CN102245632B

CN102245632B - Muc-1胞质结构域肽作为癌症的抑制剂

Info

Publication number: CN102245632B
Application number: CN200980149998.9A
Authority: CN
Inventors: D·W·库弗; S·克哈班达
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc; Genus Oncology LLC
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc; Genus Oncology LLC
Priority date: 2008-10-17
Filing date: 2009-10-16
Publication date: 2018-10-12
Anticipated expiration: 2029-10-16
Also published as: JP2012505922A; KR101689408B1; AU2009305550A1; US9546201B2; ZA201103150B; AU2009305550B2; JP6030622B2; WO2010045586A2; CA2741065C; CA2741065A1; EP2727601B1; DK2352508T3; DE09740811T9; WO2010045586A3; RU2011119606A; ES2395028T1; IL212383A; DE09740811T1; US20120172312A1; US8957185B2

Abstract

本发明提供了来自MUC1胞质结构域的肽及其使用方法。这些肽可抑制MUC1的寡聚化，从而在体内预防肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡和肿瘤组织的坏死。

Description

Muc-1胞质结构域肽作为癌症的抑制剂

发明背景

本申请要求美国临时申请系列号61/106,380(递交日为2008年10月17日)和美国临时申请系列号61/177,109(递交日为2009年5月11日)的权益，在此将所述两个申请的全部内容通过引用而并入。

1.发明领域

本发明涉及细胞生长的调控，更具体而言涉及癌细胞生长的调控。特别地，源自MUC1胞质结构域的特定区域的MUC1肽被显示抑制MUC1的寡聚化和核易位，引起表达MUC1的肿瘤细胞的抑制甚至死亡。

2.相关技术

粘蛋白是被广泛O-糖基化的蛋白质，其主要由上皮细胞表达。被分泌的和膜-结合的粘蛋白形成物理屏障，所述物理屏障保护上皮细胞的顶端边缘免受由存在于与外部环境的接触面的毒素、微生物和其它形式的应激所诱导的损伤。跨膜粘蛋白1(MUC1)还可通过其胞质结构域向细胞内部发信号。除了存在海胆精子蛋白-肠激酶-集聚蛋白(SEA)结构域之外，MUC1与其它的膜-结合粘蛋白没有序列相似性(Duraisamy等人，2006)。在这方面，MUC1被翻译为单一的多肽，然后在SEA结构域处进行自我切割(autocleavage)(Macao，2006)。

MUC1N-末端亚基(MUC1-N)含有可变数目的串联重复，所述串联重复具有高比例的经O-糖基化修饰的丝氨酸和苏氨酸(Siddiqui等人，1988)。MUC1-N延伸超过细胞的多糖包被并通过非共价结合至跨膜的MUC1C-末端亚基(MUC1-C)而被束缚于细胞表面(Merlo，1989)。MUC1-C由58个氨基酸的胞外结构域、28个氨基酸的跨膜结构域和72个氨基酸的与不同信号分子相互作用的胞质结构域组成(Kufe，2008)。MUC1-N脱落进入所述保护性的物理屏障中，留下MUC1-C在细胞表面作为推定的受体以转导引起生长和生存的细胞内信号(Ramasamy等人，2007；Ahmad等人，2007)。

可获得的证据表明人的癌在促进肿瘤发生中利用了MUC1功能。在此情形中，随着转化和极性的丧失，在乳腺癌和其它上皮癌中MUC1以高水平表达在整个细胞表面(Kufe，1984)。其它的工作显示了MUC1的过表达引起了锚定不依赖性生长(anchorage-independent growth)和肿瘤发生(Li等人，2003a；Raina等人，2004；Ren等人，2004；Wei等人，2005)，这至少部分地是通过对β-联蛋白的稳定化作用(Huang等人，2005)。此外，与对于正常上皮细胞的生存功能一致，MUC1的过表达引起了癌细胞对应激诱导的凋亡的抗性(Ren等人，2004；Yin和Kufe，2003；Yin等人，2004；Yin等人，2007)。

至顶端膜的限制的丧失允许了与表皮生长因子受体(EGFR)形成复合物以及对EGFR介导的信号传导的共活化(Li等人，2001；Ramasamy等人，2007)。癌细胞对MUC1的过表达还与MUC1-C在胞质中的聚积以及此亚单位对核(Li等人，2003b；Li等人，2003c)和线粒体(Ren等人，2004；Ren等人，2006)的靶向相关。重要地，MUC1-C的寡聚化对于其核靶向以及与不同效应子的相互作用言是必需的(Leng等人，2007)。例如，MUC1-C胞质结构域(MuC1-CD)作为c-Src(Li等人，2001)，c-Ab1(Raina等人，2006)，蛋白激酶Cδ(Ren等人，2002)和糖原合成酶激酶3β(Li等人，1998)的底物起作用，并且直接与Wnt通路的效应子β-联蛋白(Yamamoto等人，1997；Huang等人，2005)以及p53肿瘤抑制因子(Wei等人，2005)相互作用。因此，虽然寡聚化似乎是重要的，没有直接的证据表明干扰MUC1寡聚体的形成将在肿瘤细胞中有任何有益效果，更没有表明这可以如何被实现。

发明概述

因此，根据本发明，提供了抑制受试者中MUC1-阳性肿瘤细胞的方法，包括向所述受试者施用含有至少4个连续的MUC1残基且不多于20个连续的MUC1残基的MUC1肽，并且所述MUC1肽包含序列CQC，其中CQC的氨基-末端半胱氨酸在其NH₂-端被至少一个氨基酸残基掩盖，所述至少一个氨基酸残基无需对应于天然的MUC-1跨膜序列。所述肽可包含至少5个连续的MUC1残基，至少6个连续的MUC1残基，至少7个连续的MUC1残基，至少8个连续的MUC1残基并且所述序列可更特别地包含CQCR(SEQ ID NO：54)，CQCRR(SEQ ID NO：50)，CQCRRR(SEQ IDNO：51)，CQCRRRR(SEQ ID NO：52)，CQCRRK(SEQ ID NO：4)，或CQCRRKN(SEQ ID NO：53)。所述肽可含有不多于10个连续的MUC1残基，不多于11个连续的MUC1残基，不多于12个连续的MUC1残基，不多于13个连续的MUC1残基，不多于14个连续的MUC1残基，不多于15个连续的MUC1残基，不多于16个连续MUC1的残基，不多于17个连续的MUC1残基，不多于18个连续的MUC1残基或不多于19个连续的MUC1残基。所述肽可与细胞递送结构域(例如聚-D-R、聚-D-P或聚-D-K)融合。所述肽可全包含L氨基酸，全包含D氨基酸或者包含L和D氨基酸的混合。

所述MUC1-阳性肿瘤细胞可以是癌细胞、白血病细胞或骨髓瘤细胞，例如前列腺或乳腺癌细胞。施用可包括静脉内、动脉内、肿瘤内、皮下、局部的或腹膜内施用，或者局部、区域性、全身性或连续施用。抑制可包括诱导所述肿瘤细胞的生长停滞，所述肿瘤细胞的凋亡和/或包含所述肿瘤细胞的肿瘤组织的坏死。所述受试者可以是人。

所述方法还可包括向所述受试者施用第二种抗癌疗法。所述第二种抗癌疗法可以是外科手术、化学疗法、放射疗法、激素疗法、毒素疗法、免疫疗法和冷冻疗法。所述第二种抗癌疗法可在所述肽之前、在所述肽之后或与所述肽同时被施用。所述方法还可包括在施用所述肽之前评估所述受试者的肿瘤细胞中MUC1的表达的步骤和/或所述方法还可包括评估所述肽对于所述受试者的肿瘤中MUC1的表达的影响的步骤。

所述肽可以0.1-500mg/kg/d或10-100mg/kg/d被施用。所述肽可被每天施用，例如施用7天、2周、3周、4周、一个月、6周、8周、两个月、12周或三个月。所述肽可被每周施用，例如施用2周、3周、4周、6周、8周、10周或12周。

在另一个实施方式中，提供了药物组合物，其包含(a)含有至少4个连续的MUC1残基且不多于20个连续的MUC1残基的MUC1肽，并且所述MUC1肽包含序列CQC，其中CQC的氨基-末端半胱氨酸在其NH₂-端被至少一个氨基酸残基掩盖，所述至少一个氨基酸残基无需对应于天然的MUC-1跨膜序列，和(b)药学上可接受的载体、缓冲剂或稀释剂。所述肽可以是至少5、6、7或8个连续的MUC1残基。所述肽可以是不多于10个连续的MUC1残基，不多于11个连续的MUC1残基，不多于12个连续的MUC1残基，不多于13个连续的MUC1残基，不多于14个连续的MUC1残基，不多于15个连续的MUC1残基，不多于16个连续的MUC1残基，不多于17个连续的MUC1残基，不多于18个连续的MUC1残基或不多于19个连续的MUC1残基。所述肽可与细胞递送结构域(例如聚-D-R、聚-D-P或聚-D-K)融合，或与细胞转导结构域(例如HIV tat细胞转导结构域)融合。所述肽的长度可以是至少8个残基，并且至少两个非相邻的残基通过其侧链形成桥。所述桥可包含连接子、经化学修饰的侧链或烃铆合(hydrocarbon stapling)。所述连接子可包含稳定所述肽的α-螺旋结构的修饰。所述缓冲剂可包含β-巯基乙醇、谷胱甘肽或抗坏血酸或其它保持所述肽为单体状态的还原剂。

在另一个实施方式中，提供了抑制细胞内的MUC1-寡聚化和核转运的方法，包括使表达MUC1的细胞与含有至少4个连续的MUC1残基且不多于20个连续的MUC1残基的MUC1肽接触，并且所述MUC1肽包含序列CQC，其中CQC的氨基-末端半胱氨酸在其NH₂-端被至少一个氨基酸残基掩盖，所述至少一个氨基酸残基无需对应于天然的MUC1跨膜序列。所述肽可包含至少5个连续的MUC1残基，至少6个连续的MUC1残基，至少7个连续的MUC1残基，至少8个连续的MUC1残基并且所述序列可更特别地包含CQCR，CQCRR，CQCRRR，CQCRRRR，CQCRRK，或CQCRRKN。所述肽可含有不多于10个连续的MUC1残基，不多于11个连续的MUC1残基，不多于12个连续的MUC1残基，不多于13个连续的MUC1残基，不多于14个连续的MUC1残基，不多于15个连续的MUC1残基，不多于16个连续的MUC1残基，不多于17个连续的MUC1残基，不多于18个连续的MUC1残基或不多于19个连续的MUC1残基。所述肽可与细胞递送结构域(例如聚-D-R、聚-D-P或聚-D-K)融合。所述肽可全包含L氨基酸，全包含D氨基酸或者包含L和D氨基酸的混合。

所述表达MUC1的细胞可以是肿瘤细胞，例如癌细胞、白血病细胞或骨髓瘤细胞，例如前列腺或乳腺癌细胞。所述肿瘤细胞可位于活的受试者中。所述活的受试者可以是人受试者。

在另一实施方式中，提供了模拟MUC1肽的结构和MUC-1结合能力的肽模拟物，所述MUC1肽含有至少4个连续的MUC1残基且不多于20个连续的MUC1残基，并且包含序列CQC，其中CQC的氨基-末端半胱氨酸在其NH₂-端被至少一个氨基酸残基掩盖，所述至少一个氨基酸残基无需对应于天然的MUC1跨膜序列。另一个实施方式提供了含有至少3个连续的MUC1残基且不多于20个连续的MUC1残基的MUC1肽，并且所述MUC1肽包含序列CQC，其中所述肽的所有氨基酸残基均为D-氨基酸。所述肽还可包含序列KRRCQC(SEQ ID NO：49)。

癌细胞可以是，例如，乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌、神经组织癌、黑色素瘤、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、宫颈癌、阴道癌或膀胱癌细胞。

本发明还包括杀死癌细胞的方法。此方法可包括，在进行上面所述的方法之前、之后或同时，使受试者暴露于一种或多种另外的疗法。所述疗法可以是，例如，一种或多种形式的电离辐射和/或一种或多种化疗剂。所述一种或多种化疗剂可以是，例如，顺铂、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法伦(melphalan)、苯丁酸氮芥、bisulfan、亚硝基脲、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、plicomycin、丝裂霉素、依托泊甙(etoposide)、verampil、鬼臼毒素、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉酚、反式铂(transplatinum)、5-氟脲嘧啶、长春花新碱、长春灭瘟碱、甲氨蝶呤、或前述任一的类似物。还构想作为组合疗法的是激素疗法、免疫疗法、毒素疗法、冷冻疗法和外科手术。

