ES2639855T3 - Nanopartícula conjugada a péptidos de unión a CD44 - Google Patents

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Abstract

Una nanopartícula conjugada a una proteína capaz de unirse a un polipéptido codificado por el exón 9 de CD44 humano (CD44ex9), dicha proteína comprende o consiste en (i) una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID No. 1 to 5; o (ii) una secuencia de aminoácidos con al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos dada en las SEQ ID No. 1 a 5 en su conjunto, en el que dicha proteína tiene una longitud de 100 aminoácidos o menor.

Description

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DESCRIPCION
Nanopartmula conjugada a peptidos de union a CD44 Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a nanopartmulas conjugadas a una protema capaz de unirse al dominio codificado por el exon 9 del CD44 humano (CD44ex9). La invencion se refiere ademas a un procedimiento de produccion para la protema y las respectivas nanopartmulas conjugadas y al uso de los conjugados de la invencion para el tratamiento y diagnostico de diversas enfermedades y, especialmente, para cancer.
Antecedentes de la invencion
Estudios extensos de los patrones de transcripcion del cancer han llevado al descubrimiento de objetivos moleculares para distinguir los canceres malignos de los benignos y los mas agresivos de los que son menos agresivos. Los canceres a menudo sobreexpresan una serie de protemas, incluyendo ciertos antfgenos de superficie celular, por ejemplo, receptores de superficie celular. Los anticuerpos que se unen a tales antfgenos de superficie celular sobreexpresados pueden facilitar la deteccion y el tratamiento de tales canceres. Se han utilizado varios enfoques para generar anticuerpos contra los receptores de superficie celular de cancer que pueden usarse como diagnosticos o terapeuticos potenciales. La identificacion de los receptores de superficie celular sobreexpresados y de los anticuerpos que se unen a ellos proporciona una via para el desarrollo de terapias contra el cancer, especialmente para los subtipos de cancer con mal pronostico y resistencia a terapias tradicionales. CD44, CA19-9 y CEA son dichos receptores de superficie celular sobreexpresados, que se sabe que son relevantes para la progresion y la malignidad tumoral.
CD44, una molecula de adhesion principal para la matriz extracelular, ha estado implicada en una amplia variedad de procesos fisiologicos, incluyendo el direccionamiento y la activacion de leucocitos, la cicatrizacion de heridas y la migracion celular, asf como en la invasion de celulas tumorales y la metastasis (Gunthert y col., 1991; Nagano y Saya, 2004; Ponta y col., 2003).
CD44 es una molecula de cadena unica que comprende un dominio extracelular N-terminal conservado, una region proximal de membrana no conservada, una region variable que expresa diversas combinaciones de exones variantes, un dominio transmembrana conservado y una cola citoplasmica conservada. El mapa genomico de CD44 incluye 5 exones constantes en el extremo 5' y 5 exones constantes en el extremo 3'. El gen CD44 de raton incluye tambien 10 exones variantes en el centro de la molecula designada V1-V10, lo que da como resultado un total de 20 exones. El gen CD44 humano comprende solo 9 de estos 10 exones variantes (V2-V10), comprendiendo de este modo un total de 19 exones. El empalme alternativo diferencial genera muchas isoformas de CD44 que expresan diversas combinaciones de exones variantes (denominados Exon Vx, x = 1 a 10), que se insertan en el dominio proximal de la membrana y constituyen la region variable de la molecula. Estas moleculas se denominan variantes de CD44 (CD44v). Hasta la fecha, se conocen 20 isoformas de CD44.
Mientras que la isoforma CD44 estandar (CD44s) se expresa predominantemente en celulas hematopoyeticas y subpoblaciones de celulas epiteliales normales, se ha descubierto que las variantes de CD44 con inserciones en la region extracelular proximal de la membrana eran abundantes en diversos tumores humanos, incluyendo carcinomas de colon, de mama, gastrico, vejiga, de prostata y diversas neoplasias hematopoyeticas. Informes adicionales sugirieron una estrecha correlacion entre la expresion del CD44 variante y la progresion tumoral y, en particular, la diseminacion linfatica de celulas neoplasicas.
En conjunto, estas observaciones apuntan a una funcion importante de las variantes CD44 en la iniciacion tumoral y el mantenimiento de celulas cancerosas ademas de sus funciones mas establecidas en la adhesion y migracion celular.
Ademas del papel de CD44 en el cancer, tambien se ha sugerido que el CD44 es un potencial objetivo en enfermedades autoinmunes. Se ha publicado (Hale y col., 1992) que la administracion de una protema o peptido de CD44 se puede usar para tratar diversas enfermedades autoinmunes.
Basandose en el papel establecido de CD44 en cancer y en las enfermedades autoinmunes, tambien se han generado anticuerpos monoclonales dirigidos contra diversas regiones variantes de CD44 como agentes potenciales para el diagnostico o el tratamiento de trastornos relacionados con CD44.
Seiter y col., describen mAb dirigidos contra variantes espedficas de metastasis de la protema de superficie CD44 de un adenocarcinoma pancreatico de rata (Seiter y col., 1993). Estos anticuerpos se proponen para producir inmunosupresion para el tratamiento terapeutico de trastornos inmunorreguladores incluyendo, por ejemplo, enfermedades del tipo reumatico. Tambien se han proporcionado anticuerpos monoclonales reactivos con CD44 que inhiben la proliferacion de linfocitos T para el tratamiento de diversas enfermedades autoinmunes. Tambien se ha indicado que los anticuerpos monoclonales que se unen a formas de CD44 que contienen el peptido exon v6 son utiles para diagnosticar enfermedades inflamatorias (Jalkanen y col., 1986).
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El documento WO 91/17248 A1 se refiere al uso de anticuerpos anti-CD44v para la terapia y el diagnostico de tumores. El documento WO 95/00851 A1 se refiere al uso de anticuerpos dirigidos contra los exones variables de CD44 para el diagnostico de tumores. El documento WO 95/04547 A1 desvela el uso de anticuerpos anti-CD44 dirigidos especialmente contra epftopos dentro de la secuencia del exon v5 para fines inmunoterapeuticos e inmunogammagraficos. Un anticuerpo anti-CD44 dirigido contra el exon v6 se desvela en el documento WO 95/33771 A1. Adicionalmente, el documento EP 0 538 754 A2 ensena el uso de anticuerpos dirigidos contra variantes de CD44 para la inmunosupresion.
Los anticuerpos anti-CD44 de la tecnica anterior muestran varias desventajas. Representan moleculas grandes y complejas que tienen que generarse mediante procedimientos de produccion recombinante. De este modo, el proceso de produccion es elaborado, costoso y tiene que cumplir estrictos requisitos reglamentarios. Adicionalmente, la necesidad de un potencial inmunogenico reducido requiere la generacion de anticuerpos humanos o humanizados.
La entrada de base de datos n.° ADR58907, recuperada del numero de referencia EBI. GSP: ADR58907 (BASE DE DATOS Geneseq [Online] 18 de noviembre de 2004, "Human Elk1 phosphorylation/Eik1 kinase activation protein- SEQ ID 10.") y el documento WO 2004/072277 A2 (ASAHI KASEI PHARMA CORP [JP]; MATSUZAKI OSAMU [JP]; MATSUDA AKIO [JP]; 26 de agosto de 2004) desvelan un peptido de 184 aminoacidos que es un 100 % identico a la SEQ ID No. 2 de la presente solicitud en un solapamiento de 32 aa. De manera notable, esta entrada de base de datos no ensena ninguna union a CD44.
La entrada de base de datos. n.° AWV72632 (recuperada del n.° de referencia EBI GSP:AWV72632, DATABASE Geneseq [Online] 9 de julio de 2009, "Human pancreatic cancer associated target (PCAT) protein, SEQ ID14.") y el documento US 2009/138977 A1 (DOMON BRUNO [US] y col.; 28 May 2009) desvelan una protema de 198 aminoacidos que comprende los aa 33 a 66 de la SEQ ID. No. 4 de la presente invencion con solo 1 aminoacido de diferencia. Para dicha protema no se desvela ninguna union a CD44. La entrada de base de datos n.° AZM18611 (recuperada del n.° de referencia EBI GSP: AZM18611, DATABASE Geneseq [Online] 13 de octubre de 2011, "Human lung cancer target LCAT protein sequence SEQ: 1.") y el documento Us 2011/212085 A1 (JOSELOFF ELIZABETH [US] y col.; 1 de septiembre de 2011) desvelan una protema LCAT objetivo de cancer de pulmon humano de 102 aminoacidos que completa la SEQ ID NO: 5 completa de 62 aa de longitud de la presente solicitud. No hay divulgacion de union a CD44.
La solicitud WO 1995/04547 A1 (Boehringer Ingelheim Int. [OE]; Kernforschungszentrum Karlsruhe [OE]; Adolf G) 16 de febrero de 1995) desvela
Kenichiro y col., ("Inhibition of liver metastasis formation by anti CD44 variant exon 9 monoclonal antibody", Int. J. Oncology, 1997, vol. 11, n.° 6, paginas 1257-1261) la capacidad de un anticuerpo monoclonal dirigido contra el exon 9 de la variante de CD44 para inhibir la formacion de metastasis hepatica. Sin embargo, Kenichiro y col., no mencionan nada sobre los peptidos que se unen al exon 9 de CD44.
Kimura y col., 2013 ("CD44variant exon 9 plays an important role in colon cancer initiating cells", Oncotarget, paginas 785-791) indica un papel importante del exon 9 de la variante de CD44 para el inicio del cancer de colon pero no desvela peptidos de union a CD4v9.
Park y col., ("Screening of Peptides Bound to Breast Cancer Stem Cell Specific Surface Marker CD44 by Phage Display", Molecular Biotechnology, 2011, vol. 51, n.° 3, paginas 212-220) se refiere a un cribado de peptido de expresion en fagos contra CD44, pero no desvela ningun peptido relacionado con los peptidos de la presente invencion.
La entrada de base de datos n.° AZV55426 (recuperada del n.° de referencia EBI GSP: AZV55426; database Geneseq [Online] 21 de junio de 2012, "Human derived cancer-associated target protein SEQ ID NO: 673.") y el documento US 8 168 586 B1 (Fang Dong y col., 1 de mayo 2012) desvelan una secuencia con 57 aa y que tiene una identidad del 83,3 % con la secuencia completa de la SEQ ID No: 4 de la presente invencion. Dicha protema se identifica como una protema diana asociada al cancer humano. Sin embargo, no hay ninguna referencia de union al exon 9 de CD44.
La entrada de base de datos n.° C9J6S2 (UniProt Online database, 3 de noviembre de 2009; "SubName: Full = Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-3 {EC 0:00003131 Ensembl: ENSP00000418353};" recuperada de n.° de referencia EBI UNIPROT:C9J6S2) y Burkhard y col., ("Initial characterization of the human central proteome", BMC Systems Biology 2011, vol. 5, n.° 1, pagina 17) desvelan una subunidad beta-3 de ATPasa transportadora de sodio/potasio con 89 aa y que tiene una identidad del 83,3 % con la secuencia completa de la SEQ ID No: 4 de la presente invencion. No hay ninguna referencia de union al exon 9 de CD44.
La entrada de base de datos n.° AXT76926 (recuperada del n.° de referencia EBI GSP: AXT76926; Geneseq Online, 18 de febrero de 2010; "Human Na-K ATPase beta3 CAT protein SEQ ID: 130.") y el documento US 7 582 441 B1 (Ruben S y col., 1 de septiembre de 2009) desvelan un () desvelan una protema beta 3 CAT de la ATPasa de Na-K humana con 57 aa y que tiene una identidad del 89,5 % con la secuencia completa de la SEQ ID No: 4 de la presente invencion. No hay ninguna referencia de union al exon 9 de CD44.
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La entrada de base de datos n.° ARW93074 (recuperada del n.° de referencia EBI GSP: ARW9307; Geneseq Online 7 de agosto de 2008, "N-linked glycopeptide SEQ: 101."), la entrada de base de datos n.° ARW9307 (recuperada del n.° de referencia EBI GSP: ARW93073, database Geneseq Online, 7 de agosto de 2008, "N-linked glycopeptide SEQ: 100.") y el documento WO 2008/066629 A2 (Inst Systems Biology, Aebersold R, Zhang H, 5 de junio de 2008) desvelan la secuencia ID No: 100 de 25 aminoacidos y la secuencia ID No: 101 de 32 aminoacidos ambas con una identidad del 54,9 % con la secuencia completa de la SEQ ID No: 4.
La entrada de base de datos n.° AAM62836 (recuperada del n.° de referencia EBI GSP: AAM62836, database Geneseq Online, 5 de noviembre de 2001, "Human brain expressed single exon probe encoded protein SEQ ID NO: 34941.") y el documento WO 01/57275 A2 (Molecular Dynamics Inc.; Penn Sharron G; Hanzel Oavio K; 9 de agosto de 2001) desvelan una protema de 63 aminoacidos, expresada en el cerebro y que tiene una identidad del 61,3% con la SEQ ID No: 5 de la presente invencion.
De este modo, todavfa existe la necesidad de moleculas de union a variantes de CD44. El objeto de la presente invencion es, por tanto, proporcionar una sustancia de union a la variante de CD44 que supera al menos uno de los inconvenientes mencionados anteriormente.
Este problema se resuelve proporcionando una protema de union a la variante de CD44 de acuerdo con la reivindicacion 1 y un uso de dicha protema de union para diagnostico y tratamiento, especialmente utilizando nanopartmulas recubiertas con dicha protema. Las realizaciones espedficas de la invencion son objeto de otras reivindicaciones independientes o dependientes.
Sumario de la invencion
En un primer aspecto, la invencion proporciona nanopartmulas conjugadas a una protema capaz de unirse a un polipeptido codificado por el exon 9 de CD44 humano (CD44ex9), dicha protema comprende o consiste en
a) una secuencia de aminoacidos de acuerdo con las SEQ ID No. 1 to 5; o
b) una secuencia de aminoacidos con al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoacidos dada en las SEQ ID No. 1 a 5 en su conjunto,
en el que dicha protema tiene una longitud de 100 aminoacidos o menos.
Mediante la realizacion de una evaluacion de dos hfbridos de levadura, los inventores fueron capaces de identificar cinco peptidos diferentes con una union espedfica al polipeptido codificado por el exon 9 de CD44. Las secuencias de aminoacidos se presentan en la Figura 3 y en la siguiente tabla y se designan como SEQ ID No. 1 a 5.
SEQ ID No.
Secuencia de aminoacidos
1
PGVPGVQLTA NTQSLVLMSA FDIAIEVTFI SS
2
PGLQISFAVQ VPVSVQESSP SVQEGIQIQV AIE
3
PGGDHERAPA SCYNGERLSS QLSFEVQWET SETLKILVKP LVFVCREVYD PPC
4
PGPYYGKKLH VGYLQPLAAV QVSFAPNNTG KEVTVECKID GSANLKSQDD RDKFLGRVMF KITARA
5
YYPYYGKLLQ PKYLQPLLAV QFTNLTMDTE IRIECKAYGE NIGYSEKDRF QGRFDVKIEV KS
Un analisis adicional revelo que se puede derivar una secuencia de consenso a partir de estas secuencias que exhiben la siguiente secuencia de aminoacidos:
PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQX10-14AIE.
Estas secuencias de consenso se designan SEQ ID No. 6 a 10 como se representa en la siguiente tabla, por lo que estas cinco secuencias difieren en la longitud de la secuencia arbitraria X10-14. Cabe destacar que "X" se define como un aminoacido arbitrario.
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SEQ ID No.
