JPWO2007119515A1 - 新規腫瘍抗原ペプチド - Google Patents

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Abstract

新規な腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチド、ならびにこれらの物質の癌免疫分野における利用に関する。具体的には、Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3に由来する部分ペプチドを含有し、かつＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド、当該ペプチドと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物等に関する。

Description

本発明は、新規な腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチド、ならびにこれらの物質の癌免疫分野における利用に関する。
生体による癌（腫瘍）の排除には、免疫系、特にＴ細胞が重要な役割を果たしていることが知られている。実際、ヒトの癌局所には癌細胞に対して傷害活性を示すリンパ球の浸潤が認められ（非特許文献１を参照）、メラノーマからは自己の癌細胞を認識する細胞傷害性Ｔ細胞（以下CTL）が比較的容易に分離されている（非特許文献２、３および４を参照）。また、該CTLの移入によるメラノーマ治療の臨床結果からも、癌排除におけるＴ細胞の重要性が示唆されている（非特許文献５を参照）。
自己の癌細胞を攻撃するCTLが標的とする分子については長い間不明であったが、最近の免疫学および分子生物学の進歩により次第に明らかになってきた。すなわちCTLは、T細胞受容体（TCR）を用いて、癌抗原ペプチドと呼ばれるペプチドと主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ抗原（MHCクラスI抗原、HLA抗原とも呼ばれる）との複合体を認識することにより、自己の癌細胞を攻撃していることが明らかとなった。
癌抗原ペプチドは、癌に特有のタンパク質、すなわち癌抗原タンパク質が細胞内で合成された後、プロテアソームにより細胞内で分解されることによって生成される。生成された癌抗原ペプチドは、小胞体内でMHCクラスI抗原（HLA抗原）と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示された複合体を抗原特異的なCTLが認識し、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗癌作用を示す。このような一連の作用の解明に伴い、癌抗原タンパク質または癌抗原ペプチドをいわゆる癌ワクチンとして利用することにより、癌患者の体内の癌特異的CTLを増強させる治療法が可能となった。
腫瘍抗原タンパク質としては、1991年にT.Boonらが初めてＭＡＧＥと名付けたタンパク質をヒトメラノーマ細胞から同定した（非特許文献６を参照）。その後、いくつかの腫瘍抗原タンパク質が、主にメラノーマ細胞から同定されている。
腫瘍抗原タンパク質や腫瘍抗原ペプチドを腫瘍の治療や診断に応用するために、メラノーマに比べて発生頻度が圧倒的に高い腺癌（肺癌等）などに幅広く適応可能な、新たな腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチドの同定が望まれている。
Lengsin(Glutamate-ammonia ligase (glutamine synthase) domain containing 1 (GLULD1) UniGene Hs.149585)は、ヒトレンズで多く発現する新規遺伝子として同定され、そのアミノ酸配列の類似性からグルタミン合成酵素のファミリーに属する可能性が報告されている。しかし、生理的機能については不明である（非特許文献７を参照）。
BJ-TSA-9(Hypothetical protein MGC14128)(UniGene Hs.379821)は、The National Institutes of Health Mammalian Gene Collection (MGC) Programにおいてクローニングされた新規遺伝子であるが、その生理的機能については不明である（非特許文献８を参照）。
C20orf42(あるいはURP1, Kindlerin)は肺癌、結腸癌で高発現する遺伝子としてクローニングされ（非特許文献９を参照）、C. elegans UNC-112と高い類似性を有する。UNC-112と同様Integrinと相互作用し、またTGF-βで発現誘導されることが示されている（非特許文献１０を参照）。一方、C20orf42は稀な常染色体性劣性遺伝性皮膚症であるKindler syndromeで変異の認められるKindlerin遺伝子として同定されている（非特許文献１１、１２を参照）。
BUB1は細胞周期Ｍ期の紡錘体形成チェックポイントで働くSerine/threonine Kinase分子であり、BUB1機能欠失により染色体分離に異常を生じる。またBUB1はCdc20をリン酸化し、APC/Ccdc20のubiquitin ligase活性を抑制し、その結果染色体の異常な分配が阻止される（非特許文献１３を参照）。癌組織においては発現低下あるいは変異が報告されている（非特許文献１４、１５を参照）。
C10orf3はThe National Institutes of Health Mammalian Gene Collection (MGC) Programにおいてクローニングされた新規遺伝子であるが、その生理的機能については不明である（非特許文献１６を参照）。
HIFPH3(egl nine homolog3,EGLN3)はC.elegansでHypoxia-inducible factor1(HIF1)の活性を制御するdioxygenase分子として同定されたegl9と同様な活性を担う3種の分子の1種としてクローニングされた（非特許文献１７を参照）。HIF1を介して低酸素状態での活性を制御していると考えられているが3種のegl nine homologの違いについては明らかではない。
Arch.Surg.，126:200 (1990) Immunol.Today，8:385 (1987) J.Immunol.，138:989 (1987) Int.J.Cancer，52:52 (1992) J.Natl.Cancer.Inst.，86:1159 (1994) Science, 254, 1643-1647 (1991) Mol. Vis. Jun. 15;8:185-95 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 99(26):16899-903 (2002) Biochim. Biophys. Acta 1637: 207-216 (2003) J. Biol. Chem., Feb 20; 279(8):6824-33 (2004） Hum. Molec. Genet., 12: 925-935 (2003) Am. J. Hum. Genet., 73: 174-187 (2003) Mol. Cell., Nov 5;16(3):387-97 (2004) Oncogene Jul 11;21(30):4673-9 (2002) Leuk. Lymphoma. Feb;43(2):385-91 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., Dec 24;99(26):16899-903 (2002) Cell 107: 43-54 (2001)
本発明の目的は、新規な腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチド、ならびにこれらの物質の癌免疫分野における用途を提供することにある。
本発明者らは、各種癌組織において、正常組織に比して発現頻度および／または発現量が上昇している遺伝子につき鋭意検討した結果、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子およびHIFPH3遺伝子の計6遺伝子が選択され、これらの遺伝子およびその発現産物(タンパク質)は、癌に対する疾患マーカーとして有用であることが明らかとなった。
さらに、これらLengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子およびHIFPH3遺伝子がコードするタンパク質（Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3およびHIFPH3）のアミノ酸配列よりHLA分子に結合する可能性のあるペプチド部分を選択し、HLA分子への結合親和性やCTL誘導活性等を解析した結果、これら6種類のタンパク質（特にBJ-TSA-9、C20orf42およびC10orf3）は腫瘍抗原タンパク質であり、その部分ペプチドは腫瘍抗原ペプチドであることが明らかとなった。従って、これらLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3、HIFPH3、およびこれらに由来するペプチドは、これら因子の発現（特に発現上昇）が認められる種々の癌に対する癌ワクチンとして有用であると考えられる。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、
(1) Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3に由来する部分ペプチドを含有し、かつＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド、
(2) ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４抗原またはＨＬＡ−Ａ２抗原である、前記(1)記載のペプチド、
(3) 配列番号：１３〜配列番号：２０１のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、前記(2)記載のペプチド、
(4) 配列番号：１３〜配列番号：３１、配列番号：４２〜配列番号：４９、配列番号：５９〜配列番号：７８、配列番号：８９〜配列番号：１１７、配列番号：１５８〜配列番号：１６５、配列番号：１７６〜配列番号：１８３、配列番号：１９５〜２０１のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンに置換され、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンに置換されたアミノ酸配列を含有し、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド、
(5) 配列番号：３２〜配列番号：４１、配列番号：５０〜配列番号：５８、配列番号：７９〜配列番号：８８、配列番号：１１８〜配列番号：１５７、配列番号：１６６〜配列番号：１７５、配列番号：１８４〜配列番号：１９４のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸がロイシン、メチオニン、バリン、イソロイシンまたはグルタミンに置換され、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンに置換されたアミノ酸配列を含有し、かつＨＬＡ−Ａ２抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド、
(6) 前記(1)〜(5)のいずれかに記載のペプチドを含有するエピトープペプチド、
(7) 前記(1)〜(6)のいずれかに記載のペプチドと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(8) 前記(1)〜(6)のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
(9) 前記(8)記載の核酸と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(10) Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(11) Lengsinが配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前記(10)記載の医薬組成物、
(12) BJ-TSA-9が配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前記(10)記載の医薬組成物、
(13) C20orf42が配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前記(10)記載の医薬組成物、
(14) BUB1が配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前記(10)記載の医薬組成物、
(15) C10orf3が配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前記(10)記載の医薬組成物、
(16) HIFPH3が配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前記(10)記載の医薬組成物、
(17) Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(18) Lengsinをコードするポリヌクレオチドが配列番号：１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、前記(17)記載の医薬組成物、
(19) BJ-TSA-9をコードするポリヌクレオチドが配列番号：３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、前記(17)記載の医薬組成物、
(20) C20orf42をコードするポリヌクレオチドが配列番号：５に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、前記(17)記載の医薬組成物、
(21) BUB1をコードするポリヌクレオチドが配列番号：７に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または配列番号：８に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、前記(17)記載の医薬組成物、
(22) C10orf3をコードするポリヌクレオチドが配列番号：９に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または配列番号：１０に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、前記(17)記載の医薬組成物、
(23) HIFPH3をコードするポリヌクレオチドが配列番号：１１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または配列番号：１２に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、前記(17)記載の医薬組成物、
(24) 以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）前記(1)〜(6)のいずれかに記載のペプチド、
（ｂ）前記(8)記載の核酸、
（ｃ）Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3、および
（ｄ）Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、抗原提示能を有する細胞とをイン・ビトロで接触させることを特徴とする、抗原提示細胞の製造方法、
(25) 前記(24)記載の製造方法により製造される抗原提示細胞、
(26) 前記(25)記載の抗原提示細胞と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(27) 以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）前記(1)〜(6)のいずれかに記載のペプチド、
（ｂ）前記(8)記載の核酸、
（ｃ）Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3、および
（ｄ）Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、末梢血リンパ球とをイン・ビトロで接触させることを特徴とする、ＣＴＬの誘導方法、
(28) 前記(27)記載の誘導方法により誘導されるＣＴＬ、
(29) 前記(28)記載のＣＴＬと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(30) ＣＴＬの誘導剤として使用される、前記(7)、(9)〜(23)、(26)または(29)のいずれかに記載の医薬組成物、
(31) 癌ワクチンとして使用される、前記(7)、(9)〜(23)、(26)または(29)のいずれかに記載の医薬組成物、
(32) 前記(1)〜(5)のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体、
(33) 前記(1)〜(5)のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡ抗原とを含有するＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマー、
(34) 前記(33)記載のＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマーを成分として含有する、Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3に由来する腫瘍抗原ペプチド特異的なＣＴＬの検出用試薬、
(35) Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなる癌疾患の疾患マーカー、
(36) 癌疾患の検出においてプローブまたはプライマーとして使用される前記(35)に記載の疾患マーカー、
(37) Lengsin遺伝子に関する疾患マーカーが肺腺癌、肺扁平上皮癌または胃癌に対するものである、前記(35)または(36)に記載の疾患マーカー、
(38) BJ-TSA-9遺伝子に関する疾患マーカーが白血病、肺腺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌、口腔癌、胃癌、膵臓癌またはリンパ腫に対するものである、前記(35)または(36)に記載の疾患マーカー、
(39) C20orf42遺伝子に関する疾患マーカーが肺扁平上皮癌、肺腺癌、肝臓癌、胃癌、白血病、悪性リンパ腫組織、直腸癌、結腸癌または膵臓癌に対するものである、前記(35)または(36)に記載の疾患マーカー、
(40) BUB1遺伝子に関する疾患マーカーが乳癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、口腔扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫またはメラノーマに対するものである、前記(35)または(36)に記載の疾患マーカー、
(41) C10orf3遺伝子に関する疾患マーカーが乳癌、結腸癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌、小細胞肺癌またはメラノーマに対するものである、前記(35)または(36)に記載の疾患マーカー、
(42) HIFPH3遺伝子に関する疾患マーカーが乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌、肺腺癌または肺扁平上皮癌に対するものである、前記(35)または(36)に記載の疾患マーカー、
(43) 下記の工程(a)、(b)および(c)を含む癌疾患の検出方法：
(a)被験者の生体試料から調製されたRNAまたは該RNAから転写された相補的ポリヌクレオチドと前記(35)〜(42)のいずれかに記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
(b)該疾患マーカーに結合した生体試料由来のRNAまたは該RNAから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記(b)の測定結果に基づいて、癌疾患の罹患を判断する工程、
(44) 工程(c)における癌疾患の罹患の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われるものである前記(43)に記載の癌疾患の検出方法、
(45) Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3を特異的に認識する抗体を含有する、癌疾患の疾患マーカー、
(46) 癌疾患の検出においてプローブとして使用される前記(45)に記載の疾患マーカー、
(47) 下記の工程(a)、(b)および(c)を含む癌疾患の検出方法：
(a)被験者の生体試料から調製されたタンパク質と前記(45)または(46)に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
(b)該疾患マーカーに結合した生体試料由来の蛋白質またはその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記(b)の測定結果に基づいて、癌疾患の罹患を判断する工程、ならびに
(48) 工程(c)における癌疾患の罹患の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われるものである前記(47)に記載の癌疾患の検出方法、に関する。
本発明の新規な腫瘍抗原ペプチドまたはこれらをコードする核酸等は、癌ワクチンとして有効に用いることができる。また当該腫瘍抗原ペプチドは、CTLを検出するためのHLAテトラマー等の成分としても有効に用いることができる。
以下、本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、IUPAC-IUBの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
1)本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3、HIFPH3の各タンパク質である。
本発明のタンパク質Lengsinは、配列番号：2に記載のアミノ酸配列またはそれに類似するアミノ酸配列を含有する。本発明のLengsinは、天然物（例えば肺腺癌細胞株1-87）に由来するタンパク質であってもよく、また組換えタンパク質であっても良い。ここで配列番号：2に記載のアミノ酸配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_016571、Accession No. NP_057655として登録されたヒトLengsin(Glutamate-ammonia ligase (glutamine synthase) domain containing 1、GLULD1とも称する)のアミノ酸配列である。当該ヒトLengsinは非特許文献７(Mol. Vis. Jun. 15;8:185-95 (2002))により公知である。
本発明のタンパク質BJ-TSA-9は、配列番号：4に記載のアミノ酸配列またはそれに類似するアミノ酸配列を含有する。本発明のBJ-TSA-9は、天然物（例えば肺腺癌細胞株1-87）に由来するタンパク質であってもよく、また組換えタンパク質であっても良い。ここで配列番号：4に記載のアミノ酸配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_032899、Accession No. NP_116288として登録されたヒトBJ-TSA-9(Hypothetical protein MGC14128)のアミノ酸配列である。当該ヒトBJ-TSA-9は非特許文献８(Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 99(26):16899-903 (2002))により公知である。
本発明のタンパク質C20orf42は、配列番号：6に記載のアミノ酸配列またはそれに類似するアミノ酸配列を含有する。本発明のC20orf42は、天然物（例えば結腸癌細胞株SW480）に由来するタンパク質であってもよく、また組換えタンパク質であっても良い。ここで配列番号：6に記載のアミノ酸配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_017671、Accession No. NP_060141として登録されたヒトC20orf42(URP1、Kindlerinとも称する)のアミノ酸配列である。当該ヒトC20orf42は非特許文献９(Biochim. Biophys. Acta 1637: 207-216 (2003))により公知である。
本発明のタンパク質BUB1は、配列番号：8に記載のアミノ酸配列またはそれに類似するアミノ酸配列を含有する。本発明のBUB1は、天然物（例えば膵臓癌細胞株PUN）に由来するタンパク質であってもよく、また組換えタンパク質であっても良い。ここで配列番号：8に記載のアミノ酸配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_004336、Accession No. NP_004327として登録されたヒトBUB1のアミノ酸配列である。当該ヒトBUB1は文献 (Genomics 46:379-388(1997)により公知である。
本発明のタンパク質C10orf3は、配列番号：10に記載のアミノ酸配列またはそれに類似するアミノ酸配列を含有する。本発明のC10orf3は、天然物（例えば肺腺癌細胞株1-87）に由来するタンパク質であってもよく、また組換えタンパク質であっても良い。ここで配列番号：10に記載のアミノ酸配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_018131、Accession No. NP_060601として登録されたヒトC10orf3のアミノ酸配列である。当該ヒトC10orf3は非特許文献１６(Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., Dec 24;99(26):16899-903 (2002))により公知である。
本発明のタンパク質HIFPH3は、配列番号：12に記載のアミノ酸配列またはそれに類似するアミノ酸配列を含有する。本発明のHIFPH3は、天然物（例えば腎癌細胞株SMKTR-1）に由来するタンパク質であってもよく、また組換えタンパク質であっても良い。ここで配列番号：12に記載のアミノ酸配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_022073、Accession No. NP_071356として登録されたヒトHIFPH3(egl nine homolog3、EGLN3とも称する)のアミノ酸配列である。当該ヒトHIFPH3は非特許文献１７(Cell 107: 43-54 (2001))により公知である。
以上に示したLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3、HIFPH3を「本発明タンパク質」と称する場合がある。
前記において「配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、具体的には、配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、若しくは配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列を含有し、そのＮ末端側及び/又はＣ末端側に他のアミノ酸配列の付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。ここで「他のアミノ酸配列」とは本発明タンパク質以外の構造遺伝子のアミノ酸配列であっても良い。