构想本申请中所描述的任何方法或组合物可相关于本申请中所描述的任何其它方法或组合物被实施。

当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”共同使用时，使用用语“a”或“an”可指“一个”，但是其也与下列意思一致：“一个或多个”，“至少一个”和“一个或多于一个”。用语“大约”指加或减所述数字的5％。

本发明的其它目标、特征和优势将通过下面的详述变得显然。然而，应当理解，详细的描述和特定的实施例虽然表明了本发明的特定实施方式，但是仅是通过例证的方式给出的，因为通过这种详细的描述，在本发明精神和范围内的各种变化和修饰对于本领域技术人员而言将是显然的。

附图说明

下列附图形成了本说明书的一部分并且被包括以进一步表明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合详细说明，可更好地理解本发明。

图1A-D.MUC1/CQC肽阻碍MUC1的寡聚化。(图1A)显示了MUC1-C亚基和MUC1-CD的72-氨基酸序列的图示。N-末端的15个氨基酸(阴影的序列)MUC1/CQC和突变的MUC1/AQA肽带有聚-dAr g转导结构域而被合成。(图1B)在BIAcore中将His-MUC1-CD(1.4mg/ml)固定于传感芯片上。在所述传感芯片上方10μM处注射MUC1/CQC。通过BIAevaluation软件3.0版本分析原始的结合数据并使其与1∶1Languir结合模型拟合。(图1C)使纯化的His-MUC1-CD(1.5mg/ml)与PBS、200μM MUC1/CQC或200μM MUC1/AQA一同在室温下孵育1小时。在非还原性的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离蛋白并通过使用抗-MUC1-C的蛋白质印迹法来进行分析。(图1D)瞬时转染293细胞以表达空的载体或GFP-MUC1-CD和Flag-MUC1-CD。转染后48小时，用5μMMUC1/CQC或MUC1/AQA处理所述细胞3天。然后收获所述细胞用于以抗-MUC1-C进行的蛋白质印迹法(左图)。还用抗-Flag沉淀了全细胞裂解物，并且用所示抗体对沉淀物进行了蛋白质印迹分析(右图)。

图2A-C.MUC1/CQC肽阻碍MUC1-C的核定位。(图2A)用5μM FITC-标记的MUC1/CQC肽孵育ZR-75-1细胞所示的时间，然后通过流式细胞术进行分析。平均荧光指数(MFI)被包括在每幅图中。(图2B-C)在5μM MUC1/CQC或MUC1/AQA肽的存在下孵育ZR-75-1(图2B)和MCF-7(图2C)细胞3天。用所示的抗体对全细胞裂解物(WCL)(左图)和核裂解物(右图)进行蛋白质印迹测试。

图3A-D.MUC1/CQC肽诱导S期停滞和坏死。用5μM MUC1/CQC或MUC1/AQA处理ZR-75-1(图2A-B)和MCF-7(图2C-D)细胞3和4天。将细胞固定并通过流式细胞术分析其细胞周期分布(图2A和2C)。图中包括了在G1、S和G2/M期的细胞的百分比。还用碘化丙啶对细胞进行了染色并且通过流式细胞术分析了坏死(图2B和2D)。图中包括了坏死细胞的百分比。

图4A-E.MUC1/CQC对于表达MUC1的乳腺癌细胞的选择性。(图4A)用空的慢病毒(载体)或表达MUC1 siRNA的慢病毒(载体)稳定地感染ZR-75-1细胞。用所示的抗体对经感染细胞的裂解物进行蛋白质印迹分析。(图4B)ZR-75-1/载体细胞是未处理的(菱形)，而ZR-75-1/载体(方形)和ZR-75-1/MUC1siRNA(三角形)细胞是用5μM MUC1/CQC肽处理了所示的时间。通过台盼蓝排除法(trypan blue exclusion)确定了存活的细胞数目。(图4C)293细胞是未处理的(菱形)，和用5μM MUC1/CQC(方形)或MUC1/AQA(三角形)处理了所示的时间。通过台盼蓝排除法确定了存活的细胞数目。(图4D)MCF-10A细胞是未处理的(左图)，和经5μMMUC1/CQC(中间图)或MUC1/AQA(右图)处理的。第3天，分析细胞的细胞周期分布。(图4E)MCF-10A细胞是未处理的(菱形)，和用5μM MUC1/CQC(方形)或MUC1/AQA(三角形)处理了所示的时间。通过台盼蓝排除法确定了存活的细胞数目。

图5A-C.MUC1/CQC肽阻碍ZR-75-1乳腺瘤异种移植物的生长。(图5A)将17-β-雌二醇栓植入4-6周大的雌性Balb-cnu/nu小鼠中。24h后，将ZR-75-1乳腺癌细胞(包埋在基质胶中)皮下注射到侧腹中。当肿瘤为约150mm³时，将所述小鼠配对成组并每天腹膜内注射PBS(载体对照；闭和的方形)，50mg/kg MUC1/AQA肽(对照肽，开放的方形)或10mg/kg MUC1/CQC肽(闭合的三角形)，注射21天。另一组每天以50mg/kg MUC1/CQC肽处理，处理6天(开放的三角形)。每周对小鼠进行两次称重并且每4天进行肿瘤的测量。(图5B和5C).在第24天(星号)，用H&E(图5B)以及抗MUC1的抗体(图5C)对收获自对照组和经50mg/kg/d x 6d处理的组的肿瘤进行染色。

图6A-B.MUC1/CQC肽在ZR-75-1肿瘤上的长期效果。(图6A)如图5A的图注中所描述的，用ZR-75-1细胞注射小鼠。当肿瘤为约275mm³时，将所述小鼠配对成组并每天腹膜内注射PBS(载体对照；开放的方形)，或30mg/kg MUC1/CQC肽(闭合的方形)，注射21天。在第32天，当肿瘤达到约1200mm³时处死对照小鼠。监测经处理的小鼠直至第52天时收获肿瘤用于H&E染色(图6B)。

图7.MUC17-mer抑制前列腺癌。用5μM CQC短肽(7-mer)或5μMCQC长肽(15-mer)处理DU145前列腺癌细胞4天。通过MTT测试测量细胞的生长。数据代表与未处理的细胞(对照)相比生长抑制的百分比。

图8.MUC1-CD铆合肽的序列。

图9A.MUC1-CD-铆合肽对于H1650非小细胞肺癌细胞的生长的影响。为了评估对MUC1功能的抑制的敏感度，用1和5μM MUC1 CQC铆合肽(GO-200-1B)处理H1650NSCLC细胞7天。用5μM GO-200-1B对H1650细胞的处理与显著的生长抑制和之后的细胞数量减少相关。

图9B.GO-200-2B对于细胞增殖的影响。在含有10％加热失活的胎牛血清及100单位/mL青霉素、100μg/ml链霉素和2mmol/L L-谷氨酸的DMEM中培养H-1975非小细胞肺癌细胞系。在处理的前一天重新接种细胞。用5μM GO-200-2B处理细胞3天，并且通过台盼蓝排除法确定细胞的存活。

图10.不同MUC1-CD CQC-区域肽对于激素依赖性乳腺癌细胞的生长的影响。为了确定暴露于不同的包含MUC1-CD CQC-区域的肽是否影响生长，用5μM不同的肽处理ZR-75-1乳腺癌细胞4天并监测细胞增殖。显著地，与未经处理的细胞相比，有较大的生长抑制。

图11.不同MUC1-CD CQC-区域肽对于非小细胞癌细胞的生长的影响。用5μM GO-203、GO-203-2或GO-203cyc处理A549非小细胞肺癌细胞7天。通过台盼蓝排除法确定第7天时的存活细胞数目，并且通过与未经处理的细胞生长比较来计算生长抑制百分比。

图12.不同MUC1-CD CQC-区域肽对于H1975非小细胞癌细胞的生长的影响。用5μM不同的MUC1-CD CQC-区域肽处理H1975非小细胞肺癌细胞6天。通过台盼蓝排除法确定第6天时的存活细胞数目。结果显示用5μM不同的肽处理H1975细胞与显著的生长抑制相关。

图13.不同MUC1-CD CQC-区域肽对于三重阴性乳腺癌细胞的生长的影响。用5μM不同的MUC1-CD CQC-区域肽处理MDA-MB-231三重阴性乳腺癌细胞6天。通过台盼蓝排除法确定第6天时的存活细胞数目。结果显示用不同的肽处理MDA-MB-231细胞与显著的生长抑制相关。

图14.较短的GO-203肽对于ZR-75-1乳腺癌细胞的增殖的影响。在补充了10％加热失活的胎牛血清、100单位/mL青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640中培养人ZR-75-1乳腺癌细胞。每天用5μM的不同的肽处理细胞，处理4天，并且通过台盼蓝排除法确定细胞的存活。与GO-210相反，每天用5μM GO-203(SEQ ID NO：53)、GO-207(SEQ IDNO：4)、GO-208(SEQID NO：50)和GO-209(SEQ ID NO：54)处理ZR-75-1乳腺癌细胞，处理4天，与显著的生长抑制相关。

图15A-D.GO-203与不同的抗癌药物组合的效果。使ZR-75-1细胞暴露于单独的及与GO-203相组合的、所示浓度的顺铂(图15A)、多柔比星(图15B)、rh-TNF-α(图15C)和紫杉酚(图15D)。对于顺铂、多柔比星和紫杉酚而言，处理是相继进行的，其中将细胞暴露于这些试剂72h，继以用5μM GO-203处理72h。在用rh-TNF进行的研究中，使细胞同时暴露于单独的及与5μM GO-203相组合的、不同浓度的rh-TNF 72h。利用MTS检测确定细胞的存活。

图16.GO-203与抗癌试剂是加成的或协同的。图中显示了相对于不同效力水平(被影响的部分)的组合指数。通过用抗癌药物和GO-203的所示组合处理细胞而获得了所述效力水平。

具体实施方式

I.本发明

发明人和其它人已经广泛研究了MUC1在癌症中的作用。如上文所述，人MUC1是异源二聚体糖蛋白，其被翻译为单一的多肽并在内质网被切割为N和C末端亚基(Ligtenberg等人，1992；Macao等人，2006；Levitin等人，2005)。MUC1的异常过表达(正如在大多数人类癌症中所发现的(Kufe等人，1984))引起锚定不依赖性生长和肿瘤发生(Li等人，2003a；Huang等人，2003；Schroeder等人，2004；Huang等人，2005)。其它的研究显示，MUC1的过表达引起了对由氧化应激和遗传毒性的抗癌试剂所诱导的凋亡的抗性(Yin和Kufe，2003；Ren等人，2004；Raina等人，2004；Yin等人，2004；Raina等人，2006；Yin等人，2007)。

受束缚的和分泌的粘蛋白家族在提供上皮细胞表面的保护性屏障方面发挥作用。随着上皮层的损伤，相邻细胞间的紧密连接被破坏，并且由于细胞引起heregulin诱导的修复程序而丧失极性(Vermeer等人，2003)。MUC1-N从细胞表面脱落(Abe和Kufe，1989)，留下MUC1-C作为环境应激信号对细胞内部的传导者起作用。在这方面，MUC1-C与ErbB受体家族的成员形成细胞表面复合物，并且MUC1-C响应heregulin刺激而被靶向核(Li等人，2001；Li等人，2003c)。MUC1-C还通过MUC1胞质结构域(CD)与联蛋白家族成员间的直接相互作用在整合ErbB受体与Wnt信号通路中起作用(Huang等人，2005；Li等人，2003c；Yamamoto等人，1997；Li等人，1998；Li等人，2001；Li和Kufe，2001)。其它的研究显示，MUC1-CD被糖原合酶激酶3β、c-Src、蛋白激酶Cδ和c-Ab1磷酸化(Raina等人，2006；Li等人，1998；Li等人，2001；Ren等人，2002)。

