其它变体区域的蛋白质,所述其它变体,如v1,v2,v3,v4,v6,v7,v8,v9和/或v10。
在本发明的一个进一步的实施例中,本发明所述的CD44ex9结合蛋白质偶联或融合至异源蛋白质或多肽。此偶联/融合可改变所述结合蛋白质的药效学和药代动力学特性,或者其可用于减少潜在的副作用。
它可进一步作为报告蛋白质使用,促进结合蛋白的检测,或者作为使蛋白纯化的肽或蛋白质使用,并且其可用蛋白酶或化学试剂就切割位点进一步被改造,所述蛋白酶或化学试剂使得两段分离的蛋白质得以释放。
通过融合一种GST蛋白质、FLAG肽或一段6个组氨酸的肽(6x His-tag),该技术通常被用于识别和纯化蛋白质,所述6个组氨酸的肽可通过使用具有镍或钴树脂的亲和层析而被分离出来。
所述结合蛋白质优选连接或融合至一种包含有选自以下物质的蛋白质:抗体,毒素,免疫调节肽和细胞因子。
在一个优选实施例中,所述偶联/融合蛋白质为一种酶,所述酶从前体分子催化细胞毒素或细胞抑制剂的产生。合适酶的非穷举名单包括:醛氧化酶,氨基酸氧化酶,细胞色素P450氧化酶,NAD(P)H:醌氧化还原酶,酪氨酸酶,胸苷酸合成酶,胸苷磷酸化酶,谷胱甘肽-S-转移酶,脱氧胞苷激酶,羧酸酯酶,碱性磷酸酶,β-葡萄糖醛酸酶,半胱氨酸偶联-β裂解酶以及硝基还原酶。
本发明所述的结合蛋白质还可偶联或融合至一种蛋白质,该蛋白质抑制、损害或杀死癌细胞或者使得癌细胞对另外的细胞毒性化合物很敏感。所述蛋白质的非限制性实施例为:胞嘧啶脱氨酶,可溶性FMS样酪氨酸激酶配体,单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-TK),细胞色素P450 2B1,视网膜母细胞瘤相关蛋白,p16/cdkn2与MMAC1/PTEN。MMAC1/PTEN作为磷酰肌醇3-激酶的负调节物。MMAC1代表多种晚期癌症1中的突变。
在另一个方面,本发明提供了一种偶联物,包含本发明所述的CD44ex9结合蛋白质,其通过一个连接分子直接或间接地连接至一种化合物,所述化合物选自以下物质所构成的组:碳水化合物,染料分子,放射性同位素,毒素,细胞抑制剂,细胞因子,免疫调节剂,或它们的前药。
根据本发明所述的偶联物,通常可被连接至损害、抑制甚至杀死癌细胞的任何类型的药物。因此,特别优选一种细胞毒素剂。细胞毒素剂的非限制性例子包括:替莫唑胺,卡莫司汀,洛莫司汀,甲基苄肼,链脲霉素,伊立替康或者这些试剂中的两种或多种的任意结合。
合适的癌症抑制剂的进一步的例子包括:(-)-Ci-Cdpl,(-)-Ci-Cdp2,(-)-儿茶素,(+)-Cbi-Cdpi2,(+)-Ci-Cdp2,10-脱乙酰巴卡丁Ⅲ,4-脱甲氧道诺霉素,5-氮胞苷/5-氮杂-2'-脱氧胞苷,5-氟尿嘧啶,5-亚氨基阿霉素盐酸盐,6-巯基嘌呤,阿柔比星,诺考达唑,放线菌素D,腺嘌呤的磷酸盐,腺苷,阿得巴司,阿多来新;U-73,975,阿非替康,阿仑单抗,阿利维A酸,阿洛司琼盐酸盐,麦珠子酸,六甲蜜胺,阿螺旋霉素,双硫脲脒腙,阿美蒽醌,氨磷汀,氨鲁米特,安吖啶盐酸盐,安拉罗汀,苦杏仁甙,阿那格雷,阿那曲唑,阿那昔酮,安西他滨,annomontacin,刺果番荔枝素A,(C19/C20赤式),刺果番荔枝素B,(C10/C11,C19/C20赤式),刺果番荔枝素C,(所有这三种)刺果番荔枝素E,番荔枝素,番荔枝素-IO-1,番荔枝素-A-1,annonidin B,annonin VI,annosquamosin A,annosquamosin B,安曲霉素,apaziquone,精美司那,aristoforin,三氧化二砷,青蒿素,子囊霉素,门冬酰胺酶,阿托西班,阿莫司汀,阿西替尼,盐酸阿扎司琼,阿扎替派,硫唑嘌呤,阿奇霉素,巴氟替尼,巴拉莫德,banoxantrone,batabulin,巴马司他,Bbr-34384,becatecarin,贝洛替,贝那昔滨,苯达莫司汀,苄替哌,berubicin,白桦脂醇,桦木酸,桦木醛,贝伐单抗,贝沙罗汀,比卡鲁胺,胺利血平,比立考达,蒽双咪腙,bistramide A;bistratene A,比折来新,博来霉素,博来霉素A2的硫酸盐,平阳霉素,硫酸博来霉素,硼替佐米,波生坦,波舒替尼,布喹那钠,布喹那,溴匹立明,brostallicin,布朵替坦,布拉它辛,布舍瑞林,白消安,卡巴他赛,亚叶酸钙,左亚叶酸钙,卡普睾酮,喜树碱,卡奈替尼,莰佛,斑蝥素,卡培他滨,卡醋胺,卡贝替姆,卡铂,卡前列素(卡前列素氨丁三醇),卡波醌,卡非佐米,卡哥鲁酸,卡莫氟,卡折来新,西地芬戈,西马多丁,西妥昔单抗,西维布林,苯丁酸氮芥,氮芥(二氯甲基二乙胺),氯碱他莫昔芬,氯烯雌醚,塞奥罗奈,顺铂,克拉屈滨,克兰氟脲,安妥明,氯法齐明,克罗米芬,虫草素,科罗索酸,克雷斯托,姜黄素,环胞苷,环磷酰胺,阿糖胞苷,胞苷,D-氨基乙酰丙酸,达卡巴嗪,二氢豚草素,达尼喹酮,达鲁舍替,达珀利奈,darinaparsin,达沙替尼,daunoblastina,柔红霉素,地西他滨,拉罗司,雷帕霉素,秋水仙胺,艾日布林,阿霉素,地塞米松尼古,右奥马铂,鸟嘌呤,卫康醇,二溴螺氯铵,诺孕素,二氟替康,dinalin,地舍莫来,多西他赛,多非喹达,甲磺酸多拉司琼,多韦替尼,去氧氟尿苷,阿霉素,屈他雄酮,达佐霉素,duocarmycin,dynemicin,罗氮芥,依达曲沙,edotecarin,edotreotide,依氟鸟氨酸,依克立达,elacytarabine,伊利司莫,依利奈法德,厄洛替康,依沙,乙嘧替氟,恩洛铂,依诺他滨,恩普氨酯,恩替卡韦,恩替诺特,恩曲他滨,enzastaurin,表阿霉素,依他前列素,艾日布林,厄洛替尼,多柔比星,雌莫司汀,etalocib,依他硝唑,依托格鲁,依托泊苷,依沙替康,依西美坦,依昔舒林,法倔唑,法扎拉滨,地西他滨,氟尿苷,氟达拉滨,氟甲睾酮,氟胞嘧啶,氟他胺,福美坦,呋咯地辛,fosfluridine tidoxil,磷喹酮,福司曲星,福莫司汀,福曲他明,氟维司群,烟曲霉素,加柔比星,加洛他滨,吉非替尼,吉西他滨,吉妥单抗,吉罗酚,gigantetronenin,gigantetroneninone,吉马替康,吉莫斯特,格洛沙腙,葡磷酰胺,goniothalamicin,goniothalamin,戈舍瑞林,盐酸格拉司琼,胍立莫司,海沙瑞林,高三尖杉酯羟基喜树碱,羟基脲,羟基脲,金丝桃素,伊班膦酸钠,伊班膦酸,伊达比星盐酸盐,脱氢雌马酚,异环磷酰胺,伊莫福新,伊马替尼,甲磺酸伊马替尼伊美克,英丙舒凡,因卡磷酸二钠,吲地布林,N-(3-氯-1H-吲哚-7-基)-1,4-苯二磺酰胺,伊诺他酮,inproquone,(2R)-2-[4-[(7-溴喹啉-2-基)氧基]苯氧基]丙酸,碘苄胍,伊洛福芬,依索拉定,伊斯平斯,伊沙匹隆,甲氨蝶呤,丙氨菌素,liquidar,拉帕替尼二甲苯磺酸酯,兰瑞肽,larotaxel,ledoxantrone,来那度胺香菇多糖,来他替尼,来曲唑,醋酸亮丙瑞林,亮丙瑞林,马沙骨化醇,利阿唑洛铂,洛那法尼,氯尼达明,米托蒽醌,Ly-83583,赖氨加压素,马磷酰胺甘露醇氮芥,mannosulfan,马立马司他,marinomycin A,马赛替尼,山楂酸马丙考,氮芥,阿霉素,甲地孕酮,美雄烷,巯美司钠,甲氨蝶呤,甲基氨基乙酰丙酸,美托咪酯,氯苯氨啶,美妥替哌米帕,米哚妥林,米伐木肽,milataxel,米普昔芬,米铂,米索硝唑米丁度胺,米托拉酮,米托胍腙,丝裂霉素,米托胍腙,米托喹酮,米托坦米托蒽醌,替莫唑胺,(-)-(S)-N-(5-氨基-2-甲基-3-苯基-L,2-二氢吡啶并[3,4-B]吡嗪-7-基)氨基甲酸乙酯,咪唑立宾,莫法罗汀,莫哌达醇,莫特塞尼莫特沙芬,木利替尼,muricapentocin,muricatacin,盐酸氮芥,吗替麦考酚酯霉酚酸,奈达铂,奈拉滨,奈莫柔比星,亚铜灵,neptamustine neratinib,尼日利亚,尼洛替尼,尼鲁米特,尼莫司汀,氨基胞,诺拉霉素洛拉曲克,斑蝥素,愈创木酸,nortopixantrone,novembichin obatoclax,奥曲肽,奥拉帕尼,齐墩果醛,高三尖杉酯碱,ombrabulin omtripolide,盐酸昂丹司琼,沃塔紫杉醇,奥替拉西,氧嗪酸钾,奥沙利铂,奥昔舒仑氧芬胂,紫杉醇酯,帕利伐米,帕诺斯琼,帕米膦酸二钠帕米膦酸,帕尼单抗,帕比司他,帕妥匹隆,泊泽尼普定,帕唑帕尼培门冬酶,peldesine,培利替尼,N-((5-(2-((6S)-2-氨基-1,4,5,6,7,8-六氢-4-氧代吡啶并[2,3-D]嘧啶-6-基)乙基)-4-甲基-2-噻吩)甲酰基)-L-谷氨酸,培美曲塞二钠,喷司他丁,peplomycin peretinoin,异环磷酰胺,哌立福新,pibrozelesin的氢溴酸盐,吡铂,吡萘非特哌泊舒凡,吡柔比星,吡非尼酮,吡曲克辛,吡罗蒽醌,匹杉琼,培美曲塞普卡,plitidepsin,普洛美坦,鬼臼毒素,泊马度胺,卟菲尔钠普拉曲沙,普啉司他,盐酸甲基苄肼,普罗帕脒,氯化丙啶,嘌嘧替派嘌呤霉素,吡唑霉素,quarfloxin,拉替拉韦,雷替曲塞,盐酸雷莫司琼,雷莫司汀瑞他霉素,retelliptine,利波腺苷,利曲舒凡,利妥昔单抗,罗氟司特,罗米地辛1-(2-脱氧-beta-呋喃核糖基)-5-碘-2-嘧啶酮,罗喹美克,罗莎布林,卢比替康,sabarubicin,沙芬戈,salirasib sapacitabine,塞卡替尼,sardomozide,赛特铂,司铂,细胞周期蛋白B激酶抑制剂,马沙尼;SU-5416,洛莫司汀,舍莫瑞林,司莫紫杉醇,辛曲秦,西他列汀,裂裥菌素,soblitodin sobuzoxane,苯丁酸钠,索拉非尼,斯帕磷酸,稀疏霉素,螺铂角鲨胺,squamocin,链黑菌素,链霉素,异环磷酰胺,软化剂,舒尼替尼苦马豆素,泰克地那林,他氟前列素,[(2R)-1-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰基]吡咯烷-2-基]硼酸,他利霉素,他莫司汀,talotrexin taltobulin,枸橼酸他莫昔芬,凡德他尼,替拉替尼,N-[2-[[4-[2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢-1H-异喹啉-2-基)乙基]苯基]氨基甲酰基]-4,5-二甲氧基苯基]喹啉-3-甲酰胺,tasidotin,他斯索兰牛磺莫司汀,替加氟,替加氟-尿嘧啶,telatinib,替洛蒽醌,替莫唑胺,teniposide tenuazonic酸,MESO-1,4-双(3,4-二甲氧基苯基)二甲基丁烷,特立帕肽,tesetaxel,睾内酯,扎西他滨,硝咪硫鸟嘌呤,塞替派,胸腺生成素,噻唑呋林,噻氯咪索,替洛隆,timecoder,噻莫西酸硫鸟嘌呤,替拉扎明,todadesine,拓优得,盐酸拓扑替康,托瑞米芬tosedostat,托西莫,toxipantrone,曲妥珠单抗,三亚胺醌,维甲酸,曲西瑞宾,曲洛司坦三甲,triplatin四硝酸酯,雷公藤,曲普瑞林,氯乙环磷酰胺,盐酸托烷司琼妥布氯唑,娃儿藤碱,U-67786,U-68415,U-71 184,U-76074,U-78057,乌苯美司卡莫司汀,乌瑞替派,氨基甲酸酯,尿苷,熊果酸,乌苏醛,2,5-己酮可可碱,戊柔比星伐司朴达,凡德他尼,伐普肽,伐他拉尼;PTK787,维替泊芬,维格列汀,硫酸长春碱,长春新碱,长春地辛,长春匹定,长春氟宁,长春米特,长春西汀,长春西醇,长春罗新,长春瑞滨[碱],酒石酸长春瑞滨,长春曲醇,长春利定,伏立康唑,伏立诺他,伏氯唑,雷公藤内酯A,黃黴素A,扎西他滨,折尼铂,zilascorb,zinostatin,唑来膦酸,佐柔比星,唑喹达,或其类似物,或者包含上述癌症抑制剂中的至少一种的结合。
此外,抗血管新生药也可被用于本发明所述的偶联物。非限制性例子包括:贝伐单抗,阿柏西普,西地尼布,索拉非尼,舒尼替尼,凡德他尼,帕唑帕尼,瓦他拉尼,伊马替尼,西仑吉肽,血管内皮抑素,血小板因子4。特别地,所述抗血管新生药可以所列例子中的两种或多种的任意组合使用。
辐射增敏剂代表另一类用于所述偶联物的药物种类,包含根据本发明所述的CD44ex9结合蛋白质。非限制性例子为卡铂,西仑吉肽,CG841251,如MK-1775的星孢菌素衍生物,4-苯基丁酸钠盐,一种包含如莫特沙芬钆化合物的钆,如紫杉醇或多西他赛的紫杉烷衍生物,或者它们的结合。
在另一方面,本发明提供了一种编码CD44ex9结合蛋白质或根据本发明所述的CD44v5肽的分离的核酸分子。