Secuencia de aminoacidos
6
PYYGKXLXXX YLQPSFAVQV XXSXQXXXXX XXXXXAIE
7
PYYGKXLXXX YLQPSFAVQV XXSXQXXXXX XXXXXXAIE
8
PYYGKXLXXX YLQPSFAVQV XXSXQXXXXX XXXXXXXAIE
9
PYYGKXLXXX YLQPSFAVQV XXSXQXXXXX XXXXXXXXAI E
10
PYYGKXLXXX YLQPSFAVQV XXSXQXXXXX XXXXXXXXXA IE
La capacidad para derivar una secuencia de consenso unica que abarca todos los peptidos independientes que interaccionan con CD44 aislado valida adicionalmente los resultados del procedimiento de seleccion de dos Idbridos.
Debe hacerse hincapie en que los peptidos de la invencion muestran por primera vez que no solo pueden generarse anticuerpos grandes contra epftopos CD44, sino mas bien peptidos pequenos con una longitud entre 32 y 66 aminoacidos que se unen de forma espedfica y selectiva a un dominio de CD44 clmicamente relevante.
En contraste con los anticuerpos (monoclonales) CD44v5 de la tecnica anterior, estos peptidos presentan varias ventajas.
Puesto que representan peptidos cortos sin la necesidad de formar complejos o puentes disulfuro intramoleculares son mucho mas faciles de producir y purificar.
Como peptidos con una longitud entre 32 y 66 aminoacidos es incluso posible sintetizarlos mediante smtesis en fase solida (segun Merrifield). Esta smtesis proteica ex vivo es especialmente ventajosa dados los estrictos requisitos reguladores asociados con la expresion de protemas recombinantes.
Adicionalmente, como peptidos pequenos, pueden estar ventajosamente conjugados o fusionados a una protema diferente, compuestos espedficos o incluso nanopartmulas para su uso para tratamiento o diagnostico.
Como peptidos pequenos son capaces de atravesar la barrera hematoencefalica y las membranas celulares para administrar compuestos a compartimentos a los que no se puede llegar con anticuerpos.
Debido a su pequeno tamano de las protemas de la invencion se reduce considerablemente el riesgo de provocar una respuesta inmune. Debe hacerse hincapie en que el riesgo de inmunogenicidad que es inherente a los anticuerpos altera considerablemente su uso clmico.
Cabe destacar que la protema de union a CD44ex9 de la invencion, al interferir solo con el dominio variante v5, deja intacta la funcion deCD44 normal y, por lo tanto, permite una intervencion espedfica.
En resumen, las protemas de union a CD44ex9 de la invencion abren la puerta a nuevas estrategias para el trata miento y el diagnostico del cancer con un riesgo reducido de efectos secundarios.
Descripcion detallada de la invencion
En una realizacion de la invencion, la invencion proporciona una protema que se une a un polipeptido codificado por el exon 9 de CD44 humano (CD44ex9), dicha protema comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos con una identidad de al menos un 95 % y, espedficamente, una identidad de al menos 97,5 % con la secuencia de aminoacidos dada en la SEQ ID No. 1 a 5.
En un aspecto adicional, la solicitud describe una protema que se une a un polipeptido codificado por el exon 9 de CD44 humano (CD44ex9), dicha protema comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos con una identidad de al menos un 90 %, preferentemente de al menos un 95 %, mas preferentemente de al menos un 97,5% e incluso mas preferentemente de al menos un 100 % de identidad con el motivo de union a CD44 definido por la secuencia: "PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQX10-14AIE" como se representa en las SEQ ID No. 6 a 10, en la que X indica un aminoacido arbitrario.
Las protemas segun se reivindican en el presente documento tienen una longitud de 100 aminoacidos o menos y aun mas preferentemente una longitud de 90, 85, 80, 75, 70 o 66 aminoacidos o menos.
En una realizacion adicional de la invencion, la protema de union a CD44ex9 tiene una alta afinidad con el polipeptido codificado por el exon 9 con un valor de ki de menos de 10 |jM, preferentemente de menos de 1 |jM, mas preferentemente de menos de 100 nM y mas preferentemente de menos de 10 nM.
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En una realizacion adicional de la invencion, la protema de union a CD44ex9 se une selectivamente al polipeptido codificado por exon9, que se administra cuando se une a otras protemas arbitrarias con un valor de ki que es, preferentemente, al menos 10 veces menos y, mas preferentemente, 100 veces menos del valor ki para la union a CD44ex9.
En una realizacion, la protema de union a CD44ex9 de la invencion es capaz de unirse a cada isoforma de CD44 que contiene el dominio codificado por el exon 9, que tambien se designa "variante 5" (v5).
En una realizacion preferida, la protema de union a CD44ex9 de la invencion se une a una isoforma de CD44 seleccionada de la lista que consiste en CD44 v5, CD44 v5-v6, CD44 v3-v6, CD44 v3-v6, CD44 v2-v10, CD44 v3- v10, CD44 V4-v7 y CD44 v4-v10.
De manera notable, la protema de union a CD44ex9 de la invencion se une tambien a protemas que comprenden junto al dominio v5 tambien otros dominios variantes tales como v1, v2, v3, v4, v6, v7, v8, v9 y/o v10.
La nanopartmula conjugada de acuerdo con la invencion puede, en general, unirse a cualquier tipo de farmaco que perjudique, inhiba o incluso mate celulas cancerosas. De este modo, es particularmente preferente un agente citotoxico. Ejemplos no limitantes de agentes citotoxicos incluyen emozolomida, carmustina, lomustina, procarbazina, estreptozocina, irinotecan o cualquier combinacion de dos o mas de estos agentes.
Ejemplos adicionales de inhibidores de cancer adecuados son (-)-Ci-Cdpl, (-)-Ci-Cdp2, galato de (-)- epigalocatequina, (+)-Cbi-Cdpi2, (+)-Ci-Cdp2, 10-deacetilbacatina III, 4-demetoxi daunorubicina, 5-azacitidina/5-aza- 2'-desoxicitidina, 5-fluorouracilo, clorhidrato de 5-iminodoxorubicina, 6-mercaptopurina, aclarubicina, acodazol, actinomicina D, adenina fosfato, adenosina, aderbasib, adozelesina; U-73, 975, afeletecan, alemtuzumab, alitreninoma, alosetron HCl, acido alfitolico, altretamina, alvespimicina, ambazona, ametantrona, amifostina, aminoglutetimida, amsacrina HCl, amsilaroteno, amigdalina, anagrelida, anastrozol, anaxirona, ancitabina, annomontacina, annomuricina A, (C19/C20-eritro), annomuricina B, (C 1 0/C I I, C19/C20-eritro), annomuricina C, (todo-treo) annomuricina E, annonacina, annonacin-IO-Ona, annonacin-A-Ona, annonidina B, annonina VI, annosquamosina A, annosquamosina B, antramicina, apaziquona, argimesna, aristoforina, trioxido de arsenico, artemisinina, ascomicina, asparaginasa, atosiban, atrimustina, axitinib, azasetron HCl, azatepa, azatioprina, azotomicina, bafetinib, balamapimod, banoxantrona, batabulina, batimastat, Bbr-34384, becatecarina, belotecan, benaxibina, bendamustina, benzodepa, berubicina, betulina, acido betulmico, aldehfdo betulmico, bevacizumab, bexaroteno, bicalutamida, bietaserpina, biricodar, bisantreno, bistramida A; bistrateno A, bizelesina, bleomicina, bleomicina A2 [sulfato], bleomicina A5, sulfato de bleomicina, bortezomib, bosentano, bosutinib, brequinar sodico, brequinar, bropirimina, brostalicina, budotitano, bulatacina, buserelina, busulfan, cabazitaxel, folinato de calcio, levofolinato de calcio, calusterona, camptotecina, canertinib, canfosfamida, cantaridina, capecitabina, caracemida, carbetimer, carboplatino, carboprost (carboprost trometamina), carboquona, carfilzomib, acido carglumico, carmofur, carzelesina, cedefingol, cemadotina, cetuximab, cevipabulina, clorambucilo, clormetina (mecloretamina), clorotamoxifeno, clorotrianiseno, cioteronel, cisplatino, cladribina, clanfenur, clofarabina, clofazimina, citrato de clomifeno, cordicepina, acido corosolico, crisnatol, curcumina, ciclocitidina, ciclofosfamida, citarabina, citidina, acido D-aminolevulmico, dacarbazina, damsina, daniquidona, danusertib, daporinad, darinaparsina, dasatinib,
daunoblastina, daunorubicina/ daunomicina, decitabina, deferasirox, deforolimus, demecolcina, denibulina, detorubicina, dexniguldipina, dexormaplatino, dezaguanina, dianhidrodulcitolum, cloruro de dibrospidio, dienogest, diflomotecan, dinalina, disermolida, docetaxel, dofequidar, mesilato de dolasetron, dovitinib, doxifluridina, doxorrubicina, dromostanolona, duazomicina, duocarmicina, dinemicina, ecomustina, edatrexato, edotecarina, edotreotida, eflomitina, elacridar, eacitarabina, elesclomol, elinafida, elomotecan, elsamitrucina, emitefur, enloplatino, enocitabina, enpromato, entecavir, entinostat, entricitabina, enzastaurina, epirrubicina, eptaloprost, eribulina, erlotinib, esorubicina, estramustina, etalocib, etanidazol, etoglucid, etoposido, exatecan, exemestano, exisulind, fadrozol, fazarabina, fiacitabina, floxuridina, fludarabina, fluoximesterona, fluorocitabina, flutamida, formestano, forodesina, fosfluridina tidoxil, fosquidona, fostriecina, fotemustina, fotretamina, fulvestrant, fumagilina, galarubicina, galocitabina, gefitinib, gemcitabina, gemtuzumab ozogamicina, geroquinol, gigantetronenina, gigantetroneninona, gimatecan, gimeracilo, gloxazona, glufosfamida, goniotalamicina, goniotalamicinona, goserelina, granisetron HCl, gusperimus, hexarelina, homoharrlngonina, hidrocamptotecina, hidroxicarbamida, hidroxiurea, hipericina, ibandronato sodico, acido ibandronico, idarubicina HCl, idronoxilo, ifosfamida, ilmofosina, imatinib, mesilato de imatinib, imexon, improsulfan, incadronato, indibulina, indisulam, inolitazona, inproquona, intiquinatina, intoplicina, iobenguano, irofulven, irsogladina, ispinesib, ixabepilona, ketotrexato, L-alanosina, laniquidar, ditosilato de lapatinib, laromustina, larotaxel, ledoxantrona, lenalidomida, lentinan, lestaurtinib, letrozol, acetato de leuprolida, leuprorelina, lexacalcitol, liarozol, lobaplatino, lonafarnib, lonidamina, losoxantrona, Ly-83583, lisipresina, mafosfamida, mannomustina, manosulfan, marimastat, marinomicina A, masitinib, acido maslmico, masoprocol, mecloretamina, medorubicina, megestrol, mepitiostana, mercaptopurina, mesna, metotrexato, aminolevulinato de metilo, metomidato, metoprina, meturedepa, miboplatino, midostaurina, mifamurtida, milataxel, miproxifeno, miriplatina, misonidazol, mitindomida, mitoflaxona, mitoguazona, mitomicina, mitonafida, mitoquidona, mitotano, mitoxantrona, mitozolomida, mivobulina, mizoribina, mofarotena, mopidamol, motesanib, motexafino, mubritinib, muricapentocina, muricatacina, mustina HCl, micofenolato mofetilo, acido micofenolico, nedaplatino, nelzarabina, nemorrubicina, neocuproma, neptamustina, neratinib, nigericina, nilotinib, nilutamida, nimustina, ninopterina, nitracrina, nogalamicina, nolatrexed, norcantaridina, acido nordihidroguaiaretico, nortopixantrona, novembichina, obatoclax, octreotida, olaparib, aldehfdo oleanolico, mepesuccinato de omacetaxina, ombrabulina, omtripolida, ondansetron HCl, ortataxel, oteracilo, oteracilo
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potasico, oxaliplatino, oxisuran, oxofenarsina, ceribato de paclitaxel, palifosfamida, palonosetron, pamidronato disodico, acido pamidronico, panitumumab, panobinostat, patubilona, pazeliptina, pazopanib, pegaspargasa, peldesina, pelitinib, pelitrexol, pemetrexed disodico, pentostatina, peplomicina, peretinoma, perfosfamida, perifosina, hidrobromuro de pibrozelesina, picoplatino, pinafida, piposulfan, pirarrubicina, pirfenidona, piritrexim, piroxantrona, pixantrona, plevitrexed, plicamicina, plitidepsina, plomestano, podofilotoxina, pomalidomida, porfimer sodico, pralatrexato, prinomastat, procarbazina HCl, propamidina, cloruro de prospidio, pumitepa, puromicina, pirazofurina, ouarfloxina, raltegravir, raltitrexed, ramosetron HCl, ranimustina, retaspimicina, reteliptina, riboprina, ritrosulfan, rituximab, roflumilast, romidepsina, ropidoxuridina, roquinimex, rosabulina, rubitecan, sabarubicina, safingol, salirasib, sapacitabina, saracatinib, sardomozida, satraplatino, sebriplatino, seliciclib, semaxanib; SU-5416, semustina, sermorelina, simotaxel, simtrazeno, sitagliptina, sizofuran, soblitodina, sobuzoxano, fenibutirato sodico, sorafenib, acido esparfosico, esparsomicina, espiroplatino, escualamina, escuamocina, estreptonigrina, estreptovaricina, sufosfamida, sulofenur, sunitinib, swainsonina, tacedinalina, tafluposido, talabostat, talisomicina, talimustina, talotrexina, taltobulina, citrato de tamoxifeno, tandutinib, tanespimicina, tariquidar, tasidotina, tasisulam, tauromustina, tegafur, tegafur-uracilo, telantinib, teloxantrona, temozolomida, teniposido, acido tenuazonico, terameprocol, teriparatida, tesetaxel, testolactona, tezacitabina, tiamiprina, tioguanina, tiotepa, timopoyetina, tiazofurina, tilomisol, tilorona, timcodar, timonacic, tioguanina, tirapazamina, tocladesina, tomudex, clorhidrato de topotecan, citrato de toremifeno, tosedostat, tositumomab, toxipantrona, trastuzumab, trenimon, tretinoma, triciribina, trilostano, trimetrexato, tetranitrato de triplatino, triptolida, triptorelina, trofosfamida, tropisetron HCl, tubulozol, tiloforina, U-67786, U-68415, U-71184, U-76074, U-78057, ubenimex, uramustina, uredepa, uretano, uridina, acido ursolico, aldetndo ursolico, vadimezan, valrubicina, valspodar, vandetanib, vapreotida, vatalanib; PTK-787, verteporfina, vildagliptina, sulfato de vinblastina, vincristina, vindesina, vinepidina, vinflunina, vinformida, vinfosiltina, vinleucinol, vinleurosina, vinorelbina [Base], sulfato de vinorelbina, vintriptol, vinzolidina, voriconazol, vorinostat, vorozol, wilforlida A, xantomicina A, zalcitabina, zeniplatino, zilascorb, zinostatina, acido zoledronico, zorubicina, zosuquidar o similares, o una combinacion que comprende al menos uno de los inhibidores de cancer anteriores.
Adicionalmente, tambien se podna usar un farmaco antiangiogenico para la nanopartmula conjugada de la invencion. Ejemplos no limitantes son bevacizumab, aflibercept, cediranib, sorafenib, sunitinib, vandetanib, pazopanib, vatalanib, mesilato de imatinib, cilengitida, angiostatina, endostatina, factor 4 de las plaquetas. Particularmente, dicho farmaco antiangiogenico podna usarse en cualquier combinacion de dos o mas de los ejemplos indicados.