引起MUC1-C的核靶向的机制是不清楚的。含有经典的核定位信号(NLS)的蛋白质通过首先结合至输入蛋白α及而后转而结合至输入蛋白β被输入到核中(Weis，2003)。装载物(cargo)-输入蛋白α/β复合物通过结合至核孔蛋白而停靠在核孔，并通过依赖于Ran GTP酶的机制被转运通过所述孔。经典的NLS是具有4-5个碱性氨基酸的单一簇的单分体或具有被10-12个氨基酸的连接体间隔开的两簇碱性氨基酸的二分体。MUC1-CD包含不符合原型单分体NLS的RRK基序(Hodel等人，2002)。然而，含有非经典NLS的某些蛋白通过直接结合至输入蛋白β而被转运通过核孔(Kau等人，2004)。输入蛋白B与数种核孔蛋白联合(Ryan和Wente，2000)，包括位于核孔复合体的胞质面和核质面的Nup62(Percipalle等人，1997)。其它的研究显示β-联蛋白是通过不依赖于输入蛋白和核孔蛋白的机制被输入到核中的(Suh和Gumbiner，2003)。

在2006年，发明人报道了MUC1是通过涉及结合至Nup62的机制被输入到核中的。他们还表明了MUC1通过MUC1胞质结构域中的CQC基序形成寡聚体并且MUC1的寡聚化对于核输入是必需的。在本申请中，他们将此工作延伸至包括对于CQC基序在寡聚体形成中所起的作用的进一步理解。他们还表明了对应于此区域的短肽能够破坏MUC1寡聚体的形成，防止向肿瘤细胞的核内转运。这些肽能够抑制肿瘤细胞生长，以及在此类细胞中诱导凋亡、甚至肿瘤组织的坏死。下面详细描述了本发明的这些方面及其它方面。

II.MUC1

A.结构

MUC1是表达在正常分泌性上皮细胞顶端边缘上的粘蛋白型糖蛋白(Kufe等人，1984)。在被合成为单一的多肽，并当前体在内质网中被切割为两个亚基后，MUC1形成异源二聚体(Ligtenberg等人，1992)。所述切割可由自催化过程介导(Levitan等人，2005)。＞250kDa的MUC1N-末端(MUC1N-ter，MUC1-N)亚基含有可变数目的、20个氨基酸的串联重复，所述串联重复具有高度保守的变异而是不完全重复并且经O-连接的多糖修饰(Gendler等人，1988；Siddiqui等人，1988)。MUC1-N通过与约23kDa的C-末端亚基(MUC1C-ter，MUC1-C)二聚化而被束缚在细胞表面，所述C-末端亚基包括58个氨基酸的胞外结构域、28个氨基酸的跨膜结构域和72个氨基酸的胞质结构域(CD；SEQ IDNO：1)(Merlo等人，1989)。人MUC1序列如下所示：

GSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAV (SEQ ID NO：2)

粗体的序列表示CD，而加下划线的部分是实施例中所描述的寡聚体抑制肽(SEQID NO：3)。

随着正常上皮细胞向癌的转化，MUC1在细胞溶质中及在整个细胞膜上异常地过表达(Kufe等人，1984；Perey等人，1992)。与细胞膜相联合的MUC1通过网格蛋白介导的内吞作用而被靶向至内体(Kinlough等人，2004)。此外，MUC1-C，而非MUC1-N，被靶向至核(Baldus等人，2004；Huang等人，2003；Li等人，2003a；Li等人，2003b；Li等人，2003c；Wei等人，2005；Wen等人，2003)和线粒体(Ren等人，2004)。

B.功能

MUC1与ErbB受体家族的成员(Li等人，2001b；Li等人，2003c；Schroeder等人，2001)、以及与Wnt效应子β-联蛋白(Yamamoto等人，1997)相互作用。表皮生长因子受体和c-Src在Y-46处磷酸化MUC1胞质结构域(MUC1-CD)，并从而增加MUC1和β-联蛋白的结合(Li等人，2001a；Li等人，2001b)。MUC1与β-联蛋白的结合还由糖原合酶激酶3β和蛋白激酶Cδ调控(Li等人，1998；Ren等人，2002)。MUC1与β-联蛋白在核内共定位(colocalize)(Baldus等人，2004；Li等人，2003a；Li等人，2003c；Wen等人，2003)并且共同活化Wnt靶基因的转录(Huang等人，2003)。其它的研究显示，MUC1也直接与p53结合并调控p 53靶基因的转录(Wei等人，2005)。值得注意地，MUC1的过表达足以诱导锚定不依赖性生长和肿瘤发生(Huang等人，2003；Li等人，2003b；Ren等人，2002；Schroeder等人，2004)。

大多数线粒体蛋白质在核内被编码并通过线粒体外膜和内膜中的易位复合体被输入到线粒体中。某些线粒体蛋白质含有N-末端线粒体靶向序列并且与线粒体外膜中的Tom20相互作用(Truscott等人，2003)。其它的线粒体蛋白质含有内部的靶向序列并且与Tom70受体相互作用(Truscott等人，2003)。最近的工作显示，没有内部靶向序列的线粒体蛋白质通过HSP 70和HSP90的复合物被递送至Tom70(Young等人，2003)。

III.MUC1肽

A.结构

本发明构想了各种MUC1肽的设计、生产和用途。这些肽的结构特征如下。首先，所述肽具有不多于20个连续的MUC1残基。因此，术语“具有不多于20个连续残基的肽”(甚至当包括术语“包含”时)不能被理解为包含更多数目的连续的MUC1残基。第二，所述肽将含有CQC基序，并且也可包括CQCR基序，CQCRR基序和CQCRRK基序。因此，所述肽将至少具有MUC1-C结构域的这三个连续的残基。第三，所述肽将具有至少一个附着于CQC基序中第一个C残基的NH₂-末端侧的氨基酸残基，从而所述第一个C残基被附着于其上的所述至少一个氨基酸所“掩盖”。所述残基可以是来自于MUC1的(即，来自跨膜结构域)、可以是随机选择的(20个天然存在的氨基酸或其类似物中的任意一个)，或者可以是另一个肽序列(例如，用于纯化的标签序列、稳定化序列或细胞递送结构域)的一部分。

一般而言，所述肽将为50个残基或更少，再次的，其包含不多于20个连续的MUC1残基。总的长度可以是4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49或50个残基。构想了4-50个残基，5-50个残基，6-50个残基，7-50个残基，7-25个残基，4-20个残基，5-20个残基，6-20个残基，7-20个残基和7-15个残基的肽长度的范围。连续的MUC1残基的数目可以是4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20。构想了4-20个残基，5-20个残基，6-20个残基，7-20个残基和4-15个残基，5-15个残基，6-15个残基或7-15个残基的连续残基的范围。

本发明可利用L-构型的氨基酸、D-构型的氨基酸或其混合。虽然L-氨基酸代表蛋白质中所发现的绝大多数氨基酸，在一些由奇特的海洋-居住的生物体(例如芋螺(conesnail))所产生的蛋白质中发现了D-氨基酸。它们也是细菌的肽多糖细胞壁的丰富的组分。D-丝氨酸可作为脑中的神经传递素。对于氨基酸构型的L和D约定不是指氨基酸本身的光学活性，而是指甘油醛异构体的光学活性，理论上可从所述甘油醛合成那种氨基酸(D-甘油醛是右旋性的；L-甘油醛是左旋性的)。

“全D”肽的一种形式是逆-反肽。对天然存在的多肽的逆-反修饰涉及对具有与相应的L氨基酸相反的α碳立体化学的氨基酸的合成组合，即，相对于天然的肽序列是相反顺序的D-氨基酸。逆-反类似物因而具有倒转的末端和倒转的肽键方向(NH-CO而不是CO-NH)，而大概维持了如同在天然肽序列中的侧链拓扑结构。参见美国专利6,261,569，在此通过引用而并入。

如上文所提及的，本发明构想了融合或缀合细胞递送结构域(也称为细胞递送载体，或细胞转导结构域)。这类结构域在本领域是公知的并且一般被表征为短的两性或阳离子性肽及肽衍生物，通常含有多个赖氨酸和精氨酸残基(Fischer，2007)。特别感兴趣的是聚-D-Arg和聚-D-Lys序列(例如，右旋性的残基，8个残基长)，而其它的显示在下表1中。

表1

此外，如上文中所提及的，构想了通过在氨基和/或羧基末端添加阻断剂以促进肽在体内的存留而针对在体内用途被修饰的肽。这在细胞摄取之前，肽末端倾向于被蛋白酶降解的情形中可以是有用的。此类阻断剂可以包括但不限于，可以被附着到待施用的肽的氨基和/或羧基末端残基上的其它相关的或无关的肽序列。这些试剂可以在所述肽的合成中被化学添加，或通过本领域中熟悉的方法通过重组DNA技术被添加。备选地，阻断剂(例如焦谷氨酸或本领域中已知的其它分子)可被附着至氨基和/或羧基末端残基。

B.合成

利用固相合成技术生产肽是有利的(Merrifield，1963)。其它的肽合成技术是本领域技术人员公知的(Bodanszky等人，1976；肽合成，1985；Solid Phase PeptideSynthelia，1984)。在上文中以及在有机化学的保护性基团(1973)中将找到用于此类合成的适当的保护性基团。这些合成方法涉及将一个或多个氨基酸残基或合适的保护性氨基酸残基相继添加至生长中的肽链。通常，第一个氨基酸残基的氨基或羧基基团被合适的、可选择性去除的保护性基团保护。不同的、可选择性去除的保护性基团被用于含有反应性侧基的氨基酸(例如赖氨酸)。

使用固相合成作为示例，通过其未经保护的羧基或氨基使经保护的或衍生的氨基酸附着于惰性固体支持物。然后选择性地去除所述氨基或羧基的保护性基团，并且掺入具有经适当保护的互补(氨基或羧基)基团的、序列中的下一个氨基酸，并使其与已经附着于固体支持物上的残基反应。然后，从这一新添加的氨基酸残基上去除氨基或羧基的保护性基团，然后添加下一个氨基酸(经适当保护的)，依此类推。当所有所需的氨基酸都以适当的顺序被连接起来后，相继或同时去除任何剩余的末端和侧基保护性基团(以及固体支持物)，以提供最终的肽。本发明的肽优选没有苄化的或甲苄化的氨基酸。此类保护性基团部分可被用于合成的过程中，但是在使用所述肽之前去除它们。可能需要其它的反应，如其它地方所描述的，以形成用于限制构象的分子内连接。

除了可使用20个标准氨基酸外，还有大量的“非标准”氨基酸。其中的两个可由遗传密码子给定，但在蛋白质中是相当少见的。硒代半胱氨酸在UGA密码子处被掺入一些蛋白质中，而UGA密码子通常是终止密码子。吡咯赖氨酸被一些产甲烷的古细菌用于其用以产生甲烷的酶中。其以密码子UAG被编码。没有在蛋白质中被发现的非标准氨基酸的实例包括羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸和神经传递素γ-氨基丁酸。非标准氨基酸常常在标准氨基酸的代谢途径中作为中间体产生-例如，鸟氨酸和瓜氨酸产生于尿素循环中(氨基酸分解代谢的一部分)。非标准氨基酸通常通过对标准氨基酸的修饰而形成。例如，高半胱氨酸是通过转硫作用途径或通过介由中间代谢产物S-腺苷甲硫氨酸的甲硫氨酸的去甲基化作用而形成的，而羟脯氨酸是通过脯氨酸的翻译后修饰制得的。

C.连接子

连接子或交联剂可被用于将MUC1肽与其它蛋白质性质的序列融合。双功能的交联剂被广泛用于各种目的，包括制备亲和基质、修饰和稳定各种结构、配体和受体结合位点的鉴别以及结构的研究。携带两个相同的官能团的同双功能试剂被证明在诱导相同或不同大分子或大分子亚基间的交联方面，以及在将多肽配体连接至其特异性结合位点方面是高效的。异双功能试剂含有两种不同的官能团。通过利用所述两种不同官能团的不同反应活性，可选择性地和相继地控制交联。可根据其官能团的特异性将双功能的交联剂分为，例如氨基-、巯基-、胍基-、吲哚-、或羧基-特异性基团。其中，针对游离氨基的试剂特别普及，因为其商业可获得性、易于合成和其可被应用的温和的反应条件。多数异双功能交联剂含有伯胺反应基团和硫醇反应基团。

