BRPI0920360A2 - peptideos do dominio citoplasmatico muc-1 e inibidores do cancer - Google Patents

Abstract

PEPTÍDEO MUC1,SEU USO,COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO O REFERIDO PEPTÍDEO BEM COMO MÉTODO IN VITRO DE INIBIÇÃO DE OLIGOMERIZAÇÃO DE MUC1. A presente invenção refere-se a peptídeos do domínio citoplasmático MUC1 e método de uso para eles. Esses peptídeos podem inibir a oligomenização MUC1, deste modo evitando o crescimento de células tumorais, induzindo a apoptose de células tumorais e a necrose do tecido tumoral in vivo.

Description

. vs7 Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTÍDEO MUC1, SEU USO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO ' O REFERIDO PEPTÍDEO BEM COMO MÉTODO /N VITRO DE INIBIÇÃO DE OLIGOMERIZAÇÃO DE MUC1". S — ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Ameri- cano Nº de Série 61/106.380, depositado no dia 17 de outubro de 2008, e o Pedido Provisório Americano Nº de Série 61/177.109, depositado no dia 11 de maio de 2009, todo o conteúdo de ambos os pedidos sendo por meio deste documento incorporados por referência.

1. Campo da Invenção A presente invenção refere-se à regulação do crescimento celu- lar e, mais particularmente, à regulação do crescimento da célula cancerosa. Em particular, foi mostrado que peptídeos MUC1 derivados de uma região particular do domínio citoplasmático MUC1 inibem a oligomerização MUC1 e a translocação nuclear, causando a inibição e até mesmo a morte de células tumorais que expressam MUC1.

2. Técnica Relacionada Mucinas são proteinas extensivamente O-glicosiladas que são —predominantemente expressas pelas células epiteliais. As mucinas secretadas e ligadas à membrana formam uma barreira física que protege as bordas api- cais de dano induzidos por toxinas, micro-organismos e outras formas de es- tresse que ocorrem na interface com o ambiente externo. A mucina 1 trans- membranar (MUC1) pode também sinalizar para o interior da célula através de — seu domínio citoplasmático. MUC1 não tem similaridade de sequência com ou- tras mucinas ligadas à membrana, exceto quanto à presença de um domínio de proteina-enteroquinase-agrina (SEA) de esperma de ouriço do mar (Duraisamy et al., 2006). Sob este aspecto, MUC1 é traduzido como um polipeptídeo único e, em seguida, sofre autoclivagem no domínio SEA (Macao, 2006).

A subunidade N-terminal MUC1 (MUC1-N) contém quantidades variáveis de repetições em tandem com uma alta proporção de serinas e treoninas que são modificadas pela O-glicositação (Siddiqui, 1988). MUC1-N estende-se além do glicocálix das células e é preso à superfície celutar atra-

vés da ligação não covalente com a subunidade C-terminal MUC1 trans- membranar (MUC1-C) (Merlo, 1989). MUC1-C consiste em um domínio ex- tracelular de 58 aminoácidos, um domínio transmembranar de 28 aminoáci- . dos e um domínio citoplasmático de 72 aminoácidos que interage com diver- sas moléculas de sinalização (Kufe, 2008). O derramamento de MUC1-N na barreira física protetora deixa MUC1-C na superfície celular como um recep- tor putativo. para transduzir sinais intracelulares que conferem crescimento e , sobrevivência (Ramasamy et al., 2007; Ahmad et a/., 2007). Evidências disponíveis indicam que os carcinomas humanos têm explorado a função MUC1 na promoção da tumorigenicidade. Neste contex- to, com a transformação e perda de polaridade, MUC1 é expresso em altos “o níveisemtodaa superfície celularnos carcinomas da mama e outros epité- lios (Kufe, 1984). Outro trabalho demonstrou que a superexpressão da Ú MUC1 confere tumorigenicidade e crescimento independente de ancoragem .- 15 (Liefal,2003a; Raina et al, 2004; Ren et al., 2004; Wei et al., 2005), pelo menos em parte, através da estabilização da B-catenina (Huang et al., 2005). Além disso, consistente com uma função de sobrevivência para células epí- teliais normais, a superexpressão de MUC1 confere resistência das células de carcinoma para apoptose induzida por estresse (Ren et al., 2004; Yin e —KUFE., 2003; Yin et al., 2004; Yin ef al., 2007). A perda de restrição à membrana apical permite a formação de complexos com o receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) e a coativação da sinalização mediada por EGFR (Li et al., 2001; Ramasamy et al., 2007). A superexpressão de MUC1 por células de carcinoma também está associada com a acumulação do MUC1-C no citosol e o direcionamento desta subunidade para o núcleo (Li et a/., 2003b; Li et al., 2003c.) e a mito- côndria (Ren et al., 2004; Ren et a/., 2006). Importantemente, a oligomeriza- ção de MUC1-C é necessária para o seu alvejamento nuclear e interação com diversos efetores (Leng et a/., 2007). Por exemplo, o domínio citoplas- —mático MUC1-C (MUC1-CD) funciona como um substrato para o c-Sre (Li et al., 2001), c-Abl (Raina et a/., 2006), a proteina quinase C3 (Ren et a/., 2002) e glicogênio sintase quinase 3 (Li et a/., 1998) e interage diretamente com o

EEE efetor da via Wnt, B-catenina (Yamamoto et al., 1997; Huang et a/., 2005), e o supressor do tumor p53 (Wei et al., 2005). Assim, enquanto a oligomeriza- ção parece ser importante, não houve nenhuma evidência direta de que a - interferência com a formação de oligômero MUC1 teria quaisquer efeitos — benéficos nas células tumorais, e muito menos como isto poderia ser reali- zado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Assim, de acordo com a presente invenção, é fornecido um mé- todo de inibição de uma célula tumoral MUC1-positiva em um indivíduo compreendendo a administração ao dito paciente de um peptíideo MUC1 de pelo menos 4 resíduos MUC1 consecutivos, e não mais de 20 resíduos “ MUCT consecutivos, e compreendendo a sequência do CQC, em que a cis- teina amino-terminal do CQC é coberta em seu terminal NH> por pelo menos S um resíduo de aminoácido que não precisa corresponder à sequência . 15 transmembranar MUC-1 natural. O peptídeo pode compreender pelo menos 5 resíduos MUC1 consecutivos, pelo menos 6 resíduos MUC1 consecutivos, pelo menos 7 resíduos MUC1 consecutivos, pelo menos 8 resíduos MUC1 consecutivos e a sequência pode especificamente compreender CQCR (SEQ ID NO: 54), COCRR (SEQ ID NO: 50), COCRRR (SEQ ID NO: 51), CQCRRRR (SEQ ID NO: 52), COCRRK (SEQ ID NO: 4) ou COCRRKN (SEQ ID NO: 53). O peptídeo pode conter mais de 10 resíduos consecutivos, 11 resíduos consecutivos, 12 resíduos consecutivos, 13 resíduos consecuti- vos, 14 resíduos consecutivos, 15 resíduos consecutivos, 16 resíduos con- secutivos, 17 resíduos consecutivos, 18 resíduos consecutivos ou 19 resí- — duos consecutivos de MUC1. O peptídeo pode ser fundido a um domínio de distribuição celular, como poli-D-R, poli-D-P ou poli-D-K. O peptídeo pode compreender todos os aminoácidos L, todos os aminoácidos D, ou uma mis- tura de aminoácidos L e D. A célula tumoral MUC1 positiva pode ser uma célula de carci- —noma, uma célula de leucemia ou uma célula de mieloma, como uma célula de carcinoma de próstata ou mama. A administração pode compreender a administração intravenosa, intra-arterial, intratumoral, por via subcutânea,

tópica ou intraperitoneal, ou local, regional, sistêmica ou contínua. A inibição pode compreender a indução da interrupção do crescimento da dita célula tumoral, a apoptose da dita célula tumoral e/ou a necrose de um tecido tu- - moral compreendendo a dita célula tumoral. O indivíduo pode ser um ser humano, O método pode ainda compreender a administração ao dito indi- víduo de uma segunda terapia anticâncer. A. segunda terapia anticâncer-po de ser cirurgia, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, tratamento com toxina, imunoterapia e crioterapia. A segunda terapia anticâncer pode ser administrada antes do dito peptídeo, após o dito peptídeo, ou ao mesmo tempo que o dito peptídeo. O método pode ainda compreender a etapa de avaliação da expressão da MUC1 em uma célula tumoral do dito indivíduo antes de administrar o dito peptídeo e/ou o método pode ainda compreender : a etapa de avaliação do efeito do dito peptídeo sobre a expressão de MUC1 . 15 emumtumordo dito indivíduo.

O peptídeo pode ser administrado a 0,1 a 500 mg/Kg/d, ou a 10 a 100 mg/Kg/d. O peptídeo pode ser administrado diariamente, por exemplo, por 7 dias, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, um mês, 6 semanas, 8 se- manas, dois meses, 12 semanas ou 3 meses. O peptídeo pode ser adminis- trado semanalmente, por exemplo, por 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas ou 12 semanas.

Em outra modalidade, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo (a) um peptíideo MUC1 de pelo menos 4 resíduos MUC1 consecutivos e não mais de 20 resíduos de MUC1 consecutivos e compre- endendo a sequência CQC, em que a cisteína amino-terminal do CQC é co- berta em seu NH, terminal por pelo menos um resíduo de aminoácido que não precisa corresponder à sequência transmembranar MUC1 nativa, e (b) um veículo, tampão ou diluente farmaceuticamente aceitável. O peptídeo pode ser, pelo menos, 5, 6, 7 ou 8 resíduos MUC1 consecutivos. O peptídeo — pode não ter mais de 10 resíduos consecutivos, 11 resíduos consecutivos, 12 resíduos consecutivos, 13 resíduos consecutivos, 14 resíduos consecuti- vos, 15 resíduos consecutivos, 16 resíduos consecutivos, 17 resíduos con-

SE EE secutivos, 18 resíduos consecutivos ou 19 resíduos consecutivos de MUC1. O peptídeo pode ser fundido a um domínio de distribuição celular, como poli- D-R, poli-D-P ou poli-D-K, ou um domínio de transdução celular, como um . domínio de transdução celular de HIV tat. O peptídeo pode ser de pelo me- —nos8 resíduos de comprimento, e pelo menos dois resíduos não adjacentes formam uma ponte através de suas cadeias laterais. A ponte pode compre- ender um ligante, cadeias laterais quimicamente modificadas, -ou ligação de hidrocarbonetos. Os ligantes podem compreender modificações que estabili- zam uma estrutura de alfa-hélice do dito peptídeo. O tampão pode compre- ender f-mercaptoetanol, glutationa ou ácido ascórbico, ou outro agente re- dutor que mantém o peptídeo em um estado monomérico.

Em outra modalidade, é fornecido um método de inibição de oli- gomerização de MUC1 e transporte nuclear em uma célula que compreende ] o contato de uma célula expressando MUC1 com um peptídeo MUC1 de + 15 pelomenos 4 resíduos MUC1 consecutivos e não mais de 20 resíduos MUC1 consecutivos e compreendendo a sequência CQC, em que a cisteína amino-terminal de CQC é coberto em seu terminal NH> por pelo menos um resíduo de aminoácido que não precisa corresponder à sequência trans- membranar MUC1 natural. O peptíideo pode compreender pelo menos 5 re- —síduos MUC1 consecutivos, pelo menos 6 resíduos MUC1 consecutivo, pelo menos 7 resíduos MUC1 consecutivos, pelo menos 8 resíduos MUC1 con- secutivos, e a sequência pode compreender mais especificamente CQCR, COCRR, COCRRR, CQCRRRR, CQCRRK ou CQCRRKN. O peptídeo pode conter não mais do que 10 resíduos consecutivos, 11 resíduos consecutivos, 12 resíduos consecutivos, 13 resíduos consecutivos, 14 resíduos consecuti- vos, 15 resíduos consecutivos, 16 resíduos consecutivos, 17 resíduos con- secutivos, 18 resíduos consecutivos ou 19 resíduos consecutivos de MUC1. O peptídeo pode ser fundido a um domínio de distribuição de células, tal como poli-D-R, poli-D-P ou poli-D-K. O peptídeo pode incluir todos aminoá- cidosL, todos os aminoácidos D ou uma mistura de aminoácidos L e D. A célula que expressa MUC1 pode ser uma célula tumoral, como uma célula de carcinoma, uma célula de leucemia ou uma célula de mielo-

TESE ma, como uma célula de carcinoma de próstata ou mama. A célula tumoral : pode estar localizada em um indivíduo vivo. O indivíduo vivo pode ser um indivíduo humano. . Em ainda outra modalidade, é fornecido um peptídeo mimético quemimetizaa estrutura e capacidade de ligação do MUC-1 de um peptídeo MUC1 de pelo menos 4 resíduos MUC1 consecutivos e não mais de 20 resí- duos. .MUC1 consecutivos e compreendendo a sequência CQC, em que a cisteína amino-terminal de CQC é coberta em seu terminal NH; em pelo menos um resíduo de aminoácido que não precisa corresponder à sequên- cia transmembranar MUC1 nativa. Uma modalidade adicional fornece um peptídeo MUC1 de pelo menos 3 resíduos MUC1 consecutivos e não mais “o de20resíduos MUC1 consecutivos e compreendendo a sequência CQC, em NS que todos os resíduos de aminoácidos dos ditos peptídeos são aminoácidos i D. O peptídeo pode ainda compreender a sequência KRRCQC (SEQ ID NO: . 15 49).