また前記において「配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、具体的には以下の(a)〜(c)に挙げるタンパク質が挙げられる：
(a) 配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するタンパク質、
(b) 配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含有するタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するタンパク質、
(c) 配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するタンパク質。
好ましくは、配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列からなるタンパク質としては、以下の(a')〜(c')に挙げるタンパク質が挙げられる：
(a') 配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するタンパク質、
(b') 配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するタンパク質、
(c') 配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するタンパク質。
前記(a)における「配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、人為的に作製したいわゆる改変タンパク質や、生体内に存在するアレル変異体等のタンパク質を意味する。
ここでタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、本発明タンパク質の活性が保持される限り制限はない。このように活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個欠失、置換及び／又は付加されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の10％以内であり、好ましくは全アミノ酸の5％以内である。また置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe及びTrpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及びGlnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Asp及びGluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またLys、Arg及びHisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
前記(b)における「配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列と70％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、例えば配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列と約70％以上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。具体的には、配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列の部分配列からなるタンパク質などが挙げられる。
ここで「配列同一性」とは、２つのタンパク質間の、配列の同一性及び相同性をいう。当該「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のタンパク質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994))を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
前記(c)における「配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約40％以上、好ましくは約60％以上、より好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の配列同一性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。具体的には、配列番号：1,3,5,7,9または11に記載の塩基配列と、約40％以上、好ましくは約60％以上、より好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の配列同一性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。より具体的には、配列番号：1,3,5,7,9または11に記載の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチドなどが挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えばMolecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に記載の方法に従って行うことができる。また市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)や前記Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。
ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、6×SSC(20×SSCは、333mM Sodium citrate、333mM NaClを示す)、0.5%SDSおよび50% ホルムアミドを含む溶液中で42℃にてハイブリダイズさせる条件、または6×SSCを含む(50%ホルムアミドは含まない)溶液中で65℃にてハイブリダイズさせる条件などが挙げられる。
またハイブリダイゼーション後の洗浄の条件としては、「１×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。
前記のように本発明タンパク質は、腫瘍抗原タンパク質としての活性を有する。ここで「腫瘍抗原タンパク質としての活性」とは、既存の腫瘍抗原タンパク質の活性測定法により活性を示すことを意味する。具体的には、例えば、Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3を発現させた細胞がCTLにより認識される、すなわち当該細胞がCTLに反応性を示す、換言すれば本発明のタンパク質若しくは該タンパク質に由来する抗原ペプチドがCTLを活性化する若しくはCTLを誘導するという性質を示す。
前記において細胞とは、HLA抗原を発現する細胞であることが好ましい。従って前記腫瘍抗原タンパク質としての活性とは、より具体的には、例えばHLA-A24やHLA-A2等のHLA抗原を発現する細胞において本発明のタンパク質を発現させることにより、本発明タンパク質由来の抗原ペプチドとHLA抗原との複合体が細胞表面に提示され、その結果、当該細胞がCTLに認識される、すなわちCTLが活性化される（CTLが誘導される）という性質を指す。
このような本発明タンパク質の性質は、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法（例えば51Crリリースアッセイ（J.Immunol.,159:4753,1997）、LDHリリースアッセイ（LDH Cytotoxicity Detection Kit（タカラバイオ))、サイトカイン量の測定等）により容易に測定することができる。以下に具体的なアッセイ法を例示する。
まず、293-EBNA細胞（Invitrogen社）等の宿主細胞に対し、本発明タンパク質をコードするDNAを含有する発現ベクターと、HLA抗原をコードするDNAを含有する発現ベクターとをトランスフェクトする。ここで用いるHLA抗原をコードするDNAとしては、例えばHLA-A24抗原をコードするDNA若しくはHLA-A2抗原をコードするDNAが挙げられる。HLA-A24抗原をコードするDNAとしてはHLA-A2402のcDNA（Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995)、Genbank Accession No.M64740）が挙げられる。またHLA-A2抗原をコードするDNAとしてはHLA-A0201のcDNA（GenBank Acc.No.M84379）が挙げられる。
前記トランスフェクトは、例えばリポフェクトアミン試薬（GIBCO BRL社製）を用いたリポフェクチン法などにより行うことができる。その後、用いたHLA抗原に拘束性のCTLを加えて作用させ、該CTLが反応（活性化）して産生する種々のサイトカイン、例えばIFN-γの量を、例えばＥＬＩＳＡ法などで測定することにより調べることができる。ここでCTLとしては、ヒトの末梢血リンパ球を本発明タンパク質で刺激することにより調製されたCTLや、Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N. Eng. J. Med, 333, 1038-1044, 1995等に記載の方法により樹立したCTLを用いることができる。
また本発明タンパク質は、例えばヒトモデル動物を用いたアッセイ（WO 02/47474 号公報、Int J. Cancer:100,565-570 (2002)）に供することにより、in vivoでのCTL誘導活性を調べることができる。
本発明のタンパク質は、天然物（種々の癌細胞株など）から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することができる。また後述する本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸を含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。
2)本発明タンパク質由来のペプチド
本発明のペプチドとは、Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3に由来する部分ペプチドを含有し、かつHLA抗原と結合してCTLにより認識される腫瘍抗原ペプチドである（以下「本発明ペプチド」または「本発明の腫瘍抗原ペプチド」と称する場合もある）。すなわち、前記した本発明タンパク質のアミノ酸配列の一部を含有するペプチドであって、かつ、該ペプチドとＨＬＡ抗原との結合複合体がCTLにより認識されるようなペプチドであれば、本発明タンパク質のアミノ酸配列中の如何なる位置に存する如何なる長さのペプチドを含有するものであっても良い。
このような本発明ペプチドは、例えば、Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3の一部よりなる候補ペプチドを合成し、該候補ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体がCTLにより認識されるか否か、すなわち候補ペプチドが腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するか否かをアッセイすることにより、同定することができる。
ここで、ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。該公知方法としては文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成，広川書店，1991）などに記載されている方法が挙げられる。
次に、本発明の腫瘍抗原ペプチドの同定方法につき記述する。
HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401, -Cw0602などのＨＬＡの型については、該ＨＬＡに結合して提示される抗原ペプチドの配列の規則性（モチーフ）が判明している（例えばImmunogenetics,41:p178,1995などを参照のこと）。例えばHLA-A24のモチーフとしては、8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンとなることが知られている（J.Immunol.,152,p3913,1994、Immunogenetics,41:p178,1995、J.Immunol.,155:p4307,1994）。またHLA-A2のモチーフについては、以下の表１に示したモチーフが知られている（Immunogenetics,41,p178,1995、 J.Immunol.,155:p4749,1995）。
Figure 2007119515
さらに近年、ＨＬＡ抗原に結合可能と予想されるペプチド配列を、インターネット上、NIHのBIMASのソフトを使用することにより検索することができる（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/ ）。
ペプチドの長さとしては、各種HLA分子に結合している抗原ペプチドの解析により（Immunogenetics，41:178，1995）、通常8から1４アミノ酸程度であることが明らかにされている（ただしHLA‐DR、‐DP、‐DQについては、14アミノ酸以上の長さの抗原ペプチドも認められる）。
これらのモチーフに関わるペプチド部分を本発明タンパク質のアミノ酸配列中から選び出すのは容易である。例えば、前記BIMASソフトでの検索により、ＨＬＡ抗原に結合可能と予想される配列を容易に選び出すことができる。選び出された候補ペプチドを前述の方法にて合成し、該候補ペプチドがＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識されるか否か、すなわち候補ペプチドが腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するか否かを測定することにより、本発明のペプチドを同定することができる。
本発明の腫瘍抗原ペプチドの具体的な同定法としては、例えば J.Immunol.,154,p2257,1995に記載の方法が挙げられる。すなわち、候補ペプチドを提示すると考えられるタイプのＨＬＡ抗原が陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、in vitroで該候補ペプチドを添加して刺激した場合に、該候補ペプチドをパルスしたHLA抗原陽性細胞を特異的に認識するCTLが誘導された場合は、該候補ペプチドが腫瘍抗原ペプチドに成り得ることが示される。ここでCTLの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してCTLが産生する種々のサイトカイン（例えばIFN-γ）の量を、例えばELISA法などによって測定することにより、調べることができる。また51Crで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するCTLの傷害性を測定する方法（51Crリリースアッセイ、Int.J.Cancer,58:p317,1994）によっても調べることができる。
さらに、候補ペプチドを提示すると考えられるタイプのＨＬＡ抗原をコードするｃＤＮＡを発現する発現プラスミドを、例えば 293-EBNA細胞（Invitrogen社）に導入した細胞に対して候補ペプチドをパルスし、この細胞に対して、前記候補ペプチドを提示すると考えられるタイプのＨＬＡ抗原に拘束性のCTLを反応させ、該CTLが産生する種々のサイトカイン（例えばIFN-γ）の量を測定することによっても、調べることができる（J.Exp.Med.,187: 277,1998）。
ここでHLA抗原としては、HLA-A24抗原若しくはHLA-A2抗原が挙げられる。HLA-A24拘束性の腫瘍抗原ペプチドを選択する場合には、前記HLA抗原をコードするcDNAとしてはHLA-A2402のcDNA（Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995)、Genbank Accession No.M64740）を用いることができる。またHLA-A2拘束性の腫瘍抗原ペプチドを選択する場合は、前記HLA抗原をコードするcDNAとしてはHLA-A0201のcDNA（GenBank Acc.No.M84379）を用いることができる。
また前記CTLとしては、ヒトの末梢血リンパ球のペプチド刺激により調製される場合の他、Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N. Eng. J. Med, 333, 1038-1044, 1995等に記載の方法により樹立したCTLを用いることができる。
また本発明のペプチドは、例えばヒトモデル動物を用いたアッセイ（WO 02/47474 号公報、Int J. Cancer:100,565-570 (2002)）に供することにより、in vivoでの活性を調べることができる。
前記のように腫瘍抗原ペプチドの配列の規則性（モチーフ）が判明している場合と異なり、例えばHLA-B55やHLA-A26のようにそのペプチドのモチーフが明らかでない場合は、これらのHLA抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を認識するCTL株が存在する場合には、例えばWO97/46676等に記載の方法に準じて本発明の腫瘍抗原ペプチドを同定することができる。
以上のような本発明のペプチドの具体例としては、配列番号：2に記載のアミノ酸配列からなるLengsin、配列番号：4に記載のアミノ酸配列からなるBJ-TSA-9、配列番号：6に記載のアミノ酸配列からなるC20orf42、配列番号：8に記載のアミノ酸配列からなるBUB1、配列番号：10に記載のアミノ酸配列からなるC10orf3、または配列番号：12に記載のアミノ酸配列からなるHIFPH3の部分ペプチドであって、かつHLA抗原と結合してCTLにより認識されるペプチドが挙げられる。また、本発明のペプチドが結合するHLA抗原の観点からは、HLA-A24抗原またはHLA-A2抗原に結合する本発明のペプチドを挙げることができる。ペプチドの長さとして、好ましくは8〜14アミノ酸が、より好ましくは8〜11アミノ酸が挙げられる。
具体的には、配列番号：13〜201のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有し、かつHLA抗原と結合してCTLにより認識されるペプチドが挙げられる。ペプチドの長さとして、好ましくは9〜14アミノ酸が、より好ましくは9〜11アミノ酸が挙げられる。より具体的には、例えばHLA-A24結合性の腫瘍抗原ペプチドとしては、配列番号：13〜配列番号：31、配列番号：42〜配列番号：49、配列番号：59〜配列番号：78、配列番号：89〜配列番号：117、配列番号：158〜配列番号：165、配列番号：176〜配列番号：183、配列番号：195〜配列番号：201のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドであって、HLA-A24抗原に結合してCTLに認識されるペプチドが挙げられる（後述の表5,7,9,11,13,15）。好ましくは、配列番号：42,43,44,45,46,47,49,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159,160,161,15,16,21,22,23,24,25,26,27,30,195,197,198,199,200,201,177,178,179,183に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
より好ましくは、配列番号：158,22,23,26,27,198,200,201,177,178,179,183に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
また、HLA-A2結合性の腫瘍抗原ペプチドとしては、配列番号：32〜配列番号：41、配列番号：50〜配列番号：58、配列番号：79〜配列番号：88、配列番号：118〜配列番号：157、配列番号：166〜配列番号：175、配列番号：184〜配列番号：194のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドであって、HLA-A2抗原に結合してCTLに認識されるペプチドが挙げられる（後述の表6,8,10,12,14,16)。
本発明においては、前記の如き配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列の一部を含有するペプチドのみならず、当該ペプチドの一部を改変した改変ペプチドであっても、HLA抗原と結合してCTLにより認識されるという性質を有する限り、本発明のペプチドの範疇に含まれる。具体的には、本発明のLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3のアミノ酸配列、より具体的には配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列の一部からなる本発明のペプチドのアミノ酸配列に対して、１又はそれ以上のアミノ酸残基の改変を施したアミノ酸配列を含有する改変ペプチドであって、かつＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識されるという腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するものは、本発明のペプチドの範疇に含まれる。
ここで、アミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、及び／又は付加（ペプチドのＮ末端、Ｃ末端へのアミノ酸の付加も含む）を意味し、好ましくはアミノ酸残基の置換が挙げられる。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸残基の数および位置は、腫瘍抗原ペプチドとしての活性が維持される限り、任意であるが、前記したように通常、腫瘍抗原ペプチドの長さが８〜１４アミノ酸程度であることから、１個から数個の範囲が好ましい。
本発明の改変ペプチドの長さとしては、８〜１４アミノ酸程度が好ましい（ただしHLA-DR、-DP、-DQについては、14アミノ酸以上の長さの場合もある。）
先に記載したように、HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401, -Cw0602などのＨＬＡの型については、該ＨＬＡに結合して提示される抗原ペプチドの配列の規則性（モチーフ）が判明している。また前記したように、HLA抗原に結合可能と予想されるペプチド配列をインターネット上検索することができる（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/ ）。従って、該モチーフ等に基づき、前記改変ペプチドを作製することが可能である。
例えばHLA-A24に結合して提示される抗原ペプチドのモチーフとしては、前記したように、8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンであることが知られている（J.Immunol., 152:p3913,1994、Immunogenetics,41:p178,1995、J.Immunol.,155:p4307,1994）。またHLA-A2の場合は、8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がロイシン、メチオニン、バリン、イソロイシンまたはグルタミンであり、Ｃ末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンであることが知られている（Immunogenetics,41,p178,1995、 J.Immunol.,155:p4749,1995）。またインターネット上でHLA抗原に結合可能と予想されるペプチド配列が示されており（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/）、例えば前記モチーフ上とり得るアミノ酸に類似の性質を持つアミノ酸が許容される。従って、これらモチーフ上アミノ酸の置換が可能な位置（HLA-A24、HLA-A2においてはペプチドの第2位とＣ末端）にあるアミノ酸を他のアミノ酸（好ましくは前記インターネット等で結合可能と予想されているアミノ酸）に置換したアミノ酸配列を含むものであって、かつＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識されるという活性を持つ改変ペプチドを挙げることができる。
より好ましくは、該位置において、前記モチーフ上知られたアミノ酸残基のいずれかに置換したアミノ酸配列を含有するペプチドであって、かつ腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有する改変ペプチドが挙げられる。すなわち配列番号：13〜配列番号：31、配列番号：42〜配列番号：49、配列番号：59〜配列番号：78、配列番号：89〜配列番号：117、配列番号：158〜配列番号：165、配列番号：176〜配列番号：183、配列番号：195〜配列番号：201に示されるようなHLA-A24結合性のペプチドの場合、その第2位のアミノ酸をチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンに置換し、及び／又はＣ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンに置換したアミノ酸配列を含有するペプチドであって、かつHLA-A24抗原と結合してＣＴＬにより認識される改変ペプチドが挙げられる。このうち第2位のアミノ酸をチロシンに置換したペプチドがより好ましい。
さらに好ましくは、配列番号：42,43,44,45,46,47,49,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159,160,161,15,16,21,22,23,24,25,26,27,30,195,197,198,199,200,201,177,178,179,183のいずれかに記載のアミノ酸配列の第2位のアミノ酸をチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンに置換し、及び／又はＣ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンに置換したアミノ酸配列からなり、かつHLA-A24抗原と結合してCTLにより認識されるペプチドが挙げられる。より好ましくは、配列番号：158,22,23,26,27,198,200,201,177,178,179,183のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して前記の置換を施し、かつHLA-A24抗原と結合してCTLにより認識されるペプチドが挙げられる。
また配列番号：32〜配列番号：41、配列番号：50〜配列番号：58、配列番号：79〜配列番号：88、配列番号：118〜配列番号：157、配列番号：166〜配列番号：175、配列番号：184〜配列番号：194に示されるようなHLA-A2結合性のペプチドの場合、そのアミノ酸配列の第２位のアミノ酸をロイシン、メチオニン、バリン、イソロイシンまたはグルタミンに置換し、及び／又はＣ末端のアミノ酸をバリンまたはロイシンに置換したアミノ酸配列を含有し、かつHLA-A2抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドが好ましい。
