KR20160102057A - Cd44 결합 펩티드 - Google Patents

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익스체인지 이매징 테크놀로지스 게엠베하
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Abstract

본 발명은 인간의 CD44(CD44ex9)의 엑손(exon) 9로부터 암호화되는 영역(domain)에 결합하는 단백질과 연관되며, 융합 단백질 및 상기 단백질과의 결합 단백질, 그리고 특히 상기 단백질과 결합하는 나노입자(nanoparticle)와 결합하는 단백질에 관한 관련된 것이다. 나아가 본 발명은 단백질, 상기 결합하는 나노입자의 제조와 관련되고, 암에 대한 치료와 진단을 위한 단백질의 사용에 관한 것이다.

Description

CD44 결합 펩티드{CD44 binding peptides}
본 발명은 인간의 CD44(CD44ex9)의 엑손(exon) 9로부터 암호화되는 영역(domain)에 결합하는 단백질과 연관되며, 융합 단백질 및 상기 단백질과의 결합 단백질, 그리고 특히 상기 단백질과 결합하는 나노입자(nanoparticle)와 결합하는 단백질에 관한 관련된 것이다. 나아가 본 발명은 단백질, 상기 결합하는 나노입자, CD44v5 유래 펩티드의 제조와 관련되고, 단백질의 사용, 다양한 질병, 특히 암에 대한 치료와 진단을 위한 본 발명의 펩티드의 제조에 관련된 것이다.
방대한 암 전사 패턴(Cancer transcriptional pattern)으로부터 양성과 악성 종양 그리고 공격적인 암과 보다 덜 공격적인 암을 구별할 수 있는 분자 타켓(molecular target)들이 발견되었다. 암은 종종 세포 표면 리셉터와 같은 세포 표면 항원 등의 다양한 종류의 단백질을 과다발현한다. 이러한 과다발현된 세포 표면 항원과 결합하는 항체들은 특정 암의 진단이나 치료에 사용될 수 있다. 이러한 잠재적 진단제나 치료제로 사용될 수 있는 암세포 표면 리셉터와 결합하는 항체를 제조하는 다양한 방법이 사용되어 왔다. 특히 진단이 어렵고 전통적 치료에 저항성을 갖는 암에 관하여 더욱 과다발현된 세포 표면 리셉터 및 이들과 결합하는 항체의 발견은 암 치료제의 개발에 있어 중요한 방법이 되고 있다. CD44, CA19-9 그리고 CEA는 이러한 과다발현된 세포 표면 리셉터로 암의 진행 및 악성화에 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
CD44는 세포외 기질의 주요 접착 분자로, 백혈구의 귀소성과 활성, 상처의 치료, 세포 이동, 암세포 침투 및 전이를 포함하는 다양한 생리학 과정과 연관이 되어 있는 것으로 알려져 있다 (Gunthert 외.,1991;Nagano and Saya, 2004; Ponta 외 2003).
CD44는 단일 사슬 분자로 보호된 N 말단의 세포외 영역과 보호되지 않는 세포막 근위의 영역, 다양한 조합의 엑손이 발현되는 변동 영역, 보호되는 막횡단 나선형 영역, 그리고 보존되는 세포질 꼬리로 이루어져 있다. CD44의 유전자 지도는 5' 말단에 5개의 정형 엑손과 3' 말단에 5개의 정형 엑손으로 구성되어 있다. 생쥐의 CD44 유전자는 분자의 중앙에 10개의 변형 엑손이 있고 이는 V1-V10 영역으로서 총 20개의 엑손이 존재하게 된다. 인간의 CD44 유전자는 이 10개의 변형 엑손 (V2-V10) 중 9개만으로 구성되어 있어 총 19개의 엑손으로 구성되어 있다. 차별적인 대체적 스플라이싱(Differential alternative splicing)은 CD44의 다양한 유전자 아형을 발생시키고 이들은 다양한 엑손 (지정된 엑손 Vx, x=1~10)의 다양한 조합체를 발현시킨다. 이들은 세포막 근위의 영역에 삽입되고 분자의 변형 영역을 구성하게 된다. 이러한 분자들은 CD44 이형(CD44v)으로 지정된다. 현재까지 총 20개의 CD44의 유전자 아형이 알려져 있다.
표준적인 CD44 유전자 아형(CD44s)는 주로 조혈세포와 일반 상피세포의 부분집합에 발현되는 반면, 세포막 근위의 세포외 영역에 삽입되는 CD44 이형(CD44v)은 다양한 종류의 인간 대장, 유방, 위장, 방광, 전립선 및 기타 다양한 혈액암에 다량 발현되는 것이 발견되고 있다. 기타 연구에 의하면 이형 CD44의 발현과 암의 진행, 특히 종양세포의 림프전이성과 그 근접한 상관관계가 보고되고 있다.
이러한 정보 및 연구는 종양의 개시, 암세포의 유지에 덧붙여 더욱 잘 알려진 세포 접착 및 세포이동에 있어서 CD44의 중요한 역할이 부각되게 한다.
암에서의 CD44의 역할과 달리, CD44는 자가면역질환에 있어서도 잠재적 타켓으로 제시된 바 있다. 다양한 자가면역 질환에 CD44 단백질, 펩티드 혹은 유도체의 투여가 치료에 도움이 되었음이 보고된 바 있다 (Hale 외., 1992).
암과 자가면역질환에 있어서의 CD44의 확고한 역할에 기초하여 CD44 관련 질환의 진단 또는 치료를 위하여 CD44의 다양한 변형 영역에 대한 단일클론항체가 제작되었다.
사이터 (Seiter) 및 연구자들은 래트의 췌장선암세포의 전이-특이적인 이형 CD44의 표면 단백질을 겨냥한 단일클론항체에 대하여 기술한 바 있다(Seiter 외.,1993). 이 항체들은 류마티즘 질환과 같은 면역조정성 질환에 대한 면역억제적 치료에 사용될 수 있다. 또한 T 세포 확산을 억제하는 기능을 갖는 CD44에 대한 단일클론항체들은 다양한 자가면역질환에 사용되고 있다. 나아가, 엑손 v6 단백질을 포함하는 CD44에 대한 단일클론항체들은 염증성질환에 대한 진단 기능이 있음이 보고되어 있다 (Jalkannen 등., 1986).
WO91/17248은 암의 진단과 치료를 위한 항-CD44 항체의 사용에 관련된 것이다. WO95/00851은 암의 진단에 사용되는 CD44의 다양한 엑손들을 겨냥한 항체의 사용에 관한 것이다. WO95/04547은 면역요법과 면역진단의 목적을 위하여 제작되는, 특히 엑손 v5의 시퀀스내 에피토프(epitope)를 직접 겨냥하는 항-CD44항체들에 관한 것이다. WO95/337771은 엑손 v6를 직접 겨냥하는 항-CD44 항체들에 대하여 기술하고 있다. 또한, EP0538754는 면역억제를 위한 이형 CD44를 겨냥한 항체에 대하여 기술하고 있다.
선행기술에 나타나는 항-CD44는 여러가지 단점을 드러낸다. 이들은 크고 복잡한 분자로 묘사되고 재조합의 제조방식으로만 제조된다. 따라서 제조과정은 정교하고, 고비용이며, 엄격한 규제를 거쳐 제조되어야만 한다. 나아가, 감소된 면역 성 잠재력이 필요하기 때문에 인간 또는 인간화된 항체가 요구되는 문제가 있다. 따라서 여전히 CD44 이형 결합 분자의 제조가 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 상기 기재된 단점 중 하나라도 극복할 수 있는 CD44 이형결합 물질을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 상기 목적은 청구항 제1항에 기재된 CD44 이형 결합 단백질을 제공하고, 본 결합 단백질을 진단이나 치료에 사용하는 방법을 통해 해결할 수 있는 바, 특히 본 단백질로 코팅된 나노입자(nanoparticle)를 사용함으로써 달성할 수 있다.
본 발명의 첫번째 특징은 인간의 CD44의 엑손(exon)9가 암호화하는 폴리펩티드와 결합하는 단백질을 제공하며, 상기 단백질은 하기와 같이 구성되는 것을 특징으로 한다;
가) 서열번호 1 에서 5 에 따른 아미노산 서열, 또는
나) 서열번호 1에서 5에 기재된 아미노산 서열과 적게는 80%, 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 동일성을 가지는 아미노산 서열, 또는
다) 서열번호 6에서 10에 기재된 "PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQX10 - 14AIE "로 정의되고 X가 임의적 아미노산인 CD44 결합 모티프(motif)와 적어도 90%, 바람직하게는 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는; 그리고 최대 100 아미노산의 길이를 갖는다.
발명자들은 효모 이중 혼성화 스크리닝을 통하여 CD44의 엑손 9로부터 암호화되는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 5가지 다른 펩티드를 발견할 수 있었다. 아미노산 서열은 도표 3에 기재되어 있으며 하기 표 1의 서열번호 1번에서 5번으로 기재되어 있다.
서열번호 아미노산 서열
1 Pro Gly Val Pro Gly Val Gln Leu Thr Ala Asn Thr Gln Ser Leu Val Leu Met Ser Ala Phe Asp Ile Ala Ile Glu Val Thr Phe Ile Ser Ser
2 Pro Gly Leu Gln Ile Ser Phe Ala Val Gln Val Pro Val Ser Val Gln Glu Ser Ser Pro Ser Val Gln Glu Gly Ile Gln Ile Gln Val Ala Ile Glu
3 Pro Gly Gly Asp His Glu Arg Ala Pro Ala Ser Cys Tyr Asn Gly Glu Arg Leu Ser Ser Gln Leu Ser Phe Glu Val Gln Trp Glu Thr Ser Glu Thr Leu Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp Pro Pro Cys
4 Pro Gly Pro Tyr Tyr Gly Lys Lys Leu His Val Gly Tyr Leu Gln Pro Leu Ala Ala Val Gln Val Ser Phe Ala Pro Asn Asn Thr Gly Lys Glu Val Thr Val Glu Cys Lys Ile Asp Gly Ser Ala Asn Leu Lys Ser Gln Asp Asp Arg Asp Lys Phe Leu Gly Arg Val Met Phe Lys Ile Thr Ala Arg Ala
5 Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Gly Lys Leu Leu Gln Pro Lys Tyr Leu Gln Pro Leu Leu Ala Val Gln Phe Thr Asn Leu Thr Met Asp Thr Glu Ile Arg Ile Glu Cys Lys Ala Tyr Gly Glu Asn Ile Gly Tyr Ser Glu Lys Asp Arg Phe Gln Gly Arg Phe Asp Val Lys Ile Glu Val Lys Ser
추가적 분석에 의하면 상기 서열들로부터 공통서열이 발견되었고 이는 하기와 같다: PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQX10-14AIE.
상기 공통서열은 하기 표 2의 서열번호 6번에서 10번으로 지정되어 있으며, 이 다섯가지 공통서열은 임의적 서열인 X10-14 에 있어서 길이의 차이를 가지고 있다. 여기서 "X" 는 임의적 아미노산으로 정의된다.
서열번호 아미노산 서열
6 Pro Tyr Tyr Gly Lys Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu
7 Pro Tyr Tyr Gly Lys Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu
8 Pro Tyr Tyr Gly Lys Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu
9 Pro Tyr Tyr Gly Lys Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu
10 Pro Tyr Tyr Gly Lys Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu
모든 독립적인 CD44-상호작용 펩티드를 포함하는 특유의 공통서열을 얻을 수 있는 능력은 효과적인 이중 혼성화 스크리닝의 결과를 입증한다.
이후의 두가지 독립적 친화도 시험을 통하여 서열번호 1번에서 5번은 CD44의 엑손9로부터 암호화되는 폴리펩티드와 결합성이 분석되었고 친화도의 순위가 매겨졌다. 각 펩티드는 하기와 같이 명명되었다:
서열번호 1번의 펩티드: 펩티드 A
서열번호 2번의 펩티드: 펩티드 C
서열번호 3번의 펩티드: 펩티드 B
서열번호 4번의 펩티드: 펩티드 D
서열번호 5번의 펩티드: 펩티드 E
두가지 친화도 시험, pseudohitpicking 시험 및 Fluorescein di-beta-D-galacto-pyranoside(FDG)-기반 시험은 같은 순위를 나타내었다:
B>A,C,D,E
C>A,D,E
D>A,E
E>A
A>
결과적으로, 펩티드 B (서열번호 3번)는 CD44의 의 엑손9번으로부터 암호화되는 폴리펩티드에 대한 친화도가 가장 높았으며 본 발명에서 가장 선호되는 펩티드이다. 상기 펩티드에 대하여 에피토프 매핑(epitope mapping)이 수행되었으며, 여기서 삭제 분석과 알라닌(alanine) 스캔이 수행되었다.
나아가, 펩티드 A,C,D 그리고 E에 대해서도 삭제 분석이 수행되었는 바, 공통 서열의 유효성을 확인하였다.
이러한 분석에 의거하여 본 발명은 인간 CD44의 엑손9가 암호화하는 폴리펩티드(CD44ex9)에 결합하는 단백질을 제공하며, 상기 단백질은 다음으로 구성되는 것을 특징으로 한다;
가) 서열번호 39에서 52에 따른 아미노산 서열; 또는
나)서열번호 39에서 52에 기재된 아미노산 서열과 적게는 80%, 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 동일성을 가지는 아미노산 서열; 또는
다) 서열번호 39에서 52에 기재된 "PGLQPSFAVQVX2S/AXQX10 - 14AIE"로 정의되고 X가 임의적 아미노산인 CD44 결합 모티프(motif)와 적어도 90%, 바람직하게는 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는; 그리고 최대 100 아미노산의 길이를 갖는다.
서열번호 아미노산 서열
39 Pro Gly Gln Leu Ser Phe Glu Val Gln Trp Glu Thr Ser Glu Thr Leu Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp Pro Pro Cys
40 Pro Gly Ala Leu Ser Phe Glu Val Gln Trp Glu Thr Ser Glu Thr Leu Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp Pro Pro Cys
41 Pro Gly Gln Ala Ser Phe Glu Val Gln Trp Glu Thr Ser Glu Thr Leu Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp Pro Pro Cys
42 Pro Gly Gln Leu Ala Phe Glu Val Gln Trp Glu Thr Ser Glu Thr Leu Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp Pro Pro Cys
43 Pro Gly Gln Leu Ser Ala Glu Val Gln Trp Glu Thr Ser Glu Thr Leu Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp Pro Pro Cys
44 Pro Gly Gln Leu Ser Phe Ala Val Gln Trp Glu Thr Ser Glu Thr Leu Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp Pro Pro Cys
45 Pro Gly Gln Leu Ser Phe Glu Ala Gln Trp Glu Thr Ser Glu Thr Leu Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp Pro Pro Cys
46 Pro Gly Gln Leu Ser Phe Glu Val Ala Trp Glu Thr Ser Glu Thr Leu Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp Pro Pro Cys
47 Pro Gly Gln Leu Ser Phe Glu Val Gln Ala Glu Thr Ser Glu Thr Leu Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp Pro Pro Cys
48 Pro Gly Gln Leu Ser Phe Glu Val Gln Trp Ala Thr Ser Glu Thr Leu Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp Pro Pro Cys
49 Pro Gly Gln Leu Ser Phe Glu Val Gln Trp Glu Ala Ser Glu Thr Leu Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp Pro Pro Cys
50 Pro Gly Gln Leu Ser Phe Glu Val Gln Trp Glu Thr Ala Glu Thr Leu Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp Pro Pro Cys
51 Pro Gly Gln Pro Leu Ala Ala Val Gln Val Ser Phe Ala Pro Asn Asn Thr Gly Lys Glu Val Thr Val Glu Cys Lys Ile Asp Gly Ser Ala Asn Leu Lys Ser Gln Asp Asp Arg Asp Lys Phe Leu Gly Arg Val Met Phe Lys Ile Thr Ala Arg Ala
52 Pro Gly Leu Gln Pro Leu Leu Ala Val Gln Phe Thr Asn Leu Thr Met Asp Thr Glu Ile Arg Ile Glu Cys Lys Ala Tyr Gly Glu Asn Ile Gly Tyr Ser Glu Lys Asp Arg Phe Gln Gly Arg Phe Asp Val Lys Ile Glu Val Lys Ser
이러한 펩티드들의 에피토프 매핑(epitope mapping)에 기반하여 상기 기재된 공통 서열이 입증되었다. 그러나, 하기와 같은 아미노산 서열의 더욱 바람직한 공통 서열을 얻어낼 수 있다:
PGLQPSFAVQVX2S/AXQX10-14AIE
이러한 공통 서열들은 하기 표 4에 기재된 바와 같이 서열번호 53에서 62로 지정되며, 이 서열들은 포지션 14(Ser-Ala)에서 아미노산 교환의 차이가 나고 임의적 시퀀스인 X10-14의 길이에 차이가 있다.
서열번호 아미노산 서열
53 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu
54 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu
55 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu
56 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu
57 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu
58 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ala Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu
59 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ala Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu
60 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ala Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu
61 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ala Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu
62 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ala Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu
본 발명에서 강조되어야 할 것은 본 펩티드들은 CD44 에피토프에 큰 항체 뿐만 아니라 32에서 66개의 아미노산 길이를 갖는 상대적으로 작은 펩티드들도 관련되는 CD44 영역에 특이적, 선택적으로 결합할 수 있는 것을 최초로 기술하였다는 것이다.
선행기술문헌에 기재된 CD44v5 단일클론항체들과 대조적으로, 본 발명의 펩티드들은 여러가지의 장점을 가지고 있다.
이들 펩티드는 짧은 길이를 가지고 있어 복잡한 형태를 띄거나 분자내 이황화 결합을 형성할 필요가 없기 때문에 제조와 정제가 훨씬 더 편리하다.
32에서 66개의 아미노산 길이를 가진 펩티들은 심지어 고체 단계의 합성을 가능하게도 한다 (Merrifield 참조). 이러한 엑스 비보 (ex-vivo) 단백질 합성은 재조합 단백질 발현과 관련한 엄격한 규제 요건을 감안할때 특히 장점을 갖게 된다.
또한, 작은 분자의 펩티드이기 때문에 진단 혹은 치료 목적으로 다른 단백질이나 특이한 화합물, 또는 나노입자과도 쉽게 결합 혹은 융합시킬 수 있다.
작은 분자의 펩티드로서 기타 항체는 접근할 수 없는 혈액뇌관문이나 세포 막을 통과하여 화합물을 전달할 수 있는 역할을 하기도 한다.
본 발명의 펩티드의 작은 사이즈 때문에 면역반응을 유도할 위험성은 현저히 감소한다. 실제로 기타 항체의 면역성은 임상에서의 이용을 막는 큰 요인이 되어 온 것은 주목할만 하다.
또한 본 발명의 CD44ex9-결합 단백질은 가변 영역인 v5과만 반응하는 경우 정상적인 CD44기능이 유지되므로 특이적인 개입반응을 가능케 한다.
결론적으로, 본 발명의 CD44ex9-결합 단백질은 부작용이 적으며 진단 및 치료에 효과적인 새로운 암의 치료전략의 장을 연다.
본 발명은 CD44 이형 결합 단백질 및 이를 포함하는 발현 벡터를 제공한 뿐 아니라, 암 항원-결합물질 또는 나노입자를 제공하는 효과가 있고, 다양한 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
도1은 C44의 유전적 구조와 단백질 영역을 나타낸 모식도이다.
도2는 (A) 나타낸 효모단백질잡종법의 개략적 전략을 나타낸 모식도이며, (B)는 Y2H 스크리닝을 위해 사용된 벡터의 모식도이다.
도3은 CD44와 상호작용하는 클론들의 아미노산 서열과 그로부터 유래한 공통서열을 나타낸 표이다.
도4는 나노입자 결합물인 Q_CA19-9-3으로 표지된 HT29 세포를 나타낸 사진도이다.
도5는 나노입자 결합물인 Q_CA19-9-5으로 표지된 HT29 세포의 음성 대조군을 나타낸 사진도이다.
도6은 나노입자 결합물인 Q_CA19-9-3이나 음성대조군 MBP-나노입자으로 표지된 HT29 세포의 정량분석을 나타낸 그래프이다.
도7은 나노입자 결합물인 Q_CA19-9-3으로 표지된 HT29 세포가 자유 표적 CA19-9를 점차 증가시켜 첨가하였을때 일어나는 경쟁에 대하여 나타낸 그래프이다.
도8은 나노입자 결합물인 Q_CA19-9-3으로 표지된 Colo29 세포를 나타낸 사진도이다.
도9는 나노입자 결합물인 Q_CA19-9-5으로 표지된 Colo29 세포의 음성대조군을 나타낸 사진도이다.
도10은 나노입자 결합물인 Q_CA19-9-3으로 표지된 SW116 세포를 나타낸 사진도이다.
도11은 나노입자 결합물인 Q_CA19-9-5으로 표지된 SW116 세포의 음성대조군을 나타낸 사진도이다.
도12는 항- CEA와 항 CA-19-9에 결합된 이중특이적 나노입자 Q_CEA/CA19-9_12으로 표지된 점액성 선암 조직(샘플번호 35)을 나타내는 사진도이다. 사분면은 하기의 각 조건에 따라 분석되었다:
상좌: Q_CEA/CA19-9_12를 이용한 표지
상우: 자유 표적 MBP-CEA(25μM)를 첨가한 CEA/CA19-9_12를 이용한 표지
하좌: 자유 표적 Sialyl Lewisa(250μM)를 첨가한 Q_CEA/CA19-9_12 를 이용한 표지
하우: 자유 표적 MBP-CEA(25μM)와 Sialyl Lewisa (250μM)를 첨가한 Q_CEA/CA19-9_12 를 이용한 표지
도13은 펩티드 A에서 E의 친화력 순위 실험: 가선별작업 분석 Ⅰ을 나타내는 표이다.