A célula cancerosa pode ser, por exemplo, um câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer renal, câncer de estômago, câncer do fígado, câncer ósseo, câncer hematológico, câncer do tecido neural, melanoma, câncer de ovário, câncer de testículo, câncer de próstata, câncer cervical, câncer vaginal ou células cancerosas da bexiga.

Também englobados pela invenção são os métodos de matar uma célula cancerosa. Os métodos podem incluir, antes, depois ou ao mes- mo tempo que a execução dos métodos descritos acima, a exposição do indivíduo a uma ou mais terapias adicionais. As terapias podem ser, por e- xemplo, uma ou mais formas de radiação ionizante e/ou um ou mais agentes quimioterapêuticos. O um ou mais agentes quimioterapêuticos pode ser, por exemplo, cisplatina, carboplatina, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfa- mida, camptotecina, ifosfamida, melfalano, clorambucil, bissulfano, nitrossu- reia, dactinomícina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicomicina, — mitomicina, etoposídeo, verampil, podofilotoxina, tamoxífeno, taxol, transpla- tina, 5-fluoruracil, vincristina, vinblastina, metotrexato ou um análogo de qualquer um dos acima mencionados. Também são contemplados como terapias de combinação a terapia hormonal, a imunoterapia, terapia com to- xina, crioterapia e cirurgia. É contemplado que qualquer método ou composição aqui descri- . ta pode ser implementada com relação a qualquer outro método ou a com- posição descrita aqui. O uso da palavra "um" ou "uma" quando usado em conjunto com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou no relatório descritivo po- de significar "um", mas também é consistente com o significado de "um ou mais", "pelo menos um", e "um ou mais de um". A palavra "cerca de" signifi- camais ou menos 5% do número indicado. Outros objetos, características e vantagens da presente inven- “o çãosetornarãoevidentesa partirda descrição detalhada a seguir. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, Ú embora indicando modalidades específicas da invenção, são fornecidos so- . 15 mente a título de ilustração, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e escopo da invenção se tornarão evidentes para as pes- soas versadas na técnica a partir desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Os desenhos a seguir fazem parte do presente relatório descriti- 20 voe são incluídos para demonstrar adicionalmente certos aspectos da pre- sente invenção. A invenção pode ser mais bem entendida por referência a um ou mais desses desenhos em combinação com o detalhado. FIGURAS 1A-D. Oligomerização de MUC1 de blocos de peptí- deo MUC1/CQC. (figura 1A) Representação esquemática da subunidade 25 MUC1-C e da sequência de 72 aminoácidos de MUC1-CD é mostrada. Os aminoácidos N-terminais (sequência sombreada) MUC1/CQC e peptí- deos MUC1/AQA modificados foram sintetizados com o domínio de transdu- ção poli-dArg. (figura 1B). His-MUC1-CD (1,4 mg/mL) foi imobilizada em um chip sensor em um BlAcore. MUC1/CQC foi injetado sobre o chip a 10 uM. Os dados de ligação brutos foram analisados pelo software BlAevaluation versão 3.0 e ajustados para um modelo de ligação Languir 1:1 vinculativo. (figura 1C) His-MUC1-CD purificado (1,5 mg/mL) foi incubado com PBS,

MUC1/CQC 200 uM ou MUC1/AQA 200 uM por 1 h em temperatura ambien- te.

As proteínas foram separadas em um gel de SDS-poliacrilamida não re- dutor e analisadas por imunoblotting com anti-MUC1-C. (figura 1D) Células - 293 foram transfectadas transitoriamente para expressar um vetor vazio ou —GFP-MUC1-CD e Flag-MUC1-CD.

Em 48 h após a transfecção, as células foram tratadas com MUC1/CQC 5 uM ou MUC1/AQA por 3 d.

As células fo- ram então coletadas por imunoblotting com anti-MUC1-C (painel esquerdo). Lisados de células inteiras foram também precipitadas com anti-Flag e os precipitados foram imunomanchados com anticorpos indicados (painéis à direita). FIGURAS 2A-C.

Localização nuclear dos blocos de peptídeos MUC1/CQC de MUC1-C. (figura 2A) Células ZR-75-1 foram incubadas com ' o peptídeo MUC1/CQC marcado com FITC 5 uM para os tempos indicados Ú e, em seguida, analisados por citometria de fluxo.

O índice de fluorescência .- 15 média (MFI) é incluído em cada um dos painéis. (figuras 2B-C) Células ZR- 75-1 (figura 2B) e MCF-7 (figura 20) foram incubadas na presença do pepti- deo MUC1/CQC ou MUC1/AQA 5 uM por 3 d.

Lisados de células inteiras (WCL) (painéis à esquerda) e lisados nucleares (painéis à direita) foram i- munomarcados com os anticorpos indicados.

FIGURAS 3A-D.

O peptídeo MUC1/CQC induz a parada na fase S e a necrose.

As células ZR-75-1 (figuras 2A-B) e MCF-7 (figuras 2C-D) foram tratadas com MUC1/CQC ou MUC1/AQA 5 uM por 3 e 4 d.

As células foram fixadas e analisadas para a distribuição do ciclo celular por citometria de fluxo (figuras 2A e 2C). A porcentagem de células nas fases G1, S e G2/M está incluída nos painéis.

As células foram também marcadas com iodeto de propídio e analisadas por citometria de fluxo para necrose (figuras 2B e 2D). O porcentual de células necróticas está incluído nos painéis.

FIGURAS 4A-E.

Seletividade de MUC1/CQC para MUC1 ex- pressando células de câncer de mama. (figura 44) Células ZR-75-1 foram —estavelmente infectadas com um lentivírus vazio (vetor) ou um expressando um siRNA MUC1. Lisados para as células infectadas foram imunomarcados com os anticorpos indicados. (figura 4B) Células de ZR-75-1/vetor foram mantidas não tratadas (diamantes) e as células ZR-75-1/vetor (quadrados) e : ZR-75-1I/MUC1ISIRNA (triângulos) foram tratadas com o peptideo MUC1/CQC 5 mM pelos tempos indicados. O número de células viáveis foi . determinado pela exclusão com azul tripano. (figura 4C) 293 células foram deixadas sem tratamento (diamantes), e tratadas com MUC1/CQC 5 uM (quadrados) ou MUC1/AQA (triângulos) para os tempos indicados. O número : de células viáveis foi determinado pela exclusão de azul. tripano, (figura 4D) Células MCF-10A foram deixadas sem tratamento (painel esquerdo), e trata- das com MUC1/CQC 5 uM (painel do meio) ou MUC1/AQA (painel direito). Em3d,as células foram analisadas quanto a distribuição do ciclo celular. (figura 4E) Células MCF-10A foram deixadas sem tratamento (diamantes), e “o tratadas com MUC1/CQC 5 mM (quadrados) ou MUC1/AQA (triângulos) pelo = tempos indicados. O número de células viáveis foi determinado por exclusão ' de azul tripano. 2 15 FIGURAS 5A-C. O peptíideo MUC1/CQC bloqueia o crescimento de xenoenxertos de tumor de mama ZR-75-1. (figura 5A) Camundongos Balb-c nu/nu fêmeas de quatro a seis semanas de idade foram implantados com plugues de 17-B-estradiol. Após 24 h, as células do câncer de mama ZR-75-1 (embebidas em matrigel) foram injetadas subcutaneamente no flan- co. Quando os tumores estavam com - 150 mmº?, os camundongos foram pareados em pares e injetados intraperitonealmente com PBS (controle de veículo; quadrados fechados), 50 mg/Kg de peptideo MUC1/AQA (peptídeo controle; quadrados abertos) ou 10 mg/Kg de peptídeo MUC1/CQC (triângu- los fechados) diariamente durante 21 d. Outro grupo foi tratado com 50 mg/Kgde peptideo MUC1/CQC diariamente durante 6 d (triângulos abertos). Os camundongos foram pesados duas vezes por semana e as medições do tumoral foram efetuadas a cada 4 d. (figuras 5B e 5C). No dia 24 (asterisco), os tumores coletados do grupo controle e o grupo tratado com 50 mg/Kg/d x 6d foram marcados com H&E (figura 5B) e com um anticorpo contra MUC1 (figura5C).

FIGURAS 6A-B. Efeitos prolongados do peptideo MUC1/COC nos tumores ZR-75-1. (figura GA) Os camundongos foram injetados com cé-

lulas ZR-75-1 conforme descrito na legenda para a figura 5A. Quando os : tumores tinham — 275 mm?, os ratos foram pareados em grupos e injetados intraperitonealmente com PBS (controle de veículo; quadrados abertos) ou . 30 mg/Kg de peptídeo MUC1/CQC (quadrados fechados) diariamente por 21 dias. Os camundongos de controle foram sacrificados no dia 32, quando os tumores atingiram — 1200 mm?. Os camundongos tratados foram monitora- dos: até -o dia 52-quando os tumores foram -retirados para marcação com H&E (figura 6B). FIGURA 7, MUC1 7-mer inibe carcinoma de próstata. As células de carcinoma de próstata DU145 foram tratadas com peptídeos curtos CQC 5 uM (7-mer) ou peptídeos longos CQC 5 uM (15-mer) por 4 dias. O cresci- mento de células foi medido pelo ensaio de MTT. Os dados representam a - inibição de crescimento porcentual em comparação com células não tratadas Ú (controle). 2 15 FIGURA 8. Sequências de peptídeos grampeados MUC1-CD. FIGURA 9A. Efeitos do peptídeo grampeado MUC1-CD no cres- cimento de células de carcinoma de pulmão de células não pequenas H1650. Para avaliar a sensibilidade à inibição da função MUC1, células H1650 NSCLC foram tratadas com 1 e 5 uM de peptídeo grampeado MUC1 CQOC1eS5uM(GO-200-1B) durante 7 dias. O tratamento de células H1650 com GO-200-1B 5 uM foi associado com a inibição significativa do cresci- mento e, depois com um decréscimo no número de células.

FIGURA 9B. Efeito de GO-200-2B na proliferação celular. A |li- nhagem de células de carcinoma de pulmão não pequenas H-1975 cresceu emmeio DMEM com 10%, de soro bovino fetal inativado pelo calor com 100 unidades/mL de penicilina, 100 ug/mL de estreptomicina e 2 mmol/L de L- glutamina, As células foram ressemeadas um dia antes dos tratamentos. As células foram tratadas com 5 uM de GO-200-2B por 3 dias e a viabilidade celular foi determinada pela exclusão de azul tripano.

FIGURA 10. Efeito de diferentes peptídeos da região MUC1-CD CQC no crescimento de células de carcinoma de mama hormônio- dependentes. Para determinar se a exposição a diferentes peptídeos con-

ETERNA

| 11/57 tendo a região MUC1-CD CQC afeta o crescimento, células de carcinoma de mama ZR-75-1 foram tratadas com 5 uM de peptídeos diferentes durante 4 dias e monitoradas para a proliferação celular. Significativamente, houve ' uma inibição do crescimento substancial em comparação com aquela nas célulasnão tratadas, FIGURA 11. Efeito de diferentes peptídeos da região MUC1-CD COC sobre o crescimento de células.de carcinoma não pequenas. As célu- las de carcinoma de pulmão não pequenas A549 foram tratadas com GO- 203, GO-203-2 e GO-203cyc 5 uM por 7 dias. O número de células viáveis nodia?7 foi determinado pela exclusão do azul tripano e a inibição do cres- cimento porcentual foi calculada comparando o crescimento das células das o células nãotratagas UU :"AÉEET : FIGURA 12. Efeito de diferentes peptídeos da região MUC1-CD : CQC sobre o crescimento de células de carcinoma não pequenas H1975. As - 15 célulasde carcinoma de pulmão não pequenas H1975 foram tratadas com 5 HM de diferentes peptídeos da região MUC1-CD CQC por 6 dias. O número de células viáveis no dia 6 foi determinado pela exclusão de azul tripano. Os resultados demonstram que o tratamento de células H1975 com 5 uM de diferentes peptídeos foi associado com significativa inibição do crescimento.

FIGURA 13. Efeito de diferentes peptídeos da região MUC1-CD CQC sobre o crescimento de células de carcinoma de mama triplo negati- vas. Células de carcinoma de mama triplo negativas foram tratadas com 5 UM de diferentes peptídeos da região MUC1-CD CQC durante 6 dias. O nú- mero de células viáveis no dia 6 foi determinado pela exclusão do azul tripa- no Os resultados demonstram que o tratamento de células MDA-MB-231 com diferentes peptídeos foi associado com significativa inibição do cresci- mento.

FIGURA 14, Efeito dos peptídeos GO-203 mais curtos sobre a proliferação de células de câncer de mama ZR-75-1. Células de câncer de “mama ZR-75-1 humanas foram cultivadas em RPMI1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado por calor, 100 unidades/mL de penicilina, 100 ug/mL de estreptomicina., As células foram tratadas com peptídeos dife-

rentes em 5 uM todos os dias durante quatro dias e a viabilidade celular foi determinada pela exclusão do azul tripano. Ao contrário do GO-210, o trata- mento de células de carcinoma de mama ZR-75-1 com 5 uM de GO-203 " (SEQ ID NO: 53), GO-207 (SEQ ID NO: 4), GO-208 (SEQ ID NO : 50) e GO- 209(SEQIDNO: 54) todos os dias durante 4 dias foi associado com inibição significativa do crescimento.