在另一个实施例中，异双功能交联剂和使用所述交联剂的方法被描述于美国专利5,889,155中，在本申请中特别以其全部通过引用而并入。所述交联剂将亲核性酰肼残基与亲电子的马来酰亚胺残基相结合，在一个实施例中允许了醛类与游离硫醇的耦合。所述交联剂可经修饰以交联各种官能团并因此对于交联多肽是有用的。在特定的肽在其天然序列中不含有可用于给定交联剂的残基的情形中，可利用一级序列中的保守性遗传或合成氨基酸变化。

在肽作为治疗剂的情境中，连接子的另一个用途是AileronTherapeutics的所谓的“铆合肽”技术。用于“铆合”肽的通常的方式是通过经由氨基酸侧链附着连接子而修饰所述肽中的两个关键的残基。一旦被合成，通过催化剂连接所述连接子，从而形成物理上将所述肽限制为其天然α-螺旋形状的桥。除了帮助保持与靶分子相互作用所需的天然结构外，此构象还提供抵抗肽酶类的稳定性和细胞渗透特性。描述了此技术的美国专利7,192,713和7,183,059在此通过引用而并入。还参见Schafmeister等人，Journal of the AmericanChemical Society，2000.122(24)：p.5891-5892。

D.设计、变体和类似物

本发明的焦点在于包含序列CQC的肽。鉴别了MUC1寡聚体形成中的这一关键结构后，发明人还构想了可利用所述CQC序列的变体。例如，某些满足CQC序列的结构限制的非天然氨基酸可被取代而不丧失(且或许具有改善的)生物学功能。此外，当前的发明人还构想了可配制结构上相似的化合物以模拟本发明的肽或多肽的关键部分。可以与本发明的肽相同的方式使用此类化合物(可被称为肽模拟物(peptidomimetics))，因此，其也是功能上的等价物。

Johnson等人(1993)描述了某些模拟蛋白二级结构和三级结构的元素的模拟物。使用肽模拟物背后的基本原理是蛋白的肽骨架存在而主要用于以促进分子相互作用(例如抗体和/或抗原的相互作用)的方式定向氨基酸侧链。肽模拟物因此被设计为允许类似于天然分子的分子相互作用。

现有技术中公开了产生特定结构的方法。例如，美国专利5,446,128；5,710,245；5,840,833；和5,859,184中公开了α-螺旋模拟物。产生构象上受限的β-折叠和β-凸起的方法被描述于例如，美国专利5,440,013；5,618,914；和5,670,155中。其它类型的模拟折叠包括反转和γ-折叠。美国专利5,475,085和5,929,237中公开了反转折叠，而美国专利5,672,681和5,674,976中描述了γ-折叠。

如在本申请中所使用的，“分子建模”指基于三维结构信息和蛋白-蛋白相互作用模型，对蛋白-蛋白物理相互作用的结构和功能的定量和/或定性分析。这包括传统的基于数值的分子动态和能量最小化模型、交互性计算机图形模型、经修饰的分子力学模型、距离几何和其它基于结构的限制模型。通常使用计算机进行分子建模，并且可使用已知的方法进行进一步优化。使用X射线晶体学数据的计算机程序对于设计此类化合物特别有用。程序，例如RasMol，可被用于产生三维模型。计算机程序，例如INSIGHT(Accelrys，Burlington，MA)，GRASP(Anthony Nicholls，哥伦比亚大学)，Dock(分子设计研究所，加州大学旧金山分校)和Auto-Dock(Accelrys)允许进一步的操控和引入新结构的能力。所述方法可涉及向输出设备输出所述化合物的3-D结构模型的额外步骤。此外，候选化合物的3-D数据可与计算机数据库(例如3-D结构的)进行比较。

本发明的化合物还可以是使用其它基于结构的设计/建模技术从本申请中所描述的化合物的结构信息中被交互式设计的(参见，例如，Jackson，1997；Jones等人，1996)。然后，可在本领域技术人员所熟悉的标准检测中测试候选化合物。本申请中描述了示例性的检测。

生物大分子(例如，蛋白质、核酸、碳水化合物和脂类)的3-D结构可以通过各种方法从所获得的数据中被确定。最有效地被用于评估蛋白质3-D结构的这些方法包括：(a)x-射线晶体学；(b)核磁共振(NMR)光谱学；(c)分析大分子上确定位点间形成的物理距离限制，例如，蛋白质上残基间的分子内化学交联(例如，PCT/US00/14667，其公开在本申请中以其全部通过引用而并入)，和(d)基于目的蛋白一级结构知识的分子建模方法，例如，同源性建模技术、线程算法(threading algorithms)或使用计算机程序(例如MONSSTER(ModelingOf New Structures from Secondary and Tertiary Restraints))的从新(ab initio)结构建模(参见例如国际申请号PCT/US99/11913，在本申请中以其全部通过引用而并入)。也可以根据本发明采用其它分子建模技术(例如，Cohen等人，1990；Navia等人，1992，它们的公开在本申请中以其全部通过引用而并入)。所有这些方法均产生可用于计算机分析的数据。在本发明的方法中也可以是有用的、但是目前不提供关于生物分子的原子水平结构细节的其它光谱方法包括：圆二色光谱和荧关及紫外/可见光吸收光谱。优选的分析方法是x-射线晶体学。下面提供了此过程和NMR光谱的描述。

X-射线晶体学。X-射线晶体学是基于围绕目的分子或分子复合物的晶体中原子核的电子云对特征性波长的x-辐射的衍射。此技术使用纯化的生物学大分子或分子复合物(但这些经常包括溶剂组分、辅助因子、底物或其它配体)的晶体，从而以接近原子的分辨率确定构成所述特定生物学大分子的原子。通过x-射线晶体学解出3-D结构的前提是将会强烈地衍射x-射线的良好有序的晶体。此方法使x-射线束指向许多相同分子的规则的、重复的阵列，从而x-射线以单个分子的结构能够从其中被获取的图样自所述阵列被衍射。例如，球状蛋白分子的良好有序的晶体是具有不规则表面的大的、球形或椭球形的对象。所述晶体含有单个分子之间的大通道。这些通常占据超过一半晶体体积的通道被杂乱的溶剂分子填充，并且蛋白质分子仅在少许小区域处彼此接触。这是为什么晶体中的蛋白质结构与溶液中的蛋白质结构通常相同的一个原因。

以下描述了获得目的蛋白质的方法。晶体的形成取决于许多不同的参数，包括pH、温度、生物大分子的浓度、溶剂和沉淀剂的性质、以及所添加的离子或蛋白质配体的存在。可能需要许多常规的结晶实验，以就给出适于x-射线衍射分析的晶体的组合筛选所有这些参数。结晶机器人可以使可再现地建立大量结晶实验的工作自动化并加快速度(参见，例如美国专利5,790,421，其公开在本申请中以其全部通过引用而并入)。

多肽结晶在其中多肽浓度超过其最大溶解度的溶液(即多肽溶液是过饱和的)中发生。可以通过降低多肽的浓度(优选通过多肽晶体的沉淀)使此类溶液恢复到平衡状态。通常可通过加入改变多肽表面电荷或扰乱多肽与自由水之间的相互作用的试剂以促进引起结晶的结合而诱导多肽从过饱和溶液中结晶。

结晶通常在4℃和20℃之间进行。已知为“沉淀剂”的物质通常被用于通过在多肽分子周围形成能量上不利的沉淀耗尽层，而减少浓缩溶液中多肽的溶解度(Weber，1991)。除了沉淀剂之外，其它的材料有时被加入所述多肽结晶溶液中。这些其它的材料包括用于调节所述溶液的pH的缓冲剂和用于降低多肽的溶解度的盐。本领域中已知各种沉淀剂并包括下列：乙醇、3-乙基-2-4戊二醇以及许多聚二醇(例如聚乙二醇(PEG))。沉淀溶液可包括，例如，13-24％PEG 4000，5-41％硫酸铵和1.0-1.5μM氯化钠，以及5.0-7.5的pH范围。其它的添加剂可包括0.1M羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)，2-4％丁醇，20-100mM乙酸钠，50-70mM柠檬酸，120-130mM磷酸钠，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)及1mM二硫苏糖醇(DTT)。在缓冲剂中制备这些试剂并且以各种组合被滴加到结晶缓冲剂中。待结晶的蛋白质可被修饰，例如，通过磷酸化作用或通过使用磷酸盐模拟物(例如，钨酸盐、甲次砷酸盐或硫酸盐)。

通常使用的多肽结晶方法包括下列技术：批处理、悬滴、晶种起始和透析。在各个所述方法中，重要的是通过保持过饱和的溶液促进成核以后的持续结晶。在批处理方法中，将多肽与沉淀剂混合以达到过饱和，并且将容器密封并放置一旁直至晶体出现。在透析方法中，将多肽保留在密封的透析膜中，所述透析膜被置于含有沉淀物的溶液中。跨膜的平衡增加多肽和沉淀剂的浓度，从而使所述多肽达到过饱和水平。

在优选的悬滴技术中(McPherson，1976)，通过将沉淀剂加入浓缩的多肽溶液中而制备起初的多肽混合物。多肽和沉淀剂的浓度是这样的：以这种起初的形式，多肽不结晶。将一小滴此混合物置于倒置的、并悬于第二种溶液的储库之上的载玻片上。然后将此系统密封。典型地，所述第二种溶液含有更高浓度的沉淀剂或其它脱水剂。沉淀剂浓度上的差别引起蛋白质溶液具有比所述第二种溶液更高的蒸汽压。因为含有所述两种溶液的系统是密封的，建立了平衡，并且多肽混合物中的水转移至所述第二种溶液。这一平衡增加了所述多肽溶液中多肽和沉淀剂的浓度。在多肽和沉淀剂的临界浓度处，所述多肽的晶体可形成。

另一种结晶的方法将成核位点引入浓缩的多肽溶液中。一般而言，制备浓缩的多肽溶液并且将所述多肽的晶种引入此溶液中。如果所述多肽和任何沉淀剂的浓度是正确的，所述晶种将提供围绕其形成更大的晶体的成核位点。

此外，另一种结晶的方法是电解结晶方法，其中利用了在临近电极的赫姆霍尔兹(Helmholtz)层中自我排列的蛋白质大分子的偶极矩(参见，例如，美国专利5,597,457，其公开在本申请中以其全部通过引用而并入)。

一些蛋白质可能是难以结晶的。然而，技术人员可使用数种技术来诱导结晶。例如，去除蛋白质氨基或羧基端的弹性多肽区段可促进晶体蛋白质样品的产生。可使用分子生物学技术或用蛋白酶(例如胰蛋白酶、糜蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶)处理所述蛋白质来去除此类区段。

在衍射实验中，从x-射线源取出狭窄的平行x-射线束并使其指向晶体以产生经衍射的束。入射的主束引起大分子和溶剂分子的损伤。因此，冷却(例如至-220℃和-50℃之间)所述晶体以延长其寿命。所述主束必须从许多方向击中所述晶体以产生所有可能的衍射点，因而在实验过程中在所述束中旋转晶体。在胶片上或通过电子检测器记录衍射点。经暴光的胶片需在扫描设备中被数字化和量化，而电子检测器将其检测到的信号直接供给计算机。电子区域检测器显著地减少了收集和测量衍射数据所需的时间。在胶片或检测器板上被记录为点的各个衍射束由三个性质确定：从点的强度量出的振幅；由x-射线源设置的波长；和在x-射线实验中丧失的相位。对于所有的衍射束都需要所有三个性质，以便确定产生所述衍射束的原子的位置。确定相位的一种方式叫做多重同晶置换(MIR)，其要求将外源的x-射线散射体(例如，重原子，如金属原子)引入晶体的晶胞中。对于MIR的更详细的描述，参见美国专利6,093,573(第15栏)，其公开在本申请中以其全部通过引用而并入。

原子坐标指衍生自涉及数据的傅立叶合成的数学方程式的笛卡儿坐标(x，y和z位置)，所述数据源自通过晶体形式的目的生物学大分子的原子(散射中心)对x-射线的单色束的衍射而获得的图样。衍射数据被用于计算晶体中重复单位(晶胞)的电子密度图。电子密度图被用于确立单个原子在晶体的晶胞中的位置(原子坐标)。原子坐标的绝对值传达了原子间的空间关系，因为归于原子坐标的绝对值可通过沿着x，y，和/或z轴的旋转性和/或平动性移动而被一同或单独地改变，而保持相同的原子间相对空间关系。因此，生物学大分子(例如蛋白质)(它的一组绝对原子坐标值可被旋转地或平动地调节以符合来自对另一样品的分析的一组事先确定的值)被认为具有与获得自其它样品的原子坐标相同的原子坐标。