도14는 펩티드 A에서 E의 친화력 순위 실험: FDG 분석 Ⅰ을 나타내는 표이다.
도15는 펩티드 A에서 E의 친화력 순위 실험: 가선별작업 분석 Ⅱ을 나타내는 표이다.
도16는 펩티드 A에서 E의 친화력 순위 실험: FDG 분석 Ⅱ을 나타내는 표이다.
도17은 펩티드 A에서 E의 친화력 순위 실험의 전체 요약을 나타낸 표이다.
도18은 펩티드 A,C,D 그리고 E의 결실돌연변이를 나타내는 도표이다.
도19는 펩티드 B(왼쪽)의 결실돌연변이와 FDG 분석 결과(오른쪽)를 나타내는 도표이다.
도20은 펩티드 B의 알라닌 스캐팅 돌연변이와 두번 행해진 PHP, FDG 분석결과를 나타내는 도표이다.
도21은 결합 분석을 위하여 만든 대안적인 CD44 구조를 나타내는 모식도이다.
도22는 형광 나노입자에 결합되어 있는 CD44v5-결합 펩티드 A,B, 또는 C를 이용하여 수행된 체외의 세포화학적 실험의 개관을 나타낸 표이다.
본 발명의 일실시예에 따르면 본 발명은 인간 CD44의 엑손 9(CD44ex9)로부터 암호화되는 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 제공하며, 상기 단백질은 서열번호 1번에서 5번 그리고 39번에서 52번에 기재된 아미노산과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 특히 적어도 97.5%의 동일성을 갖는 서열의 아미노산으로 구성되어 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 본 발명은 인간 CD44의 엑손9(CD44ex9)로부터 암호화되는 폴리펩타이드에 결합하는 단백질을 제공하며, 상기 단백질은 다음과 같이 정의되는 서열번호 6번에서 10번의 CD44 결합 모티프 "PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQX10-14AIE"와 서열번호 53번에서 62번의 CD44 결합 모티프 "PGLQPSFAVQVX2S/AXQX10-14AIE"에 적어도 90%. 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 97.5%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 100% 동일성을 갖는 서열의 아미노산으로 구성되어 있으며, 상기 X는 임의적 아미노산을 지칭한다.
본 발명에서 청구하는 단백질은 최대 300 아미노산의 길이와 바람직하게는 최대 200 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 최대 100 아미노산의 길이, 그리고 가장 바람직하게는 최대 90,85,80,75,70 또는 66 아미노산 길이를 갖는다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면 CD44ex9-결합 단백질은 ki 값이 10μM 미만이거나, 보다 바람직하게는 1μM 미만, 이보다 더욱 바람직하게는 100nM 미만, 그리고 이보다도 더욱 바람직하게는 10nM 미만의 ki 값을 갖는 엑손9로부터 암호화된 폴리펩티드와 높은 친화력을 가지고 있다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면 CD44ex9-결합 단백질은 엑손9에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 선택적으로 결합하며, 이는 다른 임의적 단백질의 ki 값이 바람직하게는 CD44ex9 결합의 경우보다 최소한 10배 혹은 더욱 바람직하게는 100배 적은 경우에 해당한다.
본 발명의 일실시예에 의하면, CD44ex9-결합 단백질은 엑손9에 의하여 암호화되는 영역을 포함하는 모든 CD44 동형단백질과 결합할 수 있고, 이러한 영역을 "베리언트 5 (v5)" 라고 지칭한다.
보다 바람직한 실시예에 의하면, CD44ex9-결합 단백질은 CD44 v5, CD44 v5-v6, CD44 v3-v6, CD33 v3-v6, CD44 v2-v10, CD44 v3-v10, CD44 v4-v7 그리고 CD44 v4-v10의 리스트 중 하나의 선택되는 CD44 동형단백질과 결합한다.
특히, CD44ex9-결합 단백질은 v5 영역을 제외한 v1, v2, v3,v4,v6,v7,v8,v9과/또는 v10과 같은 다른 다양한 영역으로 구성되어 있는 단백질과도 결합한다.
다른 실시예에 의하면, CD44ex9-결합 단백질은 이종 단백질이나 폴리펩티드와 결합된 형태이거나 융합되어 있다. 이러한 결합/융합은 결합 단백질의 열역학적 혹은 약동학적 특징을 변화시키거나 잠재적 부작용을 감소하는데 도움이 될 수 있다.
또한 이러한 결합/융합은 결합 단백질의 발견을 위한 보고 단백질로 활용되거나, 단백질 정제를 위한 펩티드나 단백질로 사용되거나, 추가적 공정을 통해 프로테아제나 화학작용제를 위한 오목한 사이트가 제작되어 별개의 단백질로의 분리를 가능케할 수도 있다.
이러한 기술은 종종 GST 단백질의 융합, FLAG 단백질, 니켈이나 코발트 레진을 이용한 친화성 크로마토그래피를 통하여 분리된 헥사-His 펩티드(6x His-tag)를 통한 단백질의 식별과 정제에 사용되고 있다.
결합 단백질은 바람직하게는 항원, 독소, 면역중재 펩티드나 사이토카인으로 구성되는 그룹 중 선택되는 단백질과 연결 혹은 융합할 수 있다.
바람직한 실시예의 결합/융합 단백질은 전구 물질로부터 세포독성이 있거나 세포증식을 억제하는 물질의 생성을 돕는 효소이다. 이러한 효소들로는, 알데하이드 산화효소, 아미노산 산화효소, 싸이토그롬 P450 산화효소, NAD(P)H: 퀴논 산화환원효소, 티로시나아제, 티미디레이트 합성효소, 티미딘 포스포릴라아제, 글루타타이온 S 전달효소, 디옥시사이티딘 키나아제, 카르볼시에스트라아제, 알칼라인포스파다아제, 베타글루쿠로니다아제, 씨스테인 결합-베타라아제 및 나이트로리덕타아제가 있다.
본 발명의 단백질은 암세포를 억제, 손상하거나 죽이거나 세포독성물질에 더욱 민감하게 하는 단백질과 결합 또는 융합될 수 있다. 상기 단백질의 예로는 싸이토신 디아미나아제, 수용성 Fms-유사 티로신 키나아제 리간드, 헤르페스 심플렉스 바이러스1 티미딘 키나아제 (HSV1-TK), 싸이토크롬 P450 2B1, 망막아종 관련 단백질들, P16/cdkn2 그리고 MMAC1/PTEN 을 포함한 무수히 많은 단백질이 있다. MMAC1/PTEN은 포스포이노시타이드3키나아제의 부정적은 규제 장치로서 작용한다. MMAC1은 Mutated in Multiple Advanced Cancers1 의 약자이다.
본 발명은 또한 직접적으로 혹은 간접적으로 링커를 통하여 탄수화물, 염색 분자, 방사성 동위 원소, 독소, 세포분열억제제, 싸이토카인, 면역조절제 또는 전구약물체의 목록에 포함되는 화합물 중 하나와 결합하는 CD44ex9-결합 단백질을 포함하는 결합단백질에 관한 것이다.
본 발명의 결합단백질은 일반적으로 어떠한 종류의 약물과도 결합할 수 있는바, 이러한 약물은 암세포를 손상, 억제 또는 사멸을 초래한다. 따라서 바람직하게는 세포독성 물질이 특히 이용된다. 제한되지 않은 세포독성 물질의 예로는 에모졸로마이드, 카머스틴, 로머스틴, 프로카바진, 스트렙토신, 이리노테칸 또는 이들 중 두개 혹은 그 이상의 결합이 사용된다.
암의 억제제로서 가능한 것은 (-)-Ci-Cdp1, (-)-Ci-C에, (-)-에피갈로카테킨 갈레이트, (+)-Cbi-Cdpi2, (+)-Ci-Cdp2, 10-디아세틸바카틴 Ⅲ, 4-디메톡시다우노루비신, 5-아자씨티딘/5-아자-2'디옥시싸이티딘, 5-플루오로유라실, 5-이미노독소루비신하이드로클로라이드, 6-머캅토퓨린, 아클라루비신, 아코다졸, 악티노마이신 D, 아데닌포스페이트, 아데노신, 아데바십, 아도젤레신; U-73, 975, 아펠레테칸, 알렘투주맙, 알리트레니노인, 알로세트론 HCl, 알피토릭 산, 알트레타민, 알베스피미신, 암바존, 아메탄트론, 아미포스틴, 아미노글루테티미드, 암사크린 HCl, 암실라로텐, 아믹달린, 아나그렐리드, 아나스트로졸, 아낙시론, 안시타빈, 안노몬타신, 안노뮤리신 A, (C19/C20-Erythro), 안노뮤리신 B, (C10/C11, C19/C20-Erythro), 안노뮤리신 C, 안노뮤리신 E, 안노나신, 안노나신-IO-One, 안노나신-A-One, 안노니딘B, 안노닌 Ⅵ, 안노스콰모신 A, 안노스콰모신 B, 안트라마이신, 아파찌큐온, 알기메스나, 아리스토포린, 알세닉트리옥사이드, 아르테미시닌, 아스코마이신, 아스파라지네이즈, 아토시반, 아트리뮤스틴, 악시티닙, 아자세트론 HCL, 아자테파, 아자카이오프린, 아조토마이신, 바페티닙, 발라마피모드, 바녹산트론, 바타불린, 바티마스탓, Bbr-34384, 베카테카린, 벨로테칸, 베낙시빈, 벤다무스틴, 벤조데파, 베루비신, 베툴린, 베툴리닉산, 베툴리닉알데히드, 베바씨주맙, 벡사로텐, 바이칼루타마이드, 바이에타세르핀, 바이산트렌, 바이스타라미드 A, ;바이스타라텐 A, 바이젤레신, 블레오마이신, 블레오 마이신 A2, 블레오마이신 A5, 블레오마이신 설페이트, 보르테조밉, 보센탄, 보수티닙, 브레키나소듐, 브레키나, 브로피리민, 브로스탈리친, 부도티테인, 불라타신, 부세렐린, 부설판, 카바찌탁셀, 칼슘폴리네이트, 칼슘레보폴리네이트, 칼루스테론, 캄토테신, 카너티닙, 칸포스파마이드, 칸타리딘, 카페치타빈, 카라세마이드, 카베티머, 카보플라틴, 카보프로스트 (카보프로스트 트로메타민), 카보쿠온, 카필조밉, 카클루믹산, 카모퍼, 카젤레신, 세데핑골, 세마도틴, 세툭시맙, 세피파불린, 클로람뷰실, 클로메틴(메클로에타민), 클로로타목시펜, 클로로트리아미센, 치오테로넬, 시스플라틴, 클라드리빈, 클란페너, 클로파라빈, 클로파지민, 클로피펜시트레이트, 코디세핀, 코로솔릭산, 크리스나톨, 큐커민, 싸이틀로씨티딘, 싸이클로포스파마이드, 싸이타라빈, 싸이티딘, D-아미노레불리닉산, 다카바진, 담신, 다니퀴돈, 다누세팁, 다포리나드, 다리나파신, 다사티닙, 다우노블라스틴, 다우노루비신/다우노마이신, 디시씨타빈, 디페라시록스, 디포롤리머스, 디메콜친, 디니불린, 디토루비신, 덱스니굴디핀, 덱소마플라틴, 데자구아닌, 디안파이드로둘치톨룸, 디브로스피디움클로라이드, 디에노게스트, 디플로모데칸, 디날린, 디세몰리드, 도씨탁셀, 도페퀴다, 돌라세트론메실레이트, 도비티닙, 독시플루리딘, 독소루비신, 드로모스타놀론, 두아조마이신, 두오카마이신, 다이네미신, 에코무스틴, 에다트렉세이트, 에도테카린, 에도트레오티드, 이플로니틴, 엘라크리다, 이아씨타라빈, 엘레스클로몰, 엘리나파이드, 엘로모테칸, 엘사미트루신, 에키테퍼, 엔로플라틴, 에노씨타빈, 엔프로메이트, 엔테카비르, 엔티노스타트, 엔트리치타빈, 엔자스타우린, 에피루비신, 엡탈로프로스, 에리불린, 얼로티닙, 에소루비신, 에스트라무스틴, 에탈로씹, 에타니다졸, 에토글루시드, 에토포시드, 엑사테칸, 엑세메스테인, 엑시술린드, 파드로졸, 파자라빈, 피아씨타빈, 플록스유리딘, 티독실, 포르퀴돈, 포르트리에신, 포테무스틴, 포트레타민, 플베스트란트, 푸마길린, 갈라루비씬, 살로씨타빈, 게피니팁, 젬사이타빈, 겜투주맙 오조가미신, 게로퀴놀, 기간테트로네닌, 기간테트로네니논, 기마테칸, 기메라실, 글록사존, 글루포스파마이드, 고니오탈라마이신, 고니오탈라마이시논, 고세렐린, 그라니세트론 HCl, 구스페리무스, 헥사렐린, 호모할링고닌, 하이드로캄토테신, 하이드록시카바마이드, 하이드록시유레아, 파이퍼리신, 이반드로네이트소듐, 이반드로닉산, 아디루비신 HCl, 이드로녹실, 이포스파마이드, 일모포신, 이마티닙, 아마티닙 메실레이트, 이멕손, 임프로설판, 인카드로네이트, 인디불린, 인디술람, 이노리타존, 인프로큐온, 인티퀴나틴, 인토플리신, 이오벤구에인, 이로풀벤, 어소글라딘, 이스피네십, 익사베필론, 케토트렉세이트, L- 알라노신, 라니퀴다, 라파티닙디토실레이트, 라로무스틴, 라로탁셀, 레독산트론, 레날리도마이드, 렌티난, 레스타우티닙, 레트로졸, 류플로리드아세테이트, 류프로렐린, 렉사칼시톨, 리아로졸, 로바플라틴, 로나파팁, 로니다민, 로속산트론, Ly-83583, 리시프레신, 마포스파마이드, 만노무스틴, 만노설판 마리마스탓, 마리노마이신 A, 마시티닙, 마스리닉산, 마소프로콜, 메클로에타민, 메도루비신, 메게스트롤, 메피티오스테인, 메캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 메틸아미노레불리네이트, 메토미데이트, 메토프린, 메투레데파, 미보플라틴, 미도스타우린, 미파머티드, 밀라탁셀, 미프록시펜, 미리플라틴, 미소니다졸, 미티도마이드, 미토플락손, 미토구아존, 미토마이신, 미토나파이드, 미토퀴돈, 미토테인, 미톡산트론, 미토졸로마이드, 미보불린, 비조리빈, 모파로텐, 모페다몰, 모테사닙, 모틱사핀, 무브리티닙, 무리카펜토신, 무리카타신, 무스틴 HCl, 마이코페놀레이트모페틸, 마이코페놀릭산, 네다플라틴, 넬자라빈, 네모루비신, 네오큐프로인, 넵타무스틴, 네라티닙, 니게리신, 닐로티닙, 니무스틴, 니놉테린, 니트라크린, 노갈라마이신, 놀라트렉세드, 노르칸타리딘, 노르디파이드로쿠아이아레틱산, 노르토픽산트론, 노벰비친, 오바토클락스, 옥트레오티드, 올라파립, 올리아놀릭알데하이드, 오마세탁신메페석시네이트, 옴브라불린, 옴트리폴리드, 온단세트론 HCl, 오타탁셀, 오테라실, 오테라실포타슘, 옥살리플라틴, 옥시수란, 옥소펜나신, 팍리탁셀세리베이트, 파리포스파마이드, 팔로노세트론, 파미드로네이트디소듐, 파미드로닉산, 파티투무맙, 파노비노스탓, 파투빌론,파젤립틴, 파조파닙, 페가스파게이즈, 펠데신, 펠리티닙, 펠리트렉솔, 페레트렉세드디소듐, 펜토스타틴, 페플로마이신, 페레티노인, 퍼포스파마이드, 페리포신, 피브로젤레신하이드로브로마이드, 피코플라틴, 피나파이드, 피포설판, 피라루비신, 퍼페니돈, 피리트렉심, 피로크산트론, 픽산트론, 플레비트렉세드, 플리카마이신, 플리티뎁신, 플로메스테인, 포도필로톡신, 포말리도마이드, 포르피머소듐, 프랄라트렉세이트, 프리노마스타트, 프로카바진 HC1, 프로파미딘, 프로스피디움클로라이드, 푸미테파, 퓨로마이신, 피라코퓨린, 우아플록신, 랄테그라비르, 랄티트렉세드, 라모세트론 HC1, 라니무스틴, 레타스파이마이신, 레틸립틴, 리보프린, 리트로설판, 리툭시맙, 로플루밀라스트, 로키뎁신, 로피독스유리딘, 로퀴니멕스, 로사불린, 루비테칸, 사바루비신, 사핀골, 살리라십, 사파시타빈, 사라카티닙, 사도모자이드, 사트라플라틴, 세브리플라틴, 셀리치크립, 세막사닙; SU-5416, 세무스틴, 세모렐린, 시모탁셀, 심트라젠, 시타글립틴, 시조푸란, 소블리토딘, 소부족산, 소듐페닐뷰티레이트, 소라페닙, 스파포식산, 스파소마이신, 스피로플라틴, 스콸라민, 스콰모신, 스트렙토니그린, 스트렙토바리신, 수포스파마이드, 술로페너, 수니티닙, 스퉤인소닌, 타세디날린, 타풀로포시드, 탈라보스타트, 탈리소마이신, 탈리무스틴, 탈로트렉신, 탈토불린, 타목시펜시트레이트, 탄두티닙, 탄네스피마이신, 타리퀴다, 타시도틴, 타시술람, 타우로무스틴, 테가퍼, 테가퍼-유라실, 텔란티닙, 텔록산트론, 테모졸로마이드, 테니포사이드, 테누아조닉산, 테라메프로콜, 테리파라타이드, 테세탁셀, 테스토락톤, 테마시타빈, 티아미프린, 티오구아닌, 티오테파, 티모포이에틴, 티아조퓨린, 틸로미솔, 틸로곤, 팀코다, 키모나식, 티오구아닌, 티라파자민, 토클라데신, 토무덱스, 토포테칸파이드로클로라이드, 토레미펜시트레이트, 토세도스탓, 토시투모맙, 톡시판트론, 트라스투주맙, 트레니몬, 트레티노인, 트리치리빈, 트릴로스테인, 트리메트렉세이트, 트리플라틴 테트라나이트레이트, 트립톨리드, 트립토렐린, 트로포스파마이드, 트로피세트론 HC1, 투부로졸, 타이로포린, U-67786, U-86415, U-71184, U-76074, U-78057, 유베니멕스, 유라무스틴, 우레데파, 우레테인, 유리딘, 어솔릭산, 어솔릭알데히드, 바디메잔, 발루비신, 발스포다, 반데타닙, 바프레오디트, 바탈라닙; PTK-787, 베르테포핀, 빌닥립팁, 빈블라스틴설페이트, 빈크리스틴, 빈데신, 비네피딘, 빈플루닌, 빈포마이드, 빈포실틴, 빈류시놀, 빈류로신, 비노렐빈[Base], 비노렐빈타트레이트, 빈트립톨, 빈졸리딘, 보리코나졸, 보리노스타트, 보로졸, 윌포리드A, 크산토마이신 A, 잘시타빈, 제니플라틴, 질라스콥, 지노스타틴, 졸레드로닉산, 조루비신, 조수퀴다, 또는 이와 유사한, 또는 상기 항암제 중 적어도 하나 이상으로 구성되는 것으로 한다.
또한, 항혈관신생 약물 역시 본 발명의 결합물로 활용될 수 있다. 이에 해당하는 약물로는, 베바씨주맙, 아플리베셉트, 세디라닙, 소라페닙, 수니티닙, 반데타닙, 파조파닙, 바탈라닙, 이마티닙메실레이트, 실렌기타이드, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 프레들레이트 팩터-4 등이 있으며 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 방사선 증감제들도 CD44ex9-결합 단백질을 구성하는 결합물로서 사용될 수 있다. 방사선 증감제들로는 카보플라틴, 셀렌기타이드, CG841251, MK-1775와 같은 스타우로스포린 유래물질, 4-페닐뷰티레이트, 모텍사핀-가돌리늄과 같은 가돌리늄 포함 화합과 팍리탁셀이나 도시탁셀과 같은 탁세인 유래물이나 상기 물질들의 결합물이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 특징으로는 발명의 CD44-ex9-결합 단백질이나 CD44v5 펩티드를 암호화하는 독립된 핵산 분자를 제공하는데에 있다.
또 다른 특징으로는 CD44ex9-결합단백질이나 CD44v5 펩티드나 융합단백질의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공하는데에 있다.
또 다른 특징으로는 CD44ex9-결합단백질이나 CD44v5 펩티드나 융합단백질의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공하는데에 있다.
또 다른 실시예에 따르면 본 발명은 CD44ex9-결합단백질이나 CD44v5 펩티드를 제조하는 방법을 제공하며 상기 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다:
1) 본 발명의 단백질이나 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 발현 구조를 갖는 숙주세포를 변형하는 단계와;
2) 숙주세포를 CD44ex9-결합단백질이나 CD44v5 펩티드를 생산하는데 적합한 조건에서 배양하는 단계.