EIGURAS 154-D, Efeitos-de G0-203 em combinação com dife- . rentes fármacos anticâncer. As células ZR-75-1 foram expostas às concen- trações indicadas de Cisplatina (figura 15A), doxorrubicina (figura 15B), rh- TNF-a (figura 15C) e Taxol (figura 15D) isoladamente e em combinação com GO-203. O tratamento foi sequencial para cisplatina, doxorrubicina e Taxol onde as células foram expostas a esses agentes por 72 h, seguido de trata- - mento com 5 uM de GO-203, por 72 h. Em estudos com rh-TNF, as células foram expostas concomitantemente a diferentes concentrações de rh-TNF + 15 isoladamente e em combinação com 5 uM de GO-203 por 72 h. O ensaio MTS foi utilizado para determinar a sobrevivência das células.

FIGURA 16. GO0-203 é aditivo ou sinergístico com agentes anti- câncer. Os gráficos mostram índices de combinação contra diferentes níveis de efeito (fração afetada). O nível de efeito foi obtido por tratamento de célu- lascomas combinações indicadas de fármacos anticâncer e GO-203.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS |. A Presente Invenção MUC1 tem sido amplamente estudado pelos inventores e outros por seu papel no câncer. Como discutido acima, MUC1 humano é uma gli- coproteína heterodimérica, traduzida como um polipeptídeo único e clivada em subunidades N- e C-terminais no retículo endoplasmático (Ligtenberg et al., 1992; Macao et al., 2006; Levitin et a/., 2005). A superexpressão aber- rante de MUC1, como encontrado na maioria dos carcinomas humanos (KUFE et al., 1984), atribui o crescimento independente de ancoragem e tu- morigenicidade (Li et a/., 2003a; Huang et a/., 2003; Schroeder et al., 2004; Huang et al., 2005). Outros estudos têm demonstrado que a superexpressão da MUC1 confere resistência a apoptose induzida por estresse oxidativo e

REA agentes anticâncer genotóxicos (Yin e KUFE, 2003; Ren et a/l., 2004; Raina : et al., 2004; Yin et al., 2004; Raina et a/., 2006; Yin et al., 2007). A família de funções de mucinas amarradas e secretadas no for- " necimento de uma barreira protetora da superfície das células epiteliais.

Com danos à camada epitelial, as junções justas entre as células vizinhas são rompidas, e a polaridade é perdida conforme as células iniciam um pro- grama de reparo induzido. por heregulina (Vermeer ef.al., 2003). MUC1-N é desprendido da superfície celular (Abe e Kufe, 1989), deixando MUC1-C funcionar como um transdutor de sinais de estresse ambiental para o interior da célula.

Sob esse aspecto, MUC1-C forma complexos de superfície celular com membros da família de receptores ErbB, e MUC1-C é direcionado para “o núckoem resposta à estimulação de heregulina (Li ef al, 2001; Lietal, | NS

2003c). MUC1-C também funciona na integração do receptor ErbB e nas vias de sinalização Wnt através de interações diretas entre o domínio cito- . 15 plasmático MUC1 (CD) e os membros da família de catenina (Huang et al, 2005; Li et al., 2003c; Yamamoto et a/l., 1997; Li et al., 1998; Li et al., 200; Li e Kufe, 2001). Outros estudos têm demonstrado que o MUC1-CD é fosforila- do pela glicogênio sintase quinase 3fB, c-Src, proteina quinase Cô e c-Abl

(Raina et al., 2006; Li et al., 1998; Li et al., 2001; Ren et a/., 2002). Os mecanismos responsáveis pelo direcionamento nuclear de MUC1-C não são claros.

Proteínas contendo um sinal de localização nuclear clássico (NLS) são importadas para o núcleo através da primeira ligação à importina a. e, em seguida, por sua vez, importina B (Weis, 2003). O comple- xo cargo-importina o/B se acomoda ao poro nuclear pela ligação às nucleo- porinase é transportado através do poro por um mecanismo dependente da Ran GTPase.

NLSs clássicos são monopartite com um único grupo de 4 a 5 aminoácidos básicos ou bipartite, com dois grupos de aminoácidos básicos separados por um ligante de 10 a 12 aminoácidos.

MUC1-CD contém uma porção RRK que não se conforma com NLS monopartite prototípico (Hodel etal, 2002). No entanto, certas proteínas contendo NLSs não clássicas são transportadas através do poro nuclear, ligando diretamente à importina 3 (Kau ef a/., 2004). Associados de B importina com várias nucleoporinas

(Ryan e Wente, 2000), incluindo Nup62, que está localizado em ambas as : faces citoplasmática e nucleoplásmica dos complexos de poro nuclear (Per- cipalle et a/., 1997). Outros estudos indicaram que a B-catenina é importada . dentro do núcleo por um mecanismo independente de nucleoporina (Suh e Gumbiner, 2003).

Em 2006, os inventores informaram que MUC1 é importado den- tro do-núcleo-por um mecanismo -que envolve a ligação ao -Nup62. Eles-tam- bém demonstraram que MUC1 forma oligômeros através de uma porção CQC no domínio citoplasmático MUC1 e que a oligomerização MUC1 é ne- cessária para a importação nuclear. Aqui, eles estenderam este trabalho pa- ra abranger uma compreensão adicional do papel que a porção CQC de- sempenha na formação do oligêmero. Eles também demonstraram que os peptídeos curtos correspondentes a esta região são capazes de romper a Ú formação do oligômero MUC1, prevenindo o transporte para o núcleo das :; 15 células tumorais. Estes peptídeos são capazes de inibir o crescimento de células tumorais, bem como induzir a apoptose em tais células e até mesmo a necrose do tecido tumoral. Estes e outros aspectos da invenção são des- critos em detalhes abaixo.

1. MUC1 A Estrutura MUC1 é uma glicoproteína tipo mucina, que é expressa nas bor- das apicais das células epiteliais secretoras normais (Kufe et al/., 1984). MUC1 forma um heterodimero após síntese como um polipeptídeo único e clivagem do precursor em duas subunidades no retículo endoplasmático (Ligtenberg et al., 1992). A clivagem pode ser mediada por um processo au- tocatalítico (Levitan et a/.,, 2005). A subunidade N-terminal de MUC-1 > 250 KDa (MUC1 N-ter, MUC1-N) contém números variáveis de repetições de 20 aminoácidos em tandem que são imperfeitas, com variações altamente con- servadas, e são modificadas por glicanos O-ligados (Gendler et a/., 1988; Siddiqui eta, 1988). MUC1-N é preso à superfície celular pela dimerização com a subunidade C-terminal de — 23 KDa (MUC1 C-ter, MUC1-C), que in- clui uma região extracelular de 58 aminoácidos, um domínio transmembra-

ROSSAS nar de 28 aminoácidos e uma domínio citoplasmático de 72 aminoácidos (CD; SEQ ID NO: 1) (Merlo et a/., 1989). A sequência MUC1 humana é mos- trada abaixo:

GSVVWVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPF — SAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCAQCRRKNYGQLDIFPAR

DTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAA TSANL (SEQ.1ID NO:2) A sequência em negrito indica o CD, e a parte sublinhada é um peptídeo inibidor de oligêmero (SEQ ID NO: 3) descrito nos exemplos. Com a transformação do epitélio normal para carcinomas, MUC1 é aberrantemente superexpresso no citosol e em toda a membrana celular “o (KUFEetal,1984;Pereyetal, 1992). MUC1 associado à membrana celular - é direcionado aos endossomas por endocitose mediada por clatrina (Kinlou- | gh et a/., 2004). Além disso, MUC1-C, mas não MUC1-N, é direcionado para : 15 o núcleo (Baldus et a/., 2004; Huang et a/l., 2003; Li et al., 2003a; Li et al, 2003b; Li et al,, 2003c; Wei et a/., 2005; Wen et a/l., 2003) e mitocôndria (Ren et al., 2004). B. Função MUC1 interage com os membros da família de receptores ErbB (Lietal,2001b; Li etal. 2003c; Schroeder et a/., 2001) e com o efetor Wnt, B-catenina (Yamamoto et a/l., 1997). O receptor do fator de crescimento epi- dérmico e c-Src fosforilam o domínio citoplasmático MUC1 (MUC1-CD) em Y-46 e, assim, aumentam a ligação de MUC1 e B-catenina (Li et al., 2001a; Li et al., 2001b). A ligação da MUC1 e da B-catenina também é regulada pe- lo glicogênio sintase quinase 33 e proteina quinase Cô (Li et a/., 1998; Ren et al., 2002), MUC1 colocaliza com B-catenina no núcleo (Baldus et a/., 2004; Li ef al., 2003a; Li ef al., 2003c; Wen et a/., 2003) e coativa a transcrição de genes-alvo Wnt (Huang et al, 2003). Outros estudos mostraram que a MUC1 também se liga diretamente a p53 e regula a transcrição dos genes- alvop53 (Wei et al, 2005). Notavelmente, a superexpressão de MUC1 é suficiente para induzir o crescimento independente de ancoragem e tumori- genicidade (Huang et al., 2003; Li et al., 2003b; Ren et a/., 2002; Schroeder et al., 2004). : A maioria das proteínas mitocondriais são codificadas no núcleo e são importadas para dentro da mitocôndria por complexos de translocação ' nas membranas externa e interna da mitocôndria.

Algumas proteínas mito- condriais contêm sequências de alvejamento mitocondrial N-terminais e inte- ragem com Tom20 na membrana externa mitocondrial (Truscott et a/., 2003). Qutras. proteínas mitocondriais internas. contêm sequências de atvejamento internas e interagem com o receptor Tom70 (Truscott et al., 2003). Trabalhos recentes mostraram que as proteínas mitocondriais sem sequências internas de alvejamento são entregues a Tom70 por um complexo de HSP70 e HSP90 (Young ef a/., 2003). o NM PeptidoáaMIca . A.

Estrutura i A presente invenção contempla o projeto, produção e uso de vá- ; 15 rios peptídeos MUC1, As características estruturais destes peptídeos são as seguintes.

Primeiro, os peptídeos não têm mais de 20 resíduos consecutivos de MUC1. Assim, o termo "um peptídeo que não tenha mais de 20 resíduos consecutivos", mesmo quando incluir o termo "compreendendo", não pode ser entendido como compreendendo um número maior de resíduos MUC1 consecutivos.

Em segundo lugar, os peptídeos conterão a porção CQC, e podem incluir também a porção CQCR, a porção CQCRR e a porção CQ- CRRK.

Assim, os peptídeos terão, no mínimo, estes três resíduos consecuti- vos do domínio MUC1-C.

Em terceiro lugar, os peptídeos terão pelo menos um resíduo de aminoácido ligado ao lado NH7 terminal do primeiro resíduo C —naporçãoCQC, de tal forma que o primeiro resíduo C é "coberto", pelo me- nos, por um aminoácido que se fixa a ele.

Este resíduo pode ser natural ao MUC1 (isto é, a partir do domínio transmembranar), pode ser selecionado ao acaso (qualquer um dos 20 aminoácidos de ocorrência natural ou seus aná- logos), ou pode ser parte de outra sequência de peptídeo (por exemplo, uma sequência etiqueta para purificação, uma sequência de estabilização, ou um domínio de distribuição celular). Em geral, os peptídeos, serão de 50 resíduos ou menos, mais FEET:

uma vez, compreendendo não mais do que 20 resíduos consecutivos de MUC1. O comprimento total pode ser de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ' 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 resíduos. Fai- xasde comprimento de peptídeo de 4 a 50 resíduos, 5 a 50 resíduos, 6 a 50 resíduos, 7 a 50 resíduos, 7 a 25 resíduos, 4 a 20 resíduos, 5 a 20 resíduos, 6-2 -20-residuos; 7 a-20 resiídues 0-7 -a- 16-residuos-são contempladas. O número de resíduos MUC1 consecutivos pode ser de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. Faixas de resíduos consecutivos de 4 a resíduos, 5 a 20 resíduos, 6 a 20 resíduos, 7 a 20 resíduos e 4 a 15 resí- duos, 5 a 15 resíduos, 6 a 15 resíduos ou 7 a 15 resíduos são contempla- das.