关于x-射线结晶法的进一步的细节可获得自共同在审(co-pending)的美国申请号2005/0015232、美国专利6,093,573和国际申请号PCT/US99/18441、PCT/US99/11913和PCT/US00/03745。所有这些专利文件的公开在本申请中以其全部通过引用而并入。

NMR光谱。x-射线结晶法需要目的大分子的单晶，而NMR测量是在接近生理的条件下、在溶液中进行的。然而，源自NMR的结构不如源自晶体的结构那样详细。

虽然直至较近期，NMR光谱的应用仍局限于阐明较小分子(例如，100-150个氨基酸残基的蛋白质)的3-D结构，包括放射性标记目的分子和横向弛缓最佳化光谱(TROSY)的最近的进展允许了将此方法延伸至分析大得多的分子(例如，具有110kDa的分子量的蛋白质(Wider，2000))。

NMR利用射频辐射来检测以特定射频脉冲的均一磁场中磁性原子核的环境。脉冲扰乱具有非零自旋的核的那些原子的核磁化。当系统返回平衡状态时，检测到瞬态时域信号。将所述瞬态信号傅立叶转换为频域产生了一维NMR光谱。这些光谱中的峰代表各种活性核的化学位移。通过原子的局部电子环境确定其化学位移。二维NMR实验可提供关于所述结构中和三维空间中的各种原子的接近性的信息。可通过进行许多二维(有时是三维或四维)NMR实验并利用所产生的信息作为一系列蛋白质折叠模拟中的约束条件来确定蛋白质结构。

NMR光谱学方面的更多信息(包括关于如何利用从NMR实验获得的原始数据来确定大分子的3-D结构的详细描述)可在下列中找到：Protein NMR Spectroscopy，Principlesand Practice，(1996)；Gronenborn等人(1990)；和Wider(2000)(同上)，所有这些的公开在本申请中以其全部通过引用而并入。

所感兴趣的还有基于本发明的为肽的化合物的氨基酸序列而设计的肽模拟物化合物。肽模拟物化合物是合成的化合物，其具有与所选择的肽的三维构象基本上相同的三维构象“基序”。所述肽基序为肽模拟物化合物提供了抑制MUC1寡聚化的能力。肽模拟物化合物可具有增强其体内实用性的其它特征，例如增加的细胞渗透性和延长的生物学半衰期。所述肽模拟物典型地具有部分或完全是非肽的骨架，但是具有与存在于所述肽模拟物所基于的肽中的氨基酸残基的侧基相同的侧基。本领域中已知数种化学键(例如酯键、硫酯键、硫代酰胺键、逆酰胺(retroamide)键、还原的羰基键、二亚甲基键和酮亚甲基(ketomethylene)键)在蛋白酶抗性肽模拟物的构建中是通常有用的肽键替代物。

IV.治疗

A.药物制剂和施用途径

当构想临床应用时，需要以适于预期应用的形式制备药物组合物。一般而言，这将使得必须制备基本上不含热源及其它对人或动物可能有害的杂质的组合物。

通常将希望采用适当的盐和缓冲剂以使得递送载体稳定并且顾及到靶细胞的摄取。当将重组细胞引入患者中时也将采用缓冲剂。本发明的水性组合物包含有效量的载体至细胞，其被溶解或分散于药学上可接受的载体或水性介质中。此类组合物也被称为接种物。用语“药学上或药理学上可接受的”指当施用于人或动物时不产生不利的、变应性的或其它不良反应的分子实体和组合物。如在本申请中所使用的，“药学上可接受的载体”包括任何以及所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂及抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。对于药学活性物质使用此类介质和试剂是本领域公知的。除非任何常规的介质或试剂与本发明的载体或细胞不相容，构想了其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可被混入所述组合物中。

本发明的活性组合物可包括经典的药物制备物。施用根据本发明的这些组合物将是通过任何常见的途径，只要靶组织通过那一途径是可得的。此类途径包括口途径、鼻途径、颊途径、直肠途径、阴道途径或局部途径。备选地，施用可以是通过常位注射、真皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射或静脉内注射。此类组合物将通常作为药学上可接受的组合物被施用，如上文所述。特别感兴趣的是直接的肿瘤内施用，肿瘤的灌注或对于肿瘤局部或区域性地施用，例如在局部或区域性的脉管系统或淋巴系统中，或在经切除的瘤床中。

活性化合物也可被肠胃外施用或腹膜内施用。可在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水中可制备作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物溶液。也可在甘油、液态聚乙二醇，及其混合物中以及在油中制备分散体。在普通的存储和使用条件下，这些制备物含有防腐剂以防止微生物的生长。

适于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有的情形中，所述形式必须是无菌的，并且必须是液态的以达到存在易注射性的程度。其在生产和储存的条件下必须是稳定的并且必须抵抗微生物(例如细菌和真菌)的污染作用而被保存。载体可以是溶剂或分散体介质，其包括，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、它们的合适的混合物，以及植物油。可例如，通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过维持所需的粒度(在分散体的情形中)、及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可由各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)带来对微生物的作用的预防。在许多情形中，将优选包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。可通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)而带来所述可注射组合物的延长的吸收。

通过将所需量的活性化合物与上面列举的各种其它成分(按照需要)混入适当的溶剂中，继以滤过灭菌而制备无菌可注射溶液。一般而言，通过将各种无菌活性成分混入含有基本分散介质和所需的上面所列举的其它成分的无菌媒介物中而制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术从活性成分加上任何其它所需成分的先前无菌滤过的溶液产生其粉末。

如在本申请中所使用的，“药学上可接受的载体”包括任何以及所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂及抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。对于药学活性物质使用此类介质和试剂是本领域公知的。除非任何常规的介质或试剂与活性成分不相容，构想了其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可被混入所述组合物中。

为了口服施用，可将本发明的多肽与赋形剂混合并且以不可吞咽的漱口液和洁齿剂的形式使用。可通过以所需的量将活性成分混入合适的溶剂中(例如硼酸钠溶液(多贝耳液))而制备漱口液。备选地，可将活性成分混入含有硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的杀菌洗液中。也可将活性成分分散在洁齿剂中，所述洁齿剂包括：凝胶、膏、粉末和浆。可以治疗上有效的量将活性成分加入牙膏中，所述牙膏可包含水、结合剂、磨料、调味剂、发泡剂和保湿剂。

本发明的组合物可以中性的形式或盐形式被配制。药学上可接受的盐包括酸加成盐(以蛋白质的游离氨基基团形成)，并且其是用无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的。以游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(例如，异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。

形成后，将以与剂量制剂相符的形式和治疗上有效的量施用溶液。所述制剂以各种剂量形式(例如可注射溶液、药物释放胶囊等)被容易地施用。对于在水溶液中肠胃外施用，例如，如果需要的话所述溶液应是适当缓冲的，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂成为等渗的。这些特别的水溶液特别适于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这一点上，根据本公开，可采用的无菌水性介质将是本领域技术人员所知道的。例如，可将一剂溶于1ml等渗NaCl溶液中，并且加入1000ml皮下输液中或注射到所计划的灌输位点(参见，例如“Remington′s Pharmaceutical Sciences，”第15版，1035-1038和1570-1580页)。取决于被治疗的受试者的状况，将必然产生剂量上的一些变化。无论如何，负责施用的人将决定对于个体受试者而言适当的剂量。此外，对于人的施用，制备物应满足FDA生物制品标准局所要求的无菌、致热原性、一般的安全性和纯度标准。

B.癌症类型和受试者

可向其施用本发明的方法的癌细胞一般包括任何表达MUC1，并且更特别地，过表达MUC1的细胞。适当的癌细胞可以是乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌(例如白血病或淋巴瘤)、神经组织癌、黑色素瘤、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、宫颈癌、阴道癌或膀胱癌细胞。此外，本发明的方法可被施用于范围广泛的物种，例如人、非人灵长类动物(例如猴子、狒狒或黑猩猩)、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔子、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠和小鼠。

C.治疗方法

抑制MUC1寡聚体形成的肽或类似物通常作为抗癌治疗剂或预防剂是有用的。它们可单独地或与其它药物和/或放射疗法联合而被施用于哺乳动物受试者(例如，人乳腺癌患者)。所述化合物也可被施用于遗传上和/或环境上(由于，例如生理的和/或环境的因素)易患癌症的受试者，例如具有癌症(例如，乳腺癌)家族史的受试者，具有慢性炎症或经受慢性压力的受试者或暴露于天然或非天然环境致癌条件(例如，过度暴露于日光、工业致癌物或烟草烟雾)的受试者。

当对患有癌症的受试者施用所述方法时，在施用化合物之前，可以可选地通过本领域已知的方法就MUC1的表达(MUC1蛋白或MUC1mRNA表达)测试所述癌。以这种方式，受试者可被鉴别为患有表达MUC1或过表达MUC1的癌。可在体外、在获得自受试者的癌细胞上进行此类方法。备选地，可进行利用，例如特异于MUC1的放射标记的抗体的体内成像技术。此外，可就升高水平的MUC1蛋白或MUC1蛋白片段测试来自具有癌症的受试者的体液(例如，血液或尿)。

所需的剂量取决于所选择的施用途径，制剂的性质，患者的疾病的性质，患者的尺寸、重量、表面积、年龄和性别，所施用的其它药物，以及主治医师的判断。合适的剂量在0.0001mg/kg-100mg/kg的范围内。考虑到可使用的化合物的多样性和各种施用途径的不同效率，所需剂量的广泛变化是将被预计到的。例如，与通过静脉内注射施用相比，将预期口服施用需要更高的剂量。如本领域中所熟知的，可使用用于优化的标准经验性常规来调节这些剂量水平中的变化。施用可以是单次的或多次的(例如，2、3、4、5、6、8、10、20、50、100、150或更多次)。将所述多肽包封于合适的递送媒介(例如多聚微粒或可植入的设备)中可增加递送的效率，特别是对于口服递送而言。

V.组合疗法

肿瘤细胞对DNA损伤剂的抗性代表了临床肿瘤学中的主要问题。目前癌症研究的目标之一就是找到提高化学和放射疗法的效率的方式。一种方式是通过将此类传统疗法与基因疗法相组合。在本发明的情境中，构想了MUC1肽疗法可类似地与化学治疗性干预、放射治疗性干预或免疫治疗性干预相联合而被使用。

为了使用本发明的方法和组合物而杀死细胞、抑制细胞生长、抑制转移、抑制血管发生或者逆转或减少肿瘤细胞的恶性表型，通常将使靶细胞与MUC1肽和至少一种其它的治疗相接触。将以有效杀死或抑制细胞增殖的组合量提供这些治疗。此方法可涉及使所述细胞同时与所述试剂/治疗相接触。这可通过使所述细胞与含有两种试剂的单一的组合物或药物制剂相接触而实现；或者通过使所述细胞同时与两种不同的组合物或制剂相接触而实现，其中一种组合物包括MUC1肽而另一种包括所述试剂。

备选地，所述MUC1治疗可以数分钟至数周范围的间隔而在其它的治疗之前或之后。在分别将其它治疗和MUC1肽施用于细胞的实施方式中，通常将确保在各个递送时间之间相当长的一段时间不期满，从而所述治疗将仍能够在细胞上产生有利组合的效果。在此情形中，构想的是将在相互间约12-24小时内、在相互间约6-12小时内、或以仅约12小时的延迟时间使细胞与两种形式均接触。在一些情形中，可能需要显著地延长用于治疗的时间段，然而，其中各施用之间经过数天(2，3，4，5，6或7)至数周(1，2，3，4，5，6，7或8)。

也可构想的是将需要施用MUC1肽或另一种治疗多于一次。可采用各种组合，其中所述MUC1肽是“A”，而所述另一种治疗是“B”，举例说明如下：

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/BA/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/AA/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/BB/A/B/B B/B/A/B