본 발명의 일실시예에 따르면 CD44ex9-결합 단백질 또는 CD44v5펩티드는 인슐린 의존적 당뇨병, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루푸스와 같은 자가 면역성 질환, 건선, 아토피성 피부질환과 같은 피부 질환, 류마티드 관절염 이나 염증성 대장질환과 같은 만성 염증성 질환, 조직 괴사, 알러지 및 암으로 이루어진 그룹에서 선택되는 질환의 진단이나 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 CD44ex9-결합 단백질 또는 CD44v5 펩티드의 염증질환에의 진단이나 치료제로서의 사용은 CD44가 염증세포를 감염이나 세포 괴사의 장소로 이동시키는데 역할을 담당하기 때문에 가능하다. 여기서 활성화된 T 림프구, 단핵백혈구나 활성화된 내피세포의 CD44는 세포외 기질의 구성성분인 히알루로난과 결합하여 CCR2와 같은 싸이토카인의 생성을 유도하고 이는 다시 염증세포가 염증장소로 이동할 수 있도록 자극한다 (존슨, 러펠., 2009). CD44ex9-결합 단백질이 CD44를 막거나, CD44v5 펩티드가 히알루로난을 막는 것은 이 과정을 방해하게 된다.
예를 들면, 류마티드 관절염을 가진 환자를 대상으로 한 연구에서 환자들의 윤활액의 단핵백혈구에서 CD44 발현이 증가된 것이 조사된다. 이러한 증가는 류마티드 관절염 환자들의 윤활액 염증의 정도와 긍정적 연관성이 있음이 드러난다. 또한, CD44가 없는 쥐들은 관절염 스코어가 낮고, 동물 모델에서 항CD44 치료 후 관절염 스코어가 낮아짐을 보인다. 따라서, 본 발명의 CD44ex9-결합 단백질 또는 CD44v5 펩티드는 관절염의 진단 및 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면 CD44ex9-결합 단백질 또는 CD44v5 펩티드는 T 세포 증식 억제를 통한 장기이식 거부반응을 방지하기 위한 면역억제제로써 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 CD44ex9-결합 단백질 또는 CD44v5 펩티드는 암의 진단이나 치료에 사용될 수 있다. 이는 v5영역을 포함하는 CD44의 이형들이 암세포에 존재함이 밝혀졌기 때문이다.
CD44ex9-결합 단백질의 CD44의 v5 영역과 특이적으로 결합하는 성격 때문에 상기 결합 단백질은 CD44가 기타 다양한 세포외 기질 단백질과 상호작용하는 것을 방해하고, 결과적으로 암세포의 접착, 이동, 전이를 방지하며 암세포 증식을 억제하게 된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에 의하면 CD44ex9-결합 단백질이나 CD44v5 펩티드는 암줄기세포의 진단 및 치료에 이용될 수 있다. 암줄기세포는 장기 생존도 및 암의 재발, 전이와 관련되어 있기 때문에 암의 성공적인 치료에 그 영향이 큰 것으로 알려져 있다(디오나라인 외.,2009). CD44는 암줄기세포에서 발현이 되며 이는 세포의 장기 생존 및 전이력에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 유방암의 암줄기세포는 CD44+/CD24low로 표시될 수 있고 이는 CC44가 항 CLC-타겟으로서 작용할 수 있음을 시사한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 의하면 CD44ex9-결합 단백질이나 CD44v5 펩티드가 림프성 백혈병의 진단이나 치료에 사용될 수 있다. 장(Zhang) 외 연구진들은 (2013) 림프성 백혈병 세포들이 CD44 발현율이 높고 CD44 항체 치료는 암세포를 사멸시키는데에 체내 및 체외에서 모두 효과적이었음을 보인 바 있으며, 이는 이종이식 모델에서 암이 개체에서 완전히 사라졌음을 통하여 입증되었다.
CD44ex9-결합 단백질이나 CD44v5 펩티드를 이용한 유방암의 진단 및 치료는 CD44v5가 유방암에서 가장 많이 발현되는 CD44 이형 지표(CD44v5는 56%, CD44v6는24%, CD44v8는 15%)이기 때문에 가능하다. 더욱이, CD44v5의 발현은 유방암의 감소된 생존기간과도 관련이 있다. CD44v5가 발현되는 암환자의 5년 생존율은 71%이고, CD44v5가 발현되지 않는 암환자의 5년 생존율은 85%이다 (템퍼 외.,1996).
바람직한 실시예에 의하면 CD44ex9-결합 단백질이나 CD44v5 펩티드는 CD44v5(와 CD44v6)가 대장암 진단시 좋지 않은 예후를 지칭하기에, 대장암의 진단이나 치료에 사용될 수 있다. 여기서 앞 샘플 중 높은 CD44v5나 CD44v6 발현을 가진 환자는 재발이 없는 생존기간이 짧았던 것이 나타났다 (비조소 외., 2004).
다른 바람직한 실시예에 의하면 CD44ex9-결합 단백질인 CD44v5 펩티드는 머리목편평세포암의 진단이나 치료에 사용될 수 있다. 이러한 암은 CD44를 강하게 발현하고 CD44를 발현하는 세포군은 방사선과 화학요법에 민감도가 낮은 것으로 알려져 있다(라 플로어 외.,2012).
다른 바람직한 실시예에 의하면 CD44ex9-결합 단백질과 특히 CD44v5 펩티드는 흑생종의 진단이나 치료에 사용될 수 있다. CD44 유래의 펩티드는 흑생종 모델을 이용한 실험에서 체외 및 체내 모두에서 효과가 있음이 보고되었다 (피오트로비츠 외.,2011).
본 발명의 바람직한 실시예에서의 CD44ex9-결합 단백질은 의약용 대조 작용제로 사용된다.
또 다른 바람직한 실시예에서 대조 작용제는 암세포나 상피성암세포를 발견할 수 있다.
특정 실시예에서의 결합 단백질이나 유래물, 결합물, 융합물 또는 나노입자에 결합되어 있는 단백질은, 선암, 흉선상피세포종, 자궁암세포종, 비호지킨 림프종, 폐암세포종, 췌장암세포종과 암줄기세포중에서 선택되는 암세포를 발견하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 CD44ex9-결합 단백질은 어떠한 종류의 나노입자과 결합할 수 있다. 선행기술에서 이미 다양한 종류의 나노입자가 알려져 있고, 통상의 기술자는 특이적인 진단이나 치료 목적으로 적합한 나노입자을 선택할 수 있다.
CD44ex9-결합 단백질과 결합할 수 있는 나노입자의 예로서는 양자점, 귀금속 클러스터, 초상자성 철 산화물나노입자 (IONPs), 블록혼성중합체 미셀, 나노셀, 덴드리머, 나노튜브, 폴리머좀, XPclad® 나노입자, 무정형 실리카로 이루어지고 크리스탈 발광성 칼슘 포스페이트 층(예, ORMOBEAD®)으로 둘러쌓인 나노입자가 있다.
오모비드(ORMOBEAD) 파티클은 폴리에틸렌이민이나 TRIAMO로 표면을 적절히 변경할 수 있어 아민 그룹이나 6-아미노 헥사노익산(AHA)이나 아디픽산을 생성해 카르복실 그룹을 생성할 수 있다. 이러한 그룹은 본 발명의 단백질에 결합하는데에 사용될 수 있다. 오모비드(ORMOBEAD) 기술은 뎀스키외 연구진(2013)들에 의하여 밝혀졌고 상기 나노입자의 제조와 사용에 대한 기술을 위하여 인용하고 있다.
본 발명의 일실시예에 의하면 100nm 이하 사이즈의 SiO2/Zn2SiO4:Mn2 +와 SiO2/Ca10(PO4)6OH:EU3+ 의 코어쉘 나노입자는 본 발명의 단백질과 커플링을 할 수 있는 나노입자로 사용할 수 있다. 이러한 파티클은 뎀스키외 연구진(2011a,2011b)들에 의하여 밝혀졌고 상기 나노입자의 제조와 사용에 대한 기술을 위하여 인용하고 있다.
또 다른 실시예에서는 형광 염료로 표지된 잡종 나노입자가 사용될 수 있다. 상기 나노입자는 공유결합으로 연결된 유기물의 형광단과 함께 SiO2-기반의 파티클 매질로 이루어져 있다. 이들은 유기물의 염료분자의 광학적 특성과 무기물의 파티클 매질 특성을 혼합적으로 가지고 있다. 결과적으로 이들은 광퇴색에 대한 증가된 저항성과 감소된 염료 누출이라는 특성을 보이게 된다. 상기 나노입자는 Probst외 (2012)에 기재되어 있고 상기 나노입자의 제조와 사용데 대한 기술을 위하여 인용하고 있다.
또 다른 실시예에서는 카드뮴으로부터 자유로운 양자점이 사용될 수 있다. 이러한 나노입자는 가시 그리고 원적외선의 스펙트럼에서 밝은 발광을 한다. 상기 나노입자는 나노코 테크놀로지사 (Nanoco Technologies Ltd. (Manchester, UK))에서 제조되고 있고, WO07/020416, WO08/100276, WO10/52455, WO10/15824, WO10/10329와 WO13/93631에 기술되어 있고 상기 나노입자의 제조와 사용에 관한 기술을 위하여 인용하고 있다.
본 발명의 한 실시예에 의하면 (그룹 Ⅱ 합금) 그룹 Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ 세미컨덕터 양자점, 그룹 Ⅲ-Ⅴ 양자점 또는 에비든트 테크놀로지 (Evident Technologies, Troy, NY, USA)에 의해 개발된 미분화 세미콘덕터 나노크리스탈 구조물이 사용될 수 있다. 이러한 나노입자는 WO07/118118, WO08/94292, WO06/17125 또는 WO05/110916에 각각 기술되어 있고 상기 나노입자의 제조와 사용에 관한 기술을 위하여 인용하고 있다.
또 다른 실시예에서는 초상자성 철 산화물 나노입자 (IONPs), 블록혼성중합체 미셀, 나노셀, 덴드리머, 나노튜브, 폴리머좀, XPclad® 나노입자가 이용될 수 있다. 상기 나노입자는 싱과 릴라드(2009), 씨 외 연구진(2010)에 의해 기술되어 있고 상기 나노입자의 제조와 사용에 관한 기술을 위하여 인용하고 있다.
또 다른 발명의 실시예에 의하면, 비-카드뮴-나노입자가 이용될 수 있고, 그 중심영역은 해당 영역의 반사방지성막을 나타내는 껍질영역으로 둘러싸여야한다. 상기 나노입자는 US 2008/0286826 A1 (필립스 인텔렉츄얼 프로퍼티와 스탠다드)에 기술되어 있고, 상기 나노입자의 제조와 사용에 관한 기술을 위하여 인용하고 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 표적 약물 치료에 사용되는 자분이 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에 따르면 상기 자분은 초상자성 금속 산화물 그리고/또는 본 발명의 펩티드로 코팅이 된 금속, 그리고 선택적으로 하나 또는 그 이상의 추가적 약물로 구성되어 있다. 상기 자분은 EP 1 267 843 B1 (EUCRO)에 기술되어 있고, 상기 자분의 제조와 사용에 관한 기술을 위하여 인용하고 있다.
변형된 나노입자는 바람직하게는 CRC세포를 감지하는 체내의 대조작용제로 사용될 수 있다. WO2007/057182A3 은 유리한 나노입자에 대하여 기재하고 있고, 상기 나노입자의 제조와 사용에 관한 기술을 위하여 인용하고 있다. 상기 나노입자는 유체역학적 지름이 15nm이 넘지 않아야 하고 생물학 시스템에서 활성이 있어야 한다.
본 발명의 나노입자는 적어도 하나의 암항원 결합물질 그리고/또는 세포독성 물질에 결합될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 나노입자는 CEA 항원, CA-19-9 항원, 그리고 어드헤신(adhesin) 또는 이들의 결합물 중에서 선택되는 암항원 결합물질과 결합된다.
바람직한 실시예에 의하면, 나노입자와 결합한 어드헤신은 그 아미노산이 변형되어 있고, 더욱 바람직하게는 인용되어 있는 WO2009/106102 A1에 기재되어 있는 바에 따라 변형되어 출원의 일부가 될 수 있도록 한다.
본 발명의 바람직한 나노입자는 적어도 세개의 구조로 이루어져 있는 바, 이는 이미다졸을 포함하는 층(하기 기재에 따르면 "부동화 막"이라 한다)으로 코팅되어 있는 무기질의 중심부이며, 이는 특정 리간드를 수송하며, 상기 특정 리간드는 층의 일부일 수 있다. 상기 리간드는 생물학 시스템의 표적에 특이적으로 결합하는 나노입자가 된다.
바람직한 나노입자는 부동화 막을 포함하는 무기질의 중심부는 유체역학적 지름이 15nm를 넘지 않고, 가능하다면 바람직하게는 10nm가 넘지 않는다. 가장 바람직하게는 유체역학적 지름이 8nm을 넘지 않거나 5nm를 넘지 않는다. 이것은 구형의 나노입자에 특히 적용된다. 이러한 사이즈의 나노입자는 신장을 통하여 조명될 수 있으므로 체내에 축적되지 않으며 축적이 된다 하더라도 체내에서 문제가 되지 않는 양이다. 이러한 특징은 체내 투여를 가능하게 한다. 이러한 적용은 유체역학적 지름이 5nm보다 크지 않은 나노입자에 특히 해당된다.
대안적인 실시예에 따르면 나노입자는 막대형태로도 가능하다. 본 실시예에서는 막대의 지름이 상기 언급된 15nm의 직경을 넘지 않아야 유익하다. 상기와 마찬가지로 직경이 5,8,10nm 가 바람직하고 이는 인체에서 배출에 유리하기 때문이다. 예를 들자면, 본 발명에 따른 사용되는 나노입자는 길이/폭의 치수가 8X15nm이다.
본 발명의 나노입자는 바람직하게는 파장에서의 최대 방출량이 600에서 700nm 사이이며, 예를 들자면, 620에서 660nm이고, 특히 바람직하게는 625에서 655 nm 사이이다. 상기 방출은 인간의 눈에 가시적이고 이러한 나노입자는 의학용으로 직접 대조작용제로써 사용될 수 있다. 결과적으로, 보조시각장비의 사용이 때로 불요하다.
대체적 실시예에서는, 상기 언급된 유체역학적 지름의 길이를 넘는 나노입자는 파티클이 체내에서의 활성이 보장되는 한 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 활성이 있다는 것은 상기 파티클이 생분해성이 있어 미립자로 이용되는 금속(예, 카드뮴)이 이온의 형태로 전환되는 경우에 해당한다. 분해된 물질은 신장을 통해 조명될 수 있다.
부동화 막을 가지며 이미다졸 성분을 포함하는 무기질의 나노입자는 체내에서 진정 활성이 있으며 이는 기존에 기술된 바 있다. 그러나 이들은 이러한 조건에서 분해된다. 따라서 상기 나노입자는 생분해와 분해 물질의 신장 경로의 조건을 만족시키며, 이는 특히 생체내 적용에 큰 연관성을 갖는다. 부동화 막은 특히 나노입자의 화학적, 물리적 안정성을 증가시키기 때문에 이러한 사실은 놀라운 발견이다 (추가적 설명은 하기의 설명을 참조할 것). 따라서, 명확한 진단을 위한 나노입자의 안정성과 "큰" 파티클의 신장경로의 통과를 위한 생분해성간의 관계가 생체내 대조작용제로서의 사용에 중요한 역할을 한다.
부동화막의 주요한 역할은 무기질 중심부의 형광 강도와 물리화학적 안정성을 증가시키는데에 있다. 상기 부동화막으로 코팅되어 있는 무기질 중심부는 적어도 10%, 유익하게는 적어도 30, 50 이나 70%의 양자양의 특징을 가지고 있다. 상기 양자양은 샘플로부터 방출되는 빛과 샘플이 흡수하는 빛의 비율을 뜻한다. 바람직하게는, 부동화막이 1nm보다 두껍지 않으며, 이 경우, 부동화된 중심부의 지름은 2nm보다 크지 않다.
바람직하게는 특히 생물학적 환경과 양립가능성을 증가시키기 위해서 각 나노입자는 조절물질이 제공된다. 바람직하게는 조절물질의 사용에 따른 유체역학적 반경의 증가는 2nm를 넘지 않는다. 특정 경우에서는 부동화막과 조절물질의 두께는 두 구조의 관계 및 무기질 중심부와의 관계에 영향을 받는다.
본 발명의 상기 바람직한 나노입자는 상기 언급된 바와 같이 지름이 한정된다면 이들은 특별히 살아있는 환자에 사용될 수 있는 진단 물질로 사용될 수 있다. 즉 사이즈의 감소는 확산의 비율과 조직내로의 침투 깊이를 증가시킨다. 이것은 나노입자가 생물학적 환경에서 골고루, 빠르게 분산할 수 있게 하며, 국소 투약 후 조직(예를 들면 암)내에 깊은 침투를 가능케 한다. 또한 본 발명의 나노입자는 주사제를 이용한 주입을 통한 체순환적 투약이 가능하다. 그러나, 국소 투약, 예를 들면 국부치료, 종양내 혹은 종양주변의 투약도 역시 암의 치료를 위해 이용될 수 있다.
바람직한 실시예에 의하면, 나노입자을 포함하며 본 발명의 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는 경우 그 유체역학적 지름은 8nm를 넘지 않으며, 특히 바람직하게는 4nm를 넘지 않는다. 이러한 크기의 나노입자는 이미 신장을 통하여 조명되어 체내에 축적되지 않고 축적된다 하더라도 소량의 양이 된다. 따라서 본 발명의 나노입자는 알려 져 있는 양자점과 관련이 되는 장기적 독성 문제를 현저하게 줄일 수 있다.
나노입자는 유리하게 600에서 700nm사이의 형광 스펙트럼을 발광하고, 특히 바람직하게는 600에서 660nm를, 더욱 바람직하게는 620에서 660nm를 발광한다. 상기 발광 스펙트럼은 생명체 내(물을 포함) 헤모글로빈 및 기타 광흡수 물질에 의한 낮은 흡수도에 의거하여 매우 뛰어난 조직 전달력을 보인다. 이 파장의 광은 여전히 인간의 눈에 감지될 수 있으므로 의사가 치료과정에서 특별히 복잡한 기술적 감지 기술(예, CCD 카메라)을 사용하지 않고도 표지된 조직을 감지해낼 수 있다. 이것은 특히 외과적 치료를 위하여 CD44, CEA- 그리고 /또는 CA19-9-발현 세포, 그리고 특히 암세포와 정상 세포를 구별할 때 나노입자가 조영제로 사용될 때 유익하다.
한 실시예에 의하면, 바람직하게 사용 가능한 나노입자는 예를 들면 CdSe, CdS 또는 CdTe와 같은 중심부를 가진 나노입자가며, 예를 들자면 US2004/0247861에 인용하고 있는 과학문헌에 기재된 바와 같다. 이러한 인쇄문헌은 또한 중심부 물질을 만드는 방법에 관하여 인용문헌을 사용하고 있으며, 예로는 US 6,179,912가 있다. 인용문헌은 상기 나노입자 및 및 그 제조 방법에 관하여는 인용문헌을 통하여 전부 기재가 되어 있다. 또한 나노입자의 제조에 관하여 US 7,147,712 B2에 기재가 되어 있으며, 역시 인용문헌에 기재가 되어 있다.
더욱 유익하게는, 나노입자의 무기질 중심부는 근본적으로 반도체로 구성되어 있다. 이러한 중심부는 사이즈 그리고/또는 구성에 따라 다양한 발색광을 발광하나, 모두가 동일한 범위의 스펙트럼(UV에서 VIS 범위) 내의 광대역을 흡수한다. 뛰어난 스토크스 이동(Stokes shift) 때문에 여자와(excitation) 발광의 스펙트라(spectra)가 멀리 떨어져 있으며 이는 다양한 나노입자의 단순하고 동시적인 여자를 가능하게 한다. 이들은 좁고 대칭적인 발광 스펙트라를 가지며 서로 조금 겹치거나 전혀 겹치지 않는다. 뛰어난 여과기능과 체내 표지를 위하여 중요한 다른 유익한 특성으로는 80%에 이르는 양자양과 광안전성이 있다.
바람직한 나노입자는 WO2005/001889에 기재되어 있다. 이에 기재된 바, 나노입자는 적어도 두개의 균일하게 분포되거나 합금간 농도 기울기가 있는 적어도 두개의 반도체로 구성된 무기질의 중심부로 이루어져 있다. 상기 나노입자의 자연적 특성과 제조에 관한 기재에 관하여 WO2005/001889을 인용하고 있고 상기 기재된 바 있다. 이러한 중심부는 각 사이즈 범위의 5% 정도는 벗어날 수 있다.
이에 따라, 나노입자의 무기질 중심부는 적어도 두개의 반도체의 합금으로 구성될 수 있고, 중심부는 균일한 구성을 가지며 두 반도체의 분자비에 비선형관계에 있는 밴드갭에너지 ("band-gap energy")로 특징된다.
대안적으로는, 중심부는 비균질일 수 있으며 첫번째 반도체의 농도가 중심부의 중심에서 표면으로 점차적으로 증가하며, 두번째 반도체의 농도는 중심부의 중심에서 표면으로 점차적으로 감소한다.