“ A presente invenção pode utilizar um aminoácidos de configura- ção L, aminoácidos de configuração D, ou uma mistura do mesmos. Apesar -« 15 deosaminoácidosL representarem a grande maioria dos aminoácidos en- contrados nas proteínas, aminoácidos D são encontrados em algumas prote- ínas produzidas por organismos exóticos marinhos, como os caramujos. E- les também são componentes abundantes das paredes celulares de pepti- doglicanos de bactérias. D-serina pode agir como um neurotransmissor no 20 cérebro. A convenção L e D para a configuração de aminoácidos não se re- fere à atividade ótica do aminoácido em si, mas sim para a atividade óptica do isômero de gliceraldeído a partir do qual este aminoácido pode, teorica- mente, ser sintetizado (D-gliceraldeido é dextrorrotatório; L- gliceraldeido é levorrotatório). Uma forma de um peptídeo "todo-D" é um peptídeo retroinverso. A modificação retroinversa de polipeptídeos de ocorrência natural envolve a montagem sintética de aminoácidos com uma estereoquímica de carbono a oposta à dos aminoácidos L correspondentes, isto é, aminoácidos D em or- dem inversa no que diz respeito à sequência de peptídeo natural. Um análo- go retroinverso, assim, tem terminais revertidos e direção reversa das liga- ções peptídicas (NH-CO ao invés de CO-NH), enquanto mantém aproxima- damente a topologia das cadeias laterais como na sequência do peptídeo

EEE RREO E E OD natural. Vide Patente US Nº 6.261.569, aqui incorporada por referência. Como mencionado acima, a presente invenção contempla a fu- são ou conjugação de um domínio de distribuição celular (também chamado ' de vetor de distribuição celular, ou domínio de transdução celular). Tais do- —míniossãobem-conhecidos na técnica e são geralmente caracterizados co- mo peptídeos catiônicos anfifáticos e derivativos de peptídeos, frequente- mente -contendo múltiplos resíduos-de lisina e arginina (Fischer, 2007). De particular interesse são as sequências poli-D-Arg e poli-D-Lys (por exemplo, resíduos dextrorrotatórios, oito resíduos de comprimento), enquanto outros sãomostrados na Tabela 1, abaixo., TABELA 1 PEPTÍDEOS CDD/CTD SEQ ID NO 1 QAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE 5 ROIKIWFONRRMKWKK 6 z RRMKWKK 7 RRWRRWWRRWWRRWRR 8 RGGRLSYSRRRFSTSTGR 9 YGRKKRRORRR 10 RKKRRORRR 11 YARAAARQARA 12 RRRRRRRR 13 KKKKKKKK 14 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKXIL 15 LLILLRRRIRKQANAHSK 16 SRRHHCRSKAKRSRHH 17 NRARRNRRRVR 18 RQOLRIAGRRLRGRSR 19 KLIKGRTPIKFGK 20 RRIPNRRPRR 21 KLALKLALKALKAALKLA 22 KLAKLAKKLAKLAK 23 GALFLGFLGAAGSTNGAWSQPKKKRKV 24

EEE ASR RETAS

PEPTÍDEOS CDD/CTD SEQ ID NO . KETWWETWWTEWSQPKKKRKV 25 GALFLGWLGAAGSTMGAKKKRKV 26 MGLGLHLLVLAAALOGAKSKRKV 27 AAVALLPAVLLALLAPAAANYKKPKL 28 MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP 29 LGTYTQADFNKFHTFPEATAIOVGAP 3o DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPXPD 31 PPPPPPPPPPPPPP 32 VRLPPPVRLPPPVRLPPP 33 PRPLPPPRPG 34 O SVRRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPP 35 TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK 36 ' GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS 37 : KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK 38 ALWMTLLKKVLKAAAKAALNAVLVGANA 39 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ 40 INLKALAALAKKIL 41 GFFALIPKIISSPLPKTLLSAVGSALGGSGGQE 42 LAKWALKQGFAKLKS 43 SMAQDIISTIGDLVKWIIQTVNXFTKK 44 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVORIKQRIKDFLANLVPRTES 45 LKKLLKKLLKKLLKKLLKKL 46 KLKLKLKLKLKLKLKLKL 47 PAWRKAFRWAWRMLKKAA 48 Também conforme mencionado acima, peptídeos modificados para utilização in vivo pela adição, nas extremidades amino e/ou carbóxi terminais, de um agente de bloqueio para facilitar a sobrevivência do pepti- deo in vivo são contempladas. Isso pode ser útil nas situações em que os terminais de peptídeo tendem a ser degradados por proteases antes da ab- sorção celular. Tais agentes bloqueadores podem incluir, sem limitação, se- quências adicionais de peptídeo relacionadas ou não relacionadas que po-

EEE E TES EA dem ser fixadas aos resíduos amino e/ou carbóxi terminais do peptídeo a ser : administrado. Estes agentes podem ser adicionados quimicamente, durante a síntese do peptídeo, ou por tecnologia de DNA recombinante por métodos conhecidos na técnica. Alternativamente, agentes bloqueadores como o áci- — do piroglutâmico ou outras moléculas conhecidas na técnica podem ser liga- dos ao resíduos amino e/ou carbóxi terminais. B. Síntese Será vantajoso produzir peptídeos utilizando as técnicas de sín- tese em fase sólida (Merrifield, 1963). Outras técnicas de síntese de peptí- deos são bem-conhecidas para as pessoas versadas na técnica (Bodanszky et al., 1976; Peptide Synthesis, 1985; Solid Phase Peptide Synthelia, 1984). “ &Gruposde proteção adequados para uso em tais sínteses como serão en- contrados nos textos acima, bem como em Protective Groups in Organic Chemistry, 1973. Estes métodos de síntese envolvem a adição sequencial ;: 15 deumoumaisresíduos de aminoácidos ou resíduos de aminoácidos prote- gidos adequados a uma cadeia peptídica em crescimento. Normalmente, tanto o grupo amino ou carboxila do primeiro resíduo de aminoácido é prote- gido por um grupo protetor removível seletivamente adequado. Um grupo protetor removível seletivamente diferente é utilizado para aminoácidos que contêm um grupo reativo lateral, como a lisina.

Utilizando a síntese em fase sólida como exemplo, os aminoáci- dos protegidos ou derivatizados são ligados a um suporte sólido inerte atra- vês do seu grupo carboxila ou amino desprotegido. O grupo protetor do gru- po amino ou carboxila é então removido seletivamente e o aminoácido se- —guintena sequência com o grupo de complementaridade (amino ou carboxi- la) adequadamente protegidos é misturado e reage com o resíduo já fixado ao suporte sólido. O grupo de proteção do grupo amino ou carboxila é então removido de seu resíduo de ácido recém-adicionado, e o aminoácido seguin- te (devidamente protegido) é então adicionado, e assim por diante. Depois de todos os aminoácidos desejados terem se ligado na sequência correta, quaisquer grupos protetores e grupos terminais e laterais remanescentes (e suporte sólido) são removidos sequencialmente ou simultaneamente, para fornecer o peptídeo final. Os peptídeos da invenção são preferivelmente i- sentos de aminoácidos benzilados ou metilbenzilados. Essas porções de grupo protetor podem ser utilizadas durante a síntese, mas elas são removi- das antes de os peptídeos serem usados. Reações adicionais podem ser necessárias, como já descrito em outros locais, para formar as ligações in- tramoleculares para restringir a conformação.

Além dos 20 aminoácidos padrão.que.podem. ser. usados, há um grande número de aminoácidos "não padrão". Dois deles podem ser especi- ficados pelo código genético, mas são bastante raros em proteínas. Seleno- cisteina é incorporada em algumas proteínas no códon UGA, que normal- mente é um códon de parada. Pirrolsina é usado por alguns arqueias meta- nogênicas em enzimas que elas usam para produzir metano. Ela é codifica- ' da para com o códon UAG. Exemplos de aminoácidos não padrão que não são encontrados em proteínas incluem lantionina, ácido 2-aminoisobutírico, : 15 desidroalaninae o neurotransmissor ácido gama-aminobutírico. Aminoácidos não padrão ocorrem frequentemente como intermediários nas vias metabóli- cas para aminoácidos-padrão - por exemplo, ornitina e citrulina ocorrem no ciclo da ureia, que faz parte do catabolismo de aminoácidos. Aminoácidos não padrão são normalmente formados por meio de modificações para ami- —noácidos padrão. Por exemplo, a homocisteína é formada através da via de transulfuração ou pela desmetilação da metionina através do metabólito in- termediário S-adenosil metionina, enquanto a hidroxiprolina é feita por uma modificação pós-tradução de prolina.

C. Ligantes Ligantes ou agentes de reticulação podem ser utilizados para fundir peptideos MUC1 a outras sequências proteináceas. Reagentes de reticulação bifuncionais forma extensivamente usados para diversos fins, incluindo a prepração das matrizes de afinidade, modificação e estabilização de diversas estruturas, a identificação de sítios de ligação ligantes e recepto- res, e estudos estruturais. Reagentes homobifuncionais que carregam dois grupos funcionais idênticos provaram ser altamente eficientes na indução de reticulações entre as macromoléculas idênticas e diferentes ou subunidades

FERE E

| 22/57 de uma macromolécula, e ligação de ligantes de polipeptídeo aos seus sítios de ligação específicos.

Reagentes heterobifunctionais contêm dois diferentes grupos funcionais.

Tirando vantagem das diferentes reatividades dos dois grupos funcionais diferentes, a reticulação pode ser controlada tanto seleti- —vamente quanto sequencialmente.

Os reagentes de reticulação bifuncionais podem ser divididos de acordo com a especificidade de seus grupos funcio- . nais, por exemplo, grupos-amino, sulfidrila; guanidino, indol, ou carbóxi es- pecíficos.

Destes, reagentes direcionados para grupos amino livres torna- ram-se especialmente populares devido às suas disponibilidades comerciais, facilidade de síntese e condições reacionais brandas em que eles podem ser aplicados.

A maioria dos reagentes de reticulação heterobifunctionais con- “ témum grupo aminorreativo primário e um grupo tiol-reativo. | Em outro exemplo, reagentes de reticulação bifuncionais e mé- todos de uso dos reagentes de reticulação são descritos na Patente US ;: 15 5.889.155, especificamente aqui incorporada por referência em sua totalida- de.

Os reagentes de reticulação combinam um resíduo de hidrazida nucleofi- lico com um resíduo de maleimída eletrofílico, permitindo o acoplamento em um exemplo, de aldeídos aos tióis livres.

O reagente de reticulação pode ser modificado para reticular vários grupos funcionais e, portanto, ele é útil para reticular polipeptídeos.

Nos casos em que um peptídeo particular não con- tém um resíduo passível de um determinado reagente de reticulação em sua sequência nativa, as alterações de aminoácidos genéticas ou sintéticas na sequência primária podem ser utilizadas.

Outro uso de ligantes no contexto dos peptídeos como terapêuti- coséa chamada tecnologia do "Peptídeo Grampeado" de Aileron Terapêuti- ca.

A abordagem geral para "grampear" um peptídeo que é dois resíduos chave no peptídeo são modificados pela colocação de ligantes através das cadeias laterais de aminoácidos.

Uma vez sintetizados, os ligantes são co- nectados através de um catalisador, criando assim uma ponte que fisica- — mente restringe o peptídeo em sua forma nativa de a-hélice.

Além de ajudar a reter a estrutura nativa necessária para interagir com uma molécula-alvo, esta conformação também fornece estabilidade contra peptidases, bem co-

mo propriedades permeadoras de células. As patentes US Nº 7.192.713 e

7.183.059, descrevendo esta tecnologia, são incorporadas por referência neste documento. Vide também Schafmeister et al. Journal of the American Chemical Society, 2000. 122(24): p. 5891-5892.

D. Projeto, Variantese Análogos A invenção atual é focada em peptídeos compreendendo a se- * quência -CQC. Depois -de identificar-essa- estrutura ehave-na formação-de oligômero MUC1, os inventores também contemplam que variantes da se- quência CQC podem ser empregadas. Por exemplo, alguns aminoácidos não naturais que satisfazem às restrições estruturais da sequência CQC po- dem ser substituídos sem perda, e talvez com uma melhoria na função bio- lógica. Além disso, os presentes inventores também contemplam que os compostos estruturalmente similares podem ser formulados para imitar as partes chave do peptídeo ou polipeptídeos da presente invenção. Esses - 15 compostos, que podem ser denominado peptidomiméticos, podem ser utili- zados da mesma forma que os peptídeos da invenção e, portanto, também são equivalentes funcionais. Certos miméticos que imitam elementos da estrutura da proteína secundária e terciária são descritos em Johnson et a/. (1993). O raciocínio subjacente à utilização de peptídeos miméticos é que a estrutura peptídica das proteínas existe principalmente para orientar as cadeias laterais de ami- noácidos, de tal forma a facilitar as interações moleculares, como aquelas do anticorpo e/ou antígeno. Um peptídeo mimético é, assim, projetado para permitir interações moleculares similares à molécula natural.

Métodos para a geração de estruturas específicas foram descri- tos na técnica. Por exemplo, miméticos de a-hélice são descritos nas Paten- tes US Nº 5.446.128; 5.710.245; 5.840.833 e 5.859.184, Métodos para a ge- ração de B-voltas e B-protuberâncias conformacionalmente restritas são des- critos, por exemplo, nas Patentes US Nº 5,440.013; 5.618.914 e 5.670.155.

— Outros tipos de voltas miméticas incluem voltas y e reversas. Voltas reversas miméticas são descritas nas Patentes US Nº 5.475.085 e 5.929.237, e y- voltas miméticas são descritas nas Patentes US Nº 5.672.681 e 5.674.976.

EEE RE NESSA

Conforme utilizado na presente invenção, "modelagem molecu- lar" significa análise quantitativa e/ou qualitativa da estrutura e função da interação física proteina-proteina com base na informação estrutural tridi- mensional e em modelos de interação proteína-proteína. Isso inclui a dinã- mica molecular de base numérica convencional e modelos de minimização de energia, modelos gráficos de computador interativos, modelos mecânicos . moleculares modificades, geometria de distância e-outros modelos de restri- ção de base estrutural. A modelagem molecular tipicamente é efetuada utili- zando um computador e pode ser adicionalmente otimizada usando métodos conhecidos. Os programas de computador que utilizam dados de cristalogra- fia de raios X são particularmente úteis para a concepção de tais compostos. Programas como o RasMol, por exemplo, podem ser usados para gerar mo- delos tridimensionais. Os programas de computador como INSIGHT (Accel- : rys, Burlington, MA), GRASP (Anthony Nicholls, da Universidade de Colúm- : 15 bia), Dock (Molecular Design Institute, Universidade da Califórnia em São Francisco), e Auto-Dock (Accelrys) permitem a manipulação adicional e a capacidade de introduzir novas estruturas. Os métodos podem envolver a etapa adicional de produzir informações para um dispositivo de saída de um modelo da estrutura 3D do composto. Além disso, os dados 3D de compos- tos candidatos podem ser comparados a um banco de dados computadori- zado, por exemplo, estruturas 3D.