在另一方面,本发明涉及一种表达载体,含有所述CD44ex9结合蛋白质、所述CD44v5肽或者它们的融合蛋白的核苷酸序列。
在进一步的另一方面,本发明提供了一种含有所述表达载体的宿主细胞,所述表达载体含有所述CD44ex9蛋白质、所述CD44v5肽或者它们的融合蛋白的核苷酸序列。
在一个进一步的实施例中,本发明提供了一种生产所述CD44ex9结合蛋白质或所述CD44v5肽的方法,其中,所述方法包含以下步骤:
1)采用表达构建来转化宿主细胞,所述表达构建包含编码本发明所述蛋白质或相应的融合蛋白的核酸分子;并且
2)在适于生产所述CD44ex9结合蛋白质或所述CD44v5肽的条件下培养所述宿主细胞。
在本发明的一个实施例中,所述CD44ex9结合蛋白质或所述CD44v5肽可被用于诊断或治疗以下疾病:自身免疫性疾病,如:胰岛素依赖型糖尿病,多发性硬化症,干燥综合征和系统性红斑狼疮(SLE);皮肤病,如:牛皮癣或过敏性皮炎;慢性炎症性疾病,如:类风湿性关节炎或炎症性肠疾病;组织损伤;变应性疾病和癌症。
本发明所述的CD44ex9结合蛋白质或所述CD44v5肽在诊断或治疗炎症中的应用是基于以下事实,CD44起到引导炎症细胞达到感染或组织破坏的部位的作用。由此,在活化的T淋巴细胞、单核细胞或活化内皮细胞上的CD44结合细胞外基质组分的透明质酸,诱导如CCR2的趋化因子,然后促进炎性细胞向炎症部位的迁移(Johnson&Ruffell,2009)。由所述CD44ex9结合蛋白质引起的CD44的阻塞或者由所述CD44v5肽引起的透明质酸的封锁会阻止这一过程。
例如,CD44表达已在具有类风湿关节炎的病人中得到了广泛的研究,从而,来自具有类风湿关节炎的病人的滑液中的单核细胞上的CD44表达水平已被证实明显升高。CD44表达水平的升高,与炎症中滑膜炎的程度呈正相关。进一步地,缺乏CD44的小鼠具有较低等级的关节炎,并且抗-CD44处理被证明有效地降低了动物模型中的关节炎程度。因此,本发明所述的CD44ex9结合蛋白质或所述的CD44v5肽可被用于诊断或治疗炎症。
在本发明的一个进一步的实施例中,所述的CD44ex9结合蛋白质或所述的CD44v5肽可被用于生产免疫抑制剂,例如,通过抑制T细胞增殖以阻止移植排异反应。
在本发明的一个优选实施例中,所述CD44ex9结合蛋白质或所述CD44v5肽可被用于诊断或治疗癌症。这一优选应用是基于以下事实,CD44变体包含在癌细胞中已经描述了的v5区域。
由于所述CD44ex9结合蛋白质向所述CD44蛋白质的v5区域的特异性结合,事实结合蛋白质抑制CD44与各种胞外基质蛋白的相互作用,并从而抑制肿瘤细胞的附着、迁移和转移,并且也可削弱肿瘤细胞的增殖率。
在一个进一步优选的实施例中,本发明所述的CD44ex9结合蛋白质或所述CD44v5肽可被用于癌症干细胞(CSC)的诊断和治疗。一个新出现的概念表明,CSC最终确定癌症治疗的成功与否,由于细胞代表了长期生存下来群体,随后导致了复发和转移(Deonarain etal.,2009)。CD44被显示在CSC上表达,并为所述长期生存和相应肿瘤的转移倾向负责。作为一个实施例,乳腺癌的CSC由CD44+/CD24low的表达而被表征,CD44+/CD24low论证了CD44作为一种有希望的抗CLC-靶标。
在本发明的另一个实施例中,本发明所述的CD44ex9结合蛋白质或所述CD44v5肽可被用于诊断或治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)。Zhang等人(2013)的研究表明CLL细胞显示出CD44的高表达,并且进一步地,抗CD44抗体有效地杀死体外和体内的白血病细胞,因而,在一个移植瘤模型中,肿瘤完全从有机体中消失。
通过本发明所述的CD44ex9结合蛋白质或所述CD44v5肽进行的乳腺癌诊断或治疗由以下事实得以支持,CD44V5代表了乳腺癌中最丰富表达的CD44变体(CD44v5占56%对CD44v6占24%和CD44v8占15%)。此外,CD44v5变体的表达与乳腺癌的生存期短有关:在CD44v5癌症病人中的五年存活时间占71%,这与在CD44v5阴性病人中的五年存活时间占86%相对(Tempfer et al.1996)。
在一个优选实施例中,本发明所述的CD44ex9结合蛋白质或所述CD44v5肽可被用于诊断或治疗结直肠癌,因为已证明CD44v5(和CD44v6)与结直肠癌中的预后不良有关。因此,在肿瘤样品中具有较高CD44v5或CD44v6含量的病人有一个明显缩短的无复发生存期(Vizoso et al.2004)。
在另一个优选实施例中,本发明所述的CD44ex9结合蛋白质或所述CD44v5肽可被用于诊断或治疗头颈部鳞状细胞癌(HNSCC),由于这些肿瘤显示出CD44的高表达,具有CD44高表达的亚群对放疗和化疗较不敏感(La Fleur et al,2012)。
在另一个实施例中,本发明所述的CD44ex9结合蛋白质并且尤其是所述CD44v5肽可被用于诊断或治疗黑素瘤,由于体外和体内的CD44衍生肽在黑素瘤肿瘤模型显示出了疗效(Piotrowicz et al,.2011)。
在本发明的一个优选实施例中,所述CD44ex9结合蛋白质被用于制备造影剂,用于医疗用途。
在一个进一步优选的实施例中,所述造影剂能够识别出癌细胞或原位癌细胞。
在一个特定实施例中,结合蛋白质或任意的衍生物、偶联物、融合蛋白质或者结合到纳米颗粒的蛋白,能够识别选自以下名单中的癌细胞:腺癌细胞,胸腺上皮肿瘤细胞,宫颈癌细胞,非霍奇金淋巴瘤细胞,肺细胞癌细胞,胰腺癌细胞以及癌症干细胞。
本发明所述的CD44ex9结合蛋白质可被结合至任何种类的纳米颗粒。现有技术中已知了多种纳米颗粒,而本领域技术人员可根据具体的治疗或诊断的要求选择合适类型的纳米颗粒。
结合至所述CD44ex9结合蛋白质的纳米颗粒的例子为:量子点,贵金属团簇,超顺磁性氧化铁纳米颗粒(IONPs),嵌段共聚物胶束,纳米细胞,树枝状聚合物,纳米管,聚合物囊泡,纳米颗粒,以及由被结晶发光磷酸钙层包围着的无定形二氧化硅组成的纳米颗粒(例如,)。
ORMOBEAD颗粒可以在表面上用聚乙烯亚胺或TRIAMO得到的胺基或者6-氨基己酸(AHA)或己二酸得到的羧基进行适当修饰。这些基团可被偶联至本发明所述的蛋白质。ORMOBEAD技术是由Dembski等人(2013)所公开的,在此对其全部内容进行引用,出于公开制备和使用所述纳米颗粒的目的。
在本发明的一个实施例中,SiO2/Zn2SiO4:Mn2+和SiO2/Ca10(PO4)6OH:Eu3+核心-壳纳米颗粒具有小于100nm的直径,被作为用于偶联至本发明所述的蛋白质的纳米颗粒使用。这些颗粒由Dembski等人所公开,在此对其全部内容进行引用,出于公开制备和使用所述纳米颗粒的目的。
在另一个实施例中,发光染料标记的混合纳米颗粒可以被使用,这些纳米颗粒包含基于SiO2的颗粒基质,具有共价连接的有机荧光物质。它们将有机染料分子的光学特性与无机颗粒基质属性结合。因此,它们展现出对光漂白增加的抗性以及降低的染料渗漏。相应的纳米颗粒由Probst等人(2012)所公开,在此对其全部内容进行引用,出于公开制备和使用所述纳米颗粒的目的。
在另一个实施例中,无镉量子点可被使用。这些纳米颗粒显示出了在光谱的可见光和近红外区明亮的发光。相应的纳米颗粒由Nanoco Technologies Ltd.(Manchester,UK)所公开,并且在WO07/020416,WO08/100276,W010/52455,W010/15824,W010/10329和W013/93631中被公开,在此对这些专利申请的全部内容进行引用,出于公开制备和使用所述纳米颗粒的目的。
在本发明的一个实施例中,(Ⅱ族合金)Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族半导体量子点,Ⅲ-Ⅴ族量子点或者如Evident Technologies(Troy,NY,USA)所研发出的微粉型半导体纳米晶体复合物可以被使用。这些纳米颗粒在WO07/118118,WO08/94292,WO06/17125或WO05/110916中分别被公开,在此对这些专利申请的全部内容进行引用,出于公开制备和使用所述纳米颗粒的目的。
在另一个实施例中,超顺磁性氧化铁纳米颗粒(lONPs),嵌段共聚物胶束,纳米细胞,树枝状聚合物,纳米管,聚合物囊泡以及纳米颗粒可以被使用。相应的纳米颗粒被Singh和Lillard(2009)以及Xie等人(2010)所公开,在此对其全部内容进行引用,出于公开制备和使用所述纳米颗粒的目的。
在本发明的另一个实施例中,可以使用无镉纳米颗粒,其包括一个被壳区覆盖的核心区,所述壳区代表该核心区的一个抗反射涂层。相应的纳米颗粒被US 2008/0286826A1(飞利浦知识产权及标准部)所公开,在此对其全部内容进行引用,出于公开制备和使用所述纳米颗粒的目的。
在本发明的另一个实施例中,磁性颗粒可以被使用。所述磁性颗粒特别适用于靶向药物递送。在一个优选实施例中,所述磁性颗粒由超顺磁性金属氧化物和/或金属组成,并且被本发明所述的肽所涂覆,并且可选地被一种或多种额外的药物所涂覆。相应的磁性颗粒被EP1267843 B1(EUCRO)所公开,在此对其全部内容进行引用,出于公开制备和使用所述磁性颗粒的目的。
修改后的纳米颗粒可优选用作体内的造影剂,用于检测CRC细胞。WO 2007/057182A3公开了有利的纳米粒子,在此对其全部内容进行引用,出于公开制备和使用所述纳米颗粒的目的。所述纳米颗粒尤其为那些流体动力学直径不超过15纳米且在生物系统中非惰性的纳米颗粒。
本发明所述的纳米颗粒可进一步被偶联至至少一种肿瘤抗原结合物质和/或细胞毒素剂。
在本发明的一个优选实施例中,所述纳米颗粒被进一步偶联至肿瘤抗原结合物质,所述肿瘤抗原结合物质选自:抗CEA抗体,抗CA-19-9抗体,以及一种粘附素,或者它们任意的结合。
在一个优选的实施例中,偶联至纳米颗粒的粘附素在其自身的氨基酸序列中进行了修饰,并且更优选地根据WO 2009/106102 A1进行了修饰,其通过引用在此并入本文,以便其公开成为本发明申请的一部分。
本发明优选的纳米颗粒包括至少3种结构,即:一种被包含咪唑成分的层涂覆的无机核心,包含所述咪唑成分的层(在下文中也被称为“钝化层”)依次携带特异性配体,其中,所述特异性配体也可为该层的一部分。所述配体导致所述纳米颗粒特异性地结合至生物系统的靶标。
在优选的纳米颗粒中,所述无机核心包括围绕它的所述钝化层,具有不超过15nm的流体动力学直径,如果可能,优选不超过10nm。特别优选的是,流体动力学直径不超过8nm或不超过5nm。这尤其适用于球形纳米颗粒。该尺寸的纳米颗粒可以通过肾脏消除,因而不会积累,或者至多在体内以可耐受的量积累。这使得体内应用成为可能。这尤其适用于具有不超过5nm的流体动力学直径的纳米颗粒。
在一个替代性实施例中,所述纳米颗粒也可以是杆状的。在此实施例中,以下情况是有利的:该杆的直径不超过15nm的上述限制。同样地,优选的直径为5,8或10nm的范围内,以有助于从体内消除。因此,例如,根据本发明所述的可使用的纳米颗粒可具有8×15nm的长度/宽度尺寸。
根据本发明所述的可使用的纳米颗粒优选具有在600至700纳米之间波长的最大发射光,例如620至660纳米,尤其优选约625纳米或655纳米。所述发射光是容易被人眼所见的,因此,这种纳米颗粒可被直接用作造影剂,用于医疗干预。因此,在某些情况下可以省去辅助光学仪器。
在一个替代性实施例中,超出上述流体动力学直径的纳米颗粒可根据本发明而被采用,只要所述颗粒确保在体内是非惰性的。后者是所述颗粒为生物可降解的先决条件,因此,最初被固定在其中的金属(例如Cd)颗粒可被转换成离子形式。降解产物可通过肾脏消除。
具有包含咪唑成分的钝化层的无机纳米颗粒在体内的确为非惰性的,由于先前已经证明,但是它们在这些条件下被降解。因此,所述纳米颗粒符合生物降解性的标准以及降解产物的肾通路的标准,这对于体内应用特别相关。这是一个令人惊喜的发现,这是因为,钝化层尤其还用于增加了纳米颗粒的化学和/或物理稳定性(本文中,见下面的附加注释)。于是,一方面良好的诊断所需的纳米颗粒的稳定性与另一方面“大”颗粒肾通路所需的生物降解性的关系使得其适合用作体内造影剂。
钝化层的主要风险在于增加了荧光强度以及无机核心的化学和物理稳定性。被钝化层所涂覆的无机核心由至少10%的量子产率所表征,有利地为至少30%、50%甚至70%。此处所述的量子产率指的是由样品发出的光的量与由样品吸收的光的量的比率。有利的是,所述钝化层具有不超过1nm的厚度。在这种情况下,所述钝化的核心的直径增加不超过2nm。