적어도 하나의 반도체는 그룹 Ⅱ~그룹 Ⅵ 반도체이거나 그룹 Ⅲ~그룹 Ⅴ 반도체이다(그룹의 정의는 주기율표의 그룹에 따른다). 예를 들면, 합금은 다음의 그룹에서 선택된다: CdSeTe, CdSSe, CdSTe, ZnSeTe, ZnCdTe, CdHgS, CdHgTe, InGaAs, InGaP, GaAIAs, InGaN. 이러한 중심부들은 무기질의 물질의 코팅을 포함할 수 있는데, 예로는 반도체(예. ZnS)가 있다. 이러한 추가적 층은 통상의 기술자에게는 "캐핑(capping)" 이나 "쉘(shell)"로 알려져 있다.
그룹 Ⅱ~ 그룹 Ⅵ과 그룹 Ⅲ~그룹 Ⅴ반도체는 일반적 알려져 있고, 예를 들어 CdS1 - xSex, CdS1 - x,Tex, CdSe1 - xTex, ZnSe1 - xTex, Zn1 - xCdxTe, Cd1 - xHgxS, Cd1 - xHgxTe, In1-xGaxAs, Ga1 - xAlxAs 그리고 In1 - xGaxP를 포함한다. CdSe1 - xTex , CdS1 - x,Tex , ZnSe1 - xTex, Zn1-xCdxTe, Cd1 - xHgxS, Cd1 - xHgxTe, In1 - xGaxAs, In1 - xGaxP와 같은 반도체에 선호도가 있으며, x는 0에서 1 사이의 분수이다.
반도체의 분자비는 어떠한 분자비율도 가능하다. 그러나 합금이 CdSSe를 포함하는 경우에는 분자식 CdS1 - xSex를 포함하는 합금이 선호된다. 만일 합금이 CdSTe를 포함하는 경우에는 분자식 CdS1 - xTex를 포함하는 합금이 선호된다. 만일 합금이 ZnCdTe를 포함하는 경우에는 분자식 CdTe를 단독으로 포함하는 합금이 선호된다. 이 모든 경우 x는 0과 1사이의 분수이다.
바람직한 나노입자의 무기질 중심부는 다음과 같은 단계를 거쳐 제조되는 것이 바람직하다:
(ⅰ) 나노크리스탈이 형성될 수 있는 조건 하 첫번째 용액 제조의 단계
(ⅱ) 나노크리스탈이 형성되지 않는 조건 하 분자비를 갖는 반도체의 전구물질로 구성된 두번째 용액의 제조의 단계
(ⅲ) 두번째 용액을 첫번째 용액에 첨가하여 나노입자가 형성되는 단계
(ⅳ) 나노크리스탈의 성장과 형성을 방해하는 조건의 변경 단계.
중심부를 제조하는 방법은 WO 2005/001889에 기재되어 있으며 이는 발명의 상기 바람직한 나노입자의 무기질 중심부에 대한 실시예의 기재를 위하여 인용하고 있다.
대안적 실시예에 의하면, 무기질 중심부는 바람직하게는 2 와 27 귀금속 원자를 포함하는 필수적 귀금속 클러스터로 구성된다. 바람직한 실시예에 의하면, 귀금속은 금, 은, 구리, 플래티넘, 팔라디엄, 오스미움, 이리디움, 루테니움 그리고 로디움의 그룹에서 선택된다. 본 클러스너트는 다양한 전하를 띌 수 있다.
이러한 중심부는 독립적인 "나노도트(nanodot)"으로 감지될 수 있다는 장점이 있으며 이는 강한 흡수력과 발광력을 가진 약한 수은 램프 여자(excitation)을 사용한다. 본 발명의 이러한 중심부를 포함하는 나노입자는 독립 형광 분자 레이블과 매스 레이블(mass label)로 이용될 수 있다.
"귀금속"이라는 용어는 금, 은, 구리 그리고 플래티넘 그룹 금속 (PGM), 플래티넘, 팔라디움, 오스미움, 이리듐, 구레늄, 그리고 로듐 중 선택되는 원소의 그룹에 이용한다. 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 귀금속은 금, 은과 구리의 그룹에서 선택된다. 특히 바람직한 실시예에 의하면 귀금속은 은이나 금이다.
"클러스터"라는 용어는 2-27 금속 원자의 화합물과 관련된다. 클러스터는 화학촉매, 도예, 반도체 기술과 재료과학에서 사용된다. 따라서 통상의 기술자는 이들의 제조에 관하여 친숙하다. WO 2004/003558은 이 분야와 관련하여 귀금속 클러스터의 제조 및 광범위한 인용문헌을 기재하고 있다. 더욱 구체적으로는, 유기 분자와 관련된 귀금속 나노클러스터의 제조에 대하여 기재하고 있다. 관련이라는 것은 결합의 물리화학적 성격과 무관한 어떠한 형태의 결합을 지칭한다(즉, 예를 들면, 공유결합, 비공유결합, 정전결합, 반데르발스 결합이 있다). 본 발명의 나노입자의 중심부로서의 나노클러스터에 대하여는 WO 2004/004558을 인용하고 있다.
본 발명의 나노입자는 바람직하게는 형광강도를 증가시키고 무기질 중심부의 물리화학적 안전성을 증진시키는 부동화막을 포함한다. 따라서, 본 나노입자는 10%보다 많고, 바람직하게는 50%보다 많은 양자량의 발광을 한다.
상기 나노입자는 바람직하게는 수용성 환경, 4˚C, 그리고 가능하다면 pH5~pH10, 바람직하게는 pH7~pH10 의 범위에서 12개월의 저장 안정성을 가지는데, 즉, 양자량, 최대 발광량의 포지션, 발광 스펙트럼의 반진폭너비의 특정 스펙트럼 성질의 50%보다 적은 범위 내에서 편차를 보인다. 바람직한 파티클은 특정 스펙트럼 성질의 10%보다 적은 범위 내에서 편차를 보인다.
본 나노입자는 본 발명의 또 다른 실시예에 의하여 생물학적(즉, 생리학적) 조건이나 생체내에서 적어도 3일간 그 중심부(둘러싸는 부동화막을 포함)의 불변성/안전성을 보인다. 바람직한 파티클은 7일에서 14일까지
이러한 불변성/안전성을 보이는 바, 한가지 특징의 적어도 50%의 안정성을 보유할 수 있다. 이러한 정보는 실질적 표적 장기에서의 나노입자의 안정성과 연관된다. 우선적인 촉매적 기능을 하는 장기 내의 나노입자의 안정성은 현저하게 불안정할 수는 있다(예로 간을 들 수 있다). 이는 특별히 선호될 수 있다.
비록 나노입자가 상기와 같이 안정성을 가질 수 있지만 그럼에도 불구하고 기초적으로 체내에서는 분해성이 있고 이에 따라 활성이 있다. 이러한 맥락에서, "활성" 이른 적어도 50%의 나노입자가 투약 후 이미 12주나 그 이상의 기간 이후에 분해되었다는 것을 의미한다. 8,6, 또는 4주의 기간 이후 적어도 50%의 분해가 이미 감지되는 경우가 선호된다. 이러한 목적의 파티클의 감지로는 체내에 남아있는 체내 장기, 혈장에 대한 것이 포함된다. 따라서, "비활성"이란 나노입자가 환자의 체내에서 투약 후 4주이후에 50% 보다 많고 거의 100% 에 이르는 양이 감지되는 경우를 뜻한다.
나노입자의 분해성은 통상의 기술자에게 친숙한 분석을 통하여 감지될 수 있는 바, 이는 예를 들자면, 유도결합플라즈마 질량분석법(ICP-MS)을 이용할 수 있으며, 이러한 분석은 샘플에 적합한 경우 형광분광 분석법에 의하여 보조될 수 있다.
부동화막은 적어도 하나의 이미다졸로 구성물이 포함되어 있다. 이러한 화합물은 금속 원자나 아연 이온, 수은 이온이나 카드뮴이온과 같은 금속 이온을 조정하는 능력이 있다. 바람직한 실시예에 의하면, 이미다졸 그룹은 분자의 구조에 기초하여 보았을 때 말단의 위치에 있다. 또한 부동화막은 가교제를 가질 수 있으며, 원형 또는 선형의 이미다졸 성분도 역시 가교제를 가질 수 있다. 가교제로는 알카라인이 사용될 수 있다.
금속 원자나 금속 이온을 포함하는 조정 화합물들은 킬레이션, 조정, 또는 루이스 베이스를 이용한 전자공여 특징을 이용하여 기능적으로 형광 무기물 중심부에 결합할 수 있고, 이에 따라 결합된 일부물질/그룹를 형성할 수 있다. 상기 분자들은 수용성이나 습윤성을 중심부에 전달할 수 있는 수용성 물질로 둘러싸인 일부 물질을 포함할 수 있다.
이미다졸 성분은 포스핀 화합물, 바람직하게는 알킬포스핀 화합물에 의하여 교차결합되어 있다.
본 발명의 목적에 맞는 "이미다졸 성분"이란 이종고리식 또는 복소고리방향족 분자로 적어도 하나의 이미다졸 그룹(이미다졸 유래물 포함)을 포함하며, 무기질 중심부 또는 카드뮴, 아연, 갈륨 또는 금속 양이온, 또는 이러한 금속 양이온을 포함하는 물질을 포함하는 부동화막과 결합이 가능한 구성물을 의미한다. 이러한 결합에서는 바람직하게는 분자의 구조에 따라 이미다졸 그룹이 말단에 위치한다. 기능적인 형태의 이미다졸 성분은 비국재화된 분자오비탈을 포함하는 고리를 통하여 형광 나노크리스탈과 결합한다. 일반적으로, 이미다졸 고리의 질소 원자는 카드뮴이나 아연과 같은 금속 이온과 기능적으로 결합하기 위한 조정 리간드로 작용한다.
하나의 실시예에 의하면, 이미다졸 성분은 반응적이고 기능적인 하나 혹은 두개의 아미노산으로 구성되어 있고, 예를 들면, 히스티딘, 카르노신, 안세린, 발레인, 호모카르노신, 히스티딜페닐알라닌, 싸이클로히스티딜페닐알라닌, 5-아미노-4-이미다졸카르복사미드, 히스티딜류신, 2-머캅토이미다졸, 복-히스티딘, 하이드라지드, 히스티놀, 1-메틸이미다졸, 3-메틸히스티딘, 이미다졸라이신, 이미다졸-포함 오르니틴 (예, (베타)-(2-이미다졸)-L-(알파) 알라닌), 카르지닌, 히스타민이 있다. 이러한 히스티딘 기반의 분자 또는 이미다졸을 포함하는 아미노산들은 통상적으로 알려져 있는 방법에 의해 합성될 수 있다.
본 발명의 목적에 맞는 "포스핀"은 Se, S와 같은 비금속이나 기타 비금속, 또는 이러한 원자를 포함하는 물질과 결합 혹은 킬레이팅할 수 있는 적어도 하나의 포스핀 그룹(유래물 포함)을 포함하며, 이웃 분자들과 반응할 수 있는 적어도 하나의 기능성 그룹(예, 하이드록실기, 아미노기, 타이올기, 카르복시기, 카르복사마이드기 등)을 제공하는 물질이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 이미다졸 성분은 적어도 하나의 히스티딜 잔기를 포함하는 펩티드이고, 바람직하게는 하나 또는 두개의 히스-잔기를 포함하는 디펩티드이다.
더욱 바람직한 실시예에 의하면, 이미다졸 성분은 다른 히스티딜 포함 디펩티드의 혼합물이다.
바람직하게는 적어도 하나의 포스핀 그룹이 분자의 구조에 따라 말단에 위치하는 것이 좋다. 포스핀 일부는 형광 중심부나 Se나 S와 같은 비금속 이온의 차폐층의 화합물과 결합하는 기능적 형태의 조정 리간드로 작용한다.
바람직한 실시예에 의하면, 포스핀을 포함하는 화합물은 하나, 두개 또는 그 이상의 서로 커플된 포스핀 그룹을 포함하며 (예, 중합체 형태로), 이는 하이드록시메틸포스핀 화합물 혹은 유사물을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 포스핀을 포함하는 화합물은 통상적으로 알려져 있는 방법에 의해 합성될 수 있다. 또한, 알킬포스핀을 포함하는 화합물은 하나 또는 그 이상의 추가적 기능성 그룹(예, 하이드록실기, 아미노기, 타이올기, 카르복시기, 카르복사마이드기 등)을 포함할 수 있다. 유래물의 예로는 하이드록시메틸포스핀 유래물, 아미드나 에스테르가 있고, 상기 유래물이 포스핀의 기능과 양립할 수 있는 경우이다.
특히 바람직하게는 본 발명의 나노입자의 형광 무기질 중심을 코팅하는 트리스(하이드록시메틸)포스핀과 베타-[트리스(하이드록시메틸)포스피노]프로파노익산이 있다. 가교결합된 포스핀- 포함- 화합물은 아연이나 카드뮴과 같은 금속 원자 그리고/또는 이온에 추가적으로 기능적 결합을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 관점에서 기능성이 있는 아이소씨아네이트나 알킬씨아노아크릴레이트는 리간드를 위한 가교제와 형광 중심부를 갖는 부가물의 생성에 유용할 수 있다. 상기 가교제는 기초적인 형태로 가능하다.
본 발명에 따른 부동화막의 부동화 효과는 표면 카드뮴이나 아연 원자나의 쉴딩이나 이미다졸 성분을 이용한 유사 화합물의 형성, 그리고 포스핀- 포함-화합을 이용한 화합물 형성을 통한 Se나 S와 같은 카운터 아톰(counter atom)의 쉴딩에 있다.
본 발명의 나노입자의 부동화막은 US 2004/0247861 A1에 개시되어 있다. 이러한 공개된 출원은 예를 들면 양자점과 같은, 부동화막으로 코팅된 무기질 중심에 대하여 기술하고 있다. 따라서US 2004/0247861 A1는 본 명에 따른 부동화막의 제조와 부동화막으로 코팅된 무기질 중심에 대한 기술을 위하여 인용하고 있다.
따라서 부동화막의 분자는 표적 분자나 세포(특정 리간드)에 결합하거나 가교하기 위한 화학 그룹을 포함하거나 수송할 수 있다. ZnSO4나 Na2S와 같은 적합한 시약의 존재 하에서 상기 분자나 화합물은 형광 중심부("캐핑" 이나 "쉘")의 분자를 이용하여 부동화막을 형성할 수 있다.
유리한 실시예에 의하면, 본 발명의 나노입자는 추가적으로 유기물 그리고/또는 무기물의 일부 물질을 갖는 수정제를 가질 수 있다. 이들은특히 생리학적 환경에서 나노입자의 용액이나 부양액에서의 양립가능성, 효율성 그리고/또는 수용성을 증가시키기 위해 사용된다. 이러한 표면 수정제는 비특이적이며 매우 낮은 흡착성을 갖게 하며 생물학적 환경, 특히 인간의 체내에서 증가된 양립가능성에 큰 도움이 된다.
하나의 방법으로는, PEG(polyethylene glycol)를 이용하여 표면을 수정하는 것인 바, 이는 특정 의약물 투여에 이미 사용되고 있으며, 특히 나노입자가 작은 사이즈를 갖게 하는 낮은 분자량 형태를 이용하고 있다. 따라서 나노입자의 생물학적 양립가능성, 혈액 순환 시간 그리고 세포 투입의 효율성이 모두 증가된다. 낮은 분자량의 PEG와 비타민, 예를 들면 엽산을 결합하면 상기 나노입자의 대식세포로의 낮은 흡수율을 초래할 수 있는 바, 이는 나노입자에 단백질이 흡착하여 상기 나노입자가 면역 시스템에 의해 인식되는 것이 지연되기 때문이다.
또 다른 수정제를 이용한 표면 수정방법의 유리한 방법으로는 단당류, 이당류, 또는 삼당류를 사용하고, 한 종류의 단당류나 다양한 단당류를 이용하여 낮은 분자량의 다당류를 이용해 코팅하는 방법이다. 하나의 방법은, 폴리글루코스를 이용한 수정방법으로 예를 들면, 의학적으로 혈액 대용으로 사용할 수 있는 덱스트란의 사용이다. 이는 뛰어난 생체 양립가능성/내성을 가진다. 또다른 실시예로는 발생 가능한 분해를 방지할 수 있는 단당류의 입체 이성체 형태(D-/L-)를 이용한 것이 있다.
또다른 실시예에서는 수정제로 생물학적으로 양립가능한 친구성 비타민을 사용하며, 예로는 티아민, 리보플라빈, 니아신, 피리독신, 코발라민, 판테톤산, 아스코르빈산과 엽산이 있다. 즉, 예를 들면 엽산은 나노입자의 암세포와의 결합을 유도할 수 있다. 이러한 비타민은 매우 낮은 면역성만을 보이기 때문에 뛰어난 생물학적 양립가능성을 가지고 있다. 나노입자의 소화는 세포막에 위치하는 엽산 수용체에 의하여 가능하게 된다.
표면 수정은 또한 친유성 비타민, 예를 들면 레티놀, 콜레칼시페롤, 토코페롤과 필로퀴논을 사용하여 할 수 있다. 즉, 예를 들면 비타민 E는 나노입자의 세포내 흡수를 증진시킬 수 있다.
지방산, 예를 들면 1-옥타데센 또는 18-마텔레이코사논산 및 이들의 유래물질은 콜로이드의 수용성과 안정성을 증가시킬 수 있고, 말단의 기능적 카르복실기가 있어 특정 리간드의 후속적 결합에 사용될 수 있다. 따라서 수정제의 사용에 지방산을 포함시키는 것이 유리하다.
또 다른 표면 수정에 대한 실시예는 폴리알콜을 사용하고 있는데, 예를 들면, 비특이적 단백질 흡착을 감소시키는데 유리한 다이에틸렌글라이콜(DEG)의 사용이 있다. 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE, Teflon)에도 적용이 되는 바, 특히 이들의 낮은 분자량 형태는 단백질의 흡착을 줄일 수 있다. 폴리테트라플루오로에틸렌은 심장외과적 적용에 자주 사용되고 있다.
또한 표면 수정은 하나 또는 그 이상의 자연적으로 발생하는 단백질을 형성하거나 하지 못하는 아미노산, 그리고 합성된 아미노산을 포함하여 수행될 수 있다. 두가지 입체이성체는 ( D-, L-형태)가 모두 이용될 수 있다. 상기 아미노산을 이용한 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드에서 작은 폴리펩티드들은 거의 면역 시스템을 자극하지 않기 때문에 얇은 적합층을 형성하는데 유용하다. 이러한 아미노산으로는 자연적인 것 뿐 아니라 인공적인 아미노산도 이용될 수 있다. 자연적 단백질의, 예를 들면 파이토킬라틴(phytochelatin)의 펩티드 유래물도 표면 수정에 사용될 수 있다. 바이오의약 분야에의 적용을 위하여Tat 펩티드와 Tat 펩티드- 포함- 펩티드를 이용한 나토파티클의 제조를 통한 표면 수정도 가능하다. Tat 펩티드는 예를 들면 금 나노입자을 세포막을 통해 핵까지 이동시키는 역할을 하는데 효과적인 분자이다.
사용 가능한 수정제에 관한 또다른 실시예에는 포스포릴콜린 코팅의 제조를 통한 사용에 관하여 기술하고 있다. 포스포릴콜린은 발생 가능한 비특이적 단백질 흡착을 감소시키며, 예를 들면 컨택트 렌즈에의 사용이 있다. 항혈전성 특징 때문에 포스포릴콜린 수정은 생물학적 시스템에 사용될 수 있으며, 뛰어난 저장 안정성이라는 특징이 있다.
폴리악테이트(polyactate)는 생물학적 양립가능성이 있기 때문에 다양한 의학적 용도로 사용되고 있다. 더욱 특별하게는, 낮은 분자량 형태의 폴리악테이트는 본 발명의 나노입자의 표면 수정제로서 구성물로 사용된다. 두가지 입체이성체 (D-,L-형태) 는 발생할 수 있는 생물학적 분해를 감소시키기 위한 역할을 위해 사용될 수 있다.
상기 기재된 표면 수정 외에도, 비특이적 단백질의 나노입자에 대한 가수분해적 결합이 또한 가능하다. 이것은 생물학적 양립가능성을 증가시킬 수 있다. 표적 위치에서, 큰 단백질은 조직에서 방사되는 작은 나노입자과 함께 제거될 수 있다. 상기 제거는 적당한 세포내 잔류 기간 이후에 이루어질 수도 있다. 이에 적합하게 이용되는 단백질로는 예를 들면, 트랜스퍼린, 락토페린, 세룰로플라스민, 엘라스틴 그리고 알부민이 있으며 이외에는 비특이적 흡착을 감소시키는 단백질이 있어 통상 선호된다. 즉, 예를 들면 엘라스틴을 포함하는 폴리펩티드의 조합을 이용한 표면 코팅을 통하여 원치 않는 혈전형성을 방지하고 결과적으로 나노입자의 생물학적 양립가능성을 증가시킨다.
대표적인 혈청 단백질인 알부민은 혈장 막과의 비특이적 반응을 감소시킬 수 있다. 또한, 적당히 수정된 나노입자는 파티클 표면과 특이적 리간드의 동시적 결합을 통하여 표적 세포와 특이적 반응을 할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 혈청 알부민을 이용한 코팅은 정맥내 투여 이후 대식세포의 빠른 흡수를 방지하여 코팅되지 않은 나노입자에 비하여 현저하게 긴 혈액 순환 시간을 제공할 수 있다.