本発明のペプチドには、さらに、前記本発明の腫瘍抗原ペプチドを含有するエピトープペプチドも含まれる。
近年、複数のCTLエピトープ（抗原ペプチド）を連結したペプチド（エピトープペプチド）が、効率的にCTL誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1998, 161: 3186-3194には、腫瘍抗原タンパク質PSA由来のHLA-A2, -A3, -A11, B53拘束性CTLエピトープを連結した約30merのペプチドが、イン・ビボでそれぞれのCTLエピトープに特異的なCTLを誘導したことが記載されている。
またCTLエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたペプチド（エピトープペプチド）により、効率的にCTLが誘導されることも示されている。ここでヘルパーエピトープとはＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化させる作用を有するペプチドを指すものであり（Immunity., 1:751, 1994）、例えばＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが知られている。当該ヘルパーエピトープにより活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＣＴＬの分化の誘導や維持、およびマクロファージなどのエフェクター活性化などの作用を発揮するため、抗腫瘍免疫応答に重要であると考えられている。このようなヘルパーエピトープとCTLエピトープとを連列したペプチドの具体例として、例えばJournal of Immunology 1999, 162: 3915-3925には、HBV由来HLA-A2拘束性抗原ペプチド６種類、HLA-A11拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープより構成されるペプチドをコードするDNA（ミニジーン）が、イン・ビボでそれぞれのエピトープに対するCTLを効果的に誘導したことが記載されている。また実際に、CTLエピトープ（メラノーマ抗原gp100の第280位〜288位からなる腫瘍抗原ペプチド）とヘルパーエピトープ（破傷風毒素由来Tヘルパーエピトープ）とを連結したペプチドが臨床試験に供されている（Clinical Cancer Res., 2001,7:3012-3024）。
従って、前記本発明の腫瘍抗原ペプチドを含む複数のエピトープを連結したペプチド（エピトープペプチド）であって、CTL誘導活性を有するペプチドも、本発明のペプチドの具体例として例示することができる。
ここに、エピトープペプチドとは、(1)複数のCTLエピトープ（腫瘍抗原ペプチド）を連結したペプチド、若しくは(2)CTLエピトープとヘルパーエピトープとを連結したペプチドであって、抗原提示細胞内にてプロセッシングを受け、生じた腫瘍抗原ペプチドが抗原提示細胞に提示され、CTL誘導活性を導くペプチドとして定義される。
ここで、本発明のペプチドに連結させるエピトープがCTLエピトープの場合、用いるCTLエピトープとしては、配列番号：2に代表されるLengsin、配列番号：4に代表されるBJ-TSA-9、配列番号：6に代表されるC20orf42、配列番号：8に代表されるBUB1、配列番号：10に代表されるC10orf3、または配列番号：12に代表されるHIFPH3のアミノ酸配列由来のHLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37,-B55, -Cw0401, -Cw0602などに拘束性のCTLエピトープが挙げられる。また、他の腫瘍抗原タンパク質由来のCTLエピトープも挙げられる。これらCTLエピトープは複数個連結することが可能であり、１つのCTLエピトープの長さとしては、各種HLA分子に結合している抗原ペプチドの解析により（Immunogenetics，41:178，1995）、8〜14アミノ酸程度を挙げることができる。
また本発明のペプチドに連結させるエピトープがヘルパーエピトープの場合、用いるヘルパーエピトープとしては、前述のようなＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが挙げられる。また当該ヘルパーエピトープの長さとしては、13〜30アミノ酸程度、好ましくは13〜17アミノ酸程度を挙げることができる。
このような複数のエピトープを連結させたペプチド（エピトープペプチド）は、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またこれら複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のDNA合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より目的の複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドを回収することにより製造することができる。これらの手法は、前述のように文献(Molecular Cloning, T.Maniatis et al.,CSH Laboratory(1983)、DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS(1985))に記載の方法などに準じて行うことができる。
以上のようにして製造された複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドを、前述のin vitroアッセイや、WO 02/47474 号公報および Int J. Cancer:100,565-570 (2002)に記述のヒトモデル動物を用いたin vivoアッセイに供すること等によりCTL誘導活性を測定することができる。
さらに、前記本発明の腫瘍抗原ペプチドのＮ末端アミノ酸のアミノ基、またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾することも可能であり、このような修飾に係るペプチドも本発明のペプチドの範疇に含まれる。
ここでＮ末端アミノ酸のアミノ基の修飾基としては、例えば１〜３個の炭素数１から６のアルキル基、フェニル基、シクロアルキル基、アシル基が挙げられ、アシル基の具体例としては炭素数１から６のアルカノイル基、フェニル基で置換された炭素数１から６のアルカノイル基、炭素数５から７のシクロアルキル基で置換されたカルボニル基、炭素数１から６のアルキルスルホニル基、フェニルスルホニル基、炭素数２から６のアルコキシカルボニル基、フェニル基で置換されたアルコキシカルボニル基、炭素数５から７のシクロアルコキシで置換されたカルボニル基、フェノキシカルボニル基等が挙げられる。
C末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したペプチドとしては、例えばエステル体およびアミド体が挙げられ、エステル体の具体例としては、炭素数１から６のアルキルエステル、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキルエステル、炭素数５から７のシクロアルキルエステル等が挙げられ、アミド体の具体例としては、アミド、炭素数１から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子を含んで５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。
3)本発明の核酸
本発明の核酸とは、具体的には、
(1)Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
(2)本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
を指す。
(1)Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3をコードするポリヌクレオチド及びそれを含有する核酸
Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3をコードするポリヌクレオチドは、種々の細胞や組織、例えば前立腺癌等に由来する細胞や組織の cDNAやmRNA、cRNA、ゲノムDNA、または合成DNAのいずれであっても良い。また1本鎖、2本鎖のいずれの形態であっても良い。具体的には、
(a) 配列番号：1,3,5,7,9または11に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
(b) 配列番号：2,4,6,8,10または12に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
また前記（a）または(b)のポリヌクレオチドに類似の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、が例示される。
ここで配列番号：1に記載の塩基配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_016571として登録されているヒトLengsin遺伝子の塩基配列である。また配列番号：2に記載のアミノ酸配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_016571、Accession No. NP_057655として登録されているヒトLengsinのアミノ酸配列である。当該ヒトLengsin遺伝子は非特許文献７(Mol. Vis. Jun. 15;8:185-95 (2002))により公知である。
また配列番号：3に記載の塩基配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_032899として登録されているヒトBJ-TSA-9遺伝子の塩基配列である。また配列番号：4に記載のアミノ酸配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_032899、Accession No. NP_116288として登録されているヒトBJ-TSA-9のアミノ酸配列である。当該ヒトBJ-TSA-9遺伝子は非特許文献８(Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 99(26):16899-903 (2002))により公知である。
また配列番号：5に記載の塩基配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_017671として登録されているヒトC20orf42遺伝子の塩基配列である。また配列番号：6に記載のアミノ酸配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_017671、Accession No. NP_060141として登録されているヒトC20orf42のアミノ酸配列である。当該ヒトC20orf42遺伝子は非特許文献９(Biochim. Biophys. Acta 1637: 207-216 (2003))により公知である。
また配列番号：7に記載の塩基配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_004336として登録されているヒトBUB1遺伝子の塩基配列である。また配列番号：8に記載のアミノ酸配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_004336、Accession No. NP_004327として登録されているヒトBUB1のアミノ酸配列である。当該ヒトBUB1遺伝子は文献(Genomics 46:379-388(1997))により公知である。
また配列番号：9に記載の塩基配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_018131として登録されているヒトC10orf3遺伝子の塩基配列である。また配列番号：10に記載のアミノ酸配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_018131、Accession No. NP_060601として登録されているヒトC10orf3のアミノ酸配列である。当該ヒトC10orf3遺伝子は非特許文献１６(Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., Dec 24;99(26):16899-903 (2002))により公知である。
また配列番号：11に記載の塩基配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_022073として登録されているヒトHIFPH3遺伝子の塩基配列である。また配列番号：12に記載のアミノ酸配列は、GenBank データベースにおいて Accession No. NM_022073、Accession No. NP_071356として登録されているヒトHIFPH3のアミノ酸配列である。当該ヒトHIFPH3遺伝子は非特許文献１７(Cell 107: 43-54 (2001))により公知である。
前記において (a)配列番号：1,3,5,7,9,11に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、(b) 配列番号：2,4,6,8,10,12に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとは、より具体的には、配列番号：1,3,5,7,9,11に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号：2,4,6,8,10,12に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが例示される。さらに、当該配列番号：1,3,5,7,9,11に記載の塩基配列、または配列番号：2,4,6,8,10,12に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列の5'末端側及び/又は3'末端側に他の塩基配列の付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドが例示される。ここで「他の塩基配列」とは、例えばLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3、HIFPH3以外の構造遺伝子をコードする塩基配列であっても良い。
これらLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3をコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が、腫瘍抗原タンパク質としての活性を有すものであれば良い。当該活性およびその測定法については、前記 「1)本発明のタンパク質」において記載したとおりである。
配列番号：1に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、GenBank Accession No. NM_016571において開示されている塩基配列、あるいは本明細書の配列表の配列番号：1に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダイゼーションのプローブあるいはPCRのプライマーに用いて、例えば肺腺癌細胞株（例えば1-87）由来のcDNAライブラリーをスクリーニングすることなどによりクローニングすることができる。
配列番号：3に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、GenBank Accession No. NM_032899において開示されている塩基配列、あるいは本明細書の配列表の配列番号：3に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダイゼーションのプローブあるいはPCRのプライマーに用いて、例えば肺腺癌細胞株（例えば1-87）由来のcDNAライブラリーをスクリーニングすることなどによりクローニングすることができる。
配列番号：5に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、GenBank Accession No. NM_017671において開示されている塩基配列、あるいは本明細書の配列表の配列番号：5に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダイゼーションのプローブあるいはPCRのプライマーに用いて、例えば結腸癌細胞株（例えばSW480(ATCC Number:CCL-228))由来のcDNAライブラリーをスクリーニングすることなどによりクローニングすることができる。
配列番号：7に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、GenBank Accession No. NM_004336において開示されている塩基配列、あるいは本明細書の配列表の配列番号：7に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダイゼーションのプローブあるいはPCRのプライマーに用いて、例えば膵臓癌細胞株（例えばPUN)由来のcDNAライブラリーをスクリーニングすることなどによりクローニングすることができる。
配列番号：9に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、GenBank Accession No. NM_018131において開示されている塩基配列、あるいは本明細書の配列表の配列番号：9に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダイゼーションのプローブあるいはPCRのプライマーに用いて、例えば肺腺癌細胞株（例えば1-87)由来のcDNAライブラリーをスクリーニングすることなどによりクローニングすることができる。
配列番号：11に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、GenBank Accession No. NM_022073において開示されている塩基配列、あるいは本明細書の配列表の配列番号：11に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダイゼーションのプローブあるいはPCRのプライマーに用いて、例えば腎癌細胞株（例えばSMKTR-1)由来のcDNAライブラリーをスクリーニングすることなどによりクローニングすることができる。
該クローニングは、例えばMolecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。
また、前記（a）または(b)のポリヌクレオチドに類似の塩基配列を含有するポリヌクレオチドとは、具体的には、
(c) 前記(a)または(b)のポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、
(d) 前記(a)または(b)のポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、
(e) 前記(a)または(b)のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、
が挙げられる。
好ましくは、前記(a)または(b)のポリヌクレオチドに類似の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。前記(a)または(b)のポリヌクレオチドに類似の塩基配列からなるポリヌクレオチドとしては、以下の(c')〜(e')に挙げるポリヌクレオチドが挙げられる：
(c') 前記(a)または(b)のポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、
(d') 前記(a)または(b)のポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、
(e') 前記(a)または(b)のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド。
前記において「前記(a)または(b)のポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば前記(a)または(b)のポリヌクレオチドの塩基配列と約40％以上、好ましくは約60％以上、より好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の配列同一性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。具体的には、前記(a)または(b)のポリヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドなどが挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えばMolecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に記載の方法に従って行うことができる。また市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)や前記Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。
ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、6×SSC(20×SSCは、333mM Sodium citrate、333mM NaClを示す)、0.5%SDSおよび50% ホルムアミドを含む溶液中で42℃にてハイブリダイズさせる条件、または6×SSCを含む(50%ホルムアミドは含まない)溶液中で65℃にてハイブリダイズさせる条件などが挙げられる。
またハイブリダイゼーション後の洗浄の条件としては、「１×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。
前記において「前記(a)または(b)のポリヌクレオチドと70％以上の配列同一性を示す塩基配列を含有するポリヌクレオチド」とは、例えば前記(a)または(b)のポリヌクレオチドの塩基配列と約70％以上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の配列同一性を示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。具体的には、前記(a)または(b)のポリヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドなどが挙げられる。
ここで「配列同一性」とは、２つのポリヌクレオチド間の、配列の同一性及び相同性をいう。当該「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のポリヌクレオチドは、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994))を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
このような配列同一性を有するポリヌクレオチドは、前述のハイブリダイゼーション反応や通常のＰＣＲ反応により、または後述するポリヌクレオチドの改変（欠失、付加、置換）反応により作製することができる。
前記において「前記(a)または(b)のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、人為的に作製したいわゆる改変タンパク質や、生体内に存在するアレル変異体等のタンパク質をコードする核酸を意味する。
ここでタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、本発明タンパク質の活性が保持される限り制限はない。このように活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個欠失、置換及び／又は付加されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の10％以内であり、好ましくは全アミノ酸の5％以内である。また置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe及びTrpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及びGlnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Asp及びGluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またLys、Arg及びHisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
この改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に記載の種々の方法、例えば部位特異的変異誘発やPCR法等によって製造することができる。また市販のキットを用いて、Gapped duplex法やKunkel法などの公知の方法に従って製造することもできる。
以上のような本発明タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有する。ここで「腫瘍抗原タンパク質としての活性」とは、既存の腫瘍抗原タンパク質の活性測定法により活性を示すことを意味する。具体的には、例えば、本発明タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させた細胞がCTLにより認識される、すなわち当該細胞がCTLに反応性を示す、換言すれば本発明タンパク質若しくはそれに由来する抗原ペプチドがCTLを活性化する若しくはCTLを誘導するという性質を示す。当該活性およびその測定法については、前記 「1)本発明のタンパク質」において記載したとおりである。
前記本発明のポリヌクレオチドを含有する核酸は、1本鎖および2本鎖のいずれの形態もとることができる。またDNA、RNAのいずれの形態もとることができる。本発明のポリヌクレオチドが２本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、本発明のタンパク質を発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。すなわち本発明の核酸の範疇には、本発明の２本鎖型ポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して作製された組換え発現ベクターも含まれる。
ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、pUC118、pUC119、pBR322、pCR3等のプラスミドベクター、λZAPII、λgt11などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、pYES2、pYEUra3などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、pAcSGHisNT-Aなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、pCEP4、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV、pRc/CMVなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。