也构想了其它的组合。再次地，为了实现杀死细胞，以有效杀死细胞的组合量向所述细胞递送两种治疗。

适于在组合疗法种使用的试剂或因素包括当被施用于细胞时诱导DNA损伤的任何化合物或治疗方法。此类试剂或因素包括诱导DNA损伤的辐射和波，例如γ-照射、X-射线、UV-照射、微波、电子发射等。各种化合物(也被描述为“化疗剂”或“遗传毒性试剂”)意欲被用于本申请所公开的组合治疗方法中。在根据本发明治疗癌症时，将使肿瘤细胞与表达构建体之外的试剂接触。这可通过用例如X-射线、UV-光、γ-射线或甚至微波的辐射照射局部的肿瘤位点而实现。备选地，可通过向受试者施用治疗上有效量的药物组合物而使肿瘤细胞与所述试剂接触。

构想了用于与本发明的肽组合使用的各类化疗剂。例如，选择性雌激素受体拮抗剂(“SERMs”)，例如他莫昔芬，4-羟基他莫昔芬(阿非昔芬)，Falsodex，雷洛昔芬，巴多昔芬，氯米芬，Femarelle，拉索昔芬，奥美昔芬和托瑞米芬。

构想的有用的化疗剂包括，例如喜树碱、放线素菌-D、丝裂霉素C。本发明还包括一种或多种DNA损伤剂(无论是基于辐射的还是实际的化合物)的组合的用途，例如使用X-射线与顺铂或使用顺铂与依托泊甙。如上所述，通过将所述试剂与MUC1肽组合，所述试剂可作为组合的治疗组合物或试剂盒被制备和使用。

热激蛋白90是在许多真核细胞中找到的调控蛋白。已显示HSP90抑制剂在癌症的治疗中是有用的。此类抑制剂包括格尔德霉素、17-(丙烯胺基)-17-去甲氧基格尔德霉素、PU-H71和利福布汀。

也设想了直接交联DNA或形成加合物的试剂。可使用试剂，例如顺铂，及其它DNA烷化剂。顺铂被广泛用于治疗癌症，在临床应用中所使用的有效剂量为20mg/m²，每三周使用5天，一共三个疗程。顺铂经口不被吸收而因此必须通过静脉内、皮下、肿瘤内或腹膜内注射而被递送。

损伤DNA的试剂还包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的化合物。此类化疗化合物包括阿霉素(也已知为多柔比星)、依托泊甙、维拉帕米、鬼臼毒素等。在肿瘤治疗的临床环境中所广泛使用的，是通过静脉内推注注射而施用这些化合物，剂量范围是从25-75mg/m²(对于多柔比星而言，以21天的间隔)至35-50mg/m²(对于静脉内注射依托泊甙而言)，或者口服是静脉内剂量的二倍。也构想了微管抑制剂，例如紫杉烷类。这些分子是二萜类，其由紫杉属的植物产生并且包括紫杉醇和多西紫杉醇(docetaxel)。

表皮生长因子受体抑制剂，例如艾瑞莎、mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标)。mTOR也已知为FK 506结合蛋白12雷帕霉素相关蛋白1(FRAP1)，其是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其调控细胞生长、细胞增殖、细胞运动性、细胞存活、蛋白质合成，以及转录。因此，构想了将雷帕霉素及其类似物(“rapalogs”)用于根据本发明的组合癌症疗法。

另一种与本申请中要求保护的肽组合的可能的治疗是TNF-α(肿瘤坏死因子α)，其是参与全身性炎症的细胞因子并且是刺激急性期反应的细胞因子组的成员。TNF的主要作用是调控免疫细胞。TNF还能够诱导凋亡性细胞死亡、诱导炎症、以及抑制肿瘤发生和病毒复制。

破坏核酸前体和亚基的合成和忠实性的试剂也导致DNA损伤。如此，已开发了一些核酸前体。特别有用的是经过了大量的测试并且容易获得的试剂。如此，试剂(例如5-氟尿嘧啶(5-FU))优先地被肿瘤组织利用，使得所述试剂对于靶向肿瘤细胞而言特别有用。虽然十分有毒，5-FU可在宽范围的载体中被应用(包括局部的)，然而，以3至15mg/kg/天范围内的剂量静脉内施用是经常使用的。

其它引起DNA损伤并被广泛使用的因素包括通常已知为γ-射线、x-射线的因素，和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。也构想了其它形式的DNA损伤因素，例如微波和UV-照射。最有可能的是所有这些因素在DNA前体上、DNA的复制和修复上及在染色体的组装和保持上引起宽范围的DNA损伤。x-射线的剂量范围为从50至200伦琴的日剂量(对于长时期而言，3-4周)到2000至6000伦琴的单一剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、所发射的辐射的强度和类型、以及被肿瘤细胞的摄取。

本领域技术人员被指引至“Remington’s Pharmaceutical Sciences”第15版，第33章，特别是第624-652页。取决于被治疗的受试者的状况，将必然产生剂量上的一些变化。无论如何，负责施用的人将决定对于个体受试者而言适当的剂量。此外，对于人的施用，制备物应满足FDA生物制品标准局所要求的无菌、致热原性、一般的安全性和纯度标准。

发明人提出，向癌症患者局部或区域性地递送MUC1肽将是非常有效的治疗临床疾病的方法。类似地，化学或放射疗法可针对患者身体的特定的、受影响的区域。备选地，在某些情况下(例如，当广泛的转移发生时)，区域性或全身性地递送表达构建体和/或试剂可能是适当的。

除了使MUC1疗法与化学和放射疗法组合外，也构想了与免疫疗法、激素疗法、毒素疗法及外科手术的组合。特别地，可采用靶向的治疗剂，例如阿瓦斯丁(Avastin)、爱必要(Erbitux)、格列卫(Gleevec)、赫赛汀(Herceptin)和美罗华(Rituxan)。

还应指出，前述的任何疗法可证明其在治疗癌症方面是单独有用的。

VI.实施例

下面的实施例被包括是为了表明本发明的特定实施方式。本领域技术人员将领会下面的实施例中所公开的技术代表发明人发现在本发明的实施中运作良好的技术，因此其可被认为构成了实施的特定模式。然而，根据本公开，本领域技术人员将领会在所公开的特定实施方式中可进行许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果而不偏离本发明的精神和范围。

实施例1-材料和方法

细胞培养物。人乳腺癌细胞ZR-75-1、ZR-75-1/载体、ZR-75-1/MUC1siRNA(Ren等人，2004)细胞系在补充了10％加热失活的胎牛血清(HI-FBS)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Invitrogen)的RPMI1640培养基上，在湿润的培养箱中，在37℃和5％CO₂下生长。人MCF-7乳腺癌细胞和293细胞在含有10％HI-FBS、抗生素和2mM L-谷氨酸胺的达尔伯克氏改良伊格尔(Dul becco’smodified Eagle’s)培养基上生长。人MCF-10A乳腺上皮细胞在哺乳动物上皮细胞生长培养基(MEGM；Lonza)中生长。用由MIT生物聚合物实验室(Cambridge，MA)合成的MUC1/CQC或MUC1/AQA肽处理细胞。通过台盼蓝排除法确定存活力。

免疫沉淀和免疫印迹分析。如所描述地(Leng等人，2007)制备全细胞和核裂解物。使可溶的蛋白质经受以抗-Flag(Sigma，St.Louis，MO)进行的免疫沉淀。通过用抗-His(Cell Signaling Technology，Danvers，MA)，抗-GFP(Millipore，Danvers，MA)，抗-Flag，抗-MUC1-C(Ab1；NeoMarkers，Fremont，CA)，抗-核纤层蛋白B(EMD，La Jolla，CA)或抗-β肌动蛋白(Sigma)进行的免疫印迹来分析免疫沉淀物和可溶的蛋白质。用辣根过氧化物酶缀合的二抗及化学发光来检测反应性。

细胞转染。如所描述的(Leng等人，2007)，用表达GFP，GFP-MUC1-CD或Flag-MUC1-CD的载体、在Lipofectamine的存在下转染293细胞。

肽摄取。用FITC-标记的MUC1/CQC肽(MIT生物聚合物实验室)孵育细胞，用冷的PBS清洗，在1％多聚甲醛/PBS中固定并通过流式细胞术就荧光进行分析。

分析细胞周期分布、凋亡和坏死。收获细胞，用PBS清洗，用80％的乙醇固定并在含有40μg/ml RNA酶及40μg/ml碘化丙啶的PBS中、于37℃孵育30分钟。通过流式细胞术确定细胞周期分布。如所描述的(Yin等人，2007)，通过用碘化丙啶对经乙醇固定并且经柠檬酸盐缓冲剂渗透的细胞进行染色，以及通过流式细胞术监测来评估Sub-G1DNA含量。为了评估坏死，如所描述的(Yin等人，2007)，用1μg/ml碘化丙啶/PBS在室温孵育细胞5分钟，然后通过流式细胞术监测。

人乳腺肿瘤异种移植物模型。用套管针枪向4-6周大、体重为18-22克的Balb-cnu/nu雌小鼠(Charles River实验室，Wilmington，MA)皮下植入17-β-雌二醇栓(0.72mg；Innovative Research，Sarasota，FL)。24h后，将包埋在基质胶(BD Biosciences)中的1x10⁷ZR-75-1细胞皮下注射到侧腹中。当在约150mm³(同期组群1)或275mm³(同期组群2)可检测到肿瘤时，将小鼠配对为处理组和对照组。每组含有5只小鼠，其中的每只都被加上了耳标并在整个研究过程中被追踪。在配对时(第1天)施用了起初的剂量。每天通过腹膜内注射施用磷酸盐缓冲的盐水(媒介)、MUC1/CQC肽和MUC1/AQA肽。每周对小鼠称重两次，并且每4天使用测径器对肿瘤进行测量。使用公式V＝W2x L/2计算肿瘤体积(V)，其中W和L分别是较小和较大的直径。处死时，用盐水、然后用经磷酸盐缓冲的福尔马林通过心脏施用而灌注小鼠。肿瘤被切除、浸泡固定4h、通过梯度的系列乙醇被脱水、并被处理用于常规石蜡包埋。如所描述的(Kufe，1984)，通过H&E染色以及就用抗-MUC1进行的免疫过氧化物酶染色来评价肿瘤。

药物和细胞因子。顺二氨二氯化铂(II)、多柔比星(阿霉素)、紫杉酚(紫杉醇)购自Sigma(St.Louis，MO)。rh-TNF-α购自Promega(Madison，WI)。GO-203肽由Anaspec Inc.合成。

体外细胞毒性和组合测定。以1000细胞/孔(对于6天的实验)或者以3000细胞/孔(对于3天的实验)在96孔平底微量滴定板(Fisher)中接种细胞。然后将细胞培养24h。将抗癌药物和GO-203稀释至所示的浓度并加至细胞。每24h添加GO-203(5μmol/L)，共72h。通过向细胞中加入MTS试剂并由微板测读仪读取490nm处的吸光率而确定细胞存活性。

数据分析。通过使用Graphpad Prism(GraphPad Software，San Diego CA)进行非线性回归分析来测定所有抗癌药物的IC₅₀值。在5μmol/L GO-203的存在下在剂量范围内，使用CombiTool计算机程序(版本2.001，IMB Jena Biocomputing Group)来计算组合指数。

实施例2-结果

MUC1/CQC肽对MUC1寡聚体形成的影响。MUC1胞质结构域(MUC1-CD)含有寡聚体形成和核定位所必需的CQC基序(Leng等人，2007)。为了测定小分子是否可被设计为阻碍寡聚化，发明人合成了含有CQC基序的、源自MUC1-CD的N-末端区域的肽(MUC1/CQC肽；图1A)。在合成中包括了聚D-精氨酸转导结构域以促进所述肽进入细胞中(Fischer，2007)(图1A)。作为对照，合成了类似的肽，其中CQC基序被变为了AQA(MUC1/AQA肽；图1A)。为了评估所述肽与MUC1-CD的结合，发明人将组氨酸标记(His-tagged)的MUC1-CD固定在BIAcore传感芯片上。MUC1/CQC肽以30nM的解离常数(Kd)与His-MUC1-CD结合(图1B)，所述Kd与用MUC1-CD寡聚体所获得的相似(Leng等人，2007)。相反地，没有明显的MUC1/AQA肽的结合(数据未显示)。如通过聚丙烯酰胺凝胶电泳所检测到的，纯化的组氨酸标记的MUC1-CD形成寡聚体(图1C)。用MUC1/CQC肽孵育His-MUC1-CD大幅减少了寡聚体的形成并且增加了单体(图1C)。此外，用MUC1/AQA肽孵育有很小的效果(如果有任何效果的话)(图1C)。为了评估对于体内MUC1寡聚化的影响，用表达GFP-MUC1-CD和Flag-MUC1-CD的载体转染293细胞(图1D，左侧)。通过共沉淀来自未暴露于肽的细胞的裂解物，可检测GFP-MUC1-CD和Flag-MUC1-CD的复合物(图1D，右侧)。与体外结果相呼应，用MUC1/CQC肽孵育被转染的293细胞与破坏Flag-MUC1-CD和GFP-MUC1-CD之间的相互作用相关联(图1D，右侧)。此外，MUC1/AQA肽没有明显的效果(图1D，右侧)。这些结果表示，MUC1/CQC肽结合MUC1-CD并且在体外和在细胞中阻碍MUC1-CD寡聚体的形成。