Compostos da invenção também podem ser projetados de ma- neira interativa a partir de informações estruturais dos compostos aqui des- critos com outras técnicas de planejamento/modelagem de base estrutural (vide, por exemplo, Jackson, 1997; Jones et a/., 1996). Compostos candida- tos podem então ser testados em ensaios padrão familiares para as pessoas versadas na técnica. Ensaios exemplares são descritos aqui.

A estrutura 3D de macromoléculas biológicas (por exemplo, pro- teínas, ácidos nucleicos, carboidratos e lipídeos) pode ser determinada a — partir dos dados obtidos por uma variedade de metodologias. Estas metodo- logias, que têm sido aplicadas de forma mais eficaz para a avaliação da es- trutura 3D das proteínas, incluem: (a) cristalografia de raios X, (b) espectros- EEE ETTA:

[oO 25/57 copia de ressonância magnética nuclear (RMN); (c) análise dos limites de distância física formados entre os sítios definidos em uma macromolécula, por exemplo, reticulações químicas intramoleculares entre os resíduos em uma proteina (por exemplo, PCT/US00/14667, a descrição do qual sendo —aquiincorporada por referência em sua totalidade), e (d) métodos de mode- lagem molecular com base no conhecimento da estrutura primária de uma " proteína de interesse, por exemple, técnicas -de modelagem por tionotogia, algoritmos de enfileiramento, ou modelagem de estrutura ab iniítio usando programas de computador como MONSSTER (Modelagem de Novas Estru- turas a partir de Restrições Secundárias e Terciárias) (vide, por exemplo, o Pedido Internacional Nº PCT/US99/11913, cuja descrição está aqui incorpo- “ radasporreferênciaem sua totalidade). Outras técnicas de modelagem mo- lecular também podem ser utilizadas de acordo com esta invenção (por e- xemplo, Cohen et a/., 1990; Navia et a/., 1992), as descobertas dos quais ;: 15 sendo aqui incorporados por referência, nas suas totalidades). Todos estes métodos produzem dados que são passíveis de análise por computador.

Outros métodos espectroscópicos que também podem ser úteis no método da invenção, mas que atualmente não fornecem detalhes estruturais ao nível atômico sobre biomoléculas, incluem dicroísmo circular e fluorescência e espectroscopia de absorvância de luz no ultravioleta/visível.

Um método pre- ferido de análise é a cristalografia de raios X.

As descrições deste procedi- mento e da espectroscopia de RMN são fornecidas abaixo.

Cristalografia de raios X.

A cristalografia de raio X é baseada na difração de raios X de um comprimento de onda característico por nuvens de elétrons ao redor dos núcleos atômicos em um cristal de uma molécula ou complexo molecular de interesse.

A técnica utiliza cristais de macromolécu- las biológicas purificadas ou complexos moleculares (mas estes com fre- quência incluem componentes do solvente, cofatores, substratos, ou outros ligantes) para determinar perto da resolução atômica dos átomos que com- põem a macromolécula biológica particular.

Um pré-requisito para a resolu- ção da estrutura 3D por cristalografia de raio X é um cristal bem-ordenado que irá fortemente difratar fortemente os raios X.

O método direciona um EEE EEE:

| VV .e. 26/57 feixe de raios x em um arranjo regular e repetido de muitas moléculas idênti- cas de modo que os raios X sejam difratados a partir de um arranjo em um padrão a partir do qual a estrutura de uma molécula individual pode ser re- cuperada.

Cristais bem-ordenados de, por exemplo, moléculas de proteínas —globulares são objetos grandes, esféricos ou elipsoidais com superfícies ir- regulares.

Os cristais contêm grandes canais entre as moléculas individuais. : Esses canais, que -normalmente-coupam-mais da metade do: volume do cris- tal, são preenchidos com moléculas de solvente desordenadas, e as molécu- las de proteínas estão em contato umas com as outras em apenas algumas "regiões pequenas.

Esta é uma razão pela qual as estruturas de proteinas em cristais são geralmente as mesmas que aquelas das proteínas em solução.

Métodos de obtenção das proteínas de interesse estão descritos abaixo.

A formação dos cristais é dependente de um número de diferentes parâmetros, incluindo pH, temperatura, a concentração da macromolécula : 15 biológica, a natureza do solvente e precipitante, bem como a presença de íons adicionados ou ligantes da proteína.

Muitos experimentos de cristaliza- ção de rotina podem ser necessários para a triagem de todos estes parâme- tros para as combinações que fornecem um cristal apropriado para a análise de difração de raios X.

Robôs de cristalização podem automatizar e acelerar o trabalho de forma reproduzível pelo ajuste de grande número de experi- mentos de cristalização (vide, por exemplo, a Patente US Nº 5.790.421, cuja descrição está aqui incorporada por referência em sua totalidade). A cristalização do polipeptídeo ocorre em soluções em que a concentração do polipeptídeo excede a sua solubilidade máxima (ou seja, a solução de polipeptídeo é supersaturada). Tais soluções podem ser restau- radas até o equilíbrio, reduzindo a concentração de polipeptídeo, preferivel- mente através da precipitação dos cristais de polipeptídeos.

Comumente os polipeptídeos podem ser induzidos a cristalizar a partir de soluções supersa- turadas pela adição de agentes que alteram as cargas superficiais do poli- —peptídeo ou perturbem a interação entre os polipeptídeos e massa de água para promover as associações que levem à cristalização.

Cristalizações são geralmente realizadas entre 4ºC e 20ºC.

EEE EEE EEE:

Substâncias conhecidas como "precipitantes" são frequentemente usadas para diminuir a solubilidade do polipeptideo em uma solução concentrada, formando uma camada empobrecida de precipitante energeticamente desfa- vorável em torno das moléculas de polipeptídeos (Weber, 1991). Além dos —precipitantes, outros materiais são, algumas vezes, adicionados à solução de cristalização do polipeptídeo. Estes incluem tampões para ajustar o pH da solução e sais para reduzir a solubilidade do polipeptídeo. Vários precipitan- tes são conhecidos na técnica e incluem os seguintes: etanol, 3-etil-2-4- pentanodiol, e muitos dos poliglicóis, tal como o polietilenoglicol (PEG). As soluções de precipitação podem incluir, por exemplo, 13 a 24% de PEG 4000, 5 a 41% de sulfato de amônio e 1,0 a 1,5 M de cloreto de sódio, e um “o pHente50e7,5. Outros aditivos podem incluir Hepes 0,1 M, 2 a 4% de butanol, acetato de sódio 20 a 100 mM, ácido cítrico 50 a 70 mM, fosfato de sódio 120-130 mM, de ácido etilenodiaminotetracético 1 mM (EDTA), e ditio- : 15 treitol 1 mM (DTT). Esses agentes são preparados em tampões e são adi- cionados gota a gota em várias combinações ao tampão de cristalização. Proteínas a serem cristalizadas podem ser modificadas, por exemplo, por fosforilação ou usando um fosfato mimético (por exemplo, tungstato, cacodi- lato ou sulfato).

Métodos de cristalização de polipeptídeos comumente usados incluem as seguintes técnicas: lote, gota suspensa, iniciação de sementes e diálise. Em cada um desses métodos, é importante promover a cristalização continuada após a nucleação através da manutenção de uma solução su- persaturada. No método em lote, polipeptídeo é misturado com precipitantes para atingira supersaturação, e o frasco é vedado e posto em repouso até os cristais aparecerem. No método de diálise, o polipeptídeo é retido em uma membrana de diálise vedada que é colocada em uma solução contendo precipitante. O equilíbrio através da membrana aumenta as concentrações do polipeptídeo e precipitante, fazendo com que o polipeptídeo alcance ní- veisde supersaturação.

Na técnica de gota suspendida preferida (McPherson, 1976), uma mistura de polipeptídeo inicial é criada pela adição de um precipitante a

ESSE SEE uma solução concentrada de polipeptídeo. As concentrações do polipeptídeo e precipitantes são tais que, nessa forma inicial, o polipeptídeo não cristalize.

Uma pequena gota desta mistura é colocada sobre uma lâmina de vidro que é invertida e suspensa sobre um reservatório de uma segunda solução. O sistema é então vedado. Normalmente, a segunda solução contém uma maior concentração de precipitante ou outro agente desidratante. A diferen- . ça-nas-censentrações preeipitantes faz com que a-soltução-de proteina-tentha uma pressão de vapor mais alta do que a segunda solução. Uma vez que o sistema contendo as duas soluções é vedado, um equilíbrio é estabelecido, eaáguada mistura de polipeptídeo transfere a segunda solução. Este equi- líbrio aumenta a concentração de polipeptídeo e precipitante na solução po- lipeptídica. Na concentração crítica de polipeptídeo e precipitante, um cristal . do polipeptídeo pode se formar. Outro método de cristalização introduz um sítio de nucleação em : 15 uma solução concentrada de polipeptídeo. Geralmente, uma solução con- centrada de polipeptídeo é preparada e um cristal de semente do polipepti- deo é introduzido nesta solução. Se as concentrações do polipeptídeo e quaisquer precipitantes estiverem corretas, o cristal de semente irá fornecer um sítio de nucleação em torno do qual se forma um cristal maior.

Ainda outro método de cristalização é um método de eletrocrista- lização em que o uso é feito de momentos de dipolo de macromoléculas de proteínas que se autoalinham na camada de Helmholtz adjacente a um ele- trodo (vide, por exemplo, a Patente US Nº 5.597.457, cuja descrição é aqui incorporada por referência na sua totalidade).

Algumas proteínas podem ser recalcitrantes para a cristalização. No entanto, várias técnicas são disponíveis para a pessoa versada na técni- ca para induzir a cristalização. Por exemplo, a remoção dos segmentos de polipeptídeo flexíveis na extremidade amino ou carbóxi terminal da proteína pode facilitar a produção de amostras de proteínas cristalinas. A remoção de tais segmentos pode ser feita usando técnicas de biologia molecular ou tra- tamento da proteína com proteases como tripsina, quimotripsina, ou subtili- sina.

EEE ARES

Em experimentos de difração, um feixe estreito e paralelo de rai- os x é tomado da fonte de raio x e direcionado no cristal para produzir feixes difratados. Os feixes primários incidentes causam danos tanto para as ma- ' cromoléculas quanto para as moléculas de solvente. O cristal é, portanto, —esfriado (por exemplo, até entre -220 ºC e -50 ºC) para prolongar seu tempo de vida. O feixe primário deve atingir o cristal de várias direções para produ- zir. todos os pontos. de difração possíveis, entãe o cristal é -girado no feixe durante o experimento. Os pontos difratados são registrados em um filme ou por um detector eletrônico. O filme exposto tem que ser digitalizado e quanti- ficado em um dispositivo de varredura, enquanto que os detectores eletrôni- cos alimentam os sinais que eles detectam diretamente em um computador.

Os detectores de área eletrônica reduzem significativamente o tempo neces- sário para coletar e medir os dados de difração. Cada feixe de difração, que é registrado como um ponto no filme ou uma placa detectora, é definido por : 15 três propriedades: a amplitude, que é medida a partir da intensidade do pon- to; o comprimento de onda, que é definido pela fonte de raios x; e a fase, que se perde nos experimentos de raios x. Todas as três propriedades são necessárias para todos os feixes difratados, a fim de determinar as posições dos átomos que dão origem aos feixes difratados. Uma maneira de determi- —narasfasesé chamada de Substituição Isomórfica Múltipla (MIR), que exige a introdução de espalhadores de raios X exógeno (por exemplo, átomos pe- sados como átomos de metal) na célula unitária do cristal. Para uma descri- ção mais detalhada do MIR, vide a Patente US 6.093.573 (coluna 15) a des- crição da qual sendo aqui incorporada por referência em sua totalidade.

Coordenadas atômicas referem-se às coordenadas cartesianas (posições x, y e z) derivadas de equações matemáticas que envolvem a sín- tese de Fourier de dados derivados a partir de padrões obtidos através da difração de um feixe monocromático de raios X pelos átomos (centros de espalhamento) da macromolécula biológica de interesse na forma de cristal.

Dados de difração são usados para calcular os mapas de densidade eletrô- nica das unidades de repetição no cristal (célula unitária). Os mapas de den- sidade eletrônica são usados para estabelecer as posições (coordenadas

ESA SEO atômicas) de átomos individuais dentro de uma célula unitária do cristal. Os valores absolutos das coordenadas atômicas transmitem as relações espa- ciais entre os átomos, porque os valores absolutos atribuídos a coordenadas atômicas podem ser alterados por movimento de rotação e/ou translação ao S longo dos eixos x, y e/ou z, em conjunto ou separadamente, mantendo as mesmas relações espaciais relativas entre os átomos. Assim, uma macro- molécula-biclógica-(por exemplo; uma proteína), cujo conjunto de valores de coordenadas atômicas absolutas pode ser ajustado de maneira rotacional ou translacional para coincidir com um conjunto de valores previamente deter- —minados a partir de uma análise da outra amostra é considerada como tendo as mesmas coordenadas atômicas que aquelas obtidas da outra amostra. o o — — Mais detalhes sobre a cristalografia de raio X podem ser obtidos a partir do Pedido US copendente Nº 2005/0015232, a Patente US 6.093.573 e os Pedidos Internacionais Nº POT/US99/18441, POT/US99/11913 e PCT/ US00/03745. As descrições de todos esses documentos de patentes são incorporadas por referência, nas suas totalidades.