有利的是,在不同情况下,所述纳米颗粒也提供有修饰剂,特别是用于改善与生物环境的相容性。优选地,由于使用修饰剂而增加的流体力学半径不超过2nm。在特殊情况下,钝化层和修饰剂的厚度还取决于这两个结构彼此之间的与相对于无机核心的关系。
本发明优选使用的纳米颗粒,如果如上所述限制其尺寸,特别适于用作活体病人中的诊断试剂。于是,尺寸的减小增大了扩散和穿透入组织的深度的比率。这就允许纳米颗粒均匀、迅速地分布在生物环境里,并且在局部给药后尽可能远地穿透组织(例如一个肿瘤组织)。类似地,本发明所述的纳米颗粒允许全身给药,这也可以通过注射的方式来进行。然而,局部给药,例如外用药或肿瘤内或周围给药以用于治疗肿瘤,也是可能的。
本发明特别优选的实施例包括偶联至本发明所述蛋白质的纳米颗粒,其具有不超过8nm的流体动力学直径,优选不超过4nm。此尺寸顺序的纳米颗粒可通过肾脏排除,从而不会积累,或者在体内累积到一个明显轻微的程度。其结果是,本发明所述的纳米颗粒大大减少了可能与已知的量子点关联的长期毒性的问题。
所述纳米颗粒有利地发射的荧光光谱范围为600-700nm,特别优选最大发光光谱为600-660nm,尤其优选为620-660nm。所述发光光谱具有非常高的组织传输性的优点,这是因为,在一个生命系统中,通过血红蛋白和其他吸光物质(包括水)仅有低的吸收。这些波长的光仍然可以通过人眼来感测并因此使得负责治疗的医生能识别被标记的组织而无需任何其他复杂的技术检测装置(例如,电荷耦合摄像机)。当在手术介入期间使用本发明所述的纳米颗粒作为造影剂用于识别CD44,CEA-和/或CA19-9表达细胞的时候,尤其是用于鉴别致癌和健康组织的时候,这是特别有利的。
在一个实施例中,优选可以使用的纳米颗粒为已知的纳米颗粒,具有例如碲化镉、硫化镉或碲化镉的核心,如US 2004/0247861所述,参照科学出版物。该印刷出版物还引用了关于制备核心材料的文献,例如引用了US 6,179,912。兹提述了这些文献中关于这些已知的纳米颗粒的性质及其制备方法的公开的全部内容。一种制备纳米颗粒的方法也在US7,147,712B2中被公开,出于公开的目的,该专利也在此进行了引用。
特别有利的是,纳米颗粒的无机核心主要含有半导体。这些核心发出各种颜色的光,取决于各自的大小和/或组成,但是它们在相同的光谱范围内的宽波段进行吸收(紫外到可见光范围)。由于高斯托克斯位移,激发和发射光谱相距甚远,这实现了对各种纳米颗粒简单地且同步地激发。它们具有窄而对称的发射光谱,其稍有重叠或根本没有重叠。非常重要的其它有益特性,特别是用于提升滤过深度和体内标记,为高达80%的高量子产率和高耐光性。
优选的纳米颗粒已经被公开,例如在WO 2005/001889中。因此,它们包含一种由合金制成的无机核心,所述合金具有均匀分布的至少两种半导体,或者在每种情况下存在该合金中的浓度梯度。关于所述纳米颗粒的性质和制备方法的公开,请参考上面所引用的WO2005/001889。所述核心在尺寸上各自会有约5%的偏差。
因此,所述纳米颗粒的无机核心可包含至少两种半导体的合金,其中,所述核心具有一种均匀的组合物并且通过“频带隙能量”被表征,其对于这两种半导体的摩尔比是非线性的。
可选地,所述核心可为不均匀的,其具有从核心中心到核心表面的浓度逐渐增加的第一半导体,以及具有从核心中心到核心表面的浓度逐渐减少的第二半导体。
对于这两种内核,该半导体中的至少一种为Ⅱ-Ⅵ族半导体或者Ⅲ-Ⅴ族半导体(此处所述族的定义对应于元素周期表中族的定义)。例如,所述合金可以选择以下物质所组成的组:CdSeTe,CdSSe,CdSTe,ZnSeTe,ZnCdTe,CdHgS,CdHgTe,InGaAs,InGaP,GaAIAs,InGaN。这些核心可进一步承载无机材料涂层,例如,如半导体(例如硫化锌)。该附加层对于本领域技术人员而言被称为“压盖”或“壳”。
Ⅱ-Ⅵ族半导体和Ⅲ-Ⅴ族半导体通常是已知的,例如包括:CdS1-xSex,CdS1-xTex,CdSe1-xTex,ZnSe1-xTex,Zn1-xCdxTe,Cd1-xHgxS,Cd1-xHgxTe,ln1-xGaxAs,Gai-xAlxAs和ln1-xGaxP。优选的是使用以下半导体:CdSe1-xTex,CdS1-xTex,ZnSe1-xTex,Zn1-xCdxTe,Cd1-xHgxS,Cd1- xHgxTe,ln1-xGaxAs,ln1-xGaxP,其中,x=0-1。
半导体的摩尔比可为任意的摩尔比。然而,如果所述合金包含CdSSe,优选为具有CdS1-xSex分子式的合金。如果该合金包含CdSTe,优选具有CdS1-xTex分子式的合金。如果该合金包含ZnSeTe,优选具有ZnSe1-xTex分子式的合金。如果该合金包含ZnCdTe,优选仅具有CdTe分子式的合金。在上述每种情况下,x=0-1。
所述纳米颗粒的这些优选的无机核心,可通过使用如下步骤制备:(i)在形成纳米晶体的条件下制备第一溶液;(ii)在不形成纳米晶体的条件下制备第二溶液,所述第二溶液包含具有一定摩尔比的半导体前体;(iii)将所述第二溶液添加至所述第一溶液中,这使得纳米颗粒形成;以及(iv)更改条件,使得纳米晶体的生长和形成均停止。制备核心的方法如WO 2005/001889所述,该专利申请被引用,关于本发明所述的纳米颗粒的无机核心的此优选实施例的制备的公开。
在一个替代性实施例中,所述无机核心可主要包含贵金属团簇,其优选包括2和27个贵金属原子。在一个优选实施例中,所述贵金属选自:金,银,铜,铂,钯,锇,铱,钌和铑。该团簇可具有不同的电荷。
这些核心具有以下优点,通过使用弱汞灯激发,它们可以作为单独的“纳米点”而很容易地被检测到,由于它们的强大的吸收和发射。含有这些核心的本发明所述的纳米颗粒可有利地用作单独分子荧光标记和质量标记。
术语“贵金属”指的是选自金,银和铜,和铂族金属(PGM),铂,钯,锇,铱,钌和铑的一组元素。在本发明的优选实施例中,所述贵金属选自:金、银和铜。在一个特别优选的实施例中,所述贵金属为银或金。
术语“团簇”是指金属的2-27个原子的化合物。团簇尤其可从化学催化,陶瓷,半导体技术,材料科学技术领域中知晓。因此,本领域技术人员熟知它们的制备方法。WO 2004/003558特别描述了贵金属团簇的制备,并且另外含有关于这个问题的进一步广泛引用。更具体的是,它公开了与有机分子关联的贵金属纳米团簇的制备。此处所述的术语“关联”指的是任何形式的结合,独立的化学或物理性的结合(因此,例如,共价的,非共价的,静电或范德华力结合)。关于作为本发明所述的纳米颗粒的核心纳米团簇的制备,被引用在WO2004/003558中。
根据本发明所述的优选可使用的纳米颗粒具有一钝化层,其增加了荧光强度并且改善了所述无机核心的化学和物理稳定性。因此,该纳米颗粒发光具有大于10%的量子产率,优选大于50%。
优选的所述纳米颗粒在4℃的含水环境中具有至少12个月的储存稳定性,如果可能,稳定于pH值为5-10的pH环境中,优选pH值为7-10,即就其特定的光谱特性而言它们表现出小于50%的偏差,所述光谱特性如量子产率,最大发射的位置,发光光谱的半峰宽。就这些特定的光谱特性而言,优选的颗粒展现出小于10%的偏差。
根据本发明的另一个实施例,还在生物条件(即生理条件)下或体内,所述可用的纳米颗粒在一段至少三天时间内基本上展现出所述核心的属性的一个恒定性/稳定性(包括围绕它的钝化层)。优选的颗粒在7-14天内展现出此类恒定性/稳定性,其中,通过稳定性的方法保留了属性的至少50%的恒定性。此信息尤其是指所述纳米颗粒在实际的靶器官中的稳定性。值得注意的是,主要有代谢功能的器官中的纳米颗粒的稳定性可能明显不太稳定(例如在肝脏中)。这甚至可以是明确地期望的。
虽然所述纳米颗粒在上述情况下是稳定的,但它们却在活体内发生根本降解,因此它们是非惰性的。从这个意义上来说,“非惰性”的意思是,在12周以上或更多用药后,至少50%的纳米颗粒已被分解。优选的是,在8、6或4周后,至少50%的已发生的降解是可检测的。残留在体内的颗粒的检测包括人体器官内的检测和为此目的的等离子体中的检测。因此,“惰性”的意思是,在给药4周后,大于50%甚至多达近100%的颗粒仍然在病人体内可检测到。纳米颗粒的降解可以通过本领域技术人员所知的分析方法进行检测,即例如通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS),如果样品合适,该分析还可以通过荧光光谱法测量进行补充。
所述钝化层包含至少一种咪唑成分。这种化合物能够配位金属原子或金属离子,例如锌离子、镉离子或汞离子。在一个优选实施例中,咪唑基团基于分子的结构而位于末端位置。所述钝化层可进一步具有交联剂,或者环状的或线性的咪唑成分也可以用作交联剂。所述交联剂可以是碱性的。
通过螯合、配合的方式或路易斯碱的电子供体特性,含有金属原子或金属离子的配位化合物可功能性结合至荧光无机核心,并且具有相应的偶联部分/基团。所述分子可进一步包含将润湿性或溶解性给予在水溶液中的所述核心的部分,所述核心涂覆有这些分子。
所述咪唑成分适当地由膦化合物交联,优选为烷基膦化合物。
术语“咪唑成分”指的是,为了本发明所述的目的,一种杂环基或杂芳基分子,其含有至少一个咪唑基(包括咪唑衍生物),并且其可用于结合所述无机核心或所述钝化层,具有金属如镉,锌,镓,或金属阳离子或者含有这种阳离子的基质。在这种情况下,优选的至少一个咪唑基应当基于分子的结构而位于末端位置。以其功能形式存在的所述咪唑成分通过环进行结合至荧光纳米晶体,所述环含有离域分子轨道。一般地,咪唑环的氮原子作为配合的配体以功能性地结合金属离子,如镉或锌。
在一个实施例中,所述咪唑成分包含反应性官能团,如一个或两个氨基酸,例如组氨酸,肌肽,鹅肌肽,巴莱纳,高肌肽,组氨酸苯基丙氨酸,环组氨酰苯丙氨酸,4-氨基-5-咪唑甲酰胺,组氨酰亮氨酸,2-巯基咪唑,BOC-组氨酸,酰肼,组氨酸,1-甲基组氨酸,3-甲基组氨酸,咪唑烷,含咪唑的鸟氨酸(例如5-甲基咪唑),含咪唑的丙氨酸(例如,β-(2-咪唑基)-1-α丙氨酸),carzinine,组胺。这些基于组氨酸的分子或包含咪唑的氨基酸可以通过一般已知的方法合成。
术语“膦”指的是,为了本发明所述的目的,一种具有至少一个膦基团(包括它们的衍生物)的分子,用于结合或螯合非金属,如Se,S或者其他非金属或含有这些原子的基质,并且其提供了至少一个官能团(例如羟基,氨基,巯基,羧基,甲酰胺基等)用于与相邻分子发生反应。
在本发明所述的一个优选实施例中,所述咪唑成分是一种肽,含有至少一个组氨酸残基,并且优选为一种含有一个或多个组氨酸残基的二肽。
在一个进一步优选的实施例中,所述咪唑成分是含组氨的不同二肽的混合物。优选地,基于分子的结构,至少一个膦基团应当位于末端位置。膦部分作为配位配体,以其功能形式结合荧光核心或来自屏蔽层的化合物、非金属或离子,如Se或S。
在一个优选实施例中,所述包含膦的化合物包括一个、两个或多个彼此偶联的膦基(例如以聚合形式),其可包括但不限于羟甲基膦化合物或其类似物。所述包含膦的化合物可通过一般已知的方法合成。此外,含有烷基膦的混合物被已知还可能具有一个或多个另外的官能团(例如羟基,氨基,巯基,羧基,甲酰胺基等)。衍生物的例子为羟甲基膦衍生物、酰胺或酯,只要所述衍生与本文中所述的作为膦涂覆的功能相兼容。
特别优选的是三(羟甲基)膦和3-[三(羟甲基)膦基]丙酸,用于涂覆本发明所述的纳米颗粒的荧光无机核心。交联的含膦化合物是公知的另外能够功能性地结合至金属原子和/或离子,如Zn或Cd。在这方面官能化的异氰酸酯或氰基丙烯酸烷基酯可进一步被作为交联剂,用于配体以及与荧光核心的加成物的形成。所述交联剂也可以是碱性的。
本发明所述的钝化层存在的钝化效应是基于表面镉或锌原子或类似物的屏蔽作用,通过与咪唑成分形成复合物的形成,并且基于反原子(Se或S)的屏蔽作用,通过与含膦的化合物形成复合物的形成。
本发明所述的纳米颗粒的钝化层已被US 2004/0247861 A1公开。该公开申请描述了涂覆有钝化层的无机核心的制备,例如量子点。出于公开本发明所述的采用的钝化层及涂覆着该钝化层的无机核心的制备方法的目的,US 2004/0247861 A被引用了。
所述钝化层的分子可以进一步具有或承载为了结合并交联目标分子和细胞(特异性配体)的化学基团。在适当合适的试剂存在下,如ZnSO4和Na2S,所述分子或化合物可形成一种钝化层,具有在所述荧光核心上的分子(“压盖”或“壳”)。