MUC1/CQC肽阻碍MUC1-C向核的靶向。人的ZR-75-1和MCF-7乳腺癌细胞过表达内源性的MUC1，因此代表了用于评价MUC1/CQC肽的效果的潜在的模型(Ramasamy等人，2007)。为了评估摄取，用5μMFITC-MUC1/CQC肽孵育ZR-75-1细胞(图2A)。在2h时，通过流式细胞术对细胞的分析显示了荧光强度的可观增加，所述荧光强度的平均值(MFI)为145(图2A)。在6和24h时鉴别了MFI的进一步增加(图2A)。MUC1-C的寡聚化对于其核输入是必需的(Leng等人，2007)。用MUC1/CQC或MUC1/AQA肽处理ZR-75-1细胞对于细胞的MUC1-C水平没有影响(图2B)。然而，与对于寡聚化的影响相呼应，用MUC1/CQC肽进行的处理而非用MUC1/AQA肽进行的处理与核的MUC1-C水平的减少相关联(图2B)。在MCF-7细胞中观察到了类似的影响，响应于MUC1/CQC肽的处理，有核MUC1-C水平的下调(图2C)。这些发现表示，MUC1/CQC肽阻碍MUC1-C的寡聚化并且从而阻碍将MUC1-C靶向于核。

MUC1/CQC肽阻碍生长并且诱导坏死。为了确定MUC1/CQC肽是否影响生长，用5μMMUC1/CQC处理ZR-75-1细胞72小时，并就细胞周期分布进行监测。显著地，与未被处理的或用MUC1/AQA肽处理的细胞中的情形相比，在S期中有大量的停滞(图3A)。在96h时，S期的群体减少了，潜在地是通过细胞死亡的消耗(图3A)。具有亚-G1DNA内容的细胞积聚以支持凋亡的诱导是很少的(如果有的话)(图3A)。然而，用MUC1/CQC肽(而非用MUC1/AQA肽)对ZR-75-1细胞的处理与坏死的诱导相关联，所述坏死在72h时可检测到并且在96h时更加显著(图3B)。MCF-7细胞以S期中的生长停滞(图3C)和坏死的诱导(图3D)类似地响应MUC1/CQC肽。这些发现表示MUC1/CQC肽抑制人乳腺癌细胞的生长并诱导其坏死。

MUC1/CQC肽对于表达MUC1的癌细胞的特异性。为了确定MUC1/CQC肽针对过表达内源性MUC1的乳腺癌细胞是否具有选择活性，发明人处理了用MUC1siRNA使MUC1的表达被稳定沉默的ZR-75-1细胞(图4A)。与对照ZR-75-1/载体细胞的生长停滞和死亡相反，MUC1/CQC肽对于所述ZR-75-1/MUC1siRNA细胞具有显著较小的影响(图4B)。此外，MUC1/CQC肽对于MUC1-阴性293细胞的生长没有明显影响(图4C)。还在MCF-10A非转化的哺乳动物上皮细胞系(Muthuswamy，2001；Soule，1990)上进行了研究，所述细胞系表达MUC1，但是表达水平比在ZR-75-1和MCF-7细胞中所发现的低(Ahmad等人，2007)。值得注意地，与ZR-75-1和MCF-7细胞相反，MUC1/CQC肽对MCF-10A的细胞周期分布(图4D)和生长(图4E)没有影响。这些发现表示，MUC1/CQC肽针对过表达内源性MUC1的乳腺癌细胞具有选择活性。

MUC1/CQC在体内抑制肿瘤发生。为了确定MUC1/CQC肽的施用是否与对体重的影响相关，对5只雌性裸(nu/nu)小鼠进行了腹膜内(IP)注射，以50mg/kg的剂量每天注射一次。施用所述肽11天对于个体小鼠的重量没有明显影响。此外，在停止施用MUC1/CQC后，在接下来的28天对于体重没有后继影响(数据未显示)。为了评估抗肿瘤活性，将ZR-75-1细胞(1x10⁷)皮下植入裸小鼠的侧腹中。12天后，用MUC1/CQC肽以10和50mg/kg/d的剂量处理带有约150mm³的肿瘤的小鼠。作为对照，单独用媒介或用MUC1/AQA肽处理小鼠。与以50mg/kg/d给予MUC1/AQA肽所获得的结果相比，以10mg/kg/d x 21d施用MUC1/CQC肽减慢了生长(图5A)。此外，以50mg/kg/d施用MUC1/CQC肽，在处理的起初7天阻碍了生长(图5A)。因此，停止了处理并且就再生长监测小鼠。显著地，在接下来的17天，没有可检测到的肿瘤生长(图5A)。为了部分地评估此活性的基础，通过组织病理学检测了从对照小鼠和经处理的小鼠收获的肿瘤。与来自用媒介或MUC1/AQA肽处理的小鼠的肿瘤相比，来自用MUC1/CQC(10和50mg/kg)处理的小鼠的肿瘤是显著坏死的(图5B和数据未显示)。然而，值得注意的是，在坏死区域的周围也可检测到肿瘤细胞(图5B)。也用抗MUC1的抗体对肿瘤切片进行了染色。与对照肿瘤和用MUC1/AQA肽处理的肿瘤中的情况相比，用MUC1/AQA肽进行的处理与MUC1表达的显著下调相关(图5C和数据未显示)。

也在更大的肿瘤(～275mm³)上进行了研究(图6A)。以30mg/kg/dx 21d的中等剂量施用MUC1/CQC肽与肿瘤生长的停滞相关(图6A)。此外，在处理后的接下来31天没有明显的再生长(图6A)，进一步表明了MUC1/CQC肽在停滞肿瘤生长方面是有效的。在第52天收获的肿瘤显示出广大的坏死区域(图6B)以及MUC1表达的下调。这些发现表明MUC1/CQC肽下调MUC1的表达并且与诱导坏死和延长肿瘤生长的停滞相关。

MUC1-C-末端CQC铆合肽。控制许多生物学通路的细胞内蛋白-蛋白相互作用经常是由蛋白的α-螺旋结构介导的。螺旋肽也可干扰或稳定蛋白-蛋白相互作用。天然的螺旋肽作为治疗剂具有主要的缺点，因为低的效力、不稳定性和向细胞的低效递送。最近的研究显示了通过称为“烃铆合”的对α-螺旋肽的化学修饰可以克服这些问题。

发明人使用了MUC1-C末端内源肽序列(AIVYLIALAVCQCRRKNYG)并利用烃铆合产生了两个α螺旋肽GO-200-1B和GO-200-2B。

GO-200-1B：Ac-AIVYL-S5-ALA-S5-CQCRRKNYG-NH₂

GO-200-2B：Ac-AKKYL-S5-ALA-B5-CQC-S5-RKNY-NH₂

为了确定暴露于GO-200-1B是否影响非小细胞肺癌细胞的生长，用1和5μM GO-200-1B处理H-1650细胞7天并就生长进行监测。结果显示，用5μM GO-200-1B处理细胞与显著的生长抑制相关(图9A)。此外，用5μM GO-200-2B处理另一种非小细胞肺癌细胞系(H-1975)3天并监测了细胞生长及细胞死亡。结果显示用GO-200-2B处理H-1975细胞3天与对细胞增殖超过80％的抑制相关。此外，GO-200-2B还与显著的对细胞死亡的诱导相关(图9B)。这些发现表明铆合的MUC1-C肽在诱导人MUC1阳性癌细胞的生长停滞和死亡方面是有效的。

GO-203类似物。发明人最近的研究表明，MUC1C-末端肽(CQCRRKNYGQLDIFP)在抑制多种癌细胞系的生长方面是有活性的。他们还表明了更短的MUC1-C-末端肽CQCRRKN在杀死肿瘤细胞方面也是有活性的。然而，这些MUC1-C-末端肽是由L-氨基酸组成的。重要地，具有L-氨基酸的肽易于被蛋白水解酶降解，而已显示含有D-氨基酸的那些是更稳定的。因此，他们生成了上述更短的MUC1C-末端肽的全右旋形式，其中L-氨基酸被变成了D-氨基酸(GO-203)。此外，为了确定保持细胞杀死活性所需的最少的来自MUC1-C-末端区域的氨基酸残基，他们还生成了许多不同版本的GO-203，如图8中所述。

多种肿瘤细胞系在(ZR-75-1激素依赖性乳腺癌；MDA-MB-231三重阴性乳腺癌；A549非小细胞肺癌；H-1975非小细胞肺癌)在补充了10％加热失活的胎牛血清、100单位/mL青霉素和100μg/ml链霉素及2mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI-1640中生长。分别用5μM GO-203的不同类似物处理细胞(图8)3至7天，并且通过台盼蓝排除法确定存活性。将不同细胞系的繁殖与仅用媒介处理过的细胞进行比较。结果显示，用5μM不同的GO-203类似物处理多种肿瘤细胞系与显著的生长抑制相关(图10-14)。

组合疗法。用通过CombiTool程序生成的组合指数(CI)值相对于被药物组合影响的部分作图。对于顺铂和GO-203，所述CI值接近1，表明加成的相互作用。对于多柔比星(25，50，100，200nM)，紫杉酚(25，50，100nM)和TNF(10，20，40ng/ml)与GO-203，所获得的CI值小于1，支持了强的加成效果或协同作用(图15A-D和16)。

实施例3-讨论

MUC1/CQC肽阻碍MUC1寡聚化。MUC1的过表达足以诱导锚定不依赖性生长和肿瘤发生(Li等人，2003a；Huang等人，2003；Huang等人，2005)。然而，值得注意的是，通过将胞质结构域中的CQC基序突变为AQA而消除了MUC1转化功能(Leng等人，2007)。MUC1形成寡聚体并且CQC基序对于此寡聚化是必需的(Leng等人，2007)。此外，寡聚体的形成对于将MUC1-C亚基靶向核是必需的(Leng等人，2007)。MUC1-C亚基的其它功能(例如活化Wnt/β-联蛋白和IKKβ→NF-κB通路)也依赖于MUC1-C寡聚体的形成(未发表的数据)。基于这些发现，发明人推理，通过小分子破坏MUC1的寡聚化将有阻碍MUC1转化功能的潜能。在那种情境下中，他们合成了含有CQC基序和用于进入细胞的聚-Arg细胞递送结构域的MUC1-衍生肽。用此MUC1/CQC肽进行的起初的研究显示其在体外抑制MUC1-CD的寡聚化。正如之前由BIAcore分析所显示的，MUC1-CD以33nM的解离常数(Kd)形成二聚体(Leng等人，2007)。MUC1/CQC肽以30nM的Kd类似地结合MUC1-CD。此外，所表明的MUC1/AQA肽对于MUC1寡聚化有很小的影响(如果有任何影响的话)提供了关于依赖于CQC基序的支持。MUC1/CQC，而非MUC1/AQA，在抑制细胞中的MUC1-CD寡聚化方面也是有效的。这些发现因此表明，MUC1/CQC肽可被用于破坏MUC1寡聚化并从而潜在地破坏MUC1在人乳腺癌细胞中的功能。