높은 방산율과 살포율을 갖는 감소된 유체역학적 지름, 상기 기재된 특성, 개선점, 특히 가시의 적색선 범위에서의 높은 형광감도의 혼합으로 인하여 본 발명의 나노입자는 체내에서 선택적이고 명확한 조직의 구별을 하는데 사용되는 진단제로서의 특징을 부여받는다.
이러한 특징으로 인하여 항원특이적 바이오마커와의 조합적 이용을 통한 특히 CD44v5, CEA- 그리고/또는 CA-19-9 발현 세포와 특히 비정상의 전암세포적 조직을 일반 조직으로부터 구별하는 감지를 할 수 있고, 이는 더욱 정밀한 종양의 제거를 위한 외과적 치료에 가시적인 도움을 제공할 수 있다.
본 발명의 나노입자는 따라서 대조작용제로서 사용될 수 있다. 이는 특히 암의 진단 및 외과적 치료에 사용된다.
본 발명의 CD44ex9-결합단백질을 포함하는 나노입자는 체외/생체 외 또는 생체 내 진단 물질, 치료진단 물질 그리고/또는 치료물질로서 사용될 수 있다. 이러한 목적 ‹š문에, 이들은 국소적으로(종양 내, 근육 내, 외과적으로 접근 가능한 조직/장기 내) 투약되거나, 전신(예, 정맥으로)으로 투약될 수도 있다. 국소적인 투여는 용액형태, 분사형태, 폼, 크림이나 활성 패치 형태로도 할 수 있다. 이러한 방법은 특히 대장암과 같은 속이 빈 장기에 발생하는 암의 경우에 진단/치료의 목적으로 선호될 수 있다. 경구투여도 가능한데, 예를 들면 정제나 캡슐의 형태의 시럽으로 사용될 수 있다. 흡입제의 사용도 가능하며 예로는 스프레이가 있다. 좌약을 통한 항문 투여도 할 수 있다. 또 다른 형태로는 저장고의 형태로 나노입자을 이식하는 방법이다.
본 발명의 선호되는 실시예에 의하면 CD44ex9-결합단백질은 표적 약물 수송에 사용될 수 있다. 본 발명의 맥락에 의하면, 표적 약물 전달이란 약물투여를 관심 조직에 집중시키는 반면 기타 조직에는 약물투여의 상대적 양을 감소시키는 것이다. 이러한 목적하에, CD44ex9-결합단백질은 단독으로 혹은 융합 단백질로 또는 결합물 형태로 약물 전달물질과 결합하게 된다. 통상의 기술자에게 알려져 있는 다양한 종류의 약물 전달물질이 존재하고, 통상의 기술자는 목적에 부합하는 특이적 전달물질을 선택할 수 있는 바, 예로는 미셀 폴리머, 리포좀, 리포프로테인 기반의 약물전달물질, 나노입자 약물 전달 물질, 덴드리머 등이 있다. 이상적인 약물전달물질은 독성이 없고, 생물학적으로 양립가능성이 있고, 면역성이 없고, 생물학적인 분해가 가능하고 숙주의 방어 체계를 회피할 수 있어야 한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 지질-유래의 바이포스포닉산을 포함하는 리포좀은 표적 약물 전달에 사용될 수 있고 특히 골 구조물에의 전달에 용이하다. 상기 지질-유래의 바이포스포닉산은 WO 2005/070952 A2 (MCS Micro Carrier Systems GmbH)에 기재되어 있으며, 상기 바이포스포틱산의 제조와 사용에 관한 기재를 위하여 인용하고 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면CD44ex9-결합단백질은 체내 혹은 체외 진단제로서 사용될 수 있다. 체내 혹은 체외의 진단은 환자의 샘플로부터 얻은 CD44v5 단백질의 감지로서 이루어질 수 있다. 이러한 샘플은 어떠한 조직, 장기로부터 얻을 수 있으며, 이로부터 얻은 생체조직이나 혈액, 혈청, 소변, 침이나 뇌액과 같은 인체 유래물로부터도 얻을 수 있다.
진단적인 사용을 위하여는, CD44ex9-결합단백질은 감지를 위하여 표지된다.
적합한 표지는 선행기술에 기재되어 있고 발광 혹은 형광 염색료와 같은 염료, 방사성 동위원소, 효소, FLAG 태그, GST태그, MBP 태그, His 태그와 같은 단백질 태그 또는 나노입자가 포함된다
표지의 결합을 위하여 메르캅토기, 아민기 또는 카르복실기를 이용한 임의의 수정에 관하여 선행문헌에서 기술하고 있다. 대안으로는 시스테인 잔기와 같은 활성 그룹을 추가하거나 제거하는 유전공학적 방법이 사용될 수 있다.
대안적 방법으로는 또한 짧은 펩티드 표지를 수용 사이트로서 작용하는 단백질에 결합시킬 수 있다. 여기서 표지는 태그의 고유한 활성이나 트랜스에 제공되는 효소의 활성으로 부착될 수 있다. 상기 활성과 연관된 표지작업은 사이트 특이적인 바이오티닐레이션을 포함하고, 이는 태그된 단백질이 다양한 종류의 아비딘/스트렙타비딘 제제에 결합되도록 하는 바이오틴 홀로효소 합성효소 BirA에 의하여 중개된다. LUMIO-태그 (테트라시스테인 모티프를 포함하는 헥사펩티드)는 2개의 비소 원자를 포함하는 염색료에 의하여 직접 염색될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 공학적으로 변경된 형태의 인간 DNA-복원 효소 O(6)-알킬구아닌 DNA 알킬 트란스퍼레이즈 (AGT; SNAP-Tag 로도 알려져 있다)는CD44ex9-결합단백질과 결합되어 있다. O(6)-벤질구아닌을 포함하는 기질은 안정한 티오에테르 결합에 의하여 융합 단백질에 빠르고 특이적인 자가 표지적 공유결합을 한다. 이러한 표지 기술과 진단 목적에의 이용은 캠프마이어(Kampmeier) 외 연구진(2009)과 씨(Xie) 외 연구진(2010)에 의하여 기재된 바 있고, 상기 표지에 관한 제조와 사용에 관한 목적의 기술을 위하여 인용하고 있다.
바람직한 실시예에 의하면CD44ex9-결합단백질은 나노입자에 결합되어 있다. 다양한 형태의 나노입자는 선행문헌에 기재되어 있고 본 발명에도 기재되어 있다.
보다 바람직한 실시예에 의하면, 바람직하게는 나노입자에 결합하는 표지된 CD44ex9-결합단백질은 수분 액침욕에 포함되어 있다. 액침욕에 샘플을 담금으로써 표지된CD44ex9-결합단백질은 샘플의 CD44v5 단백질을 특이적으로 표지화하고 이는 조사자에 의하여 가시적인 조사가 이루어질 수 있게 한다. 이러한 과정은 특히 분리된 조직이 외과적 치료 중 종양 마커의 탐지를 위한 분석을 가능하게 하는 치료에 사용될 수 있다. 결과적으로 외과의는 종양의 절제와 관련하여 즉시적인 피드백을 얻을 수 있게 된다.
본 발명에서 사용되는 "진단적 제제"는 문맥적으로 "대조작용제"와 동의어로 사용되고, 즉, 생물학적 조직의 형태학적이거나 기능적인 구조의 가시화를 분별하는 역할을 한다. 이는 특히 의학적 용도로써 살아있는 인체에 사용이 될 수 있다.
나노입자는 외과적 치료에서 사용되는 대조작용제로 사용될 수 있다. 이들은 최소 침습성 방안 (예, 내시경, 복강경 검사법)에도 사용될 수 있다. PET, MRT, CT 와 같은 이미징 장비와도 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 국소적 투약이 특히 유익하다. 국소적 투여에 이용되는 카드뮴의 양은 노인이 평범한 일상생활을 통하여 축적되게 되는 총 노출 카드뮴 양의 1/10을 초과하지 않는다. 이처럼 장기의 총 노출량은 약 18mg이다. 따라서 나노입자의 국소 투여시 카드뮴의 양은 한정되어 총량이 2mg을 넘지 않는 것이 유리하다. 바람직한 실시예에 의하면, 카드뮴 양이 0.6mg, 더욱 바람직하게는 0.2mg을 넘지 않는 대조작용제의 사용으로 종양의 가시화를 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 목적에 맞는 "국소 투여"란 투여의 방법에 의존적으로 대조작용제의 증가된 양이나 복용량이 신체의 특정 부위에서 관찰되는 것을 뜻한다. 따라서 만일 투여하는 자가 예를 들어 구심성 및 원심성 혈관에 결찰을 가해 대조작용제가 혈관계에 분산되는 것을 막았다면, 이러한 대조작용제의 혈액투여도 국소 투여에 해당한다.
본 실시예의 특별한 이익은 나노입자을 살아있는 사람에 대하여 의학적 목적으로 사용할 수 있다는 것이다. 그렇지 않다면 (예, 조직, 계통적 투여의 경우라면) 발생하는 독성 때문에 사용이 불가능했을 것이기 때문이다. 국소 투여는 적합한 가시화를 위하여 나노입자의 용량을 최소화할 수 있기 때문이다.
카드뮴을 포함하는 대조작용제는체내 종양 가시화를 위한 발명에 따르면, 종양 조직에서 0.002mg 에서 0.02mg의 카드뮴/cm3의 용량을 사용할 때 특히 유익하다고 알려져 있다. 대조작용제의 용량이 종양 조직에서0.002mg 에서 0.015mg의 카드뮴/cm3 일때가 특히 유익하고, 이는 특히 0.002~0.010mg 의 용량일 경우 가장 유익하다. 종양 조직이 150cm3 정도 되는 경우에 체내 가시화를 위하여 상기 용량을 적용하면 인간의 한계 용량을 초과하지 않고 종양을 가시화할 수 있다. 특히, 가장 바람직한 가시화를 위해서는 종양 조의 부피는 50 cm3 까지 사용할 수 있다.
조사는 접근 가능한 환자의 모든 조직/장기에 관하여 할 수 있고, 특히 피부나 원통형 장기(예, 위장, 비뇨생식기, 기도), 또는 외부에서 접근이 가능한 감각적 장기의 영역, 그리고 심혈관계 조직에도 수행할 수 있다.
체외의 진단제로서도 사용이 가능하며, 예를 들면 면역조직화학이나 FACS, ELISA 에도 사용 가능하다. 체내 그리고 체외의 진단 (예, 조직검사 시료)에 특히 유용하다.
본 발명의CD44ex9-결합단백질은 나노입자에 결합된 상태나 제거할 수 있거나 감지되거나 혹은 해방될 수 있는 상태로 존재한다.
본 발명은 또한 하기 표와 같은 CD44v5 펩티드들을 제공하며 이들은 서열번호 11에서 38로 지정된다. 이러한 펩티들은 12-머(mer)로 서로 중첩되는 서열이 인간 CD44의 v5 영역 전체를 덮고 있다.
CD44v5 펩티드 번호 아미노산 서열 서열번호
1 Asp Val Asp Arg Asn Gly Thr Thr Ala Tyr Glu Gly 11
2 Val Asp Arg Asn Gly Thr Thr Ala Tyr Glu Gly Asn 12
3 Asp Arg Asn Gly Thr Thr Ala Tyr Glu Gly Asn Trp 13
4 Arg Asn Gly Thr Thr Ala Tyr Glu Gly Asn Trp Asn 14
5 Asn Gly Thr Thr Ala Tyr Glu Gly Asn Trp Asn Pro 15
6 Gly Thr Thr Ala Tyr Glu Gly Asn Trp Asn Pro Glu 16
7 Thr Thr Ala Tyr Glu Gly Asn Trp Asn Pro Glu Ala 17
8 Thr Ala Tyr Glu Gly Asn Trp Asn Pro Glu Ala His 18
9 Ala Tyr Glu Gly Asn Trp Asn Pro Glu Ala His Pro 19
10 Tyr Glu Gly Asn Trp Asn Pro Glu Ala His Pro Pro 20
11 Glu Gly Asn Trp Asn Pro Glu Ala His Pro Pro Leu 21
12 Gly Asn Trp Asn Pro Glu Ala His Pro Pro Leu Ile 22
13 Asn Trp Asn Pro Glu Ala His Pro Pro Leu Ile His 23
14 Trp Asn Pro Glu Ala His Pro Pro Leu Ile His His 24
15 Asn Pro Glu Ala His Pro Pro Leu Ile His His Glu 25
16 Pro Glu Ala His Pro Pro Leu Ile His His Glu His 26
17 Glu Ala His Pro Pro Leu Ile His His Glu His His 27
18 Ala His Pro Pro Leu Ile His His Glu His His Glu 28
19 His Pro Pro Leu Ile His His Glu His His Glu Glu 29
20 Pro Pro Leu Ile His His Glu His His Glu Glu Glu 30
21 Pro Leu Ile His His Glu His His Glu Glu Glu Glu 31
22 Leu Ile His His Glu His His Glu Glu Glu Glu Thr 32
23 Ile His His Glu His His Glu Glu Glu Glu Thr Pro 33
24 His His Glu His His Glu Glu Glu Glu Thr Pro His 34
25 His Glu His His Glu Glu Glu Glu Thr Pro His Ser 35
26 Glu His His Glu Glu Glu Glu Thr Pro His Ser Thr 36
27 His His Glu Glu Glu Glu Thr Pro His Ser Thr Ser 37
28 His Glu Glu Glu Glu Thr Pro His Ser Thr Ser Thr 38
하나의 실시예에 의하면 본 발명은 서열번호 11에서 38에 지정된 펩티드와 연관되고, 이는 N말단이나 C말단에서 하나, 두개 혹은 세개의 아미노산의 삭제가 있다.
또다른 실시예에 의하면, 본 발명은 서열번호 11에서 38에 지정된 펩티드와 연관되고, 이는N말단이나 C말단에서 하나, 두개 혹은 세개의 아미노산의 추가가 있고, 추가되는 아미노산은 상기 CD44v5 아미노산에 속하는 것이다.
바람직한 실시예에 의하면 상기 펩티드는 본 발명의 CD44ex9-결합단백질을 블로킹하는데 사용될 수 있다. 이러한 길항적 작용 때문에, 이 펩티들은 체외, 체내, 탈체의 CD44 표지작업의 특이성을 검증하는데 사용할 수 있다.
나아가 상기 펩티드는 CD44ex9-결합단백질의 치료적 사용에 이용되는 길항제로서 사용될 수 있다. 이러한 맥락에서 펩티드는CD44ex9-관련 치료의 효과를 조절, 감소 혹은 방지하는데 사용할 수 있다.
치료적 목적에 기하여, 본 발명의 CD44v5 펩티드들은 CD44 수용체의 내생적 리간드에 직접 결합할 수 있다. 이러한 결합은 이러한 리간드의 중성화를 초래할 수 있고 (CD44 수용체로서의 사용을 불가하게 한다), 대식세포에 의한 신속한 제거를 초래할 수도 있다.
본 발명의 더욱 바람직한 실시예에 의하면, 서열번호 11에서 38번 중 하나 또는 그 이상의 펩티드는 개인의 v5 영역을 발현하는 CD44 이형에 대한 적응면역력을 유도하는 면역시스템을 자극하는 백신으로 사용될 수 있다. 백신으로서의 상기 펩티드는 암의 예방에 사용되거나 암의 면역적 치료에 사용될 수 있다.
두 하이브리드 스크리닝의 성공적인 결과로 인한CD44ex9-결합단백질의 식별 덕분에 상기 펩티드들은 면역적으로 연관된 에피토프(epitope)로서 검증되었다. 따라서 이들은 백신으로서 사용에 적합하다.
서열번호 11에서 38의 분리된 단백질이나 이들 중 펩티드 조각 또는 상기 단백질의 핵산 또는 암의 예방이나치료에 사용되는 의약제제로서의 상기 펩티드 조각을 포함하는 백신 구성물을 제공하는 것이 또한 본 발명의 한 분야이다.
또다른 발명의 분야는 바람직하게는 나노입자과 약학적으로 사용가능한 수송체와 결합하며, CD44ex9-결합단백질 또는 발명의 CD44v5펩티드 또는 표지된 CD44ex9-결합단백질이나 CD44v5펩티드를 포함하는 약학적 구성물에 관한 것이다.
본 발명의 단백질이 상대적으로 작은 분자이기 때문에 백신이나 면역학적 구성물 등을 제조하기 위하여 어쥬반트와 같은 다양한 물질과 결합시켜야하는 경우가 있다. 어쥬반트는 면역 반응을 증진시키는 물질로 널리 정의가 되어 있다. 자주 쓰이는 어쥬반트로는 프로인드의 완전 또는 불완전한 어쥬반트이거나 사멸시킨 B. 퍼터씨쓰 개체가 있고 이들은 예를 들면 명반침전된 항원과 혼합하여 사용된다. 어쥬반트에 대한 일반적 논의는 고딩(Goding), 단일클론항체: 원리와 실제(2차 편집, 1986)의 페이지 61-63에 기재되어 있다. 고딩에 의하면 항원의 분자량이 적거나 면역성이 좋지 않은 경우 면역적 수송체와의 결합이 바람직하다고 한다. 이러한 수송체 분자의 예로는 키홀 림펫 헤모사이아닌, 보바인 세럼 알부민, 오발부민 그리고 가금 이뮤노글로불린이 있다. 다양한 사포닌 추춘물은 면역성 구성물의 어쥬반트로서 추천된 바 있다. 최근에는, 잘 알려져 있는 싸이토카인인 과립구집락자극인자(GM-CSF)가 어쥬반트로서 제안된 적이 있다 (WO 97/28816).
본 발명에 따른 백신 구성물은 어쥬반트 그리고/또는 수송체를 포함하는 것이 바람직하다. 유용한 어쥬반트와 수송체의 예는 하기와 같이 기재되어 있다.
따라서 구성물에 포함되어 있는 CD44v5펩티드나 이의 펩티드 조각은 단백질 또는 CD44v5펩티드나 이의 조각을 T 세포에 제시할 수 있는 수지상세포와 같은 항원제시세포의 수송체와 연관될 수 있다.
어쥬반트는 백신 구성물에 혼합되어 포함되는 경우 본 발명의 CD44v5 펩티드에 대한 면역 반응을 증가시키거나 조절할 수 있는 어떠한 물질을 지칭한다. 수송체는 스캐폴드 형태의 구조물로, 예로는 CD44v5펩티드나 이의 조각이 결합될 수 있는 폴리펩티드나 폴리사카라이드이다.
어쥬반트는 AIK(SO4)2, AINa(SO4)2, AINH4(SO4), 실리카, AI(OH)3, Ca3(PO4)2, 카올린, 탄소, 알루미늄하이드록사이드, 무라밀디펩티드, N-아세틸무라밀-L-트레오닐-D-아이소글루타민(thr-DMP), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-아이소글루타민 (CGP 11687, nor-MOP 라고도 불리움), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-아이소글루타미닐-L-알라짖2-(1'2'-디팔미토일-sn-글라이세로-3-하이드록스포스포릴록시)-에딜아민(CGP 19835A, MTP-PE라고도 불리움), RIBI(MPL+TDM+CWS)가 2%의 스쿠알렌/트윈80-RTM 유화액, 리포폴리사카라이드와 리피드 A, 프로인드 완전한 어쥬벤트(FCA), 머크 어쥬벤트 65, 폴리뉴클레오타이드(예로 폴리 IC,폴리 AU 산), 마이코박테리아로부터의 왁스0, 코니발테리윰 파붐(Cornenacterium parvum)에서 발견되는 물질, 보데텔라 퍼터씨스(Bordetella pertussis), 브루셀라 (Brucella)속 의 멤버들, 리포좀이나 다른 리피드 유화액, 티터맥스(Titernax), ISCOMS, 퀼라(Quila), ALUN (US 58767과 554372 참조), 리피드 A 유래물, 콜레라톡신 유래물, HSP 유래물, LPS 유래물, 합성펩티드 매트릭스나 GMDP, 인터루킨1, 인터루킨2, 몬타나이드 ISA-51과 QS-21을 포함하는 다양한 유래물에 포함될 수 있다. 본 발명의 바람직한 어쥬반트로는 기름/ 계면활성제를 기본으로 하는 몬타나이트(Montanide) 어쥬번트 (세픽, 벨기에 (Seppic, Belgium)에서 구할 수 있음)가 있고 바람직하게는 몬타나이느 ISA-51이 있다. 또 다른 바람직한 어쥬반트로는 CpG 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 박테리아 DNA 기본의 어쥬반트가 있다. 또 다른 바람직한 어쥬번트로는 폴리 I:C 이미다조칠린과 같은 바이란 dsRNA가 있다. 더 나아가 바람직한 어쥬번트로는 리포좀이 있다. 가장 바람직한 어쥬번트는 인간에게 사용가능한 어쥬번트들이다.