这些试剂也可功能性地结合至所述荧光纳米晶体表面的原子或离子,并因此,此额外的钝化层也可直接形成于所述核心的表面。
在一个有利的实施方案中,本发明所述的纳米颗粒可另外具有修饰剂,其包含有机和/或无机部分。它们被用于提升所述纳米颗粒在液体或悬浮介质中,特别是在生理环境中的相容性、功效和/或溶解性。表面修饰特别有利于实现非常低的非特异性吸附和增加的生物系统中的兼容性,尤其是在人体中的兼容性。
一种可能性为用聚乙二醇(PEG)修饰表面,聚乙二醇已被批准用于特定医疗应用,特别是以低分子量形式用于所述纳米颗粒,以保持整体尺寸较小。于是,所述纳米颗粒的生物相容性和血液循环时间以及进入细胞的摄取效率可被提升。将低分子量PEG层与如维生素的其它物质接合,例如叶酸,可以获得所述纳米颗粒向巨噬细胞中较低的摄取,这是因为吸收于所述纳米颗粒的由此减少了的蛋白质,通过免疫系统使得所述纳米颗粒的识别更加困难。
通过修饰剂进行的另一种可能有利的表面修饰是用单糖、二糖或三糖以低分子量多糖的形式涂覆,所述低分子量多糖由单糖或不同的单糖组成。一个可能的发展类型为采用多聚葡萄糖进行修饰,例如,其中可使用右旋糖苷,所述右旋糖苷已被医学证明作为血液代用品。其表现出良好的生物相容性/耐受性。另一个实施例是,为了抵消可能的降解而使用糖类的立体异构体形式(D型和L型)。
另一个实施例为使用生物相容的亲水性维生素作为修饰剂,例如硫胺素,核黄素,烟酸,吡哆醇,钴胺素,泛酸,抗坏血酸和叶酸。于是,例如叶酸可导致纳米颗粒优选地结合至癌细胞。此维生素仅展现出低免疫原性,因此具有很高的生物相容性。结合到膜结合叶酸受体有助于纳米颗粒的内化。
表面修饰也可能采用亲脂性维生素,如视黄醇,胆钙化甾醇,生育酚和叶绿醌。于是,例如维生素E能够增加纳米颗粒的细胞摄取。
脂肪酸,例如1-十八烯或18-甲基二十烷酸及其衍生物,可增加胶体的溶解性和稳定性,并且具有一末端官能羧基,其可被用于随后结合特异性配体。因此,可以采用脂肪酸作为修饰剂。
表面修饰的另一个实施例是具有多元醇的涂层,所述多元醇例如为二甘醇(DEG),其特别有利于减少非特异性蛋白质吸收。这同样适用于聚四氟乙烯(PTFE,铁氟龙),尤其是以其低分子量的形式,其可以实现蛋白质吸收的减少。聚四氟乙烯在心脏外科手术中得以频繁使用。
表面修饰同样可以通过使用一种或多种天然存在的氨基酸实施,所述氨基酸包括蛋白原和非蛋白原氨基酸以及合成的氨基酸。两种立体异构体(D型和L型)都可在此处被使用。上述氨基酸的二肽,三肽,四肽直至小的多肽几乎不刺激免疫系统且因此同样适合于薄兼容层。它们可以是人造的氨基酸序列以及来自生物蛋白质的氨基酸序列。天然蛋白质的肽衍生物,例如植物螯合肽,同样可用于表面修饰。采用Tat肽与含有Tat肽的多肽的表面修饰是使得纳米颗粒适用于生物医学应用中的另一种可能。所述Tat肽是一种有效分子,例如,用于通过细胞膜递送金纳米颗粒并一路进入细胞核。
可能的修饰剂的另一个实施例为磷酰胆碱涂层的形成。磷酰胆碱减少了可能的非特异性蛋白质吸收,例如在隐形眼镜上。由于它的不形成血栓的性质,一种磷酰胆碱修饰可以容易地在生物系统中被实施,并且通过高储存稳定性而被区分。由于聚乳酸酯是生物相容性的,这种物质在多种医疗应用中得以使用。更具体地,聚乳酸酯的低分子量形式构成了本发明所述的纳米颗粒的表面修饰的另一种可能。为了减少可能的生物降解,这两种立体异构体(D型和L型)都可在此处被使用。
除了所述表面修饰以外,非特异性蛋白质的向纳米颗粒的蛋白水解剪切结合也是可能的。这可增加生物相容性/兼容性。在目标位置,大分子蛋白质可用被释放在组织中的小纳米颗粒去除。所述去除也可在适当的停留时间之后发生。适合于此的优选为常用的蛋白质,除了降低非特异性吸收的其它蛋白质以外,例如可以为转铁蛋白,乳铁蛋白,血浆铜蓝蛋白,弹性蛋白和白蛋白。因此,由结合有弹性蛋白的多肽组成的表面涂层可阻止不想要的血块形成,并因此增加所述纳米颗粒的生物相容性。
主要的血清蛋白白蛋白可减少与质膜的非特异性相互作用。此外,适当修饰的纳米颗粒保留了与靶标分子发生特异性相互作用的能力,其通过特异性配体同时结合到颗粒表面。具有血清白蛋白的涂层可在静脉注射后通过防止巨噬细胞快速吸收而引起一个基本上更长的血液循环时间,所述血液循环时间比未涂覆的纳米颗粒的情况下要长。导致扩散率和所述灌注较高的降低的流体动力学直径与上述属性和改进以及高荧光强度、尤其是在可见红光范围内的荧光强度的一并结合致使本发明所述的纳米颗粒成为一种简单的诊断试剂,其可以许多不同的方式被用于选择性地和准确地辨别体内的组织形式。这些可能性,与抗原特异性生物标记物相结合,特别用于识别CD44V5,CEA-和/或CA19-9表达细胞,尤其是用于从正常组织中区分异常的(预)致癌组织,在外科介入期间,为帮助更精确的肿瘤切除术协助视觉评估。
因此,本发明所采用的创造性的纳米颗粒作为造影剂使用。这尤其适用于癌症的诊断和手术中。
承载有本发明所述的CD44ex9结合蛋白质的纳米颗粒,可在活体内采用或者离体采用,亦或作为体内诊断试剂,治疗诊断剂和/或治疗剂。出于此目的,它们可被局部给药(例如,瘤内注射,肌肉注射,或者通过手术抵达组织/器官)或者也可以全身给药(例如,通过静脉注射)。局部给药或外部给药可通过液体,喷雾溶液,泡沫,膏或有效贴剂而被提供。这可以特别优选用于空腔器官的治疗/诊断,所述空腔器官如在肠癌的情况下。也可能采用口服,例如,糖浆或以片剂或胶囊的形式。吸入剂(例如喷雾剂)同样也是可能的。在一种变体中,所述纳米颗粒可以药物储存库的形式而被植入。
在本发明的一个优选实施例中,所述CD44ex9结合蛋白质可用于靶向药物递送。在本发明的文本中,靶向药物递送被定义为在所关注的组织中浓缩药物的一种方法,同时降低该药物在剩余的组织中的相对浓度。出于此目的,所述CD44ex9结合蛋白质单独或作为一种融合蛋白或偶联物(优选偶联至纳米颗粒)被结合至药物递送媒介。存在本领域技术所知的各种类型的药物递送媒介,并且本领域技术人员可根据具体的目的而进行选择,例如高分子胶束,脂质体,基于脂蛋白的药物载体,纳米药物载体,树形载体等等。一种理想的药物递送媒介必须是无毒的,生物相容的,非免疫原性的,可生物降解的,并且避免被宿主的防御机制所识别。
在本发明的一个优选实施例中,包含脂质衍生双膦酸的脂质体可被用于靶向给药,特别适用于向骨骼结构给药。各种脂质衍生双膦酸被WO 2005/070952 A2(MCS MicroCarrier Systems GmbH)所公开,在此对其全部内容进行引用,出于公开制备和使用所述双膦酸的目的。
在本发明的一个优选实施例中,本发明所述的CD44ex9结合蛋白质可被作为离体或体外诊断试剂使用。体外或离体诊断用途涉及到源自病人的样品内所述CD44v5蛋白质的检测。待分析的样品可以是任何类型的,包括组织,器官,以及由此所得的活组织切片或体液,如:血液,血清,尿,唾液或脑液。
为了诊断用途,所述CD44ex9结合蛋白质被标记用于检测。合适的标记均是现有技术中已知的,并且包括染料,如发光或荧光染料,放射性同位素,酶,蛋白质标签,如:FLAG标签,GST标签,MBP标签或组氨酸标签,或者纳米颗粒。
为了并入一种标记,许多现有技术中的方法均是已知的,它们依赖于巯基,胺基,或羧基的随机修饰。可替代地,基因工程可用于引入或除去额外的活性基团,如半胱氨酸残基。
作为一种替代性方法,短肽标记可被粘附至用作标记受体位点的蛋白质。这样,标记既通过该标记的固有活性也通过反式提供的酶的活性而被粘附。所述活性相关的标记的例子包括位点特异性生物素酰化,如由生物素全酶合成酶BirA所媒介的那样,其允许标记的蛋白质与众多抗生物素蛋白/链霉亲和素试剂相结合。融合到LUMIO标签(含四半胱氨酸基序的一种六肽)的蛋白质可通过包含两个砷原子的染料直接染色。
在本发明的一个优选实施例中,人类DNA修复酶O6-烷基鸟嘌呤DNA-烷基转移酶(AGT,也称为SNAP标签)的工程改造的版本被融合到所述CD44ex结合蛋白质。含有O6-苄基鸟嘌呤的基质,以快速和高度特异性的自标记反应,通过稳定的硫醚键被共价结合到所述融合蛋白质。所述标记技术与其为了诊断目的的用途,被Kampmeier等人(2009)和Xie等人(2010)公开,在此对其全部内容进行引用,出于公开制备和使用所述标记的目的。
在一个优选实施例中,所述CD44ex9结合蛋白质被结合至纳米颗粒。各种类型的纳米颗粒均是现有技术已知的,并且也在本申请中被公开。
在一个进一步优选的实施例中,所述标记的CD44ex9结合蛋白质,其被优选结合至纳米颗粒,被包含在水浸泡浴中。通过将样品浸渍入浸泡浴,所述标记的CD44ex9结合蛋白质将特异性地标记该样品的CD44v5蛋白质,其可直接由研究者进行目测评估。该方法特别适用于外科手术,从而提取的组织可在手术期间分析肿瘤标记物的存在。因此,外科医生对肿瘤切除的准确性具有一个即时反馈。
用在本发明中的术语“诊断试剂”是“造影剂”的同义词,即它被用于生物系统中的,尤其是活人的形态和功能结构的可视化识别,以协助医学介入。
所述纳米颗粒可被用作诊断试剂,尤其是用在手术治疗中。它们同样可在微创方法中使用(例如,内窥镜,腹腔镜)。与影像学检查方法的结合(如PET,MRT,CT等)是值得的。
如上所述,根据本发明所述以局部给药的形式进行的应用是特别有利的。为此进行局部给药所采用的Cd的量最好不超过总摄入量的十分之一,所述总摄入量通常无论如何都会在人生过程中积累于老龄的和异常生活方式的人的肝脏和肾脏。这些器官的总摄入量约为18mg。因此,在局部给药时限制纳米颗粒的量是有利的,以便供应的Cd的量至少基本上不超过2mg。在一个特别优选的实施例中,肿瘤可视化是可能的,即使使用造影剂的量不超过0.6mg镉总量,特别优选0.2mg镉总量。
“局部给药”是指出于本发明的目的而进行的任何给药,其中,造影剂增加的量或剂量可在身体的不同区域被预知,这取决于给药的方式。相应地,如果给药人员采取相应的措施,所述造影剂的血管给药也是一种局部给药,所述措施例如为将绷带绑定至传入或传出血管以阻止造影剂以基本上无阻碍的方式在身体的整个血液循环系统中传播。
因而,该实施例的特殊优点为在活人中的医用纳米颗粒的应用也是可能的,因为不然——即作为全身给药——这将被排除,由于与之相关的毒性。这是因为局部给药减少了足够可视化所必须的纳米颗粒的剂量。
据报道,根据本发明所述的含Cd的造影剂被优选用于,以对应于每cm3肿瘤组织而采用0.002-0.02mgCd的剂量,在活体内可视化肿瘤。按照0.002-0.015mg Cd/cm3肿瘤组织而采用的造影剂的剂量是特别有利的,特别是按照0.002-0.010mg Cd/cm3肿瘤组织。采用该有利的剂量可能以多达150cm3的活体内体积来可视化肿瘤,从而无需超过对人类而言的暴露的正常可接受的上限。特别优选以多达50cm3的体积实施肿瘤的可视化。
调查可能涉及病人的所有可接触的组织/器官,尤其是在皮肤中,中空器官中(例如,胃肠,泌尿生殖器官,呼吸道)或者感觉器官的其它从外部接触的区域以及心血管系统。
作为一种体外诊断试剂使用也是可能的,例如,免疫组织化学或FACS和ELISA。体内和体外诊断(例如,活检标本)的结合是特别有利的。
根据本发明所述的CD44ex9结合蛋白质可保持结合到所述纳米颗粒,或者可以是可拆卸的、或可检测的、或可释放的。
在另一方面,本发明提供了下表所列出的CD44v5肽,并且指定为SEQ ID NO:11-38。这些肽为12个重复单元,具有覆盖人类CD44基因的整个v5区域的重叠的序列。
CD44v5肽编号 | 氨基酸序列 | SEQ序列号 |
1 | DVDRNGTTAYEG | 11 |
2 | VDRNGTTAYEGN | 12 |
3 | DRNGTTAYEGNW | 13 |
4 | RNGTTAYEGNWN | 14 |
5 | NGTTAYEGNWNP | 15 |
6 | GTTAYEGNWNPE | 16 |
7 | TTAYEGNWNPEA | 17 |
8 | TAYEGNWNPEAH | 18 |
9 | AYEGNWNPEAHP | 19 |
10 | YEGNWNPEAHPP | 20 |
11 | EGNWNPEAHPPL | 21 |
12 | GNWNPEAHPPLI | 22 |
13 | NWNPEAHPPLIH | 23 |
14 | WNPEAHPPLIHH | 24 |
15 | NPEAHPPLIHHE | 25 |
16 | PEAHPPLIHHEH | 26 |
17 | EAHPPLIHHEHH | 27 |