Los agentes sensibilizadores de radiacion representan una clase de farmaco adicional para la nanopartmula conjugada que comprende la protema de union a CD44ex9 segun la invencion. Ejemplos no limitantes son carboplatino, cilengitida, CG841251, derivados de estaurosporina, tales como mK-1775, 4-fenilbutirato, un compuesto que contiene gadolinio, tal como motexafin-gadolinio, un derivado de taxano, tal como paclitaxel o docetaxel, o una combinacion de los mismos.
En otro aspecto, la solicitud desvela una molecula de acido nucleico aislada que codifica la protema de union a CD44ex9 o el peptido CD44v5 de acuerdo con la invencion.
En un aspecto adicional, la solicitud desvela un vector de expresion que contiene la secuencia de nucleotidos de la protema de union a CD44ex9, el peptido CD44v5 o una protema de fusion del mismo.
En un aspecto adicional mas, la solicitud desvela una celula huesped que contiene el vector de expresion que contiene la secuencia de nucleotidos de la protema CD44ex9, el peptido CD44v5 o una protema de fusion del mismo.
En un aspecto adicional, la solicitud desvela un procedimiento para producir la protema de union a CD44ex9 o el peptido CD44v5, en el que dicho procedimiento comprende las etapas siguientes:
1. ) Transformar una celula huesped con una construccion de expresion que comprende una molecula de acido nucleico que codifica la protema de la invencion o una protema de fusion respectiva; y
2. ) Cultivar la celula huesped en condiciones adecuadas para producir la protema de union a CD44ex9 o el peptido CD44v5.
En una realizacion de la invencion, la nanopartmula conjugada de la invencion puede usarse para el diagnostico o tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedades autoinmunes, tales como diabetes insulino-dependiente, esclerosis multiple, smdrome de Sjogren o lupus eritematoso sistemico (LES); enfermedades de la piel, tales como psoriasis o dermatitis atopica; enfermedades inflamatorias cronicas, tales como artritis reumatoide o enfermedad inflamatoria intestinal; lesion en los tejidos; enfermedades alergicas y cancer.
El uso de la nanopartmula conjugada de la invencion para el diagnostico o tratamiento de la inflamacion se basa en el hecho de que CD44 desempena un papel en la direccion de las celulas inflamatorias al sitio de infeccion o destruccion de tejidos. De este modo, el CD44 en los linfocitos T activados, los monocitos o las celulas endoteliales activadas se une al componente de matriz extracelular hialuronano, induce quimiocinas tales como CCR2 que luego estimula la migracion de las celulas inflamatorias al sitio de la inflamacion (Johnson & Ruffell, 2009). El bloqueo de CD44 por la protema de union a CD44ex9 o el bloqueo del hialuronano por el peptido CD44v5 evitana este proceso.
Por ejemplo, la expresion de CD44 se ha estudiado extensamente en pacientes con artritis reumatoide, por lo que se
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ha demostrado que el nivel de expresion de CD44 en celulas monodticas en el Ifquido sinovial de pacientes con AR esta elevado. Este aumento en la expresion de CD44 se correlaciono positivamente con el grado de inflamacion sinovial en la AR. Adicionalmente, los ratones deficientes en CD44 tienen grados mas bajos de artritis y se ha demostrado que el tratamiento con anti-CD44 reduce eficazmente la puntuacion de artritis en modelos animales. De este modo, la protema de union a CD44-ex9 o el peptido CD44v5 de la invencion pueden utilizarse para el diagnostico o el tratamiento de la AR.
En una realizacion adicional de la invencion, la nanopartmula conjugada puede usarse para producir inmunosupresion, por ejemplo, para la prevencion del rechazo del trasplante mediante la inhibicion de la proliferacion de linfocitos T.
En una realizacion preferente de la invencion, la nanopartmula conjugada puede usarse para el diagnostico o tratamiento del cancer. Este uso preferente se basa en el hecho de que las variantes de CD44 que comprenden el dominio v5 se han descrito en celulas cancerosas.
Debido a la union espedfica de la protema de union a CD44ex9 al dominio v5 de la protema CD44, dicha protema de union inhibe la interaccion de CD44 con diversas protemas de la matriz extracelular y, por lo tanto, inhibe la union, la migracion y la metastasis de las celulas tumorales y tambien puede perjudicar a la proliferacion de celulas tumorales.
En una realizacion preferida adicional, la nanopartmula conjugada de la invencion puede usarse para el diagnostico o tratamiento de celulas madre de cancer (CSC). Un concepto emergente indica que las CSC determinan, en ultima instancia, el exito del tratamiento del cancer, ya que las celulas representan una poblacion superviviente a largo plazo que posteriormente conduce a recafdas y metastasis (Deonarain y col., 2009). Se demostro que CD44 se expresaba en las CSC y se le ha hecho responsable de dicha supervivencia a largo plazo y potencial metastasico de los respectivos tumores. Como ejemplo, las CSC del cancer de mama se caracteriza por la expresion de CD44+/CD24bajo, que argumenta que el CD44 es una prometedora anti-diana de CLC.
En otra realizacion de la invencion, la nanopartmula conjugada de la invencion puede usarse para el diagnostico o tratamiento de la leucemia linfatica cronica (LLC). Zhang y col., (2013) pudieron demostrar que las celulas de LLC muestran una expresion elevada de CD44 y, ademas, que los anticuerpos anti-CD44 eran efectivos en la muerte de las de LLC in vitro e in vivo, con lo que en un modelo de xenoinjerto el tumor desaparecio completamente del organismo.
El diagnostico o tratamiento del cancer de mama por la nanopartmula conjugada de la invencion se apoya en el hecho de que CD44v5 representa la variante de cD44 mas expresada en el cancer de mama (56 % para CD44v5 frente a 24 % para CD44v6 y 15 % para CD44v8). Ademas, la expresion de la variante CD44v5 se asocia con un tiempo de supervivencia mas corto del cancer de mama: El tiempo de supervivencia a cinco anos es del 71 % en pacientes con cancer CD44v5 frente al 86 % en pacientes negativos para CD44v5 (Tempfer y col., 1996).
En una realizacion preferida, la nanopartmula conjugada de la invencion puede usarse para el diagnostico o tratamiento de cancer colorrectal, ya que se demostro que CD44v5 (y CD44v6) estan asociados con un mal pronostico en el cancer colorrectal. De este modo, los pacientes con mayor contenido de CD44v5 o CD44v6 en muestras tumorales tuvieron una supervivencia libre de recafdas considerablemente mas corta (Vizoso y col., 2004).
En otra realizacion preferida, la nanopartmula conjugada de la invencion puede usarse para el diagnostico o tratamiento de tumores de celulas escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), ya que estos tumores exhiben una expresion alta de CD44 y la subpoblacion con expresion alta de CD44 son menos sensibles a la radiacion y a la quimioterapia (La Fleur y col., 2012).
En una realizacion adicional, la nanopartmula conjugada de la invencion puede usarse para el diagnostico o tratamiento de melanomas, ya que un peptido derivado de CD44 mostro eficacia in vitro e in vivo en un modelo de tumor de melanoma (Piotrowicz y col., 2011).
En una realizacion preferida de la invencion, la nanopartmula conjugada se utiliza para preparar un agente de contraste para uso medico.
En una realizacion preferida adicional, el agente de contraste es capaz de identificar celulas cancerosas o celulas de carcinoma in situ.
En una realizacion espedfica, la nanopartmula conjugada de la invencion es capaz de identificar celulas cancerosas que se seleccionan de la lista que consiste en celulas de adenocarcinoma, celulas de tumores epiteliales del timo, celulas de carcinoma del cuello uterino, celulas de linfoma no Hodgkin, celulas de carcinoma de celulas pulmonares, celulas de carcinoma de pancreas y celulas madre de cancer.
Las protemas de union a CD44ex9 de la invencion pueden estar unidas a nanopartmulas de cualquier tipo. En la tecnica anterior se conocen diversas clases de nanopartmulas y el experto en la materia puede seleccionar el tipo apropiado de nanopartmula de acuerdo con los requisitos terapeuticos o diagnosticos espedficos.
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Ejemplos de nanopartmulas para acoplar a la protema de union a CD44ex9 son puntos cuanticos, grupos de metales nobles, nanopartmulas de oxido de hierro superparamagneticas (IONP), micelas de copoUmero de bloques, nanocelulas, dendnmeros, nanotubos, polimersomas, nanopartmulas XPclad® y nanopartmulas que consiste en s^lice amorfa rodeada por una capa de fosfato de calcio luminiscente cristalino (por ejemplo, ORMOBEAD®).
Las partmulas de ORMOBEAD pueden modificarse adecuadamente en la superficie con polietilenimina o TRIAMO dando grupos amina o acido 6-amino hexanoico (AHA) o con acido adfpico dando grupos carboxilo. Estos grupos se pueden usar para el acoplamiento a las protemas de la invencion. Dembski y col., (2013) desvelan la tecnologfa ORMOBEAD junto con procedimientos para preparar y usar dichas nanopartmulas.
En una realizacion de la invencion se usan nanopartmulas con nucleo-envoltura de SiO2/Zn2SiO4:Mn2+ y SiO2/Ca-io(PO4)6OH:Eu3+ con diametros inferiores a 100 nm para acoplar con las protemas de la invencion. Dembski y col., (2011 a, 2011 b) desvelan estas partmulas, junto con procedimientos para preparar y usar dichas nanopartmulas.
En una realizacion adicional, se pueden usar nanopartmulas tnbridas marcadas con colorantes luminiscentes. Estas nanopartmulas consisten en una matriz de partmulas a base de SiO2 con fluoroforos organicos unidos covalentemente. Combinan las propiedades opticas de las moleculas de colorante organico y las propiedades de la matriz de partmulas inorganicas. Como resultado, muestran una mayor resistencia al fotoblanqueo y una disminucion de las fugas de colorante. Probst y col., (2012) desvelan nanopartmulas respectivas, junto con procedimientos para preparar y usar dichas nanopartmulas.
En otra realizacion, pueden utilizarse puntos cuanticos libres de cadmio. Estas nanopartmulas muestran emision brillante en la region visible y del infrarrojo cercano del espectro. Nanoco Technologies Ltd. (Manchester, Reino Unido) desarrollan nanopartmulas correspondientes y se desvelan en los documentos WO07/020416 A1, WO08/100276 A2, WO10/52455 A1, WO10/15824 A1, WO10/10329 A2 y WO13/93631 A2, junto con procedimientos de preparacion y uso de dichas nanopartmulas.
En una realizacion de la invencion, se pueden usar los puntos cuanticos semiconductores del grupo I-III-VI (grupo II- aleado) o complejos de nanocristales semiconductores micronizados como los desarrollados por Evident Technologies (Troy, NY, EE.UU.). Estas nanopartmulas se desvelan en los documentos WO07/118118 A2, WO08/94292 A1, WO06/17125 A2 o WO05/110916 A2, junto con procedimientos de preparacion y uso de dichas nanopartmulas.
En otra realizacion se pueden usar nanopartmulas de oxido de hierro superparamagneticas (IONP), micelas de copolfmero de bloques, nanocelulas, dendnmeros, nanotubos, polimersomas y nanopartmulas XPclad®. Singh y Lillard (2009) y Xie y col., (2010) desvelan nanopartmulas respectivas, junto con procedimientos para preparar y usar dichas nanopartmulas.
En una realizacion adicional de la invencion, pueden usarse nanopartmulas sin Cd, que comprenden un area de nucleo cubierta por un area de envoltura que representa un recubrimiento antirreflectante del area de nucleo. El documento US 2008/0286826 A1 (Philips Intellectual Property & Standards) desvela nanopartmulas respectivas, junto con procedimientos para preparar y usar dichas nanopartmulas.
En otra realizacion de la invencion, se pueden usar partmulas magneticas, que son especialmente adecuadas para la administracion dirigida de farmacos. En una realizacion preferida, dichas partmulas magneticas consisten en oxidos metalicos superparamagneticos y/o metales y estan recubiertas con los peptidos de la invencion y, opcionalmente, con uno o mas farmacos adicionales. Las partmulas magneticas respectivas se desvelan en el documento EP 1 267 843 A1 (EUCRO) junto con procedimientos de preparacion y utilizacion de dichas partmulas magneticas.
Las nanopartmulas modificadas se pueden emplear, preferentemente, como agentes de contraste in vivo para detectar celulas CRC. El documento WO 2007/057182 A2 desvela nanopartmulas ventajosas, procedimientos de preparacion y uso de dichas nanopartfculas. Dichas nanopartfculas son, en particular, aquellas cuyo diametro hidrodinamico no excede de 15 nm y que no son inertes en sistemas biologicos.
Las nanopartfculas de la invencion pueden conjugarse ademas con al menos una sustancia de union al antfgeno tumoral y/o agente citotoxico.
En una realizacion preferida de la invencion, la nanopartfcula se conjuga adicionalmente con una sustancia de union al antfgeno tumoral que se selecciona de la lista que consiste en un anticuerpo contra CEA, un anticuerpo contra CA-19-9 y una adhesina o cualquier combinacion de los mismos.
En una realizacion preferida, la adhesina conjugada a nanopartfcula esta modificada en su secuencia de aminoacidos, y mas preferentemente esta modificada de acuerdo con el documento WO 2009/106102 A1.
Las nanopartfculas preferidas de la invencion comprenden al menos tres estructuras, a saber, un nucleo inorganico que esta recubierto por una capa que comprende una capa que contiene un componente de imidazol (que tambien
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se denomina en lo sucesivo "capa de pasivacion") que, a su vez, porta ligandos espedficos, en los que dichos ligandos espedficos tambien pueden formar parte de la capa. Dichos ligandos dan lugar a que la nanoparffcula se una espedficamente a la diana del sistema biologico.
En nanoparffculas preferentes, el nucleo inorganico que incluye la capa de pasivacion que lo rodea tiene un diametro hidrodinamico de no mas de 15, si es posible, preferentemente no mas de 10 nm. Se prefieren especialmente los diametros hidrodinamicos de no mas de 8 nm o no mas de 5 nm. Esto se aplica especialmente a las nanoparffculas esfericas. Las nanoparffculas de este tamano se pueden iluminar a traves de los rinones y, por lo tanto, no se acumulan, o como mucho se acumulan en cantidades tolerables, en el cuerpo. Esto posibilita la aplicacion in vivo. Esto se aplica en particular a las nanoparffculas que tienen un diametro hidrodinamico no superior a 5 nm.
En una realizacion alternativa, las nanoparffculas tambien pueden ser de tipo barra. En esta realizacion, es ventajoso que el diametro de la barra no supere el lfmite mencionado anteriormente de 15 nm. Aqm tambien se da preferencia a diametros en el intervalo de 5, 8 o 10 nm para facilitar la eliminacion del cuerpo. De este modo, por ejemplo, las nanoparffculas utilizables de acuerdo con la invencion pueden tener dimensiones de longitud/anchura de 8 x 15 nm.
Las nanoparffculas utilizables de acuerdo con la invencion tienen, preferentemente, una emision maxima a una longitud de onda de entre 600 y 700 nm, por ejemplo de entre 620 y 660, particularmente preferentemente a aproximadamente 625 nm o 655 nm. Dicha emision es facilmente visible para el ojo humano, y, por tanto, tales nanoparffculas pueden usarse directamente como agentes de contraste para intervenciones medicas. Por consiguiente, en algunas circunstancias se pueden prescindir de los instrumentos opticos auxiliares.
En una realizacion alternativa, se pueden emplear nanoparffculas que superen los diametros hidrodinamicos mencionados anteriormente de acuerdo con la invencion, siempre y cuando se garantice que las parffculas no son inertes in vivo. Esta ultima es la condicion previa para que dichas parffculas sean biodegradables y, como resultado, los metales (por ejemplo, Cd) que estan unidos en como parffculas inicialmente, se convierten en la forma ionica. Los productos de degradacion pueden iluminarse a traves de los rinones.