また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Hisタグ、あるいはGST（グルタチオンS-トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（lac、tac、trc、trp、CMV、SV40初期プロモーターなど）を有するGST融合タンパクベクター（pGEX4Tなど）や、Myc、Hisなどのタグ配列を有するベクター（pcDNA3.1/Myc-Hisなど）、さらにはチオレドキシンおよびHisタグとの融合タンパク質を発現するベクター（pET32a）などを用いることができる。
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。
ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、E.coli K-12系統のHB101株、C600株、JM109株、DH5α株、AD494(DE3)株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、L929細胞、BALB/c3T3細胞、C127細胞、CHO細胞、COS細胞、Vero細胞、Hela細胞、293-EBNA細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはsf9などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明タンパク質を製造することができる。得られたタンパク質は、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のタンパク質を、前述のチオレドキシンやHisタグ、GST等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
(2)本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド及びそれを含有する核酸
前述のように本発明の核酸の範疇には、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸も含まれる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、DNAの形態であってもRNAの形態であっても良い。また1本鎖、2本鎖のいずれの形態であっても良い。これら本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報およびそれによりコードされるDNAの配列情報に基づき容易に製造することができる。具体的には、通常のDNA合成やPCRによる増幅などによって、製造することができる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、具体的には、前記エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸は、1本鎖および2本鎖のいずれの形態もとることができる。またDNA、RNAのいずれの形態もとることができる。本発明のポリヌクレオチドが２本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、本発明のペプチド（エピトープペプチド）を発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。
ここで用いる発現ベクターや宿主細胞、宿主細胞の形質転換方法等については、前述の(1)と同様である。
4)本発明の抗原提示細胞
前記した本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれかと抗原提示能を有する細胞とをイン・ビトロで接触させることにより、抗原提示細胞を作製することができる。具体的には本発明は、腫瘍患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞と、本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれかとをイン・ビトロで接触させることを特徴とする抗原提示細胞の製造方法、および当該製造方法により製造される抗原提示細胞を提供するものである。
ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示することの可能なＨＬＡ抗原を細胞表面に発現する細胞であれば特に限定されないが、特に抗原提示能が高いとされる樹状細胞が好ましい。
また、前記抗原提示能を有する細胞から本発明の抗原提示細胞を調製するために添加される物質としては、本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれであっても良い。
本発明の抗原提示細胞は、腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明のタンパク質またはペプチドをイン・ビトロでパルスして、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させることにより得られる(Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998、Ｊ.Immunol.,158,p1796,1997、Cancer Res.,59,p1184,1999）。樹状細胞を用いる場合は、例えば、腫瘍患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をGM-CSFおよびIL-4存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のタンパク質またはペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明の核酸を導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該核酸は、DNAの形態であっても、RNAの形態であっても良い。具体的には、DNAの場合は Cancer Res.,56:p5672,1996や J.Immunol.,161: p5607,1998などを参考にして行うことができ、またRNAの場合は J.Exp.Med., 184: p465,1996などを参考にして行うことができる。
本発明の抗原提示細胞は、本発明のペプチドとHLA抗原との複合体の提示された抗原提示細胞であれば良く、具体的には、例えば配列番号：42,43,44,45,46,47,49,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159,160,161,15,16,21,22,23,24,25,26,27,30,195,197,198,199,200,201,177,178,179または183に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（好ましくは配列番号：158,22,23,26,27,198,200,201,177,178,179または183に記載のアミノ酸配列からなるペプチド）とHLA-A24抗原との複合体が樹状細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞を挙げることができる。当該抗原提示細胞は、例えばHLAの型がHLA-A24である前立腺癌患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に、配列番号：42,43,44,45,46,47,49,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159,160,161,15,16,21,22,23,24,25,26,27,30,195,197,198,199,200,201,177,178,179または183に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（好ましくは配列番号：158,22,23,26,27,198,200,201,177,178,179または183に記載のアミノ酸配列からなるペプチド）をイン・ビトロでパルスし、HLA-A24抗原と前記ペプチドとの複合体を提示させることにより得られる。
5)本発明のCTL
本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれかと末梢血リンパ球とをイン・ビトロで接触させることにより、CTLを誘導することができる。具体的には本発明は、腫瘍患者由来の末梢血リンパ球と、本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれかとをイン・ビトロで接触させることを特徴とするCTLの誘導方法、および当該方法により誘導されるCTLを提供するものである。
例えばメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養し、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159 、1994）。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をイン・ビトロで腫瘍抗原ペプチドTRP-2で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なCTLを増殖させ、該CTLをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J.Exp.Med.,185:453,1997 ）。これは、抗原提示細胞上のHLA抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するCTLを、イン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明のタンパク質、ペプチドまたは核酸を用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的CTLを増やした後、このCTLを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。
養子免疫療法において用いられるCTLは、患者の末梢血リンパ球を単離し、これを本発明のタンパク質、ペプチド、あるいは核酸でイン・ビトロで刺激することにより作製される(Journal of Experimental Medicine 1999, 190:1669)。
本発明のCTLは、本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれかと末梢血リンパ球とをイン・ビトロで接触させることにより誘導されたものであれば良く、単一のCTLクローンであっても、様々な種類のクローンからなるCTL混合物(集団)であっても良い。具体的には、例えば配列番号：42,43,44,45,46,47,49,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159,160,161,15,16,21,22,23,24,25,26,27,30,195,197,198,199,200,201,177,178,179または183に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとHLA-A24抗原との複合体を特異的に認識するCTLを挙げることができる。より好ましくは、配列番号：158,22,23,26,27,198,200,201,177,178,179または183に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとHLA-A24抗原との複合体を特異的に認識するCTLを挙げることができる。
6)本発明の医薬組成物
以上に記載した本発明のタンパク質、ペプチド、核酸、抗原提示細胞およびCTLは、それぞれの物質に応じた適切な形態とすることにより、医薬組成物の有効成分とすることができる。本発明の医薬組成物は、CTLの誘導剤、すなわち癌ワクチンの有効成分として使用することができる。以下具体的に説明する。
(1)本発明タンパク質を有効成分とするCTLの誘導剤
本発明のタンパク質(Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3、HIFPH3)はCTLの誘導作用を有するため、腫瘍の治療または予防のための医薬（癌ワクチン）の有効成分とすることができる。すなわち本発明のタンパク質を有効成分として含有するCTLの誘導剤は、腫瘍を治療または予防し得るものである。当該タンパク質を腫瘍患者に投与すると、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた腫瘍抗原ペプチドがHLA抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に提示され、この複合体に特異的なCTLが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療又は予防が達成される。
本発明のタンパク質を有効成分とするCTLの誘導剤は、Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3陽性の如何なる腫瘍患者に対しても使用することができる。
具体的には、例えばLengsinを有効成分とするCTLの誘導剤は、肺腺癌、肺扁平上皮癌または胃癌などの癌（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。
またBJ-TSA-9を有効成分とするCTLの誘導剤は、白血病、肺腺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌、口腔癌、胃癌、膵臓癌またはリンパ腫などの癌（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。
またC20orf42を有効成分とするCTLの誘導剤は、肺扁平上皮癌、肺腺癌、肝臓癌、胃癌、白血病、悪性リンパ腫組織、直腸癌、結腸癌または膵臓癌などの癌（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。
またBUB1を有効成分とするCTLの誘導剤は、乳癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、口腔扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫またはメラノーマなどの癌（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。
またC10orf3を有効成分とするCTLの誘導剤は、乳癌、結腸癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌、小細胞肺癌またはメラノーマなどの癌（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。
またHIFPH3を有効成分とするCTLの誘導剤は、乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌、肺腺癌または肺扁平上皮癌などの癌（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。
本発明のタンパク質を有効成分として含有するCTLの誘導剤は、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントと混合して投与、又は併用して投与することができる。
アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev., 7:277-289, 1994)に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分又はその誘導体、サイトカイン、植物由来成分又はその誘導体、海洋生物由来成分又はその誘導体、水酸化アルミニウムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、または油乳濁液（エマルション製剤）などを挙げることができる。また、リポソーム製剤、直径数μm のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤、マイクロスフェアー製剤、マイクロカプセル製剤なども考えられる。
前記において菌体由来成分又はその誘導体とは、具体的には、例えば(1)細菌の死菌、(2)細菌由来の細胞壁骨格（Cell Wall Skeleton, CWSと略する）、(3)菌体由来の特定の成分又はその誘導体等に分類される。ここで(1)細菌の死菌としては、例えば溶連菌粉末（例えばピシバニール；中外製薬株式会社）、死菌浮遊物カクテル（例えばブロンカスマ・ベルナ；三和化学研究所）、あるいはヒト型結核菌の死菌等が挙げられる。
(2)細菌由来のCWSとしては、マイクバクテリア属由来のCWS（例えばマイコバクテリア属ウシ型結核菌であるBCG株のCWS）、ノカルディア属由来のCWS（例えばノカルディア・ノブラのCWS）、あるいはコリネバクテリア属由来のCWS等が挙げられる。
(3)菌体由来の特定の成分又はその誘導体としては、例えば菌体由来多糖類であるヒト型結核菌由来多糖類成分（例えばアンサー；ゼリア新薬工業株式会社）や担子菌由来多糖類（例えばレンチナン；味の素、クレスチン；三共株式会社、担子菌カワラタケ）、またムラミルジペプチド（MDP）関連化合物、リポ多糖（LPS）、リピドＡ関連化合物（MPL）、糖脂質トレハロースジマイコレート（TDM）、細菌由来のDNA（例えばCpGオリゴヌクレオチド）、あるいはこれらの誘導体などが挙げられる。
これら菌体由来成分及びその誘導体は、既に市販されているものであればそれを入手するか、又は公知文献（例えばCancer Res.,33,2187-2195(1973)、J.Natl.Cancer Inst.,48,831-835(1972)、J.Bacteriol.,94,1736-1745(1967)、Gann,69,619-626(1978)、J.Bacteriol.,92,869-879(1966)、J.Natl.Cancer Inst.,52,95-101(1974)）等に基づき単離又は製造することが可能である。
前記において「サイトカイン」とは、例えばIFN-α、IL-12、GM-CSF、IL-2、IFN-γ、IL-18、あるいはIL-15などが挙げられる。これらのサイトカインは、天然品であっても遺伝子組換え品であっても良い。これらのサイトカインは、既に市販されていればそれを入手して使用することができる。また遺伝子組換え品であれば、例えばGenBank、EMBL、あるいはDDBJ等のデータベースにおいて登録されている各塩基配列に基き、常法により所望の遺伝子をクローニングし、適当な発現ベクターに連結して作製された組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、発現・生産することができる。
前記において「植物由来成分又はその誘導体」とは、例えばサポニン由来成分であるQuil A（Accurate Chemical&Scientific Corp）、 QS-21（Aquila Biopharmaceuticals inc.）、あるいはグリチルリチン（SIGMA-ALDRICHなど）などが挙げられる。
前記において「海洋生物由来成分又はその誘導体」とは、例えば海綿由来の糖脂質であるα-ガラクトシルセラミドなどが挙げられる。
前記において油乳濁液（エマルション製剤）とは、例えば油中水型（w/o）エマルション製剤、水中油型（o/w）エマルション製剤、水中油中水型（w/o/w）エマルション製剤などが挙げられる。
ここで油中水型（w/o）エマルション製剤は、有効成分を水の分散相に分散させた形態をとる。水中油型（o/w）エマルション製剤は、有効成分を水の分散媒に分散させた形態をとる。また水中油中水型（w/o/w）エマルション製剤は、有効成分を最内相の水の分散相に分散させた形態をとる。このようなエマルション製剤の調製は、例えば、特開平８−９８５号公報、特開平９−１２２４７６号公報等を参考にして行うことができる。
前記においてリポソーム製剤とは、有効成分を脂質二重膜構造のリポソームで水相内または膜内に包み込んだ形の微粒子である。リポソームを作るための主要な脂質としては、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン等が挙げられ、これにジセチルホスフェート、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン等を加えてリポソームに荷電を与えて安定化させる。リポソームの調製方法としては、超音波法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、フレンチプレスエクストラクション法等が挙げられる。
前記においてマイクロスフェアー製剤は、均質な高分子マトリックスから構成され、該マトリックス中に有効成分が分散された形の微粒子である。マトリックスの材料としては、アルブミン、ゼラチン、キチン、キトサン、デンプン、ポリ乳酸、ポリアルキルシアノアクリレート等の生分解性高分子が挙げられる。マイクロスフェアー製剤の調製方法としては公知の方法（Eur. J. Pharm. Biopharm. 50:129-146, 2000、Dev. Biol. Stand. 92:63-78, 1998、Pharm. Biotechnol. 10:1-43, 1997）等に従えばよく特に限定されない。
前記においてマイクロカプセル製剤は、有効成分を芯物質として被膜物質で覆った形の微粒子である。被膜物質に用いられるコーティング材料としては、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、エチルセルロース、ゼラチン、ゼラチン・アラビアゴム、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース等の膜形成性高分子が挙げられる。マイクロカプセル製剤の調製方法は、コアセルベーション法、界面重合法等が挙げられる。
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明のタンパク質の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは 0.001mg〜100mg、より好ましくは0.01mg〜10mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
(2)本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤
本発明のペプチドはCTL誘導活性を有する。誘導されたCTLは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍作用を発揮することができる。従って本発明のペプチドは、腫瘍の治療または予防のための医薬(癌ワクチン)の有効成分とすることができる。本発明のペプチドを有効成分として含有するCTLの誘導剤を腫瘍患者に投与すると、抗原提示細胞のHLA抗原に本発明のペプチドが提示され、提示されたHLA抗原とペプチドとの結合複合体特異的CTLが増殖して腫瘍細胞を破壊することができ、従って、患者の腫瘍を治療又は予防することができる。
本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤は、本発明タンパク質陽性の如何なる腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前記6)-(1)に示した癌（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。
本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤は、単一のCTLエピトープ（本発明のペプチド）を有効成分とするものであっても、また他のペプチド（CTLエピトープやヘルパーエピトープ）と連結したエピトープペプチドを有効成分とするものであっても良い。近年、複数のCTLエピトープ（抗原ペプチド）を連結したエピトープペプチドが、イン・ビボで効率的にCTL誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1998, 161: 3186-3194には、腫瘍抗原タンパク質PSA由来のHLA-A2, -A3, -A11, B53拘束性CTLエピトープ（抗原ペプチド）を連結した約30merのエピトープペプチドが、イン・ビボでそれぞれのCTLエピトープに特異的なCTLを誘導したことが記載されている。またCTLエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドにより、効率的にCTLが誘導されることも示されている。このようなエピトープペプチドの形態で投与した場合、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドがHLA抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なCTLが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。このようにして腫瘍の治療または予防が達成される。
本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤として、より具体的には、例えば配列番号：13〜配列番号：201のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤が挙げられる。好ましくは配列番号：42,43,44,45,46,47,49,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159,160,161,15,16,21,22,23,24,25,26,27,30,195,197,198,199,200,201,177,178,179または183に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤が挙げられる。より好ましくは、配列番号：158,22,23,26,27,198,200,201,177,178,179または183に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤が挙げられる。
本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤は、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントと混合して投与、又は併用して投与することができる。
アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev., 7:277-289, 1994)に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分又はその誘導体、サイトカイン、植物由来成分又はその誘導体、海洋生物由来成分又はその誘導体、水酸化アルミニウムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、または油乳濁液（エマルション製剤）などを挙げることができる。また、リポソーム製剤、直径数μm のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤、マイクロスフェアー製剤、マイクロカプセル製剤なども考えられる。これらアジュバントの具体例については、前記「6)-(1)本発明タンパク質を有効成分とするCTLの誘導剤」の項を参照されたい。
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは 0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg 〜10mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
(3)本発明の核酸を有効成分とするCTLの誘導剤
本発明の核酸はCTLの誘導作用を有するため、腫瘍の治療または予防のための医薬(癌ワクチン)の有効成分とすることができる。本発明の核酸を有効成分として含有するCTLの誘導剤は、例えば、本発明の核酸を腫瘍患者に投与し発現させることで、腫瘍を治療または予防し得るものである。