18 | AHPPLIHHEHHE | 28 |
19 | HPPLIHHEHHEE | 29 |
20 | PPLIHHEHHEEE | 30 |
21 | PLIHHEHHEEEE | 31 |
22 | LIHHEHHEEEET | 32 |
23 | IHHEHHEEEETP | 33 |
24 | HHEHHEEEETPH | 34 |
25 | HEHHEEEETPHS | 35 |
26 | EHHEEEETPHST | 36 |
27 | HHEEEETPHSTS | 37 |
28 | HEEEETPHSTST | 38 |
在一个实施例中,本发明还涉及一种被指定为如SEQ ID NO:11-38的肽,其在N-末端和/或C-末端缺失一个、两个或三个氨基酸。
在另一个实施例中,本发明还涉及被指定为如SEQ ID NO:11-38的肽,其在N-末端和/或C-末端延伸一个、两个或三个氨基酸,从而,这些额外的氨基酸为那些相应的CD44v5氨基酸序列。
在一个优选实施例中,所述肽可被用于阻断本发明所述的CD44ex9结合蛋白质。由于这种拮抗活性,这些肽可被用于验证CD44在体外、离体或体内标记的特异性。
此外,所述肽可被用作所述CD44ex9结合蛋白质的治疗用途的拮抗剂。在本文中,肽可被用于调节、削弱或抵消CD44ex9相关治疗的效果。
在治疗环境中,本发明所述的CD44v5肽可直接连接至所述CD44受体的内源性配体。这可导致这些配体的中和(使得它们不能被CD44受体所利用)并且也可导致被巨噬细胞迅速清除。
在本发明的一个进一步优选的实施例中,为了刺激个体的免疫系统,根据SEQ IDNO:11-38序列的这些肽中的一种或多种可被用作一种疫苗抵抗所述CD44变体表达所述v5-区域。作为疫苗,所述肽可被用于预防癌症或者用于癌症的免疫疗法。
由于两者杂交筛选的成果,导致了所述CD44ex9结合蛋白质的识别,各个肽作为免疫相关的表位而已经得到了验证。因此,它们适合于用作疫苗。
本发明的另一方面还提供了一种疫苗组合物,包含一种根据SEQ ID NO:11-38序列的分离的蛋白质或其肽片段,或者一种编码所述蛋白质或所述肽片段的核酸,用作一种预防或治疗癌症的药剂。
在另一方面,本发明涉及一种药物组合物,包含本发明所述的CD44ex9结合蛋白质或CD44v5肽,或者标记的CD44ex9结合蛋白质或CD44v5肽,其优选连接至纳米颗粒,以及一种药学上可接受的载体。
由于本发明所述的肽是相对小的分子,其可在这种组合物中被要求结合所述肽和各种物质,如佐剂,以生产疫苗、免疫原性组合物等。广义定义的佐剂是促进免疫应答的物质。通常情况下,选择的佐剂为弗氏完全佐剂或不完全佐剂,或者灭活的百日咳杆菌有机体,例如与明矾沉淀抗原联合使用。助剂的一般性讨论被Goding,Monoclonal Antibodies:Principles&Practice(第61-63页,1986年第二版)所提供。根据Goding所述,当目标抗原为低分子量的或免疫原性差的时候,推荐偶联到免疫原性载体。这种载体分子的例子包括:匙孔血蓝蛋白,牛血清白蛋白,卵清蛋白和家禽免疫球蛋白。各种皂苷提取物也已被建议用作免疫原性组合物中的佐剂。最近,WO 97/28816已经提出使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),即一种公知的细胞因子作为助剂的建议。
根据本发明所述的疫苗组合物优选含有一种佐剂和/或一种载体。有用的佐剂和载体的例子示例如下。
于是,存在于所述组合物中的所述CD44v5肽或其肽片段可与例如为一种蛋白质的载体相关联,或者与抗原呈递细胞相关联,所述抗原呈递细胞例如为树突状细胞(DC),能够将所述CD44v5肽或其片段递送给T细胞。
佐剂为其混合成疫苗组合物可提升或相反地修饰对本发明所述CD44v5蛋白质的免疫应答的任何物质。载体为支架结构,例如,多肽或多糖,所述CD44v5肽或其片段能够连接至所述多肽或多糖上。
例如,佐剂可选自以下物质所构成的组:AIK(SO4)2,AINa(SO4)2AINH4(SO4),二氧化硅,明矾,AI(OH)3,Ca3(PO4)2,高岭土,碳,氢氧化铝,胞壁酰二肽,N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-DMP),N-乙酰基-nornuramyl-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(CGP 11687,也被称为nor-MOP),N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1’2’-二棕榈酰基-sn-丙三氧基-3-羟基苯磷酰)-乙基胺(CGP 19835A,也被称为MTP-PE),2%角鲨烯/吐温80-RTM-乳液中的RIBI(MPL+TDM+CWS),脂多糖及其各种衍生物,包括脂质A,弗氏完全佐剂(FCA),弗氏不完全佐剂,默克佐剂65,多核苷酸(例如,聚IC和聚AU酸),源自结核分枝杆菌的蜡0,肺结核,短小棒状杆菌中发现的物质,百日咳杆菌,以及布鲁氏菌属成员,脂质体或其它脂质乳剂,Titermax,ISCOMS,奎尔A,ALUN(参见US58767和5,554,372),脂质A衍生物,霍乱毒素衍生物,HSP衍生物,LPS衍生物,合成肽基质或GMDP,白细胞介素1,白细胞介素2,的Montanide ISA-51以及QS-21。与本发明共同使用的优选佐剂包括基于油/表面活性剂的佐剂,如Montanide佐剂(来自Seppic,比利时),优选为Montanide ISA-51。其它优选的佐剂为基于细菌DNA的佐剂,如包括CpG寡核苷酸序列的佐剂。其它优选的佐剂是基于病毒dsRNA的佐剂,如聚l:C咪唑喹啉是优选佐剂的另一例子。此外,优选的佐剂为脂质体。最优选的佐剂为适于人类使用的佐剂。
Montanide佐剂(全来自Seppic,比利时)可选自:Montanide ISA-51,MontanideISA-50,Montanide ISA-70,Montanide ISA-206,Montanide ISA-25,Montanide ISA-720,Montanide ISA-708,Montanide ISA-763A,Montanide ISA-207,Montanide ISA-264,Montanide ISA-27,Montanide ISA-35,Montanide ISA 51F,Montanide ISA 0160和Montanide IMS,优选自:Montanide ISA-51,Montanide IMS和Montanide ISA-720,更优选自:Montanide ISA-51。Montanide ISA-51(Seppic公司)是基于油/表面活性剂的佐剂,其中,不同的表面活性剂与一种不可代谢的矿物油、一种可代谢的油或二者的混合物相结合。它们优选被用作一种具有水溶液的乳液,包含所述CD44v5肽或其片段。所述表面活性剂为二缩甘露醇油酸酯。OS-21(Antigenics;Aquila Biopharmaceuticals,Framingham,MA)是一种高度纯化的水溶性的皂素,作为水溶液处理。OS-21和Montanide ISA-51佐剂可以无菌的单次使用的小瓶的形式被提供。
根据本发明所述的疫苗组合物可包含多于一种的不同佐剂。此外,本发明涵盖了进一步包括任何佐剂物质的治疗性组合物,所述任何佐剂物质包括上述任一种或它们的组合。也可以预期的是,所述CD44v5或其片段,以及所述佐剂可以任何适当的顺序单独给药。
载体可以是独立于佐剂存在的。例如,载体的功能可以是增加所述肽或其片段的分子量,以便提高它们的活性或免疫原性,以赋予稳定性,增加生物活性,或者增加血清半衰期。另外,一种载体可有助于将CD44v5肽或其片段递送至T细胞。所述载体可以是本领域技术人员已知的任何合适的载体,例如蛋白质或抗原呈递细胞。一种载体蛋白质可以是但不限于:匙孔血蓝蛋白,如转铁蛋白之类的血清蛋白,牛血清白蛋白,人血清白蛋白,甲状腺球蛋白或卵清蛋白,免疫球蛋白,或激素,如胰岛素或棕榈酸。为了人类的免疫,所述载体必须是生理上可接受的载体,并且是人类可接受的且安全的。但是在本发明的一个实施例中,破伤风类毒素和/或白喉类毒素是合适的载体。可替换地,所述载体可以是右旋糖酐,例如琼脂糖凝胶。
相应地,本发明涵盖了一种治疗性组合物,进一步包括一种佐剂物质,所述佐剂物质包括上述任一种或它们的组合。可以预计的是,抗原,即本发明所述的肽和佐剂可以任何适当的顺序同时或单独给药。
根据本发明所制备的所述药物组合物包含所述CD44ex9结合蛋白质或连同药学上可接受的载体的CD44v5肽。术语“药学上可接受的”包括不妨碍CD44ex9结合蛋白质或CD44v5肽的生物活性的有效性的任何载体,并且这些载体对于其所给药的宿主是没有毒性的。
作为本发明的一种实施方式,所述组合物通过使用具有稳定的人血清白蛋白的CD44ex9结合蛋白质或CD44v5肽而被制得。为此,CD44ex9结合蛋白质或CD44v5肽的制备方法为与人血清白蛋白一起冻干在小瓶中。
在某些实施例中,所述药物组合物还包含一种或多种作为毒素,细胞因子,细胞生长抑制剂,或免疫调节剂的其它药物。
如本文所述的,词汇“药学上可接受的载体”旨在包括任何和所有的溶剂,增溶剂,填充剂,稳定剂,粘合剂,吸收剂,碱,缓冲剂,润滑剂,控释赋形剂,稀释剂,乳化剂,保湿剂,润滑剂,分散介质,包衣,抗菌或抗真菌剂,等渗剂和吸收延迟剂等等与药物施用相容的载体。用于药学活性物质的此类介质和试剂是本领域所已知的。除非任何常规介质或试剂是与活性化合物不相容的,它们在组合物中使用是可预期的。补充试剂也可被并入所述组合物。
本发明所述的一种药物组合物被配制成与其预期的给药途径相容。给药途径的例子包括不经肠道的给药,例如:静脉内给药,皮内给药,皮下给药,口服给药(例如吸入),经皮给药(外用),透黏膜给药,以及直肠给药。用于肠胃外,皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分:无菌稀释剂,如注射用水,盐水溶液,不挥发油或其它合成溶剂;抗菌剂,如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂,如抗坏血酸或硫酸氢钠;螯合剂,如EDTA;缓冲剂如乙酸盐,硝酸盐或磷酸盐,以及用于调节张力的试剂,如氯化钠和右旋糖。pH值可用酸或碱调节,如盐酸和氢氧化钠。肠胃外制剂可以封装在安瓿,一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液或分散液以及用于临时配制无菌可注射液或分散液的无菌粉末。为了静脉内给药,合适的载体包括生理盐水,抑菌水,聚氧乙烯蓖麻油(BASF,Ludwigshafen,BRD)或者磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下,可注射的组合物应当是无菌的并且应当是容易注射性存在的流体程度。它必须在生产和存储条件下是稳定的,并且必需能防止微生物的污染作用,所述微生物如细菌和真菌。所述载体可以是溶剂或分散介质,例如包含水、乙醇等等,以及它们合适的混合物。例如,适当的流动性可以通过使用一种涂层而被保持,所述涂层如卵磷脂,在分散液的情况下以及通过使用表面活性剂时,通过维持所需颗粒大小。
微生物作用的预防可通过各种抗菌剂和抗真菌剂实现,所述抗菌剂和抗真菌剂,如:对羟基苯甲酸酯,氯丁醇,苯酚,抗坏血酸,硫柳汞等。在许多情况下,优选在该组合物中包括等渗剂,例如糖,如甘露糖醇、山梨糖醇的多元醇,以及氯化钠。注射组合物的延迟吸收可通过在该组合物中包括一种延缓吸收的试剂而引起,所述延缓吸收的试剂例如为单硬脂酸铝。
无菌可注射溶液可通过将活性化合物(例如,所述CD44ex9结合蛋白质或CD44v5肽)以所需的量并入到合适溶剂中,并与以上列举的一种成分或它们的组合相结合而制备,根据需要,随后过滤灭菌。一般地,分散液是通过将活性化合物并入至无菌媒介而制备的,所述无菌媒介含有碱性分散介质和以上列举的所需的其它成分。在无菌粉末用于制备无菌注射溶液的例子中,优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥,其产出活性成分加上来自先前无菌过滤的溶液的任何另外所需成分的粉末。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用的载体。它们可被封装在明胶胶囊中或者被压制成片剂。出于口服治疗给药的目的,所述活性化合物可与赋形剂结合并以片剂、锭剂或胶囊形式被使用。口服组合物也可通过使用流体载体制备,所述流体载体用作漱口水,其中在所述流体载体里的所述化合物被置于口中漱口,然后吐出或吞咽。药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可被作为该组合物的一部分。片剂,丸剂,胶囊,锭剂等可包含任何以下成分或具有类似性质的化合物:粘合剂,如微晶纤维素;赋形剂,如淀粉或乳糖;崩解剂,如藻酸,羟基乙酸淀粉钠(例如,),或玉米淀粉;润滑剂,如硬脂酸镁;助流剂,如胶体二氧化硅;甜味剂,如蔗糖或糖精;调味剂,如薄荷,水杨酸甲酯,或橙味剂。