Las nanoparffculas inorganicas que tienen una capa de pasivacion que contiene un componente de imidazol son, de hecho, no inerte in vivo, como se ha demostrado anteriormente, pero se degradan en estas condiciones. Por tanto, dichas nanoparffculas satisfacen el criterio de biodegradabilidad y de paso renal de los productos de degradacion, lo que es particularmente relevante para la aplicacion in vivo. Esto fue un hallazgo sorprendente porque la capa de pasivacion sirve especialmente tambien para aumentar la estabilidad qmmica y/o ffsica de las nanoparffculas (en este contexto, veanse tambien los comentarios adicionales a continuacion). De este modo, la relacion entre, por un lado, la estabilidad de las nanoparffculas que se requiere para un buen diagnostico y, por otro lado, la biodegradabilidad que se requiere para el paso renal de parffculas "grandes", es adecuada para su uso como agente de contraste in vivo.
La tarea principal de la capa de pasivacion es aumentar la intensidad de la fluorescencia y la estabilidad qmmica y ffsica del nucleo inorganico. Los nucleos inorganicos recubiertos por la capa de pasivacion se caracterizan por un rendimiento cuantico de al menos 10 %, ventajosamente de al menos 30, 50 o incluso 70 %. Por rendimiento cuantico en el presente documento se entiende la relacion entre la cantidad de luz emitida por una muestra y la cantidad de luz absorbida por la muestra. Ventajosamente, la capa de pasivacion tiene un espesor no superior a 1 nm. En este caso, el diametro del nucleo pasivado aumento en no mas de 2 nm.
Ventajosamente, las nanoparffculas estan dotadas, en cada caso, de modificadores, en particular para mejorar la compatibilidad con el entorno biologico. Preferentemente, el aumento del radio hidrodinamico debido al uso de modificadores no excede de 2 nm. En casos particulares, el espesor de la capa de pasivacion y los modificadores tambien depende de las relaciones de las dos estructuras entre sf y en relacion con el nucleo inorganico.
Las nanoparffculas preferentemente utilizadas de la invencion, si estan restringidas en tamano como se ha mencionado anteriormente, son particularmente adecuadas para el uso como agente de diagnostico en un paciente vivo. De este modo, la reduccion de tamano aumenta la velocidad de difusion y la profundidad de penetracion en el tejido. Esto permite que las nanoparffculas se diseminen uniforme y rapidamente en el entorno biologico y, tambien, la penetracion en la medida de lo posible de un tejido (por ejemplo, un tumor) despues de la administracion local. Asimismo, las nanoparffculas de la invencion permiten una administracion sistemica que tambien puede llevarse a cabo mediante inyeccion. Sin embargo, tambien es posible la administracion local, por ejemplo aplicacion topica o administracion intra o peritumoral para el tratamiento de tumores.
Realizaciones particularmente ventajosas de la invencion que comprenden las nanoparffculas acopladas a las protemas de la invencion tienen un diametro hidrodinamico no superior a 8, particularmente preferentemente de no mas de 4 nm. Las nanoparffculas de este orden de magnitud pueden ya estar iluminadas a traves de los rinones y, por lo tanto, no se acumulan, o, como mucho, se acumulan en menor medida, en el cuerpo. Como resultado, las nanoparffculas de la invencion reducen considerablemente el problema de la toxicidad a largo plazo probablemente asociada a los puntos cuanticos conocidos.
Las nanoparffculas emiten ventajosamente un espectro fluorescente entre 600 y 700 nm, particularmente preferentemente con una emision maxima entre 600 y 660 nm, particularmente preferentemente entre 620 y 660 nm.
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Dicho espectro de emision tiene la ventaja de una transmision en tejido muy alta debido a la baja absorcion por la hemoglobina y otras sustancias absorbentes de la luz en un sistema vivo (incluida el agua). La luz de estas longitudes de onda todavfa puede ser detectada por el ojo humano y, por lo tanto, permite al medico encargado del tratamiento identificar el tejido marcado sin ningun otro auxiliar tecnico de deteccion complicado (por ejemplo, camaras CCD). Esto es particularmente ventajoso cuando se utilizan nanoparrtculas de la invencion como agentes de contraste durante la intervencion quirurgica para identificar celulas que expresan CD44, CEA y/o CA19-9, en particular para discriminar tejidos carcinogenicos y sanos.
En una realizacion, las nanoparrtculas preferentemente utilizables son nanoparrtculas conocidas que tienen un nucleo de, por ejemplo, CdSe, CdS o CdTe, como se ha descrito, por ejemplo, en el documento US 2004/0247861 A1 con referencia a publicaciones cienrtficas. Esta publicacion impresa hace referencia tambien a documentos relativos a la preparacion de los materiales de nucleo, por ejemplo, al documento US 6.179.912 B1. Se hace referencia a todo el contenido de estos documentos con respecto a la divulgacion de las propiedades de estas nanopartfculas conocidas y su preparacion. Un procedimiento para preparar nanopartfculas tambien se desvela adicionalmente en el documento US 7.147.712 B2-.
De forma particularmente ventajosa, el nucleo inorganico de las nanoparrtculas consiste esencialmente en semiconductores. Estos nucleos emiten luz de varios colores, dependiendo de su tamano y/o composicion individuales, pero todos ellos absorben sobre una banda ancha dentro del mismo intervalo del espectro de luz (rango UV a VIS). Debido al alto desplazamiento de Stokes, los espectros de excitacion y emision estan muy separados, lo que permite la excitacion simple y simultanea de varias nanoparrtculas. Tienen espectros de emision estrechos y simetricos que solo se superponen ligeramente o nada en absoluto. Otras propiedades beneficiosas que son de gran importancia particularmente para mejorar la profundidad de la filtracion y el marcaje in vivo son el alto rendimiento cuantico de hasta el 80 % y la elevada fotoestabilidad.
Se han desvelado nanopartfculas preferentes, por ejemplo, en el documento WO 2005/001889 A2. Por consiguiente, comprenden un nucleo inorganico hecho de una aleacion de al menos dos semiconductores que estan distribuidos de forma homogenea o para los cuales hay, en cada caso, un gradiente de concentracion dentro de la aleacion. Con respecto a la divulgacion de la naturaleza y la preparacion de dichas nanopartfculas, se hace referencia al documento WO 2005/001889 A2 citado anteriormente. Los nucleos pueden desviarse en su tamano en cada caso en un 5 %.
Por consiguiente, el nucleo inorganico de las nanopartfculas puede comprender una aleacion de al menos dos semiconductores, en la que el nucleo tiene una composicion homogenea y se caracteriza por una "energfa de espacio de banda" que no es lineal a la relacion molar de los dos semiconductores.
Como alternativa, el nucleo puede ser no homogeneo, aumentando la concentracion del primer semiconductor gradualmente, comenzando desde el centro del nucleo hasta la superficie del nucleo, y disminuyendo gradualmente la concentracion del segundo semiconductor desde el centro del nucleo hasta su superficie.
Para ambos nucleos, al menos uno de los semiconductores es un semiconductor del grupo II-grupo VI o un semiconductor del grupo III-grupo V (la definicion de grupos corresponde a los grupos de la Tabla Periodica de los Elementos). Por ejemplo, la aleacion puede seleccionarse del grupo de las siguientes aleaciones: CdSeTe, CdSSe, CdSTe, ZnSeTe, ZnCdTe, CdHgS, CdHgTe, InGaAs, InGaP, GaAlAs, InGaN. Estos nucleos pueden ademas llevar un recubrimiento de material inorganico tal como, por ejemplo, semiconductores (por ejemplo, ZnS). Esta capa adicional es conocida por el tecnico experto como "proteccion" o "envoltura".
Los semiconductores del grupo II-grupo VI y del grupo III-grupo V son generalmente conocidos e incluyen, por ejemplo, CdS1-xSex, CdS-i-xTex, CdSe-i-xTex, ZnSe-i-xTex, Zn-i-xCdxTe, Cd-i-xHgxS, Cd-i-xHgxTe, In-i-xGaxAs, Ga-i-xAIxAs y In-i-xGaxP. Se prefiere utilizar los semiconductores CdSe-i-xTex, CdS-^Tex, ZnSe-i-xTex, Zn-i-xCdxTe, Cd-i-xHgxS, Cd-i. xHgxTe, In-i-xGaxAs, In-i-xGaxP, en los que n es una fraccion de 0 a 1.
La relacion molar de los semiconductores puede ser cualquier relacion molar. Sin embargo, si la aleacion comprende
CdSSe, se da preferencia a una aleacion que tiene la formula molecular CdS-i-xSex. Si la aleacion comprende
CdSTe, se da preferencia a una aleacion que tiene la formula molecular CdS-^Tex. Si la aleacion comprende
ZnSeTe, se da preferencia a una aleacion que tiene la formula molecular ZnSe1-xTex. Si la aleacion comprende
ZnCdTe, se da preferencia a una aleacion que tiene la formula molecular de CdTe solo. En cada uno de estos casos, x es una fraccion entre 0 y 1.
Estos nucleos inorganicos preferidos de las nanopartfculas pueden prepararse usando las siguientes etapas: (i) preparacion de una primera solucion en condiciones que permiten la formacion de nanocristales, (ii) preparacion de una segunda solucion que comprende un precursor de los semiconductores con una relacion molar en una condicion que no permite la formacion de nanocristales, (iii) adicion de la segunda solucion a la primera solucion que permite la formacion de nanopartfculas, y (iv) alteracion de las condiciones, lo que detiene el crecimiento y la formacion de los nanocristales. El procedimiento de preparacion de los nucleos se ilustra en el documento WO 2005/001889 A2.
En una realizacion alternativa, el nucleo inorganico puede consistir esencialmente en un grupo de metales nobles que comprende, preferentemente, 2 y 27 atomos de metal noble. En una realizacion preferente, el metal noble se
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selecciono de un grupo que consiste en oro, plata, cobre, platino, paladio, osmio, iridio, rutenio y rodio. El grupo puede tener cargas variables.
Estos nucleos tienen la ventaja de que pueden detectarse facilmente como nanopuntos individuales, utilizando una excitacion debil de la lampara de mercurio, debido a su fuerte absorbancia y emision. Las nanoparffculas de la invencion que contienen estos nucleos pueden utilizarse ventajosamente como marcador de molecula individual fluorescente y marcador de masa.
La expresion "metal noble" se refiere a un grupo de elementos que consisten en oro, plata y cobre, y los metales del grupo de platino (PGM), platino, paladio, osmio, iridio, rutenio y rodio. En realizaciones preferentes de la presente invencion, los metales nobles se seleccionan del grupo que consiste en oro, plata y cobre. En una realizacion particularmente preferente, el metal noble es plata u oro.
El termino "grupo" se refiere a un compuesto de 2-27 atomos de un metal. Los grupos son conocidos, entre otros, por los campos de la catalisis qmmica, ceramica, la tecnologfa de semiconductores y las ciencias materiales. Por lo tanto, un experto en la tecnica esta familiarizado con su preparacion. El documento WO 2004/003558 A1 describe, entre otras cosas, la preparacion de grupos de metales nobles y, ademas, contiene extensas referencias adicionales a este tema. Mas espedficamente, desvela la preparacion de nanogrupos de metales nobles asociados con moleculas organicas. El termino asociacion en el presente documento significa cualquier forma de union, independientemente de la naturaleza qmmica o ffsica de la union (por lo tanto, por ejemplo, union covalente, no covalente, electrostatica o de van der Waals). Se hace referencia al documento WO 2004/003558 A1 con respecto a la preparacion de los nanogrupos como nucleo de las nanoparffculas de la invencion.
Las nanoparffculas de uso preferente de acuerdo con la invencion tienen una capa de pasivacion que aumenta la intensidad de la fluorescencia y mejora la estabilidad qmmica y ffsica del nucleo inorganico. Como resultado, las nanoparffculas emiten luz preferentemente con un rendimiento cuantico de mas del 10 %, preferentemente de mas del 50 %.
Dichas nanoparffculas tienen, preferentemente, una estabilidad al almacenamiento de al menos 12 meses en un entorno acuoso a 4 °C y son, si es posible, si es posible, estables a traves de un intervalo de pH 5 a pH 10, preferentemente de pH 7 a pH 10, es decir, presentan desviaciones de menos del 50 % con respecto a sus caracteffsticas espectrales espedficas, tales como el rendimiento cuantico, la posicion de la emision maxima, la mitad del ancho del espectro de emision. Las parffculas preferentes presentan desviaciones de menos del 10 % con respecto a estas caractensticas espectrales espedficas.
Las nanoparffculas utilizables de acuerdo con otra realizacion de la invencion exhiben esencialmente una constancia/estabilidad de las propiedades del nucleo (incluyendo la capa de pasivacion que lo rodea) tambien en condiciones biologicas (es decir, fisiologicas) o in vivo durante un peffodo de al menos tres dfas. Las parffculas preferidas presentan una constancia/estabilidad de este tipo durante un periodo de 7 a 14 dfas, en el que por medio de la estabilidad se conserva al menos el 50 % de la constancia de las propiedades. Esta informacion se refiere especialmente a la estabilidad de las nanoparffculas en el organo diana real. Cabe destacar que la estabilidad de las nanoparffculas en los organos que tienen funcion principalmente catabolica puede ser claramente menos estable (por ejemplo en el Iffgado). Esto puede incluso ser expresamente deseable.
Aunque las nanoparffculas son estables en el sentido anterior, son sin embargo fundamentalmente degradables in vivo y, por consiguiente, no son inertes. En este sentido, "no inerte" significa que al menos el 50 % de las nanoparffculas ya se han degradado despues de 12 semanas o mas despues de la administracion. Se prefiere que al menos el 50 % de la degradacion sea detectable ya despues de 8, 6 u 4 semanas. La deteccion de las parffculas que quedan en el cuerpo incluye la deteccion en organos del cuerpo y en el plasma para este fin. Por consiguiente, "inerte" significa que mas del 50 %, incluso hasta casi el 100 %, de las parffculas todavfa son detectables en el cuerpo del paciente despues de 4 semanas desde la administracion.
La degradabilidad de las nanoparffculas puede detectarse mediante ensayos que son conocidos por el experto en la materia, a saber, por ejemplo, por espectrometffa de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS), cuyos ensayos tambien pueden complementarse con mediciones de espectrometffa de fluorescencia, si las muestras son adecuadas.
La capa de pasivacion contiene al menos un componente imidazol. Dicho compuesto es capaz de coordinar atomos metalicos o iones metalicos, por ejemplo iones de cinc, iones de mercurio o iones de cadmio. En una realizacion preferente, el grupo imidazol esta en una posicion terminal segun la estructura de la molecula. La capa de pasivacion puede tener ademas un reticulante, o el componente imidazol dclico o lineal tambien puede actuar como un reticulante. El reticulante puede ser alcalino.
Los compuestos de coordinacion que contienen atomos metalicos o iones metalicos pueden unirse funcionalmente a nucleos inorganicos fluorescentes por medio de propiedades de quelacion, coordinacion o donacion de electrones de las bases de Lewis y tienen restos/grupos conjugados de forma correspondiente. Dichas moleculas pueden ademas contener restos que imparten solubilidad o humectabilidad a los nucleos recubiertos con ellos en soluciones acuosas.
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El componente de imidazol esta adecuadamente reticulado por un compuesto de fosfina, siendo, preferentemente, un compuesto de alquilfosfina.