例えば発現ベクターに組み込まれた本発明の核酸を以下の方法により腫瘍患者に投与すると、抗原提示細胞内で腫瘍抗原タンパク質が高発現する。その後、細胞内分解を受けて生じた腫瘍抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示されることにより、腫瘍特異的ＣＴＬが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療または予防が達成される。
本発明の核酸を有効成分とするCTLの誘導剤は、本発明タンパク質陽性の如何なる腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前記6)-(1)に示した癌（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。
本発明の核酸を投与し細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
本発明の核酸を実際に医薬として作用させるには、当該核酸を直接体内に導入する in vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外で核酸を該細胞に導入しその細胞を体内に戻す ex vivo法がある（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等）。in vivo法がより好ましい。
in vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明の核酸を含有する注射剤等とされ、必要に応じて、医薬上許容されるキャリアー（担体）を加えてもよい。また、本発明の核酸を含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（HJV)-リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中の本発明の核酸の含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、核酸中のポリヌクレオチドの含量として、0.0001mg〜100mg、好ましくは0.001mg〜10mgの本発明の核酸を、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
また近年、複数のCTLエピトープ（腫瘍抗原ペプチド）を連結したエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはCTLエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが、in vivoで効率的にCTL誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1999, 162: 3915-3925には、HBV由来HLA-A2拘束性抗原ペプチド６種類、HLA-A11拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープを連結したエピトープペプチドをコードするDNA（ミニジーン）が、イン・ビボでそれぞれのエピトープに対するCTLを効果的に誘導したことが記載されている。
従って、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを１種または２種以上連結させることにより、また場合によっては他のペプチドをコードするポリヌクレオチドも連結させることにより作製されたポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込むことにより、CTLの誘導剤の有効成分とすることができる。このようなCTLの誘導剤も、前記と同様の投与方法および投与形態をとることができる。
(4)本発明の抗原提示細胞を有効成分とするCTLの誘導剤
本発明の抗原提示細胞はCTLの誘導作用を有するため、腫瘍の治療または予防のための医薬(癌ワクチン)の有効成分とすることができる。本発明の抗原提示細胞を有効成分として含有するCTLの誘導剤は、本発明の抗原提示細胞を腫瘍患者に投与することで、腫瘍を治療または予防し得るものである。
本発明の抗原提示細胞を有効成分とするCTLの誘導剤は、本発明タンパク質陽性の如何なる腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前記6)-(1)に示した癌（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。
抗原提示細胞を有効成分として含有するCTLの誘導剤は、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量は、前記文献記載の投与量が例示される。このような抗原提示細胞を有効成分として含有してなるCTLの誘導剤を患者の体内に戻すことにより、本発明タンパク質陽性の患者の体内で効率良く特異的なCTLが誘導され、腫瘍を治療することができる。
(5)本発明のCTLを有効成分とする癌ワクチン
本発明のCTLは腫瘍細胞傷害作用を有するため、腫瘍の治療または予防のための医薬(癌ワクチン)の有効成分とすることができる。
本発明のCTLを有効成分とする腫瘍の治療または予防薬は、本発明タンパク質陽性の如何なる腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前記6)-(1)に示した癌（腫瘍）の予防または治療のために使用することができる。
CTLを有効成分として含有する腫瘍の治療または予防薬は、CTLを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。このようなCTLを有効成分として含有してなる腫瘍の治療または予防剤を患者の体内に戻すことにより、本発明タンパク質陽性の患者の体内でCTLによる腫瘍細胞の傷害作用が促進され、腫瘍細胞を破壊することにより、腫瘍を治療することができる。
7)本発明のペプチドに対する抗体
本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、本発明のペプチドを免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またモノクローナル抗体であっても良い。
本発明の抗体は前記のように本発明のペプチドに特異的に結合するものであれば特に制限されないが、具体的には、配列番号：13〜201のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体が挙げられる。好ましくは、配列番号：42,43,44,45,46,47,49,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159,160,161,15,16,21,22,23,24,25,26,27,30,195,197,198,199,200,201,177,178,179または183に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体が挙げられる。より好ましくは、配列番号：158,22,23,26,27,198,200,201,177,178,179または183に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体が挙げられる。
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13、Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York 1989）。
具体的には、本発明のペプチド（例えば配列番号：42,43,44,45,46,47,49,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159,160,161,15,16,21,22,23,24,25,26,27,30,195,197,198,199,200,201,177,178,179または183のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド）を免疫原として用い、家兎等の非ヒト動物を免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、本発明のペプチド（例えば配列番号：42,43,44,45,46,47,49,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159,160,161,15,16,21,22,23,24,25,26,27,30,195,197,198,199,200,201,177,178,179または183のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチド）をマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
本発明のペプチドに対する抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
以上のように本発明のペプチドを用いて常法により適宜動物を免疫することにより、ペプチドを認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられる。免疫学的診断は、イムノブロット法、放射免疫測定法（RIA）、酵素免疫測定法（ELISA）、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学的診断は、本発明タンパク質をコードする遺伝子が発現している癌の診断において有効である。
8)本発明のHLAモノマー、HLAダイマー、HLAテトラマーおよびHLAペンタマー
本発明はまた、本発明の腫瘍抗原ペプチドとHLA抗原とを含有するHLAモノマー、HLAダイマー、HLAテトラマーまたはHLAペンタマーを提供する。
癌免疫療法において、治療前に腫瘍抗原（腫瘍抗原ペプチド）に対するCTL前駆細胞の頻度や量を予め調べることや、腫瘍抗原（腫瘍抗原ペプチド）による治療実施中の患者におけるCTLの頻度や量を調べることは、当該腫瘍抗原（腫瘍抗原ペプチド）に対する応答性が高い患者の選択や、治療効果のモニタリング、治療の適合性の判定などにおいて重要な指標となる。腫瘍抗原ペプチドとHLA抗原とを含有するHLAモノマー、HLAダイマー、HLAテトラマーおよびHLAペンタマーは、抗原（抗原ペプチド）特異的CTLの検出、すなわち当該CTLの頻度や量を測定するための試薬として有用である。
ここでHLAテトラマーとは、HLA抗原のα鎖とβ2ミクログロブリンをペプチド（抗原ペプチド）と会合させた複合体（HLAモノマー）をビオチン化し、アビジンに結合させることにより４量体化したものを指す（Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996))。
HLAモノマーとは前記HLAテトラマーの製造において用いられる、HLA抗原α鎖、β2ミクログロブリン、抗原ペプチドの会合体をビオチン化したもの（単量体)を指す。
HLAダイマーとはHLA抗原α鎖とIg（イムノグロブリン、例えばIgG1)とを融合させ、これにβ2ミクログロブリン、抗原ペプチドを結合させたものを指す(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6671-6675(1993))。HLAダイマーに結合した抗原ペプチド特異的CTLは、例えば標識抗IgG1抗体をIgG1に結合させることなどにより、検出することができる。
HLAペンタマーとは近年開発された技術であり、HLA抗原と抗原ペプチドとの複合体5分子がCoiled-Coilドメインを介して重合した５量体を指す。HLA抗原−抗原ペプチドの複合体を蛍光色素等で標識することができるため、HLAテトラマー法と同様にフローサイトメーター等で解析することができる（http://www.proimmune.co.uk/参照）。
以上に述べたHLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーはいずれも受託合成可能であり、例えばProImmune社やBD Biosciences社などに委託することにより合成することができる。また現在では種々の抗原ペプチドを含有するHLAテトラマーなども市販されている（(株)医学生物学研究所等）。
本発明のHLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーとして具体的には、例えば配列番号：42,43,44,45,46,47,49,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,158,159,160,161,15,16,21,22,23,24,25,26,27,30,195,197,198,199,200,201,177,178,179または183に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとHLA-A24抗原とを含有するHLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーが挙げられる。好ましくは配列番号：158,22,23,26,27,198,200,201,177,178,179または183に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとHLA-A24抗原とを含有するHLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーが挙げられる。このうちCTLの検出においてはHLAテトラマーまたはHLAペンタマーを用いることが好ましい。
HLAモノマー、HLAテトラマーおよびHLAペンタマーは、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡等の公知の検出手段により結合したCTLを容易に選別または検出することが出来るように蛍光標識されていることが好ましい。具体的には、例えばフィコエリスリン（PE）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ペリジニンクロロフィルプロテイン（PerCP）、アロフィコシアニン(APC)などにより標識されたHLAモノマー、HLAテトラマーおよびHLAペンタマーが挙げられる。
本発明のHLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーの成分であるHLA抗原のうち、HLA-A24抗原（HLA-A24抗原のα鎖）は、Genbank Accession No.M64740 に開示されているHLA-A2402の公知の塩基配列の情報等に基づき、PCR法等の常法により容易にクローニングすることができる。またHLA-A2抗原（HLA-A2抗原のα鎖）は、GenBank Acc.No.M84379に開示されているHLA-A0201遺伝子の公知の塩基配列の情報等に基づき、PCR法等の常法により容易にクローニングすることができる。
本発明のHLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーの成分であるβ2ミクログロブリンは、ヒト由来のβ2ミクログロブリンが好ましい。当該ヒトβ２ミクログロブリンは GenBank Acc.No.AB021288 に開示されているヒトβ2ミクログロブリンの公知の塩基配列情報に基づき、PCR法等の常法により容易にクローニングすることができる。
HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマー作製法については、前記各文献により周知であるが、具体的にHLA-A24を用いたHLAテトラマーの作製法につき簡単に述べると以下のようになる。
まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、HLA-A24α鎖発現ベクターおよびβ2ミクログロブリン発現ベクターを導入し発現させる。ここでは大腸菌（例えばBL21）を用いることが好ましい。得られた単量体HLA-A24複合体と本発明ペプチドとを混合し、可溶性のHLA-ペプチド複合体を形成させる。次にHLA-ペプチド複合体におけるHLA-A24α鎖のC末端部位の配列をBirA酵素によりビオチン化する。このビオチン化されたHLA-ペプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを4：1のモル比で混合することにより、HLAテトラマーを調製することができる。なお、前記各ステップにおいて、ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。
前記で本発明のHLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマーは、本発明タンパク質由来の腫瘍抗原ペプチド特異的なCTLの検出用試薬として有効に用いられる。
本発明のCTL検出用試薬は、例えば以下の目的に使用することができる：
1)本発明のタンパク質、ペプチドまたは核酸による治療開始前に、本発明の腫瘍抗原ペプチドに対するCTL前駆細胞の頻度や量を調べる。これにより、当該腫瘍抗原ペプチドに対する患者の応答性を判断することができる。
2) 本発明のタンパク質、ペプチドまたは核酸による治療実施中の患者におけるCTLの頻度や量を調べる。これにより治療効果のモニタリング、治療の適合性の判定、治療が順調に進んでいることの確認などを行うことができる。
CTLの検出法としては、具体的には、被験患者よりCTLを含む生体試料（例えばPBMC)を単離し、本発明のHLAテトラマー等と前記生体試料とを接触させ、HLAテトラマー等に結合した本発明ペプチド特異的なCTLの存在頻度または量を、フローサイトメーター等で測定する。
9)本発明の疾患マーカー
本発明はまた、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子、あるいはこれらの発現産物を利用した、癌(腫瘍)の疾患マーカーを提供する。
前記のように本発明は、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子およびHIFPH3遺伝子が、正常組織における発現量および／または発現頻度に比して、癌組織における発現量および／または発現頻度が有意に上昇していることを見出した。従って、これらの遺伝子、またはその発現産物（タンパク質）を認識する抗体は、これらの遺伝子が発現している癌に対する疾患マーカーとして有効に利用することができる。
以下、これらLengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子のポリヌクレオチド、並びにこれらの発現産物(タンパク質)を認識する抗体の、疾患マーカーとしての用途を説明する。
(1)癌疾患の疾患マーカーおよびその応用
(1-1) ポリヌクレオチド
前述のように、ヒト由来のLengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子、HIFPH3遺伝子は公知の遺伝子である。
本発明は前述するように、癌疾患に罹患した患者の組織においては、正常な組織に比して、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子、HIFPH3遺伝子の発現量および／または発現頻度が特異的に増大するという知見を発端に、これら遺伝子の発現の有無や発現の程度を検出することによって、上記癌疾患の罹患の有無、罹患の程度、回復の程度などが特異的に検出でき、該疾患の診断を正確に行うことができるという発想に基づくものである。
すなわち本発明は、被験者における上記遺伝子の発現の有無またはその程度を検出することによって、被験者について癌疾患の罹患の有無又は罹患の程度を診断することのできるツール（疾患マーカー）として有用なポリヌクレオチドを提供するものである。
ここで「ポリヌクレオチド」とは、RNAおよびDNAのいずれをも包含するものであり、1本鎖、2本鎖のいずれの形態であっても良い。ここで「DNA」には、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAのいずれもが含まれる。また「RNA」には、total RNA、mRNAおよび合成のRNAのいずれもが含まれる。
本発明の疾患マーカーは、前記Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなることを特徴とするものである。
具体的には、本発明の疾患マーカーは、配列番号1に記載のLengsin遺伝子の塩基配列、配列番号3に記載のBJ-TSA-9遺伝子の塩基配列、配列番号5に記載のC20orf42遺伝子の塩基配列、配列番号7に記載のBUB1遺伝子の塩基配列、配列番号9に記載のC10orf3遺伝子の塩基配列、または配列番号11に記載のHIFPH3遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなるものを挙げることができる。
ここで相補的なポリヌクレオチド(相補鎖、逆鎖)とは、上記各配列番号に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した15塩基長の塩基配列を有するその部分配列(ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう)に対して、A : TおよびG : Cといった塩基対関係に基づき、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイスすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に示されるように、複合体或いはプローブと結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えば、ハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件としては「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
また、正鎖側のポリヌクレオチドには、前記Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の塩基配列、またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
上記正鎖のポリヌクレオチドおよび相補鎖(逆鎖)のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されてもよい。
本発明の癌疾患の疾患マーカーは、具体的にはLengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の塩基配列(全長配列)からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。またLengsin遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチド、BJ-TSA-9遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチド、C20orf42遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチド、BUB1遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチド、C10orf3遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチド、またはHIFPH3遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に(特異的に)認識するものであれば、上記全長配列もしくはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、部分配列としては、上記全長配列もしくはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも15個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
なお、ここで「選択的に(特異的に)認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子、HIFPH3遺伝子またはこれらの遺伝子に由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またRT-PCR法においては、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子、HIFPH3遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それらに限定されず、当業者が上記検出物または生成物がこれらの遺伝子に由来するものであると判断できるものであればよい。
本発明疾患マーカーは、例えば配列番号:1に記載のLengsin遺伝子の塩基配列、配列番号:3に記載のBJ-TSA-9遺伝子の塩基配列、配列番号:5に記載のC20orf42遺伝子の塩基配列、配列番号:7に記載のBUB1遺伝子の塩基配列、配列番号:9に記載のC10orf3遺伝子の塩基配列、または配列番号:11に記載のHIFPH3遺伝子の塩基配列をもとに、例えばprimer 3 (http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)あるいはベクターNTI(Infomax社製)を利用して設計することができる。具体的には前記Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の塩基配列をprimer 3またはベクターNTIのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、もしくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。
本発明で用いる疾患マーカーは、上述するように連続する少なくとも15塩基の長さを有するものであればよく、具体的にはマーカーの用途に応じて、その長さを適宜選択し設定することができる。
(1-2)プローブまたはプライマーとしてのポリヌクレオチド
本発明において癌疾患の検出（診断）は、被験者の生体組織における、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子およびHIFPH3遺伝子の少なくとも1つの発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することによって行われる。この場合、上記本発明の疾患マーカーは、上記各遺伝子の発現によって生じたRNAまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、または該RNAまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
上記疾患マーカーを癌疾患の検出(遺伝子診断)においてプライマーとして用いる場合には、通常15bp-100bp、好ましくは15bp-50bp、より好ましくは15bp-35bpの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常15bp-全配列の塩基数、好ましくは15bp-1kb、より好ましくは100bp-1kbの塩基長を有するものが例示できる。
本発明疾患マーカーは、ノーザンブロット法、RT-PCR法、in situハイブリダーゼーション法などの、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができる。これによって癌疾患に関連する、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の発現の有無または発現レベル(発現量)を評価することができる。