为了吸入给药,所述化合物从加压容器或分配器中以气溶胶喷雾形式递送,所述加压容器或分配器含有合适的推进剂,例如为一种气体,如二氧化碳或喷雾剂。
全身给药还可通过粘膜或透皮实施。为了经粘膜或透皮给药,适于待渗透屏障的渗透剂在制剂中使用。这些渗透剂一般都是本领域已知的,并包括,例如:用于经粘膜给药的洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。粘膜给药可通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂来实现。为了透皮给药,生物活性化合物被配制成一般为本领域已知的油膏,软膏或乳膏。
所述组合物也可以栓剂(例如,采用常规的栓剂基质,如可可脂和其它甘油酯)或用于直肠给药的保留灌肠剂的形式被制备。
在一个实施例中,可包含所述CD44ex9结合蛋白质或CD44v5肽的治疗性部分,采用会防止从体内迅速消除该化合物的载体制备,如控释制剂,包括植入物和微囊化递送系统。用于制备这种制剂的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。该材料也可商购获得,例如购买自Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals Incorporation。脂质体悬浮液(包括靶向癌细胞的具有针对肿瘤抗原的抗体的脂质体)也可被用作药学上可接受的载体。这些可通过本领域技术人员已知的方法制得。
特别有利的是,以剂量单元形式配制口服或肠胃外组合物,以方便给药且均匀剂量。此处所使用的剂量单元形式包括物理上离散的单元,适合作为单一剂量用于接受治疗的主体;每个单元含有经计算能产生期望的治疗效果的预定量的活性蛋白质,与所需的药物载体相联合。本发明所述的剂量单元形式的规格由所掌控且直接取决于活性蛋白质的独有特点待实现的特定治疗效果,以及在本领域中组合这种活性蛋白用于治疗个体所固有的局限性。
本发明所述蛋白质的毒性和疗效可以通过细胞培养或实验动物中的标准制药程序来确定,例如,用于确定LD50(半数致死剂量)与ED50(半数有效剂量)。毒性和治疗效果的剂量比为治疗指数并且其可被表达为LD50/ED50比率。表现出大的治疗指数的蛋白质为优选的。当表现出毒副作用的蛋白质可被使用的时候,应注意设计递送系统,所述递送系统将这种蛋白质靶向输送至受影响的组织位点,以便尽量减少非癌症细胞的潜在损害,从而减少副作用。
从细胞培养试验和动物研究中获得的数据可被用于配制用于人类的剂量范围。这种化合物的剂量优选出于循环浓度范围内,所述浓度包括的ED50具有很少毒性或没有毒性。所述剂量可在此范围内根据所用的剂型以及所利用的给药途径而变化。对于在本发明所述方法中所使用的化合物,治疗有效剂量可从细胞培养分析进行初步估计。剂量可在动物模型中配制,以获得包括如在细胞培养中测定的IC50(即测试化合物达到了症状的半数最大抑制量的浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更准确地确定人类中的有用剂量。血浆中的水平例如可通过高效液相色谱被测量。
所述药物组合物可被包括在一个容器、包装或一并具有给药指令的分配器内。
另一方面,本发明提供了一种药剂/剂量计组合套装,包括:a)被单独给药的一种药剂,和b)用于患者特异性的诊断指标体系,所述患者特异性与待施用给病人的药物的作用、副作用、相互作用、代谢、吸收、分布、代谢、消除有关,其中,所述患者特异性选自:内源性物质,调节机制,基因或指示系统。在上述组合套装中,药剂或诊断指示剂系统可为分离的CD44ex9结合蛋白质或任何融合蛋白质或与它的偶联物。出于以上目的,本发明所述的CD44v5肽也可被用作药剂或诊断指示剂系统。
合适的组合套装被EP1542644 B1(MCS Micro Carrier Systems GmbH)所公开,在此对其全部内容进行引用,出于公开制备和使用所述药剂/剂量计组合的目的。
本发明的另一方面包括制备药物组合物的方法,用于调节表达或本发明所述蛋白质的活性。这种方法包含配制一种药学上可接受的载体以及一种调节表达或本发明所述蛋白质的活性的试剂。这种组合物可进一步包括额外的活性剂。于是,本发明还包括通过配制药学上可接受的载体和调节表达或本发明所述蛋白质的活性的试剂以及一种或多种额外的生物活性剂以制备药物组合物的方法。
定义
在本发明文本中,术语“CD44ex9结合蛋白质”是指被用于具有300个氨基酸长度或更短的的蛋白质,其结合至被人类CD44基因外显子9编码的多肽。在本发明的说明书中,它也被称为“结合蛋白质”或“活性化合物”。
本发明文本中的一种蛋白质被定义为一种由氨基酸构成的分子。因此,术语蛋白质包括:二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽,更长的寡肽和氨基酸链。所述氨基酸链可以是直链或支链的形式。
本发明所述的氨基酸为有机化合物,含有至少一个氨基和至少一个羧基,它们在蛋白质中形成酰胺键。
所述氨基酸为所述蛋白质的一部分,可以从20个标准的α-氨基酸或非标准氨基酸中选取,如:硒代半胱氨酸,吡咯赖氨酸,羊毛硫氨酸,羟脯氨酸,羧基谷氨酸,2-氨基异丁酸,脱氢丙氨酸。此外,β氨基酸(例如β丙氨酸),γ氨基酸甚至更高等的氨基酸等其它氨基酸都可为所述蛋白质的一部分。
对于某些氨基酸,可选择不同的对映或立体异构体形式,例如对于存在两种对映体形式的α氨基酸,可与选择D型和L型。
所述蛋白质可以合成制成(通过无细胞系统中的有机合成方式,所述无细胞系统利用核糖体系统,可以是人造的或非人造的)或者它可由可被或不可被被基因操纵的细胞自然制备,或者被单细胞生物体(例如通过细菌或酵母细胞)或多细胞生物体自然制备。
所述蛋白质可以许多方式进行修饰。典型的修饰为翻译后修饰,其包括脂质,乙酸酯基团,磷酸基团,或碳水化合物。所述蛋白质也可采用例如生物素群进行化学修饰。
所述蛋白质可以是多聚体,包含相同的亚基(单体)或由共价键或非共价相互作用保持在一起的不同的蛋白质(异聚体)。
本文所使用的术语“结合亲和力”是指CD44ex9结合蛋白质与CD44v5区域之间的亲和力的强度,并且由解离常数KD描述。用于CD44ex9结合蛋白质与CD44v5区域之间的结合亲和力的KD的值由例如平衡法(例如,酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析法(RIA))或动力学研究(例如BIACORETM分析)所确定。
“KD”是指所述CD44ex9结合蛋白质与所述CD44v5区域之间的相对结合亲和力。高KD值表示低的结合亲和力。
术语“治疗”或“处理”指的是用于预防,减少,缓解或治愈哺乳动物中的尤其是人类的生理疾病所需的任何医疗措施。根据本发明所述的治疗也可涵盖靶向药物递送。
“治疗有效量”被定义为减少与神经和的神经退行性疾病相关的症状,如中风,的活性成分的量。“治疗上有效的”也指在疾病严重程度上或事故发生频率上与没有治疗相比所得到的任何改善。术语“治疗”涵盖了治愈或愈合以及减轻、缓解或预防的意思。
术语“表达载体”是指具有能力并入外源细胞并在外源细胞中表达异源DNA片段的载体。许多原核和真核表达载体是已知的和/或商购可得的。合适表达载体的选择是本领域技术人员所熟知的知识。
在本发明的文本中,术语“纳米颗粒”是指尺寸小于1微米并优选在1-100纳米的颗粒。因而,术语“纳米颗粒”包括由半导体材料制成的纳米晶体(所谓量子点),以及包括贵金属团簇的纳米颗粒,基于稀土的无机发光纳米颗粒,超顺磁性氧化铁纳米颗粒(IONPs),嵌段共聚物胶束,纳米细胞,树枝状聚合物,纳米管,聚合物囊泡,纳米颗粒,以及由被结晶发光磷酸钙层包围着的无定形二氧化硅组成的纳米颗粒(例如,)。
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附图说明
图1:CD44的基因组结构和蛋白质区域。
图2:(A)酵母双杂交筛选方法原理示意图;(B)用于所述Y2H-筛选的载体。
图3:阳性CD44相互作用克隆体与衍生于它的共有序列的氨基酸序列。
图4:采用纳米颗粒偶联物Q_CA19-9-3标记HT29细胞。
图5:采用纳米颗粒偶联物Q_CA19-9-5标记HT29细胞的阴性对照。
图6:采用纳米颗粒偶联物Q_CA19-9-3或者所述阴性对照MBP-纳米颗粒标记HT29细胞的定量分析。
图7:通过递增量地添加无靶标CA19-9使纳米颗粒偶联物Q_CA19-9-3与标记HT29细胞的竞争。
图8:采用纳米颗粒偶联物Q_CA19-9-3标记Colo29细胞。
图9:采用纳米颗粒偶联物Q_CA19-9-5标记Colo29细胞的阴性对照。
图10:采用纳米颗粒偶联物Q_CA19-9-3标记SW116细胞。
图11:采用纳米颗粒偶联物Q_CA19-9-5标记SW116细胞的阴性对照。
图12:采用偶联至抗CEA抗体和抗CA-19-9抗体的双特异性纳米颗粒Q_CEA/CA19-9_12标记黏液腺癌组织(样品号35)。在四个象限中,按以下条件进行分析:
左上象限:用Q_CEA/CA19-9_12标记
右上象限:通过添加无靶标MBP-CEA(25微米)用CEA CA19-9_12标记
左下象限:通过添加无靶标唾液酸化路易斯a(250微米)用Q_CEA/CA19-9_12标记
右下象限:通过添加无靶标MBP-CEA(25微米)和唾液酸化路易斯a(250微米)用Q_CEA/CA19-9_12标记
图13:依据伪样品挑选检测I的结果进行的肽A-E的亲和力的排名实验。
图14:依据FDG检测I的结果进行的肽A-E的亲和力的排名实验。
图15:依据伪样品挑选检测Ⅱ的结果进行的肽A-E的亲和力的排名实验。
图16:依据FDG检测Ⅱ的结果进行的肽A-E的亲和力的排名实验。
图17:肽A-E的亲和力排名实验的全面评价。
图18:图中显示了对于肽A、C、D和E的缺失型突变体。
图19:图中显示了对于肽B(左侧)的缺失型突变体以及FDG检测中它们的亲和力分析的结果(右侧)。
图20:图中显示了对于肽B的丙氨酸扫描变体以及PHP和FDG检测中它们的亲和力分析的结果,在这两种检测方法中各进行了两次。
图21:图中显示了替代性的CD44结构,其被生成用于结合分析。
图22:图中给出了体外生物化学实验的概览,所述体外生物化学实验采用偶联至荧光纳米颗粒的CD44v5结合肽A,B或C实施。
实施例
实施例1:CD44ex9结合蛋白质的分离
为了分离结合至CD44基因的v5区域的蛋白质或蛋白质片段,根据EP 1721 974 A1所公开的方法实施了一种竞争性双杂交筛选。作为诱饵,v5片段被融合至所述GAL4结合区域。各自的ORF被克隆到质粒载体并被指定为pGBKT7(见图2)。具有融合至GAL4激活区域的片段的一种人类cDNA信息库被用作被捕食者(见图2,载体pGADT7-RecAB)。
所述筛选在严格的筛选条件下进行,并导致了39个阳性克隆体的识别。诱饵和被捕食者质粒的选择性共转化之后,39个克隆体中的21个仍然为阳性。这21个克隆体进行测序并通过BLAST研究进行分析。因此,这21个序列可被减少至12个不同的序列,由于四个序列进行了双重识别并且一条序列存在于4个克隆体中。
进一步地,序列的比较表明这五个序列家族显示出了大量的序列同源性,允许共有序列的形成(见图3)。
实施例2:抗原表达的肿瘤细胞的离体检测
2.1背景和目的
为了展示该蛋白质-量子点偶联物的能力,以特异性检测抗原表达的肿瘤细胞,肿瘤标本或离体培养的肿瘤细胞通过荧光法被分析,并同时通过免疫组织化学用于分析各抗原的表达。作为第一抗原,癌胚抗原(CEA)被分析了。CEA是一种参与细胞粘附的糖蛋白。作为检测配体,所述抗CEA抗体被偶联至量子点QDBP-655(电荷#773780)。进一步地,所述癌症抗原19-9(CA19-9)被分析了。CA19-9是一种唾液酸化路易斯(a)抗原并代表一种肿瘤标记物,其主要被用于胰腺癌的管理。