몬타나이드 어쥬번트는 (세필, 벨기에서 구할 수 있음), 몬타나이드 ISA-51, 몬타나이드 ISA-50, 몬타나이드 ISA-70, 몬타나이드 ISA-206, 몬타나이드 ISA-25, 몬타나이드 ISA-720, 몬타나이드 ISA-708, 몬타나이드 ISA-763A, 몬타나이드 ISA-207, 몬타나이드 ISA-264, 몬타나이드 ISA-27, 몬타나이드 ISA-35, 몬타나이드 ISA-51F, 몬타나이드 ISA-0160, 몬타나이드 ISA-IMS를 포함하는 그룹에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 몬타나이드 ISA-51. 몬타나이드 ISA-IMS, 몬타나이드 ISA-720의 그룹에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 몬타나이드 ISA-51을 포함하는 그룹에서 선택할 수 있다. 몬타나이드 ISA-51(세픽, Inc.)은 기름/계면활성제 기본의 어쥬반트로, 비대사성 미네랄 오일, 대사성 오일 둘의 혼합물과 혼합되어 있다. 이들은 상기 CD44v5 펩티드나 이의 조각을 포함하는 수용성 용액과 사용되는 유화제로써 사용되기 위해 준비된다. 본 계면활성제는 만나이드 올리에이트 (mannide oleate)이다. OS-21 (Antigenics; Aquila Biopharmaceuticals, Framingham, MA) 는 잘 정제되고 수용성인 사포닌으로 수용영성 용액으로써 다루어진다. OS-21과 몬타나이드 ISA-51 어쥬번트는 살균된 일회용의 바이얼에 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 구성물은 하나 이상의 다른 어쥬번트를 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명은 상기 기재된 어떠한 어쥬번트나 이들의 혼합물을 포함하는 치료적 조성물을 제공한다. 또한, 상기 CD44v5 펩티드나 조각 및 어쥬번트는 적합한 순서에 따라 따로 투여될 수도 있다.
캐리어(carrier)는 어쥬번트의 없이 독립적으로 존재할 수 있다. 캐리어는 예를 들어 안정성을 주거나 생물학적 활성을 증진시키기 위하거나 혈청의 반감기의 증가를 위한 활성이나 면역성을 증가시키기 위하여 펩티드나 상기 조각의 분자량을 증가시키느 기능을 가질 수 있다. 나아가 캐리어는 T 세포에 대하여 CD44v5 펩티드나 상기 조각을 제시하는 것을 도울 수 있다. 캐리어는 통상의 기술자에게 알려져 있는 어떠한 적합한 것도 사용할 수 있고, 예를 들어 단백질이나 항원제시세포가 있다. 캐리어 단백질은 예를 들어 키홀 림펫 헤모싸이아닌, 트란스페린, 보바인 세럼 알부민, 인간 세럼 알부민과 같은 혈청 단백질, 타이로글로불린, 오발부민, 이뮤노글로불린, 인슐린아나 팔미틱산과 같은 호르몬이 이용될 수 있다. 인간을 면역화하기 위해서는 캐리어는 생리학적으로 인간에게 사용가능한 안전한 것이어야 한다. 한편 테타터스 톡소이드(tetanus toxoid) 그리고/또는 디프테리아 톡소이드는 본 발명의 한 실시예에 있어서 적합한 캐리어가 된다. 대안으로는 세파로스와 같은 덱스트란이 캐리어로 사용될 수도 있다.
이에 따라 본 발명은 상기 기재된 어쥬반트 혹은 그 혼합형태를 구성물로 하는 치료적 조성물을 제시한다. 또한,항원, 즉 본 발명의 펩티드와 어쥬반트는 동시 혹은 이시적으로 적합한 순서에 따라 투여될 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 약학적 조성물은 CD44ex9-결합 단백질이나 CD44v5 펩티드를 약학적으로 사용가능한 캐리어와 함께 포함하고 있다. "약학적 사용가능성"은 CD44ex9-결합 단백질이나 CD44v5 펩티드의 생물학적 활성의 효과를
방해하지 않으며 투여되는 자에 대하여 독성이 없는 캐리어의 특성을 뜻한다.
본 발명의 한 실시예에서는, 조성물은 인간 혈청 알부민로으로 안정화시킨 CD44ex9-결합 단백질이나 CD44v5 펩티드를 포함하여 준비된다. 이러한 목적으로 인하여 CD44ex9-결합 단백질이나 CD44v5 펩티드는 인간 혈청 알부민과 바이얼 내에서 동결건조되어 제조된다.
몇 실시예에 의하면, 약학적 조성물은 독소, 싸이토카인, 세포정지제 또는 면역 조절제로 작용하는 하나 또는 그 이상의 약품을 포함한다.
"약학적으로 사용가능한 캐리어"란, 용액, 용해제, 필러, 안정제, 바인더, 흡수제, 염기, 완충제, 윤활제, 방출이 조절되는 운송수단, 희석액, 유화제, 습윤제, 확산제, 코팅, 항박테리아 혹은 항진균성 제제, 등장성 용액, 흡수를 지연하는 제제 그리고 유사물이거나, 약학적 투여를 가능하게 하는 물질이다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 용액이나 제제는 통상의 업계에 잘 알려져 있다. 통상의 용액이나 제제가 활성물질과의 사용이 어려운 경우에는 그 사용이 재고된다. 추가적 제제는 조성물에 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 의도되는 투여 경로에 맞추어 제조된다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예를 들면 정맥주사, 피내주사, 피하주사가 있으며, 경구(흡입)투여, 경피(국소적)투여와 직장투여가 있다. 비경구투여, 피내주사 또는 피하주사에 사용되는 용액이나 현탁액은 다음의 구성물을 포함할 수 있다: 주사를 위하여 살균된 물, 생리식염수, 고정유 또는 합성 용해제; 벤질 알코올이나 메틸 파라벤과 같은 항박테리아 제제; 아스코르빈산이나 소듐바이설페이트와 같은 항산화 물질; EDTA와 같은 킬레이트 시약; 아세테이트, 씨트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충액과 탄력성을 조절하기 위한 제제인 소듐클로라이나 덱스트로스이다. pH 값은 염산이나 수산화나트륨의 산이나 염기를 이용하여 조절될 수 있다. 비경구 투여는 앰퓰, 일회용 주사기 또는 유리나 플라스틱의 주사약병의 형태로 담아 투여할 수 있다.
주사용 제제로 사용 가능한 약학적 조성물은 임시적 살균주사 용액이나 분산액의 조제를 위한 살균된 수용액이나 분산액 그리고 살균분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해서는 생리학적 식염수, 세균발육저지 물, 크레모포(Cremophor) ELTM(BASF, Ludwigshafen, BRD), 또는 인산완충용액(PBS)을 포함하는 적합한 캐리어가 사용된다. 모든 경우에, 주사용 조성물은 살균되어야 하고 주사기에 적합한 용액형태여야 한다. 조제의 조건에 용이한 형태여야 하고 보관은 박테리아와 곰팡이의 오염으로부터 보존될 수 있는 형태여야 한다. 캐리어는 용액이나 분산액의 형태로 예를 들어 물, 에탄올 혹은 유사물질을 포함하거나 이들의 적합한 혼합물을 포함한다. 레시틴과 같은 물질을 이용한 코팅을 통하거나 파티클의 사이즈를 분산에 적합하도록 유지하거나 계면활성제를 활용하여 적합한 유동성이 유지될 수 있다.
미생물 활동의 예방은 다양한 항균 혹은 항진균제의 사용으로 이룰 수 있고, 예를 들면, 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀, 아스코르빈산, 티오메살, 그리고 유사물을 이용할 수 있다. 많은 경우, 조성물에 등장성 제제가 사용될 수 있고, 예를 들어 설탕, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알코올 또는 염화나트룸이 사용될 수 있다. 주사용 조성물의 지연된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 제제를 사용함으로써 이룰 수 있고, 예로는 알루미늄 모노스테아레이트가 있다.
살균 주사용 제제는 활성 혼합물(예, CD44ex9-결합단백질이나 CD44v5 펩티드)을 적절한 용액에 요구되는 양 및 상기 열거된 재료 중 하나 혹은 혼합물을 넣은 후 살균여과시켜 조제할 수 있다. 일반적으로 분산액은 활성 혼합물을 염기 확산 미디움을 포함하는 살균된 운반물질에 포함시키고 기타 필요한 재료를 상기 열거된 재료 중 선택하여 혼합으로 조제할 수 있다. 살균주 사용용액의 제조에 있어서 살균 분말의 경우 바람직하게는 진공 건조나 동결건조를 이용하며, 이는 활성 재료의 분말 및 기존의 살균 여과된 용액의 추가적으로 필요한 재료를 생성하게 한다.
경구제제는 일반적으로 비활성 희석액이나 식용 캐리어를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐이나 정제형태로 압축될 수 있다. 경구치료 투여를 위해서는 활성 혼합물은 약물전달용첨가제가 추가되어야 하고 정제, 알약, 또는 캡슐의 형태로 사용되어야 한다. 경구제제는 또한 구강청결제로의 사용을 위한 유동의 캐리어를 이용하여 제조될 수 있으며 상기 유동캐리어의 혼합물은 구강용으로 투여되어 입안에서 움직이거나, 뱉거나, 삼킬 수 있다. 약학적으로 사용 가능한 결합제제 그리고 또는 어쥬반트 물질은 상기 제제에 포함될 수 있다. 정제, 캡슐, 알약, 그리고 유사물은 하기 기재된 어떠한 재료 또는 유사한 성질의 혼합물: 마이크로크리스탈린 셀룰로오스: 녹말이나 락토스와 같은 첨가제: 알긴산과 같은 붕해제, 소듐 스타치 글라이콜레이트(예, Primogel®) 또는 옥수수 녹말; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활유; 콜로이달 실리콘 다이옥사이드와 같은 활주제; 설탕이나 삭카린과 같은 감미료; 페퍼민트, 메틸살리실레이트나 오렌지향과 같은 향료를 포함할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위한 조성물은 압축용기를 이용한 에어로졸 스프레이나 적합한 압축가스(예, 이산화탄소와 같은 가스나 분무기)를 포함하는 디스펜서의 형태일 수 있다.
전신투여방법으로는 점막투여나 경피투여를 의미할 수 있다. 점막투여나 경피투여를 위해서는 조성물 내에 장벽 침투에 적합한 침투제가 사용된다. 상기 침투제는 통상의 기술분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들어 점막 투여, 세제, 담즙산염, 푸시딘산유래물과 같은 물질을 포함한다. 점막 투여는 비강스프레이나 좌약을 통하여 이루어질 수 있다. 경피투여를 위해서는 생활성 조성물이 연고, 기름, 크림으로 제형되어야 하고 이는 통상의 기술분야에서 잘 알려져 있다.
조성물은 또한 좌약의 형태 (예, 코코아 버터나 기타 글리세라이드와 같은 전통적 좌약)나 직장으로 전달하기 위한 보류 관장으로 사용될 수 있다.
한 실시예에서는, 치료적 성분은 CD44ex9-결합단백질이나 CD44v5 펩티드를 포함할 수 있고, 조성물의 신체로부터의 급속한 제거를 방지하는 캐리어와 함께 제조될 수 있다. 예로는 이식물과 마이크로캡슐운반제를 포함하는 방출조절제를 포함할 수 있다. 상기 제형을 제조하는 방법은 통상의 기술자에게 명백히 알려져 있다. 재료들은 예를 들어 알자사(Alza Corporation)나 노바 제약사(Nova Pharmaceutials Incorporation)로부터 구매될 수 있다. 리포좀 현탁액은 (암항원에 대한 항체와 함께 암세포를 표적으로 하는 리포좀을 포함) 약학적으로 사용가능한 캐리어로 이용될 수 있다. 이들은 통상의 기술자에게 알려져 있는 방법에 따라 제조될 수 있다.
경구나 비경구 제제를 단위투여제형으로 제조하는 것이 투여나 복용량의 단일화를 위하여 유리하다. 상기 단위투여제형은 투여대상에 적합한 단일 복용량에 맞는 물리적으로 개별적인 단위를 사용하고; 각 단위는 의도하는 치료효과를 요구되는 약학적 캐리어와 함께 나타내기 위하여 미리 결정된 활성 단백질의 양을 포함하고 있다. 본 발명의 단위투여제형의 사양은 활성 단백질과 목적하는 치료적 효과, 개별 투여대상에 투여하기 위한 활성 단백질의 내재적인 한계에 의하여 결정되고 직접적으로 의존하고 있다.
본 발명 단백질의 독성과 치료적 효과는 세포 배양이나 실험 동물을 이용한 표준 약학적 과정, 예로 LD50 (50%의 개체수의 치사량)와 ED50(50%의 개체수에 치료적 효과가 있는 복용량)에 의하여 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료적 효과의 복용량 비율은 치료적 지침이 되며, 이는 LD50/ED50-단백질로 표현될 수 있는 바, 큰 수치의 치료적 지침이 선호된다. 독성을 나타내는 단백질이 사용될 수 있지만, 정상세포에 잠재적 손상을 최소화하고 부작용을 최소화하기 위하여 이러한 단백질을 표적으로 하며 영향을 받은 조직으로 수송하는 수송 시스템을 디자인하는 경우 주의를 요구된다.
세포 배양 분석과 동물 실험으로부터 얻은 데이터는 인간에의 사용되는 복용량의 범위를 형성하는데 이용될 수 있다. 이러한 조성물의 복용량은 ED50를 포함하는 순환적 농도의 범위와 연관성을 가지며 적은 독성을 갖거나 아예 독성을 나타내지 않는다. 복용량은 상기 농도의 범위 내에서 다양하게 이용될 수 있고, 이는 제형과 투여 경로에 의존한다. 본 발명의 방법으로 사용되는 어떠한 조성물도 일차적으로 세포배양분석으로부터 그 치료효과적 복용량을 예측할 수 있다. 복용량은 IC50(증상의 반최고치 억제를 달성하는 시약의 농도)를 포함하는 순환적 혈장 농도를 구하기 위하여 세포배양에서 결정된 경우와 같이 동물 모델에서 구할 수 있다. 이러한 정보는 인간의 적합한 복용량을 정확히 결정하기 위해 이용될 수 있다. 혈장에서의 농도는 예를 들면 고성능액체크로마토그래피에 의하여 측정될 수 있다.
약학적 조성물은 투여를 위한 지시사항과 함께 용기, 상자, 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
또 다른 일면으로는 본 발명은 가) 개별적으로 복용될 수 있는 약, 나) 환자에게 투여 후 작용, 부작용, 상호작용, 대사, 흡수, 분배, 제거에 연관되는 환자 특이적 성격을 갖는 진단적 지표계 시스템 약/약량계의 혼합 패키지를 제공한다. 상기 환자 특이적 성격은 내생의 물질, 조절 메카니즘, 유전자나 지침시스템에서 선택되는 성격이다. 상기 기재된 혼합 패키지에 관하여, 약물이나 진단적 지표계 시스템은 분리된 CD44ex9-결합단백질이나 어떠한 융합 단백질이나 혼합물일 수 있다. 상기 기재된 목적에 의하면, 본 발명의 CD44v5 펩티드는 약물이나 진단적 지표계 시스템으로도 사용될 수 있다.
적합한 혼합 패키지는 EP 1542644B1(MCS Micro Carrier Systems GmbH)에 공지되어 있으며, 상기 약물/약량계의 제조 및 사용을 위한 목적의 기재를 위하여 인용하고 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 단백질의 발현이나 활성을 조절하는 약학적 조성물을 제조하는 방법에 대하여 기술하고 있다. 상기 방법은 본 발명 단백질의 발현이나 활성을 조절하는 제제와 약학적으로 사용가능한 캐리어를 포함한다. 이러한 조성물은 추가적인 활성 제제를 포함할 수 있다. 따라서 본 발명은 하나 또는 그 이상의 추가적 생활성 물질을 포함하며, 단백질의 발현이나 활성을 포함하는 조절하는 제제를 함께 포함하는 약학적으로 사용가능한 캐리어를 형성함으로써 약학적 조성물을 제조하는 방법을 포함한다.
본 발명에서 "CD44ex9-결합단백질"은 300 또는 그 이하의 아미노산 길이로 인간 CD44 유전자의 엑손9에 의하여 암호화되는 단백질에 결합하는 단백질을 뜻한다. 명세서에 의하면 "결합 단백질" 또는 "활성 조성물"이라고도 지칭한다.
본 발명의 단백질은 아미노산으로 구성되는 분자로 정의된다. 단백질이란 용어는 따라서 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 헥사펩티드, 헵타펩티드, 옥타펩티드, 더 긴 올리고펩티드 그리고 아미노산 사슬을 포함한다. 아미노산 사슬은 선형이거나 분지형이다.
본 발명의 아미노산은 오가닉 물질로 아미드 결합을 형성하는 적어도 하나의 아미노기와 적어도 하나의 카르복실기를 포함한다.
단백질을 이루는 아미노산들은 20개의 기본형 알파아미노산이나 셀레노시스테인, 피롤라이신, 란티오닌, 하이드록시프롤린, 카르복시글루타메이트, 2-아미노아이소뷰트릭산, 디하이드로알라닌과 같은 비기본형 아미노산으로부터 선택될 수 있다. 나아가 베타아미노산(예, 베타 알라닌), 감마아미노산 또는 고등의 아미노산과 같은 다른 아미노산은 단백질을 이룰 수 있다.
특정 아미노산은 다른 거울상 이성질체나 입체이성체형태 중에서 선택될 수 있고, 예를 들어 두가지 거울상 이성질체로 존재하는 알파아미노산의 경우에는 D 형태와 L 형태로 존재할 수 있다.
단백질은 합성적으로 형성(인공적이거나 인공적이지 않은 리보좀 시스템을 사용하는 세포가 없는 시스템에서 오가닉 합성에 의한 방법으로)되거나, 유전적으로 조작되거나 조작되지 않는 세포에 의해 자연스럽게 형성되거나, 단일 세포 개체 (예, 박테리아나 효모)나 다세포 개체에서 형성될 수 있다.
단백질은 다양한 방법으로 변형될 수 있다. 대표적인 변형 방법으로는 지질, 아세테이트 그룹, 포스페이트 그룹, 또는 탄수화물을 포함하는 번역후 변형이 있다. 단백질은 또한 예를 들어 바이오틴 그룹으로 화학적으로 변형될 수 있다.
단백질은 공유결합이나 비공유 작용에 의하여 결합되는 동일한 하위단원(호모머, homomer) 또는 다른 단백질(헤테로머, heteromer)으로 구성되는 멀티머(multimer)일 수 있다.
상기 사용되는 "결합 친화력"은 CD44ex9-결합단백질과 CD44v5 영역간의 친화력의 강도를 지칭하며, 해리상수 KD에 의하여 설명할 수 있다. CD44ex9-결합단백질과 CD44v5 영역간의 친화력을 의미하는 Kd 값은 평형 방법에 의하여 결정될 수 있고 예를 들어 ELISA, 방사면역검지법, 또는 동역학 (예, BIACORE TM 분석)으로 결정될 수 있다.
"KD" 는 CD44ex9-결합단백질과 CD44v5 영역간의 상대적인 친화력을 지칭한다. 높은 KD 값은 낮은 결합 친화력을 의미한다.
본 발명의 "급성치료"는 단기의 의학적 치료를 의미하며, 주로 병원에서 급성 질환, 부상 또는 수술 후 회복 중인 환자를 위한 치료이다. "포스트 급성치료"는 중도기간의 치료로써 주로 병원에서 급성 질환이나 부상 혹은 수술 후 회복중인 환자를 위한 치료이다.
"치료중"이나 "치료"는 특히 인간 혹은 포유동물의 생리학적 장애를 예방, 감소, 치료하는 어떠한 필요적인 의학적 방법을 지칭한다. 본 발명에 따르면 치료는 표적 약물 전달을 포함한다.
"치료적 효과량"이란 중풍과 같은 신경학적이나 신경퇴행성 질환과 연관된 증상을 완화하는 활성 재료의 양을 의미한다. "치료적으로 효과있는" 이란 것은 치료를 받지 않은 상태와 비교할 때 질환의 정도나 질환 발생의 정도에 있어서 어떠한 향상을 의미한다. "치료"란 치유, 완화, 차도, 예방의 의미를 포함한다.
"발현 벡터"란 이종의 DNA 조각을 외부 세포에서 포함하고 발현하는 능력이 있는 벡터를 지칭한다. 많은 전핵세포나 진핵세포의 발현벡터들은 알려져 있고/있거나 상업적으로 사용 가능하다. 적합한 발현벡터의 선택은 통상의 기술자에 의하여 가능하다.
본 발명의 "나노입자"은 1μm 미만으로 바람직하게는 1과 100nm 사이의 사이즈를 갖는 파티클을 지칭한다. 따라서 "나노입자"은 반도체 물질로부터 만들어진 나노크리스탈(양자점이라고도 불리움)을 포함하며 귀금속 클러스터로 구성되는 나노입자, 희토류 기반의 무기물 형광 나노입자, 초상자성 아연 산화물 나노입자(INOPs), 블록코폴리머 미셀, 나노셀, 덴드리머, 나노튜브, 폴리머좀, XPclad® 나노입자, 크리스탈 형광 칼슘 포스페이트 층으로 둘러쌓인 무정형 실리카로 구성되는 나노입자 (예, ORMOBEAD®)을 포함한다.
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[실시예]
[ 실시예 1] CD44ex9 -결합 단백질의 분리
CD44의 v5 영역에 결합하는 단백질이나 단백질 조각의 분리를 위하여 효모단백질잡종법이 EP 1721974 A1의 방법에 기재된 바와 같이 수행되었다. 베이트로써 v5-조각은 은 GAL4 결합 영역에 결합되었다. 상기 ORF는 플라스미드 벡터로 클론되었고 pGBKT7(도2 참조)라고 지칭하였다. GAL4-활성 영역에 결합되어 있는 인간 cDNA 라이브러리의 조각은 프레이로써 사용되었다(pGADT7-RecAB; 도2 참조).