なお、測定対象とする試料は、例えば、被験者の対象組織の一部をバイオプシなどで採取し、そこから常法に従って調製したtotal RNAであってもよいし、該RNAをもとにして調製される各種のポリヌクレオチドであってもよい。
また、生体組織における、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の発現レベルは、DNAチップを利用して検出あるいは定量することができる。この場合、本発明疾患マーカーは当該DNAチップのプローブとして使用することができる(例えば、Affymetrix社のGene Chip Human Genome U95 A,B,C,D,Eの場合、25bpの長さのポリヌクレオチドプローブとして用いられる)。本発明の疾患マーカーをプローブとするDNAチップを、生体組織から採取したRNAをもとに調製される標識DNAまたはRNAとハイブリダイズさせることにより、本発明疾患マーカー（プローブ）と標識DNAまたはRNAとの複合体が形成される。該複合体を、該標識DNAまたはRNAの標識を指標として検出することにより、、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の発現の有無または発現レベル(発現量)が評価できる。
上記DNAチップは、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子と結合し得る1種または2種以上の本発明疾患マーカーを含んでいればよい。複数の疾患マーカーを含むDNAチップの利用によれば、ひとつの生体試料について、同時に複数の遺伝子の発現の有無または発現レベルの評価が可能である。
本発明の疾患マーカーは、癌疾患の診断、検出(罹患の有無、罹患の程度の診断)に有用である。具体的には、該疾患マーカーを利用した癌疾患の診断は、被験者の生体組織と正常者の生体組織における、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の遺伝子発現レベルの違いを判定することによって行うことができる。
この場合、遺伝子発現レベルの違いには、発現のある／なしの違いだけでなく、被験者の生体組織と正常者の生体組織の両者ともに発現がある場合でも、両者間の発現量の格差が1.5倍以上、好ましくは2倍以上、更に好ましくは3倍以上の場合が含まれる。
Lengsin遺伝子由来のポリヌクレオチドは特に、肺腺癌、肺扁平上皮癌または胃癌に対する疾患マーカーとして有用である。
BJ-TSA-9遺伝子由来のポリヌクレオチドは特に、白血病、肺腺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌、口腔癌、胃癌、膵臓癌またはリンパ腫に対する疾患マーカーとして有用である。
C20orf42遺伝子由来のポリヌクレオチドは特に、肺扁平上皮癌、肺腺癌、肝臓癌、胃癌、白血病、悪性リンパ腫組織、直腸癌、結腸癌または膵臓癌に対する疾患マーカーとして有用である。
BUB1遺伝子由来のポリヌクレオチドは特に、乳癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、口腔扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫またはメラノーマに対する疾患マーカーとして有用である。
C10orf3遺伝子由来のポリヌクレオチドは特に、乳癌、結腸癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌、小細胞肺癌またはメラノーマに対する疾患マーカーとして有用である。
HIFPH3遺伝子由来のポリヌクレオチドは特に、乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌、肺腺癌または肺扁平上皮癌に対する疾患マーカーとして有用である。
(1-3) 抗体
本発明は、癌疾患の疾患マーカーとしての、Lengsin遺伝子の発現産物(Lengsin)、BJ-TSA-9遺伝子の発現産物(BJ-TSA-9)、C20orf42遺伝子の発現産物(C20orf42)、BUB1遺伝子の発現産物(BUB1)、C10orf3遺伝子の発現産物(C10orf3)、またはHIFPH3遺伝子の発現産物(HIFPH3)を特異的に認識することができる抗体を提供する。
当該抗体として、具体的には、配列番号:2に記載のアミノ酸配列を有するLengsinタンパク質、配列番号:4に記載のアミノ酸配列を有するBJ-TSA-9タンパク質、配列番号:6に記載のアミノ酸配列を有するC20orf42タンパク質、配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するBUB1タンパク質、配列番号:10に記載のアミノ酸配列を有するC10orf3タンパク質、または配列番号:12に記載のアミノ酸配列を有するHIFPH3タンパク質を特異的に認識することのできる抗体を挙げることができる。
本発明は、前述するように、癌疾患の患者の癌組織において、正常な細胞や組織に比して、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子およびHIFPH3遺伝子が特異的に発現量および／または発現頻度が上昇しているという知見を発端に、これらのタンパク発現の有無や発現の程度を検出することによって上記癌疾患の罹患の有無や罹患の程度が特異的に検出でき、該疾患の診断を正確に行うことができるという発想に基づくものである。
上記抗体は、従って、被験者における上記タンパク質の発現の有無またはその程度を検出することによって、該被験者が癌疾患に罹患しているか否か、またはその疾患の程度を診断することのできるツール（疾患マーカー）として有用である。
前述のようにヒト由来のLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3およびHIFPH3は公知のタンパク質である。
本発明の抗体は、その形態に特に制限はなくLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよく、更には当該タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、更に好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明抗体も、これらの常法に従って製造することができる(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12-11.13)。具体的には、ポリクローナル抗体は、常法に従って大腸菌などで発現し精製したLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3タンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎などの非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体は、常法に従って大腸菌などで発現し精製したLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウスなどの非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4-11.11)。
抗体の作製に免疫抗原として使用されるLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3タンパク質は、本発明により提供される配列番号：1,3,5,7,9,11のいずれかの遺伝子配列情報に基づいて、DNAクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、文献記載の方法(Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985))などに準じて行うことができる。
具体的には、Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA(発現ベクター)を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。また、これらのLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3の部分ペプチドは、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号：2,4,6,8,10,12）に従って、一般的な化学合成法(ペプチド合成)によって製造することもできる。
なお、本発明のLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3には、配列番号：2,4,6,8,10,12のいずれかに示す各アミノ酸配列に関わるタンパク質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列において、1もしくは複数(通常数個)のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、それぞれのタンパク質の公知の機能と同等の免疫学的活性を有するタンパク質を挙げることができる。
ここで、同等の免疫学的活性を有するタンパク質としては、適当な動物あるいはその細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3に対する抗体と特異的に結合する能力を有するタンパク質を挙げることができる。
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数および変異部位は、その免疫学的活性が保持される限り制限はない。免疫学的活性を消失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の10％以内であり、好ましくは全アミノ酸の5％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の1％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質が、Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3と同等の免疫学的活性を保持している限り、特に制限されない。この置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、アミノ酸の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、両親媒性などにおいて置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、PheおよびTrpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、AsnおよびGlnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、AspおよびGluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またLys、ArgおよびHisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
本発明の抗体は、また、Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってもよい。かかる抗体誘導のために用いられるオリゴペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、各々対応する上記タンパク質と同様の免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3のアミノ酸配列において、少なくとも連続する8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるオリゴペプチドを例示することができる。
かかるオリゴペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールのような表面活性物質、BCG(カルメット−ゲラン桿菌)やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。
また、既に市販されている抗体である、抗Bub1抗体（Upstate社）、抗C10orf3抗体（Abnova社）、抗C20orf42抗体（Imgenex社）、抗HIFPH3抗体（Bethyl社）などを、本発明の抗体として用いることもできる。
本発明抗体は、Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3に特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、被験者の組織内に発現した上記タンパク質(その相同物を含む)を特異的に検出することができる。すなわち、当該抗体は被験者の組織内におけるLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3の発現の有無およびその発現の程度を検出するためのプローブとして有用である。
具体的には、患者の生体組織(対象組織)の一部をバイオプシなどで採取し、そこから常法に従って調製した組織抽出物やタンパク質を用いて、例えばウェスタンブロット法、ELISA法など公知の検出方法において、本発明抗体を常法に従ってプローブとして使用することによって、Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3を検出することができる。
癌疾患の診断に際しては、被験者の組織などに存在するLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3およびHIFPH3のいずれか少なくとも1つの量と、正常者の組織に存在する当該タンパク質の量と対比して、その違いを判定すればよい。この場合、タンパク質の量の違いには、タンパク質のある／なしと共に、タンパク質の量の違いが2倍以上、好ましくは3倍以上の場合が含まれる。
Lengsinを特異的に認識する抗体は特に、肺腺癌、肺扁平上皮癌または胃癌に対する疾患マーカーとして有用である。
BJ-TSA-9を特異的に認識する抗体は特に、白血病、肺腺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌、口腔癌、胃癌、膵臓癌またはリンパ腫に対する疾患マーカーとして有用である。
C20orf42を特異的に認識する抗体は特に、肺扁平上皮癌、肺腺癌、肝臓癌、胃癌、白血病、悪性リンパ腫組織、直腸癌、結腸癌または膵臓癌に対する疾患マーカーとして有用である。
BUB1を特異的に認識する抗体は特に、乳癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、口腔扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫またはメラノーマに対する疾患マーカーとして有用である。
C10orf3を特異的に認識する抗体は特に、乳癌、結腸癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌、小細胞肺癌またはメラノーマに対する疾患マーカーとして有用である。
HIFPH3を特異的に認識する抗体は特に、乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌、肺腺癌または肺扁平上皮癌に対する疾患マーカーとして有用である。
(2)癌疾患の検出方法(診断方法)
本発明は、前述した本発明疾患マーカーを利用した癌疾患の検出方法(診断方法)を提供する。
具体的には、本発明の検出方法は、被験者の生体組織(対象組織)の一部を、バイオプシなどで採取し、そこに含まれる癌疾患に関連するLengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の発現レベル(発現量)、または該遺伝子に由来するタンパク質であるLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3のタンパク質レベル(量)を検出、測定することにより、癌疾患の罹患の有無またはその程度を検出(診断)するものである。また、本発明の検出(診断)方法は、例えば癌疾患患者において、該疾患の改善のために治療薬などを投与した場合における、該疾患の改善の有無またはその程度を検出（診断）することもできる。
本発明の検出方法は、次の(a)、(b)および(c)の工程を含むものである：
(a) 被験者の生体試料と本発明疾患マーカーを接触させる工程、
(b) 生体試料中のLengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の遺伝子発現レベル、あるいはLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3のタンパク質の量を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
(c) 上記(b)の結果をもとに、癌疾患の罹患を判断する工程。
ここで用いられる生体試料は、被験者の生体組織から調製される対象試料を挙げることができる。具体的には、該組織から調製されるRNA含有試料、もしくはそれらから更に調製されるポリヌクレオチドを含む試料、または上記組織から調製されるタンパク質を含む試料を挙げることができる。これらのRNA、ポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む試料は、例えば被験者の生体組織の一部をバイオプシなどで採取後、常法に従って調製することができる。
本発明の診断方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて、具体的には下記のようにして実施される。
(2-1) 測定対象の生体試料としてRNAを利用する場合
測定対象物としてRNAを利用する場合、癌疾患の検出は、具体的に下記の工程(a)、（b）及び（c）を含む方法によって実施することができる：
(a)被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれらから転写された相補的ポリヌクレオチドと、前記本発明の疾患マーカー（Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド）とを結合させる工程、
(b)該疾患マーカーに結合した生体試料由来のRNAまたは該RNAから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記(b)の測定結果に基づいて、癌疾患の罹患を判断する工程。
測定対象物としてRNAを利用する場合、本発明検出方法(診断方法)は、該RNA中のLengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。具体的には、前述のポリヌクレオチドからなる本発明疾患マーカー(Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび／またはその相補的なポリヌクレオチド)をプライマーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、RT-PCR法、DNAチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
ノーザンブロット法を利用する場合、本発明疾患マーカーをプローブとして用いることによって、RNA中の、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、まず本発明疾患マーカー(相補鎖)を放射性同位元素(32P、33Pなど：RI)、蛍光物質などで標識する。次いで、得られる標識疾患マーカーを常法に従ってナイロンメンブレンなどにトランスファーした被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせる。その後、形成された標識疾患マーカー(DNA)とRNAとの二重鎖を、該標識疾患マーカーの標識物(RI、蛍光物質など)に由来するシグナルを放射線検出器(BAS-1800II、富士フィルム社製)、蛍光検出器などで検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham Pharamcia Biotech社製)を用いて、該プロトコールに従って疾患マーカー(プローブDNA)を標識し、被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、疾患マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860 (Amersham Pharmacia Biotech社製)で検出、測定する方法を採用することもできる。
RT-PCR法を利用する場合、本発明疾患マーカーをプライマーとして用いて、RNA中のLengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、まず被験者の生体組織由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製し、これを鋳型として標的の、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の疾患マーカーから調製した一対のプライマー(上記cDNA(−鎖)に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖)をこれとハイブリダイズさせる。その後、常法に従ってPCR法を行い、得られた増幅二本鎖DNAを検出する。増幅された二本鎖DNAの検出には、予めRI、蛍光物質などで標識しておいたプライマーを用いて上記PCRを行うことによって産生される標識二本鎖DNAを検出する方法、産生された二本鎖DNAを常法に従ってナイロンメンブレンなどにトランスファーさせて、標識した疾患マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖DNA産物はアジレント2100バイオアナライザ(横河アナリティカルシステムズ社製)などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
DNAチップ解析を利用する場合、本発明疾患マーカーをDNAプローブ(1本鎖または2本鎖)として貼り付けたDNAチップを用意し、これに被験者の生体組織由来のRNAから常法によって調製されたcRNAをハイブリダイズさせ、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、本発明疾患マーカーから調製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。また、上記DNAチップとして、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の遺伝子発現レベルを検出、測定可能なDNAチップを用いることもできる。かかる、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の発現レベルを検出、測定することができるDNAチップとしては、例えばAffymetrix社のGene Chip Human Genome U95 A, B, C, D, Eを挙げることができる。かかるDNAチップを用いた、被験者RNA中の、Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定については、実施例に詳述する。
(2-2) 測定対象の生体試料としてタンパク質を用いる場合
測定対象としてタンパク質を用いる場合、本発明検出(診断)方法は、生体試料中の、Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3を検出し、その量(レベル)を測定することによって実施される。具体的には、下記の工程(a)、(b)及び(c)を含む方法によって実施することができる。
(a)被験者の生体試料から調製されたタンパク質と抗体に関する本発明の疾患マーカー（Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3を認識する抗体）とを結合させる工程、
(b)該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質またはその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記(b)の測定結果に基づいて、癌疾患の罹患を判断する工程。
より具体的には、抗体に関する本発明の疾患マーカーとして抗体（Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3を特異的に認識する抗体）を用いて、ウエスタンブロット法などの公知方法で、Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3を検出、定量する方法を挙げることができる。
ウエスタンブロット法は、一次抗体として本発明疾患マーカーである上記抗体を用いた後、二次抗体として125Iなどの放射性同位元素、蛍光物質などで標識した標識抗体(一次抗体に結合する標識抗体)を用い、得られる標識結合物の放射性同位元素、蛍光物質などに由来するシグナルを放射線測定器(BAS-1800II：富士フィルム社製など)、蛍光検出器などで検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、ECL Plus Western Blotting Detction System (Amersham Pharmacia Biotech 社製)を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860 (Amersham Pharmacia Biotech 社製)で測定することもできる。
(2-3)癌疾患の診断
癌疾患の診断は、被験者の生体組織におけるLengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の遺伝子発現レベル、もしくはLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3タンパク質の量（レベル）を、対応する正常な組織における当該遺伝子発現レベルまたは当該タンパク質レベルと比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
この場合、正常な組織などから採取、調製した生体試料(RNAまたはタンパク質)が必要であるが、これは癌疾患に罹患していない人の組織あるいは癌疾患に罹患している人の非癌部正常組織などをバイオプシなどで採取したり、死後に本人の同意に基づいて採取された組織から得ることができる。なお、ここで「癌疾患に罹患していない人」とは、少なくとも癌疾患の自覚症状がなく、好ましくは他の検査方法、例えばX線検査などによる検査の結果、癌疾患でないと診断された人をいう。なお、当該「癌疾患に罹患していない人」を、以下、本明細書では単に正常者という場合もある。
被験者の生体組織と正常な生体組織(癌疾患に罹患していない人の生体組織あるいは癌疾患に罹患している人の非癌部正常組織)との遺伝子発現レベルまたはタンパク質レベルの比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。また、並行して行わなくても、複数(少なくとも2、好ましくは3以上、より好ましくは5以上)の正常な生体組織を用いて均一な測定条件で測定して得られたLengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の遺伝子発現レベル、もしくはLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3のタンパク質レベルの平均値または統計的中間値を、正常者の遺伝子発現レベルもしくはタンパク質の量として比較に用いることができる。