2.2样品
2.2.1细胞培养样品
在第一组实验中,使用了离体培养的人类癌细胞株HT29,Colo25和HT29,SW116。HT29是一种附着的结直肠腺癌细胞株,Colo25是一种人结肠癌细胞株而SW116是一种结肠直肠癌细胞株。
2.2.2肿瘤样品
在独立的一组实验中,使用了来自人类肿瘤的样品。肿瘤样品No.35在2011年被从盲肠切除,并且被诊断为粘液腺癌。根据TNM分类标准,它被归类为pT4No(0/18)G3Ro。不以其他方式预处理的样品按照下文进行制备和固定。
组织切片的制备和固定
通过使用HM560MV低温恒温器(Thermo Scientific,Walldorf,德国),在-70℃储存的被切除的肿瘤样品被用于制备5微米的冰冻切片。所述切片于室温下干燥60至120分钟并用冷丙酮(-20℃)培育10分钟。在进一步于室温下干燥10分钟的步骤之后,所述切片在-70℃下被冷冻过夜。
将所述切片在封闭盒中于室温下解冻30分钟。通过在溶液中进行培育而实施固定,所述溶液含有20mg/ml二甲基辛二亚酰胺化物(DMS)以及pH8.0的250mM的Tris-盐酸缓冲液中的20mM CaCl2。之后,将所述切片在D-PBS-T缓冲液中洗涤5分钟,所述D-PBS-T缓冲液含有130mM NaCl,7mM Na2HPO4,3mM KH2PO4和0.1%Tween 20,通过在缓冲液中持续20分钟的淬灭步骤,所述缓冲液含有:130mM NaCl,7mM Na2HPO4,3mM KH2PO4和200mM甘油。在最后一步中,所述切片被置于D-PBS-T缓冲液中洗涤5分钟。
组织切片的复染
通过使用根据以下协议所述的Dako自动染色升级(DAKO Deutschland GmbH,Hamburg,Germany)来实施复染:
——用D-TBS-T缓冲液漂洗
——用1%BSA/5%山羊血清在D-PBS缓冲液中封闭60分钟
——吹净
——采用2×100μl的偶联物(20nM,在D-PBS缓冲液中的1%BSA/5%山羊血清中)孵育60分钟
——采用D-PBS-T漂洗三次
——吹净
——采用2×100μl的一级抗体(20nM,在含有1%BSA/5%山羊血清的D-PBS缓冲液中)孵育60分钟
——采用D-PBS-T漂洗三次
——吹净
——采用2×100μl的二级抗体(20nM,在含有1%BSA/5%山羊血清的D-PBS缓冲液中)孵育60分钟
——采用D-PBS-T漂洗三次
——吹净
——采用3×200μl的Hoechst荧光染料33342(在D-PBS缓冲液中浓度为2μg/ml)孵育10分钟
——采用D-PBS-T漂洗三次
——用Mowiol/三乙烯二胺(DABCO)封片
微观评估
如上所制得的切片被采用反向显微镜Axiovert200进行评价,所述反向显微镜Axiovert200具有Axiocam HrM和Axiocam Hrc CCD摄像系统,HXP 120C照明装置。通过使用Axiovision软件(4.8版,Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)对图像进行分析。
2.3蛋白质-量子点偶联物
为了抗原检测,如下表所列出的量子点被制备:
偶联物Q561是一种所述量子点QDBP-655(批号#773780)和所述配体SI6166之间的偶联物。QDBP-655具有的流体动力学直径为6nm并且拥有一个Ni-NTA配体。所述配体SI6166是一种CEA结合蛋白质,具有2.1nm的流体动力学直径,并且最终的偶联物显示出10.1nm的流体动力学直径。所述抗CEA蛋白质被偶联至所述量子点。
所述量子点Q_CA19-9-x为所述量子点QDBP-655(批号#773780)和所述抗CA 19-9抗体“MBP-NS-19-9-scFv-His6”之间的偶联物。此抗-CA 19-9抗体是一种重组的抗体模拟,包含重链(VH)和轻链(VL)的可变区可被描述为“可变区的单链片段”scFv。此scFv片段被融合至组胺-标签,其被用于偶联至所述量子点。所述抗CA 19-9抗体“MBP-NS-19-9-scFv-His6”还被命名为SI6950。
所述量子点Q_CEA CA19-9_x为双特异性偶联物,其中,携带所述抗CEA抗体SI6166的所述量子点Q561进一步与所述抗CA抗体SI6950偶联。
所述偶联物Q_CEA/CA19-9_x的不同批次以不同的量子点比配体的比率被制备(参见商标的最后一列)。
3.CA19-9偶联的纳米颗粒的结果
3.1 HT29细胞
如图4左上象限所示,所述偶联物Q_CA19-9-3标记了HT29细胞的细胞膜。具有抗CA19-9抗体的所述细胞的染色,通过Alexa Fluor 488荧光法检测出来(见右上象限),显示出显示着偶联结合特异性的信号的完美共定位。在右下象限中,将细胞通过差示干涉差显微镜术(DIC)进行显示。
在阴性对照中,偶联至MBP(MBP-His/QDP655)的量子点被使用了。如图5的左上象限所示,未能检测到任何标记。所述CA19-9抗原的存在,通过采用抗CA19-9抗体对细胞染色来验证,所述抗CA19-9抗体由Alexa Fluor 488荧光法所检测到(右上象限)。
所述CA19-9抗原的特异性标记通过滴定实验被示出。如图6所示,所述偶联物Q_CA19-9_3的增加量导致所述HT29细胞标记增加,这是通过增加相对荧光法得以证实的。与此不同,所述阴性对照MBP-His/QDP655仅造成一个稀疏荧光标记,在较高浓度的偶联物中也没有表现出重大增长。
所述CA19-9的标记特异性通过竞争性实验进一步得到验证,如图7所示:向所述标记混合物中添加的游离CA 19-9抗原的增加量导致CA 19-9标记下降。
3.2 Colo29细胞
如图8的左上象限所示,所述偶联物Q_CA19-9-3标记了Colo29细胞的细胞膜。具有抗CA19-9抗体的所述细胞的染色,通过Alexa Fluor 488荧光法检测出来(见右上象限),显示出显示着偶联结合特异性的信号的完美共定位。在右下象限中,将细胞通过差示干涉差显微镜术(DIC)进行显示。
在阴性对照中,偶联至MBP(MBP-His/QDP655)的量子点被使用了。如图9的左上象限所示,未能检测到任何标记。所述CA19-9抗原的存在,通过采用抗CA19-9抗体对细胞染色来验证,所述抗CA19-9抗体由Alexa Fluor 488荧光法所检测到(右上象限)。
3.3 SW116细胞
如图10的左上象限所示,所述偶联物Q_CA19-9-3标记了Colo29细胞的细胞膜。具有抗CA19-9抗体的所述细胞的染色,通过Alexa Fluor 488荧光法检测出来(见右上象限),显示出显示着偶联结合特异性的信号的完美共定位。在右下象限中,将细胞通过差示干涉差显微镜术(DIC)进行显示。
在阴性对照中,偶联至MBP(MBP-His/QDP655)的量子点被使用了。如图11的左上象限所示,未能检测到任何标记。所述CA19-9抗原的存在,通过采用抗CA19-9抗体对细胞染色来验证,所述抗CA19-9抗体由Alexa Fluor 488荧光法所检测到(右上象限)。
4.双特异性偶联纳米颗粒的结果
为了检测双特异性偶联纳米颗粒与给定靶标的抗原相互作用的能力,进行了一系列实验。出于此目的,与所述抗CA19-9抗体和所述抗CEA抗体偶联的纳米颗粒被用于检测上述样品NO.35的肿瘤细胞上的相应的抗原。所述特异性通过采用无靶标MBP-CEA与19-9进行抑制而被证实。
如图12的左上象限所示,所述双特异性纳米颗粒标记了所述肿瘤组织的细胞膜。采用抗CA19-9抗体或抗CEA抗体对肿瘤组织的染色,在每种情况下,都显示出了结合着所述纳米颗粒的完整标记信息的部分共定位。
当所述双特异性纳米颗粒与游离靶标MBP-CEA结合使用时,可以观察到标记,其显示出与染色的所述抗CA-19-9抗体(见图12的右上象限)的完美共定位。于是,游离靶标抑制了与所述细胞绑定CEA的相互作用,却仍然允许所述CA 19-9的标记。
如图12的左下象限所示,游离靶标Sialyl-Lewisa的添加抑制了与所述细胞CA19-9抗原的相互作用,却仍然保留了CEA标记。
在最后的实验中,所述双特异性纳米颗粒与游离靶标、MBP-CEA和Sialyl-Lewisa相结合(见图12的右下象限)。因此,标记被完全抑制住(见左上象限)。所有抗原的共定位表达均通过与各个抗CEA和CA19-9抗体染色来验证。
实施例3:通过亲和力排名进行的CD44ex9结合蛋白质的表征
介绍:
如在的实施例1的竞争性双杂交筛选中所识别的所述CD44ex9结合蛋白质,通过两种不同的亲和力分析法被进一步分析,以建立亲和力的排名。
方法:
作为第一种分析法,采用了伪样品挑选检测,其按照如下所述进行:为了比较两种不同肽的亲和力,菌落分别表达该第一肽或第二肽,涂布于琼脂板的第一或第二半。用于定义一个菌落作为“命中”的阈值随后被确定,预先定义的第一肽的菌落百分比,在该板的基准区域被选为“命中”。在同样的实验中,第二肽的菌落被扫描和拾起。第二肽的菌落数随后被与第一肽的菌落数相比较,并且以百分比表示。基于此百分比,可以推导出相对作用强度(即对所述CD44肽的亲和力)。
FDG检测是基于两个杂交扫描系统的报告系统。从而,具有CD44v5肽的所述GAL4结合区域与融合至GAL4活化2区域的相应的肽相互作用。经过复杂的形成,两个独立的报告基因被激活,第一个编码荧光蛋白,第二个报告基因编码所述β-半乳糖苷酶,其酶活性可通过使用荧光基质荧光素二-β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)确定。
在伪样品挑选检测中,所有报道系统都将被认为是:开始,子叶报告基因的荧光,并且在采用荧光基质培育之后,第二种酶的活性编码报告基因。于是,两种不同报告基因的结果可在一个实验中被确定。
如图13-16所示,SEQ ID NO:1-5这5个肽中的2个的十种不同的组合在伪样品挑选检测中进行了比较,并且平行实施了FDG检测。于是,两个独立的实验被实施,如图13-20所示。
结果:
所有实验表明,肽B(SEQ ID NO:3)具有对所述CD44V5肽最高的亲和力,随后是肽C和肽D。图17给出了亲和力排名分析的概览。
实施例4:通过缺失CD44ex9结合大蛋白质的表征
介绍:
对于5个肽,实施了基于缺失表位映射,以便识别并表征这些肽的结合位点。该结果表明了一个重要的信息,其能够有助于与CD44v5关联的治疗和诊断的发展。
方法:
对于所有的5个肽A-E,缺失突变体在PHP和FDG分析中被生成并检测。对于肽A、C、D和E,N-或C-末端缺失片段生成并命名为肽A1、C1、D1和E1。用于A、C、D和E的缺失突变体的序列如图18所示。
对于所述肽B,以及一共四个缺失突变体,即肽B1-B4如图19所示的那样被生成。
所述肽在PHP和FDG检测中进行了比较测试。
对于肽B,18个氨基酸的N末端缺失(肽B1)导致了一种活性稍微下降的肽(将图19,右侧)。因而,此N末端区域并非对所述CD44v5肽相互作用的关键所在,并因此肽B1代表了一段核心序列,用于与CD44v5肽相互作用。
如图19所示,具有N末端和C末端缺失的肽(肽B4),仅仅具有C末端缺失(肽B2)并且具有核心序列“QLSFEVQWETS”(肽B3)的缺失,完全丧失结合至CD44v5的能力。这一结果与肽B1展示出的至少核心序列C末端部分一起是CD44v5结合所需的属性完全一致。
肽A1和C1与其亲本肽A与C的区别在于在C末端缺乏3个或8个氨基酸长度的序列,包括所述共有序列的"AIE"基序。在这两种情况下,结合至CD44v5几乎完全被阻断,表现出所述共有序列的这部分的相关性。
肽D1和E1与其亲本肽D与E的区别在于在N末端缺乏包括所述核心序列的“PYYGKXLXX”基序的序列。在这两种情况下,结合至CD44v5并不会削弱。然而,肽D1具有类似的亲和力,与亲本肽E相比,所述肽E1甚至表现出朝向CD44v5的更强的结合。
这些结果与上述肽B的结果完美一致。所述N末端区域并不是CD44v5结合所必须的,一条缩短的肽及其作为核心序列的各共有序列代表优选的肽基序,用于与CD44v5相关联的诊断和治疗。
实施例5:通过丙氨酸扫描而进行的CD44ex9结合蛋白质的表征
介绍:
对于大多数仿射肽B而言,其核心序列的丙氨酸被扫描以识别对于CD44v5结合至关重要的那些氨基酸。如由突变的肽B3所示,所述核心序列“QLSFEVQWETS”的存在对于CD44v5结合是必须的。