스크리닝은 엄격한 선별 조건에서 수행되었으며 39개의 포지티브 클론의 식별을 가능케 하였다. 베이트와 프레이 플라스미드의 선별적인 동시형질전환 후, 39개의 클론 중 21개가 포지티브로 남았다. 21개의 클론들은 시퀀싱 후 BLAST 검색에 의해 분석되었다. 결과적으로 21개의 시퀀스는 12개의 다른 시퀀스로 선별되었는데 이는 4개의 서열이 이중으로 검색되고, 하나의 서열은 4개의 클론에서 발견되었기 때문이다.
나아가 서열의 비교를 통하여 다섯개의 서열 패밀리는 높은 서열상동성을 나타내어 공통서열을 추릴 수 있었다 (도3 참조).
[ 실시예 2] 항원 발현 암세포의 체외 탐지
2.1 배경과 목적
항원 발현 암세포를 탐지하기 위한 단백질-양자점 결합물의 능력을 설명하기 위하여 암샘플 또는 체외에서 배양된 암세포는 상기 항원의 발현을 보기 위한 형광과 동시에 면역조직화학적으로 분석되었다. 첫번째 항원으로, 암배아항원(CEA)이 분석되었다. CEA는 세포 접착과 관련된 당단백질이다. 탐지-리간드로써 항 CEA 항체는 QDBP-655(charge #773780) 양자점과 결합되었다. 나아가 암 항원 19-9(CA 19-9가 분석되었다. CA19-9는 시알화 루이스(a) 항원으로 주로 췌장암의 치료에 사용되는 암 지표이다.
2.2. 샘플
2.2.1. 세포 배양 샘플
첫번째 실험에서는 체외에서 배양된 인간 암세포주인 HT29, Colo25 그리고 SW116이 사용되었다. HT29는 접착성대장선암 세포주이고, Colo25는 인간 접착성 결장암 세포주이며, SW116은 직장결장암 세포주이다.
2.2.2. 암 샘플
또 다른 실험에서는 인간의 암에서 얻은 조직이 이용되었다. 암 샘플 35번은 2011년에 맹장으로부터 절제되었고 점액성선암으로 진단되었다. TNM 분류체계에 따라 pT4No(0/18)G3Ro로 분류되었다. 상기 샘플은 다른 설명이 없는 경우에는 하기와 같은 방법으로 준비되고 고정되었다.
조직절편의 준비와 고정
-70℃에서 보관되는 절제된 암 샘플은 HM560 MV 저온유지장치(Thermo Scientific, Walldorf, Germany)에서 5μm의 두께의 크리오섹션을 위하여 준비되었다. 절편은 60 에서 120분 동안 상온에서 건조되었고 찬 아세톤(-20℃)에서 10분간 배양되었다. 상온에서 추가적인 건조 단계를 10분간 거친 후, 절편은 -70℃에서 다음날까지 보관되었다.
절편들은 30분간 밀폐된 용기와 상온에서 해동되었다. 고정의 배양은 250mM의 Tris-HCl 완충용액, pH 8.0에 20mg/ml의 다이메틸수버리미데이트(DMS)와 20mM의 CaCl2가 포함된 용액을 이용하여 수행되었다. 이후 절편들은 130mM의 NaCl, 7mM의 Na2HPO4, 3mM의 KH2PO4 가 포함된 D-PBS-T 완충용액에서 5분간, 0.1% Tween 20가 포함된 130mM 의 NaCl, 7mM Na2HPO4, 3mM의 KH2PO4 와 200mM의 글라이세린 완충용액에서 급랭단계로 20분 동안 세척되었다. 마지막 단계에서 절편들은 D-PBS-T 완충용액에서 5분간 세척되었다.
조직절편의 대조염색
Dako Autostainer Plus (DAKO Deutschland GmbH, Hamburg, Germany)를 하기의 프로토콜을 이용하여 대조염색이 수행되었다:
- D-PBS-T 완충액으로 헹굼
- 1% BSA/5% 염소혈청을 포함하는 D-PBS buffer에서의 60분간의 배양
- 블로우 오프(blowing off)
- 2x100μl 결합물(1% BSA내 20nM/D-PBS내 5% 염소혈청)과의 60분간의 배양
- D-PBS-T를 이용한 세번의 헹굼
- 블로우 오프
- 2x100μl의 일차 항원(1% BSA내 20nM/D-PBS내 5% 염소혈청)과의 60분간의 배양
- D-PBS-T 를 이용한 세번의 헹굼
- 블로우 오프
- 2x100μl의 이차 항원(1% BSA내 20nM/D-PBS내 5% 염소혈청)과의 60분간의 배양
- D-PBS-T 를 이용한 세번의 헹굼
- 블로우 오프
- 3x200μl의 Hoechst 33342(D-PBS내 2μg/ml)과의 10분간의 배양
- D-PBS-T 를 이용한 세번의 헹굼
- Mowiol/트리에틸렌다이아민(DABCO)에 임베딩(embedding)
현미경 분석
상기 방법에 의해 준비된 절편은 Axiocam HrM과 Axiocam Hrc CCD 카메라 시스템, HXP 120 C 발광장치를 이용하여 역현미경 Axiovert 200으로 평가되었다. 사진은 Axiovision 소프트웨어(버젼 4.8; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하여 분석되었다.
2.3. 단백질- 양자점 결합물
항원감지를 위하여 하기 표6에 있는 양자점들이 준비되었다.
결합물 QDBP-655 양자점의 종류 리간드 QDBP/리간드 비율
Q 561 #773780 SI6166 N/A
Q_CA19-9-20 #773780 MBP-NS-19-9-scFv-His6 + SI6166 1:50
Q_CEA/CA19-9_9 Q561 MBP-NS-19-9-scFv-His6 + SI6166 1:10
Q_CEA/CA19-9_10 Q561 MBP-NS-19-9-scFv-His6 + SI6166 1:20
Q_CEA/CA19-9_11 Q561 MBP-NS-19-9-scFv-His6 + SI6166 1:30
Q_CEA/CA19-9_12 Q561 MBP-NS-19-9-scFv-His6 + SI6166 1:40
Q_CEA/CA19-9_13 Q561 MBP-NS-19-9-scFv-His6 + SI6166 1:50
Q_CEA/CA19-9_1 Q561 MBP-NS-19-9-scFv-His6 + SI6166 1:50
Q561 결합물은 양자점 QDBP-655 (배치 #773780 )과 리간드 SI6166과의 결합물이다. QDBP-655는 6nm의 유체역학적 직경을 가지며 Ni-NIA 리간드를 소유한다. 리간드 SI6166은 CEA- 결합 단백질로 2.1nm의 유체역학적 직경을 갖고, 최종 결합물은 10.1nm의 유체역학적 직경을 갖는다. 항 CEA단백질은 양자점에 연결되어 있다.
양자점 Q_CA19-9-x는 양자점 QDBP-655 (배치 #773780)와 항-CA 19-9 항체 "MBP-NS-19-9-scFv-His6"와의 결합물이다. 상기 항-CA 19-9 항체는 재조합 항체로 중연쇄의 가변영역과 경연쇄로 이루어지고 "가변영역의 단일 사슬 조각(scFv)"으로 서술될 수 있다. 상기 scFv 조각은 양자점과의 결합에 이용되는 His-태그와 결합할 수 있다. 항-CA 19-9 항체 "MBP-NS-19-9-scFv-His6"는 SI6950으로 표시될 수 있다.
양자점 Q_CEA/CA19-9_x는 이중특이결합물로, 항-CEA항원 SI6166을 품는 양자점 Q561은 항-CA 19-9 항체 SI695과 결합할 수 있다.
결합물 Q_CEA/CA19-9_x의 다양한 배치들은 양자점과 리간드의 다른 비율에 따라 준비되었다 (표6의 마지막 열을 참조).
3. CA19-9 결합 나노입자 의 결과
3.1. HT29 세포
도4의 상좌 패널에서 보이는 바와 같이, 양자점 Q_CA19-9-3은 HT29세포의 세포벽을 표지한다. Alexa Fluor 488 형광으로 탐지되는 항CA19-9 항체를 이용한 세포의 염색은 (상우 패널) 결합의 특이성을 나타내는 시그널의 완벽한 공통적 위치를 나타낸다. 하우 패널의 세포는 차별적 간섭 대조(DIC) 현미경을 통하여 보여지고 있다.
음성대조군으로는 MBP(MBP-His/QDP655)과 결합된 양자점이 이용되었다. 도5의 상좌 패널에 보인 바와 같이, 아무런 표지도 감지되지 않았다. CA19-9 항원의 존재는 항-CA-19-9로 세포를 염색하여Alexa Fluor 488 형광으로 탐지될 수 있다(상우 패널).
CA19-9항원의 특이적 표지는 적정법 실험을 통하여도 볼 수 있다. 도6에 보인 바와 같이, 결합물 Q_CA19-9_3의 증가하는 양은 HT29세포의 증가하는 표지로 귀결되며, 이는 상대적 형광도의 증가로 알 수 있다. 이와 반대로, 음성 대조군인 MBP-His/QDP655는 희박한 형광 감지로 귀결되는 바 이는 높은 결합물 농도에서 큰 증가를 보이지 않는다.
CA19-9표지의 특이성은 도7에 보인 바와 같은 경쟁실험에 의하여 확인되었다: 표지 혼합물에 더해지는 증가하는 양의 자유 CA19-9 항원은 CA19-9 표지의 감소로 귀결된다.
3.2. Colo29 세포
도8의 상좌패널에 보이는 바와 같이, 결합물 Q_CA19-9-3은 Colo29 세포의 세포막을 표지한다. Alexa Fluor 488 형광으로 탐지되는 항-CA19-9항체(상우 패널)로 염색된 세포는 결합물의 결합의 특이성을 보이는 시그널의 완벽한 공통적 위치를 나타낸다. 하우 패널의 세포는 차별적 간섭 대조(DIC) 현미경을 통하여 보여지고 있다.
음성대조군으로는 MBP에 결합된 양자점 (MBP-His/QDP655) 사용되었다. 도9의 상좌에 보이는 바와 같이 아무런 표지도 발견되지 않았다. CA19-9항원은 항-CA-19-9항체를 이용하여Alexa Fluor 488 형광으로 탐지되는 방법으로 세포 염색 여부가 확인되었다(상우 패널).
3.3. SW116세포
도10의 상좌패널에 보인 바와 같이, 결합물 Q_CA19-9-3은 Colo29 세포의 세포벽을 표지한다. Alexa Fluor 488 형광으로 탐지되는 항-CA19-9항체를 이용한 세포의 염색은 (상우 패널) 결합의 특이성을 보여주는 시그널의 완벽한 공통위치를 나타낸다. 하우 패널의 세포는 차별적 간섭 대조(DIC) 현미경을 통하여 보여지고 있다.
음성대조군으로는 MBP에 결합된 양자점 (MBP-His/QDP655) 사용되었다. 도11의 상좌에 보이는 바와 같이 아무런 표지도 발견되지 않았다. CA19-9항원은 항-CA-19-9항체를 이용하여Alexa Fluor 488 형광으로 탐지되는 방법으로 세포 염색 여부가 확인되었다(상우 패널).
4. 이중특이적인 나노입자 의 결합 결과
본 실험에서는 이중특이적인 결합을 하는 나노입자가 주어진 표적에 대하여 두개의 항원에 대하여 작용하는 능력을 테스트하고자 하였다. 이러한 목적으로 각 항-CA19-9 항체나 항 CEA항체와 결합된 나노입자는상기 서술된 샘플 35번의 암조직의 해당 항원을 탐지하기 위하여 사용되었다. 특이성은 자유 표적인 MBP-CEA 와 19-9를 이용한 억제를 통해 설명되었다.
도12의 상좌에 보이는 바와 같이, 이중특이적인 나노입자는 암조직의 세포막을 표지하였다. 항-CA19-9 항체나 항 CEA항체를 이용한 암 조직의 염색은 나노입자의 각 경우 완벽한 나노입자의 표지 프로파일에 결합하는 부분적 공통위치를 나타내었다.
이중특이적 나노입자가 자유 표적인 MBP-CEA와 함께 사용될 경우, 항-CA19-9 항체(도 12참조, 상우 패널 참조)의 표지와의 완벽한 공통위치적 표지를 관찰할 수 있다. 따라서, 자유 표적은 세포 의존적인 CEA와의 상포작용을 억제하지만 CA19-9는 여전히 표지를 가능케 한다.
도12의 하좌 패널에 보이는 바와 같이, 자유 표적인 Sialyl-Lewisa 의 추가는 세포의 CA19-9항원과의 상포작용을 억제하지만, 여전히 CEA 표지는 가능케 한다.
최종 실험에서 이중특이적 나노입자는 각 자유 타켓, MBP-CEA와 Sialyl-Lewisa와 모두 결합되었다 (도12의 하좌 패널 참조). 결과적으로 표지는 완벽히 억제되었다 (도12의 하우 패널 참조). 두 항원의 공통위치적 발현은 각 항-CEA와 CA19-9항체를 이용한 염색을 통해 확인되었다.
[ 실시예 3] 친화도 순위에 따른 CD44ex9 - 결합 단백질의 특성
서언
실시예1의 효모단백질잡종법으로 감지되는 CD44ex9-결합 단백질은 친화도 순위를 얻기 위한 두가지 다른 친화도 실험에 의하여 추가적으로 분석되었다.
방법:
첫번째 실험으로는 가선별분석이 사용되며 하기와 같이 수행되었다: 두개의 다른 펩티드의 친화도를 비교하기 위하여 첫번째나 두번째 펩티드를 발현하는 세포 콜로니는 각각 아가 플레이트의 반에 접종되었다. 콜로니를"힛 (hit)"으로 정의하는 한계값은 첫번째 펩티드의 콜로니의 미리 결정한 어떠한 퍼센테이지가 플레이트의 대조영역에서 "힛"으로 선택하면서 결정되었다. 동일한 실험에서, 두번째 실험에서, 두번째 펩티드의 콜로니가 스캔되고 선택되었다. 두번째 펩티드의 콜로니의 숫자는 첫번째 펩티드의 콜로니의 숫자와 비교되어 퍼센테이지로 표현되었다. 이러한 퍼센테이지에 기하여 상대적인 상호작용의 세기 (즉, CD44 펩티드에의 친화력)이 도출될 수 있었다.
FDG 분석은 효모단백질잡종법의 리포터 시스템에 기반한다. 여기서 CD44v5 펩티드와 GAL4- 결합 영역은 GAL4-활성 영역에 결합된 각 펩티드들과 상호작용한다. 결합물을 형성한 후에는 두개의 독립적인 리포터 유전자가 활성화되며, 첫번째 유전자는 형광 단백질을 암호화하고, 두번째 리포터 유전자는 효소 활성이 형광물질 Fluroscein 다이-베타-D-갈락토피라노사이드(FDG)에 의하여 결정되는 베타-갈락토시데이즈를 암호화한다.
가선별분석 실험에서 각 리포터 시스템은 하기와 같이 고려된다: 처음에 엔도젠 리포터 유전자의 형광이, 그 후에는 형광물질과 배양되는 두번째 효소-암호화 리포터 유전자의 활성이다. 여기서 두가지 다른 리포터 유전자의 결과는 하나의 실험 내에서 모두 측정될 수 있다.
도 13에서 16에 보인 바와 같이, 서열번호 1에서 5의 다섯가지 펩티드 중 두개의 10가지 조합은 가선별분석과 FDG 분석으로 병력적으로 비교되었다. 여기서 두개의 독립적인 실험이 도13에서 도16에 보인 바처럼 수행되었다.
결과:
양 실험에서 모두 펩티드 B(서열번호 3)가 CD44v5펩티드에 대하여 가장 높은 친화도를 보였으며, 펩티드 C,D가 뒤를 이었다. 전체적인 친화도 순위의 요약은 도17에 기재되어 있다.
[ 실시예 4] 삭제에 의한 CD44ex9 -결합 단백질의 특성
서언:
펩티드의 결합 영역을 확인하기 위하여 다섯가지의 펩티드에 대하여 삭제에 기반한 에피토프(epitope) 매핑(mapping)이 수행되었다. 결과는 CD44v5 관련 치료 및 진단의 발달을 위하여 중요한 정보를 포함하고 있다.
방법:
A에서 E에 이르는 다섯가지 모두의 펩티드에 대하여, 삭제 변이가 진행되고 PHP 와 FDG 분석이 수행되었다. 펩티드 A, C, D 그리고 E에 대하여, N이나 C 말단의 삭제된 조각이 형성되었고 이는 펩티드 A1, C1, D1 그리고 E1으로 명명되었다. 펩티드 A, C; D 그리고 E의 삭제 변이의 서열은 도18에 기재되어 있다.
펩티드 B에 대하여는, 펩티드 B1에서 B4의 삭제 변이가 형성되었고 이는 도19에 기재되어 있다. 펩티드들은 PHP와 FDG 분석에 의하여 비교적으로 실험되었다.
결과:
펩티드 B에 대하여, N말단의 18 아미노산(펩티드 B1)의 삭제는 활성을 조금 감소시켰다 (도19, 오른편 참조). 따라서 상기 N말단은 CD44v5펩티드와의 상호작용에 있어서 크게 중요성이 없고 따라서 펩티드 B1은CD44v5와의 상호작용에 있어서 중심적인 서열로 대표된다.
도19에 보인 바와 같이, N과 C말단의 삭제(펩티 드 B4), C 말단만의 삭제(펩티드 B2), 그리고 중심 서열 "QLSFEVQWETS"(펩티드 B3)의 삭제는 CD44v5와 결합하는 능력을 완전히 잃게 한다. 상기 결과는 펩티드B1의 프로필이 적어도 중심 서열과 C말단 부분이 CD44v5 결합에 있어서 필요하다는 것과 완전히 일치한다.
펩티드 A1과 C1은 그들의 부모 펩티드인 펩티드 A, C와 C말단의 모티프 "AIE"의 공통서열을 포함하는 3에서 8개의 아미노산 서열이 없다는 점에서 다르다. 양측의 경우 공통서열의 이러한 부분의 연관성 측면에서 CD44v5에의 결합이 거의 발생하지 않는다.
펩티드 D1과 E1은 그들의 부모 펩티드인 펩티드 D, E와 N말단의 모티프 "PYYGKXLXX"의 공통서열이 없다는 점에서 다르다. 양측의 경우 CD44V5와의 결합이 방해받지 않는다. 펩티드 D1은 유사한 친화력을 보이는 반면, 펩티드 E1 은 CD44v5에 대하여 부모 펩티드 E에 비하여 더욱 강한 결합력을 보인다.
이러한 결과는 상기 기재된 펩티드 B에 대한 결과와 완벽하게 일치한다. CD44v5결합을 위하여 N 말단 영역은 필수적이지 않고, 짧아진 펩티드와 그의 중심의 되는 공통서열은 CD44v5 연관의 진단과 치료에 있어서 바람직한 펩티드 모티프가 된다.
[ 실시예 5] 알라닌 스캐닝을 통한 CD44 ex9 -결합 단백질의 특성
서언:
가장 친화력이 있는 펩티드 B에 대하여 CD44v5 결합에 있어 중요한 아미노산을 확인하게 위하여 중심 시퀀스의 알라닌 스캔이 수행되었다. 변이된 펩티드 B3를 통하여 알 수 있듯이, 중심 서열 "QLSFEVQWETS"의 존재는 CD44v5 결합을 위하여 필수적이다.
방법:
펩티드B는 11개의 변이체를 생성시키기 위하여 이용되었으며, 중심 서열 "QLSFEVQWETS" 의 모든 아미노산이 알라닌 아미노산으로 대체되었다(도20참조). 이러한 변이체들은 PHP와 FDG분석에서 펩티드 B와 비교하여 분석되었다. A에서 D에 이르는 다섯가지의 모든 펩티드들에 대하여 삭제 변이가 형성되고 PHP와 FDG 분석에 의하여 분석되었다.
결과:
도20에 보인 바와 같이 공통서열의 처음 열개의 아미노산의 대체는 CD44v5에 대한 친회력에 큰 영향을 주지 않는다. 그러나, 11번째 아미노산 세린을 알라닌으로 대체한 경우에 펩티드는 큰 친화력을 보였다.
따라서, 중심서열 내에는 CD44v5 결합에 중요한 단 하나의 아미노산은 없지만, 이러한 아미노산들은 표적과 대등한 방법으로 결합한다는 것이 가정되어야 한다.
그러나 결과에 따르면, 더욱 향상된 기능의 펩티드 B와 11번째 아미노산인 세린-알라닌 교환의 더욱 향상된 기능의 공통서열이 확인되었다 (서열번호 58에서 62번의 공통서열 참조).
[ 실시예 6] 이형의 CD44에 대한 CD44ex9 - 결합단백질의 결합분석
도21에 보인 바와 같이, v5영역과 다른 영역을 조합하여 포함하는 각 다른 4종류의 이형 CD44가 형성되었다. PHP와 FDG분석에 의해 드러난 바와 같이, 본 발명의CD44ex9-결합단백질은 이러한 이형 CD44와 결합할 수 있었다. 음성대조군으로 이형 CD44인 pGKT7_CD44가 이용되었고, 이는 영역 1에서 5, 그리고 15,16 만을 암호화하였다 (자료 없음). 예상대로CD44ex9-결합단백질은 이러한 CD44 단백질과는 결합하지 않는다.
[ 실시예 7] CD44ex9 - 결합단백질에 결합된 나노입자의 체외 배양된 CD44v5 -발현 암세포와의 결합분석
CD44ex9-결합단백질의 진단 및 치료적 잠재력을 알아보기 위하여, 펩티드 A,B,C는 His 태그를 포함하는MBP-융합 단백질로서 발현되었고 양자점에 연결되었으며 CD44-발현 암세포의 면역세포화학적분석에 사용되었다.