被験者が、癌疾患であるかどうかの判断は、該被験者の組織におけるLengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の遺伝子発現レベル、またはその発現産物であるLengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3のタンパク質レベルが、正常者のそれらと比較して2倍以上、好ましくは3倍以上多いことを指標として行うことができる。被験者の遺伝子発現レベルまたはタンパク質レベルが正常者のそれらのレベルに比べて多ければ、該被験者は癌疾患であると判断できるか、該疾患の罹患が疑われる。
より具体的には、被験者の肺または胃の組織において、上記遺伝子のうちLengsin遺伝子の遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量が、正常な対応する組織に比べて多い場合、癌疾患が疑われる。
またBJ-TSA-9遺伝子の遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量が、被験者の白血球、肺、口腔、胃、膵臓またはリンパ節の組織において、正常な対応する組織に比べて多い場合は癌疾患が疑われる。
またC20orf42遺伝子の遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量が、被験者の肺、肝臓、胃、白血球、リンパ節、直腸、結腸または膵臓の組織において、正常な対応する組織に比べて多い場合は癌疾患が疑われる。
またBUB1遺伝子の遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量が、被験者の乳腺、肺、卵巣、口腔、腎臓、大腸（結腸、直腸）、胃、膵臓、肝臓、白血球、リンパ節または皮膚の組織において、正常な対応する組織に比べて多い場合は癌疾患が疑われる。
またC10orf3遺伝子の遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量が、被験者の乳腺、結腸、直腸、腎臓、胃、卵巣、肝臓、膵臓、肺または皮膚の組織において、正常な対応する組織に比べて多い場合は癌疾患が疑われる。
またHIFPH3遺伝子の遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量が、被験者の乳腺、結腸、胃、腎臓、膵臓、肝臓、肺の組織において、正常な対応する組織に比べて多い場合は癌疾患が疑われる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
ヒト組織サンプル及び、ヒト癌細胞株からのトータルRNAの調製
ヒトの主要臓器由来の癌および正常組織サンプル、すなわち肺腺癌組織57サンプル、肺正常組織（肺腺癌患者由来）46サンプル、肺扁平上皮癌組織48サンプル、肺正常組織（肺扁平上皮癌患者由来）18サンプル、結腸癌組織108サンプル、結腸正常組織（結腸癌患者由来）114サンプル、直腸癌組織43サンプル、直腸正常組織（直腸癌患者由来）31サンプル、胃癌組織38サンプル、胃正常組織（胃癌患者由来）13サンプル、乳癌組織237サンプル、乳正常組織（乳癌患者由来）39サンプル、卵巣癌組織37サンプル、卵巣正常組織（卵巣癌患者由来）５サンプル、肝癌組織19サンプル、肝正常組織（肝癌患者由来）８サンプル、腎癌組織89サンプル、腎正常組織（腎癌患者由来）64サンプル、膵癌組織55サンプル、膵正常組織（膵癌患者由来）16サンプル、白血病組織６サンプル、リンパ腫組織90サンプル、骨髄正常組織２サンプル、メラノーマ組織10サンプル、皮膚正常組織72サンプルから、それぞれ常法に従いトータルRNAを調製した。
DNAチップ解析
実施例１に示したサンプルより調製したtotal RNAを用いて、DNAチップ解析を行った。なお、DNAチップ解析はAffymetrix社Gene Chip Human Genome U133セットを用いて行った。具体的には、解析は、(1) total RNAからcDNAの調製、(2) 該cDNAからラベル化cRNAの調製、(3) ラベル化cRNAのフラグメント化、(4) フラグメント化cRNAとプローブアレイとのハイブリダイズ、(5) プローブアレイの染色、(6) プローブアレイのスキャン、及び(7) 遺伝子発現解析、の手順で行った。
(1) total RNAからcDNAの調製
実施例１で得られた各total RNA 10μgとT7-(dT)24プライマー(Amersham社製)100pmolを含む11μLの混合液を、70℃、10分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、SuperScript Choice System for cDNA Synthesis(Gibco-BRL社製)に含まれる5×First Strand cDNA Buffer 4μL、該キットに含まれる0.1M DTT （dithiothreitol）2μL、該キットに含まれる10mM dNTP Mix 1μLを添加し、42℃で2分間加熱した。更に、該キットに含まれるSuper ScriptII RT 2μL(400U)を添加し、42℃で1時間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、DEPC処理水（ナカライテスク社製）滅菌蒸留水91μL、該キットに含まれる5×Second Strand Reaction Buffer 30μL、10mM dNTP Mix 3μL、該キットに含まれるE. coli DNA Ligase 1μL(10U)、該キットに含まれるE. coli DNA Polymerase I 4μL(40U)、該キットに含まれるE. coli RNaseH 1μL(2U)を添加し、16℃で2時間反応させた。次いで、該キットに含まれるT4 DNA Polymerase 2μL(10U)を加え、16℃で5分間反応させた後、0.5M EDTA 10μLを添加した。次いで、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）162μLを添加し、混合した。該混合液を、予め室温、14,000rpm、30秒間遠心分離しておいたPhase Lock Gel Light(エッペンドルフ社製)に移し、室温で14,000rpm、2分間遠心分離した後、145μLの水層をエッペンドルフチューブに移した。得られた溶液に、7.5M酢酸アンモニウム溶液72.5μL、エタノール362.5μLを加えて混合した後、4℃で14,000rpm、20分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、作製したcDNAを含むペレットを得た。その後、該ペレットに80%エタノール0.5mLを添加し、4℃で14,000rpm、5分間遠心分離した後、上清を捨てた。再度同様の操作を行った後、該ペレットを乾燥させ、DEPC処理水12μLに溶解した。以上の操作により実施例１で調製した各トータル RNAから、各cDNAを取得した。
(2) cDNAからラベル化cRNAの調製
各cDNA溶液5μLに、DEPC処理水17μL、BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit(ENZO社製)に含まれる10×HY Reaction Buffer 4μL、該キットに含まれる10×Biotin Labeled Ribonucleotides 4μL、該キットに含まれる10×DTT 4μL、該キットに含まれる10×RNase Inhibitor Mix 4μL、該キットに含まれる20×T7 RNA Polymerase 2μLを混合し、37℃で5時間反応させて、ラベル化cRNAを調製した。反応後、該反応液にDEPC処理水60μLを加えたのち、RNeasy Mini Kit（GIAGEN社製）を用いて添付プロトコールに従い、調製したラベル化cRNAを精製した。
(3) ラベル化cRNAのフラグメント化
各ラベル化cRNA 20μgを含む溶液に、5×Fragmentation Buffer（200mMトリス−酢酸 pH8.1(Sigma社製)、 500mM酢酸カリウム(Sigma社製)、150mM酢酸マグネシウム(Sigma社製)）8μLを加えた反応液40μLを、94℃で35分間加熱した後、氷中に置いた。これによって、ラベル化cRNAをフラグメント化した。
(4) フラグメント化cRNAとプローブアレイとのハイブリダイズ
各フラグメント化cRNA 40μLに、5nM Control Oligo B2（Amersham社製）4μL、100×Control cRNA Cocktail 4μL、Herring sperm DNA（Promega社製）40μg、Acetylated BSA（Gibco-BRL社製）200μg、2×MES Hybridization Buffer(200mM MES、2M [Na+], 40mM EDTA、0.02% Tween20 (Pierce社製)、pH6.5〜6.7) 200μL、及びDEPC処理水144μLを混合し、400μLのハイブリカクテルを得た。得られた各ハイブリカクテルを99℃で5分間加熱し、更に45℃で5分間加熱した。加熱後、室温で14,000rpm、5分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得た。
一方、1×MESハイブリダイゼーションバッファーで満たしたHuman genome U133プローブアレイ（Affymetrix社製）を、ハイブリオーブン内で、45℃、60rpmで10分間回転させた後、1×MESハイブリダイゼーションバッファーを除去してプローブアレイを調製した。上記で得られたハイブリカクテル上清200μLを該プローブアレイにそれぞれ添加し、ハイブリオーブン内で45℃、60rpmで16時間回転させ、フラグメント化cRNAとハイブリダイズしたプローブアレイを得た。
(5) プローブアレイの染色
上記で得られたハイブリダイズ済みプローブアレイそれぞれからハイブリカクテルを回収除去した後、Non-Stringent Wash Buffer(6×SSPE(20×SSPE(ナカライテスク社製)を希釈)、0.01%Tween20、0.005%Antifoam0-30(Sigma社製))で満たした。次にNon-Stringent Wash BufferおよびStringent Wash Buffer(100mM MES、0.1M NaCl、0.01%Tween20)をセットしたGeneChip Fluidics Station 400(Affymetrix社製)の所定の位置にフラグメント化cRNAとハイブリダイズしたプローブアレイを装着した。その後染色プロトコールEuKGE-WS2に従って、１次染色液(10μg/mL Streptavidin Phycoerythrin (SAPE)(MolecμLar Probe社製)、2mg/mL Acetylated BSA、100mM MES、1M NaCl(Ambion社製)、0.05%Tween20、0.005%Antifoam0-30)、 2次染色液（100μg/mL Goat IgG (Sigma社製)、3μg/mL Biotinylated Anti-Streptavidin antibody (Vector Laboratories社製)、2mg/mL Acetylated BSA、100mM MES、1M NaCl、0.05%Tween20、0.005%Antifoam0-30）により染色した。
(6) プローブアレイのスキャン、及び (7) 遺伝子発現量解析
染色した各プローブアレイをHP GeneArray Scanner(Affymetrix社製)に供し、染色パターンを読み取った。染色パターンをもとにGeneChip Workstation System(Affymetrix社製)によってプローブアレイ上の遺伝子の発現を解析した。次に、解析プロトコールに従ってNormalizationを行ったのち、各サンプルにおける各プローブ（各遺伝子）の発現量（average difference）及び発現の有無を算出した。同一のプローブにつき、サンプルの種類ごとに遺伝子発現量の平均値を求め、さらに各サンプル種類間における発現量、発現頻度の変化率を求めた。
発現変動解析
各種主要臓器（肺、結腸、直腸、胃、乳、肝、腎、卵巣、膵）由来の正常組織に比較し、癌組織で発現量・発現頻度が増加している遺伝子を、以下のようにして選択した。
すなわちDNAチップ解析による遺伝子発現の解析結果から、各種正常組織に比べて対応する癌組織で発現量・発現頻度が増加しているプローブセットのうち、多くの癌組織で特異的発現量・発現頻度の上昇の認められたプローブを選択した。次に、これら選択されたプローブの対応遺伝子を調べ選別した。
その結果、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子、C20orf42遺伝子、Lengsin遺伝子、HIFPH3遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子の計6遺伝子が選択された。これら6遺伝子の発現変動倍率を表２に、また発現頻度を表３に示す。
Figure 2007119515
Figure 2007119515
表２の数値は各種癌の対応する正常組織に対する発現変動倍率を示し、Human Genome U133 Chipで解析した各種正常組織の遺伝子発現量を１とした場合における同組織由来の癌組織での遺伝子発現量を示した。また表３の数値は各種癌・正常組織での、各遺伝子の発現頻度（％）を示した。
BUB1遺伝子は、調べた全ての癌組織で、正常組織に比して発現量が上昇しており、特に肺扁平上皮癌および卵巣癌において顕著であった。また発現頻度も上昇しており、特に肺扁平上皮癌、卵巣癌およびメラノーマ組織において顕著であった。
C10orf3遺伝子は、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、直腸癌およびメラノーマ組織において、正常組織に比して発現量が上昇しており、特に卵巣癌、肝臓癌、肺扁平上皮癌において顕著であった。また発現頻度も上記発現量と同様血液腫瘍を除く全ての癌種で上昇しており、特に肺扁平上皮癌、膵臓癌、卵巣癌において顕著であった。
C20orf42遺伝子は、結腸癌、肝臓癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、膵臓癌、胃癌、直腸癌、白血病および悪性リンパ腫組織において、正常組織に比して発現量が上昇しており、特に肺扁平上皮癌、肺腺癌において顕著であった。また発現頻度も上昇しており、特に肺腺癌、肺扁平上皮癌および膵臓癌において顕著であった。
Lengsin遺伝子は、肺腺癌、肺扁平上皮癌、胃癌、において、正常組織に比して発現量が上昇しており、特に肺腺癌において顕著であった。また発現頻度も上記の発現量と同様肺腺癌、肺扁平上皮癌、胃癌で上昇しており、特に肺腺癌において顕著であった。
HIFPH3遺伝子は、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、膵臓癌および胃癌組織において、正常組織に比して発現量が上昇しており、特に腎臓癌および肺扁平上皮癌において顕著であった。また発現頻度も上記の発現量と同様乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、膵臓癌および胃癌組織で上昇しており、特に腎臓癌、肺扁平上皮癌および膵臓癌において顕著であった。
BJ-TSA-9遺伝子は、肺腺癌、肺扁平上皮癌、白血病において、正常組織に比して発現量が上昇しており、特に白血病、肺腺癌、肺扁平上皮癌において顕著であった。また発現頻度も上記の発現量と同様肺腺癌、肺扁平上皮癌、白血病で上昇しており、特に肺腺癌および肺扁平上皮癌において顕著であった。
以上のように、選別された前記6個の遺伝子は、正常組織と比較して、対応する癌組織で特異的に発現量及び発現頻度が上昇する遺伝子であった。従ってこれら6遺伝子およびその発現産物（タンパク質）は、癌(特に上記に列挙した癌）に対する疾患マーカーとして有用であることが明らかとなった。
ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた各種細胞や組織での腫瘍抗原遺伝子の発現解析
先の6種類の遺伝子の各種癌細胞株、癌組織、および正常組織での発現を、RT-PCR法により解析した。各種癌細胞株、癌組織からIsogen reagent (Nippon Gene)を用いて抽出したRNA、あるいは市販正常組織（clontech）由来RNAをもとに、オリゴdTプライマーを用いてcDNAを調製し、表４に示すプライマーの組み合わせ（BUB1遺伝子のプライマー１:配列番号:208、プライマー２：配列番号：209、C10orf3遺伝子のプライマー１:配列番号:210、プライマー２：配列番号：211、C20orf42遺伝子のプライマー１:配列番号:206、プライマー２：配列番号：207、Lengsin遺伝子のプライマー１:配列番号:202、プライマー２：配列番号：203、HIFPH3遺伝子のプライマー１:配列番号:212、プライマー２：配列番号：213、BJ-TSA-9遺伝子のプライマー１:配列番号:204、プライマー２：配列番号：205）を用いてPCR反応（40サイクル）を行い、cDNAを増幅した。その後、この増幅遺伝子を電気泳動で分離し、解析した。陽性コントロールとしてG3PDH遺伝子の発現を、前記と同様にRT-PCR法を行い確認した。なお、癌組織及び正常組織の一部はインフォームドコンセントを得て、主として手術材料より準備・使用した。結果を図１〜図６に示した。
Figure 2007119515
BUB1遺伝子は、多くの主要な正常組織で発現が検出されない、あるいは低い発現量であったのに対して、口腔扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、リンパ腫、メラノーマ細胞株においては高い発現が検出された。
C10orf3遺伝子は、精巣を除く多くの主要な正常組織で発現が検出されない、あるいは低い発現量であったのに対して、肺腺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌細胞株において高い発現が検出された。
C20orf42遺伝子は、多くの主要な正常組織で発現が検出されなかったのに対して、結腸癌、膵臓癌細胞株では高い発現が検出された。
Lengsin遺伝子は、多くの主要な正常組織で発現が検出されなかったのに対して、肺腺癌、肺扁平上皮癌細胞株では高い発現が検出された。
HIFPH3遺伝子は、多くの主要な正常組織で発現が検出されたが、腎癌細胞株ではより高い発現が検出された。更に、腎癌患者由来の多くの癌組織において、正常組織に比較して高い発現が検出された。
BJ-TSA-9遺伝子は、多くの主要な正常組織で発現が検出されなかったのに対して、肺腺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌、口腔癌、胃癌、膵臓癌、リンパ腫細胞株において高い発現が検出された。
以上のように６種の遺伝子の発現は各種正常組織では発現が検出されない、あるいは癌細胞・組織に比較し低い発現レベルであるのに対し、遺伝子により癌種は異なるが、各種癌細胞株、癌組織で高い発現が検出された。従ってこれら6遺伝子およびその発現産物（タンパク質）は、癌(特に上記に列挙した癌）に対する疾患マーカーとして有用であることがDNAチップ解析の結果に加え更に強く示された。
候補ペプチドの選択および合成
(1)候補ペプチドの選択
Lengsin(配列番号：2)のアミノ酸配列中、HLA-A24分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号：13〜31および配列番号：195〜201に記載のアミノ酸配列からなるぺプチドを、またHLA-A2分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号：32〜41に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを選択した。
BJ-TSA-9(配列番号：4)のアミノ酸配列中、HLA-A24分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号：42〜49に記載のアミノ酸配列からなるぺプチドを、またHLA-A2分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号：50〜58に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを選択した。
C20orf42(配列番号：6)のアミノ酸配列中、HLA-A24分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号：59〜78に記載のアミノ酸配列からなるぺプチドを、またHLA-A2分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号：79〜88に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを選択した。
BUB1(配列番号：8)のアミノ酸配列中、HLA-A24分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号：89〜117に記載のアミノ酸配列からなるぺプチドを、またHLA-A2分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号：118〜157に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを選択した。
C10orf3(配列番号：10)のアミノ酸配列中、HLA-A24分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号：158〜165に記載のアミノ酸配列からなるぺプチドを、またHLA-A2分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号：166〜175に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを選択した。
HIFPH3(配列番号：12)のアミノ酸配列中、HLA-A24分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号：176〜183に記載のアミノ酸配列からなるぺプチドを、またHLA-A2分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号：184〜194に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを選択した。各ペプチドのアミノ酸配列上の位置、アミノ酸数およびアミノ酸配列を、以下の表５〜表１６に示す。
Figure 2007119515
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(2)ペプチド合成
前記のペプチド（配列番号：13〜配列番号：201）のうち、Lengsin由来のペプチド26種類(表5)、BJ-TSA-9由来のペプチド7種類(表7）、C20orf42由来のペプチド20種類(表9）、C10orf3由来のペプチド4種類(表13)を、Fmoc法で合成した。
各種抗原由来ペプチドのHLA-A*2402、HLA-*A0201への結合親和性の検討
実施例１で合成したペプチドのHLA-*A2402への結合親和性の測定は、文献（J. Immunol. 164:2565, 2000）に記載の方法と同様に実施した。MHCクラスI分子を発現していないマウスリンパ腫由来の細胞株RMA-SにHLA-*A2402とH-2KbのキメラMHCの遺伝子を安定的に導入した細胞株RMA-S-A*2402細胞を26℃で18時間培養した。RMA-S-A*2402をPBS溶液で洗浄後、3μL/mLのヒトβ2-ミクログロブリンと100μL/ｍLの各種ペプチドを含有する培養液OPTI-MEM(Invitrogen社)に懸濁して26℃で3時間、37℃で3時間培養した。この細胞をPBS溶液で洗浄後、抗HLA-A24抗体により4℃で30分間処理した。さらに細胞をPBS溶液で洗浄後、PE標識した抗マウスIｇG抗体により4℃で30分間処理した。細胞を洗浄後、1％ホルマリンを含むPBS溶液1mLに懸濁して固定した。細胞はフローサイトメーター装置FACScan（BDバイオサイエンス社）で測定し、平均蛍光強度によりペプチドの結合親和性を求めた。検討した31種類のペプチドの結合親和性を測定した結果を図７〜９に示す。
陽性対照として、文献(J. Immunol. 158:3325, 1997)でHLA-A*2402に結合することが報告されているEBウイルス由来のペプチド及び文献(J. Immunol. 164:2565, 2000)で報告されているHIVウイルス由来のペプチド(HIV)は、強い結合能を示した。陰性対照として用いた文献(Eur J Immunol. 21:2891, 1991)でH2-Kbに結合することが報告されているOvalbumin由来のペプチド(SL8)は低い活性を示した。試験した31種類の全てのペプチドはHLA-A*2402に良好に結合することが示された。従ってこれら31種類のペプチドは腫瘍抗原ペプチドであり、その由来であるBJ-TSA-9、C20orf42およびC10orf3は腫瘍抗原タンパク質であることが明らかとなった。
同様にして、Lengsin由来の23種類ペプチドについてHLA-A*2402への結合能を調べた結果を図10、11に示す。配列番号：15,16,21,22,23,24,25,26,27,30,195,197,198,199,200,201 に記載のペプチドについて、HLA-A*2402への有意な結合親和性が示された。従ってこれらのペプチドは腫瘍抗原ペプチドであり、その由来であるLengsinは腫瘍抗原タンパク質であることが明らかとなった。
なお、HLA-A*0201についてはヒトリンパ腫由来の細胞株T2細胞を用いて上記と同様な方法で結合能を確認することができる。またBUB1およびHIFPH3についても同様にしてHLAへの結合能を確認することができる。
腫瘍抗原由来ペプチドによるＣＴＬ誘導
実施例６でHLAへの結合能が認められたペプチドでＣＴＬを誘導し、そのＣＴＬの活性を評価することにより、BUB1、C10orf3、C20orf42、Lengsin、HIFPH3、BJ-TSA-9の各タンパク質が腫瘍抗原タンパクであり、その部分ペプチドが腫瘍抗原ペプチドであることを確認することができる。ペプチドでＣＴＬを誘導し、そのＣＴＬの活性を評価する方法は、ヒト末梢血単核球あるいはヒトモデル動物を用いた既知のアッセイ方法等に準じて行うことが出来る（J. Immunol. 169:1611, 2002、WO 02/47474 号公報、Int J. Cancer:100,565-570 (2002)）。例えば、ヒト末梢血単核球を用いたアッセイ方法の場合には、健常者あるいは癌患者からインフォームドコンセントを得て末梢血を採血し、比重遠心法により単核球を分離し、AIM-V培養液(Invitrogen社)等の培地を用いて培養する。約24時間後、非接着性の細胞を回収して、100U/ｍLのIL-2を含んだAIM-Vを用いて培養する。抗原提示用細胞調製のため、接着性の細胞は、1000U/mLのIL-4と1000U/mLのGM-CSFを含むAIM-V培養液で５日間培養後、各種癌抗原由来ペプチドを添加して１日間培養し、さらに10ng/ｍLのTNFと1000U/ｍLのIFN-αを加えて培養する。非接着性の細胞を上記のペプチドをパルスした抗原提示用細胞とともに培養する。ペプチド刺激をしたＣＴＬを含む非接着性細胞に対しては、１回目のペプチド刺激から７日後と14日後に、ペプチドパルスした抗原提示細胞を用いて２回目、３回目のペプチド刺激を行う。３回目の刺激から１週間後のＣＴＬの活性は51Cr等の放射性物質、あるいはその他の非放射性物質で標識した標的細胞（投与ペプチドが結合するHLAを発現し、更に投与ペプチドをコードする癌抗原、あるいは投与ペプチドを発現する細胞、あるいはペプチドを事前に添加した細胞）と共培養し、ＣＴＬによる標的細胞の破壊を培養上清中の放射性物質、非放射性物質の量で測定、CTLの活性を評価する。なお、CTLの活性については、CTL細胞が標的細胞と反応した結果、培養上清中に産生するIFNγをELISA法あるいはELISPOT法にて測定することで評価することも可能である。