方法:
所述肽B被用于生产共11种变体,由此,所述核心序列“QLSFEVQWETS”的每个氨基酸独立地被氨基酸丙氨酸取代(见图20)。这些变体与所述肽B进行比较而以PHP及FDG分析方法被检测。对于全部5个肽A-D,缺失变体被产生,并以PHP及FDG分析方法进行检测。
结果:
如图20所示,所述核心序列的第一氨基酸的取代并不会造成朝向CD44v5的亲和力发生显著变化。但是,带下划线的核心序列的第11个氨基酸丝氨酸用丙氨酸进行更换,导致具有更高亲和力的肽。
于是,在所述核心序列里,没有任何单一的氨基酸对于CD44v5结合而言是至关重要的,然而必须被假定为,这些氨基酸以协调的方式结合至所述靶标。
然而,基于结果,甚至改进的肽B和在第11氨基酸位置具有Ser-Ala交换的改进的共有序列被识别出来(见SEQ ID NO:No.58-62的共有序列)。
实施例5:CD44ex9结合蛋白质向不同CD44变体的结合分析
如图21所示,共有四种不同的CD44变体被生成,其含有与不同区域相结合的v5区域。如PHP分析法和FDG分析法所揭示的那样,本发明所述的CD44ex9结合蛋白质也能够结合这些CD44变体。作为阴性对照,CD44变体pGKT7_CD44被用于仅编码区域1-5以及15,16(此处未示出)。正如所预期的,所述CD44ex9结合蛋白质没有表现出向此CD44蛋白质的任何结合。
实施例5:偶联着CD44ex9结合蛋白质的纳米颗粒向体外培养的表达CD44v5的肿瘤细胞的结合分析
为了强调所述CD44ex9结合蛋白质的诊断和治疗功效,肽A、B和C被表达为MBP融合蛋白,含有组氨酸-标签,偶联至量子点并被用于表达CD44的肿瘤细胞的免疫细胞化学分析。
方法:
所述肽被表达为大肠杆菌中的MBP-(YTH_v5_A B/C)-His6融合蛋白,使用Ni-NTA亲和层析进行纯化,并且通过His6-标签偶联至所述QDBP-655量子点。这些量子点具有CdSe核心,ZnS壳以及含有咪唑化合物的钝化层。
本文所述的QDBP-655纳米颗粒的特性可总结如下:
所述纳米颗粒具有硒化镉(CdSe)核心和硫化锌(ZnS)壳。所述壳被二肽涂层所围绕,所述二肽涂层包含甘氨酸-组氨酸,组氨酸-亮氨酸,肌肽,以及氨基-PEG(聚乙二醇),通过氨基二苯甲酮与3-[三(羟甲基)膦]丙酸酯(THPP)被交联。所述二肽涂层通过其咪唑环配位结合至所述壳结构的锌离子。无伯氨基在二肽涂层中可以被用于偶联反应。关于所述二肽涂层的附加信息被公开于美国专利申请US2003/0059635 A1中。
QDBP-655由Life Technologies Corporation(Eugene,Oregon,USA)所出售。其以呈红色的胶体悬浮液而在缓冲液中被递送。所述纳米颗粒展示出以下产品特点:
外观:红透明液体
流体力学半径:<6.5nm(通过尺寸排阻色谱法测定)
分子量:1000kDa
最大发射波长:655nm±4nm
偶联:
被表达的和被亲和纯化的肽A、B或C以pH=8.3的50mM硼酸钠溶液被透析2小时(Slide-A-Lyzer Mini Dialysis Uni-10 KDa(Thermo Fisher,Rockford,IL,USA))。之后,该蛋白质浓度被确定并且将溶液稀释到所需浓度。QDBP-655量子点和蛋白质被一起混合至0.3μM(QDBP-655)的结束浓度,在无菌硼硅酸盐样品瓶中,QDBP-655/配体的比率为1∶12.5,1∶25,1∶50,1∶75和1∶100,如下表中总结所示:
Q_CD44v5 | QDBP/L | nQDBP-655 | cQDBP-655 | VQDBP-655 | V配体 | n配体 | c配体 |
_X1 | 1:- | 78pmol | 3.9pmol | 20μl | 240μl | - | - |
_X2 | 1:12.5 | 78pmol | 3.9pmol | 20μl | 240μl | 975pmol | 4.06pmol/μl |
_X3 | 1:25 | 78pmol | 3.9pmol | 20μl | 240μl | 1950pmol | 8.125pmol/μl |
_X4 | 1:50 | 78pmol | 3.9pmol | 20μl | 240μl | 3990pmol | 16.25pmol/μl |
_X5 | 1:75 | 78pmol | 3.9pmol | 20μl | 240μl | 5850pmol | 24.4pmol/μl |
_X6 | 1:100 | 78pmol | 3.9pmol | 20μl | 240μl | 7800pmol | 32.5pmol/μl |
成功的偶联通过SDS-琼脂糖凝胶电泳显示,由此,1∶50或更高的比率导致分子量的显著增大,从而显示了成功的偶联反应。
免疫细胞化学分析
肿瘤细胞的免疫细胞化学分析按如下所述进行:
·将每种5×105肿瘤细胞置于涂层镜片上
·在37℃,5%CO2条件下培育48小时
·采用1mL的D-PBS洗涤细胞3×1分钟
·采用1mL的二甲亚胺(DMS)溶液(在250 ml三羟甲基氨基甲烷盐酸盐中的20mg/ml DMS,20mM CaCl2,pH8.0)固定20分钟
·采用1mL的D-PBS洗涤细胞1×1分钟
·在含0.2%的甘氨酸的在D-PBS中培育20分钟而进行淬灭
·在含1%BSA/5%山羊血清的D-PBS中封闭60分钟
·在室温下采用50μl预培养的Qdot肽偶联物(100nM)进行孵育
·采用1mL的D-PBS洗涤细胞3×5分钟
·采用50μl一级抗体(抗CD44v5:VFF-7,1∶25)进行孵育
·采用1mL的D-PBS洗涤细胞3×5分钟
·采用50μl二级抗体进行孵育(GAM-A488,1∶100)
·采用1mL的D-PBS洗涤细胞3×5分钟
·采用300μl的Hoechst 33342(D-PBS中浓度为200ng/ml)复染10分钟
·采用1mL的D-PBS洗涤细胞3×5分钟
·用Mowiol 4-88(Sigma Aldrich,St.Louis,Ml,USA)封片
结果:
偶联至肽A、B和C的纳米颗粒采用人结肠癌细胞株HCT-1 16进行检测(见图22)。当使用所述肽偶联的纳米颗粒时,可以观察到肿瘤细胞的标记,作为阳性对照,其与所述抗CD44v5抗体所产生标记共定位。
Claims (24)
1.一种结合至被人类CD44基因外显子9(CD44ex9)所编码的多肽的蛋白质,所述蛋白质包含以下物质或者由以下物质组成:
(i)根据SEQ ID NO:1-5和SEQ ID NO:39-52所示的氨基酸序列;或
(ii)与SEQ ID NO:1-5和SEQ ID NO:39-52所给出的氨基酸序列具有至少80%一致性的,优选85%一致性的,更优选90%一致性的,且最优选95%一致性的氨基酸序列;或
(iii)与由以下序列所限定的CD44结合模体具有至少90%一致性的,优选至少95%一致性的或100%一致性的氨基酸序列:
如SEQ ID NO:6-10所示的"PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQX10-14AIE",或者由如SEQ ID NO:53-62所示的"PGLQPSFAVQVX2 S/AXQX10-14AIE"所定义的序列,其中,X表示任意的氨基酸;并且
其中所述的蛋白质具有100个氨基酸或更小的长度。
2.根据权利要求1所述的CD44ex9结合蛋白质,其特征在于,其结合至一种CD44亚型,所述CD44亚型包含外显子9所编码的区域。
3.根据权利要求2所述的CD44ex9结合蛋白质,其特征在于,所述CD44亚型选自以下名单,该名单包括:
a)CD44v5,
b)CD44v5-v6,
c)CD44v3-v6,
d)CD44v3-v6,
e)CD44v2-v10,
f)CD44v3-v10,
g)CD44v4-v7,
h)CD44v4-v10。
4.根据权利要求1-3所述的CD44ex9结合蛋白质,其特征在于,其被偶联或融合至异源蛋白质或多肽,所述异源蛋白质或多肽优选为一种酶,所述酶从前体分子催化细胞毒素剂或细胞抑制剂的产生或催化标记粘附至所述蛋白质。
5.一种偶联物,包含:
a)根据权利要求1-4所述的CD44ex9结合蛋白质;
b)一种化合物,选自以下物质所构成的组:碳水化合物,染料分子,放射性同位素,毒素,细胞抑制剂,细胞因子,免疫调节剂,或它们的前药;
其中,所述化合物直接连接至所述CD44ex9结合蛋白质或者通过连接分子连接至所述CD44ex9结合蛋白质。
6.一种分离的核酸分子,用于编码根据权利要求1-4所述的CD44ex9结合蛋白质。
7.一种表达载体,其包含有根据权利要求6所述的核苷酸序列。
8.一种宿主细胞,其包含有根据权利要求7所述的表达载体。
9.一种生产根据权利要求1-4所述的CD44ex9结合蛋白质的方法,所述方法包括:
a)采用表达构建来转化宿主细胞,所述表达构建包含编码权利要求1-4所述蛋白质的核酸分子;并且
b)在适于生产所述CD44ex9结合蛋白质或各种融合蛋白质的条件下培养所述宿主细胞。
10.一种纳米颗粒,其特征在于,其偶联至根据权利要求1-3所述的CD44ex9结合蛋白质。
11.一种纳米颗粒,其特征在于,其偶联至根据权利要求4或5所述的偶联物或融合蛋白质。
12.根据权利要求10或11所述的纳米颗粒,其特征在于,进一步偶联到至少一种肿瘤抗原结合物质和/或细胞毒素剂。
13.根据权利要求12所述的纳米颗粒,其特征在于,所述肿瘤抗原结合物质选自以下名单,该名单包括:抗CEA抗体,抗CA-19-9抗体,以及一种优选被修饰的粘附素,或者它们任意的结合。
14.根据权利要求10-13所述的纳米颗粒,其特征在于,所述纳米颗粒选自以下物质所构成的组:量子点,贵金属团簇,超顺磁性氧化铁纳米颗粒(IONPs),嵌段共聚物胶束,纳米细胞,树枝状聚合物,纳米管,聚合物囊泡,纳米颗粒,以及由被结晶发光磷酸钙层包围着的无定形二氧化硅组成的纳米颗粒,具有小于100nm的直径的SiO2/Zn2SiO4:Mn2+和SiO2/Ca10(PO4)6OH:Eu3+核心-壳纳米颗粒,以及荧光染料标记的混合的纳米颗粒。
15.根据权利要求10-13所述的纳米颗粒,其特征在于,所述纳米颗粒具有无机核心和包含咪唑成分的涂覆层,包括所述涂覆层的所述无机核心具有的最小直径为不超过15nm。
16.根据权利要求15所述的纳米颗粒,其特征在于,所述咪唑成分为一种包含至少一个组氨酸残基的肽,并且优选为二肽。
17.根据权利要求16所述的纳米颗粒,其特征在于,所述咪唑成分为含组氨酸的不同二肽的混合物。
18.根据权利要求10-17中任一项所述的纳米颗粒,其特征在于,所述纳米颗粒是非惰性的。
19.根据权利要求1-4中任一项所述的CD44ex9结合蛋白质或者根据权利要求10-18中任一项所述的纳米颗粒在诊断或治疗以下疾病中的应用:自身免疫性疾病,如:胰岛素依赖型糖尿病,多发性硬化症,干燥综合征或系统性红斑狼疮(SLE);皮肤病,如:牛皮癣或过敏性皮炎;慢性炎症性疾病,如:类风湿性关节炎或炎症性肠疾病;组织损伤;变应性疾病和癌症。
20.根据权利要求19所述的CD44ex9结合蛋白质或所述的纳米颗粒在制备造影剂中的应用。
21.根据权利要求20所述的CD44ex9结合蛋白质或所述的纳米颗粒,其特征在于,所述造影剂被用于识别癌细胞或原位癌细胞。
22.根据权利要求21所述的CD44ex9结合蛋白质或所述的纳米颗粒,其特征在于,被识别的所述癌细胞选自:
a)腺癌细胞;
b)胸腺上皮肿瘤细胞;
c)宫颈癌细胞;
d)非霍奇金淋巴瘤细胞;
e)肺细胞癌细胞;
f)胰腺癌细胞;以及
g)癌症干细胞。
23.一种药物组合物,其特征在于,包含根据权利要求1-4中任一项所述的CD44ex9结合蛋白质或者根据权利要求10-18中任一项所述的纳米颗粒以及药学上可接受的赋形剂。
24.一种药物/放射量测定器组合套装,包括:
a)一种被单独给药的药物,和
b)一种针对特定病人属性的诊断指示系统,所述属性与施用给病人的药剂的效应,副作用,相互作用,新陈代谢,吸收,分布,代谢以及消除有关;
其中,所述特定病人属性选自内源性物质,调节机制,基因或指标体系,并且
其中,所述药物或所述诊断指示系统包含根据权利要求1-4所述的CD44ex9结合蛋白质或根据权利要求10-18中任一项所述的纳米颗粒。
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