방법:
상기 단백질들은 대장균에서 MBP-(YTH_v5_A/B/C)-His6 융합 단백질로 발현되었고, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피로 정제된 후 His6 태그를 통하여 QDBP-655양자점에 연결되었다. 상기 양자점들은 CdSe 코어, ZnS 껍질과 이미다졸 성분을 지닌 부동화막을 가지고 있다.
상기 QDBP-655나노입자의 특성은 하기와 같이 요약될 수 있다:
상기 나노입자는 카드뮴셀레나이드(CdSe) 중심과 징크설파이드(ZnS) 껍질을 가지고 있다. 껍질은 글라이신-히스티딘, 히스티딘-류신, 카르노신, 아미노벤조페논과 3-[트리스(하이드록시메틸)포스포니오]프로피오네이트(THPP)를 통해 교차결합된 아미노- PEG(폴리에틸렌글라이콜)로 구성되는 디펩티드에 의해 둘러쌓여 있다. 디펩티드 코팅은 그의 이미다졸 링이 껍질 구조의 아연 이온에 대등하게 결합되어 있다. 자유 일차 아미노 그룹은 커플링 반응을 위한 디펩티드 코팅에 사용될 수 있다. 디펩티드 코팅에 관련된 추가적 정보는 US 2003/0059635 A1특허에 기재되어 있다.
QDBP-655는 Life Technologies Corporation (Eugene, Oregon, USA)사에 의해 판매되고 있다. 이것은 붉은 콜로이드의 현택액으로 완충액에 포함되어 운반이 되고 있다. 나노입자는 하기와 같은 제품 특성을 갖는다:
외관: 붉은색 맑은 용액
유체역학적 지름: ≤6.5nm (사이즈 배제 크로마토그래피로 결정됨)
분자량: 1000kDa
방사최대량: 655nm±4nm
커플링:
발현되고 친화-정제된 펩티드 A, B 또는 는 2시간 동안 50mM의 소듐보레이트 pH=8.3에 대하여 투석된다(Slide A-Lyzer Mini Dialysis Unit-10kDa;(Thermo Fisher, Rockford, IL, USA). 이후 단백질 농축이 얻어지고, 용액은 필요한 농도에 따라 희석된다. QDBP-655 양자점과 단백질은 함께 혼합되어 1:12.5, 1:25, 1:50, 1:75, 1:100의 QDBP-655/리간드 비율로 살균된 보로실리케이트 바이얼에 최종 농도 0.3μM(QDBP-655)에 따라 형성되며, 하기 표7에 요약되어 있다.
Q_CD44v5 QDBP/L nQDBP -655 cQDBP -655 VQDBP -655 VLigand nLigand cLigand
_X1 1:- 78 pmol 3.9 pmol 20μl 240μl - -
_X2 1:12.5 78 pmol 3.9 pmol 20μl 240μl 975 pmol 4.06 pmol/μl
_X3 1:25 78 pmol 3.9 pmol 20μl 240μl 1950 pmol 8.125 pmol/μl
_X4 1:50 78 pmol 3.9 pmol 20μl 240μl 3990 pmol 16.25 pmol/μl
_X5 1:75 78 pmol 3.9 pmol 20μl 240μl 5850 pmol 24.4 pmol/μl
_X6 1:100 78 pmol 3.9 pmol 20μl 240μl 7800 pmol 32.5 pmol/μl
성공적인 커플링은 SDS-아가로즈 젤 전기이동으로 나타나며, 여기서 1:50 이상의 비율은 분자량의 현저한 증가로 이어지며 성공적인 커플링 작용이 된다.
면역세포화학적 분석
암세포의 면역세포화학적 분석은 하기와 같이 수행되었다:
·각 5x105 암세포가 코팅 유리에 놓인다
·37°C, 5% 이산화탄소에서 48시간 동안 배양된다
·1분간 1mL D-PBS로 세번의 세척을 한다
·1ml 다이메킬수버이미데이트(DMS) 용액(250ml 트리스-염산, 20mM 염화칼슘, pH 8.0)으로 20분간 고정한다
·1mL D-PBS로 1분간 세포를 세척한다
·D-PBS 내 글라이산 0.2% 을 이용한 20분의 배양을 통한 담금질을 한다
·1% BSA/D-PBS 내 5% 염소 혈청dmf 이용한 60분의 블로킹 배양
·상온에서 50μl의 사전배양된 Qdot-펩티드 결합물 (100nM)과 배양
·1mL D-PBS를 이용하여 5분간 3번 세척한다
·50μl의 1차 항체(항-CD44v5: VFF-7, 1:25)와의 배양
·1mL D-PBS를 이용하여 5분간 3번 세척한다
·50μl의 22차 항체(GAM-A488, 1:100)와의 배양
·1mL D-PBS를 이용하여 5분간 3번 세척한다
·10분간 300μl의 Hoescht 33342(DPS내 200ng/ml)를 이용한 대조염색
·1mL D-PBS를 이용하여 5분간 3번 세척한다
·Mowiol4-88에 삽입 (Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA)
결과:
펩티드 A,B,C에 연결된 나노입자는 인간 결장암세포주인 HCP-116(도22 참조)를 이용하여 실험되었다. 펩티드와 결합된 나노입자을 이용할 경우 암 세포의 표지는 양성 대조군으로서의 항-CD44v5 항체를 이용한 표지와 공통적 위치로 발견되었다.
<110> Endosignals Medizintechnik GmbH <120> CD44 binding peptides <130> 12978-PT-WO <160> 62 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Pro Gly Val Pro Gly Val Gln Leu Thr Ala Asn Thr Gln Ser Leu Val 1 5 10 15 Leu Met Ser Ala Phe Asp Ile Ala Ile Glu Val Thr Phe Ile Ser Ser 20 25 30 <210> 2 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Pro Gly Leu Gln Ile Ser Phe Ala Val Gln Val Pro Val Ser Val Gln 1 5 10 15 Glu Ser Ser Pro Ser Val Gln Glu Gly Ile Gln Ile Gln Val Ala Ile 20 25 30 Glu <210> 3 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Pro Gly Gly Asp His Glu Arg Ala Pro Ala Ser Cys Tyr Asn Gly Glu 1 5 10 15 Arg Leu Ser Ser Gln Leu Ser Phe Glu Val Gln Trp Glu Thr Ser Glu 20 25 30 Thr Leu Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val 35 40 45 Tyr Asp Pro Pro Cys 50 <210> 4 <211> 66 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Gly Pro Tyr Tyr Gly Lys Lys Leu His Val Gly Tyr Leu Gln Pro 1 5 10 15 Leu Ala Ala Val Gln Val Ser Phe Ala Pro Asn Asn Thr Gly Lys Glu 20 25 30 Val Thr Val Glu Cys Lys Ile Asp Gly Ser Ala Asn Leu Lys Ser Gln 35 40 45 Asp Asp Arg Asp Lys Phe Leu Gly Arg Val Met Phe Lys Ile Thr Ala 50 55 60 Arg Ala 65 <210> 5 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Gly Lys Leu Leu Gln Pro Lys Tyr Leu Gln Pro 1 5 10 15 Leu Leu Ala Val Gln Phe Thr Asn Leu Thr Met Asp Thr Glu Ile Arg 20 25 30 Ile Glu Cys Lys Ala Tyr Gly Glu Asn Ile Gly Tyr Ser Glu Lys Asp 35 40 45 Arg Phe Gln Gly Arg Phe Asp Val Lys Ile Glu Val Lys Ser 50 55 60 <210> 6 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Pro Tyr Tyr Gly Lys Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Pro Ser Phe 1 5 10 15 Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu 35 <210> 7 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Pro Tyr Tyr Gly Lys Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Pro Ser Phe 1 5 10 15 Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu 35 <210> 8 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Pro Tyr Tyr Gly Lys Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Pro Ser Phe 1 5 10 15 Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu 35 40 <210> 9 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Pro Tyr Tyr Gly Lys Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Pro Ser Phe 1 5 10 15 Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu 35 40 <210> 10 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Pro Tyr Tyr Gly Lys Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Gln Pro Ser Phe 1 5 10 15 Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu 35 40 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asp Val Asp Arg Asn Gly Thr Thr Ala Tyr Glu Gly 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Val Asp Arg Asn Gly Thr Thr Ala Tyr Glu Gly Asn 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Asp Arg Asn Gly Thr Thr Ala Tyr Glu Gly Asn Trp 1 5 10 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Arg Asn Gly Thr Thr Ala Tyr Glu Gly Asn Trp Asn 1 5 10 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Asn Gly Thr Thr Ala Tyr Glu Gly Asn Trp Asn Pro 1 5 10 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Thr Thr Ala Tyr Glu Gly Asn Trp Asn Pro Glu 1 5 10 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Thr Thr Ala Tyr Glu Gly Asn Trp Asn Pro Glu Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Thr Ala Tyr Glu Gly Asn Trp Asn Pro Glu Ala His 1 5 10 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ala Tyr Glu Gly Asn Trp Asn Pro Glu Ala His Pro 1 5 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Tyr Glu Gly Asn Trp Asn Pro Glu Ala His Pro Pro 1 5 10 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Glu Gly Asn Trp Asn Pro Glu Ala His Pro Pro Leu 1 5 10 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gly Asn Trp Asn Pro Glu Ala His Pro Pro Leu Ile 1 5 10 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Asn Trp Asn Pro Glu Ala His Pro Pro Leu Ile His 1 5 10 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Trp Asn Pro Glu Ala His Pro Pro Leu Ile His His 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Asn Pro Glu Ala His Pro Pro Leu Ile His His Glu 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Pro Glu Ala His Pro Pro Leu Ile His His Glu His 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Glu Ala His Pro Pro Leu Ile His His Glu His His 1 5 10 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Ala His Pro Pro Leu Ile His His Glu His His Glu 1 5 10 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 His Pro Pro Leu Ile His His Glu His His Glu Glu 1 5 10 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Pro Pro Leu Ile His His Glu His His Glu Glu Glu 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Pro Leu Ile His His Glu His His Glu Glu Glu Glu 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Leu Ile His His Glu His His Glu Glu Glu Glu Thr 1 5 10 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Ile His His Glu His His Glu Glu Glu Glu Thr Pro 1 5 10 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 His His Glu His His Glu Glu Glu Glu Thr Pro His 1 5 10 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 His Glu His His Glu Glu Glu Glu Thr Pro His Ser 1 5 10 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Glu His His Glu Glu Glu Glu Thr Pro His Ser Thr 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 His His Glu Glu Glu Glu Thr Pro His Ser Thr Ser 1 5 10 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 His Glu Glu Glu Glu Thr Pro His Ser Thr Ser Thr 1 5 10 <210> 39 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Pro Gly Gln Leu Ser Phe Glu Val Gln Trp Glu Thr Ser Glu Thr Leu 1 5 10 15 Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp 20 25 30 Pro Pro Cys 35 <210> 40 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Pro Gly Ala Leu Ser Phe Glu Val Gln Trp Glu Thr Ser Glu Thr Leu 1 5 10 15 Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp 20 25 30 Pro Pro Cys 35 <210> 41 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Pro Gly Gln Ala Ser Phe Glu Val Gln Trp Glu Thr Ser Glu Thr Leu 1 5 10 15 Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp 20 25 30 Pro Pro Cys 35 <210> 42 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Pro Gly Gln Leu Ala Phe Glu Val Gln Trp Glu Thr Ser Glu Thr Leu 1 5 10 15 Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp 20 25 30 Pro Pro Cys 35 <210> 43 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Pro Gly Gln Leu Ser Ala Glu Val Gln Trp Glu Thr Ser Glu Thr Leu 1 5 10 15 Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp 20 25 30 Pro Pro Cys 35 <210> 44 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Pro Gly Gln Leu Ser Phe Ala Val Gln Trp Glu Thr Ser Glu Thr Leu 1 5 10 15 Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp 20 25 30 Pro Pro Cys 35 <210> 45 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Pro Gly Gln Leu Ser Phe Glu Ala Gln Trp Glu Thr Ser Glu Thr Leu 1 5 10 15 Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp 20 25 30 Pro Pro Cys 35 <210> 46 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Pro Gly Gln Leu Ser Phe Glu Val Ala Trp Glu Thr Ser Glu Thr Leu 1 5 10 15 Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp 20 25 30 Pro Pro Cys 35 <210> 47 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Pro Gly Gln Leu Ser Phe Glu Val Gln Ala Glu Thr Ser Glu Thr Leu 1 5 10 15 Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp 20 25 30 Pro Pro Cys 35 <210> 48 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Pro Gly Gln Leu Ser Phe Glu Val Gln Trp Ala Thr Ser Glu Thr Leu 1 5 10 15 Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp 20 25 30 Pro Pro Cys 35 <210> 49 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Pro Gly Gln Leu Ser Phe Glu Val Gln Trp Glu Ala Ser Glu Thr Leu 1 5 10 15 Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp 20 25 30 Pro Pro Cys 35 <210> 50 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Pro Gly Gln Leu Ser Phe Glu Val Gln Trp Glu Thr Ala Glu Thr Leu 1 5 10 15 Lys Ile Leu Val Lys Pro Leu Val Phe Val Cys Arg Glu Val Tyr Asp 20 25 30 Pro Pro Cys 35 <210> 51 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Pro Gly Gln Pro Leu Ala Ala Val Gln Val Ser Phe Ala Pro Asn Asn 1 5 10 15 Thr Gly Lys Glu Val Thr Val Glu Cys Lys Ile Asp Gly Ser Ala Asn 20 25 30 Leu Lys Ser Gln Asp Asp Arg Asp Lys Phe Leu Gly Arg Val Met Phe 35 40 45 Lys Ile Thr Ala Arg Ala 50 <210> 52 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Pro Gly Leu Gln Pro Leu Leu Ala Val Gln Phe Thr Asn Leu Thr Met 1 5 10 15 Asp Thr Glu Ile Arg Ile Glu Cys Lys Ala Tyr Gly Glu Asn Ile Gly 20 25 30 Tyr Ser Glu Lys Asp Arg Phe Gln Gly Arg Phe Asp Val Lys Ile Glu 35 40 45 Val Lys Ser 50 <210> 53 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu 20 25 <210> 54 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu 20 25 30 <210> 55 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu 20 25 30 <210> 56 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu 20 25 30 <210> 57 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ser Xaa Gln 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile 20 25 30 Glu <210> 58 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ala Xaa Gln 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu 20 25 <210> 59 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ala Xaa Gln 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu 20 25 30 <210> 60 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ala Xaa Gln 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu 20 25 30 <210> 61 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ala Xaa Gln 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Glu 20 25 30 <210> 62 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Pro Gly Leu Gln Pro Ser Phe Ala Val Gln Val Xaa Xaa Ala Xaa Gln 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile 20 25 30 Glu

Claims (24)

  1. 인간 CD44(CD44ex9)의 엑손9에 의하여 암호화되는 폴리펩티드에 결합하는 단백질. 여기서, 상기 단백질은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로써 구성된다.
    (ⅰ) 서열번호 1 에서 5번, 그리고 서열번호 39 에서 52번의 아미노산 서열; 또는
    (ⅱ) 서열번호 1에서 5번, 그리고 서열번호 39 에서 52번의 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (ⅲ) 서열번호 6에서 10번에 기재된 서열: "PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQX10-14AIE" 또는 서열번호 53에서 62번에 기재된 서열: "PGLQPSFAVQVX2 S/AXQX10-14AIE"로 정의되는 CD44-결합 모티프와 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열이고, 상기 X는 임의의 아미노산을 나타내며;
    상기 단백질은 100개 이하의 아미노산 길이를 갖는 단백질.
  2. 청구항 제1항에 있어서, 상기 CD44ex9-결합 단백질은, 상기 단백질은 엑손9에 의하여 암호화되는 영역을 포함하는 CD44 동형단백질에 결합하는 단백질.
  3. 청구항 제2항에 있어서, 상기 CD44ex9-결합 단백질은 하기 CD44 동형단백질의 목록에서 선택되는 단백질:
    (ⅰ) CD44v5
    (ⅱ) CD44v5-v6
    (ⅲ) CD44v3-v6
    (ⅳ) CD44v3-v6
    (ⅴ) CD44v2-v10
    (ⅵ) CD44v3-v10
    (ⅶ) CD44v4-v7
    (ⅷ) CD44v4-v10
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD44ex9-결합 단백질은 이종의 단백질 또는 폴리펩티드와 결합되거나 융합되는 단백질로서, 전구체 분자로부터 세포독성이 있거나 세포증식을 억제하는 물질을 생성하나 단백질에 표지를 부착하는 촉매작용을 하는 효소.
  5. (ⅰ) 제1항에서 제4항 중 어느 하나의 CDex44ex9-결합 단백질;
    (ⅱ) 탄수화물, 염색료 분자, 방사성 동위 원소, 독소, 세포분열억제제, 싸이토카인, 면역조절제 또는 그의 전구약물체의 그룹에서 선택되며, CD44ex9-결합 단백질과 직접적으로 또는 링커분자를 통하여 연결되는 화합물로 이루어지는 결합물.
  6. 제1항 내지 제4항의 CD44ex9-결합 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  7. 제6항의 핵산 분자의 서열을 포함하는 발현 벡터.
  8. 제7항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 CD44ex9-결합 단백질의 생산 방법으로 하기 단계를 포함하는 방법:
    (ⅰ) 제1항 내지 제4항의 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 발현 구조물을 이용하여 숙주 세포를 형질전환하는 단계; 및
    (ⅱ) CD44ex9-결합 단백질이나 해당 융합 단백질 생산에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 CD44ex9-결합 단백질에 결합하는 나노입자.
  11. 제4항 또는 제5항의 결합 단백질 또는 융합 단백질에 결합하는 나노입자.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 나노입자는 하나 이상의 암 항원-결합 물질 또는 세포독성 물질에 추가적으로 결합된 나노입자.
  13. 제12항에 있어서, 상기 암 항원-결합 물질은 CEA에 대한 항체, CA-19-9에 대한 항체, 바람직하게는 변형된 어드헤신 및 이들의 조합 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 것을 특징으로 하는 나노입자.
  14. 제10항 내지 13항 중 어느 항에 있어서, 상기 나노입자는 양자점, 귀금속 클러스터, 초상자성 철 산화물의 나노입자 (IONPs), 블록혼성중합체 미셀, 나노셀, 덴드리머, 나노튜브, 폴리머좀, XPclad® 나노입자, 크리스탈 발광성 칼슘 포스페이트 층으로 둘러쌓인 무정형 실리카로 이루어진 나노입자, 100nm 미만의 지름을 갖는 SiO2/Zn2SiO4:Mn2 +와 SiO2/Ca10(PO4)6OH:EU3 + 의 코어쉘 나노입자, 및 형광 염료로 표지된 잡종 나노입자 중에서 선택되는 어느 하나의 나노입자.
  15. 제10항 내지 제13항에 있어서, 상기 나노입자는 무기질 중심과 이미다졸 성분을 포함하는 코팅층을 가지며, 코팅층을 포함하는 가장 작은 무기질 중심의 지름이 15nm 이하인 나노입자.
  16. 제15항에 있어서, 상기 이미다졸 성분은 하나 이상의 히스티딜 잔기로 구성되는 펩티드이며 바람직하게는 디펩티드인 나노입자.
  17. 제16항에 있어서, 상기 이미다졸 성분은 다른 종류의 히스티딜을 포함하는 디펩티드의 혼합물인 나노입자.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자는 비활성이 아닌 나노입자.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항 또는 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서 상기 CD44ex9-결합 단백질이나 나노입자는,
    인슐린 의존적 당뇨병, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루푸스와 같은 자가 면역성 질환; 건선, 아토피성 피부질환; 류마티드 관절염 이나 염증성 대장질환과 같은 만성 염증성 질환; 조직 괴사; 알러지 및 암으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 질환의 진단 및 치료용 단백질 또는 나노입자.
  20. 제19항에 있어서 상기 CD44ex9-결합 단백질 또는 나노입자는 대조작용제 용도를 갖는 것이 특징인 단백질 또는 나노입자.
  21. 제20항에 있어서, 상기 대조작용제는 암세포나 제자리암종의 감지용도를 갖는 것이 특징인 단백질 또는 나노입자.
  22. 제21항에 있어서, 상기 암세포는 하기 암 중에서 선택되는 어느 하나의 암세포이다:
    (ⅰ) 선암;
    (ⅱ) 흉선상피세포종;
    (ⅲ) 자궁암세포종;
    (ⅳ) 비호지킨 림프종;
    (ⅴ) 폐암세포종;
    (ⅵ) 췌장암세포종; 그리고
    (ⅶ) 암줄기세포
  23. 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 CD44ex9-결합 단백질, 또는 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 나노입자 및 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함하는 약학적 조성물.
  24. 하기로 이루어진 약물 및 약량계 조성물 패키지:
    (ⅰ) 개별적으로 복용될 수 있는 약물, 및
    (ⅱ) 작용, 부작용, 상호작용, 대사, 흡수, 분배, 환자에게 투여되기 위한 약물의 대사 및 제거와 연관되는 환자 특이적 특성을 위한 진단적 지표계 시스템. 여기서 상기 환자 특이적 특성은 내생의 물질, 조절 메카니즘, 유전자나 지표 시스템에서 선택되는 것이며,
    상기 약물이나 진단적 지표계 시스템은 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 CD44ex9-결합단백질이나 제10항 내지 제18항 중 어느 하나의 나노입자를 포함한다.
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