またヒトモデル動物を用いたアッセイ方法の場合には癌抗原由来のペプチドを適当な剤形を用いて、ヒトHLAを発現したトランスジェニックマウスに投与し、約１週間後に脾臓細胞、あるいはその他のリンパ系組織を得る。得られた細胞を、投与したものと同様のペプチドでin vitroで抗原刺激を行い、更に約５日間培養する。得られた細胞をCTL画分とし、上記と同様な方法にてCTLの活性を評価することができる。
C10orf3由来ペプチドによるCTL誘導
実施例７に記載の方法に従い、C10orf3由来のC10orf3_193(10)のペプチドでHLA-A*2402陽性の癌患者末梢血単核球（PBMC）を刺激してCTLを誘導した。ペプチドをパルスしたT2-A24細胞（T2-A24細胞：HLA-A*2402遺伝子を有さないT2細胞（ATCC番号CRL-1992)にHLA-A*2402遺伝子を導入し発現させた細胞株）、HLA-A*2402陽性及びC10orf3陽性の癌細胞株Sw480を標的細胞としてCTL活性を求めた結果を図12に示す。誘導したCTLクローンは、ペプチド特異的な細胞傷害活性を示した。また、誘導したCTLクローンは、HLA陰性のK562細胞には反応せず、HLA-A*2402陽性及びC10orf3陽性の癌細胞株に対して細胞傷害活性を示した。このことより、C10orf3_193(10)のペプチド（配列番号：158、162）は腫瘍抗原ペプチドであることが確認できた。またC10orf3が腫瘍抗原タンパク質であることも確認された。
Lengsin由来ペプチドによるCTL誘導
合成したHLA-A*2402に結合する可能性のあるペプチドを何種類か混合し、実施例７に記載の方法に従って、HLA-A*2402陽性の癌患者のPBMCを刺激してCTLの誘導を試みた。誘導後、各ペプチドに対する反応性をIFN-γのELISPOT法で検出した結果を図13に示す。その結果、配列番号：22、23、26、27、198、200、201のペプチドに対して特異的なCTLの誘導が認められた。このことより、配列番号：22、23、26、27、198、200、201のペプチドは腫瘍抗原ペプチドであることが確認できた。またLengsinが腫瘍抗原タンパク質であることも確認された。
次に、配列番号：22のペプチドで癌患者PBMCを刺激してCTLを誘導し、CTL誘導活性を細胞傷害活性で検出した結果を図14に示す。刺激に用いたペプチドをパルスした標的細胞に対して特異的な細胞傷害活性が検出された。
HIFPH3由来ペプチドによるCTL誘導
配列番号：177、178、179及び183のペプチドを混合し、実施例７に記載の方法に従って、HLA-A*2402陽性の癌患者のPBMCを刺激してCTLの誘導を試みた。誘導後、各種腎癌細胞株に対する細胞傷害活性を測定した結果を図15に示す。ペプチド刺激して得られたリンパ球は、HLA-A24とHIFPH3が共に陽性のSMKT R-1細胞には反応して細胞傷害性を示したが、HLA-A24陰性、HIFPH3陽性のSMKT R4細胞、HLA-A24陽性、HIFPH3陰性のCaki-1細胞、HLA-A24とHIFPH3が共に陰性のACHN細胞、及びHLA陰性のK562細胞に対しては、細胞傷害性を示さなかった。このことより、ペプチド刺激によりHIFPH3に対するHLA-A24拘束性のCTLが誘導されていることが示され、これらHIFPH3_27(9)(配列番号：177)、HIFPH3_92(10)(配列番号：178)、HIFPH3_112(10)(配列番号：179)およびHIFPH3_295(9)(配列番号：183)のペプチドは腫瘍抗原ペプチドであることが確認できた。またHIFPH3が腫瘍抗原タンパク質であることも確認された。
C20orf42由来ペプチドによるCTL誘導
合成したHLA-A*2402に結合する可能性のあるペプチド20種類を4種類ずつ5グループに分けた。HLA-A*2402陽性の癌患者のPBMCを96穴プレートに播種し、実施例７に記載の方法に従い、各グループのペプチドで刺激してCTLの誘導を試みた。各グループ384穴のPBMCを刺激し、刺激したペプチドに対する細胞傷害性を調べたところ、8から14穴で、刺激ペプチドに対して特異的な細胞傷害活性が検出された。このことより、これらC20orf42由来のペプチドは腫瘍抗原ペプチドであることが確認された。またC20orf42が腫瘍抗原タンパク質であることも確認された。
本発明により新規な腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチド、ならびにこれらの物質の癌免疫分野における用途が提供される。本発明の腫瘍抗原タンパク質およびそれに由来する腫瘍抗原ペプチドは、当該腫瘍抗原タンパク質の発現している癌に罹患した患者を処置することができる。
図１は、Lengsin遺伝子の各種主要正常組織、肺癌細胞株でのmRNA発現量をRT-PCR法を用いて解析した図である。図中、Lengsin及びG3PDH（陽性対照）の矢印はそれぞれのmRNA量を示すバンドの位置を示す。Heart（心臓）、Brain（脳）、Placenta（胎盤）、Lung（肺）、Liver（肝臓）、Skeleton Muscle（骨格筋）、Kidney（腎臓）、Pancreas（膵臓）、Spleen（脾臓）、Thymus（胸腺）、Prostate（前立腺）、Testis（精巣）、Ovary（卵巣）、Small Intestine（小腸）、Large Intestine（大腸）、PBMC（末梢血単核球）、Adenocarcinoma（腺癌）、Squamous cell carcinoma（扁平上皮癌）、Small cell carcinoma（小細胞癌）は正常及び癌組織種を示す。LNY-1、A549、LHK2、1-87、LK79、Sq-1、LC817、Lu65は各種肺癌細胞株名を示す。
図２は、BJ-TSA-9遺伝子の各種主要正常組織及び肺癌、口腔癌その他癌種細胞株でのmRNA発現量をRT-PCR法を用いて解析した図である。図中、BJ-TSA-9及びG3PDH（陽性対照）の矢印はそれぞれのmRNA量を示すバンドの位置を示す。Heart（心臓）、Brain（脳）、Placenta（胎盤）、Lung（肺）、Liver（肝臓）、Skeleton Muscle（骨格筋）、Kidney（腎臓）、Pancreas（膵臓）、Spleen（脾臓）、Thymus（胸腺）、Prostate（前立腺）、Testis（精巣）、Ovary（卵巣）、Small Intestine（小腸）、Large Intestine（大腸）、PBMC（末梢血単核球）、Adenocarcinoma（腺癌）、Squamous cell carcinoma（扁平上皮癌）、Small cell carcinoma（小細胞癌）は正常及び癌組織種を示す。LNY-1、A549、LHK2、1-87、LK79、Sq-1、LC817、Lu65、OSC19、OSC20、OSC30、OSC40、OSC70、HSC2、HSC3、HSC4、KOSC3、HO-1-N-1、R3、SW450、SSTW、HS776、CHC20、CHC32、C1R、T2、888mel、LG2melは各種臓器癌細胞株名を示す。
図３は、C20orf42遺伝子の各種主要正常組織及び結腸癌、膵臓癌細胞株でのmRNA発現量をRT-PCR法を用いて解析した図である。図中、C20orf42及びG3PDH（陽性対照）の矢印はそれぞれのmRNA量を示すバンドの位置を示す。Heart（心臓）、Brain（脳）、Placenta（胎盤）、Lung（肺）、Liver（肝臓）、Skeleton Muscle（骨格筋）、Kidney（腎臓）、Pancreas（膵臓）、Spleen（脾臓）、Thymus（胸腺）、Prostate（前立腺）、Testis（精巣）、Ovary（卵巣）、Small Intestine（小腸）、colon（結腸）、leukocyte（白血球）、colon cancer（結腸癌）、pancreatic cancer（膵臓癌）は正常及び癌組織種を示す。SW480、SW620、colo205、WiDR、CFPAC、PK8、SuSu86、PUNは結腸癌、膵臓癌細胞株名を示す。
図４は、BUB1遺伝子の各種主要正常組織及び口腔扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、リンパ腫、メラノーマ細胞株でのmRNA発現量をRT-PCR法を用いて解析した図である。図中、BUB1及びG3PDH（陽性対照）の矢印はそれぞれのmRNA量を示すバンドの位置を示す。OSC19、HSC2、Caki1、R3、SW450、SSTW、HS776T、PUN、CHC20、CHC32、C1R、T2、888mel、LG2MELは各種臓器癌細胞株名を示す。
図５は、C10orf3遺伝子の各種主要正常組織及び各種肺癌細胞株でのmRNA発現量をRT-PCR法を用いて解析した図である。図中、C10orf3及びG3PDH（陽性対照）の矢印はそれぞれのmRNA量を示すバンドの位置を示す。Heart（心臓）、Brain（脳）、Placenta（胎盤）、Lung（肺）、Liver（肝臓）、Skeleton Muscle（骨格筋）、Kidney（腎臓）、Pancreas（膵臓）、Spleen（脾臓）、Thymus（胸腺）、Prostate（前立腺）、Testis（精巣）、Ovary（卵巣）、Small Intestine（小腸）、Large Intestine（大腸）、PBMC（末梢血単核球）、Adenocarcinoma（腺癌）、Squamous cell carcinoma（扁平上皮癌）、Small cell carcinoma（小細胞癌）は正常及び癌組織種を示す。LNY-1、A549、LHK2、1-87、LK79、Sq-1、LC817、Lu65は各種臓器癌細胞株名を示す。
図６は、HIFPH3遺伝子の各種主要正常組織、腎癌細胞株、及び腎癌腫瘍組織でのmRNA発現量をRT-PCR法を用いて解析した図である。図中、HIFPH3及びG3PDH、β-actin（陽性対照）はそれぞれのmRNA量を示すバンドの位置を示す。Heart（心臓）、Brain（脳）、Placenta（胎盤）、Lung（肺）、Liver（肝臓）、Skeleton Muscle（骨格筋）、Kidney（腎臓）、Pancreas（膵臓）、Spleen（脾臓）、Thymus（胸腺）、Prostate（前立腺）、Testis（精巣）、Ovary（卵巣）、Small Intestine（小腸）、colon（結腸）、leukocyte（白血球）、RCC（腎細胞癌）は正常及び癌組織種を示す。Tは腫瘍組織、Nは正常組織を示す。SMKTR-1、SMKTR-2、SMKTR-3、SMKTR-4、Caki-1、ACHNは腎癌細胞株名を示す。
図７は、BJ-TSA-9由来の８種類のペプチドおよび陽性コントロールであるEBウイルス由来ペプチド(図中EBV)、HIVウイルス由来ペプチド(図中HIV)、陰性コントロールであるOvalbumin由来のペプチド(SL8)のHLA-A*2402への結合親和性を示したグラフである。図中、横軸は平均蛍光強度（MFI,結合親和性）を示す。縦軸はペプチド名を示す。（−）はペプチド未添加の結果を示す。
図８は、C20orf42由来の20種類のペプチドおよび陽性コントロールであるEBウイルス由来ペプチド(図中EBV)、HIVウイルス由来ペプチド(図中HIV)、陰性コントロールであるOvalbumin由来のペプチド(SL8)のHLA-A*2402への結合親和性を示したグラフである。図中、横軸は平均蛍光強度（MFI,結合親和性）を示す。縦軸はペプチド名を示す。（−）はペプチド未添加の結果を示す。
図９は、C10orf3由来の４種類のペプチドおよび陽性コントロールであるEBウイルス由来ペプチド(図中EBV)、HIVウイルス由来ペプチド(図中HIV)、陰性コントロールであるOvalbumin由来のペプチド(SL8)のHLA-A*2402への結合親和性を示したグラフである。図中、横軸は平均蛍光強度（MFI,結合親和性）を示す。縦軸はペプチド名を示す。（−）はペプチド未添加の結果を示す。
図１０は、Lengsin由来の16種類のペプチドおよび陽性コントロールであるHIVウイルス由来ペプチド(図中HIV)、陰性コントロールであるOvalbumin由来のペプチド(SL8)のHLA-A*2402への結合親和性を示したグラフである。図中、横軸は平均蛍光強度（MFI,結合親和性）を示す。縦軸はペプチド名を示す。（−）はペプチド未添加の結果を示す。
図１１は、Lengsin由来の7種類のペプチドおよび陽性コントロールであるEBウイルス由来ペプチド(図中EBV)、陰性コントロールであるOvalbumin由来のペプチド(SL8)のHLA-A*2402への結合親和性を示したグラフである。図中、横軸は平均蛍光強度（MFI,結合親和性）を示す。縦軸はペプチド名を示す。（−）はペプチド未添加の結果を示す。
図１２は、C10orf3_193(10)ペプチドでHLA-A*2402陽性の癌患者PBMCを刺激することにより誘導されたCTLの、細胞傷害活性を示したグラフである。図中、「peptide2」はペプチドをパルスしたT2-A24細胞を、「Sw480」はHLA-A*2402陽性及びC10orf3陽性の癌細胞株Sw480を、それぞれ標的細胞として用いた結果を示す。また図中、「K562」はHLA陰性のK562細胞を標的細胞として用いた結果を、（−）はペプチド未添加のT2-A24細胞を標的細胞として用いた結果を示す。
図１３は、Lengsin由来ペプチドによりHLA-A*2402陽性の癌患者PBMCを刺激して誘導されたCTLの反応性を、IFN-γ量を測定するELISPOT法で検出した結果を示した図である。
図１４は、Lengsin_142(9)ぺプチドで癌患者PBMCを刺激して誘導されたCTLの、細胞傷害活性を示したグラフである。図中「T2A24+peptide」は、前記ペプチドをパルスしたT2-A24細胞を、「T2A24」は前記ペプチドをパルスしていないT2-A24細胞を、それぞれ標的細胞として用いた結果を示す。また図中、「T2A24＋HIV」はHIV由来のペプチドをパルスしたT2-A24細胞を、「K562」はHLA陰性のK562細胞を、それぞれ標的細胞として用いた結果を示す。
図１５は、HIFPH3由来ペプチド（配列番号：177、178、179及び183）混合物で、HLA-A*2402陽性の癌患者のPBMCを刺激してCTLを誘導した結果を示すグラフである。縦軸は細胞傷害活性を示す。図中、E:T1Cr％、E:T3Cr％、E:T10Cr％は、ペプチド刺激したPBMCと癌細胞との混合比が、それぞれ1、3、10であることを示す。
配列番号：１３〜２０１に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：２０２〜２１３に記載の塩基配列はプライマーである。

Claims (48)

  1. Lengsin(Glutamate-ammonia ligase (glutamine synthase) domain containing 1、GLULD1とも称する)、BJ-TSA-9(Hypothetical protein MGC14128)、C20orf42(URP1、Kindlerinとも称する)、BUB1、C10orf3またはHIFPH3(egl nine homolog3、EGLN3とも称する)に由来する部分ペプチドを含有し、かつＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド。
  2. ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４抗原またはＨＬＡ−Ａ２抗原である、請求項１記載のペプチド。
  3. 配列番号：１３〜配列番号：２０１のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、請求項２記載のペプチド。
  4. 配列番号：１３〜配列番号：３１、配列番号：４２〜配列番号：４９、配列番号：５９〜配列番号：７８、配列番号：８９〜配列番号：１１７、配列番号：１５８〜配列番号：１６５、配列番号：１７６〜配列番号：１８３、配列番号：１９５〜２０１のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンに置換され、及び／又はＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンに置換されたアミノ酸配列を含有し、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド。
  5. 配列番号：３２〜配列番号：４１、配列番号：５０〜配列番号：５８、配列番号：７９〜配列番号：８８、配列番号：１１８〜配列番号：１５７、配列番号：１６６〜配列番号：１７５、配列番号：１８４〜配列番号：１９４のいずれかに記載のアミノ酸配列の第２位のアミノ酸がロイシン、メチオニン、バリン、イソロイシンまたはグルタミンに置換され、及び／又はＣ末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンに置換されたアミノ酸配列を含有し、かつＨＬＡ−Ａ２抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド。
  6. 請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドを含有するエピトープペプチド。
  7. 請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
  8. 請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸。
  9. 請求項８記載の核酸と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
  10. Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
  11. Lengsinが配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求項１０記載の医薬組成物。
  12. BJ-TSA-9が配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求項１０記載の医薬組成物。
  13. C20orf42が配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求項１０記載の医薬組成物。
  14. BUB1が配列番号：８に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求項１０記載の医薬組成物。
  15. C10orf3が配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求項１０記載の医薬組成物。
  16. HIFPH3が配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求項１０記載の医薬組成物。
  17. Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
  18. Lengsinをコードするポリヌクレオチドが配列番号：１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、請求項１７記載の医薬組成物。
  19. BJ-TSA-9をコードするポリヌクレオチドが配列番号：３に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、請求項１７記載の医薬組成物。
  20. C20orf42をコードするポリヌクレオチドが配列番号：５に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または配列番号：６に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、請求項１７記載の医薬組成物。
  21. BUB1をコードするポリヌクレオチドが配列番号：７に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または配列番号：８に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、請求項１７記載の医薬組成物。
  22. C10orf3をコードするポリヌクレオチドが配列番号：９に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または配列番号：１０に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、請求項１７記載の医薬組成物。
  23. HIFPH3をコードするポリヌクレオチドが配列番号：１１に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または配列番号：１２に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、請求項１７記載の医薬組成物。
  24. 以下の（ａ）〜（ｄ）：
    （ａ）請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド、
    （ｂ）請求項８記載の核酸、
    （ｃ）Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3、および
    （ｄ）Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
    のいずれかと、抗原提示能を有する細胞とをイン・ビトロで接触させることを特徴とする、抗原提示細胞の製造方法。
  25. 請求項２４記載の製造方法により製造される抗原提示細胞。
  26. 請求項２５記載の抗原提示細胞と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
  27. 以下の（ａ）〜（ｄ）：
    （ａ）請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド、
    （ｂ）請求項８記載の核酸、
    （ｃ）Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3、および
    （ｄ）Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
    のいずれかと、末梢血リンパ球とをイン・ビトロで接触させることを特徴とする、ＣＴＬの誘導方法。
  28. 請求項２７記載の誘導方法により誘導されるＣＴＬ。
  29. 請求項２８記載のＣＴＬと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
  30. ＣＴＬの誘導剤として使用される、請求項７、９〜２３、２６または２９のいずれかに記載の医薬組成物。
  31. 癌ワクチンとして使用される、請求項７、９〜２３、２６または２９のいずれかに記載の医薬組成物。
  32. 請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
  33. 請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡ抗原とを含有するＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマー。
  34. 請求項３３記載のＨＬＡモノマー、ＨＬＡダイマー、ＨＬＡテトラマーまたはＨＬＡペンタマーを成分として含有する、Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3に由来する腫瘍抗原ペプチド特異的なＣＴＬの検出用試薬。
  35. Lengsin遺伝子、BJ-TSA-9遺伝子、C20orf42遺伝子、BUB1遺伝子、C10orf3遺伝子またはHIFPH3遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなる癌疾患の疾患マーカー。
  36. 癌疾患の検出においてプローブまたはプライマーとして使用される請求項３５に記載の疾患マーカー。
  37. Lengsin遺伝子に関する疾患マーカーが肺腺癌、肺扁平上皮癌または胃癌に対するものである、請求項３５または３６に記載の疾患マーカー。
  38. BJ-TSA-9遺伝子に関する疾患マーカーが白血病、肺腺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌、口腔癌、胃癌、膵臓癌またはリンパ腫に対するものである、請求項３５または３６に記載の疾患マーカー。
  39. C20orf42遺伝子に関する疾患マーカーが肺扁平上皮癌、肺腺癌、肝臓癌、胃癌、白血病、悪性リンパ腫組織、直腸癌、結腸癌または膵臓癌に対するものである、請求項３５または３６に記載の疾患マーカー。
  40. BUB1遺伝子に関する疾患マーカーが乳癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、口腔扁平上皮癌、腎臓癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫またはメラノーマに対するものである、請求項３５または３６に記載の疾患マーカー。
  41. C10orf3遺伝子に関する疾患マーカーが乳癌、結腸癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、肺扁平上皮癌、肺腺癌、小細胞肺癌またはメラノーマに対するものである、請求項３５または３６に記載の疾患マーカー。
  42. HIFPH3遺伝子に関する疾患マーカーが乳癌、結腸癌、胃癌、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌、肺腺癌または肺扁平上皮癌に対するものである、請求項３５または３６に記載の疾患マーカー。
  43. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含む癌疾患の検出方法：
    (a)被験者の生体試料から調製されたRNAまたは該RNAから転写された相補的ポリヌクレオチドと請求項３５〜４２のいずれかに記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
    (b)該疾患マーカーに結合した生体試料由来のRNAまたは該RNAから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
    (c)上記(b)の測定結果に基づいて、癌疾患の罹患を判断する工程。
  44. 工程(c)における癌疾患の罹患の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われるものである請求項４３に記載の癌疾患の検出方法。
  45. Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3またはHIFPH3を特異的に認識する抗体を含有する、癌疾患の疾患マーカー。
  46. 癌疾患の検出においてプローブとして使用される請求項４５に記載の疾患マーカー。
  47. 下記の工程(a)、(b)および(c)を含む癌疾患の検出方法：
    (a)被験者の生体試料から調製されたタンパク質と請求項４５または４６に記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
    (b)該疾患マーカーに結合した生体試料由来の蛋白質またはその部分ペプチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
    (c)上記(b)の測定結果に基づいて、癌疾患の罹患を判断する工程。
  48. 工程(c)における癌疾患の罹患の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われるものである請求項４７に記載の癌疾患の検出方法。
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