Espectroscopia de RMN. Embora a cristalografia de raio X exige monocristais de uma macromolécula de interesse, as medidas de RMN são realizadas em solução sob condições próximas da fisiológica. No entanto, as estruturas derivadas de RMN não são tão detalhadas quanto as estruturas derivadas de cristais.

Enquanto o uso de espectroscopia de RMN foi até relativamente pouco tempo limitado para a elucidação da estrutura 3-D de moléculas rela- tivamente pequenas (por exemplo, as proteínas de 100 a 150 resíduos de aminoácidos), avanços recentes, incluindo marcação isotópica da molécula de interesse e espectroscopia de relaxação transversa otimizada (TROSY) permitiram que a metodologia fosse estendida para a análise de moléculas muito maiores, por exemplo, proteínas com peso molecular de 110 KDa (Wi- der, 2000).

RMN utiliza a radiação por radiofrequência para examinar o am- biente dos núcleos atômicos magnéticos em um campo magnético homogê- neo pulsado com radiofrequência específica. Os pulsos perturbam a magne- EEE TESTE:

tização nuclear daqueles átomos com núcleos de spin diferente de zero. Si- nais de domínio de tempo transientes são detectados conforme o sistema retorna ao equilíbrio. A transformação de Fourier do sinal transiente em um domínio de frequência gera um espectro de RMN unidimensional. Picos nes- tes espectros representam deslocamentos químicos dos diversos núcleos ativos. O deslocamento químico de um átomo é determinado pelo seu ambi- -ente eletrônico local. Experimentos -de -RMN bidimensionais podem fornecer informações sobre a proximidade de vários átomos na estrutura e no espaço tridimensional. Estruturas de proteínas podem ser determinadas através da realização de uma série de experimentos de RMN bi (e algumas vezes tri ou tetra) dimensionais e utilizando as informações resultantes como restrições em uma série de simulações de dobramento de proteína.

' Mais informações sobre a espectroscopia de RMN, incluindo descrições detalhadas de como os dados brutos obtidos a partir de um expe- rimento de RMN podem ser usados para determinar a estrutura 3-D de uma macromolécula podem ser encontradas em: Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practice, (1996); Gronenborn et al. (1990); e em Wider (2000), supra., as descrições de todos os quais sendo incorporadas por referência, nas suas totalidades.

Também são de interesse os compostos peptidomiméticos que são projetados com base na sequência de aminoácidos de compostos da invenção que são peptídeos. Compostos peptidomiméticos são compostos sintéticos com uma conformação de "porção" tridimensional que é substan- cialmente a mesma conformação tridimensional de um peptídeo seleciona- do. A porção peptídica fornece o composto peptidomimético com a capaci- dade de inibir a oligomerização de MUC1. Compostos peptidomiméticos po- dem ter características adicionais que aumentam a sua utilidade in vivo, tal como o aumento da permeabilidade celular e a meia-vida biológica prolon- gada. Os peptidomiméticos geralmente têm uma estrutura que é parcialmen- te ou completamente não peptídica, mas com grupos laterais que são idênti- cos aos grupos laterais dos resíduos de aminoácidos que ocorrem no peptí- deo no qual o peptidomimético se baseia. Vários tipos de ligações químicas,

EAD EEE EEE por exemplo, ligações éster, tioéster, ticamida, retroamida, redução da car- bonila, dimetileno e cetometileno, são conhecidas na técnica como sendo geralmente substitutos úteis para ligações peptídicas na construção de pep- tidomiméticos resistentes à protease. IV. Terapias A. Formulações Farmacêuticas e Vias de Administração Onde. aplicações clínicas são contempladas, será necessário preparar composições farmacêuticas de uma forma adequada para a aplica- ção pretendida. Geralmente, isso implica em preparar composições que são essencialmente isentas de pirogênios, bem como outras impurezas que po- deriam ser prejudiciais aos seres humanos ou animais. Uma pessoa geralmente irá desejar utilizar sais apropriados e tampões para tornar os vetores de distribuição estáveis e permitir a absorção ] pelas células-alvo. Os tampões também serão empregados quando as célu- :; 15 las recombinantes são introduzidas em um paciente. As composições aquo- sas da presente invenção compreendem uma quantidade eficaz do vetor para células, dissolvida ou dispersa em um veículo farmaceuticamente acei- tável ou meio aquoso. Estas composições também são referidas como ino- culantes. A frase "farmaceuticamente ou farmaceuticamente aceitável" refe- re-sea entidades moleculares e composições que não produzem reações adversas, alérgicas, ou outras desfavoráveis quando administrados a um animal ou um ser humano. Como usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revesti- mentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, isotônicos e agentes de re- tardo de absorção e similares. O uso de tais meios e agentes para substân- cias farmaceuticamente ativas é bem-conhecido na técnica. Salvo na medida em qualquer meio ou agente convencional é incompatível com os vetores ou células da presente invenção, a sua utilização em composições terapêuticas é contemplada. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incor- —porados nas composições. As composições de ativos da presente invenção podem incluir preparações farmacêuticas clássicas. A administração dessas composições

EEE ARESTAS

| 33/57 de acordo com a presente invenção será através de qualquer via comum, : desde que o tecido-alvo esteja disponível através dessa via. Tais vias inclu- em a via oral, nasal, bucal, retal, vaginal ou tópica. Alternativamente, a ad- ' ministração pode ser por injeção ortotópica, intradérmica, subcutânea, intra- —muscular, intraperitoneal ou intravenosa. Estas composições poderiam ser normalmente administradas como composições farmaceuticamente aceitá- : veis, descritas acima, De. particular interesse é. a .administraçãe intratumera! direta, a perfusão de um tumor, ou a administração local ou regional de um tumor, por exemplo, na vasculatura local ou regional, ou o sistema linfático, ouemum leito tumoral ressecado.

Os compostos ativos também podem ser administrados por via parenteral ou por via intraperitoneal. Soluções dos compostos ativos como base livre ou de seus sais farmacologicamente aceitáveis podem ser prepa- i radas em água devidamente misturada com um tensoativo, como hidroxipro- : 15 pilcelulose. Dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietile- noglicóis líquidos, e suas misturas e óleos. Sob condições normais de arma- zenamento e uso, estas preparações contêm conservantes para evitar o crescimento de micro-organismos.

As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que ocorra a fácil capacidade de sucção por seringa. Ela deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e deve ser conservada contra a ação con- taminante de micro-organismos, como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou um meio de dispersão contendo, por exemplo, água, e- tanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglico! e polietilenoglico! líquido, e similares), misturas adequadas dos mesmos, e óleos vegetais. A fluidez a- dequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal —como lecitina, pela manutenção do tamanho das partículas necessária no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de micro- organismos pode ser provocada por vários agentes antibacterianos e anti- EEE EA:

fúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timero- sal, e similares. Em muitos casos, será preferível a inclusão dos agentes isotônicos, por exemplo, de açúcares ou de cloreto de sódio. A absorção ' prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pelo uso nas composições de agentes de retardo de absorção, por exemplo, monoestea- rato de alumínio e gelatina.

” Soluções estéreis injetáveis - são preparadas pela incorporação dos compostos ativos na quantidade necessária no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes acima enumerados, conforme necessário, seguido de esterilização filtrante. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação de vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo “o estéril quecontémomeiode dispersão básico e os outros ingredientes nec BR cessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a pre- paração de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de prepara- :; 15 çãosãotécnicasde secagem a vácuo e liofiização que produzem um pó de ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente filtrada estéril do mesmo.

Como usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes —antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absor- ção e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuti- camente ativas é bem-conhecido na técnica. Salvo na medida em que qual- quer meio ou agente é incompatível com o ingrediente ativo, o seu uso nas composições terapêuticas é contemplado. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.

Para administração oral, os polipeptídeos da presente invenção podem ser incorporados com excipientes e usados na forma de enxágues bucais e dentifrícios não ingeríveis. Um enxágue bucal pode ser preparado incorporando o ingrediente ativo na quantidade necessária em um solvente — apropriado, como uma solução de borato de sódio (Solução de Dobell). AI- ternativamente, o ingrediente ativo pode ser incorporado em um enxágue antisséptico contendo borato de sódio, glicerina e bicarbonato de potássio. O EEE:

ingrediente ativo também pode ser disperso em dentifrícios, incluindo: géis, : pastas, pós e pastas fluidas. O ingrediente ativo pode ser adicionado em uma quantidade terapeuticamente eficaz a um dentifrício em pasta que pode incluir água, aglutinantes, abrasivos, agentes aromatizantes, agentes espu- mantes,eumectantes.

As composições da presente invenção podem ser formuladas em.uma forma.neutra ou salina, Sais farmaceuticamente aceitáveis-inciuem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres da proteí- na) e que são formados com ácidos inorgânicos como, por exemplo, ácidos — clorídrico ou fosfórico, ou tais ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartári- co, mandélico e similares. Os sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados a partir de bases inorgânicas como, por e- . xemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio, ou férrico, e bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e similares.

Na formulação, as soluções são administradas de forma compa- tível com a formulação de dosagem e em uma quantidade tal que seja tera- peuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como soluções injetáveis, cápsulas de liberação de fármacos e afins. Para a administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tampona- da, se necessário, e o diluente líquido primeiramente tornado isotônico com salina ou glicose suficiente. Estas soluções aquosas particulares são espe- cialmente adequadas para a administração intravenosa, intramuscular, sub- cutânea e intraperitoneal. Neste contexto, meio aquoso estéril que pode ser empregado será conhecido pelas pessoas versadas na técnica à luz da pre- sente descrição. Por exemplo, uma dosagem poderia ser dissolvida em 1 mL de solução de NaCl isotônica e adicionada a 1000 mL de líquido de hipo- dermóclise ou injetada no local de infusão proposto (vide, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences," 15º Edição, páginas 1035-1038 e 1570-1580). Algumas variações na dosagem necessariamente irão ocorrer dependendo da condição do indivíduo sendo tratado. A pessoa responsável pela administração irá, em qualquer caso, determinar a dose adequada para o indivíduo. Além disso, para administração a seres humanos, as prepara- ções devem atender aos padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e padrões de pureza exigidos pelo Escritório do FDA de Padrões Bio- lógicos. B.Tiposde câncer e Indivíduos As células cancerosas às quais os métodos da presente inven- ção podem ser aplicados geralmente incluem qualquer céluta que expresse MUC1 e, mais particularmente, que superexpresse MUC1. Uma célula can- cerosa apropriada pode ser uma célula de câncer de mama, câncer de pul- mão, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer renal, câncer de estôma- go, câncer do fígado, câncer nos ossos, câncer hematológico (por exemplo, leucemia ou linfoma), câncer de tecido neural, melanoma, câncer de ovário, . câncer de testículo, câncer de próstata, câncer cervical, câncer vaginal, ou i células de câncer de bexiga. Além disso, os métodos da invenção podem ser : 15 aplicadosauma ampla faixa de espécies, por exemplo, seres humanos, pri- matas não humanos (por exemplo, macacos, babuínos ou chimpanzés), ca- valos, bovinos, suínos, ovinos, caprinos, cães, gatos, coelhos, porquinhos- da-índia, gerbil, hamsters, ratos e camundongos. C. Métodos de Tratamento Peptídeos ou análogos que inibem a formação do oligômero MUC1 geralmente são úteis como terapêuticos ou profiláticos anticâncer. Eles podem ser administrados a indivíduos mamíferos (por exemplo, pacien- tes com câncer de mama humanos) sozinhos ou em combinação com outros fármacos e/ou radioterapia. Os compostos também podem ser administrados a indivíduos que são geneticamente e/ou ambientalmente (devido, por e- xemplo, a fatores fisiológicos e/ou ambientais) suscetíveis ao câncer, por exemplo, indivíduos com histórico familiar de câncer (por exemplo, câncer de mama), indivíduos com inflamação crônica ou sujeitos a estresse crônico, ou indivíduos que são expostos a condições carcinogênicas ambientais naturais — ounão naturais (por exemplo, exposição excessiva à luz solar, agentes can- cerígenos industriais ou a fumaça do tabaco). Quando os métodos são aplicados a indivíduos com câncer, an-

ETERNO TATO ETA tes da administração de um composto, o câncer pode, opcionalmente, ser : testado para a expressão de MUC1 (expressão da proteina MUC1 ou do RNAm de MUC1) por métodos conhecidos na técnica. Desta forma, os indi- ' víduos podem ser identificados como tendo um câncer expressando o su- —perexpressando MUC1. Tais métodos podem ser realizados in vitro em célu- las cancerosas obtidas de um indivíduo. Alternativamente, nas técnicas de ” visualização .in-vivo, utilizande, per-exemple, anticorpos radiomarcados es- pecíficos para MUC1 podem ser realizadas. Além disso, os fluidos corporais (por exemplo, sangue ou urina) de pacientes com câncer podem ser testa- dos para níveis elevados de proteina MUC1 ou fragmentos da proteína MUC1. A dose necessária depende da escolha da via de administração; : da natureza da formulação; da natureza da doença do paciente; do tamanho, : peso, área, idade e sexo do indivíduo; outros fármacos sendo administrados; ;: 15 eojulgamentodo médico encarregado. Dosagens adequadas estão na faixa de 0,0001 mg/Kg a 100 mg/Kg. Grandes variações na dosagem necessária devem ser esperadas tendo em vista a variedade de compostos disponíveis e as eficiências diferentes de várias vias de administração. Por exemplo, é de se esperar que a administração oral requeira doses maiores do que a administração por via intravenosa. Variações nesses níveis de dosagem po- dem ser ajustadas usando rotinas empíricas padrão para a otimização, como é bem compreendido na técnica. Administrações podem ser únicas ou múlti- plas (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20, 50, 100, 150 ou mais vezes). O encapsulamento do polipeptideo em um veículo de distribuição adequado (por exemplo, micropartículas poliméricas ou dispositivos implantáveis) pode aumentar a eficiência da distribuição, particularmente para distribuição oral. V. Terapias de Combinação A resistência das células tumorais aos agentes de dano de DNA representa um grande problema na oncologia clínica. Um dos objetivos da atual pesquisa do câncer é encontrar maneiras de melhorar a eficácia da quimioterapia e da radioterapia. Uma maneira é através da combinação de tais terapias tradicionais com a terapia gênica. No contexto da presente in-

FREE venção, é previsto que a terapia do peptideo MUC1 pode ser usada da . mesma forma em conjunto com a intervenção quimioterápica, radioterápica, ou imunoterapêutica.