MUC1/CQC肽对于过表达MUC1的癌细胞的选择性。细胞递送结构域(例如聚-D-Arg)及其缀合物至少大部分是通过内吞作用进入细胞的，然后它们需要到达其所欲的靶标(Fischer，2007)。MUC1/CQC肽进入ZR-75-1乳腺癌细胞是可容易地检测的并持续至少24小时。显著地，并且与MUC1的核靶向依赖于寡聚化一致(Leng等人，2007)，MUC1/CQC肽的摄取与核中MUC1-C水平的下调相关。用MCF-7乳腺癌细胞获得了类似的结果，表明对于MUC1/CQC肽的这种应答不是细胞特异性的。此外并且值得注意的是，这些细胞暴露于MUC1/CQC，而非MUC1/AQA，与生长停滞及坏死的诱导相关。重要的是，MUC1/CQC是否是通过依赖于其所欲靶标的表达的机制诱导死亡，还是非特异性的细胞毒素。在那种情境下，在ZR-75-1细胞中沉默MUC1消除了MUC1/CQC细胞毒性的效果。相反地，使非恶性的MCF-10A哺乳动物上皮细胞暴露于MUC1/CQC肽有很小的影响。这些发现表明，对于MUC1/CQC肽的敏感性依赖于MUC1的过表达以及与恶性表型相关联的MUC1功能。因此，MUC1/CQC肽似乎具有对于过表达MUC1的癌细胞为选择性的显性-负面(dominant-negative)活性。

MUC1/CQC肽的抗肿瘤活性。利用细胞递送结构域来递送治疗性装载物(Fischer，2007)。然而，如对于任何此类试剂一样，最重要的问题是MUC1/CQC肽是否能够以有效地治疗指数(即抗肿瘤活性和可接受的毒性谱)在体内被递送。在解决这一问题时，发明人发现以10和30mg/kg/d施用MUC1/CQC肽21天是被良好耐受的而没有明显的急性毒性。他们还发现，以此剂量进行治疗在消除肿瘤生长方面是有效的。这些结果与以50mg/kg/d施用MUC1/AQA肽21天是相反的，所述施用MUC1/AQA肽没有抗肿瘤活性。此外，并且有些令人惊讶地，在以30mg/kg/d定量施用21d后，没有肿瘤再生长的证据。以50mg/kg/d施用MUC1/CQC肽7天也显示了肿瘤的生长在处理之后持续的时期中保持停滞。这些结果至少部分地通过下述发现而得到解释：利用MUC1/CQC肽的处理与肿瘤坏死的诱导相关。

MUC1/CQC 7-mer的体外活性与MUC1/CQC 15-mer一样有效。基于这些发现，将预期MUC1/CQC 7-mer在体内肿瘤模型中作为抗肿瘤剂也将是有活性的。

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本申请中所公开的和要求保护的所有组合物和/或方法，均可根据本公开被制备和实施而无需过度试验。虽然从优选实施方式的角度描述了本发明的组合物和方法，下述对本领域技术人员而言将是显然的：变体可被应用于本申请中所描述的组合物和/或方法以及所述方法的步骤或步骤的顺序中，而不偏离本发明的概念、精神和范围。更特别地，下述将是显然的：某些在化学上和生理上均相关的试剂可替代本申请中所描述的试剂而将达到相同或相似的结果。所有对本领域技术人员而言是显然的此类类似的替换和修饰被认为在由所附权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念内。

VII.参考文献

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Claims

1.MUC1肽用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中抑制MUC1-阳性肿瘤细胞：

其中所述MUC1肽含有至少6个连续的MUC1残基和不多于20个连续的MUC1残基并且包含序列CQCRRK(SEQ ID NO:4)，其中CQCRRK的氨基-末端半胱氨酸在其NH₂-末端被至少一个氨基酸残基所掩盖，所述至少一个氨基酸残基无需对应于天然的MUC-1跨膜序列。

2.权利要求1的用途，其中所述肽包含至少7个连续的MUC1残基。

3.权利要求1的用途，其中所述肽含有不多于10个连续的MUC1残基，不多于11个连续的MUC1残基，不多于12个连续的MUC1残基，不多于13个连续的MUC1残基，不多于14个连续的MUC1残基，不多于15个连续的MUC1残基，不多于16个连续的MUC1残基，不多于17个连续的MUC1残基，不多于18个连续的MUC1残基或不多于19个连续的MUC1残基。

4.权利要求1的用途，其中所述MUC1肽由不多于20个连续的MUC1残基组成并包含SEQID NO:53的序列。

5.权利要求4的用途，其中所述MUC1肽由以下序列组成：

NH2-[dR]₉-C Q C R R K N -COOH；

NH2-[dR]₉-dC dQ dC dR dR dK dN -COOH；

Acetyl-[dR]₀-dC dQ dC dR dR dK dN -NH2；

NH2-dR dR dR dC dQ dC dR dR dK dN dR -COOH；

NH2-dR dR dC dQ dC dR dR dK dN dR -COOH；

Acetyl-dR dR dC dQ dC dR dR dK dN -NH2；

Acetyl-[dR]₉-dC dQ dC dR dR dK dN -NH2；

Acetyl-dR-dR-dC dQ dC dR dR dK dN -NH2；

NH2-[dR]₉-C Q C R R K N Y G Q L D I F P -COOH；或

Ac-A I V Y L-S5-A L A-S5-C Q C-R-R K N Y G-NH2。

6.权利要求1、4或5的用途，其中所述MUC1-阳性肿瘤细胞是癌细胞。

7.权利要求1、4或5的用途，其中所述MUC1-阳性肿瘤细胞是白血病细胞或骨髓瘤细胞。

8.权利要求6的用途，其中所述癌细胞是前列腺或乳腺癌细胞。

9.权利要求1、4或5的用途，其中所述肽与细胞递送结构域融合。

10.权利要求9的用途，其中所述细胞递送结构域是聚-D-R,聚-D-P或聚-D-K。

11.权利要求1、4或5的用途，其中所述药物通过静脉内、动脉内、肿瘤内、皮下、局部或腹膜内施用。

12.权利要求1、4或5的用途，其中所述药物通过局部、区域、全身或连续施用。

13.权利要求1、4或5的用途，其中抑制包括诱导所述肿瘤细胞的生长停滞、所述肿瘤细胞的凋亡和/或包含所述肿瘤细胞的肿瘤组织的坏死。

14.权利要求1、4或5的用途，其中所述药物与第二种抗癌疗法组合施用。

15.权利要求14的用途，其中所述第二种抗癌疗法是外科手术、化学疗法、放射疗法、激素疗法、毒素疗法、免疫疗法和冷冻疗法。

16.权利要求14的用途，其中所述第二种抗癌疗法在所述药物之前施用。

17.权利要求14的用途，其中所述第二种抗癌疗法在所述药物之后施用。

18.权利要求14的用途，其中所述第二种抗癌疗法与所述药物同时施用。

19.权利要求1、4或5的用途，其中所述受试者是人。

20.权利要求1、4或5的用途，其中所述药物中的所述肽以0.1-500mg/kg/d被施用。

21.权利要求1、4或5的用途，其中所述药物中的所述肽以10-100mg/kg/d被施用。

22.权利要求1、4或5的用途，其中所述药物被每天施用。

23.权利要求22的用途，其中所述药物被每天施用，施用7天、2周、3周、4周、一个月、6周、8周、2个月、12周或3个月。

24.权利要求1、4或5的用途，其中所述药物被每周施用。

25.权利要求24的用途，其中所述药物被每周施用，施用2周、3周、4周、6周、8周、10周或12周。

26.权利要求1的用途，其中所述肽包含的均为L氨基酸。

27.权利要求1的用途，其中所述肽包含的均为D氨基酸。

28.权利要求1的用途，其中所述肽包含L和D氨基酸的混合。

29.药物组合物，其包含：

(a)含有至少6个的连续的MUC1残基且不多于20个连续的MUC1残基的MUC1肽，并且所述MUC1肽包含序列CQCRRK，其中CQCRRK的氨基-末端半胱氨酸在其NH₂-末端被至少一个氨基酸残基所掩盖，所述至少一个氨基酸残基无需对应于天然的MUC1跨膜序列；和

(b)药学上可接受的载体、缓冲剂或稀释剂。

30.权利要求29的组合物，其中所述肽是至少7个连续的MUC1残基。

31.权利要求29的组合物，其中为不多于10个连续的MUC1残基，不多于11个连续的MUC1残基，不多于12个连续的MUC1残基，不多于13个连续的MUC1残基，不多于14个连续的MUC1残基，不多于15个连续的MUC1残基，不多于16个连续的MUC1残基，不多于17个连续的MUC1残基，不多于18个连续的MUC1残基或不多于19个连续的MUC1残基。

32.权利要求29的组合物，其中所述MUC1肽由不多于20个连续的MUC1残基组成并包含SEQ ID NO:53的序列。

33.权利要求29的组合物，其中所述MUC1肽由以下序列组成：

NH2-[dR]₉-C Q C R R K N -COOH；

NH2-[dR]₉-dC dQ dC dR dR dK dN -COOH；

Acetyl-[dR]₀-dC dQ dC dR dR dK dN -NH2；

NH2-dR dR dR dC dQ dC dR dR dK dN dR -COOH；

NH2-dR dR dC dQ dC dR dR dK dN dR -COOH；

Acetyl-dR dR dC dQ dC dR dR dK dN -NH2；

Acetyl-[dR]₉-dC dQ dC dR dR dK dN -NH2；

Acetyl-dR-dR-dC dQ dC dR dR dK dN -NH2；

NH2-[dR]₉-C Q C R R K N Y G Q L D I F P -COOH；或

Ac-A I V Y L-S5-A L A-S5-C Q C-R-R K N Y G-NH2。

34.权利要求29、32或33的组合物，其中所述肽与细胞递送结构域或细胞转导结构域融合。

35.权利要求34的组合物，其中所述细胞递送结构域是聚-D-R,聚-D-P或聚-D-K。

36.MUC1肽在制备用于抑制细胞中MUC1-寡聚化和核转运的药物中的用途，其中所述MUC1肽与表达MUC1的细胞接触，所述MUC1肽含有至少6个连续的MUC1残基且不多于20个连续的MUC1残基，并且所述MUC1肽包含序列CQCRRK，其中CQCRRK的氨基-末端半胱氨酸在其NH₂-末端被至少一个氨基酸残基所掩盖，所述至少一个氨基酸残基无需对应于天然的MUC1跨膜序列。

37.权利要求36的用途，其中所述肽是至少7个连续的MUC1残基。

38.权利要求36的用途，其中为不多于10个连续的MUC1残基，不多于11个连续的MUC1残基，不多于12个连续的MUC1残基，不多于13个连续的MUC1残基，不多于14个连续的MUC1残基，不多于15个连续的MUC1残基，不多于16个连续的MUC1残基，不多于17个连续的MUC1残基，不多于18个连续的MUC1残基或不多于19个连续的MUC1残基。

39.权利要求36的用途，其中所述MUC1肽由不多于20个连续的MUC1残基组成并包含SEQID NO:53的序列。

40.权利要求36的用途，其中所述MUC1肽由以下序列组成：

NH2-[dR]₉-C Q C R R K N -COOH；

NH2-[dR]₉-dC dQ dC dR dR dK dN -COOH；

Acetyl-[dR]₀-dC dQ dC dR dR dK dN -NH2；

NH2-dR dR dR dC dQ dC dR dR dK dN dR -COOH；

NH2-dR dR dC dQ dC dR dR dK dN dR -COOH；

Acetyl-dR dR dC dQ dC dR dR dK dN -NH2；

Acetyl-[dR]₉-dC dQ dC dR dR dK dN -NH2；

Acetyl-dR-dR-dC dQ dC dR dR dK dN -NH2；

NH2-[dR]₉-C Q C R R K N Y G Q L D I F P -COOH；或

Ac-A I V Y L-S5-A L A-S5-C Q C-R-R K N Y G-NH2。

41.权利要求36、39或40的用途，其中所述肽与细胞递送结构域融合。

42.权利要求41的用途，其中所述细胞递送结构域是聚-D-R,聚-D-P或聚-D-K。

43.权利要求36的用途，其中所述表达MUC1的细胞是肿瘤细胞。

44.权利要求36的用途，其中所述表达MUC1的细胞是癌细胞。

45.权利要求44的用途，其中所述表达MUC1的细胞是白血病细胞或骨髓瘤细胞。

46.权利要求44的用途，其中所述癌细胞是前列腺或乳腺癌细胞。