El termino "componente imidazol" significa, a los efectos de la presente descripcion, una molecula heterodclica o heteroaromatica que contiene al menos un grupo imidazol (incluyendo derivados de imidazol) y que esta disponible para la union del nucleo inorganico o la capa de pasivacion que tiene un metal tal como cadmio, cinc, cinc, galio o un cation metalico o un sustrato que contiene dicho cation. A este respecto, preferentemente, el grupo imidazol esta en una posicion terminal segun la estructura de la molecula. El componente imidazol en su forma funcional se une a traves del anillo que contiene orbitales moleculares deslocalizados al nanocristal fluorescente. Normalmente, los atomos de nitrogeno del anillo de imidazol sirven como ligandos de coordinacion para unirse funcionalmente a un ion metalico tal como cadmio o cinc.
En una realizacion, el componente imidazol comprende grupos funcionales reactivos tales como uno o dos aminoacidos, por ejemplo histidina, carnosina, anserina, balema, homocarnosina, histidilfenilalanina, ciclo- histidilfenilalanina, 5-amino-4-imidazol-carboxamida, histidilleucina, 2-mercaptoimidazol, boc-histidina, hidrazida, histinol, 1 -metilhistidina, 3-metilhistidina, imidazolisina, ornitina que contiene imidazol (por ejemplo, 5-metilimidazol), alanina que contiene imidazol (por ejemplo, (beta)-(2-imidazolil)-L-(alfa)alanina), carzinina, histamina. Estas moleculas basadas en histidina o aminoacidos que contienen imidazol pueden sintetizarse mediante procedimientos generalmente conocidos.
El termino "fosfina" significa, para los fines de la invencion, una molecula que tiene al menos un grupo fosfina (incluyendo sus derivados) para unir o quelar un no metal, tal como Se, S u otros no metales o sustratos que contienen tales atomos y que proporciona al menos un grupo funcional (por ejemplo hidroxilo-, amino-, tiol-, carboxil-, carboxamida-, etc.) para la reaccion con moleculas vecinas.
En una realizacion preferente de la invencion, el componente imidazol es un peptido que comprende al menos un residuo histidilo y, preferentemente, un dipeptido que contiene uno o dos residuos His.
En una realizacion preferente adicional, el componente imidazol es una mezcla de diferentes dipeptidos que contienen histidilo.
Preferentemente, al menos un grupo fosfina debe situarse en una posicion terminal basada en la estructura de la molecula. Los restos de fosfina sirven como ligandos de coordinacion para unirse en su forma funcional con un nucleo fluorescente o un compuesto de la capa de proteccion un no metal o ion tal como Se o S.
En una realizacion preferente, el compuesto que contiene fosfina incluye uno, dos o mas grupos fosfina acoplados entre sf (por ejemplo, en forma polimerica) que pueden incluir compuestos de hidroximetilfosfina o similares, pero sin estar limitados a los mismos. Los compuestos que contienen fosfina pueden sintetizarse por procedimientos generalmente conocidos. Adicionalmente, se sabe que los compuestos que contienen alquilfosfina tienen tambien posiblemente uno o mas grupos funcionales adicionales (por ejemplo, hidroxilo-, amino-, tiol-, carboxil-, carboxamida-, etc.). Ejemplos de derivados son derivados, amidas o esteres de hidroximetilfosfina, siempre y cuando dicha derivatizacion sea compatible con las funciones descritas en el presente documento de fosfina como recubrimiento.
Se da preferencia particular a la tris(hidroximetil)fosfina y al acido p-[tris(hidroximetil)fosfino]propanoico para recubrir los nucleos inorganicos fluorescentes de las nanopartfculas de la invencion. Los compuestos que contienen fosfina reticulada son bien conocidos por ser ademas capaces de unirse funcionalmente a atomos y/o iones metalicos, tales como Zn o Cd. Los isocianatos o alquilcianoacrilatos funcionalizados a este respecto pueden ser ademas utiles como reticulantes para ligandos y la formacion de aductos con nucleos fluorescentes. Dichos reticulantes pueden ser tambien basicos.
El efecto de pasivacion de la capa de pasivacion presente de acuerdo con la invencion se basa en la proteccion de atomos de cadmio o de cinc de superficie o similares mediante la formacion de complejos con el componente imidazol y sobre la proteccion de los contraatomos (Se o S o similares) mediante la formacion de complejos con los compuestos que contienen fosfina.
La capa de pasivacion de las nanopartfculas de la invencion se ha desvelado en el documento US 2004/0247861 A1. Esta solicitud abierta a inspeccion publica describe la preparacion de nucleos inorganicos recubiertos con la capa de pasivacion, por ejemplo de puntos cuanticos. Por lo tanto, se hace referencia al documento US 2004/0247861 A1 que ensena la preparacion de la capa de pasivacion empleada de acuerdo con la invencion y de los nucleos inorganicos recubiertos con la misma.
Las moleculas de la capa de pasivacion pueden ademas tener o llevar grupos qmmicos con el fin de unirse y reticular moleculas y celulas diana (ligandos espedficos). En presencia de reactivos apropiadamente adecuados tales como ZnSO4 y Na2S, dichas moleculas o compuestos pueden formar una capa de pasivacion con las moleculas en el nucleo fluorescente ("protector" o "envoltura"). Estos reactivos tambien pueden unirse funcionalmente a atomos o iones sobre la superficie del nanocristal fluorescente y, como resultado, esta capa de pasivacion adicional tambien puede estar formada directamente sobre la superficie del nucleo.
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En una realizacion ventajosa, las nanopartmulas de la invencion pueden tener adicionalmente modificadores que pueden consistir en restos organicos y/o inorganicos. Se utilizan para mejorar la compatibilidad, la eficacia y/o la solubilidad de las nanopartmulas en un medio lfquido o de suspension, en particular en el entorno fisiologico. Esta modificacion de la superficie es especialmente ventajosa para conseguir una adsorcion inespedfica muy baja y una compatibilidad aumentada en sistemas biologicos, en particular en el cuerpo humano.
Una posibilidad es modificar la superficie con polietilenglicol (PEG) que ya se ha aprobado para aplicaciones medicas particulares, en particular en formas de bajo peso molecular para la nanopartmula para mantener un tamano global pequeno. De esta manera, tanto la biocompatibilidad como el tiempo de circulacion en sangre de las nanopartmulas y tambien la eficiencia de captacion en las celulas pueden aumentarse. La combinacion de una capa de PEG de bajo peso molecular con otras sustancias, tales como vitaminas, por ejemplo acido folico, puede conseguir una captacion menor de dichas nanopartmulas en macrofagos debido a que la adsorcion de protemas a las nanopartmulas, que esta reducida de este modo, dificulta el reconocimiento de dichas nanopartmulas por el sistema inmunologico.
Otra posible modificacion ventajosa de la superficie mediante el uso de modificadores es el recubrimiento con monosacaridos, disacaridos o trisacaridos hasta polisacaridos de bajo peso molecular compuestos por un tipo de monosacarido o monosacaridos diferentes. Un posible tipo de desarrollo es una modificacion con poliglucosa, por ejemplo, en el que se puede usar dextrano que se ha demostrado medicamente que es un sustituto de la sangre. Presenta buena biocompatibilidad/tolerancia. Otra realizacion es el uso de formas estereoisomericas (D-/L-) de sacaridos con el fin de contrarrestar una posible degradacion.
Otra realizacion es el uso de vitaminas hidrofilas biologicamente compatibles como modificadores, por ejemplo tiamina, riboflavina, niacina, piridoxina, cobalamina, acido pantotenico, acido ascorbico y acido folico. De este modo, por ejemplo, el acido folico puede conducir a una union preferida de nanopartmulas a las celulas cancerosas. Esta vitamina exhibe inmunogenicidad tan solo baja y, por lo tanto, una biocompatibilidad alta. La internalizacion de las nanopartmulas se facilita mediante la union al receptor de acido folico unido a la membrana.
Las modificaciones de la superficie tambien son posibles con vitaminas lipofflicas, tales como retinol, colecalciferol, tocoferol y filoquinona. De este modo, por ejemplo, la vitamina E puede aumentar la captacion celular de nanopartmulas.
Los acidos grasos tales como, por ejemplo, 1-octadeceno o acido 18-metileicosanoico y sus derivados, pueden aumentar la solubilidad y la estabilidad de los coloides y tienen un grupo carboxilo terminal funcional que puede utilizarse para la union posterior de ligandos espedficos. Por lo tanto, es util incluir acidos grasos como modificadores.
Otra realizacion de la modificacion de la superficie es un recubrimiento con polialcoholes tales como, por ejemplo, dietilenglicol (DEG), que son particularmente buenos para reducir la adsorcion inespedfica de protemas. Lo mismo se aplica al politetrafluoroetileno (PTFE, Teflon™), en particular en sus formas de bajo peso molecular, que pueden conseguir una adsorcion de protemas reducida. El politetrafluoroetileno se utiliza con frecuencia en aplicaciones cardioquirurgicas.
Asimismo, pueden realizarse modificaciones de la superficie usando uno o mas aminoacidos naturales que incluyen aminoacidos tanto proteinogenicos como no proteinogenicos y aminoacidos sinteticos. En el presente documento pueden usarse ambos estereoisomeros (formas D y L). Los dipolipeptidos, tripolipeptidos, tetrapolipeptidos y superiores de los aminoacidos mencionados anteriormente apenas estimulan el sistema inmunologico y, por tanto, tambien son adecuados para una capa de compatibilidad fina. Pueden ser secuencias de aminoacidos artificiales asf como secuencias de protemas biologicas. Tambien se pueden usar derivados peptfdicos de protemas naturales, tales como, por ejemplo, fitoquelatina, para la modificacion de la superficie. La modificacion de la superficie con peptidos Tat y peptidos que contienen peptidos Tat es otra posibilidad para hacer disponibles las nanopartmulas para el uso en aplicaciones biomedicas. El peptido Tat es una molecula eficaz, por ejemplo, para suministrar nanopartmulas de oro a traves de la membrana celular hasta el nucleo.
Otra realizacion de posibles modificadores es la formacion de un recubrimiento de fosforilcolina. La fosforilcolina reduce una posible adsorcion inespedfica de protemas, por ejemplo en lentes de contacto. Debido a sus propiedades no trombogenicas, una modificacion de fosforilcolina puede emplearse facilmente en sistemas biologicos y se distingue por una alta estabilidad durante el almacenamiento.
Dado que el polilactato es biocompatible, esta sustancia se utiliza en diversas aplicaciones medicas. Mas espedficamente, las formas de bajo peso molecular de polilactato constituyen otra posible modificacion de la superficie de las nanopartmulas de la invencion. En el presente documento se pueden usar ambos estereoisomeros (formas D-/L) con el fin de reducir la posible biodegradacion.
Aparte de las modificaciones de la superficie mencionadas, tambien es posible la union proteolfticamente escindible de protemas inespedficas a las nanopartmulas. Esto puede aumentar la biocompatibilidad/compatibilidad. En la localizacion diana, la protema grande puede eliminarse liberando las nanopartmulas pequenas al tejido. Dicha eliminacion tambien puede tener lugar despues de un tiempo de permanencia apropiado. Para esto normalmente se
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usan protemas preferentes, tales como, por ejemplo, transferrina, lactoferrina, ceruloplasmina, elastina y albumina, ademas de otras protemas que reducen la adsorcion inespedfica. De este modo, por ejemplo, el recubrimiento de superficie compuesto por combinaciones de polipeptidos con elastina puede evitar la formacion de coagulos no deseada y, por lo tanto, aumentar la biocompatibilidad de las nanopartmulas.
La protema seroalbumina mayoritaria puede reducir las interacciones no espedficas con las membranas plasmaticas. Adicionalmente, la nanopartmula modificada apropiadamente retiene la capacidad para desarrollar interacciones espedficas con las celulas diana mediante un ligando espedfico que se une simultaneamente a la superficie de la partmula. Un recubrimiento con seroalbumina puede dar como resultado un tiempo en la circulacion sangumea sustancialmente mas largo al impedir una absorcion por los microfagos despues de la administracion intravenosa mas rapida que en el caso de las nanopartmulas no recubiertas.
La combinacion de diametro hidrodinamico reducido que da como resultado las velocidades de difusion y perfusion mas altas mencionadas, junto con las propiedades y mejoras descritas anteriormente y la alta intensidad de fluorescencia, especialmente en el intervalo de luz roja visible, hace que las nanopartmulas de la invencion sean un simple agente de diagnostico que puede emplearse de muchas maneras diferentes para la discriminacion selectiva y precisa de las formas tisulares in vivo. Estas posibilidades, en combinacion con biomarcadores espedficos de antigenos, se usan especialmente para identificar celulas que expresan CD44v5, CEA y/o CA19-9, en particular para distinguir tejido anormal (pre)carcinogenico del tejido normal, de modo que se ayuda a la evaluacion visual durante la intervencion quirurgica para una reseccion tumoral mas precisa.
Las nanopartmulas de la invencion que se pueden usar en el presente documento sirven, por tanto, como agentes de contraste. Esto se aplica en particular al uso en el diagnostico y la cirugfa del cancer.
Las nanopartmulas que portan la protema de union a CD44ex9 de acuerdo con la invencion pueden emplearse como agente de diagnostico, agente teranostico y/o agente terapeutico in vitro, ademas de ex vivo o in vivo. A tal fin, pueden administrarse localmente (por ejemplo, por via intratumoral, intramuscular o en tejidos/organos accesibles quirurgicamente) o bien tambien sistemicamente (por ejemplo, por via intravenosa). La administracion local/topica puede proporcionarse por medio de una solucion lfquida, de pulverizacion, espuma, crema o parche activo. Esto puede ser preferente en particular para el tratamiento/diagnostico de organos huecos, tal como en el caso del cancer de intestino. Tambien es posible la ingesta oral, por ejemplo como jarabe o en forma de comprimidos o capsulas. La inhalacion es igualmente posible (por ejemplo, pulverizacion). Se preve la administracion anal mediante supositorio. En una variante, las nanopartmulas pueden implantarse en forma de deposito.
En una realizacion preferente de la invencion, la protema de union a CD44ex9 se puede usar para la administracion dirigida de farmacos. En el contexto de la presente invencion, la administracion dirigida de farmacos se define como una medida para concentrar la medicacion en los tejidos de interes mientras se reduce la concentracion relativa de la medicacion en los tejidos restantes. A tal fin, la protema de union a CD44ex9 conjugada a una nanopartmula esta unida a un vehnculo de administracion de farmaco. Existen numerosos tipos de vehnculos de administracion de farmacos que son conocidos por el experto en la tecnica y que este puede seleccionar de acuerdo con el fin espedfico, tal como, por ejemplo, micelas polimericas, liposomas, portadores de farmacos basados en lipoprotemas, portadores de farmacos en nanopartmulas, dendnmeros, etc. Un vehnculo de administracion de farmacos ideal debe ser no toxico, biocompatible, no inmunogenico, biodegradable y que evite el reconocimiento por los mecanismos de defensa del huesped.
En una realizacion preferente de la invencion, los liposomas que comprenden acidos bisfosfonicos derivados de lfpidos se pueden usar para la administracion dirigida de farmacos, especialmente para administrar en estructuras oseas. Los acidos bisfosfonicos derivados de lfpidos respectivos se describen en el documento WO 2005/070952 A2 (MCS Micro Carrier Systems GmbH) junto con procedimientos de preparacion y utilizacion de dichos acidos bisfosfonicos.
En una realizacion preferente de la invencion, la nanopartmula conjugada de la invencion puede usarse como agente de diagnostico ex vivo o in vitro. El uso diagnostico in vitro o ex vivo se refiere a la deteccion de la protema CD44v5 en una muestra derivada de un paciente. La muestra que se va a analizar puede ser de cualquier tipo, incluyendo tejidos, organos y biopsias de los mismos o fluidos corporales tales como sangre, suero, orina, saliva o lfquido cerebral.
Para el uso diagnostico, la nanopartmula conjugada esta marcada para su deteccion. Los marcadores adecuados se conocen de la tecnica anterior e incluyen colorantes tales como colorantes luminiscentes o fluorescentes, un isotopo radiactivo, una enzima, un marcador proteico, tal como un marcador FLAG, un marcador GST, un marcador-MBP o marcador-His o una nanopartmula.
Para la incorporacion de un marcador se conocen varios procedimientos de la tecnica anterior que se basan en la modificacion aleatoria de grupos sulfhidrilo, amina o carboxilo. Como alternativa, se puede usar ingeniena genetica para introducir o eliminar grupos reactivos adicionales, tales como un residuo de cistema.
Como procedimiento alternativo, se puede unir un marcador peptfdico corto a la protema que funciona como un sitio aceptor del marcador. En el presente documento, el marcador esta unido a traves de una actividad intrmseca del
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marcador o la actividad de una enzima suministrada en trans. Ejemplos de dicho marcaje asociado a la actividad incluyen biotinilacion espedfica del sitio, mediada por la holoenzima sintetasa BirA de biotina, que permite combinar protemas marcadas con una amplia gama de reactivos de avidina/estreptavidina. Las protemas fusionadas al marcador LUMIO (un hexapeptido que contiene un motivo de tetracistema) pueden tenirse directamente con colorantes que contienen dos atomos de arsenico.
En una realizacion preferente de la invencion, la version modificada por ingeniena genetica de la enzima de reparacion del ADN humano O(6)-alquilguanina ADN alquiltransferasa (AGT; tambien conocida como SNAP-Tag) se fusiona a la protema de union a CD44ex. Los sustratos que contienen O(6)-bencilguanina se unen covalentemente a las protemas de fusion a traves de un enlace tioeter estable en una reaccion rapida y altamente espedfica de automarcaje. Esta tecnica del marcador y su uso con fines de diagnostico la desvelan Kampmeier y col., (2009) y Xie y col., (2010) junto con procedimientos de preparacion y utilizacion de dichos marcadores.
De acuerdo con la invencion, la protema de union a CD44ex9 esta unida a una nanopartmula. Se conocen diversos tipos de nanopartmulas en la tecnica anterior y tambien se desvelan en la presente solicitud.
En una realizacion preferente adicional, la protema de union a CD44ex9 marcada, que esta unida a una nanopartmula, esta contenida dentro de un bano de inmersion acuoso. Sumergiendo la muestra en el bano de inmersion, la protema de union a CD44ex9 marcada marcara espedficamente las protemas CD44v5 de la muestra que el investigador puede evaluar directamente visualmente. Este procedimiento es especialmente adecuado para cirugfa, por lo que el tejido retirado puede analizarse durante la cirugfa para detectar la presencia de marcadores tumorales. Como resultado, el cirujano dispone de informacion inmediata con respecto a la precision de la reseccion del tumor.
El termino agente de diagnostico se utiliza en el contexto de la presente invencion como sinonimo de "agente de contraste", es decir, sirve para la visualizacion discriminatoria de estructuras morfologicas o funcionales en sistemas biologicos, especialmente en personas vivas, para ayudar a una intervencion medica.
Las nanopartmulas se pueden emplear como agente de diagnostico, especialmente en intervenciones quirurgicas. Tambien pueden usarse en procedimientos mmimamente invasivos (por ejemplo, endoscopia, laparoscopia). La combinacion con procedimientos de obtencion de imagenes, tales como PET, MRT, CT, etc. merece la pena.
Como ya se ha indicado anteriormente, el uso de acuerdo con la invencion en forma de administracion local es
particularmente ventajoso. La cantidad de Cd empleado en la administracion local a este respecto de forma
ventajosa no excede de una decima parte de la exposicion total que normalmente se acumula de todos modos durante el curso de la vida en el tngado y el rinon de una persona de edad avanzada y estilo de vida habitual. La
exposicion total de estos organos es de aproximadamente 18 mg. Por consiguiente, es ventajoso para la
administracion local que la cantidad de nanopartmulas este limitada de modo que la cantidad de Cd suministrada al menos no supere sustancialmente 2 mg. En una realizacion particularmente preferente, la visualizacion del tumor es posible incluso con una cantidad de agente de contraste que no exceda una cantidad total de 0,6 mg, particularmente preferentemente 0,2 mg, de cadmio.
Por "administracion local" se entiende, para el fin de la invencion, cualquier administracion, en la que se pueda esperar una cantidad o dosis aumentada del agente de contraste en regiones distintas del cuerpo, dependiendo de la forma de administracion. Por consiguiente, una administracion vascular del agente de contraste es tambien una administracion local, si las medidas de acompanamiento del personal encargado dela administracion, tal como, por ejemplo, aplicar una ligadura a vasos aferentes o eferentes, impiden la diseminacion del agente de contraste a traves del sistema vascular sangumeo en el cuerpo de una manera esencialmente sin dificultades.
La ventaja particular de esta realizacion es que el uso de las nanopartmulas en la aplicacion medica sobre una persona viva es, por lo tanto, posible porque, de otro modo, es decir, como administracion sistemica, esta excluido debido a la toxicidad asociada con la misma. Esto se debe a que la administracion local reduce la dosis de nanopartmulas necesaria para una visualizacion adecuada.
Se ha observado que el agente de contraste que contiene Cd se emplea ventajosamente de acuerdo con la invencion para visualizar un tumor in vivo a una dosis correspondiente a una cantidad de 0,002 a 0,02 mg de Cd por cm3 del tejido tumoral. Las dosis del agente de contraste de 0,002 a 0,015 mg de Cd/cm3 de tejido tumoral son particularmente ventajosas, en particular las comprendidas entre 0,002 y 0,010 mg de Cd/cm3. Es posible con esta dosificacion ventajosa visualizar tumores con un volumen de hasta aproximadamente 150 cm3 in vivo sin exceder por ello el lfmite superior de exposicion normalmente aceptable para los seres humanos. La visualizacion de tumores con un volumen de hasta 50 cm3 es particularmente favorable.
Las investigaciones pueden referirse a todos los tejidos/organos accesibles del paciente, especialmente en la piel, organos huecos (por ejemplo, en los tractos gastrointestinal, urogenital, respiratorio) o bien regiones accesibles desde fuera de los organos sensoriales y tambien al sistema cardiovascular.
Tambien es posible el uso como agente de diagnostico in vitro, por ejemplo inmunohistoqmmica o FACS, y ELISA. Una combinacion de diagnostico in vivo e in vitro (por ejemplo, material de biopsia) es particularmente ventajosa.
Las protemas de union a CD44ex9 de acuerdo con la invencion pueden permanecer unidas a las nanopartfculas o pueden eliminarse o detectarse o liberarse.
En un aspecto adicional, la solicitud desvela peptidos v5 de CD44 como se enumeran en la siguiente tabla y se designan como SEQ ID No. 11 a 38. Estos peptidos tienen 12 unidades con secuencias superpuestas que cubren el 5 dominio v5 completo del CD44 humano.
N.° de peptido de CD44v5
Secuencia de aminoacidos SEQ ID No.
1
DVDRNGTTAYEG 11
2
VDRNGTTAYEGN 12
3
DRNGTTAYEGNW 13
4
RNGTTAYEGNWN 14
5
NGTTAYEGNWNP 15
6
GTTAYEGNWNPE 16
7
TTAYEGNWNPEA 17
8
TAYEGNWNPEAH 18
9
AYEGNWNPEAHP 19
10
YEGNWNPEAHPP 20
11
EGNWNPEAHPPL 21
12
GNWNPEAHPPLI 22
13
NWNPEAHPPLIH 23
14
WNPEAHPPLIHH 24
15
NPEAHPPLIHHE 25
16
PEAHPPLIHHEH 26
17
EAHPPLIHHEHH 27
18
AHPPLIHHEHHE 28
19
HPPLIHHEHHEE 29
20
PPLIHHEHHEEE 30
21
PLIHHEHHEEEE 31
22
LIHHEHHEEEET 32
23
IHHEHHEEEETP 33
24
HHEHHEEEETPH 34
5
10
15
20
25
30
35
40
(continuacion)
N.° de peptido de CD44v5
Secuencia de aminoacidos SEQ ID No.
25
HEHHEEEETPHS 35
26
EHHEEEETPHST 36
27
HHEEEETPHSTS 37
28
HEEEETPHSTST 38
En un aspecto, la solicitud desvela un peptido designado como SEQ ID No. 11 a 38 que tiene una delecion en N- terminal y/o C-terminal de uno, dos o tres aminoacidos.
En otro aspecto, la solicitud desvela tambien un peptido designado como SEQ ID No. 11 a 38 que tiene una extension en N-terminal y/o C-terminal de uno, dos o tres aminoacidos, por lo que estos aminoacidos adicionales son los de la respectiva secuencia de aminoacidos CD44v5.
En otro aspecto, dicho peptido puede usarse para bloquear la nanopartmula conjugada de la invencion. Debido a esta actividad antagonista, estos peptidos podnan usarse para verificar la especificidad de un marcaje de CD44 in vitro, ex vivo o in vivo.
Adicionalmente, dicho peptido podna usarse como antagonista para el uso terapeutico de la nanopartmula conjugada. En este contexto, el peptido podna usarse para regular, disminuir o cancelar el efecto del tratamiento asociado con CD44ex9.
En un entorno terapeutico, los peptidos CD44v5 podnan unirse directamente a los ligandos endogenos del receptor de CD44. Esto podna conducir a la neutralizacion de estos ligandos (haciendo que no esten disponibles para los receptores de CD44) y tambien podna conducir a una rapida eliminacion por los macrofagos.
En un aspecto adicional, la solicitud desvela que uno o mas de estos peptidos de acuerdo con las SEQ ID No. 11 to 38 podnan usarse como una vacuna con el fin de estimular el sistema inmunologico del individuo para desarrollar inmunidad adaptativa contra las variantes de CD44 que expresan el dominio v5. Como una vacuna, dichos peptidos podnan usarse para la prevencion del cancer o para una inmunoterapia del cancer.
Debido al resultado exitoso de la seleccion de dos hforidos que conduce a la identificacion de la protema de union a CD44ex9, los peptidos respectivos se han validado como epttopos inmunologicamente relevantes. De este modo, son adecuados para el uso como vacunas.
La solicitud tambien desvela una composicion de vacuna que comprende una protema aislada de acuerdo con las SEQ ID No. 11 a 38 o un fragmento peptfdico de la misma o un acido nucleico que codifica dicha protema o dicho fragmento peptfdico para su uso como medicamento en la prevencion o tratamiento de un cancer.
En un aspecto adicional, la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende la protema de union a CD44ex9 de la invencion o una protema de union a CD44ex9 marcada, que estan unidas a una nanopartmula y a un vehmulo farmaceuticamente aceptable.
Las composiciones farmaceuticas preparadas de acuerdo con la invencion comprenden la nanopartmula conjugada junto con un vehmulo farmaceuticamente aceptable. La expresion “farmaceuticamente aceptable” incluye cualquier vehmulo que no interfiere con la eficacia de la actividad biologica de la protema de union a CD44ex9 y que no es toxico para el huesped al que se le administra.
Como una realizacion de la invencion, las composiciones se preparan usando protema de union a CD44ex9 estabilizada con seroalbumina humana. A tal fin, se liofiliza una preparacion de protema de union a CD44ex9 con seroalbumina humana en viales.
En ciertas realizaciones, la composicion farmaceutica comprende ademas uno o mas otros farmacos que actuan como toxina, citocina, agente citostatico o agente inmunomodulador.
Tal como se usa en el presente documento, con la expresion "vehmulo farmaceuticamente aceptable" se pretende incluir todos y cualquier disolvente, solubilizante, carga, estabilizante, aglutinante, absorbente, base, agente tampon, lubricante, vehmulo de liberacion controlada, diluyente, agente emulsionante, humectante, lubricante, medio de dispersion, recubrimiento, agente antibacteriano o antifungico, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion, y similares, compatibles con la administracion farmaceutica. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es bien conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente
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convencional es incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. Tambien se pueden incorporar agentes complementarios en las composiciones.
Una composicion farmaceutica de la invencion se formula para que sea compatible con la via de administracion que se pretende. Entre los ejemplos de las vfas de administracion se incluyen administracion parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradermica, subcutanea, oral (por ejemplo, inhalacion), transdermica (topica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicacion parenteral, intradermica o subcutanea pueden incluir los componentes siguientes: un diluyente esteril tal como agua para inyeccion, solucion salina, aceites fijos u otros disolventes sinteticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bendlico o metilparabenos; antioxidantes, tales como acido ascorbico o bisulfato sodico; agentes quelantes, tales como EDTA; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sodico o dextrosa. El valor de pH se puede ajustar con acidos o bases, tales como acido clortndrico o hidroxido sodico. La preparacion parenteral se puede encerrar en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis multiple hechos de vidrio o plastico.
Las composiciones farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. Para administracion intravenosa, los vehfculos adecuados incluyen solucion salina fisiologica, agua bacteriostatica, Cremophor EL™ (BASF, Ludwigshafen, BRD) o solucion salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composicion inyectable debera ser esteril y sera fluida en la medida en la que se pueda inyectar con facilidad. Debe ser estable en las condiciones de la fabricacion y almacenamiento y debe conservarse frente a la accion contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehfculo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula necesario y mediante el uso de tensioactivos.
La prevencion de la accion de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorbutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal y similares. En muchos casos, sera preferente incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sodico en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables se puede efectuar incluyendo en la composicion un agente que retrasa la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio.
Las soluciones inyectables esteriles pueden prepararse incorporando el compuesto activo (por ejemplo, la nanopartfcula conjugada) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con una o una combinacion de ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion por filtracion. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporacion del compuesto activo en un vehfculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados en lo que antecede. En el caso de los polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los procedimientos preferentes de preparacion son secado al vacfo y liofilizacion, que da un polvo del principio activo mas cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solucion del mismo previamente esterilizada mediante filtracion.
Las composiciones orales incluyen en general un diluyente inerte o un vehfculo comestible. Se pueden encerrar en capsulas de gelatina, comprimirse en forma de comprimidos. Con el fin de la administracion terapeutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y utilizarse en forma de comprimidos, trociscos o capsulas. Las composiciones orales tambien se pueden preparar usando un vehfculo lfquido para su uso como colutorio, en el que el compuesto en el vehfculo fluido se aplica oralmente y se mueve y se expectora o se traga. Se pueden incluir como parte de la composicion compuestos de union o materiales coadyuvantes farmaceuticamente compatibles. Los comprimidos, pfldoras, capsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina; un excipiente, tal como almidon o lactosa; un agente disgregante, tal como acido algmico, glicolato de almidon sodico (por ejemplo, Primogel ®), o almidon de mafz; un lubricante tal como estearato de magnesio; un emoliente tal como dioxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante, tal como menta piperita, salicilato de metilo o aroma de naranja.
Para la administracion por inhalacion, los compuestos se liberan en forma de un pulverizador en aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas, tal como dioxido de carbono, o un nebulizador.
La administracion sistemica tambien puede ser por via transmucosa o transdermica. Para la administracion transdermica o transmucosa, se usan penetrantes adecuados de la barrera que se desea atravesar. Dichos penetrantes se conocen generalmente en la tecnica e incluyen, por ejemplo, para administracion transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de acido fusfdico. La administracion transmucosa se puede conseguir mediante el uso de pulverizadores nasales o supositorios. Para administracion transdermica, los compuestos bioactivos se formulan como unguentos, pomadas o cremas como se conoce generalmente en la tecnica.
La composicion tambien se puede preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales, tales como manteca de cacao y otros gliceridos) o enemas de retencion para administracion rectal.
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En una realizacion, los restos terapeuticos, que pueden contener la protema de union a CD44ex9, se preparan con vehmulos que protegeran el compuesto contra la eliminacion rapida del cuerpo, tal como una formulacion de liberacion controlada, incluyendo implantes y sistemas de administracion microencapsulados. Los procedimientos para la preparacion de dichas formulaciones seran evidentes para los expertos en la tecnica. Los materiales tambien se pueden obtener comercialmente a partir, por ejemplo Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals Incorporation. Tambien pueden usarse suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a celulas cancerosas con anticuerpos contra antigenos tumorales) como vehmulos farmaceuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica.
Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificacion para facilidad de administracion y uniformidad de la dosificacion. La forma de unidad de dosificacion, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se va a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de protema activa calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vehmulo farmaceutico requerido. La especificacion para las formas de unidad de dosificacion de la invencion vienen dictadas y dependen directamente de las caractensticas unicas de la protema activa y del efecto terapeutico concreto que se debe conseguir y de las limitaciones inherentes en la tecnica de formar tal compuesto activo para el tratamiento de individuos.
La toxicidad y la eficacia terapeutica de la protema pueden determinarse por procedimientos farmaceuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentacion, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal al 50 % de la poblacion) y la DE50 (la dosis terapeuticamente eficaz en el 50 % de la poblacion). La relacion de dosis entre los efectos toxicos y los efectos terapeuticos es el mdice terapeutico y puede expresarse como la relacion DL50/DE50. Son preferentes los compuestos que exhiben indices terapeuticos grandes. Aunque pueden usarse protemas que exhiben efectos secundarios toxicos, debe llevarse cuidado disenando un sistema de administracion que dirija dichas protemas al sitio o el tejido afectado para minimizar el dano potencial a las celulas no cancerosas y, de esta manera, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios animales pueden usarse en la formulacion de un intervalo de dosificacion para su uso en humanos. La dosificacion de tales compuestos cae preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificacion puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificacion empleada y la via de administracion utilizada. Para cualquier compuesto usado en el procedimiento de la invencion, la dosis terapeuticamente eficaz puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentracion en plasma circulante que incluye la CI50 (es decir, la concentracion del compuesto de ensayo que logra una inhibicion semimaxima de los smtomas) como se determina en el cultivo celular. Tal informacion puede usarse para determinar mas precisamente las dosis utiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, por cromatograffa lfquida de alto rendimiento.
Las composiciones farmaceuticas pueden incluirse en un recipiente, embalaje o dispensador, junto con instrucciones para la administracion.
En otro aspecto, la invencion proporciona un embalaje de combinacion medicamento/dosfmetro que comprende: a) un medicamento que se va a administrar individualmente, y b) un sistema indicador de diagnostico para una propiedad espedfica del paciente que es relevante para la accion, efecto secundario, interaccion, metabolismo, absorcion, distribucion, metabolismo y eliminacion del medicamento que se va a administrar a un paciente, en el que la propiedad espedfica del paciente se selecciona de entre el grupo que consiste en una sustancia endogena, un mecanismo de regulacion, un gen o un sistema de indicacion. En el embalaje de combinacion descrito anteriormente, el medicamento o el sistema indicador de diagnostico puede ser la protema de union a CD44ex9 aislada o cualquier protema de fusion o conjugado con la misma. Para el fin descrito anteriormente, tambien se pueden usar los peptidos CD44v5 de la invencion como medicamento o sistema indicador de diagnostico.
Un embalaje de combinacion adecuado se desvela en el documento EP 1 542 644 B1 (MCS Micro Carrier Systems GmbH), junto con procedimientos de preparacion y uso de dicha combinacion de medicamento/dosfmetro.
Otro aspecto de la invencion incluye procedimientos para preparar composiciones farmaceuticas para modular la expresion o actividad de la protema de la presente invencion. Tales procedimientos comprenden la formulacion de un vehmulo farmaceuticamente aceptable con un agente que modula la expresion o la actividad de la protema de la presente invencion. Dichas composiciones pueden incluir adicionalmente agentes activos adicionales. De este modo, la invencion incluye ademas procedimientos para preparar una composicion farmaceutica formulando un vehmulo farmaceuticamente aceptable con un agente que modula la expresion o la actividad de la protema de la presente invencion y uno o mas agentes bioactivos adicionales.
Definiciones
En el contexto de la presente invencion, el termino "protema de union a CD44ex9" se usa para una protema con una longitud de 300 aminoacidos o menos que se une al polipeptido codificado por el exon 9 del gen CD44 humano. En la descripcion se denomina tambien "protema de union" o "compuesto activo".
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Una protema en el contexto de la invencion se define como una molecula que esta compuesta por aminoacidos. Por lo tanto, el termino protema incluye dipeptidos, tripeptidos, tetrapeptidos, pentapeptidos, hexapeptidos, heptapeptidos, octapeptidos, oligopeptidos mas largos y cadenas de aminoacidos. La cadena de aminoacidos puede estar en una forma lineal o ramificada.
Los aminoacidos en el contexto de la presente invencion son compuestos organicos que contienen al menos un amino y al menos un grupo carboxilo que en la protema forma un enlace amida.
Los aminoacidos que forman parte de la protema pueden tomarse de los 20 alfa-aminoacidos estandar o aminoacidos no estandar, como selenocistema, pirrolisina, lantionina, hidroxiprolina, carboxigluatamato, acido 2- aminoisobutmco, deshidroalanina. Adicionalmente, otros aminoacidos como beta-aminoacidos (por ejemplo, beta alanina), gamma aminoacidos o incluso aminoacidos superiores podnan formar parte de la protema.
Para ciertos aminoacidos se puede elegir una forma enantiomerica o estereoisomerica diferente, como, por ejemplo, para los aminoacidos alfa que existen como dos enantiomeros, la forma D y la forma L.
La protema puede fabricarse sinteticamente (por medio de smtesis organica en un sistema sin celulas que hace uso de un sistema ribosomico que puede o no ser artificial) o puede ser fabricada de forma natural por celulas que pueden o no manipularse geneticamente, o por un unico organismo celular (por ejemplo, por una bacteria o una celula de levadura) o un organismo multicelular.
La protema podna modificarse de muchas maneras. Las modificaciones tfpicas son modificaciones postraduccionales que incluyen lfpidos, grupos acetato, grupos fosfato o carbohidratos. La protema tambien podna modificarse qmmicamente, por ejemplo con biotina.
La protema puede ser un multfmero que consiste en subunidades identicas (homomero) o protemas diferentes (heteromero) que se mantienen unidas por enlaces covalentes o interacciones no covalentes.
La expresion "afinidad de union" utilizada en el presente documento se refiere a la fuerza de la afinidad entre la protema de union a CD44ex9 y el dominio CD44v5 y se describe mediante la constante de disociacion Kd. El valor de la Kd para la afinidad de union entre la protema de union a CD44ex9 y el dominio CD44v5 puede determinarse mediante procedimientos de equilibrio, (por ejemplo, ensayo de inmunoabsorcion unido a enzimas (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA)) o cinetica (por ejemplo, analisis BlAcORE™), por ejemplo.
"Kd" se refiere a la afinidad de union relativa entre la protema de union A CD44ex9 y el dominio CD44v5. Los valores de Kd altos representan una eficacia de union baja.
En el contexto de la invencion, la expresion "tratamiento agudo" se refiere a un tratamiento medico a corto plazo, normalmente en un hospital, para pacientes que tienen una enfermedad o lesion aguda o que estan en recuperacion de una cirugfa. La expresion "tratamiento postagudo" se refiere a un tratamiento medico de medio plazo, normalmente en un hospital, para pacientes que tienen una enfermedad o lesion aguda o que estan en recuperacion de una cirugfa.
El termino "tratar" o "tratamiento" se refiere a cualquier medida medica para prevenir, reducir, mitigar o curar trastornos fisiologicos en un mairnfero, en particular un ser humano, en la necesidad del mismo. De acuerdo con la invencion, el tratamiento abarca tambien una administracion dirigida de farmacos.
Una "cantidad terapeuticamente eficaz" se define como la cantidad de principio activo que reducira los smtomas asociados con una enfermedad neurologica o neurodegenerativa, tal como un accidente cerebrovascular. "Terapeuticamente eficaz" tambien se refiere a cualquier mejora de la gravedad del trastorno o la frecuencia de incidencias en comparacion con ningun tratamiento. El termino "tratamiento" abarca curar o cicatrizar, asf como mitigacion, remision o prevencion.
La expresion "vector de expresion" se refiere a vectores que tienen la capacidad de incorporar y expresar fragmentos de ADN heterologos en una celula extrana. Se conocen muchos vectores de expresion procariotas y eucariotas y/o estan disponibles comercialmente. La seleccion de vectores de expresion adecuados esta dentro del conocimiento del experto en la materia.
En el contexto de la invencion, el termino "nanopartmula" se refiere a una partmula con un tamano inferior a 1 pm y, preferentemente, entre 1 y 100 nm. De este modo, el termino "nanopartmula" incluye nanocristales hechos de materiales semiconductores (llamados puntos cuanticos), asf como nanopartmulas que consisten en un grupo de metales nobles, nanopartmulas inorganicas luminiscentes basadas en tierras raras, nanopartfculas de oxido de hierro superparamagneticas (IONP), micelas de copolfmero de bloques, nanocelulas, dendnmeros, nanotubos, polimersomas, nanopartfculas XPclad® y nanopartfculas que consisten en sflice amorfa rodeada por una capa de fosfato de calcio luminiscente cristalino (por ejemplo, ORMOBEAD®).
Referencias
Dembski S, Probst J, Kockenbring T y Barth S, News Analytik, 18/1/2013; pag. 1,-3.
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Leyendas de las figuras
Fig. 1: Estructura genomica y dominios proteicos de CD44.
Fig. 2: (A) Esquema de la estrategia de la deteccion de dos tnbridos de levadura. (B) Vector usado para la
deteccion de Y2H.
Fig. 3: Secuencias de aminoacidos de los clones positivos que interaccionan con CD44 junto con la
secuencia de consenso derivada del mismo.
Fig. 4: Marcaje de celulas HT29 con el conjugado de nanopartfculas Q_CA19-9-3.
Fig. 5: Control negativo para el marcaje de celulas HT29 con el conjugado de nanopartfculas Q_CA19-9-5.
Fig. 6: Cuantificacion del marcaje de celulas HT29 con el conjugado de nanopartfculas Q_CA19-9-3 o el
control negativo para la nanopartfcula-MBP.
Fig. 7: Competencia del marcaje de celulas HT29 con el conjugado de nanopartfculas Q_CA19-9-3 mediante
la adicion de cantidades crecientes del objetivo libre CA19-9.
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Fig. 8: Marcaje de celulas Colo29 con el conjugado de nanoparticulas Q_CA19-9-3.
Fig. 9: Control negativo para el marcaje de celulas Colo29 con el conjugado de nanoparticulas Q_CA19-9-5.
Fig. 10: Marcaje de celulas SW116 con el conjugado de nanoparticulas Q_CA19-9-3.
Fig. 11: Control negativo para el marcaje de celulas SW116 con el conjugado de nanoparticulas Q_CA19-9-5.
Fig. 12: Marcaje de tejido de adenocarcinoma mucinoso (muestra N.° 35) con una nanoparticula biespedfica Q_CEA/CA19-9_12 conjugada con un anticuerpo anti-CEA y un anticuerpo anti-CA-19-9. En los cuatro cuadrantes se analizaron las condiciones siguientes:
Izquierda superior: Marcaje con Q_CEA/CA19-9_12
Derecha superior: Marcaje con CEA/CA19-9_12 mediante la adicion de MBP-CEA diana (25 jM) Izquierda inferior: Marcaje con Q_CEA/CA19-9_12 mediante la adicion de la diana libre Sialyl LewiSa (250 jM)
Derecha inferior: Marcaje con Q_CEA/CA19-9_12 mediante la adicion de las dianas libres MBP-CEA (25 jM) y Sialyl Lewis a (250 jM)
Ejemplos
Ejemplo 1: Aislamiento de las protemas de union a CD44ex9
Para el aislamiento de protemas o fragmentos de protemas que se unen al dominio v5 de CD44 se realizo una deteccion competitiva de dos dbridos de acuerdo con el procedimiento desvelado en el documento EP 1 721 974 A1. Como cebo, se fusiono el fragmento v5 con el dominio de union a GAL4. El ORF respectivo se clono en un vector plasirndico y se designo como pGBKT7 (vease la Figura 2). Se uso una biblioteca de ADNc humano con fragmentos fusionados al dominio de activacion de GAL4 como presa (vector pGADT7-RecAB; vease la Figura 2).
La deteccion se realizo en condiciones de seleccion rigurosas y dio lugar a la identificacion de 39 clones positivos. Despues de la cotransformacion selectiva del cebo y del plasmido presa, 21 de los 39 clones permanecieron positivos. Los 21 clones se secuenciaron y se analizaron mediante busqueda BLAST. Como resultado, las 21 secuencias se pudieron reducir a 12 secuencias diferentes, ya que cuatro secuencias se identificaron dos veces y una secuencia estaba presente en cuatro clones.
Adicionalmente, una comparacion de secuencias revelo que estas cinco familias de secuencias muestran amplias homologfas de secuencia que permiten la formacion de una secuencia de consenso (vease la Figura 3).
Ejemplo 2: Deteccion in vitro de celulas tumorales que expresan antigenos
2.1 Antecedentes y objeto
Con el fin de demostrar la capacidad de los conjugados de puntos cuanticos-protema para detectar espedficamente celulas tumorales que expresan antigenos, se analizaron muestras tumorales o celulas tumorales cultivadas in vitro mediante fluorescencia y en paralelo mediante inmunohistoqmmica para la expresion del antigeno respectivo. Como primer antigeno, se analizo el antigeno carcinoembrionario (CEA). El CEA es una glicoprotema implicada en la adhesion celular. Como ligando de deteccion, el anticuerpo anti-CEA se conjugo con el punto cuantico QDBP-655 (carga # 773780). Adicionalmente, se analizo el antigeno de cancer 19-9 (CA19-9). CA19-9 es un antigeno de Lewis (a) sialilado y representa un marcador tumoral que se usa principalmente en el tratamiento del cancer de pancreas.
2.2. Muestras
2.2.1 Muestras para cultivo celular
En un primer conjunto de experimentos, se usaron las lmeas celulares de cancer humanas cultivadas in vitro HT29, Colo25 y SW116. HT29 es una lmea celular adherente de adenocarcinoma colorrectal, Colo25 una lmea celular de carcinoma de colon humano y SW116 una lmea celular de cancer colorrectal.
2.2.2. Muestra de tumor
En un conjunto diferente de experimentos, se utilizo una muestra tomada de un tumor humano. La muestra de tumor N.° 35 se reseco en 2011 del ciego y se diagnostico como un adenocarcinoma mucinoso. Se clasifico segun la clasificacion TNM como pT4No(0/18)G3Ro. Esta muestra que no se pretrato de otro modo se preparo y fijo como sigue.
Preparacion y fijacion de secciones de tejido
La muestra de tumor resecada, almacenada a -70 °C, se uso para preparar criosecciones con un espesor de 5 jm utilizando un criostato HM560 MV (Thermo Scientific, Walldorf, Alemania). Las secciones se secaron durante de 60 a 120 minutos a temperatura ambiente y se incubaron con acetona fria (-20 °C) durante 10 minutos. Despues de una
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etapa de secado adicional durante 10 minutes a temperatura ambiente, las secciones se almacenaron durante la noche a -70 °C.
Las secciones se descongelaron en una caja cerrada durante 30 minutes a temperatura ambiente. La fijacion se realizo mediante incubacion en una solucion que contema 20 mg/ml de suberimidato de dimetilo (DMS) y CaCl2l 20 mM en tampon Tris-HCl 250 mM pH 8,0. Despues, las secciones se lavaron durante 5 minutos en tampon D-PBS-T que contema NaCl 130 mM, Na2PO4 7 mM, KH2PO4 3 mM y 0,1 % de Tween 20 mediante una etapa de inactivacion durante 20 minutos en un tampon que contema NaCl 130 mM, Na2PO4 7 mM, KH2PO4 3 mM y glicerina 200 mM. En una etapa final, las secciones se lavaron durante 5 minutos en tampon D-PBS-T.
Contratincion de las secciones de tejido.
Se realizo contratincion usando Dako Autostainer Plus (DAKO Deutschland GmbH, Hamburgo, Alemania) de acuerdo con el protocolo siguiente:
- Aclarando con tampon D-PBS-T
- Bloqueando durante 60 minutos con 1 % de BSA/5 % de suero de cabra en tampon D-PBS
- Soplando
- Incubacion con 2 x 100 pl de conjugado (20nM en 1 % de BSA/5 % de suero de cabra en tampon D-PBS) durante 60 minutos
- Aclarando tres veces con D-PBS-T
- Soplando
- Incubacion con 2 x 100 pl de anticuerpo primario (20nM en 1 % de BSA/5 % de suero de cabra en tampon D- PBS) durante 60 minutos
- Aclarando tres veces con D-PBS-T
- Soplando
- Incubacion con 2 x 100 pl de anticuerpo secundario (20nM en 1 % de BSA/5 % de suero de cabra en tampon D- PBS) durante 60 minutos
- Aclarando tres veces con D-PBS-T
- Soplando
- Incubacion con 3 x 200 pl Hoechst 33342 (2 pg/ml en tampon D-PBS) durante 10 minutos
- Aclarando tres veces con D-PBS-T
- Incluyendo en Mowiol/Trietilendiamina (DABCO)
Evaluacion microscopica
Las secciones preparadas anteriormente se evaluaron con un microscopio inverso Axiovert 200 con un sistema de camara CCD Axiocam HrM y Axiocam Hrc, un dispositivo de iluminacion HXP 120 C. Las imagenes se analizaron utilizando el software Axiovision (version 4.8; Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania).
2.3 Conjugados de proteina-punto cuantico
Para la deteccion de antfgenos se prepararon los puntos cuanticos enumerados en la siguiente tabla:
Conjugado
Tipo de punto cuantico QDBP-655 Ligando Relacion QDBP/Ligando
Q561
n.° 773780 SI6166 N/A
Q_CA19-9-20
n.° 773780 MBP-NS-19-9-scFv-His6 + SI6166 1:50
Q_CEA/CA19-9_9
Q561 MBP-NS-19-9-scFv-His6 + SI6166 1:10
Q_CEA/CA19-9_10
Q561 MBP-NS-19-9-scFv-His6 + SI6166 1:20
Q_CEA/CA19-9_11
Q561 MBP-NS-19-9-scFv-His6 + SI6166 1:30
Q_CEA/CA19-9_12
Q561 MBP-NS-19-9-scFv-His6 + SI6166 1:40
Q_CEA/CA19-9_13
Q561 MBP-NS-19-9-scFv-His6 + SI6166 1:50
Q_CEA/CA19-9_1
Q561 MBP-NS-19-9-scFv-His6 + SI6166 1:50
El conjugado Q561 es un conjugado entre el punto cuantico QDBP-655 (lote # 773780) y el ligando SI6166. QDBP- 655 tiene un diametro hidrodinamico de 6 nm y posee un ligando Ni-NTA. El ligando SI6166 es una protema de union a CEA que tiene un diametro hidrodinamico de 2,1 nm, y el conjugado final exhibe un diametro hidrodinamico de 10,1 nm. La protema anti-CEA se acopla a los puntos cuanticos.
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Los puntos cuanticos Q_CA19-9-x son conjugados entre el punto cuantico QDBP-655 (lote n.° 773780) y el anticuerpo anti-CA 19-9 "MBP-NS-19-9-scFv-His6". Este anticuerpo anti-CA19-9 que es un mimetico de anticuerpo recombinante que consiste en la region variable de la cadena pesada (VH) y la cadena ligera (VL) y puede describirse como un "fragmento de cadena unica de regiones variables", scFv. Este fragmento scFv se fusiona con un marcador de His que se usa para el acoplamiento al punto cuantico. El anticuerpo anti-CA 19-9 "MBP-NS-19-9- scFv-His6" tambien se denomina SI6950.
Los puntos cuanticos Q_CEA/CA19-9_x son conjugados biespedficos, por lo que el punto cuantico Q561 que aloja el anticuerpo anti-CEA SI6166 se conjuga adicionalmente con el anticuerpo anti-CA 19-9 SI6950.
Se prepararon diferentes lotes del conjugado Q_CEA/CA19-9_x diferenciandose por la relacion del punto cuantico respecto al ligando (vease la ultima columna de la tabla).
3. Resultados de las nanoparticulas conjugadas con CA19-9
3.1 Celulas HT29
Tal y como se muestra en el panel izquierdo superior de la figura 4, el conjugado Q_CA19-9-3 marca la membrana celular de las celulas HT29. Una tincion de las celulas con el anticuerpo anti-CA19-9 detectado por fluorescencia con Alexa Fluor 488 (panel superior derecho) muestra una co-localizacion perfecta de las senales que muestran la especificidad de la union al conjugado. En el panel inferior derecho las celulas se muestran mediante microscopia de contraste de interferencia diferencial (DIC).
En el control negativo se uso un punto cuantico conjugado a MBP (MBP-His/QDP655). Como se muestra en el panel superior derecho de la Fig. 5, no se pudo detectar ningun marcaje. La presencia del antigeno CA19-9 se verifico mediante tincion de las celulas con el anticuerpo anti-CA19-9 detectado mediante fluorescencia con Alexa Fluor 488 (panel superior derecho).
El marcaje espedfico del antigeno CA19-9 tambien se demostro mediante un experimento de titulacion. Como se muestra en la figura 6, una cantidad creciente del conjugado Q_CA19-9_3 conduce a un marcaje aumentado de las celulas HT29 como se demuestra mediante el aumento de la fluorescencia relativa. Por el contrario, el control negativo MBP-His/QDP655 conduce solamente a un marcaje fluorescente escaso que no muestra un aumento mayoritario a concentraciones de conjugado mas altas.
La especificidad del marcaje de CA19-9 se verifico adicionalmente mediante un experimento de competicion como se muestra en la Figura 7: Una cantidad creciente de antigeno CA19-9 libre anadido a la mezcla de marcaje conduce a una disminucion del marcaje de CA19-9.
3.2 Celulas Colo29
Tal y como se muestra en el panel superior izquierdo de la figura 8, el conjugado Q_CA19-9-3 marca la membrana celular de las celulas Colo29. Una tincion de las celulas con el anticuerpo anti-CA19-9 detectado por fluorescencia con Alexa Fluor 488 (panel superior derecho) muestra una co-localizacion perfecta de las senales que muestran la especificidad de la union al conjugado. En el panel inferior derecho las celulas se muestran mediante microscopia de contraste de interferencia diferencial (DIC).
En el control negativo se uso un punto cuantico conjugado a MBP (MBP-His/QDP655). Como se muestra en el panel superior derecho de la Fig. 9, no se pudo detectar ningun marcaje. La presencia del antigeno CA19-9 se verifico mediante tincion de las celulas con el anticuerpo anti-CA19-9 detectado mediante fluorescencia con Alexa Fluor 488 (panel superior derecho).
3.3 Celulas SW116
Tal y como se muestra en el panel superior izquierdo de la figura 10, el conjugado Q_CA19-9-3 marca la membrana celular de las celulas Colo29. Una tincion de las celulas con el anticuerpo anti-CA19-9 detectado por fluorescencia con Alexa Fluor 488 (panel superior derecho) muestra una co-localizacion perfecta de las senales que muestran la especificidad de la union al conjugado. En el panel inferior derecho las celulas se muestran mediante microscopia de contraste de interferencia diferencial (DIC).
En el control negativo se uso un punto cuantico conjugado a MBP (MBP-His/QDP655). Como se muestra en el panel superior izquierdo de la Fig. 11, no se pudo detectar ningun marcaje. La presencia del antigeno CA19-9 se verifico mediante tincion de las celulas con el anticuerpo anti-CA19-9 detectado mediante fluorescencia con Alexa Fluor 488 (panel superior derecho).
4. Resultados de las nanoparticulas conjugadas biespecificas
Este experimento se realizo con el fin de probar la capacidad de la nanoparticula conjugada biespedfica para interaccionar con ambos antigenos en una diana dada. Con este fin se utilizo la nanoparticula conjugada tanto con el anticuerpo anti-CA19-9 como con el anticuerpo anti CEA para detectar los antigenos respectivos en las celulas
tumorales de la muestra N.° 35 descrita anteriormente. La especificidad se demostro mediante la inhibicion con las dianas libres MBP-CEA y 19-9.
Como se muestra en el panel superior izquierdo de la Fig. 12, las nanopartfculas biespedficas marcaron las membranas celulares del tejido tumoral. Una tincion del tejido tumoral con un anticuerpo anti-CA19-9 o un anticuerpo 5 anti-CEA mostro en cada caso una co-localizacion parcial que combina con el perfil de marcaje completo de la nanopardcula,
Cuando se utiliza la nanopartfcula biespedfica en combinacion con la diana libre MBP-CEA, puede observarse un marcaje que muestra una co-localizacion perfecta con la tincion del anticuerpo anti-CA-19-9 (vease la Figura 12, cuadrante superior derecho). De este modo, la diana libre inhibe la interaccion con el CEA unido a las celulas, pero 10 todavfa permite un marcaje del CA19-9.
Como se muestra en el cuadrante inferior izquierdo de la Fig. 12, la adicion de la diana libre Sialil-Lewisa inhibe la interaccion con el antfgeno CA19-9 celular pero retiene el marcaje CEA.
En un experimento final, las nanopartfculas biespedficas se combinaron con ambas dianas libres, MBP-CEA y Sialyl-Lewisa (vease el cuadrante inferior derecho de la figura 12). Como resultado, el marcaje se inhibio 15 completamente (esquina superior izquierda del cuadrante). La expresion co-localizada de ambos antfgenos se verifico mediante tincion con los respectivos anticuerpos anti-CEA y CA19-9.

Claims (17)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una nanopartmula conjugada a una protema capaz de unirse a un polipeptido codificado por el exon 9 de CD44 humano (CD44ex9), dicha protema comprende o consiste en
    (i) una secuencia de aminoacidos de acuerdo con las SEQ ID No. 1 to 5; o
    (ii) una secuencia de aminoacidos con al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoacidos dada en las SEQ ID No. 1 a 5 en su conjunto,
    en el que dicha protema tiene una longitud de 100 aminoacidos o menor.
  2. 2. La nanopartmula conjugada de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la protema de union a CD44ex9 se une a una isoforma de CD44 que comprende el dominio codificado por el exon 9.
  3. 3. La nanopartmula conjugada de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que la isoforma de CD44 se selecciona entre el enumerado que consiste en:
    a) CD44 v5,
    b) CD44 v5-v6,
    c) CD44 v3-v6,
    d) CD44 v3-v6,
    e) CD44 v2-v10,
    f) CD44 v3-v10,
    g) CD44 v4-v7,
    h) CD44 v4-v10.
  4. 4. La nanopartmula conjugada de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, conjugada ademas a al menos una sustancia de union al antigeno tumoral y/o agente citotoxico.
  5. 5. La nanopartmula conjugada de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que dicha sustancia de union al antfgeno tumoral se selecciona de la lista que consiste en un anticuerpo contra CEA, un anticuerpo contra CA-19-9, una adhesina, que esta modificada preferentemente y combinaciones de los mismos.
  6. 6. La nanopartmula conjugada de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, en la que la nanopartmula se selecciona del grupo que consiste en puntos cuanticos, grupos de metales nobles, nanopartmulas de oxido de hierro superparamagneticas (IONP), micelas de copolfmero de bloques, nanocelulas, dendnmeros, nanotubos, polimersomas, nanopartmulas XPclad®, nanopaiimulas que consisten en sflice amorfa rodeada por una capa de fosfato de calcio luminiscente cristalino, nanopartmulas con nucleo-envoltura de SiO2/Zn2SiO4:Mn2+ y SiO2/Ca-io(PO4)6OH:Eu3+ con diametros inferiores a 100 nm y nanopartmulas hforidas marcadas con colorante luminiscente.
  7. 7. La nanopartmula conjugada de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, en la que la nanopartmula tiene un nucleo inorganico y una capa de recubrimiento que comprende un componente imidazol, siendo el diametro mas pequeno del nucleo inorganico que incluye la capa de recubrimiento de no mas de 15 nm.
  8. 8. La nanopartmula conjugada de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que el componente imidazol es un peptido que comprende al menos un residuo histidilo y, preferentemente, un dipeptido.
  9. 9. La nanopartmula conjugada de acuerdo con la reivindicacion 8, en la que el componente imidazol es una mezcla de diferentes dipeptidos que contienen histidilo.
  10. 10. La nanopartmula conjugada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la nanopartmula es no-inerte.
  11. 11. La nanopartmula conjugada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para el uso en el diagnostico o tratamiento in vivo de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedades autoinmunes, tales como diabetes dependiente de insulina, esclerosis multiple, smdrome de Sjogren o lupus eritematoso sistemico (LES); enfermedades de la piel, como psoriasis o dermatitis atopica; enfermedades inflamatorias cronicas, tales como artritis reumatoide o enfermedad inflamatoria intestinal; lesion en los tejidos; enfermedades alergicas y cancer.
  12. 12. La nanopartmula conjugada de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, para el uso in vivo para distinguir tejido anormal, precancerogenico o tejido cancerogenico del tejido normal o para ayudar en la evaluacion visual durante la intervencion quirurgica.
  13. 13. La nanopartmula de acuerdo con la reivindicacion 12, en la que el agente de contraste es capaz de identificar celulas cancerosas o celulas de carcinoma in situ.
  14. 14. La nanopartmula de acuerdo con la reivindicacion 13, en la que las celulas cancerosas a identificar se
    5
    10
    15
    20
    25
    seleccionan de la lista que consiste en:
    a) celulas de adenocarcinoma;
    b) celulas de tumores epiteliales del timo;
    c) celulas de carcinoma del cuello uterino;
    d) celulas de linfoma no Hodgkin;
    e) celulas de carcinoma de celulas pulmonares;
    f) celulas de carcinoma de pancreas; y
    g) celulas madre de cancer.
  15. 15. El uso de la nanopartfcula conjugada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 como un agente de diagnostico ex vivo o in vitro para el diagnostico de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedades autoinmunes, tales como diabetes dependiente de insulina, esclerosis multiple, smdrome de Sjogren o lupus eritematoso sistemico (LES); enfermedades de la piel, como psoriasis o dermatitis atopica; enfermedades inflamatorias cronicas, tales como artritis reumatoide o enfermedad inflamatoria intestinal; lesion en los tejidos; enfermedades alergicas y cancer.
  16. 16. Una composicion farmaceutica, que comprende la nanopartfcula conjugada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
  17. 17. Un embalaje de combinacion de medicamento/dosfmetro que comprende:
    a) un medicamento para administrar individualmente, y
    b) un sistema indicador de diagnostico para una propiedad espedfica del paciente que es relevante para la accion, efecto secundario, interaccion, metabolismo, absorcion, distribucion, metabolismo y eliminacion del medicamento que se va a administrar a un paciente,
    en el que la propiedad espedfica del paciente se selecciona de entre el grupo que consiste en una sustancia endogena, un mecanismo de regulacion, un gen o un sistema de indicacion, y
    en el que el medicamento o el sistema indicador de diagnostico comprende una nanopartfcula conjugada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
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