' Para matar as células, inibir o crescimento celular, inibir a angio- — gênese ou, de outro modo, reverter ou reduzir o fenótipo maligno das células tumorais, o uso dos métodos e das composições da presente invenção, uma - pessoa poderia-em geral colocar-em contate-uma-célula-alvo-com-um pepti- deo MUC1 e pelo menos uma outra terapia. Estas terapias seriam fornecidas em uma quantidade combinada eficaz para matar ou inibir a proliferação da célula. Este processo pode envolver contato das células com os agen- tes/terapias ao mesmo tempo. Isto pode ser obtido entrando em contato com a célula com uma única composição ou formulação farmacológica que inclui . ambos os agentes, ou entrando em contato com a célula com duas compo- sições ou formulações distintas, ao mesmo tempo, em que uma composição : 15 incluiopeptídeo MUC1 e a outra inclui o agente. Alternativamente, o tratamento MUC1 pode preceder ou acom- panhar o outro tratamento por intervalos que variam de minutos a semanas. Em modalidades onde o outro tratamento e o peptíideo MUC1 são aplicados separadamente para a célula, uma pessoa poderia de modo geral garantir que um periodo significativo de tempo não termine entre o tempo de cada distribuição, de modo que as terapias ainda sejam capazes de exercer um efeito vantajosamente combinado na célula. Nesses casos, prevê-se que uma pessoa poderia colocar em contato a célula com duas modalidades dentro de aproximadamente 12 a 24 horas uma da outra, dentro de aproxi- —madamente6 a 12 horas uma da outra, ou com um atraso de apenas cerca de 12 horas. Em algumas situações, pode ser desejável estender o período de tempo para o tratamento de forma significativa; no entanto, onde vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a várias semanas (1, 2, 3, 4, 5,6,7 ou 8) decorrem entre as respectivas administrações.

Também é possível que mais de uma administração do peptídeo MUC1 ou de outra terapia seja desejada. Várias combinações podem ser empregadas, em que o peptídeo MUC1 é "A", e a outra terapia é "B", como EEE:

. 39/57 exemplificado abaixo: ' A/B/A B/AB B/(B/A A/AB B/NA A/B/(B B/B/B/A B/B/A/B AI/A/B/B A/B/AB A/B/B/A B/B/AW/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A A/A/NB B/A/ANA A/B/!NW/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B Outras combinações são contempladas. Novamente, para atingir a morte da célula, ambas as terapias são distribuídas a uma célula em uma - quantidade combinada-eficaz para -matar -a-céluta. Agentes ou fatores adequados para uso em uma terapia combi- nada inclui qualquer composto químico ou método de tratamento que induz a danos no DNA quando aplicado a uma célula. Os agentes e fatores incluem a radiação e as ondas que induzem danos ao DNA, tais como, irradiação y, “ raiosX,irradiaçãopor UV, micro-ondas, emissões eletrônicas, e similares. . Uma variedade de compostos químicos, também descritos como "quimiote- rápicos" ou "agentes genotóxicos" se destinam a ser de uso nos métodos de : 15 tratamento combinados aqui descritos. No tratamento de câncer de acordo com a invenção, uma pessoa poderia entraria em contato com as células tumorais com um agente, além do constructo de expressão. Isto pode ser conseguido através da irradiação do sítio do tumor localizado com radiação, como raios X, luz ultravioleta, raios y ou até mesmo micro-ondas. Alternati- —vamente, as células tumorais podem entrar em contato com o agente pela administração a um indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica. Várias classes de agentes quimioterapêuticos são contempladas para o uso em combinação com peptídeos da presente invenção. Por exem- plo, antagonistas do receptor de estrogênio seletivos ("SERMs"), tais como o Tamoxifeno, 4-hidroxitamoxifeno (Afimoxfene), Falsodex, Raloxifeno, Baze- doxifeno, Clomifene, Femarelle, Lasofoxifeno, Ormeloxifeno e Toremifeno. Agentes quimioterapêuticos contemplados para serem de uso incluem, por exemplo, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C. A inven- — ção também engloba o uso de uma combinação de um ou mais agentes de danos ao DNA, seja à base de radiação ou efetivamente compostos, tal co- mo o uso de raios X com a cisplatina ou a utilização de cisplatina com eto-

EEE ESET

' 40/57 posídeo. O agente pode ser preparado e usado como uma composição tera- pêutica combinada, ou kit, combinando-a com um peptídeo MUC1, como descrito acima. ' Proteína de choque térmico 90 é uma proteína regulatória en- — contrada em muitas células eucarióticas. Inibidores de HSP90 tem se mos- trado úteis no tratamento de câncer. Tais inibidores incluem Geldanamicina, - 17-(alilamino)-17-desmetoxigeldanamicina, PL HH71-e-Rifabutina: Agentes que reticulam diretamente o DNA ou formam aductos também são previstos. Agentes como a cisplatina e outros agentes alquilan- tesde DNA podem ser utilizados. A cisplatina tem sido amplamente utilizada para tratar o câncer, com doses eficazes utilizadas em aplicações clínicas de mg/m? por 5 dias a cada três semanas para um total de três processos. . Cisplatina não é absorvida por via oral e deve, portanto, ser distribuída atra- vés de injeção por via intravenosa, subcutânea, intratumoral ou intraperito- ; 15 neal Agentes que danificam o DNA também incluem compostos que interferem com a replicação do DNA, a mitose e a segregação cromossômi- ca. Tais compostos quimioterapêuticos incluem adriamicina, também conhe- cida como doxorrubicina, etoposídeo, verapamil, podofilotoxina, e similares. 20 —Amplamente utilizados em ambiente clínico para o tratamento de neoplas- mas, estes compostos são administrados através de injeções em massa por via intravenosa em doses variando de 25 a 75 mg/m? em intervalos de 21 dias para a doxorrubicina, para 35 a 50 mg/m? para o etoposídeo por via in- travenosa ou dobrar a dose intravenosa por via oral. Inibidores de microtúbu- los, como taxanos, também estão contemplados. Estas moléculas são diter- penos produzidos pelas plantas do gênero Taxus, e incluem paclitaxel e do- cetaxel. Inibidores do receptor do fator de crescimento epidérmico, como Iressa, MTOR, o alvo da rapamicina em mamíferos, também conhecido co- —moa proteína de ligação FK506 e a proteina 1 associada com 12-rapamicina (FRAP1) é uma proteína serina/treonina quinase que regula o crescimento celular, proliferação celular, motilidade celular, sobrevivência celular, síntese

TS ETTA ú 41/57 de proteínas e transcrição. Rapamíicina e seus análogos ("rapálogos") são, portanto, contemplados para utilização na terapia do câncer de combinação, de acordo com a presente invenção. ' Outra terapia de combinação possível com os peptídeos aqui reivindicados é o TNF-a (fator de necrose tumoral-alfa), uma citocina envol- vida na inflamação sistêmica e um membro de um grupo de citocinas que estimula.a.reação em fase-aguda. O principal papel-do TNF é-na regulação das células do sistema imunológico. TNF também é capaz de induzir a morte celular por apoptose, de induzir a inflamação e de inibir a tumorigênese e replicação viral. Agentes que interrompem a síntese e a fidelidade de precurso- “ resesubunidadesde ácido nucleicotambém levam a danos no DNA. Como tais, um número de precursores de ácidos nucleicos foram desenvolvidos. Particularmente úteis são os agentes que foram submetidos a testes exten- : 15 sivosesão prontamente disponíveis. Como tais, agentes como 5-fluorouracil (5-FU) são preferencialmente utilizados por tecidos neoplásicos, tornando este agente particularmente útil para o direcionamento para as células neo- plásicas. Apesar de muito tóxico, 5-FU é aplicável em uma ampla variedade de veículos, incluindo a administração tópica, porém intravenosa com doses — variandode3a15 mg/Kg/dia sendo mais usadas. Outros fatores que causam danos ao DNA e têm sido ampla- mente utilizados incluem os que são comumente conhecidos como raios y, raios X e/ou a distribuição direcionada de radioisótopos para as células tu- morais. Outras formas de fatores que danificam o DNA também são contem- —plados, como micro-ondas e radiação UV. É mais provável que todos esses fatores afetem uma ampla faixa de danos ao DNA, nos precursores do DNA, a replicação e o reparo do DNA, e a montagem e manutenção dos cromos- somos. A dosagem varia para a faixa dos raios x de doses diárias de 50 a 200 roentgens por períodos prolongados de tempo (3 a 4 semanas), até do- ses únicas de 2000 a 6000 roentgens. As faixas de dosagem para radioisó- topos variam muito, e dependem da meia-vida do isótopo, da força e do tipo de radiação emitida, e da absorção pelas células neoplásicas.

PERES

. 42/57 A pessoa versada é direcionada a "Remington's Pharmaceutical . Sciences" 15º edição, capítulo 33, particularmente as páginas 624-652. Cer- ta variação na dosagem irá necessariamente ocorrer dependendo da condi- ' ção do indivíduo a ser tratado. A pessoa responsável pela administração irá, em qualquer caso, determinar a dose apropriada para o indivíduo. Além dis- so, para administração a seres humanos, os preparativos devem atender ans. padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança-geral-e padrões de pureza, conforme exigido pelo Escritório do FDA de padrões biológicos.

Os inventores propõem que o fornecimento local ou regional de peptídeos MUC1 para pacientes com câncer vai ser um método muito efici- ente para tratar a doença clínica. Da mesma forma, a quimio ou radioterapia “ podem serdirecionadasa uma região particular afetada do corpo do indiví- duo. Alternativamente, a distribuição regional ou sistêmica do constructo de expressão e/ou do agente pode ser apropriada em certas circunstâncias, por :; 15 exemplo, onde a metástase extensa ocorreu.

Além de combinar terapias MUC1 com quimio e radioterapias, também é contemplada a combinação com imunoterapia, terapia hormonal, terapia com toxina e cirurgia. Em particular, pode-se empregar terapias-alvo tais como o Avastina, Erbitux, Gleevec, Herceptina e Rituxan.

Também deve ser salientado que qualquer uma as terapias an- teriores pode ser útil por si mesma no tratamento do câncer. Vl. Exemplos Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar modalida- des particulares da invenção. Deve ser percebido pelas pessoas versadas —natécnica que as técnicas descritas nos exemplos que se seguem represen- tam técnicas descritas pelo inventor para funcionar bem na prática da inven- ção, e assim podem ser consideradas como modos particulares para a sua prática. No entanto, as pessoas versadas na técnica deveriam, à luz da pre- sente descrição, perceber que muitas mudanças podem ser feitas nas moda- lidades específicas, que são descritos e ainda obter um resultado igual ou similar, sem se afastar do espírito e escopo da invenção. EXEMPLO 1 - Materiais e Métodos EEE:

: 43/57 Cultura de Células. Linhagens celulares de câncer de mama : humano ZR-75-1, ZR-75-1/vetor, ZR-75-1/MUC1sIRNA (Ren et al/., 2004) foram cultivadas em meio RPMI1640 suplementado com 10% de soro bovino ' fetal termoinativado (HI-FBS), 100 U/mL de penicilina e 100 ug/mL de es- treptomicina (Invitrogen) em uma incubadora umidificada a 37 ºC e 5% de CO;. Células de câncer de mama MCF-7 humanas e células 293 foram culti- vadas.em.meio-Eagle medificado -da-Dulbeceo com 10% -de -HI-FBS, antibió- ticos e L-glutamina 2 mM. As células epiteliais de mama MCF-10A humanas foram cultivadas em meio de crescimento das células epiteliais mamárias (MEGM; Lonza). As células foram tratadas com os peptídeos MUC1/CQC ou MUC1/AQA sintetizados pelo Laboratório de Biopolímeros do MIT, em Cam- o bridge, MA, A viabilidade foi determinada pela exclusão do azul tripano.

Imunoprecipitação e Análise de Imunoblot. Lisados nucleares e de células inteiras foram preparados como descrito (Leng et a/., 2007). Pro- - 15 teínas solúveis foram submetidas à imunoprecipitação com anti-Flag (Sigma, St. Louis, MO). Imunoprecipitados e proteínas solúveis foram analisadas por imunoblotting com anti-His (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti- GFP (Millipore, Danvers, MA), anti-Flag, anti-MUC1-C (Ab1; NeoMarkers, Fremont, CA), anti-lamina B (EMD, La Jolla, CA) ou anti-B-actina (Sigma). À reatividade foi detectada com anticorpos secundários conjugados com a pe- roxidase de rábano silvestre e quimiluminescência.

Transfecção de Células. Células 293 foram transfretadas com vetores que expressam GFP, GFP-MUC1-CD ou Flag-MUC1-CD na presen- ça de Lipofectamina, como descrito (Leng et al., 2007).

Absorção do peptídeo. As células foram incubadas com peptídeo MUC1/CQC marcado com FITC (Laboratório de Biopolímeros do MIT), lava- das com PBS frio, fixadas em 1% de paraformaldeído/PBS e analisadas para fluorescência por citometria de fluxo.

Análise de Distribuição do Ciclo Celular, Apoptose e Necrose. As células foram coletadas, lavadas com PBS, fixadas com etanol 80% e incu- badas em PBS contendo 40 ug/ml. de RNAse e 40 ug/mL de iodeto de pro- pídio por 30 min a 37 ºC. A distribuição do ciclo celular foi determinada por

SEE ENO EEE EEE AE

. 44/57 citometria de fluxo. O conteúdo de DNA Sub-G1 foi avaliado por coloração . com células permeabilizadas a tampão citrato e fixas com etanol com iodeto de propídio e monitoramento por citometria de fluxo, como descrito (Yin et ' al., 2007). Para a avaliação da necrose, as células foram incubadas com 1 ug/mL de iodeto de propídio/PBS por 5 minutos em temperatura ambiente e a seguir monitoradas por citometria de fluxo, como descrito (Yin et al., 2007).

Modelo de Xencenxerto -de Tumer -de-Mama Humano. -Camun- dongos Balb-c nu/nu fêmeas (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), de 4 a 6 semanas de idade pesando 18 a 22 g, foram implantados subcuta- —neamente com plugues de 17-B- estradiol (0,72 mg; Innovative Research, Sarasota, FL) utilizando uma pistola de trocarte. Após 24 h, 1 x 107 ZR-75-1 células embebidas em Matri-Gel (BD Biosciences) foram injetadas subcuta- neamente no flanco. Quando os tumores foram detectáveis a — 150 mm? (Grupo 1) ou 275 mmº (Grupo 2), os camundongos foram combinados em - 15 paresem grupos de tratamento e controle. Cada grupo continha 5 camun- dongos, cada um dos quais foi marcado na orelha e acompanhado ao longo do estudo. A dosagem inicial foi administrada no momento do pareamento dos pares (dia 1). Salina tamponada com fosfato (veículo), peptideo MUC1/CQC e peptídeo MUC1/AQA foram administrados diariamente por injeção intrape- —ritoneal. Os camundongos foram pesados duas vezes por semana, e as me- didas dos tumores foram realizadas utilizando paquímetros a cada 4 d. O volume tumoral (V) foi calculado pela fórmula V = W2 x L/2, onde W e L são os diâmetros menor e maior, respectivamente. No sacrifício, os ratos foram perfundidos com solução salina e, em seguida, formalina tamponada com fosfato por administração cardíaca. Os tumores foram extirpados, fixos por imersão por 4 h, desidratados através de uma série nivelada de etanóis, e processados para imersão em parafina de rotina. Os tumores foram avalia- dos por coloração com H&E e por marcação com imunoperoxidase com anti- MUC1, como descrito (Kufe, 1984).

Fármacos e Citocinas. Cisdiaminodicloroplatina (II), doxorrubici- na (adriamicina), Taxol (paclitaxel) foram comprados da Sigma (St. Louis, MO). rh-TNF-alfa foi comprado de Promega (Madison, WI). O peptídeo GO-

ERAS ES EEE

. 45/57 203 foi sintetizado por Anaspec Inc.

Citotoxicidade in vitro e ensaios de combinação. As células fo- ram semeadas em uma placa de microtitulação com fundo plano de 96 po- ços (Fisher) em 1000 células por poço para um experimento de 6 dias ou em — 3000 células por poço para um experimento de 3 dias. As células foram en- tão cultivadas por 24 h. Fármacos anticâncer e GO-203 foram diluídos até as - concentrações indicadas e adicionados às células.-GO-203-(5 umol/t) foi adicionado a cada 24 h por 72 h. A viabilidade celular foi determinada pela adição de reagente MTS às células e pela leitura da absorvância a 490 nm através de um leitor de microplacas.

Análise dos dados. Os valores de ICso para todos os fármacos “ anticâncerforam determinados por análise de regressão não linear usando . GraphPad Prism (GraphPad Software, São Diego, CA). O programa de computador CombiToo! (versão 2.001, IMB Jena Biocomputing Group) foi : 15 usado para calcular o índice de combinação dentro de uma faixa de dose na presença de 5 umol/L de GO0-203.

EXEMPLO 2 - Resultados Efeitos do peptíideo MUC1/CQC na formação do oligômero MUC1. O domínio citoplasmático MUC1 (MUC1-CD) contém uma porção CQC que é necessária para a formação de oligômeros e localização nuclear (Leng et al., 2007). Para determinar se uma pequena molécula pode ser pro- jetada para bloquear a oligomerização, os inventores sintetizaram um peptí- deo derivado da região N-terminal da MUC1-CD que contém a porção CQC (peptideo MUC1/CQC; FIG 1A). Um domínio de transdução de poli-D- arginina foi incluído na síntese para facilitar a entrada do peptídeo nas célu- las (Fischer, 2007) (figura 1A). Como controle, um peptídeo similar foi sinte- tizado no qual a porção CQC foi alterada para AQA (peptídeo MUC1/AQA; FIG 1A). Para avaliar a ligação dos peptídeos ao MUC1-CD, os inventores imobilizaram MUC1-CD etiquetada com His a um chip de sensor BlAcore. O —peptídeo MUC1/CQC ligado ao His-MUC1-CD com uma constante de disso- ciação (Kd) de 30 nM (figura 1B), que é similar àquela obtida com oligôêôme- ros MUC1 CD (Leng et al., 2007). Em contrapartida, não houve ligação apa-

EEE EEE

. 46/57 rente do peptídeo MUC1/AQA (dados não mostrados). MUC1-CD etiquetada com His purificado forma oligômeros como detectado por eletroforese em gel de poliacrilamida (figura 1C). Incubação de His-MUC1-CD com o peptídeo ' MUC1/CQC substancialmente diminuiu a formação de oligômeros e aumen- touos monômeros (figura 1C). Além disso, a incubação com o peptídeo MUC1/AQA teve pouco ou nenhum efeito (figura 1C). Para avaliar os efeitos sobre oligemerização-de -MUC1 in vive, células 2093 foram-transfectadas com vetores expressando GFP-MUC1-CD e Flag-MUC1-CD (figura 1D, à esquer- da). Complexos de GFP-MUC1-CD e Flag-CD-MUC1 foram detectáveis por —coprecipitação de lisatos de células não expostas ao peptídeo (figura 1D, à direita). Em conjunto com os resultados in vitro, a incubação das células 293 “o transfectadascom peptídeo MUC1/CQC foi associada com o rompimento da ' interação entre Flag-MUC1-CD e GFP-MUC1-CD (figura 1D, à direita). Além disso, o peptídeo MUC1/AQA não teve efeito aparente (figura 1D, à direita). Estes resultados indicam que o peptídeo MUC1/CQC se liga a MUC1-CD e bloqueia a formação de oligêmeros MUC1-CD in vitro e nas células.

Blocos de peptídeo MUC1/CQC direcionados a MUC1-C para o núcleo. Células de câncer de mama ZR-75-1 e MCF-7 humanas superex- pressaram MUC1 endógeno e, deste modo, representam modelos potenciais para avaliar os efeitos do peptideo MUC1/CQC (Ramasamy et al., 2007). Para avaliar a absorção, as células ZR-75-1 foram incubadas com 5 uM de peptídeo FITO-MUC1/CQC (figura 2A). Em 2 h, a análise das células por citometria de fluxo mostrou um aumento substancial na intensidade de fluo- rescência, com uma média (MFI) de 145 (figura 2A). Aumentos adicionais no —MFI foram identificados em 6 e 24 h (figura 2A). A oligomerização de MUC1- C é necessária para a sua importação nuclear (Leng et al., 2007). Tratamen- to de células ZR-75-1 com o peptideo MUC1/CQC ou o MUC1/AQA não teve efeito sobre os níveis celulares de MUC1-C (figura 2B). No entanto, em con- junto com efeitos sobre a oligomerização, o tratamento com MUC1/CQC, e —não com MUC1/AQA, o peptídeo foi associado com diminuições nos níveis de MUC1-C nucleares (figura 2B). Efeitos similares foram observados em células MCF-7 com a infrarregulação dos níveis de MUC1-C nucleares em EEE EEE EO:

. 47/57 resposta ao tratamento com o peptídeo MUC1/CQC (figura 2C). Estes resul- tados indicam que os peptídeos MUC1/CQC bloqueiam a oligomerização e, assim, o direcionamento de MUC1-C ao núcleo. ' O peptídeo MUC1/CQC bloqueia o crescimento e induz a necro- se Para determinar se o peptídeo MUC1/CQC afeta o crescimento, células ZR-75-1 foram tratadas com MUC1/CQC 5 uM por 72 horas e monitoradas para a distribuição do ciclo celular. Significativamente, houve-uma parada substancial na fase S, em comparação com aquela nas células não tratadas ou tratadas com o peptideo MUC1/AQA (figura 3A). Por 96 horas, a popula- çãode fases foi diminuída, possivelmente devido ao atrito por morte celular (figura 3A). Houve pouco ou nenhum acúmulo de células com conteúdo de DNA sub-G1 para suportar a indução de apoptose (figura 3A). No entanto, o tratamento das células ZR-75-1 com o peptideo MUC1/CQC, e não MUC1/AQA, foi associado com a indução de necrose, que foi detectável em : 15 72horase mais proeminente em 96 h (figura 3B). As células MCF-7 respon- deram de forma similar ao peptideo MUC1/CQC com a parada do cresci- mento na fase S (figura 3C) e a indução de necrose (figura 3D). Estes resul- tados indicam que o peptíideo MUC1/CQC inibe o crescimento e induz a ne- crose das células de câncer de mama humano.

Especificidade do peptideo MUC1/CQC para células de carci- noma expressando MUC1. Para determinar se o peptideo MUC1/CQC tem atividade seletiva contra células de carcinoma de mama que superexpres- sam MUC1 endógeno, os inventores trataram células ZR-75-1 que são esta- velmente silenciadas para a expressão de MUC1 com MUC1SIRNA (figura 4A). Ao contrário, para interromper o crescimento e morte das células de ZR- 75-1Wvetor, o peptideo MUC1/CQC teve significativamente menos efeito nas células ZR-75-1/MUC1siRNA (figura 4B). Além disso, o peptideo MUC1/CAC não teve efeito aparente no crescimento de células 293 MUC1-negativas (figura 4C). Estudos também foram realizados na linhagem de células epite- lials mamárias não transformadas MCF-10A (Muthuswamy, 2001; Soule, 1990), que expressa MUC1, mas em níveis inferiores aos encontrados nas células ZR-75-1 e MCF-7 (Ahmad et al., 2007). Notoriamente, ao contrário

TESES EEE EO TRE

. 48/57 das células ZR-75-1 e MCF-7, o peptíideo MUC1/CQC não teve nenhum efei- : to sobre a distribuição do ciclo celular de MCF-10A (figura 4D) e o cresci- mento (figura 4E). Estes resultados indicam que o peptídeo MUC1/CQC tem ' atividade seletiva contra células de carcinoma de mama que superexpres- sam MUC1 endógeno.

Peptídeo MUC1/CQC inibe a tumorigenicidade in vivo. Para de- terminar se a administração do peptideo MUCI/CQC está associada com efeitos sobre o peso corporal, cinco camundongos nua fêmeas (nu/nu) foram injetados por via intraperitoneal (IP), uma vez por dia com uma dose de 50 mgo/Kg. A administração do peptídeo no dia 11 não teve efeito aparente so- bre o peso dos camundongos individuais. Além disso, não houve efeito sub- sequente sobre o peso corporal ao longo dos próximos 28 d após a interrup- ção da administração de MUC1/CQC (dados não mostrados). Para avaliar a atividade antitumoral, células ZR-75-1 (1 x 10) foram implantadas subcuta- : 15 neamentenosflancosdos camundongos nus. Depois de 12 d, camundongos portadores de tumores com cerca de 150 mmº foram tratados com o peptí- deo MUC1/CQC em doses de 10 e 50 mg/Kg/d. Como controles, os camun- dongos foram tratados com veículo sozinho ou com o peptídeo MUC1/AQA. A administração do peptideo MUC1/CQC a 10 mg/Kg/d x 21 d retardou o crescimento em comparação com aquela obtida com o peptídeo MUC1/AQA dado em 50 mg/Kg/d (figura SA). Além disso, a administração do peptídeo MUC1/CQC a 50 mg/Kg/d bloqueou o crescimento durante os 7 dias iniciais de tratamento (figura 5A). Consequentemente, o tratamento foi interrompido e os camundongos foram monitorados por novo crescimento. Significativa- mente, não houve crescimento detectável dos tumores ao longo dos 17 dias seguintes (figura 5A). Para avaliar, em parte, a base para a atividade, os tu- mores coletado do controle e camundongos tratados foram examinados por histopatologia. Tumores de camundongos tratados com MUC1/CQC (10 e 50 mg/Kg) foram acentuadamente necróticos em comparação aqueles dos ca- —mundongos tratados com o veículo ou peptideo MUC1/AQA (figura 5B e da- dos não mostrados). Notavelmente, entretanto, as células tumorais foram também detectáveis ao redor das áreas de necrose (figura 5B). Seções dos TERESENSE ENO: