CN101448938A - 新肿瘤抗原肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新肿瘤抗原蛋白、肿瘤抗原肽以及这些物质在癌症免疫领域中的用途。更具体地说，本发明涉及含有来源于Lengsin、BJ－TSA－9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的部分肽、能够结合HLA抗原并因此被CTL识别的肽，以及包含上述肽和在药学上可接受的载体的药物组合物等。

Description

新肿瘤抗原肽
技术领域
[0001]本发明涉及新肿瘤抗原蛋白和由其获得的的肽以及它们在癌症免疫领域中的用途。
技术背景
[0002]已知免疫系统，尤其是T细胞，在清除活体癌(肿瘤)方面发挥重要作用。实际上，已在人癌症病灶中观察到对癌细胞表现出细胞毒活性的淋巴细胞浸润(非专利文献1)，并在没有多大困难的情况下从黑色素瘤中分离到识别自体肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(非专利文献2、3、4)。此外，通过转移CTL对黑色素瘤的临床治疗结果也表明了T细胞在癌症清除方面的重要性(非专利文献5)。
[0003]尽管在很长时间内并不清楚CTL攻击自体肿瘤细胞的靶分子，但近年来随着免疫学与分子生物学的发展，这类分子也逐渐清晰起来。具体而言，业已揭示，CTL通过T细胞受体(TCR)识别一种被称作癌抗原肽的肽与主要组织相容性复合物I类抗原(MHC-I类抗原，也称作HLA抗原)之间的复合物，并由此攻击自体肿瘤细胞。
[0004]癌抗原肽是通过癌特异性抗原蛋白在细胞内合成后的细胞内蛋白酶体降解而生成的。这样生成的癌抗原肽结合至内质网中的MHC-I类抗原(HLA抗原)，形成复合物，该复合物被运输到细胞表面，作为抗原被提呈。抗原特异性CTL识别作为抗原被提呈的复合物，并通过细胞毒活性或者产生淋巴因子而表现出抗癌作用。由于这一系列作用的阐明，有可能通过使用癌抗原蛋白或者癌抗原肽作为通常所说的癌症疫苗来增强癌症患者体内的癌特异性CTL，从而治疗癌症。
[0005]就肿瘤抗原蛋白而言，T.Boon等人于1991年首次从人黑色素瘤细胞中鉴定出一种名为MACE的蛋白(非专利文献6)。随后，主要由黑色素瘤细胞中鉴定出几种其它的肿瘤抗原蛋白。
[0006]为了将肿瘤抗原蛋白和肽应用于肿瘤治疗或诊断，必须鉴定可广泛应用于腺癌如肺癌的新肿瘤抗原蛋白和肽，所述腺癌远比黑素瘤更频繁发生。
[0007]Lengsin(含谷氨酸-氨连接酶(谷氨酰胺合酶)结构域1(GLULD1)UniGene Hs.149585)被鉴定为在人晶状体中高度表达的新基因，根据氨基酸序列的相似性已报告其为谷氨酰胺合酶家族的可能成员。然而，该基因的生理功能仍是未知的(非专利文献7)。
[0008]BJ-TSA-9(假定蛋白MGC14128)(UniGene Hs.379821)是一种在国立卫生研究院哺乳动物基因采集(MGC)计划中克隆的新基因，其生理功能仍是未知的(非专利文献8)。
[0009]C20orf42(或URP1，Kindlerin)作为在肺癌和结肠癌中高度表达的基因被克隆(非专利文献9)，与秀丽线虫(C.elegans)UNC-112具有高度相似性。业已报道，C20orf42和UNC-112一样与整联蛋白相互作用，C20orf42的表达由TGF-β诱导(非专利文献10)。C20orf42还被鉴定为在Kindler综合征中突变的Kindlerin基因，Kindler综合征是一种罕见的常染色体隐性皮肤病(非专利文献11、12)。
[0010]BUB1是涉及细胞周期M期的纺锤体关卡的丝氨酸/苏氨酸激酶，没有功能性BUB1导致异常染色体分离。另外，BUB1磷酸化Cdc2，并抑制APC/Ccdc20的泛素连接酶活性，对异常染色体分离产生预防作用(非专利文献13)。已报告BUB1在癌症组织中的表达和突变下降(非专利文献14、15)。
[0011]C10orf3是一种在国立卫生研究院哺乳动物基因采集(MGC)计划中克隆的新基因，其生理功能仍是未知的(非专利文献16)。
[0012]HIFPH3(eg19同源物3(egl nine homolog 3)，EGLN3)作为具有eg19类似活性的3种分子中的1种被克隆，其被鉴定为在秀丽线虫中调节缺氧诱导因子1(HIF1)活性的加双氧酶(非专利文献17)。其被认为在缺氧条件下通过HIF1调节活性，但3种eg19同源物之间的差异是未知的。
[0013]非专利文献1：Arch.Surg.，126：200(1990)
非专利文献2：Immunol.Today，8：385(1987)
非专利文献3：J.Immunol.，138：989(1987)
非专利文献4：Int.J.Cancer，52：52(1992)
非专利文献5：J.Natl.Cancer.Inst.，86：1159(1994)
非专利文献6：Science，254，1643-1647(1991)
非专利文献7：Mol.Vis.Jun.15；8：185-95(2002)
非专利文献8：Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99(26)：16899-903(2002)
非专利文献9：Biochim.Biophys.Acta1637：207-216(2003)
非专利文献10：J.Biol.Chem.，Feb20；279(8)：6824-33(2004)
非专利文献11：Hum.Molec.Genet.，12：925-935(2003)
非专利文献12：Am.J.Hum.Genet.，73：174-187(2003)
非专利文献13：Mol.Cell.，Nov5；16(3)：387-97(2004)
非专利文献14：Oncogene Jul11；21(30)：4673-9(2002)
非专利文献15：Leuk.Lymphoma.Feb；43(2)：385-91(2002)
非专利文献16：Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，Dec24；99(26)：16899-903(2002)
非专利文献17：Cell107：43-54(2001)
发明公开
本发明要解决的问题
[0014]本发明的目标是提供新肿瘤抗原蛋白和肽以及它们在癌症免疫领域的用途。
解决问题的方法
[0015]本发明人深入地尝试发现与正常组织相比在癌症组织中显示出表达水平和频率增加的基因，并选定6个基因：Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因，由此发现这些基因和由其表达的产物(即蛋白)可以用作癌症的疾病标志物。
[0016]然后，本发明人由Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因编码蛋白(Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3)的氨基酸序列选择可能结合HLA分子的部分肽，并检查它们与HLA分子的结合亲和力和CTL诱导活性。结果，发现这6种蛋白(尤其是BJ-TSA-9、C20orf42和C10orf3)为肿瘤抗原蛋白，得自它们的部分肽为肿瘤抗原肽。因此，Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3以及由它们获得的肽被认为可以用作癌症疫苗，用于表现出这些蛋白表达(尤其是表达增加)的多种癌症。
由如上所述的发现实现了本发明。
[0017]因此，本发明涉及以下内容：
(1)含有来源于Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的部分肽、能够结合HLA抗原并被CTL识别的肽；
(2)以上(1)的肽，其中HLA抗原为HLA-A24或HLA-A2抗原；
(3)以上(2)的肽，其含有SEQ ID NO：13-201中任一项的氨基酸序列；
(4)含有与SEQ ID NO：13-31、42-49、59-78、89-117、158-165、176-183和195-201中任一项的氨基酸序列相同的氨基酸序列的肽，只是2位的氨基酸被酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代，和/或C末端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代，所述肽能够结合HLA-A24抗原，并被CTL识别；
(5)含有与SEQ ID NO：32-41、50-58、79-88、118-157、166-175和184-194中任一项的氨基酸序列相同的氨基酸序列的肽，只是2位的氨基酸被亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺取代，和/或C末端氨基酸被缬氨酸或亮氨酸取代，所述肽能够结合HLA-A2抗原，并被CTL识别；
[0018](6)含有以上(1)-(5)中任一项的肽的表位肽；
(7)含有以上(1)-(6)中任一项的肽和在药学上可接受的载体的药物组合物；
(8)含有编码以上(1)-(6)中任一项的肽的多核苷酸的核酸；
(9)含有以上(8)的核酸和在药学上可接受的载体的药物组合物；
(10)含有Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3和在药学上可接受的载体的药物组合物；
[0019](11)以上(10)的药物组合物，其中Lengsin含有SEQ IDNO：2的氨基酸序列；
(12)以上(10)的药物组合物，其中BJ-TSA-9含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(13)以上(10)的药物组合物，其中C20orf42含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
(14)以上(10)的药物组合物，其中BUB1含有SEQ ID NO：8的氨基酸序列；
(15)以上(10)的药物组合物，其中C10orf3含有SEQ ID NO：10的氨基酸序列；
[0020](16)以上(10)的药物组合物，其中HIFPH3含有SEQ IDNO：12的氨基酸序列；
(17)一种含有核酸和在药学上可接受的载体的药物组合物，所述核酸包含编码Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸；
(18)以上(17)的药物组合物，其中编码Lengsin的多核苷酸包含SEQ ID NO：1的碱基序列，或编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(19)以上(17)的药物组合物，其中编码BJ-TSA-9的多核苷酸包含SEQ ID NO：3的碱基序列，或编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(20)以上(17)的药物组合物，其中编码C20orf42的多核苷酸包含SEQ ID NO：5的碱基序列，或编码SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
[0021](21)以上(17)的药物组合物，其中编码BUB1的多核苷酸包含SEQ ID NO：7的碱基序列，或编码SEQ ID NO：8的氨基酸序列；
(22)以上(17)的药物组合物，其中编码C10orf3的多核苷酸包含SEQ ID NO：9的碱基序列，或编码SEQ ID NO：10的氨基酸序列；
(23)以上(17)的药物组合物，其中编码HIFPH3的多核苷酸包含SEQ ID NO：11的碱基序列，或编码SEQ ID NO：12的氨基酸序列；
(24)一种制备抗原提呈细胞的方法，其中使具有抗原提呈能力的细胞在体外与以下的任一种接触：
(a)以上(1)-(6)中任一项的肽，
(b)以上(8)的核酸，
(c)Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3，和
(d)含有编码Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸的核酸；
(25)一种通过以上(24)的方法制备的抗原提呈细胞；
[0022](26)一种含有以上(25)的抗原提呈细胞和在药学上可接受的载体的药物组合物；
(27)一种诱导CTL的方法，其中使外周血淋巴细胞在体外与以下的任一种接触：
(a)以上(1)-(6)中任一项的肽，
(b)以上(8)的核酸，
(c)Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3，和
(d)含有编码Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸的核酸；
(28)通过以上(27)的方法诱导的CTL；
(29)一种含有以上(28)的CTL和在药学上可接受的载体的药物组合物；
(30)以上(7)、(9)-(23)、(26)或(29)中任一项的药物组合物，其用作CTL诱导物；
[0023](31)以上(7)、(9)-(23)、(26)或(29)中任一项的药物组合物，其用作癌症疫苗；
(32)一种特异性结合以上(1)-(5)中任一项的肽的抗体；
(33)一种含有以上(1)-(5)中任一项的肽和HLA抗原的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体；
(34)一种用于检测对肿瘤抗原肽特异性的CTL的试剂，所述肿瘤抗原肽来源于Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3，所述试剂含有作为组分的以上(33)的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体；
(35)一种由多核苷酸和/或其互补多核苷酸组成的疾病标志物，其中所述多核苷酸含有Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的碱基序列的至少15个连续核苷酸；
[0024](36)以上(35)的疾病标志物，其用作检测癌症的探针或引物；
(37)以上(35)或(36)的疾病标志物，其中来源于Lengsin基因的疾病标志物用于肺腺癌、肺鳞状细胞癌或胃癌；
(38)以上(35)或(36)的疾病标志物，其中来源于BJ-TSA-9基因的疾病标志物用于白血病、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、小细胞肺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌或淋巴瘤；
(39)以上(35)或(36)的疾病标志物，其中来源于C20orf42基因的疾病标志物用于肺鳞状细胞癌、肺腺癌、肝癌、胃癌、白血病、恶性淋巴瘤组织、直肠癌、结肠癌或胰腺癌；
(40)以上(35)或(36)的疾病标志物，其中来源于BUB1基因的疾病标志物用于乳腺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、卵巢癌、口腔鳞状细胞癌、肾癌、大肠癌(结肠癌、直肠癌)、胃癌、胰腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤或黑素瘤；
[0025](41)以上(35)或(36)的疾病标志物，其中来源于C10orf3基因的疾病标志物用于乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、小细胞肺癌或黑素瘤；
(42)以上(35)或(36)的疾病标志物，其中来源于HIFPH3基因的疾病标志物用于乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、胰腺癌、肝癌、肺腺癌或肺鳞状细胞癌；
(43)一种用于检测癌症的方法，所述方法包括以下步骤(a)、(b)和(c)：
(a)使由受试者的生物样品制备的RNA或由其转录的互补多核苷酸与以上(35)-(42)中任一项的疾病标志物杂交；
(b)通过使用所述疾病标志物作为指示剂检测与疾病标志物杂交的、由生物样品制备的RNA或由其转录的互补多核苷酸；和
(c)基于(b)中的检测结果确定受试者是否患有癌症；
(44)以上(43)的方法，其中在步骤(C)中，将受试者的检测结果与健康个体的结果进行比较且在受试者中观察到的与疾病标志物的杂交水平高于在健康个体中观察到的该水平时，则确定受试者患有癌症；
(45)一种用于癌症的疾病标志物，所述疾病标志物含有特异性识别Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的抗体；
[0026](46)以上(45)的疾病标志物，所述疾病标志物用作检测癌症的探针；
(47)一种用于检测癌症的方法，所述方法包括以下步骤(a)、(b)和(c)：
(a)使由受试者的生物样品制备的蛋白与以上(45)或(46)的疾病标志物结合；
(b)通过使用所述疾病标志物作为指示剂检测与疾病标志物结合的、由生物样品制备的蛋白或得自该蛋白的部分肽；和
(c)基于(b)中的检测结果确定受试者是否患有癌症；
(48)以上(47)的方法，其中在步骤(C)中，对受试者的检测结果与健康个体的结果进行比较且在受试者中观察到的与疾病标志物的结合水平高于在健康个体中观察到的该水平时，则确定受试者患有癌症。
本发明的作用
[0027]本发明的新肿瘤抗原肽、编码其的核酸等可以用作癌症疫苗。此外，所述肿瘤抗原肽还可以用作HLA四聚体等的组分，以检测CTL。
实施本发明的最佳方式
[0028]本文使用的氨基酸、(多)肽、(多)核苷酸等的缩写依照IUPAC-IUB(IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature，Eur.J.Biochem.，138：9(1984))的规则、“撰写含有碱基序列或氨基酸序列的说明书的指南”(日本特许办公室)和本领域常用的符号。
[0029]1)本发明的蛋白
本发明的蛋白为Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3。
本发明的蛋白Lengsin含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或类似于上述氨基酸序列的氨基酸序列。本发明的蛋白Lengsin可以为来源于天然来源(例如肺腺癌细胞系1-87)的蛋白或重组蛋白。在此，SEQ IDNO：2的氨基酸序列以登录号NM_016571、登录号NP_057655向GenBank数据库登记，并代表人Lengsin(含谷氨酸-氨连接酶(谷氨酰胺合酶)结构域1，也称为GLULD1)。人Lengsin公开于非专利文献7(Mol.Vis.Jun.15；8：185-95(2002))。
[0030]本发明的蛋白BJ-TSA-9含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列或类似于上述氨基酸序列的氨基酸序列。本发明的蛋白BJ-TSA-9可以为来源于天然来源(例如肺腺癌细胞系1-87)的蛋白或重组蛋白。在此，SEQ ID NO：4的氨基酸序列以登录号NM_032899、登录号NP_116288向GenBank数据库登记，并代表人BJ-TSA-9(假定蛋白MGC14128)。人BJ-TSA-9公开于非专利文献8(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99(26)：16899-903(2002))。
[0031]本发明的蛋白C20orf42含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列或类似于上述氨基酸序列的氨基酸序列。本发明的蛋白C20orf42可以为来源于天然来源(例如结肠癌细胞系SW480)的蛋白或重组蛋白。在此，SEQ ID NO：6的氨基酸序列以登录号NM_017671、登录号NP_060141向GenBank数据库登记，并代表人C20orf42(URP1，也称为Kindlerin)。人C20orf42公开于非专利文献9(Biochim.Biophys.Acta1637：207-216(2003))。
[0032]本发明的蛋白BUB1含有SEQ ID NO：8的氨基酸序列或类似于上述氨基酸序列的氨基酸序列。本发明的蛋白BUB1可以为来源于天然来源(例如胰腺癌细胞系PUN)的蛋白或重组蛋白。在此，SEQ ID NO：8的氨基酸序列以登录号NM_004336、登录号NP_004327向GenBank数据库登记，并代表人BUB1。人BUB1公开于文献(Genomics 46：379-388(1997))。
[0033]本发明的蛋白C10orf3含有SEQ ID NO：10的氨基酸序列或类似于上述氨基酸序列的氨基酸序列。本发明的蛋白C10orf3可以为来源于天然来源(例如肺腺癌细胞系1-87)的蛋白或重组蛋白。在此，SEQ ID NO：10的氨基酸序列以登录号NM_018131、登录号NP_060601向GenBank数据库登记，并代表人C10orf3。人C10orf3公开于非专利文献16(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，Dec 24；99(26)：16899-903(2002))。
[0034]本发明的蛋白HIFPH3含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列或类似于上述氨基酸序列的氨基酸序列。本发明的蛋白HIFPH3可以为来源于天然来源(例如肾癌细胞系SMKTR-1)的蛋白或重组蛋白。在此，SEQ ID NO：12的氨基酸序列以登录号NM_022073、登录号NP_071356向GenBank数据库登记，并代表人HIFPH3(eg19同源物3，也称为EGLN3)。人HIFPH3公开于非专利文献17(Cell 107：43-54(2001))。
[0035]Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3中的每一种在本文都还被称为“本发明的蛋白”。
[0036]具体地说，“含有SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的蛋白”包括由SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列组成的蛋白，以及由包含在N和/或C末端连接额外的氨基酸序列的SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的氨基酸序列组成的蛋白。“额外的氨基酸序列”可为来源于和本发明蛋白不同的其它结构基因的氨基酸序列。
[0037]具体地说，“含有与SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列类似的氨基酸序列的蛋白”包括以下的蛋白(a)-(c)：
(a)含有除缺失、取代和/或添加一个或多个氨基酸以外与SEQ IDNO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列相同的氨基酸序列、并具有作为肿瘤抗原蛋白的活性的蛋白；
(b)含有与SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列、并具有作为肿瘤抗原蛋白的活性的蛋白；
(c)由能够在严格条件下与编码SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸编码、并具有作为肿瘤抗原蛋白的活性的蛋白。
[0038]优选的实例包括由与SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列类似的氨基酸序列组成的蛋白。该蛋白的实例包括以下的蛋白(a′)-(c′)：
(a′)由除缺失、取代和/或添加一个或多个氨基酸以外与SEQ IDNO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列相同的氨基酸序列组成、并具有作为肿瘤抗原蛋白的活性的蛋白；
(b′)由与SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列组成、并具有作为肿瘤抗原蛋白的活性的蛋白；
(c′)由能够在严格条件下与编码SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸编码、并具有作为肿瘤抗原蛋白的活性的蛋白。
[0039]在以上(a)中“含有除缺失、取代和/或添加一个或多个氨基酸以外与SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白”是指人工生产的蛋白，即例如在活体中存在的修饰过的(变体)蛋白或等位基因变体。
在这方面，关于蛋白中的修饰(突变)的数量或位置没有限制，只要保持本发明蛋白的活性。标准(人们可基于其确定要缺失、取代和/或添加的氨基酸残基的数量或位置而不降低活性)可使用本领域众所周知的计算机程序获得，例如DNA Star软件。例如，突变数通常应在总氨基酸残基的10％之内，优选应在总氨基酸残基的5％之内。而且，考虑到保持结构，通过取代引入的氨基酸优选与被取代的氨基酸具有类似特征，所述特征包括极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、两亲性等。例如，Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe和Trp被分类为非极性氨基酸；Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn和Gln被分类为不带电的氨基酸；Asp和Glu被分类为酸性氨基酸；而Lys、Arg和His被分类为碱性氨基酸。本领域一般技术人员可以基于这些标准选择属于相同类别的适宜氨基酸。
[0040]在以上(b)中“含有与SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的蛋白”包括含有的氨基酸序列与SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列具有至少约70％、优选约80％、更优选约90％、再更优选约95％的序列同一性的蛋白，具体地说，为由SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的部分氨基酸序列组成的蛋白。
[0041]本文使用的术语“序列同一性”是指两种蛋白之间的同一性和同源性。“序列同一性”通过比较两个在待比较序列区域内最优比对的序列来确定。在本文中，待比较的最优比对的蛋白可具有添加或缺失(例如“空位”)。可通过使用例如Vector NTI、ClustalW算法(Nucleic Acid Res.，22(22)：4673-4680(1994))进行比对计算序列同一性。序列同一性可使用用于序列分析的软件(具体地说为Vector NTI或GENETYX-MAC)或由公共数据库提供的测序工具来确定。这样的公共数据库通常可在Web站点(http://www.ddbj.nig.ac.ip)获得。
[0042]在以上(c)中“能够在严格条件下与编码SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸”包括含有的碱基序列与编码SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的多核苷酸具有至少约40％、优选约60％、更优选约70％、再更优选约80％、甚至更优选约90％以及最优选约95％的序列同一性的多核苷酸。具体地说，例举的多核苷酸含有的碱基序列与SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的碱基序列具有至少约40％、优选约60％、更优选约70％、再更优选约80％、甚至更优选约90％以及最优选约95％的序列同一性。更具体地说，例举的多核苷酸由SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的碱基序列的部分序列组成。
[0043]可以按照自身已知的方法或与其等效的方法进行杂交，例如在基础教科书如“Molecular Cloning，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)”等中描述的方法。另外，可使用市售可得的文库按照其随附的说明书进行杂交。
本文使用的“严格条件”可如在文献(Berger和Kimmel，1987，“Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology”，152卷，Academic Press，San Diego Calif.；或“Molecular Cloning”第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，出处同上)中所述基于形成复合物的核酸或结合探针的核酸的解链温度(Tm)来确定。
[0044]例如，杂交可在含有6xSSC(20xSSC表示333mM柠檬酸钠、333mM NaCl)、0.5％ SDS和50％甲酰胺的溶液中于42℃进行或在含有6xSSC的溶液(无50％甲酰胺)中于65℃进行。
杂交后的洗涤可在约“1xSSC、0.1％ SDS、37℃”的条件下进行。优选地，在这样的洗涤条件下洗涤时，互补链保持与靶正向链结合。更严格的杂交条件可包括约“0.5xSSC、0.1％ SDS、42℃”的洗涤条件，再更严格的杂交条件为约“0.1xSSC、0.1％ SDS、65℃”，但其不限于此。
[0045]本发明的蛋白具有作为肿瘤抗原蛋白的活性。术语“作为肿瘤抗原蛋白的活性”是指通过用于肿瘤抗原蛋白活性的常规测定检测的活性。具体地说，其是指表达Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的细胞被CTL识别的特征，即细胞显现出对CTL的反应性，换句话说，本发明的蛋白或由其获得的的抗原肽活化或诱导CTL。
[0046]在该方面，“细胞”优选表达HLA抗原。因此，更具体地说，“作为肿瘤抗原蛋白的活性”是指以下特征：当本发明的蛋白在表达HLA抗原如HLA-A24或HLA-A2的细胞中表达时，源自本发明蛋白的肿瘤抗原肽和HLA抗原之间的复合物被提呈至细胞表面上，从而使该细胞被CTL识别，换句话说，CTL被活化(诱导)。
[0047]如上陈述的本发明蛋白的特征可易于通过已知方法或其等效方法确定，例如51Cr释放测定(J.Immunol.，159：4753，1997)、使用LDH细胞毒性检测试剂盒的LDH释放测定(Takara Bio，Inc.)、细胞因子检测等。详细测定方案将在后文阐述。
[0048]首先，用含编码本发明蛋白的DNA的表达载体和含编码HLA抗原的DNA的表达载体共转染宿主细胞，如293-EBNA细胞(Invitrogen)。编码HLA抗原的DNA包括编码HLA-A24抗原或HLA-A2抗原的DNA。编码HLA-A24抗原的DNA的实例包括HLA-A2402 cDNA(Cancer Res.，55：4248-4252(1995)，Genbank登录号M64740)。编码HLA-A2抗原的DNA的实例包括HLA-A0201 cDNA(GenBank登录号M84379)。
[0049]如上所述的转染可通过使用脂转染胺试剂(GIBCO BRL)的脂转染法等进行。然后，加入限于HLA抗原所用的CTL，并使其反应，之后例如通过诸如ELISA的方法检测活化的(反应性)CTL产生的多种细胞因子(例如IFN-γ)。本文能够使用的CTL可通过用本发明的蛋白刺激外周血淋巴细胞制备，或者按照Int.J.Cancer，39，390-396，1987，N.Eng.J.Med，333，1038-1044，1995的方法等建立。
[0050]本发明蛋白的CTL诱导活性还可以通过其中使用针对人的模型动物的测定在体内检验(WO 02/47474；Int.J.Cancer.100，565-570(2002))。
本发明的蛋白可通过用于由天然产物(例如癌细胞系)纯化蛋白的自身已知的方法制备，或通过后文所述方法制备，该方法包括培养携带核酸的转化体，所述核酸包含编码本发明蛋白的多核苷酸。
[0051]2)来源于本发明蛋白的肽
本发明的肽可被称为“本发明的肽”或“本发明的肿瘤抗原肽”，是含有Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的部分肽的肿瘤抗原肽，能够结合HLA抗原，并被CTL识别。因此，本发明的肽可以包含对应于本发明蛋白的氨基酸序列的任何位置的肽，并为任何长度，只要该肽含有如上文定义的本发明蛋白的部分氨基酸序列，并可以与HLA抗原形成被CTL识别的复合物。
[0052]可如下鉴定本发明的肽：合成候选肽，其为Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的部分片段，并对候选肽进行测定，以检验CTL是否识别候选肽与HLA抗原之间的复合物，也就是说，候选肽是否具有作为肿瘤抗原肽的活性。
可按照一般用于肽化学领域的方法进行该肽的合成。这样的方法可见于文献，包括Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；TheProteins，第2卷，Academic Press Inc.，New York，1976；Peptide-Gosei，Maruzen，Inc.，1975；Peptide-Gosei no Kiso to Jikken，Maruzen，Inc.，1985；和Iyakuhin no Kaihatsu(Zoku)，第14卷，Peptide-Gosei，Hirokawa-syoten，1991。
[0053]鉴定本发明的肿瘤抗原肽的方法将在后文详述。
针对某些HLA类型，例如HLA-A1、-A0201、-A0204、-A0205、-A0206、-A0207、-A11、-A24、-A31、-A6801、-B7、-B8、-B2705、-B37、-Cw0401和-Cw0602，已阐述了被提呈的、结合HLA抗原的肿瘤抗原肽的氨基酸序列的规律性(基序)。参见Immunogenetics，41：178页，1995等。例如，HLA-A24的基序已知具有8-11个氨基酸的氨基酸序列，其中在2位的氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，C末端氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸(J.Immunol.，152，3913页，1994，Immunogenetics，41：178页，1995.J.Immunol.，155：4307页，1994)。对于HLA-A2的基序，列于表1的那些是已知的(Immunogenetics，41，178页，1995，J.Immunol.，155：4749页，1995)。
[0054][表1]
 
HLA-A2型 在N-末端的2位的氨基酸 在C-末端的氨基酸
HLA-A0201 L、M V、L
HLA-A0204 L L
HLA-A0205 V、L、I、M L
HLA-A0206 V、Q V、L
HLA-A0207 L L
*所有肽都为8-11个氨基酸长。
[0055]最近，已有可能使用NIH的BIMAS软件(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)经互联网检索预期能够结合HLA抗原的肽序列。
关于肽的长度，结合多种HLA分子的抗原肽的分析揭示，其一般为约8-14个氨基酸(Immunogenetics，41：178，1995)。然而，对于HLA-DR、-DP和-DQ而言，还已知由14个以上的氨基酸组成的肽。
[0056]考虑到所述基序，易于由本发明蛋白的氨基酸序列选择对应于该肽的部分。例如，利用BIMAS软件，可容易地选择预期能够结合HLA抗原的序列。可如下鉴定本发明的肽：通过上述方法合成选定的候选肽，并检验该候选肽是否结合HLA抗原并被CTL识别，即该候选肽是否具有作为肿瘤抗原肽的活性。
具体地说，可通过在J.Immunol.，154，2257页，1995中所述的方法进行鉴定。因此，加入候选肽，以在体外刺激分离自人类受试者的外周血淋巴细胞，所述人类受试者对预期提呈所述候选肽的HLA抗原为阳性。在特异性识别用候选肽脉冲的HLA阳性细胞的CTL被诱发时，该候选肽可能为肿瘤抗原肽。例如，通过使用ELISA等检测CTL响应于抗原提呈细胞产生的多种细胞因子(例如IFN-γ)的量，可以检验是否发生CTL诱导。或者，还可以通过51Cr释放测定检验CTL诱导，在51Cr释放测定中，检测CTL针对用51Cr标记的抗原提呈细胞的细胞毒性(Int.J.Cancer，58：317页，1994)。
[0057]此外，可通过用候选肽脉冲诸如293-EBNA细胞(Invitrogen)的细胞检验CTL的诱导，其中所述细胞已导入编码预期存在候选肽的HLA抗原类型的cDNA的表达质粒，使细胞与限于预期提呈候选肽的前述类型的HLA抗原的CTL反应，并检测由CTL产生的多种细胞因子(例如IFN-γ)(J.Exp.Med.，187：277，1998)。
HLA抗原的实例包括HLA-A24抗原和HLA-A2抗原。为选择限于HLA-A24的肿瘤抗原肽，可使用HLA-A2402 cDNA(Cancer Res.，55：4248-4252(1995)，Genbank登录号M64740)作为编码HLA抗原的cDNA。为选择限于HLA-A2的肿瘤抗原肽，可使用HLA-A0201 cDNA(GenBank登录号M84379)作为编码HLA抗原的cDNA。
[0058]对于CTL，除了通过用肽刺激人外周血淋巴细胞获得的那些以外，还可以使用通过在文献(Int.J.Cancer，39，390-396，1987；N.Eng.J.Med，333，1038-1044，1995)中描述的方法建立的CTL。
本发明肽的体内活性可通过使用针对人的动物模型的测定(WO02/47474，Int J.Cancer100，565-570(2002))来确定。
[0059]在以上情况中，肿瘤抗原肽序列的规律性(基序)是已知的；然而，当肽的基序为未知时，HLA-B55或HLA-A26就是这种情况，本发明的肿瘤抗原肽可按照例如描述于WO97/46676的方法鉴定，只有能够识别HLA抗原和肿瘤抗原肽之间的复合物的CTL细胞系是可用的。
[0060]本发明肽的具体实例包括来源于以下的部分肽：由SEQID NO：2的氨基酸序列组成的Lengsin、由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的BJ-TSA-9、由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的C20orf42、由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成的BUB1、由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的C10orf3或由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成的HIFPH3，其能够结合HLA抗原，并被CTL识别。考虑到本发明肽结合的HLA抗原，优选实例包括能够结合HLA-A24或HLA-A2抗原的肽。肽的长度可优选为8-14个氨基酸，更优选为8-11个氨基酸。
[0061]具体地说，本发明的肽包括含SEQ ID NO：13-201中任一个的氨基酸序列、能够结合HLA抗原并被CTL识别的肽。该肽的长度可优选为9-14个氨基酸，更优选为9-11个氨基酸。更具体地说，作为结合HLA-A24的肿瘤抗原肽，例举的肽由SEQ ID NO：13-31、42-49、59-78、89-117、158-165、176-183和195-201中的任一个氨基酸序列组成，能够结合HLA-A24抗原，并被CTL识别(参见以下的表5、7、9、11、13和15)。优选地，例举的肽由SEQ ID NO：42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列组成。
更优选地，例举的肽由SEQ ID NO：158、22、23、26、27、198、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列组成。
[0062]此外，作为结合HLA-A2的肿瘤抗原肽，例举的肽由SEQ ID NO：32-41、50-58、79-88、118-157、166-175和184-194中的任一个氨基酸序列组成，能够结合HLA-A2抗原，并被CTL识别(参见以下的表6、8、10、12、14和16)。
[0063]在本发明范围内，本发明的肽不仅包括由SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的部分氨基酸序列组成的肽，而且包括通过部分修饰前述肽产生的变体(修饰)肽，只要该变体肽具有能够结合HLA抗原并被CTL识别的特征。具体地说，所包含的氨基酸序列除了已引入的至少一个氨基酸修饰以外与本发明肽的氨基酸序列(由Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的部分氨基酸序列组成，具体地说是SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列)相同，且具有作为肿瘤抗原肽的活性(即能够结合HLA抗原并被CTL识别)的变体肽，属于本发明的范围。
[0064]氨基酸残基的“修饰”是指氨基酸残基的取代、缺失和/或添加，包括向肽的N-和/或C-末端添加，优选为氨基酸残基的取代。当该修饰包括氨基酸残基取代时，可随意选择要取代的氨基酸残基的数量或位置，只要保持作为肿瘤抗原肽的活性；然而，优选所述取代包括1至数个氨基酸残基，因为肿瘤抗原肽一般为如上提及的约8-14个氨基酸长。
[0065]本发明的变体肽优选为8-14个氨基酸长(然而，就HLA-DR、-DP或-DQ而言，可接受由14个以上的氨基酸组成的肽)。
如上所述，对于某些HLA类型，例如HLA-A1、-A0201、-A0204、-A0205、-A0206、-A0207、-A11、-A24、-A31、-A6801、-B7、-B8、-B2705、-B37、-Cw0401和-Cw0602，已知结合HLA抗原并被提呈的抗原肽中的基序。此外，有可能经由互联网(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)检索预期能够结合HLA抗原的肽序列。因此，人们可以基于该基序等制备以上的变体肽。
[0066]例如，如上文所述，能够结合HLA-A24并被提呈的抗原肽的基序已知为特征如下的序列：在8-11个氨基酸的肽中，2位的氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，C末端氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸(J.Immunol.，152：3913页，1994；Immunogenetics，41：178页，1995；J.Immunol.，155：4307页，1994)。对于HLA-A2，基序已知为特征如下的序列：在8-11个氨基酸的肽中，2位的氨基酸为亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺，C末端氨基酸为缬氨酸或亮氨酸(Immunogenetics，41：178页，1995；J.Immunol.，155：4749页，1995)。此外，预期能够结合HLA抗原的某些肽序列经由互联网(httt://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/)公开。与以上基序的可用氨基酸具有类似特征的氨基酸也是可接受的。因此，本发明包括这样的变体肽：其含有的氨基酸序列与本发明肽的氨基酸序列相同，只是根据基序在可用于取代的位置(就HLA-A24和HLA-A2而言，为2位和C-末端)的氨基酸被另一个氨基酸取代，优选被来自例如上述互联网站点的预期提供结合活性的氨基酸取代，具有结合HLA抗原的活性，并被CTL识别。
[0067]更优选地，本发明包括这样的变体肽：其在上述位置的氨基酸残基被根据基序已知可用的另一个氨基酸取代，并具有作为肿瘤抗原肽的活性。因此，对于如示于SEQ ID NO：13-31、42-49、59-78、89-117、158-165、176-183和195-201的HLA-A24结合肽，变体肽的实例包括这样的肽：其含有的氨基酸序列与SEQ ID NO：13-31、42-49、59-78、89-117、158-165、176-183和195-201中的任一个氨基酸序列相同，只是在2位的氨基酸被酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代，和/或C末端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代，能够结合HLA-A24抗原，并被CTL识别。尤其是，更优选其2位的氨基酸被酪氨酸取代的肽。
[0068]更优选地，变体肽由这样的氨基酸序列组成：其与SEQID NO：42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179和183中的任一个氨基酸序列相同，只是2位的氨基酸被酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代，和/或C末端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代，该变体肽能够结合HLA-A24抗原，并被CTL识别。更优选地，变体肽由这样的氨基酸序列组成：其与SEQ ID NO：158、22、23、26、27、198、200、201、177、178、179和183中的任一个氨基酸序列相同，只是在2位的氨基酸和/或C末端的氨基酸如上所述被取代，该变体肽能够结合HLA-A24抗原，并被CTL识别。
[0069]就示于SEQ ID NO：32-41、50-58、79-88、118-157、166-175和184-194的HLA-A2结合肽而言，优选的变体肽含有的氨基酸序列与SEQ ID NO：32-41、50-58、79-88、118-157、166-175和184-194中的任一个氨基酸序列相同，只是2位的氨基酸被亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺取代，和/或C末端氨基酸被缬氨酸或亮氨酸取代，能够结合HLA-A2抗原，并被CTL识别。
[0070]本发明的肽还包括含有如上所述的本发明肿瘤抗原肽的表位肽。
最近，业已表明，由连接在一起的多个(多于1个)CTL表位(抗原肽)组成的肽(“表位肽”)有效诱导CTL。例如，业已报道，由源自肿瘤抗原蛋白PSA(各自限于HLA-A2-、-A3、-A11或B53)的CTL表位连接在一起组成的肽(约30聚体)在体内诱导对各自的CTL表位特异性的CTL(Journal of Immunology1998，161：3186-3194)。
[0071]另外，业已表明，由CTL表位和辅助表位连接在一起组成的肽(表位肽)有效诱导CTL。在本文中，“辅助表位”是指能够激活CD4阳性T细胞的肽(Immunity.，1：751，1994)，其实例包括乙型肝炎病毒来源的HBVc128-140、破伤风毒素来源的TT947-967等。由辅助表位激活的CD4+T细胞表现出一些活性，包括诱导并维持CTL，以及活化诸如巨噬细胞的效应子，并因此被认为在免疫学抗肿瘤应答中有重要作用。作为由辅助表位与CTL表位连接在一起组成的肽的具体实例，有报道指出，由6种HBV来源的HLA-A2限制性抗原肽、3种HLA-A11限制性抗原肽及辅助表位组成的DNA(微基因)在体内有效诱导针对各自表位的CTL(Journal of Immunology1999，162：3915-3925)。实际上，由CTL表位(对应于黑色素瘤抗原gp100的280-288位的肿瘤抗原肽)和辅助表位(来源于破伤风毒素的T辅助表位)连接组成的肽已进行临床试验(Clinical Cancer Res.，2001，7：3012-3024)。
因此，本发明的肿瘤抗原肽还包括由含有连接在一起的本发明肽并具有CTL诱导活性的多个表位组成的肽(表位肽)。
[0072]在这方面，“表位肽”被定义为(1)由2个或多个CTL表位(肿瘤抗原肽)连接在一起组成的肽，或(2)由CTL表位和辅助表位连接在一起组成的肽，其在抗原提呈细胞中被加工，产生肿瘤抗原肽，然后被细胞提呈，并诱导CTL。
[0073]当CTL表位与本发明的肽连接时，CTL表位可来源于示于SEQ ID NO：2的Lengsin、示于SEQ ID NO：4的BJ-TSA-9、示于SEQ ID NO：6的C20orf42、示于SEQ ID NO：8的BUB1、示于SEQID NO：10的C10orf3或示于SEQ ID NO：12的HIFPH3的氨基酸序列，并限于HLA-A1、-A0201、-A0204、-A0205、-A0206、-A0207、-A11、-A24、-A31、-A6801、-B7、-B8、-B2705、-B37、-B55、-Cw0401、-Cw0602等。来源于其它肿瘤抗原蛋白的CTL表位也是可用的。多个CTL表位可以连接在一起，基于结合多种HLA分子的抗原肽的分析，CTL表位的长度可为约8-14个氨基酸(Immunogenetics，41：178，1995)。
当辅助表位连接本发明的肽时，辅助表位可为前述乙型肝炎病毒来源的HBVc128-140、破伤风毒素来源的TT947-967等。辅助表位长度可为约13-30个氨基酸，优选为约13-17个氨基酸。
[0074]由多个表位连接在一起组成的肽(表位肽)可通过前述的常规肽合成方法来制备。也可以通过常规DNA合成方法以及基于多核苷酸(其编码由多个表位连接在一起组成的表位肽)的序列信息进行基因工程来制备。也就是说，可通过将编码表位肽的多核苷酸插入已知的表达载体，使用获得的重组表达载体转化宿主细胞，培养转化子并从培养物中回收目的表位肽，制备由多个表位连接在一起组成的表位肽。这些方法可以根据例如文献中描述的方法(Molecular Cloning，T.Maniatis等，CSH Laboratory(1983)，DNA Cloning，DM.Glover，IRLPRESS(1985))进行。
如上所述产生的由多个表位连接在一起组成的表位肽，可通过如上所述的测定检验体外CTL诱导活性，或者利用WO02/47474或Int J.Cancer.100，565-570(2002)中描述的测定使用针对人的模型动物检验体内CTL诱导活性。
[0075]另外，可以修饰本发明的肿瘤抗原肽的N-末端氨基酸的氨基或C-末端氨基酸的羧基。经历此修饰的肽也属于本发明的范围。
N-末端氨基酸氨基的修饰包括1-3个选自例如C1-6烷基、苯基、环烷基和酰基的基团。具体地说，酰基包括C1-6烷酰基、被苯基取代的C1-6烷酰基、被C5-7环烷基取代的羰基、C1-6烷基磺酰基、苯基磺酰基、C2-6烷氧基羰基、被苯基取代的烷氧基羰基、被C5-7环烷氧基取代的羰基、苯氧基羰基等。
在C-末端氨基酸的羧基被修饰的肽可以为酯或酰胺形式。具体地说，所述酯包括C1-6烷基酯、被苯基取代的C0-6烷基酯、C5-7环烷基酯等。具体地说，所述酰胺包括酰胺、被1个或2个C1-6烷基取代的酰胺、被1个或2个C0-6烷基(其中烷基被苯基取代)取代的酰胺、形成5-元至7-元氮杂环烷(包含酰胺基团的氮原子)的酰胺等。
[0076]3)本发明的核酸
具体地说，本发明的核酸是指
(1)包含编码Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸的核酸，和
(2)包含编码本发明肽的多核苷酸的核酸。
[0077](1)编码Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸以及含有该多核苷酸的核酸
编码Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸可以为多种细胞或组织的cDNA或mRNA、cRNA或基因组DNA(例如来源于前列腺癌的那些)，或合成DNA。其可为单链的或双链的。具体地说，所述多核苷酸包括以下的：
(a)含有SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的碱基序列的多核苷酸；
(b)含有编码SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸；和
含有的碱基序列类似于多核苷酸(a)或(b)的碱基序列的多核苷酸。
[0078]在这方面，SEQ ID NO：1的碱基序列对应于人Lengsin基因的碱基序列，其以登录号NM_016571向GenBank数据库登记。SEQ ID NO：2的氨基酸序列对应于人Lengsin的氨基酸序列，其以登录号NM_016571、登录号NP_057655向GenBank数据库登记。人Lengsin基因公开于非专利文献7(Mol.Vis.Jun.15；8：185-95(2002))。
[0079]SEQ ID NO：3的碱基序列对应于人BJ-TSA-9基因的碱基序列，其以登录号NM_032899向GenBank数据库登记。SEQ ID NO：4的氨基酸序列对应于人BJ-TSA-9的氨基酸序列，其以登录号NM_032899、登录号NP_116288向GenBank数据库登记。人BJ-TSA-9基因公开于非专利文献8(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，99(26)：16899-903(2002))。
[0080]SEQ ID NO：5的碱基序列对应于人C20orf42基因的碱基序列，其以登录号NM_017671向GenBank数据库登记。SEQ ID NO：6的氨基酸序列对应于人C20orf42的氨基酸序列，其以登录号NM_017671、登录号NP_060141向GenBank数据库登记。人C20orf42基因公开于非专利文献9(Biochim.Biophys.Acta1637：207-216(2003))。
[0081]SEQ ID NO：7的碱基序列对应于人BUB1基因的碱基序列，其以登录号NM_004336向GenBank数据库登记。SEQ ID NO：8的氨基酸序列对应于人BUB1的氨基酸序列，其以登录号NM_004336、登录号NP_004327向GenBank数据库登记。人BUB1基因公开于文献(Genomics46：379-388(1997))。
[0082]SEQ ID NO：9的碱基序列对应于人C10orf3基因的碱基序列，其以登录号NM_018131向GenBank数据库登记。SEQ ID NO：10的氨基酸序列对应于人C10orf3的氨基酸序列，其以登录号NM_018131、登录号NP_060601向GenBank数据库登记。人C10orf3基因公开于非专利文献16(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，Dec24；99(26)：16899-903(2002))。
[0083]SEQ ID NO：11的碱基序列对应于人HIFPH3基因的碱基序列，其以登录号NM_022073向GenBank数据库登记。SEQ ID NO：12的氨基酸序列对应于人HIFPH3的氨基酸序列，其以登录号NM_022073、登录号NP_071356向GenBank数据库登记。人HIFPH3基因公开于非专利文献17(Cell107：43-54(2001))。
[0084]具体地说，前述的(a)含有SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的碱基序列的多核苷酸和(b)含有编码SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸包括由SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的碱基序列组成的多核苷酸和由编码SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的碱基序列组成的多核苷酸。其它实例包括由含有SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的碱基序列或编码SEQID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的碱基序列(在其5′-和/或3′-末端添加额外的碱基序列)组成的多核苷酸。“额外的碱基序列”可以为编码非Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3的结构基因的碱基序列。
此编码Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸的特征在于由该多核苷酸编码的蛋白具有作为肿瘤抗原蛋白的活性。其活性和测定方法描述于“1)本发明的蛋白”。
[0085]可使用在GenBank登录号NM_016571中公开的或本文在SEQ ID NO：1中公开的碱基序列的适宜部分作为杂交探针或PCR引物，通过筛选由例如肺腺癌细胞系(如1-87)获得的cDNA文库，克隆含有SEQ ID NO：1的碱基序列的多核苷酸。
[0086]可使用在GenBank登录号NM_032899中公开的或本文在SEQ ID NO：3中公开的碱基序列的适宜部分作为杂交探针或PCR引物，通过筛选由例如肺腺癌细胞系(如1-87)获得的cDNA文库，克隆含有SEQ ID NO：3的碱基序列的多核苷酸。
[0087]可使用在GenBank登录号NM_017671中公开的或本文在SEQ ID NO：5中公开的碱基序列的适宜部分作为杂交探针或PCR引物，通过筛选由例如结肠癌细胞系(例如SW480(ATCC编号：CCL-228))获得的cDNA文库，克隆含有SEQ ID NO：5的碱基序列的多核苷酸。
[0088]可使用在GenBank登录号NM_004336中公开的或本文在SEQ ID NO：7中公开的碱基序列的适宜部分作为杂交探针或PCR引物，通过筛选由例如胰腺癌细胞系(如PUN)获得的cDNA文库，克隆含有SEQ ID NO：7的碱基序列的多核苷酸。
[0089]可使用在GenBank登录号NM_018131中公开的或本文在SEQ ID NO：9中公开的碱基序列的适宜部分作为杂交探针或PCR引物，通过筛选由例如肺腺癌细胞系(如1-87)获得的cDNA文库，克隆含有SEQ ID NO：9的碱基序列的多核苷酸。
[0090]可使用在GenBank登录号NM_022073中公开的或本文在SEQ ID NO：11中公开的碱基序列的适宜部分作为杂交探针或PCR引物，通过筛选由例如肾癌细胞系(如SMKTR-1)获得的cDNA文库，克隆含有SEQ ID NO：11的碱基序列的多核苷酸。
[0091]本领域一般技术人员可按照Molecular Cloning，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)等中所述方法容易地进行克隆。
[0092]具体地说，所含碱基序列与以上(a)或(b)的多核苷酸的碱基序列类似的多核苷酸包括以下的：
(c)在严格条件下能够与多核苷酸(a)或(b)的互补链杂交的多核苷酸，其编码的蛋白具有作为肿瘤抗原蛋白的活性；
(d)含有的碱基序列与多核苷酸(a)或(b)具有至少70％序列同一性的多核苷酸，其编码的蛋白具有作为肿瘤抗原蛋白的活性；和
(e)一种多核苷酸，其编码蛋白含有的氨基酸序列与多核苷酸(a)或(b)编码的氨基酸序列相同，只是缺失、取代和/或添加一个或多个氨基酸，其中所述蛋白具有作为肿瘤抗原蛋白的活性。
[0093]优选实例包括由与以上的多核苷酸(a)或(b)的碱基序列类似的碱基序列组成的多核苷酸。由与以上的多核苷酸(a)或(b)的碱基序列类似的碱基序列组成的多核苷酸包括以下的多核苷酸(c′)-(e′)：
(c′)在严格条件下能够与多核苷酸(a)或(b)的互补链杂交的多核苷酸，其编码的蛋白具有作为肿瘤抗原蛋白的活性；
(d′)由与多核苷酸(a)或(b)具有至少70％序列同一性的碱基序列组成的多核苷酸，其编码的蛋白具有作为肿瘤抗原蛋白的活性；和
(e′)一种多核苷酸，其编码蛋白由与多核苷酸(a)或(b)编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列组成，不同的是其中缺失、取代和/或添加一个或多个氨基酸，其中所述蛋白具有作为肿瘤抗原蛋白的活性。
[0094]“在严格条件下能够与以上多核苷酸(a)或(b)的互补链杂交的多核苷酸”的实例包括含有以下碱基序列的多核苷酸：其与以上多核苷酸(a)或(b)的碱基序列具有至少约40％、优选约60％、更优选约70％、再更优选约80％、还更优选约90％、最优选约95％的序列同一性，具体地说，包括由以上多核苷酸(a)或(b)的部分序列组成的多核苷酸。
[0095]可以按照自身已知的方法或与其等效的方法进行杂交，例如在基础教科书“Molecular Cloning，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)”中描述的方法等。另外，可使用市售可得的文库按照其随附的说明书进行杂交。
本文使用的“严格条件”可如在文献(Berger和Kimmel，1987，“Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology”，152卷，Academic Press，San Diego CA；或“Molecular Cloning”第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))中所述基于形成复合物的核酸或结合探针的核酸的解链温度(Tm)确定。
[0096]例如，杂交可在含有6xSSC(20xSSC对应于333mM柠檬酸钠、333mM NaCl)、0.5％SDS和50％甲酰胺的溶液中于42℃进行，或在含有6xSSC的溶液(无50％甲酰胺)中于65℃进行。
杂交后的洗涤可在约“1xSSC、0.1％ SDS、37℃”的条件下进行。优选地，在这样的洗涤条件下洗涤时，互补链保持与靶正向链结合。更严格的杂交条件可包括在约“0.5xSSC、0.1％ SDS、42℃”的条件下洗涤，再更严格的杂交条件为约“0.1xSSC、0.1％ SDS、65℃”，但其不限于此。
[0097]“含有的碱基序列与以上(a)或(b)的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸”包括含有的碱基序列与以上(a)或(b)的多核苷酸的碱基序列具有至少约70％、优选约80％、更优选约90％和最优选约95％的序列同一性的多核苷酸，具体地说，包括由以上(a)或(b)的多核苷酸的部分序列组成的多核苷酸。
[0098]本文使用的术语“序列同一性”是指两个多核苷酸之间的同一性或同源性。通过比较两个在对应于待比较序列的区域内最优比对的序列确定“序列同一性”。在本文中，待比较的两个多核苷酸的最佳比对可具有添加或缺失(例如“空位”)。可通过使用例如VectorNTI、ClustalW算法(Nucleic Acid Res.，22(22)：4673-4680(1994))进行比对计算此序列同一性。序列同一性可使用序列分析软件(具体地说为Vector NTI或GENETYX-MAC)或由公共数据库提供的测序工具来测定。这样的公共数据库通常可在Web站点(http://www.ddbj.nig.ac.ip)获得。
[0099]具有此序列同一性的多核苷酸可按照前述杂交方法或常规PCR反应或后文描述的用于修饰多核苷酸的反应(缺失、添加或取代)制备。
[0100]“多核苷酸，其编码蛋白含有的氨基酸序列与以上的多核苷酸(a)或(b)编码的蛋白的氨基酸序列相同，只是缺失、取代和/或添加一个或多个氨基酸”包括编码人工产生的变体蛋白或活体中存在的等位基因变体的核酸。
在这方面，对于氨基酸修饰(突变)的数目或位置没有限制，只要保持本发明蛋白的活性。标准(人们可基于其确定要缺失、取代和/或添加的氨基酸残基的数量或位置而不降低活性)可使用本领域众所周知的计算机程序获得，例如DNA Star软件。例如，突变数通常应在总氨基酸残基的10％之内，优选应在总氨基酸残基的5％之内。而且，考虑到结构保持，通过取代引入的氨基酸优选与被除去的氨基酸具有类似特征，所述特征例如为极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、两亲性等。例如，Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe和Trp被分类为非极性氨基酸；Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn和Gln被分类为不带电的氨基酸；Asp和Glu被分类为酸性氨基酸；而Lys、Arg和His被分类为碱性氨基酸。本领域一般技术人员可以基于这些标准选择相同类别内的适宜氨基酸。
[0101]编码这些变体蛋白的多核苷酸可通过多种方法制备，例如在Molecular Cloning，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中描述的定点诱变和PCR技术。其还可以使用市售可得的试剂盒通过已知方法诸如Gapped duplex或Kunkel法制备。
[0102]编码如上所述的本发明蛋白的多核苷酸编码具有作为肿瘤抗原蛋白活性的蛋白。“具有作为肿瘤抗原蛋白的活性”是指蛋白在用于肿瘤抗原蛋白活性的常规测定中为阳性。具体地说，其是指以下特征：表达编码本发明蛋白的多核苷酸的细胞被CTL识别，即细胞表现出对CTL的反应性，换句话说，本发明的蛋白或由其获得的肿瘤抗原肽活化或诱导CTL。其活性和测定方法描述于以上的“1)本发明的蛋白”。
[0103]含有本发明多核苷酸的核酸可以为单链的或双链的，并可以为DNA或RNA。当本发明的多核苷酸为双链时，可以通过将上述多核苷酸掺入表达载体中构建用于表达本发明蛋白的表达载体。因此，本发明的核酸包括通过将本发明的双链多核苷酸插入表达载体构建的重组表达载体。
[0104]适宜的表达载体可以根据要使用的宿主、用途等选择，并包括质粒、噬菌体载体、病毒载体等。
当宿主为大肠杆菌时，载体可以为质粒载体，如pUC118、pUC119、pBR322和pCR3；或噬菌体载体，如λZAPII和λgt11。当宿主为酵母时，载体可以为pYES2、pYEUra3等。当宿主为昆虫细胞时，载体可以为pAcSGHisNT-A等。当宿主为动物细胞时，载体可以为质粒载体，例如pCEP4、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV和pRc/CMV；或者为病毒载体，例如逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。
表达载体可以任选地包含诸如能够诱导表达的启动子、编码信号序列的基因、用于选择的标记基因和终止子的因子。
[0105]此外，表达载体可以含有额外的序列，用于将蛋白表达为具有硫氧还蛋白、His-标签、GST(谷胱甘肽S-转移酶)等的融合蛋白，以便有利于蛋白的分离和纯化。在此情况下能够使用的载体包括含有在宿主细胞如pGEX4T中有功能的适宜启动子(lac、tac、trc、trp、CMV、SV40早期启动子等)的GST融合蛋白载体；含有Tag序列(Myc、His等)的载体，如pcDNA3.1/Myc-His；以及能够表达具有硫氧还蛋白和His的融合蛋白的载体，如pET32a。
通过用在以上获得的表达载体转化宿主细胞，可以制备含有本发明载体的转化体。
[0106]本文可以使用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和动物细胞。大肠杆菌的实例包括大肠杆菌K-12的菌株，例如HB101、C600、JM109、DH5α和AD494(DE3)。酵母的实例包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。动物细胞的实例包括L929、BALB/c3T3、C127、CHO、COS、Vero、Hela和293-EBNA细胞。昆虫细胞的实例包括sf9。
可以使用适于以上各自对应的宿主细胞的常规方法将表达载体导入宿主细胞中。具体地说，其可以用磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电穿孔法或使用用于基因转移的脂质(Lipofectamine，Lipofectin；Gibco-BRL)的方法进行。在导入后，在含有选择标记的常规培养基中培养细胞，由此可以选择含有表达载体的转化体。
[0107]可以通过在合适的条件下培养转化体生产本发明的蛋白。产生的蛋白可以按照标准生物化学方法进一步分离并纯化。纯化方法包括盐析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。当本发明的蛋白表达为如上所述的具有硫氧还蛋白、His标签、GST等的融合蛋白时，其可以通过利用这些融合蛋白或标签的特征的适宜纯化方法分离和纯化。
[0108](2)编码本发明肽的多核苷酸和含有该多核苷酸的核酸
如上所述，含有编码本发明肽的多核苷酸的核酸属于本发明核酸的范围。
编码本发明肽的多核苷酸可以为DNA或RNA，并可以为单链的或双链的。编码本发明肽的多核苷酸可以基于关于肽的氨基酸序列或编码其的DNA的信息容易地制备。具体地说，其可以通过常规方法如DNA合成或PCR扩增来制备。
[0109]具体地说，编码本发明肽的多核苷酸包括编码如上所述的表位肽的多核苷酸。
含有编码本发明肽的多核苷酸的核酸可以为单链的或双链的，并还可以为DNA或RNA。当本发明的多核苷酸为双链时，用于表达本发明肽(表位肽)的重组表达载体可以通过将上述多核苷酸导入表达载体中构建。
本文使用的表达载体、宿主细胞、转化宿主细胞的方法等类似于以上(1)中所述的那些。
[0110]4)本发明的抗原提呈细胞
可通过使具有抗原提呈能力的细胞在体外与上述的任一种本发明的蛋白、肽和核酸接触来制备抗原提呈细胞。具体地说，本发明提供制备抗原提呈细胞的方法，其特征在于使分离自肿瘤患者的具有抗原提呈能力的细胞在体外与任一种本发明的蛋白、肽和核酸接触，并由此制备抗原提呈细胞。
[0111]在本文中，“具有抗原提呈能力的细胞”不限于具体的细胞，可为任何在表面上表达能够提呈本发明肽的HLA抗原的细胞；然而，优选已知具有特别高的抗原提呈能力的树突细胞。
此外，本发明的任何蛋白、肽和核酸均可用于由具有抗原提呈能力的细胞制备本发明的抗原提呈细胞。
[0112]本发明的抗原提呈细胞可以如下制备：由肿瘤患者分离具有抗原提呈能力的细胞，用本发明的蛋白或肽在体外脉冲所述细胞，并使所述细胞提呈HLA抗原和本发明肽之间的复合物(CancerImmunol.Immunother.，46：82，1998；J.Immunol.158：1796页，1997；Cancer Res.，59：1184，1999)。在使用树突细胞时，本发明的抗原提呈细胞例如可如下制备：使用Ficoll法由肿瘤患者的外周血分离淋巴细胞，除去非粘附细胞，在GM-CSF和IL-4存在下温育粘附细胞，以诱导树突细胞，并用本发明的蛋白或肽温育和脉冲所述树突细胞。
当本发明的抗原提呈细胞是通过将本发明的核酸导入具有抗原提呈能力的细胞中制备时，核酸可为DNA或RNA形式。具体地说，可以按照在Cancer Res.，56：5672，1996或J.Immunol.，161：5607页，1998中的教导使用DNA，并按照例如J.Exp.Med.，184：465页，1996中的教导使用RNA。
[0113]本发明的抗原提呈细胞的特征在于，该细胞提呈本发明的肽和HLA抗原之间的复合物，具体地说，包括其为树突细胞并且在细胞表面上提呈由以下氨基酸序列组成的肽和HLA-A24抗原之间的复合物的抗原提呈细胞，所述氨基酸序列如下：SEQ ID NO：42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列(优选为158、22、23、26、27、198、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列)。这样的抗原提呈细胞可以如下制备：由HLA-A24+前列腺癌患者分离具有抗原提呈能力的细胞，用由SEQ ID NO：42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列(优选为158、22、23、26、27、198、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列)组成的肽体外脉冲所述细胞，并使所述细胞提呈所述肽和HLA-A24抗原之间的复合物。
[0114]5)本发明的CTL
任一种本发明的蛋白、肽和核酸在与外周血淋巴细胞接触时均可以用于在体外诱导CTL。具体地说，本发明提供诱导CTL的方法，其中使得自肿瘤患者的外周血淋巴细胞与任一种本发明的蛋白、肽和核酸在体外接触，并由此诱导CTL。
[0115]对于黑素瘤，过继免疫治疗已显示出疗效，其中大量离体培养得自患者的肿瘤浸润T细胞，并返回到同一患者中(J.Natl.Cancer.Inst.，86：1159，1994)。此外，在小鼠黑素瘤中，通过用肿瘤抗原肽TRP-2在体外刺激脾细胞，以诱导对肿瘤抗原肽特异性的CTL增殖，并将CTL给予黑素瘤移植小鼠，已观察到转移抑制(J.Exp.Med.，185：453，1997)。这由特异性识别抗原提呈细胞上的HLA抗原和肿瘤抗原肽之间的复合物的CTL的体外增殖产生。因此，一般认为这样的治疗方法是有效的：该方法包括用本发明的蛋白、肽或核酸在体外刺激患者的外周血淋巴细胞，以增殖肿瘤特异性CTL，并将CTL返回患者中。
[0116]用于过继免疫治疗的CTL可以如下制备：由患者分离外周血淋巴细胞，并用本发明的蛋白、肽或核酸在体外刺激淋巴细胞(Journal of Experimental Medicine1999，190：1669)。
[0117]本发明的CTL的特征在于其通过使外周血淋巴细胞与任一种本发明的蛋白、肽和核酸体外接触而被诱导，并可以为单个CTL克隆或由多个CTL克隆组成的CTL混合物(群)。此CTL的具体实例为特异性识别由SEQ ID NO：42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列组成的肽和HLA-A24抗原之间的复合物的CTL。此CTL的更优选的实例为特异性识别由SEQ ID NO：158、22、23、26、27、198、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列组成的肽和HLA-A24抗原之间的复合物的CTL。
[0118]6)本发明的药物组合物
如上所述的本发明的蛋白、肽、核酸、抗原提呈细胞和CTL可以为对每种物质适宜形式的药物组合物的活性成分。本发明的药物组合物可以为CTL诱导物的活性成分，即癌症疫苗，详见下文。
[0119](1)含有本发明的蛋白作为活性成分的CTL诱导物
本发明的蛋白(Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3、HIFPH3)具有诱导CTL的活性，因此，本发明的蛋白可以用作肿瘤治疗或预防药物的活性成分(癌症疫苗)。因此，含有本发明的蛋白作为活性成分的CTL诱导物针对肿瘤发挥治疗或预防作用。所述蛋白在给予肿瘤患者时，被抗原提呈细胞掺入，并在胞内降解；通过胞内降解产生的肿瘤抗原肽结合HLA抗原，形成复合物；然后该复合物被提呈至抗原提呈细胞表面；对该复合物特异性的CTL在体内有效增殖，并破坏肿瘤细胞。以此方式实现肿瘤的治疗或预防。
[0120]可以将含有本发明蛋白作为活性成分的CTL诱导物给予Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3蛋白为阳性的任何肿瘤患者。
具体地说，含有Lengsin作为活性成分的CTL诱导物可以用于预防或治疗癌症(肿瘤)，例如肺腺癌、肺鳞状细胞癌或胃癌。
含有BJ-TSA-9作为活性成分的CTL诱导物可以用于预防或治疗癌症(肿瘤)，例如白血病、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、小细胞肺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌或淋巴瘤。
[0121]含有C20orf42作为活性成分的CTL诱导物可以用于预防或治疗癌症(肿瘤)，例如肺鳞状细胞癌、肺腺癌、肝癌、胃癌、白血病、恶性淋巴瘤组织、直肠癌、结肠癌或胰腺癌。
含有BUB1作为活性成分的CTL诱导物可以用于预防或治疗癌症(肿瘤)，例如乳腺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、卵巢癌、口腔鳞状细胞癌、肾癌、大肠癌(结肠癌、直肠癌)、胃癌、胰腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤或黑素瘤。
[0122]含有C10orf3作为活性成分的CTL诱导物可以用于预防或治疗癌症(肿瘤)，例如乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、小细胞肺癌或黑素瘤。
含有HIFPH3作为活性成分的CTL诱导物可以用于预防或治疗癌症(肿瘤)，例如乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、胰腺癌、肝癌、肺腺癌或肺鳞状细胞癌。
[0123]含有本发明蛋白作为活性成分的CTL诱导物可以作为与药学可接受的载体(例如适宜的佐剂)的混合物给予，或与该载体一起给予，以便能有效建立细胞免疫。
[0124]可用的佐剂的实例包括描述于文献(Clin.Microbiol.Rev.，7：277-289，1994)中的那些。具体地说，包括以下的：微生物来源的组分或其衍生物、细胞因子、植物来源的组分或其衍生物、海洋生物来源的组分或其衍生物、诸如氢氧化铝的矿物凝胶、表面活性剂(如溶血卵磷脂及
Figure A200780018810D00421
多元醇、聚阴离子、肽、油乳化剂(乳化制剂))等。另外，还包括脂质体制剂、其中成分结合在几μm直径的珠子上的颗粒制剂、其中成分附着至油脂的制剂、微球制剂和微囊。
[0125]在本文中，“微生物来源的组分或其衍生物”可以被具体地分类为(1)被杀死的细菌，(2)来源于细菌的细胞壁骨架(后文为“CWS”)，和(3)微生物来源的特定组分及其衍生物。
(1)被杀死的细菌的实例包括粉状溶血性链球菌(例如
Figure A200780018810D00422
Chugai Co.，Ltd.)、被杀死的细菌混悬液的混合物(例如Broncasma
Figure A200780018810D00423
Sanwa Kagaku Kenkyusho Co.，Ltd)或被杀死的结核分枝杆菌细菌。
(2)细菌来源的CWS的实例包括得自分枝杆菌的CWS(例如牛分枝杆菌CWS)、得自诺卡氏菌的CWS(例如红色诺卡氏菌CWS)、棒状杆菌CWS。
[0126](3)微生物来源的具体组分及其衍生物的实例包括微生物来源的多糖，例如来自结核分枝杆菌的多糖(例如
Figure A200780018810D00424
ZeriaPharmaceutical Co.，Ltd.)；来自担子菌类的多糖(Ajinomoto，Co.，Ltd.，；Sankyo，Co.，Ltd.；Basidiomycetes，Coriolusversicolor(Fr)Quel)；胞壁酰二肽(MDP)相关化合物；脂多糖(LPS)；脂质A(MPL)相关化合物；糖脂海藻糖二霉菌酸酯(TDM)；细菌DNA(例如CpG寡核苷酸)；及其衍生物。
这些微生物来源的组分及其衍生物可得自商业来源，或者可以按照在已知文献(例如Cancer Res.，33，2187-2195(1973)；J.Natl.CancerInst.，48，831-835(1972)，J.Bacteriol.，94，1736-1745(1967)；Gann，69，619-626(1978)，J.Bacteriol.，92，869-879(1966)或J.Natl.Cancer Inst.，52，95-101(1974))中描述的方法生产和分离。
[0127]术语“细胞因子”指例如IFN-α、IL-12、GM-CSF、IL-2、IFN-γ、IL-18或IL-15。细胞因子可以为天然产物或基因工程产物。当细胞因子市售可得时，人们可以购买和使用该细胞因子。或者，可如下重组制备细胞因子：基于向数据库如GenBank、EMBL或DDBJ登记的碱基序列以常规方式克隆所需基因，将该基因连接入适宜的表达载体中，用所获重组表达载体转化宿主细胞，并使所述细胞表达和生产预期的细胞因子。
[0128]“植物来源的组分或其衍生物”的实例包括皂苷来源的组分Quil A(Accurate Chemical & Scientific Corp)、QS-21(AquilaBiopharmaceuticals Inc.)或甘草甜素(SIGMA-ALDRICH等)。
“海洋生物来源的组分或其衍生物”的实例包括海绵来源的糖脂α-半乳糖苷神经酰胺。
油乳化剂(乳化制剂)的实例包括油包水型(w/o)、水包油型(o/w)和水包油包水型(w/o/w)的乳化制剂。
[0129]在油包水型(w/o)乳化制剂中，活性成分分散在用作分散相的水中。在水包油型(o/w)乳化制剂中，活性成分分散在用作分散介质的水中。此外，在水包油包水型(w/o/w)乳化制剂中，活性成分分散在为最内相的水中。这些乳化制剂可以按照在例如JP-A-8-985、JP-A-9-122476等中的教导生产。
[0130]“脂质体制剂”是指微粒，其中活性成分囊化在具有脂质双层结构的脂质体的水相中或脂质双层内。用于制备脂质体的代表性脂质包括磷脂酰胆碱和神经鞘磷脂。还可以加入赋予电荷的磷酸二鲸蜡酯、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸等，用于稳定脂质体。生产脂质体的方法包括超声法、乙醇注入法、乙醚注入法、反相蒸发法、高压破碎提取法(French press extraction method)等。
[0131]“微球制剂”是指由均一聚合物基质组成的微粒，其中活性成分分散在基质中。该基质可以由生物可降解的聚合物组成，所述生物可降解的聚合物例如为白蛋白、明胶、几丁质、壳聚糖、淀粉、聚乳酸、聚氰基丙烯酸烷基酯等。微球制剂可以通过任何已知的方法制备，所述方法包括但不限于在文献(Eur.J.Pharm.Biopharm.50：129-146，2000；Dev.Biol.Stand.92：63-78，1998；Pharm.Biotechnol.10：1-43，1997等)中描述的那些。
[0132]“微囊制剂”是指含有活性成分作为用膜包封的核心物质的微粒。用于膜的包衣物质包括成膜聚合物，例如羧甲基纤维素、醋酸纤维素酞酸酯、乙基纤维素、明胶、明胶/阿拉伯胶、硝酸纤维素、聚乙烯醇、羟丙基纤维素等。微囊制剂可以通过凝聚法、表面聚合等制备。
例如可以皮内、皮下、肌内或静脉内实现给药。尽管在要给予的制剂中的本发明蛋白的剂量可以根据例如要治疗的疾病、患者的年龄和体重进行适当调整，但其通常在0.0001mg-1000mg、优选0.001mg-100mg、更优选0.01mg-10mg的范围内，其可以每几天至每几个月给药一次。
[0133](2)含有本发明肽作为活性成分的CTL诱导物
本发明的肽具有诱导CTL的活性。诱导的CTL可以通过淋巴因子的细胞毒性作用或生产发挥抗肿瘤作用。因此，本发明的肽可以用作治疗或预防肿瘤的药物(癌症疫苗)的活性成分。当将含有本发明肽作为活性成分的CTL诱导物给予肿瘤患者时，本发明的肽被提呈至抗原提呈细胞中的HLA抗原。然后，所提呈的HLA抗原和本发明肽之间的结合复合物的特异性CTL增殖，其后破坏肿瘤细胞。以此方式可在患者中实现肿瘤的治疗或预防。
含有本发明肽作为活性成分的CTL诱导物可以给予任何对本发明蛋白为阳性的肿瘤患者。具体地说，其可用于预防或治疗如在以上6)-(1)中所述的癌症(肿瘤)。
[0134]包含本发明肽作为活性成分的CTL诱导物可以包含单个CTL表位(本发明的肽)或由本发明肽和其它肽(CTL表位或辅助表位)连接在一起组成的表位肽作为活性成分。最近，业已表明，由多个(多于1个)CTL表位(抗原肽)连接在一起组成的表位肽具有有效诱导CTL的活性。例如，已有报道指出，由起源于肿瘤抗原蛋白PSA、各自限于HLA-A2-、-A3-、-A11或B53的CTL表位相连接组成的约30聚体的表位肽诱导对各自的CTL表位特异性CTL(Journal ofImmunology 1998，161：3186-3194)。另外，业已报道，由相连的CTL表位和辅助表位组成的表位肽可以有效诱导CTL。当本发明的肽以表位肽的形式给予时，该肽被掺入抗原提呈细胞中；然后通过胞内降解产生的抗原肽结合HLA抗原，形成复合物；复合物被以高密度提呈至抗原提呈细胞表面；对该复合物特异性的CTL在体内有效增殖，并破坏肿瘤细胞。以此方式实现肿瘤的治疗或预防。
[0135]包含本发明肽作为活性成分的CTL诱导物的具体实例包括含有由SEQ ID NOS：13-201的任一个氨基酸序列组成的肿瘤抗原肽作为活性成分的CTL诱导物。CTL诱导物的优选实例为含有由SEQ ID NO：42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179和183的任一个氨基酸序列组成的肽作为活性成分的CTL诱导物。CTL诱导物的更优选实例为含有由SEQ ID NO：158、22、23、26、27、198、200、201、177、178、179和183的任一个氨基酸序列组成的肽作为活性成分的CTL诱导物。
[0136]含有本发明肽作为活性成分的CTL诱导物可以在与药学可接受的载体(例如适宜的佐剂)的混合物中给予或与该载体一起给予，使得可有效建立细胞免疫。
可用的佐剂的实例包括描述于文献(Clin.Microbiol.Rev.，7：277-289，1994)中的那些。具体地说，包括以下的：微生物来源的组分或其衍生物、细胞因子、植物来源的组分或其衍生物、海洋生物来源的组分或其衍生物、诸如氢氧化铝的矿物凝胶、表面活性剂(如溶血卵磷脂及
Figure A200780018810D00451
多元醇、聚阴离子、肽、油乳化剂(乳化制剂))等。另外，还包括脂质体制剂、其中成分结合在几μm直径的珠子上的颗粒制剂、其中成分附着至油脂的制剂、微球制剂和微囊。这些佐剂的具体实例与在以上“6)-1)含有本发明蛋白作为活性成分的CTL诱导物”中所述的那些相同。
[0137]例如可以皮内、皮下、肌内或静脉内实现给药。尽管本发明肽在要给予的制剂中的剂量可以根据例如要治疗的疾病、患者的年龄和体重进行适当调整，但其通常在0.0001mg-1000mg、优选0.001mg-100mg、更优选0.1mg-10mg的范围内，其可以每几天至每几个月给药一次。
[0138](3)含有本发明的核酸作为活性成分的CTL诱导物
本发明的核酸具有诱导CTL的活性。由此可以为用作治疗或预防肿瘤的药物(癌症疫苗)的活性成分。含有本发明核酸作为活性成分的CTL诱导物在给予肿瘤患者时，可以通过表达所述核酸对肿瘤发挥治疗性或预防性作用。
[0139]例如，当以下述方式将掺入到表达载体中的本发明核酸给予肿瘤患者时，肿瘤抗原蛋白在抗原提呈细胞中高度表达。此后，通过胞内降解产生的肿瘤抗原肽与HLA抗原形成复合物；然后复合物以高密度被提呈至抗原提呈细胞的表面；肿瘤特异性CTL在体内有效增殖，并破坏肿瘤细胞。以此方式实现肿瘤的治疗或预防。
含有本发明的核酸作为活性成分的CTL诱导物可以给予任何对本发明蛋白为阳性的肿瘤患者。具体地说，其可用于预防或治疗如在以上6)-(1)中所述的癌症(肿瘤)。
[0140]可以通过使用病毒载体或通过其它程序(Nikkei-Science，April，1994，20-45页；Gekkan-Yakuji，36(1)，23-48(1994)；Jikken-Igaku-Zokan，12(15)，1994，以及其中提及的参考文献)实现将本发明的核酸给予和导入细胞中。
导入病毒载体的方法可以包括将本发明的DNA掺入DNA或RNA病毒中，例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒或新培斯病毒，并将所述病毒导入细胞中。其中尤其优选涉及逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或痘苗病毒的方法。
[0141]除了以上方法，还例举了其中直接肌内注射表达质粒的方法(DNA接种)、脂质体法、脂转染法、微注射、磷酸钙法和电穿孔，在它们之中特别优选DNA接种和脂质体法。
在实践中，例如在其中将核酸直接导入体内的体内方法中，或在其中将核酸体外导入得自人类受试者的某些细胞中并将细胞再导入受试者体内的离体方法中，本发明的核酸可以用作药物(Nikkei-Science，April，1994，20-45页；Gekkan-Yakuji，36(1)，23-48(1994)；Jikkenn-Igaku-Zokan，12(15)，1994；以及其中提及的参考文献)。更优选体内方法。
[0142]就体内方法而言，根据要治疗的疾病和症状以及其它因素，可通过任何适宜的途径实现给药。例如，其可以经由静脉内、动脉内、皮下、皮内、肌内途径等给予。当以体内方法给予时，本发明的核酸可以配制为液体制剂，通常配制为含有本发明核酸作为活性成分的可注射形式，如有需要，还可以向其加入在药学上可接受的载体。对于含有本发明核酸的脂质体或膜融合脂质体(例如仙台病毒(HVJ)-脂质体)，可以接受混悬剂、冷冻制剂、离心浓缩的冷冻制剂等形式的脂质体制剂。
尽管在要给予的制剂中的本发明核酸的剂量可以根据例如要治疗的疾病、患者的年龄和体重进行适当调整，但核酸中的多核苷酸的量通常在0.0001mg-100mg、优选0.001mg-10mg的范围内，其可以每几天至每几个月给药一次。
[0143]最近，已表明编码多个(1个以上)CTL表位(肿瘤抗原肽)相连接或者CTL表位与辅助表位相连接组成的表位肽的多核苷酸在体内有效诱导CTL。例如，已报道一种编码由6种HBV来源的HLA-A2限制性抗原肽、3种HLA-A11限制性抗原肽及辅助表位相连接组成的表位肽的DNA(微基因)在体内有效诱导针对各自表位的CTL(JournalofImmunology1999，162：3915-3925)。
因此，通过连接一个或多个各自编码本发明肽的多核苷酸和任选的编码不同肽的其它多核苷酸制备的多核苷酸，在导入到适宜的表达载体中时，可以为CTL诱导物的活性成分。这样的CTL诱导物可以以上述的相同给药方式或形式施用。
[0144](4)含有本发明的抗原提呈细胞作为活性成分的CTL诱导物
本发明的抗原提呈细胞具有诱导CTL的活性，并因此可以为用于治疗或预防肿瘤的药物的活性成分(癌症疫苗)。含有本发明的抗原提呈细胞作为活性成分的CTL诱导物可以通过给予肿瘤患者抗原提呈细胞对肿瘤发挥治疗性或预防性作用。
含有本发明的抗原提呈细胞作为活性成分的CTL诱导物可以给予对本发明蛋白为阳性的任何肿瘤患者。具体地说，其可用于预防或治疗如以上6)-(1)所述的癌症(肿瘤)。
[0145]含有抗原提呈细胞作为活性成分的CTL诱导物优选含有生理盐水、磷酸缓冲盐水(PBS)、媒介物等，以稳定保持抗原提呈细胞。其可以例如静脉内、皮下或皮内给予。在先前的文献中例举了诱导物的剂量。将含有抗原提呈细胞作为活性成分的CTL诱导物再导入对本发明蛋白为阳性的患者中，可以在患者体内产生特异性CTL的有效诱导，并产生肿瘤治疗作用。
[0146](5)含有本发明的CTL作为活性成分的癌症疫苗
本发明的CTL具有抗肿瘤细胞的细胞毒活性，并因此可以为用于治疗或预防肿瘤的药物(癌症疫苗)的活性成分。
含有本发明的CTL作为活性成分、用于治疗或预防肿瘤的药物组合物可以给予对本发明蛋白为阳性的任何肿瘤患者。具体地说，其可用于预防或治疗如以上6)-(1)中所述的癌症(肿瘤)。
含有本发明的CTL作为活性成分、用于治疗或预防肿瘤的药物组合物优选含有生理盐水、磷酸缓冲盐水(PBS)、媒介物等，以稳定保持CTL。其可以例如静脉内、皮下或皮内给予。将含有本发明的CTL作为活性成分的药物组合物再导入对本发明蛋白为阳性的患者中，可以对患者体内抗肿瘤细胞的CTL的细胞毒活性产生促进作用，之后破坏肿瘤细胞，产生肿瘤治疗作用。
[0147]7)针对本发明肽的抗体
本发明提供特异性结合本发明肽的抗体。就形式而言，本发明的抗体不受限制，可以为针对本发明肽产生的多克隆抗体或单克隆抗体。
本发明的抗体在任何意义上均可不受限制，只要其特异性结合如上所述的本发明肽，具体实例是特异性结合肿瘤抗原肽的抗体，所述肿瘤抗原肽由SEQ ID NO：13-201中的任一个氨基酸序列组成，优选由SEQ ID NO：42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列组成，更优选由158、22、23、26、27、198、200、201、177、178、179或183的氨基酸序列组成。
[0148]制备抗体的方法在本领域众所周知，本发明的抗体可以按照这些常规方法(Current protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编辑，(1987)Publish.John Wiley and Sons.11.12-11.13章，Antibodies；A Laboratory Manual，Lane，H，D.等人编辑，Cold SpringHarber Laboratory Press，New York 1989)中的任一种制备。
[0149]具体地说，可以通过使用本发明的肽(例如由SEQ ID NO：42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179和183中的任一个氨基酸序列组成的肽)作为免疫原免疫非人动物如兔，并以常规方式由免疫动物血清回收抗体，获得本发明的抗体。当抗体为单克隆抗体时，其可如下获得：用本发明的肽(例如由SEQ ID NO：42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179和183中的任一个氨基酸序列组成的肽)免疫非人动物如小鼠，使所获脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，以制备杂交瘤细胞，并由杂交瘤细胞回收抗体(Current protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编辑，(1987)Publish.John Wiley and Sons.11.4-11.11章)。
[0150]针对本发明肽的抗体还可以在根据宿主使用不同佐剂增强免疫应答的同时生产。佐剂的实例包括弗氏佐剂；诸如氢氧化铝的矿物凝胶；表面活性剂，如溶血卵磷脂及
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多元醇、聚阴离子、肽、油乳化剂、匙孔
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血蓝蛋白和二硝基苯酚；人用佐剂，如BCG(卡介苗)和棒状杆菌。
[0151]如上所述，识别本发明肽的抗体和中和该肽活性的抗体可易于通过以常规方式免疫动物制备。所述抗体可用于亲和层析、免疫诊断方法等。免疫诊断方法可适当地选自免疫印迹、放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光或发光测定等。免疫诊断方法应有效诊断表达编码本发明蛋白的基因的癌症。
[0152]8)本发明的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体和HLA五聚体
本发明还提供含有本发明的肿瘤抗原肽和HLA抗原的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体。
在癌症免疫疗法中，可通过在治疗前检验患者中针对肿瘤抗原(肿瘤抗原肽)的CTL前体细胞的频率和量，或在用肿瘤抗原(肿瘤抗原肽)进行治疗的患者中检验CTL的频率或量，获得用于选择对肿瘤抗原(肿瘤抗原肽)高度响应的患者、监测疗效或评价治疗适用性的主要指示剂。各自均含有肿瘤抗原肽和HLA抗原的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体和HLA五聚体可在对抗原(抗原肽)特异性的CTL检测中用作试剂，具体地说，可用于检测CTL的频率和量。
[0153]本文使用的HLA四聚体是指如下制备的四聚体：生物素化由缔合肽(抗原肽)的HLA抗原α-链和β2-微球蛋白组成的复合物(HLA单体)，并使其结合抗生物素蛋白，用于四聚化(Science279：2103-2106(1998)；和Science 274：94-96(1996))。
HLA单体是用于制备上述HLA四聚体的单体，通过生物素化缔合的HLA抗原α-链、β2-微球蛋白和抗原肽而形成。
[0154]HLA二聚体是如下制备的二聚体：融合HLA抗原α-链和Ig(免疫球蛋白，例如IgG1)，并使所获融合体与β2-微球蛋白和抗原肽结合(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6671-6675(1993))。对结合HLA二聚体的抗原肽特异性的CTL可通过例如使标记的抗IgG1抗体结合IgG1来检测。
HLA五聚体是最近开发的技术，是指含有5个分子复合物的五聚体，该复合物为通过卷曲螺旋结构域聚合的HLA抗原和抗原肽的复合物。因为HLA抗原和抗原肽的复合物可以用荧光等标记，所以可以类似于HLA四聚体通过流式细胞术等进行分析(参见http://www.proimmune.co.uk/)。
[0155]如上所述的HLA单体、二聚体、四聚体和五聚体全部都可以通过向诸如ProImmune或BD Biosciences的生产商定制生产而获得。目前，含有不同抗原肽的HLA四聚体等市售可得(Medical&Biological Laboratories Co.，Ltd.等)。
[0156]具体地说，本发明的HLA单体、二聚体、四聚体和五聚体的实例包括HLA单体、二聚体、四聚体和五聚体，其各自均含有由SEQ ID NO：42、43、44、45、46、47、49、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、158、159、160、161、15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200、201、177、178、179和183的氨基酸序列、优选158、22、23、26、27、198、200、201、177、178、179和183的氨基酸序列和HLA-A24抗原组成的肽。尤其优选HLA四聚体或HLA五聚体来检测CTL。
[0157]优选用荧光标记HLA单体、HLA四聚体和HLA五聚体，使得结合的CTL可易于被分拣出来，或易于通过已知检测方法(如流式细胞术、荧光显微镜等)来检测。实例包括用藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、多甲藻叶绿素蛋白(PerCP)、别藻蓝蛋白(APC)等标记的HLA单体、四聚体和五聚体。
[0158]在可以为本发明的HLA单体、二聚体、四聚体和五聚体的组分的HLA抗原中，HLA-A24抗原(HLA-A24抗原的α-链)可基于在Genbank登录号M64740中公开的HLA-A2402的已知碱基序列通过常规方法如PCR容易地克隆。HLA-A2抗原(HLA-A2抗原的α-链)可基于在Genbank登录号M84379中公开的HLA-A0201基因的已知碱基序列通过常规方法如PCR容易地克隆。
[0159]为本发明的HLA单体、二聚体、四聚体和五聚体的组分的β2-微球蛋白优选源于人。人β2-微球蛋白可基于在Genbank登录号AB021288中公开的人β2-微球蛋白的已知碱基序列通过常规方法如PCR容易地克隆。
[0160]由上述的对应文献公知用于制备HLA单体、二聚体、四聚体和五聚体的方法。有关HLA-A24的HLA四聚体的制备简述如下。
首先，用HLA-A24α-链表达载体和β2-微球蛋白表达载体转化适宜的宿主细胞，如能够表达蛋白的大肠杆菌或哺乳动物细胞，并使其表达它们。在本文优选使用大肠杆菌(例如BL21)。然后将所获的单体形式的HLA-A24复合物和本发明的肽混合，形成可溶性HLA-肽复合物。用BirA酶生物素化HLA-肽复合物的HLA-A24α-链的C-末端序列。当生物素化的HLA-肽复合物和荧光标记的抗生物素蛋白以4:1的摩尔比率混合时，形成HLA四聚体。优选通过凝胶过滤等纯化以上每个步骤所获的蛋白。
[0161]上述HLA单体、二聚体、四聚体和五聚体可有效用作对来源于本发明蛋白的肿瘤抗原肽特异性的CTL的检测试剂。
本发明的CTL检测试剂可以用于例如以下用途。
1)在启动采用本发明的蛋白、肽或核酸的治疗之前检验本发明的肿瘤抗原肽的CTL前体的频率和量。这样，可以评价患者对肿瘤抗原肽的反应性。
2)检验患者在本发明的蛋白、肽或核酸治疗下CTL的频率或量。这样，可进行疗效监测、评价治疗的合适性、确证治疗进展良好等。
[0162]具体地说，可如下进行CTL的检测：由受试患者分离含有CTL的生物样品(例如PBMC)，使本发明的HLA四聚体等与该生物样品接触，并通过例如流式细胞术检测对结合HLA四聚体的本发明肽特异性的现有CTL的频率和量。
[0163]9)本发明的疾病标志物
本发明还提供利用Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因或其表达产物的癌症(肿瘤)的疾病标志物。
[0164]如上所述，本发明人发现，相比于正常组织，Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因在癌组织中的表达水平和/或频率显著增加。因此，识别这些基因或其表达产物(即蛋白)的抗体可用作表达这些基因的癌症的疾病标志物。
后文阐述了识别Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因的多核苷酸或其表达产物(即蛋白)的抗体作为疾病标志物的用途。
[0165](1)癌症疾病标志物及其应用
(1-1)多核苷酸
如上所述，人Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因是本领域已知的。
已经提到，相比于正常组织，Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因在癌症患者组织中的表达水平和/或频率明确增加，本发明基于这一发现，以下想法也基于此：检测这些基因是否表达或这些基因的表达水平可以对癌症的有或无、严重性或康复提供明确测定，并因此提供对癌症的精确诊断。
因此，本发明提供可用作工具(即疾病标志物)的多核苷酸，其可通过在受试者中检测这些基因是否表达或这些基因的表达水平，诊断受试者中癌症的有或无或严重性。
[0166]本文使用的“多核苷酸”包括RNA和DNA，并可以为单链或双链的。“DNA”包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。“RNA”包括总RNA、mRNA和合成RNA。本发明疾病标志物的特征在于其由多核苷酸和/或其互补多核苷酸组成，其中多核苷酸包含Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的碱基序列的至少15个连续核苷酸。
[0167]具体地说，本发明的疾病标志物可以由多核苷酸和/或其互补多核苷酸组成，其中多核苷酸含有Lengsin基因(SEQ ID NO：1)、BJ-TSA-9基因(SEQ ID NO：3)、C20orf42基因(SEQ ID NO：5)、BUB1基因(SEQ ID NO：7)、C10orf3基因(SEQ ID NO：9)或HIFPH3基因(SEQ ID NO：11)的碱基序列的至少15个连续核苷酸。
[0168]在本文中，术语“互补多核苷酸(互补链、反向链)”是指基于碱基配对原则(例如A:T、G:C)与以下互补的多核苷酸：由以上SEQ ID NO的任一个碱基序列组成的多核苷酸的完整序列，或其含有任一个这些碱基序列的至少15个连续核苷酸的部分序列，为方便起见，其在本文还被称为“正向链”。“互补链”可以为与目标正向链的碱基序列完全互补的序列，或者为具有的互补性足以在严格条件下与目标正向链的碱基序列杂交的序列。本文使用的严格条件可以基于如在文献中所述的形成复合物或结合探针的核酸的解链温度(Tm)来确定(Berger和Kimmel，1987，“Guide to Molecular Cloning TechniquesMethods in Enzymology”，152卷，Academic Press，San Diego CA)。例如，杂交后的洗涤通常可以在约“1 x SSC、0.1％ SDS、37℃”的条件下进行。互补链在这些洗涤条件下洗涤时优选保持结合目标正向链。更严格的杂交条件可以涉及在约“0.5 x SSC、0.1％ SDS、42℃”的条件下洗涤，再更严格的杂交条件包括约“0.1 x SSC、0.1％ SDS、65℃”的洗涤条件，但其不限于此。具体地说，这样的互补链可以由与目标正向链的碱基序列相比具有完全互补性或至少90％、优选95％的同源性的碱基序列组成。
[0169]正链的多核苷酸可以具有Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH基因的碱基序列的完整或部分序列，或者可以与上述互补链的碱基序列互补。
如上所述的正向链或互补(反向)链的多核苷酸可以以单链或双链形式用作疾病标志物。
[0170]具体地说，本发明的疾病标志物可以为由Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的碱基序列(完整序列)或其互补序列组成的多核苷酸。或者，疾病标志物可以为由如上所述的完整序列的部分序列或其互补序列组成的多核苷酸，只要该多核苷酸选择性(特异性)识别Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因或源自其的多核苷酸。部分序列可以为含有适宜地选自上述完整序列或其互补序列的碱基序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
[0171]本文使用的术语“选择性(特异性)识别”意指就RNA印迹而言，可以特异性检测Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因或由其获得的多核苷酸，就RT-PCR方法而言，生产Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因或由其获得的的多核苷酸。然而，以上定义不是限制性的，可以使用任何标准，只要本领域一般技术人员可以通过使用源自这些基因中的任一个的多核苷酸确定要检测的物质或产生的产物。
[0172]例如，本发明的疾病标志物可以利用引物3(http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)或载体NTI(Infomax)由Lengsin基因(SEQ ID NO：1)、BJ-TSA-9基因(SEQ ID NO：3)、C20orf42基因(SEQ ID NO：5)、BUB1基因(SEQ ID NO：7)、C10orf3基因(SEQ ID NO：9)或HIFPH3基因(SEQ ID NO：11)的碱基序列设计。具体地说，通过使用引物3或载体NTI软件由Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的碱基序列获得的候选序列，或者至少含有候选序列一部分的序列，可以用作引物或探针。
本发明的疾病标志物含有如上所述的至少15个连续核苷酸长度，根据标志物的应用，可以适宜地选择和设计长度。
[0173](1-2)作为探针或引物的多核苷酸
通过在受试者的生物样品中检验Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因中的至少一种是否表达或其表达水平进行本发明的癌症检测(诊断)。在此，本发明的疾病标志物可以用作特异性识别和扩增由任一个这些基因表达的RNA或由其获得的的多核苷酸的引物，或者用作特异性检测此RNA或由其获得的的多肽的探针。
[0174]当本发明的疾病标志物用作检测癌症(即用于遗传诊断)的引物时，该引物一般可以含有15-100bp、优选15-50bp、更优选15-35bp的长度。在用作检测癌症的探针时，该探针一般可以含有15bp-1kp、优选100bp-1kb的长度。
本发明的疾病标志物可以在特异性检测特定基因的任何已知方法中以常规方式用作引物或探针，所述方法例如为RNA印迹、RT-PCR、原位杂交等。然后，可以检验涉及癌症的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因是否表达或其表达水平。
[0175]待检验的样品可以为用常规方法由受试者的靶组织的生物样品(例如活检样品)制备的总RNA，或由该总RNA制备的多核苷酸。
在生物样品中的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的表达水平可以通过使用DNA芯片检测或定量。在此，本发明的疾病标志物可以用作DNA芯片的探针(就基因芯片人类基因组U95A、B、C、D、E(Affymetrix)而言，用作多核苷酸探针，其为25bp长度)。当含有本发明的疾病标志物作为其探针的DNA芯片与由生物样品的RNA制备的标记-DNA或RNA杂交时，本发明的疾病标志物(即探针)和标记的DNA或RNA形成复合物。通过利用标记的DNA或RNA的标记检测复合物，可以检验Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因是否表达或其表达水平。
[0176]DNA芯片可以含有一个或多个本发明的疾病标志物，其可以结合Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因中的任一个。当DNA芯片含有1个以上的标志物时，可以在1个生物样品中同时检验1个以上的基因是否表达或其表达水平。
[0177]本发明的疾病标志物可用于诊断或检测癌症，也就是说，诊断癌症是否存在或癌症的严重性。具体地说，可以通过评价受试者和健康个体之间的组织生物样品中的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的表达水平差异，使用疾病标志物进行癌症诊断。
在此，两种受试者的表达水平之间的差异可以为有或无表达，或者在两种受试者中均观察到表达时，该差异可以为至少1.5倍，优选2倍，更优选3倍。
[0178]具体地说，来源于Lengsin基因的多核苷酸可用作肺腺癌、肺鳞状细胞癌或胃癌的疾病标志物。
具体地说，来源于BJ-TSA-9基因的多核苷酸可用作白血病、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、小细胞肺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌或淋巴瘤的疾病标志物。
具体地说，来源于C20orf42基因的多核苷酸可用作肺鳞状细胞癌、肺腺癌、肝癌、胃癌、白血病、恶性淋巴瘤组织、直肠癌、结肠癌或胰腺癌的疾病标志物。
[0179]具体地说，来源于BUB1基因的多核苷酸可用作乳腺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、卵巢癌、口腔鳞状细胞癌、肾癌、大肠癌(结肠癌、直肠癌)、胃癌、胰腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤或黑素瘤的疾病标志物
具体地说，来源于C10orf3基因的多核苷酸可用作乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、小细胞肺癌或黑素瘤的疾病标志物。
具体地说，来源于HIFPH3基因的多核苷酸可用作乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、胰腺癌、肝癌、肺腺癌或肺鳞状细胞癌的疾病标志物。
[0180](1-3)抗体
本发明提供特异性识别Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的表达产物(即蛋白Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3)的抗体，其可以用作癌症的疾病标志物。
具体地说，本发明提供特异性识别分别具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3蛋白的抗体。
[0181]已经提到，相比于正常细胞或组织，Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3基因在癌症患者组织中的表达水平和/或频率明确增加，本发明基于这一发现，以下想法也基于此：检测这些基因是否表达或其表达水平可以对癌症的有或无、严重性或康复提供明确测定，并因此提供对癌症的精确诊断。
因此，所述抗体可用作工具(即疾病标志物)，其可通过在受试者中检测该蛋白是否表达或该蛋白的表达水平，诊断受试者是否存在癌症或其严重性。
[0182]如上所述，人Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3蛋白在本领域是已知的。
就形式而言，本发明的抗体不受限制，可为针对Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3产生的多克隆抗体或单克隆抗体。此外，本发明的抗体包括对由任一个这些蛋白的氨基酸序列的一般至少8个、优选15个、更优选20个连续氨基酸组成的多肽具有亲和力的抗体。
[0183]制备此抗体的方法在本领域众所周知，本发明的抗体可以按照任一个这些常规方法制备(Current protocols in MolecularBiology，Ausubel等人编辑，(1987)Publish.John Wiley and Sons.11.12-11.13章)。具体地说，当抗体为多克隆抗体时，其可如下获得：用以常规方式在大肠杆菌中表达并由大肠杆菌纯化的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3蛋白作为免疫原，或者用具有以常规方式合成的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的部分氨基酸序列的寡肽作为免疫原，免疫非人动物如兔，并以常规方式由免疫动物的血清回收抗体。当抗体为单克隆抗体时，其可如下获得：用以常规方式在大肠杆菌中表达并由大肠杆菌纯化的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3蛋白或者用具有以常规方式合成的任一种这些蛋白的部分氨基酸序列的寡肽免疫非人动物如小鼠，并使所获脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，以制备杂交瘤细胞，并由杂交瘤细胞回收抗体(Currentprotocols in Molecular Biology，Ausubel等人编辑，(1987)Publish.JohnWiley and Sons.11.4-11.11章)。
[0184]可以通过诸如DNA克隆、构建对应质粒、将质粒转染入宿主细胞中、培养所获转化体并由转化体培养物回收蛋白的程序，由本文提供的SEQ ID NO1、3、5、7、9和11中任一个的序列获得在抗体制备中用作免疫原的蛋白Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3。这些程序可以通过本领域技术人员已知的或在文献(Molecular Cloning，T.Maniatis等，CSH Laboratory(1983)，DNACloning，DM.Glover，IRLPRESS(1985))中描述的任一种方法进行。
[0185]具体地说，用作制备本发明抗体的免疫原的蛋白可以如下获得：构建在选定的宿主细胞中提供Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因表达的重组DNA(即表达载体)，将该DNA转染入宿主细胞中，以提供转化体，培养转化体，由转化体培养物回收目标蛋白。另外，Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的部分肽可以基于本文提供的氨基酸序列(SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12)通过常用的化学(肽)合成方法制备。
[0186]在此，本发明的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3不仅包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的蛋白，而且包括其同源物。同源物包括由以下氨基酸序列组成的蛋白：该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列相同，只是缺失、取代和/或添加一个或多个氨基酸，并具有与该蛋白的已知免疫学活性等效的免疫学活性。
具有与该蛋白的已知免疫学活性等效的免疫学活性的同源物为例如能够在适宜的动物或其细胞中诱导特异性免疫反应并特异性结合抗Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的抗体的蛋白。
[0187]关于蛋白中的氨基酸突变的数量或位置没有限制，只要保持该蛋白的免疫学活性。人们可基于其确定要缺失、取代和/或添加的氨基酸残基的数量或位置而不降低免疫学活性的标准可使用本领域众所周知的计算机程序获得，例如DNA Star软件。例如，突变数通常应在总氨基酸残基的10％之内，优选应在总氨基酸残基的5％之内，更优选在总氨基酸残基的1％之内。要取代的氨基酸不受限制，只要所获蛋白保持与Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3等效的免疫学活性。考虑到保持结构，通过取代引入的氨基酸优选与被取代的氨基酸具有类似特征，其中所述特征包括极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、两亲性等。例如，Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe和Trp被分类为非极性氨基酸；Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn和Gln被分类为不带电的氨基酸；Asp和Glu被分类为酸性氨基酸；而Lys、Arg和His被分类为碱性氨基酸。本领域一般技术人员可以基于这些标准选择属于相同类别的适宜氨基酸。
[0188]可通过使用具有Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的部分氨基酸序列的寡肽获得本发明的抗体。用于制备抗体的寡肽不一定具有功能性生物活性，但其需要具有与对应蛋白类似的免疫原性。优选地，寡肽具有这样的免疫原性，并由BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的氨基酸序列的至少8个、优选15个、更优选20个连续氨基酸组成。
[0189]为制备针对该寡肽的抗体，可将多种佐剂与免疫原一起同时给予宿主，以便增强免疫反应性。佐剂的实例为(但不限于)弗氏佐剂；诸如氢氧化铝的矿物凝胶；表面活性剂，如溶血卵磷脂、
Figure A200780018810D0061181010QIETU
多元醇、聚阴离子、肽、油乳化剂、匙孔
Figure A200780018810D0061181030QIETU
血蓝蛋白和二硝基苯酚；人用佐剂，如BCG(卡介苗)或棒状杆菌。
另外，本发明可以使用商品化抗体，包括抗Bub1抗体(Upstate)、抗-C10orf3抗体(Abnova)、抗-C20orf42抗体(Imgenex)和抗-HIFPH3抗体(Bethyl)。
[0190]本发明的抗体具有特异性结合Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的特征，因此可特异性检测在受试者的组织中表达的蛋白(及其同源物)。因此，本发明的抗体可以用作检测Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3在受试者的组织中是否表达或其表达水平的探针。
[0191]具体地说，Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3可如下检测：通过活检等获得患者靶组织的生物样品，以常规方式制备组织提取物或由其获得的的蛋白，并通过已知方法如蛋白质印迹、ELISA等使用所述抗体作为探针以常规方式进行检测。
通过检验Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3和HIFPH3中的至少一种在受试者的组织中的水平，并与健康个体中的该水平相比较，可提供癌症诊断。蛋白水平的差异可为有或无蛋白，或者可以为至少2倍，优选3倍。
[0192]特异性识别Lengsin的抗体尤其可用作肺腺癌、肺鳞状细胞癌或胃癌的疾病标志物。
特异性识别BJ-TSA-9的抗体尤其可以用作白血病、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、小细胞肺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌或淋巴瘤的疾病标志物。
特异性识别C20orf42的抗体尤其可以用作肺鳞状细胞癌、肺腺癌、肝癌、胃癌、白血病、恶性淋巴瘤组织、直肠癌、结肠癌或胰腺癌的疾病标志物。
[0193]特异性识别BUB1的抗体尤其可以用作乳腺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、卵巢癌、口腔鳞状细胞癌、肾癌、大肠癌(结肠癌、直肠癌)、胃癌、胰腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤或黑素瘤的疾病标志物。
特异性识别C10orf3的抗体尤其可用作乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、小细胞肺癌或黑素瘤的疾病标志物。
特异性识别HIFPH3的抗原尤其可以用作乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、胰腺癌、肝癌、肺腺癌或肺鳞状细胞癌的疾病标志物。
[0194](2)检测(或诊断)癌症的方法
本发明提供一种利用如上所述的本发明疾病标志物检测(或诊断)癌症的方法。
具体地说，本发明的检测方法包括通过活检等由受试者收集靶组织的生物样品，检测和测量Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的表达水平(量)或由该基因编码的蛋白的表达水平(量)，并检测(或诊断)癌症的有或无或严重性。本发明的检测(诊断)方法可用于检测(或诊断)为改善癌症而给予癌症患者的治疗剂实际上是否可以改善疾病，和/或所述治疗剂可以提供多大的改善。
[0195]本发明的癌症检测方法包括以下的步骤(a)、(b)和(c)：
(a)使由受试者制备的生物样品与本发明的疾病标志物接触；
(b)通过使用疾病标志物作为指示剂，检测样品中Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的表达水平，和
(c)基于(b)的结果确定受试者是否患有癌症。
[0196]本文使用的生物样品可以为由受试者的靶组织制备的样品。具体地说，生物样品可以为含有由(靶)组织制备的RNA的样品、含有由该RNA制备的多核苷酸的样品或含有由靶组织制备的蛋白的样品。该含有RNA、多核苷酸或蛋白的样品可在通过活检等收集受试者的一部分组织后通过常规方法制备。
本发明的诊断方法可根据要检验的生物样品如下所述进行。
[0197](2-1)当要检验的生物样品为RNA时
当要检验的生物样品为RNA时，癌症的检测可通过含有以下步骤(a)、(b)和(c)的方法进行：
(a)使本发明的疾病标志物(即具有Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的碱基序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸和/或其互补多核苷酸)与由受试者的生物样品制备的RNA或由其转录的互补多核苷酸杂交；
b)使用疾病标志物作为指示剂检测与疾病标志物杂交的、由生物样品制备的RNA或由其转录的互补多核苷酸；和
(c)基于(b)中的检测结果确定受试者是否患有癌症。
[0198]当要检验RNA时，本发明的检测(诊断)方法可通过检测和测量RNA中Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的表达水平实现。具体地说，该方法可通过使用本发明的疾病标志物(即含有Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的碱基序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸和/或其互补多核苷酸)作为引物或探针，通过已知方法如RNA印迹、RT-PCR、DNA芯片分析、原位杂交等进行。
[0199]就RNA印迹而言，本发明的疾病标志物用作探针，并可以检测和测量RNA中Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因是否表达或其表达水平。例如，本发明的疾病标志物(其为互补链)用放射性同位素(32P、33P等：RI)或荧光物质标记。然后，标记的疾病标志物以常规方式与被转移到尼龙膜等上的、由受试者的组织制备的RNA杂交。此后，可通过用放射性检测器(BAS-1800II，Fuji Photo Film.，Inc.)或荧光检测器检测和测量标记(RI或荧光物质)的信号检测在标记的疾病标志物(DNA)和RNA之间形成的双链体。或者，可以用AlkPhos直接标记和检测系统(Amersham Pharmacia Biotech)按照生产商的方案标记疾病标志物(即探针DNA)，并使其与由受试者的组织制备的RNA杂交，然后可以使用Multi-biomeasure STORM860(Amersham Pharmacia Biotech)检测和测量疾病标志物上的标记的信号。
[0200]就RT-PCR而言，本发明的疾病标志物用作引物，可以检测和测量RNA中Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因是否表达或其表达水平。例如，以常规方式由来源于受试者的组织的RNA制备cDNA，该cDNA与由本发明的疾病标志物制备的引物对(正向引物与为反向链的上述cDNA杂交，反向引物结合正向链)杂交，以便使用该cDNA作为模板扩增对应于Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的靶区域。然后，以常规方式进行PCR，检测所产生的已扩增DNA双链体。已扩增DNA双链体的检测例如可通过以下方法实现：其中采用先前用RI或荧光物质标记的引物进行PCR，检测产生的标记DNA双链体；其中产生的DNA双链体被转移到尼龙膜等之上，然后由于与用作探针的标记的疾病标志物杂交而被检测。所产生的标记DNA双链体可以使用Agilent 2100 Bioanalyser(Yokogawa Analytical Systems Inc.)等检测。检测还可以如下实现：使用SYBR Green RT-PCR试剂(AppliedBiosystems)按照生产商的方案制备RT-PCR反应溶液，使用ABIPRISM7700序列检测系统(Applied Biosystems)进行反应，并检测反应产物。
[0201]就DNA芯片分析而言，例如，在其上连接本发明的疾病标志物的DNA芯片被制备为DNA探针(其为单链的或双链的DNA探针)，DNA芯片以常规方式与由来源于受试者组织的RNA制备的cRNA杂交。然后，由DNA和cRNA形成的双链体通过使由本发明的疾病标志物制备的标记探针与该双链体结合而被检测。能够检测和测量Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的表达水平的DNA芯片可用于本发明。这样的DNA芯片的实例为基因芯片人类基因组U95A、B、C、D、E(Affymetrix)。在以下实施例中描述了使用这样的DNA芯片检测和测量Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因在受试者的RNA中的表达水平。
[0202](2-2)当要检验的生物样品为蛋白时
当要检验的生物样品为蛋白时，本发明的检测(诊断)方法通过检测和测量生物样品中的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的水平(量)进行。具体地说，该方法可包含以下步骤(a)、(b)和(c)：
(a)使由受试者的生物样品制备的蛋白与为抗体的本发明疾病标志物(即识别Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的抗体)结合；
b)通过使用疾病标志物作为指示剂，检测与疾病标志物结合的、由生物样品制备的蛋白或由其获得的的部分肽；和
(c)基于(b)中的检测结果确定受试者是否患有癌症。
[0203]具体地说，该方法可为已知方法，例如蛋白质印迹，用于通过使用为抗体的本发明疾病标志物(即特异性识别Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的抗体)检测和测量Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3。
蛋白质印迹可以通过使用抗体进行，即本发明的疾病标志物为一抗，用放射性同位素如125I、荧光物质等标记的抗体作为结合一抗的二抗，并使用放射性检测器(BAS-1800II，Fuji Photo Film.，Inc.等)、荧光检测器等检测和测量所产生的标记复合物中的放射性同位素或荧光物质的信号。或者，在使用本发明的疾病标志物作为一抗后，可以用ECL Plus蛋白质印迹检测系统(Amersham Pharmacia Biotech)按照生产商的方案和用Multi-biomeasure STORM860(Amersham PharmaciaBiotech)进行检测和测量。
[0204](2-3)癌症的诊断
癌症的诊断可如下进行：比较受试者组织中Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的表达水平或Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3蛋白的表达水平(或量)和正常组织中的该水平，并评价二者之间的差异。
[0205]由所需的正常组织收集或制备的生物样品(RNA或蛋白)可以通过活检或在其同意的情况下通过收集死后组织得自无癌症的受试者的组织或癌症患者的非癌性的正常组织。“无癌症的受试者”是指至少无症状的受试者，优选为任何其它诊断方法如X-射线检查结果未被诊断为癌症的受试者。“无癌症的受试者”在本文可被简称为“健康个体”。
[0206]可以通过在受试者和健康个体二者的平行生物样品中测量，对受试者组织中的基因或蛋白的表达水平与正常组织(即没有癌症的受试者的组织或癌症患者的非癌性正常组织)中的该表达水平进行比较。健康个体中的基因或蛋白的表达水平不一定是平行检测的水平，在恒定条件下可以使用通过检测多个(至少2个，优选等于或多于3个，更优选等于或多于5个)正常组织确定的Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因或蛋白表达水平的平均值或统计学中值。
[0207]当Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因或其表达产物(即Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3蛋白)在受试者组织中的表达水平为健康个体水平的2倍、优选3倍高时，受试者被确定为患有癌症。当受试者中的所述基因或蛋白的表达水平高于健康个体中的该水平时，受试者被确定为患有癌症或疑似患有癌症。
[0208]具体地说，在以上的基因和蛋白中，当Lengsin基因或蛋白的表达水平在受试者的肺和胃中比在对应的正常组织中高时，受试者疑似患有癌症。
此外，当BJ-TSA-9基因或蛋白的表达水平在受试者的白细胞、肺、口腔、胃、胰腺或淋巴结中比在对应的正常组织中高时，受试者疑似患有癌症。
此外，当C20orf42基因或蛋白的表达水平在受试者的肺、肝脏、胃、白细胞、淋巴结、直肠、结肠或胰腺中比在对应的正常组织中高时，受试者疑似患有癌症。
[0209]此外，当BUB1基因或蛋白的表达水平在受试者的乳腺、肺、卵巢、口腔、肾脏、大肠(结肠、直肠)、胃、胰腺、肝脏、白细胞、淋巴结或皮肤中比在对应的正常组织中高时，受试者疑似患有癌症。
此外，当C10orf3基因或蛋白的表达水平在受试者的乳腺、结肠、直肠、肾脏、胃、卵巢、肝脏、胰腺、肺或皮肤中比在对应的正常组织中高时，受试者疑似患有癌症。
此外，当HIFPH3基因或蛋白的表达水平在受试者的乳腺、结肠、胃、肾脏、胰腺、肝脏、肺中比在对应的正常组织中高时，受试者疑似患有癌症。
[0210]本发明由以下实施例具体解释，但不能在任何意义上认为所述实施例限制本发明。
实施例1
[0211]由人组织样品和人癌细胞系制备总RNA
通过常规方法由如下的人主要器官的癌症组织和正常组织的样品制备总RNA：肺腺癌(57个样品)、正常肺(得自肺腺癌患者)(46个样品)、肺鳞状细胞癌(48个样品)、正常肺(得自肺鳞状细胞癌患者)(18个样品)、结肠癌(108个样品)、正常结肠(得自结肠癌患者)(114个样品)、直肠癌(43个样品)、正常直肠(得自直肠癌患者)(31个样品)、胃癌(38个样品)、正常胃(得自胃癌患者)(13个样品)、乳腺癌(237个样品)、正常乳腺(得自乳腺癌患者)(39个样品)、卵巢癌(37个样品)、正常卵巢(得自卵巢癌患者)(5个样品)、肝癌(19个样品)、正常肝脏(得自肝癌患者)(8个样品)、肾癌(89个样品)、正常肾脏(得自肾癌患者)(64个样品)、胰腺癌(55个样品)、正常胰腺(得自胰腺癌患者)(16个样品)、白血病(6个样品)、淋巴瘤(90个样品)、正常骨髓(2个样品)、黑素瘤(10个样品)和正常皮肤(72个样品)。
实施例2
[0212]DNA芯片分析
使用由实施例1中所述的样品制备的总RNA进行DNA芯片分析。对于DNA芯片分析，使用基因芯片人类基因组U133套件(Affymetrix)。具体地说，分析包含以下步骤：(1)由总RNA制备cDNA，(2)由cDNA制备标记的cRNA，(3)片段化标记的cRNA，(4)使片段化的cRNA与探针阵列杂交，(5)染色探针阵列，(6)筛选探针阵列，和(7)分析基因表达。
[0213](1)由总RNA制备cDNA
将含有在实施例1中制备的每种总RNA(10μg)和T7-(dT)24引物(Amersham)(100pmol)(11μl)的混合物加热至70℃达10分钟，并在冰上冷却。在冷却后，加入5x首链cDNA缓冲液(4μL)、0.1M DTT(二硫苏糖醇)(2μl)和10mM dNTP Mix(1μl)(用于cDNA合成的SuperScript选择系统(Gibco-BRL))，将混合物加热至42℃达2分钟。然后，加入Super ScriptII RT(2μl，400U)(包含在上述试剂盒中)，将混合物加热至42℃达1小时，然后在冰上冷却。在冷却后，加入用DEPC(nacalai tesque)(91μl)处理的无菌蒸馏水和5x第二链反应缓冲液(30μL)、10mM dNTP Mix(3μl)、大肠杆菌DNA连接酶(1μl，10U)、大肠杆菌DNA聚合酶I(4μl，40U)和大肠杆菌RNaseH(1μl，2U)(包括在如上所述的试剂盒中)，将混合物于16℃温育2小时。在加入T4DNA聚合酶(2μl，10U)(包括在如上所述的试剂盒中)之后，将混合物再于16℃温育5分钟，然后添加0.5M EDTA(10μl)。加入苯酚/氯仿/异戊醇溶液(NIPPON GENE CO.，LTD.)(162μl)并混合。将混合物移至预先于室温以14,000rpm离心30秒的Phase Lock Gel Light(Eppendorf)，并于室温以14,000rpm离心2分钟，将其水相(145μl)移至Eppendorf管。向获得的溶液添加7.5M乙酸铵溶液(72.5μl)和乙醇(362.5μl)，并混合，然后于4℃以14,000rpm离心20分钟。在离心后，通过废弃上清液获得含有所制备的cDNA的沉淀。然后，向沉淀添加80％乙醇(0.5mL)，并于4℃以14,000rpm离心5分钟，废弃上清液。在重复相同的步骤后，干燥沉淀，用DEPC-处理的水(12μl)裂解。结果，由在实施例1中制备的每种总RNA获得cDNA。
[0214](2)由cDNA制备标记的cRNA
将每种cDNA溶液(5μl)与DEPC-处理的水(17μl)和10x HY反应缓冲液(4μl)、10x生物素标记的核糖核苷酸(4μl)、10x DTT(4μl)、10xRNA酶抑制剂混合物(4μl)和20xT7RNA聚合酶(2μl)(BioArray高产RNA转录物标记试剂盒(ENZO))混合，并于37℃温育5小时，以制备标记cRNA。在温育后，向溶液加入DEPC-处理的水(60μl)，利用RNeasy小型试剂盒(GIAGEN)按照生产商的方案纯化所制备的标记cRNA。
[0215](3)片段化标记的cRNA
向5x片段化缓冲液(200mM Tris-乙酸pH 8.1(Sigma)、500mM乙酸钾(Sigma)、150mM乙酸镁(Sigma))(8μl)加入含有每种标记的cRNA(20μg)的溶液，加热溶液(40μl)至94℃达35分钟，并置于冰上。结果，实现了标记cRNA的片段化。
[0216](4)片段化的cRNA与探针阵列的杂交
将每种片段化的cRNA(40μl)加入5nM对照寡聚物B2(Amersham)(4μl)、100x对照cRNA混合物(4μl)、鲱鱼精DNA(Promega)(40μg)、乙酰化BSA(Gibco-BRL)(200μg)、2xMES杂交缓冲液(200mM MES，2M[Na+]，40mM EDTA，0.02％吐温20(Pierce)，pH6.5-6.7)(200μl)和DEPC处理的水(144μl)，产生杂交混合物(400μl)。将获得的每种杂交混合物加热至99℃达5分钟，然后于45℃达5分钟。在加热后，于室温以14,000rpm离心杂交混合物5分钟，以获得上清液。
[0217]同时，如下制备检验阵列：用1xMES杂交缓冲液装载人类基因组U133探针阵列(Affymetrix)，在杂交烘箱中于45℃以60rpm旋转该阵列10分钟，然后除去1xMES杂交缓冲液。将如上获得的每种杂交混合物的上清液(200μl)加入探针阵列，在杂交烘箱中于45℃以60rpm旋转该探针阵列16小时，以使片段化的cRNA与探针阵列杂交。
[0218](5)探针阵列的染色
在由每个与片段化的cRNA杂交的探针阵列除去杂交混合物之后，用非严格洗涤缓冲液(6x SSPE(由20x SSPE(nacala itesque)稀释)、0.01％吐温20和0.005％防沫剂0-30(Sigma)装载探针阵列。然后，将与片段化的cRNA杂交的探针阵列置于装载非严格洗涤缓冲液和严格洗涤缓冲液(100mMMES、0.1M NaCl、0.01％吐温20)的GeneChipFluidics Station 400(Affymetrix)中的给定位置。此后，按照染色方案EuKGE-WS2，用第一染色溶液(10μg/mL链霉抗生物素蛋白藻红蛋白(SAPE)(MolecuLar Probe)、2mg/mL乙酰化BSA、100mM MES、1MNaCl(Ambion)、0.05％吐温20、0.005％防沫剂0-30)和第二染色溶液(100μg/mL山羊IgG(Sigma)、3μg/mL生物素化抗-链霉抗生物素蛋白抗体(Vector Laboratories)、2mg/mL乙酰化BSA、100mM MES、1MNaCl、0.05％吐温20、0.005％防沫剂0-30)染色探针阵列。
[0219](6)探针阵列的扫描和(7)基因表达水平分析
将染色的探针阵列运用于HP基因阵列扫描仪(Affymetrix)，并读取染色模式。基于该染色模式，通过基因芯片工作站系统(Affymetrix)分析探针阵列上的基因表达。然后，在按照分析方案标准化后，计算每个样品中每种探针(即每种基因)的表达水平(平均差异)以及是否存在表达。对于每种探针，计算不同种类样品的每一种的基因表达水平的平均值，并获得不同种类样品之间的表达水平和频率的差异。
实施例3
[0220]表达变异分析
如下所述，选择显示出在源自多种主要器官(肺、结肠、直肠、胃、乳腺、肝脏、肾脏、卵巢、胰腺)中癌组织的表达水平和/或频率比正常组织增加的基因。
[0221]按照基因表达的DNA芯片分析结果，从一组其在癌组织中的表达水平和/或频率相比于对应的正常组织增加的探针中，选择在许多癌组织中的表达水平和/或频率显示明确增加的探针。然后，检查并选择对应于这些选定探针的基因。
结果，选定6个基因：BUB1、C10orf3、C20orf42、Lengsin、HIFPH3和BJ-TSA-9基因。这6种基因的表达变异比率描述于表2，表达频率描述于表3。
Figure A200780018810D00731
[0224]表2中的值指示与对应的正常组织相比在多种癌症组织中的表达变化比率，其中在每种癌症组织中的表达水平相对于用人基因组U133芯片分析的在每种正常组织中的表达水平(被视为1)确定。表3中的值指示所述基因在多种癌症组织和正常组织中的表达频率(％)。
[0225]BUB1基因显示出在检验的所有癌症组织中的表达水平相比于正常组织增加，该增加在肺鳞状细胞癌和卵巢癌中特别显著。表达频率也增加，该增加在肺鳞状细胞癌、卵巢癌和黑素瘤组织中特别显著。
C10orf3基因显示出在乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、直肠癌和黑素瘤组织中的表达水平相比于正常组织增加，该增加在卵巢癌、肝癌和肺鳞状细胞癌中特别显著。如对表达水平所观察到的一样，表达频率在除血癌之外的所有癌症中也增加，该增加在肺鳞状细胞癌、胰腺癌和卵巢癌中特别显著。
[0226]C20orf42基因显示出在结肠癌、肝癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、胰腺癌、胃癌、直肠癌、白血病和恶性淋巴瘤组织中的表达水平相比于正常组织增加，该增加在肺鳞状细胞癌和肺腺癌中特别显著。表达频率也增加，该增加在肺腺癌、肺鳞状细胞癌和胰腺癌中特别显著。
Lengsin基因显示出在肺腺癌、肺鳞状细胞癌和胃癌中的表达水平相比于正常组织增加，该增加在肺腺癌中特别显著。如对表达水平所观察到的一样，表达频率在肺腺癌、肺鳞状细胞癌和胃癌中也增加，该增加在肺腺癌中特别显著。
[0227]HIFPH3基因显示出在乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、胰腺癌和胃癌组织中的表达水平相比于正常组织增加，该增加在肾癌和肺鳞状细胞癌中特别显著。如对表达水平所观察到的一样，表达频率在乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、胰腺癌和胃癌中也增加，该增加在肾癌、肺鳞状细胞癌和胰腺癌中特别显著。
BJ-TSA-9基因显示出在肺腺癌、肺鳞状细胞癌和白血病中的表达水平相比于正常组织增加，该增加在白血病、肺腺癌和肺鳞状细胞癌中特别显著。如对表达水平所观察到的一样，表达频率在肺腺癌、肺鳞状细胞癌和白血病中也增加，该增加在肺腺癌和肺鳞状细胞癌中特别显著。
[0228]如上所示，选定的6种基因显示出在癌症组织中的表达水平和频率相比于对应的正常组织明确增加。因此，发现这6种基因及其表达产物(即蛋白)可用作癌症的疾病标志物(尤其是对于以上提及的癌症)。
实施例4
[0229]通过RT-PCR法对不同细胞和组织中的肿瘤抗原基因进行表达分析
通过RT-PCR法分析以上6种基因在不同的癌细胞系、癌症组织和正常组织中的表达。使用Isogen试剂(Nippon Gene)或市售可得(clontech)的来源于正常组织的RNA，用寡dT引物由提取自不同癌细胞系和癌症组织的RNA制备cDNA，并使用描述于表4的引物组合(BUB1基因，引物1：SEQ ID NO：208，引物2：SEQ ID NO：209；C10orf3基因，引物1：SEQ ID NO：210，引物2：SEQ ID NO：211；C20orf42基因，引物1：SEQ ID NO：206，引物2：SEQ ID NO：207；Lengsin基因，引物1：SEQ ID NO：202，引物2：SEQ ID NO：203；HIFPH3基因，引物1：SEQ ID NO：212，引物2：SEQ ID NO：213；BJ-TSA-9基因，引物1：SEQ ID NO：204，引物2：SEQ ID NO：205)通过PCR反应(40个循环)扩增。此后，通过电泳分离扩增的cDNA，以进行分析。作为阳性对照，以和上述相同的方式通过RT-PCR法证实G3PDH基因的表达。所用的一部分癌症和正常组织在得到知情同意后主要由手术样品制备。结果示于图1-6。
[0230][表4]
 
基因 引物1 引物2
lengsin tggcactggaagaagatcaa tcaccacaactttgttgtttgtt
BJ-TSA-9 cagatccaggtgcctctgac tcaggtaatccaaccaccttg
C20orf42 tgaatttctgaggccttgct tgttctcagcagcaaacagg
BUB1 ttatctgctggcttggcact gcttttgccttaacaaatcca
C10orf3 tgtccattgttaagaggtggtg tgagagggctacatgggttt
HIFPH3 catccctgtcttgtgtgtgg ccaacagccctggattaaga
[0231]BUB1基因在大部分正常组织中不表达或以低水平表达，但在口腔鳞状细胞癌、肾癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、淋巴瘤和黑素瘤细胞系中高度表达。
C10orf3基因在除睾丸以外的大部分正常组织中不表达或以低水平表达，但在肺腺癌、肺鳞状细胞癌和小细胞肺癌细胞系中高度表达。
C20orf42基因在大部分正常组织中不表达，但在结肠癌和胰腺癌细胞系中高度表达。
Lengsin基因在大部分正常组织中不表达，但在肺腺癌和肺鳞状细胞癌细胞系中高度表达。
HIFPH3基因在大部分正常组织中表达，但在肾癌细胞系中以较高水平表达。另外，相比于正常组织，HIFPH3基因在源自肾癌患者的许多癌症组织中以较高水平表达。
BJ-TSA-9在大部分正常组织中不表达，但在肺腺癌、肺鳞状细胞癌、小细胞肺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌和淋巴瘤细胞系中高度表达。
[0232]总之，这6种基因在多种癌细胞系和组织中高度表达，尽管癌症的类型彼此不同，但不在正常组织中表达或以比在癌细胞或组织中低的水平在正常组织中表达，除了DNA芯片分析结果以外，这些结果强有力地提示，这6种基因及其表达产物(即蛋白)可以用作癌症的疾病标志物(尤其是用于如上所述的癌症)。
实施例5
[0233]候选肽的合成和选择
(1)候选肽的选择
根据Lengsin的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，选择由SEQ ID NO：13-31和195-201的氨基酸序列以及SEQ ID NO：32-41的氨基酸序列组成的肽，分别作为潜在结合HLA-A24和HLA-A2分子的候选肽。
根据BJ-TSA-9的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)，选择由SEQ ID NO：42-49的氨基酸序列和SEQ ID NO：50-58的氨基酸序列组成的肽分别作为潜在结合HLA-A24和HLA-A2分子的候选肽。
根据C20orf42的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，选择由SEQ ID NO：59-78的氨基酸序列和SEQ ID NO：79-88的氨基酸序列组成的肽，作为分别潜在结合HLA-A24和HLA-A2分子的候选肽。
[0234]根据BUB1的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)，选择由SEQID NO：89-117的氨基酸序列和SEQ ID NO：118-157的氨基酸序列组成的肽，作为分别潜在结合HLA-A24和HLA-A2分子的候选肽。
根据C10orf3的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)，选择由SEQ ID NO：158-165的氨基酸序列和SEQ ID NO：166-175的氨基酸序列组成的肽，作为分别潜在结合HLA-A24和HLA-A2分子的候选肽。
根据HIFPH3的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)，选择由SEQ ID NO：176-183的氨基酸序列和SEQ ID NO：184-194的氨基酸序列组成的肽，作为分别潜在结合HLA-A24和HLA-A2分子的候选肽。得到所述肽的氨基酸序列上的位置以及所述肽的长度和氨基酸序列列于以下的表5-16。
[0235][表5]
Lengsin A24肽
 
肽 氨基酸序列 SEQ ID NO
Lengsin_295(10) KYNYIASFFI 13
Lengsin_368(9) RYSKDRKDL 14
Lengsin_447(9) FYQVEPSEI 15
Lengsin_489(9) KYELENEEI 16
Lengsin_49(9) DMSNSNDCM 17
Lengsin_56(9) CMRDSSQIL 18
Lengsin_72(9) RMKHIRQAM 19
Lengsin_86(10) QFVRFEATDL 20
Lengsin_118(10) CMPRGYLEVI 21
Lengsin_142(9) CFNSDIVLM 22
Lengsin_160(10) PWADRTARVI 23
Lengsin_172(10) TFTVTGEPLL 24
Lengsin_199(9) GFSLLSAFI 25
Lengsin_238(10) PFMQELVDGL 26
Lengsin_265(10) QMEISFLPEF 27
Lengsin_318(10) LWDVDRKKNM 28
Lengsin_383(10) TWGYNDNSCI 29
Lengsin_385(9) GYNDNSCIF 30
Lengsin_479(9) TFIRYFVAM 31
Lengsin_149(11) LMPELSTFRVL 195
Lengsin_326(12) NMFCSTSGTEQL 196
Lengsin_486(12) AMKKYELENEEI 197
Lengsin_185(11) RYIAKRQLSHL 198
Lengsin_247(11) LYHTGANVESF 199
Lengsin_482(11) RYFVAMKKYEL 200
Lengsin_207(12) IYDFCIFGVPEI 201
[0236][表6]
Lengsin A2肽
 
肽 氨基酸序列 SEQ ID NO
Lengsin_313(9) ILSHSLWDV 32
Lengsin_239(9) FMQELVDGL 33
Lengsin_246(9) GLYHTGANV 34
Lengsin_206(10) FIYDFCIFGV 35
Lengsin_149(10) LMPELSTFRV 36
Lengsin_79(10) AMAKNRLQFV 37
Lengsin_312(10) GILSHSLWDV 38
Lengsin_270(10) FLPEFGISSA 39
Lengsin_231(10) FLNNHDQPFM 40
Lengsin_336(10) QLTITGKKWL 41
[0237][表7]
BJ-TSA-9A24肽
 
肽 氨基酸序列 SEQ ID NO
BJ-TSA-9_20(10) QWVRPARADF 42
BJ-TSA-9_120(10) SWASAEKPYL 43
BJ-TSA-9_138(10) YFQTVKHNNI 44
BJ-TSA-9_165(10) LMDVFTDVEI 45
BJ-TSA-9_227(10) IYCAKSGRKF 46
BJ-TSA-9_273(9) KFTGQAVEL 47
BJ-TSA-9_281(9) LFDEEFRHL 48
BJ-TSA-9_289(9) LYASSKPVM 49
[0238][表8]
BJ-TSA-9A2肽
 
肽 氨基酸序列 SEQ ID NO
BJ-TSA-9_164(9) ILMDVFTDV 50
BJ-TSA-9_252(9) VLSGSYSFT 51
BJ-TSA-9_100(9) LQSGTYFPV 52
BJ-TSA-9_99(10) SLQSGTYFPV 53
BJ-TSA-9_191(10) VLLDQGGVKL 54
BJ-TSA-9_199(10) KLFQEMCDKV 55
BJ-TSA-9_62(10) FLSSVEAQYI 56
BJ-TSA-9_270(10) ILSKFTGQAV 57
BJ-TSA-9_163(10) VILMDVFTDV 58
[0239][表9]
C20orf42 A24肽
 
肽 氨基酸序列 SEQ ID NO
C20orf42_79(10) KYGVQADAKL 59
C20orf42_182(9) LYSKTMTPI 60
C20orf42_283(10) KYDAVRINQL 61
C20orf42_292(10) LYEQARWAIL 62
C20orf42_319(9) QYHISKLSL 63
C20orf42_381(10) SYQPEVLNIL 64
C20orf42_655(9) EYIGGYIFL 65
C20orf42_52(9) VMLKLVEQI 66
C20orf42_68(9) CWLLKTHWTL 67
C20orf42_89(9) LFTPQHKML 68
C20orf42_202(10) TMTWFSDSPL 69
C20orf42_249(9) GWLDSSRSL 70
C20orf42_271(10) RFKYYSFFDL 71
C20orf42_392(10) YWFIFKDTSI 72
C20orf42_460(10) QYAQWMAACM 73
C20orf42_510(9) NMDMNPECF 74
C20orf42_545(9) QMPLVEAKL 75
C20orf42_554(9) RFIQAWQSL 76
C20orf42_558(10) AWQSLPEFGL 77
C20orf42_603(10) TWRFTNIKQW 78
[0240][表10]
C20orf42A2肽
 
肽 氨基酸序列 SEQ ID NO
C20orf42_69(9) WLLKTHWTL 79
C20orf42_361(9) SLLEDITDI 80
C20orf42_377(9) KLFRPKKLL 81
C20orf42_417(9) KLNLRGCEV 82
C20orf42_300(9) ILLEEIDCT 83
C20orf42_610(9) KQWNVNWET 84
C20orf42_621(9) VVIEFDQNV 85
C20orf42_291(10) QLYEQARWAI 86
C20orf42_95(10) KMLRLRLPNL 87
C20orf42_88(10) LLFTPQHKML 88
[0241][表11]
Bub1A24肽
 
肽 氨基酸序列 SEQ ID NO
Bub1_43(10) EYLITLLEHL 89
Bub1_61(9) KYHNDPRFI 90
Bub1_89(9) LYNHGIGTL 91
Bub1_101(9) LYIAWAGHL 92
Bub1_139(9) QYRLFQTRL 93
Bub1_670(9) MYSASLLRL 94
Bub1_801(9) VYEATQGDL 95
Bub1_870(9) SYGTLLNAI 96
Bub1_1061(9) HYTNKIRAL 97
Bub1_29(10) RYIQWVEENF 98
Bub1_77(10) EYNSDLHQFF 99
Bub1_206(9) NMERRVITI 100
Bub1_235(9) VMYCKEKLI 101
Bub1_292(9) KMDELHKKL 102
Bub1_353(9) TYQQTPVNM 103
Bub1_414(10) EFKPQSGAEI 104
Bub1_474(10) MFQAPTLPDI 105
Bub1_552(10) TFGERSVSRL 106
Bub1_574(9) EFLDDSTVW 107
Bub1_581(10) VWGIRCNKTL 108
Bub1_741(10) PWDDKLIFKL 109
Bub1_837(9) LMERLKPSM 110
Bub1_880(10) LYKNTPEKVM 111
Bub1_922(9) NFILGNGFL 112
Bub1_952(10) DMKLFPKGTI 113
Bub1_995(10) VYCMLFGTYM 114
Bub1_1018(10) LFRRLPHLDM 115
Bub1_1037(10) MWNEFFHVML 116
Bub1_1057(10) VFQQHYTNKI 117
[0242][表12]
Bub1 A2肽
 
肽 氨基酸序列 SEQ ID NO
Bub1_781(9) QLGSKLVYV 118
Bub1_998(9) MLFGTYMKV 119
Bub1_1026(9) DMWNEFFHV 120
Bub1_392(9) TVTDSMFAV 121
Bub1_900(9) RMLYMIEQV 122
Bub1_1017(9) GLFRRLPHL 123
Bub1_903(9) YMIEQVHDC 124
Bub1_750(9) LLSGLSKPV 125
Bub1_44(9) YLITLLEHL 126
Bub1_88(9) FLYNHGIGT 127
Bub1_292(9) KMDELHKKL 128
Bub1_785(9) KLVYVHHLL 129
Bub1_268(9) WVNEDRHYM 130
Bub1_699(9) RLTDTDAAI 131
Bub1_943(9) ALIDLGQSI 132
Bub1_746(9) LIFKLLSGL 133
Bub1_235(9) VMYCKEKLI 134
Bub1_68(9) FITYCLKFA 135
BUb1_613(9) KLPVESVHI 136
Bub1_471(9) IMNMFQAPT 137
Bub1_780(10) FQLGSKLVYV 138
Bub1_575(10) FLDDSTVWGI 139
Bub1_792(10) LLGEGAFAQV 140
Bub1_749(10) KLLSGLSKPV 141
Bub1_25(10) GEWERYIQWV 142
Bub1_954(10) KLFPKGTIFT 143
Bub1_997(10) CMLFGTYMKV 144
Bub1_745(10) KLIFKLLSGL 145
Bub1_686(10) VLTCEAELGV 146
Bub1_879(10) NLYKNTPEKV 147
Bub1_88(10) FLYNHGIGTL 148
Bub1_287(10) QLLKQKMDEL 149
Bub1_836(10) QLMERLKPSM 150
Bub1_613(10) KLPVESVHIL 151
Bub1_722(10) WMQMSSLGTV 152
Bub1_470(10) FIMNMFQAPT 153
Bub1_141(10) RLFQTRLTET 154
Bub1_982(10) WNYQIDYFGV 155
Bub1_447(10) GMVQATPSKV 156
Bub1_1048(10) DLLRQKLKKV 157
[0243][表13]
C10orf3 A24肽
 
肽 氨基酸序列 SEQ ID NO
C10orf3_193(10) VYVKGLLAKI 158
C10orf3_446(10) QYPATEHRDL 159
C10orf3_169(10) EMEIQLKDAL 160
C10orf3_355(9) QMQACTLDF 161
C10orf3_193(10) VYVKGLLAKI 162
C10orf3_446(10) QYPATEHRDL 163
C10orf3_169(10) EMEIQLKDAL 164
C10orf3_355(9) QMQACTLDF 165
[0244][表14]
C10orf3A2肽
 
肽 氨基酸序列 SEQ ID NO
C10orf3_197(9) GLLAKIFEL 166
C10orf3_376(9) QLLVILKEL 167
C10orf3_99(9) ALLEQLEET 168
C10orf3_341(9) KQQEEQTRV 169
C10orf3_228(9) YLQEEKQKC 170
C10orf3_392(9) TQLESLKQL 171
C10orf3_282(10) LLYSQRRADV 172
C10orf3_50(10) KLTDKERHRL 173
C10orf3_350(10) ALLEQQMQAC 174
C10orf3_328(10) LLSQVQFLYT 175
[0245][表15]
HIFPH3 A24肽
 
肽 氨基酸序列 SEQ ID NO
HIFPH3_6(9) IMRLDLEKI 176
HIFPH3_27(9) GFCYLDNFL 177
HIFPH3_92(10) SFLLSLIDRL 178
HIFPH3_112(10) YYVKERSKAM 179
HIFPH3_155(10) NWDAKLHGGI 180
HIFPH3_167(9) IFPEGKSFI 181
HIFPH3_173(9) SFIADVEPI 182
HIFPH3_295(9) RYAMTVWYF 183
[0246][表16]
HIFPH3 A2肽
 
肽 氨基酸序列 SEQ ID NO
HIFPH3_93(9) FLLSLIDRL 184
HIFPH3_30(9) YLDNFLGEV 185
HIFPH3_18(9) YIVPCLHEV 186
HIFPH3_159(9) KLHGGILRI 187
HIFPH3_60(9) QLAGPRAGV 188
HIFPH3_42(9) CVLERVKQL 189
HIFPH3_22(10) CLHEVGFCYL 190
HIFPH3_34(10) FLGEVVGDCV 191
HIFPH3_96(10) SLIDRLVLYC 192
HIFPH3_93(10) FLLSLIDRLV 193
HIFPH3_151(10) YLNKNWDAKL 194
[0247](2)肽合成
在如上所述的肽(SEQ ID NO：13-201)中，通过Fmoc法合成得自Lengsin的26种肽(表5)、得自BJ-TSA-9的7种肽(表7)、得自C20orf42的20种肽(表9)和得自C10orf3的4种肽(表13)。
实施例6
[0248]评价得自不同抗原的肽对HLA-A*2402和HLA-A*0201的结合亲和性
通过如在文献(J.Immunol.164：2565，2000)中所述的方法，测定在实施例1中合成的肽对HLA-A*2402的结合亲和性。通过将由HLA-A*2402和H-2Kb组成的嵌合MHC基因稳定引入到没有MHC I类分子的小鼠淋巴瘤细胞系RMA-S中获得细胞系RMA-S-A*2402细胞，将该细胞于26℃温育18小时。用PBS溶液洗涤RMA-S-A*2402细胞，悬浮在含有3μL/mL人β2-微球蛋白和100μL/mL每种肽的培养溶液OPTI-MEM(Invitrogen)中，并于26℃温育3小时和于37℃温育3小时。用PBS溶液洗涤细胞，并用抗-HLA-A24抗体于4℃处理30分钟。此外，用PBS溶液洗涤细胞，并用PE-标记的抗小鼠IgG抗体于4℃处理30分钟。洗涤细胞，并悬浮在含有1％福尔马林的1mlPBS溶液中进行固定。通过用于流式细胞术的装置FACScan(BDBioscience)检测细胞，由平均荧光强度获得肽的结合亲和力。在图7-9中显示了所检验的31种肽的结合亲和力。
[0249]EB病毒来源的肽(EBV)和HIV病毒来源的肽(HIV)已被报告结合HLA-A*2402(分别为J.Immunol.158：3325，1997和J.Immunol.164：2565，2000)，用作阳性对照，表现出强结合活性。卵清蛋白来源的肽(SL8)已被报告结合H2-Kb(Eur J Immunol.21：2891，1991)，用作阴性对照，显示出弱结合活性。所检验的31种肽都被证实全部以高度优先的方式结合HLA-A*2402。因此，发现这31种肽为肿瘤抗原肽，得自这些肽的蛋白BJ-TSA-9、C20orf42和C10orf3为肿瘤抗原蛋白。
[0250]同样，得自Lengsin的23种肽对HLA-A*2402的结合亲和性示于图10和11。SEQ ID NO：15、16、21、22、23、24、25、26、27、30、195、197、198、199、200和201的肽显示出对HLA-A*2402的显著结合亲和性。因此，发现这些肽为肿瘤抗原肽，得自这些肽的蛋白Lengsin为肿瘤抗原蛋白。
对HLA-A*0201的结合亲和性可以通过使用人淋巴瘤细胞系T2以相同方式证实。另外，可类似地证实得自BUB1和HIFPH3的肽对HLA的结合亲和性。
实施例7
[0251]肿瘤抗原来源的肽的CTL诱导
通过评价在实施例6中显示出对HLA的结合亲和性的肽诱导的CTL活性，可以证实以下事实：蛋白BUB1、C10orf3、C20orf42、Lengsin、HIFPH3和BJ-TSA-9为肿瘤抗原蛋白，其部分肽为肿瘤抗原肽。肽的CTL诱导和所诱导CTL的活性评价可以如在文献(J.Immunol.169：1611，2002，WO 02/47474，Int J.Cancer：100，565-570(2002))中所述使用人外周血单核细胞或用于人的模型动物按照已知测定进行。就使用人外周血单核细胞的测定而言，在得到知情同意后由癌症患者或健康个体收集外周血，通过密度梯度离心法分离单核细胞，并在AIM-V培养溶液(Invitrogen)中培养。在24小时培养后，收集非粘附细胞，并在含100U/mL IL-2的AIM-V中培养。为了制备抗原提呈细胞，在含有1000U/mLIL-4和1000U/mL GM-CSF的AIM-V培养物溶液中培养粘附细胞达5天，在加入每种不同的肿瘤抗原肽后再培养1天，在加入10ng/mL TNF和1000U/mL IFN-α后再培养1天。非粘附细胞与用所述肽脉冲的抗原提呈细胞一起培养。在通过使用肽脉冲的抗原提呈细胞进行第一次肽刺激后的第7和14天，含有肽脉冲的CTL的非粘附细胞接受第二次和第三次肽刺激。在第三次刺激后1周，将细胞与用放射性物质如51Cr或非放射性物质标记的靶细胞(表达与要给予的肽结合的HLA此外还提供要给予的肽的肿瘤抗原或要给予的肽自身的细胞，或者预先用对应肽脉冲的细胞)一起共培养，然后由在条件培养基中的放射性或非放射性物质的量评价CTL对靶细胞的裂解，以确定CTL活性。还可以使用ELISA或ELISPOT，通过检测在条件培养基中作为CTL和靶细胞之间响应的结果而产生的IFN-γ，评价CTL活性。
[0252]在使用用于人的模型动物评价该活性时，将稳定形成的肿瘤抗原肽给予表达人HLA的转基因小鼠，在约1周后，获得脾细胞或其它淋巴组织。用与给予肽相同的肽在体外刺激获得的细胞，并培养约5天。所获细胞被视为对应于CTL群体，CTL活性可如上所述评价。
实施例8
[0253]C10orf3来源的肽的CTL诱导
如在实施例7中所述，用C10orf3来源的肽C10orf3_193(10)刺激HLA-A*2402-阳性的癌症患者的外周血单核细胞(PBMC)，以诱导CTL。通过使用T2A24细胞(通过将HLA-A*2402基因导入不具有该基因的T2细胞(ATCC编号CRL-1992)中产生)以及对HLA-A*2402和C10orf3为阳性的癌细胞系Sw480作为靶细胞测定CTL活性，结果示于表12。诱导的CTL克隆显示出肽特异性细胞毒活性。另外，诱导的CTL克隆杀死HLA-A*2402和C10orf3阳性癌细胞系，但不杀死HLA阴性的K562细胞。该结果证实，肽C10orf3_193(10)(SEQ ID NOS：158、162)是肿瘤抗原肽，C10orf3也是肿瘤抗原蛋白。
实施例9
[0254]Lengsin来源的肽的CTL诱导
混合一些潜在结合HLA-A*2402的合成肽，并如在实施例7中所述，用于刺激HLA-A*2402阳性的癌症患者的PBMC，以诱导CTL。在诱导后，利用ELISPOT通过检测IFN-γ来测量对每种肽的响应，结果示于图13。SEQ ID NO：22、23、26、27、198、200和201的肽诱导肽特异性CTL。这些结果证实，SEQ ID NO：22、23、26、27、198、200和201的肽为肿瘤抗原肽，还证实Lengsin为肿瘤抗原蛋白。
然后，用SEQ ID NO：22的肽刺激癌症患者的PBMC，以诱导CTL，并检测作为细胞毒活性的CTL诱导活性。结果示于图14。CTL显示出特异性针对靶细胞的细胞毒活性，所述靶细胞用与用于刺激相同的肽脉冲。
实施例10
[0255]HIFPH3来源的肽的CTL诱导
混合SEQ ID NO：177、178、179和183的肽，并如在实施例7中所述，用于刺激HLA-A*2402阳性的癌症患者的PBMC，以诱导CTL。在诱导后，检测针对不同肾癌细胞系的细胞毒活性，结果示于图15。用所述肽刺激的淋巴细胞显示出针对HLA-A24+HIFPH3+SMKT R-1细胞但不针对HLA-A24-HIFPH3+SMKT R-4细胞、HLA-A24+HIFPH3-Caki-1细胞、HLA-A24-HIFPH3-ACHN细胞和HLA-K562细胞的细胞毒活性。这些结果表明，针对HIFPH3的HLA-A24-限制性的CTL通过所述肽刺激诱导，然后证实肽HIFPH3_27(9)(SEQ ID NO：177)、HIFPH3_92(10)(SEQ ID NO：178)、HIFPH3_112(10)(SEQ ID NO：179)和HIFPH3_295(9)(SEQ ID NO：183)为肿瘤抗原肽，HIFPH3为肿瘤抗原蛋白。
实施例11
[0256]C20orf42来源的肽的CTL诱导
将20种针对HLA-A*2402合成的肽分为5组，每组含有4种肽。将HLA-A*2402阳性的癌症患者的PBMC铺板在96孔板中，并按照实施例7用各组肽的每一种刺激，以诱导CTL。当用各组刺激在384孔中的PBMC时，检查针对用于刺激的各种肽的细胞毒活性，检测8-14个孔中对所述肽特异性的细胞毒活性。该结果证实，C20orf42来源的肽为肿瘤抗原肽，C20orf42为肿瘤抗原蛋白。
工业适用性
[0257]本发明提供新的肿瘤抗原蛋白和肽及其在癌症免疫领域中的用途。肿瘤抗原蛋白和由其获得的的肽可以用于治疗表达所述肿瘤抗原蛋白的癌症患者。
附图简述
[0258][图1]图1显示了通过RT-PCR分析的Lengsin基因的mRNA在主要的不同正常组织和肺癌细胞系中的表达水平。在该图中，Lengsin和G3PDH(阳性对照)的箭头表示分别显示所述基因的mRNA水平的条带位置。不同的正常组织或癌症组织如下：心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、大肠、PBMC、腺癌、鳞状细胞癌和小细胞癌。以下为不同肺癌细胞系的名称：LNY-1、A549、LHK2、1-87、LK79、Sq-1、LC817和Lu65。
[0259][图2]图2显示了通过RT-PCR分析的BJ-TSA-9基因的mRNA在主要的不同正常组织以及肺、口腔和其它癌细胞系中的表达水平。在该图中，BJ-TSA-9和G3PDH(阳性对照)的箭头表示分别显示所述基因的mRNA水平的条带位置。不同的正常组织或癌症组织如下：心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、大肠、PBMC、腺癌、鳞状细胞癌和小细胞癌。以下为起源于不同器官的癌细胞系的名称：LNY-1、A549、LHK2、1-87、LK79、Sq-1、LC817、Lu65、OSC19、OSC20、OSC30、OSC40、OSC70、HSC2、HSC3、HSC4、KOSC3、HO-1-N-1、R3、SW450、SSTW、HS776、CHC20、CHC32、C1R、T2、888mel和LG2mel。
[0260][图3]图3显示了通过RT-PCR分析的C20orf42基因的mRNA在主要的不同正常组织以及结肠和胰腺癌细胞系中的表达水平。在该图中，C20orf42和G3PDH(阳性对照)的箭头表示分别显示所述基因的mRNA水平的条带位置。不同的正常组织或癌症组织如下：心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠、白细胞、结肠癌和胰腺癌。以下为不同的结肠和胰腺癌细胞系的名称：SW480、SW620、colo205、WiDR、CFPAC、PK8、SuSu86和PUN。
[0261][图4]图4显示了通过RT-PCR分析的BUB1基因的mRNA在主要的不同正常组织和口腔鳞状细胞癌、肾癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、淋巴瘤和黑素瘤细胞系中的表达水平。在该图中，BUB1和G3PDH(阳性对照)的箭头表示分别显示所述基因的mRNA水平的条带位置。以下为起源于不同器官的癌细胞系的名称：OSC19、HSC2、Caki1、R3、SW450、SSTW、HS776T、PUN、CHC20、CHC32、C1R、T2、888mel和LG2MEL。
[0262][图5]图5显示了通过RT-PCR分析的C10orf3基因的mRNA在主要的不同正常组织和肺癌细胞系中的表达水平。在该图中，C10orf3和G3PDH(阳性对照)的箭头表示分别显示所述基因的mRNA水平的条带位置。不同的正常组织或癌症组织如下：心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、大肠、PBMC、腺癌和鳞状细胞癌、小细胞癌。以下为起源于不同器官的癌细胞系的名称：LNY-1、A549、LHK2、1-87、LK79、Sq-1、LC817和Lu65。
[0263][图6]图6显示了通过RT-PCR分析的HIFPH3基因的mRNA在主要的不同正常组织和肾癌组织以及肾癌细胞系中的表达水平。在该图中，HIFPH3和G3PDH与β-肌动蛋白(阳性对照)的箭头表示分别显示所述基因的mRNA水平的条带位置。不同的正常组织或癌症组织如下：心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠、白细胞、RCC(肾细胞癌)。T和N分别意指肿瘤和正常组织。以下为肾癌细胞系的名称：SMKTR-1、SMKTR-2、SMKTR-3、SMKTR-4、Caki-1和ACHN。
[0264][图7]图7显示了得自BJ-TSA-9的8种肽、EB病毒来源的肽(EBV)以及HIV来源的肽(HIV)(阳性对照)和卵清蛋白来源的肽(SL8)(阴性对照)对HLA-A*2402的结合亲和性。在该图中，水平轴指示平均荧光强度(MFI，对应于结合亲和性)，垂直轴指示肽的名称。未加入肽所获得的结果记录为(-)。
[0265][图8]图8显示了得自C20orf42的20种肽、EB病毒来源的肽(EBV)以及HIV来源的肽(HIV)(阳性对照)和卵清蛋白来源的肽(SL8)(阴性对照)对HLA-A*2402的结合亲和性。在该图中，水平轴指示平均荧光强度(MFI，对应于结合亲和性)，垂直轴指示肽的名称。未加入肽所获得的结果记录为(-)。
[0266][图9]图9显示了得自C10orf3的4种肽、EB病毒来源的肽(EBV)以及HIV来源的肽(HIV)(阳性对照)和卵清蛋白来源的肽(SL8)(阴性对照)对HLA-A*2402的结合亲和性。在该图中，水平轴指示平均荧光强度(MFI，对应于结合亲和性)，垂直轴指示肽的名称。未加入肽所获得的结果记录为(-)。
[0267][图10]图10显示了得自Lengsin的16种肽、HIV来源的肽(HIV)(阳性对照)和卵清蛋白来源的肽(SL8)(阴性对照)对HLA-A*2402的结合亲和性。在该图中，水平轴指示平均荧光强度(MFI，对应于结合亲和性)，垂直轴指示肽的名称。未加入肽所获得的结果记录为(-)。
[0268][图11]图11显示了得自Lengsin的7种肽、EB病毒来源的肽(EBV)(阳性对照)和卵清蛋白来源的肽(SL8)(阴性对照)对HLA-A*2402的结合亲和性。在该图中，水平轴指示平均荧光强度(MFI，对应于结合亲和性)，垂直轴指示肽的名称。未加入肽所获得的结果记录为(-)。
[0269][图12]图12显示了通过用C10orf3_193(10)肽刺激HLA-A*2402阳性的癌症患者的PBMC诱导的CTL的细胞毒活性。在该图中，“肽2”和“Sw480”分别表示使用以所述肽脉冲的T2-A24细胞以及对HLA-A*2402和C10orf3为阳性的癌细胞系Sw480作为靶细胞的结果。同样，“K562”和“(-)”分别表示使用HLA-阴性的K562细胞和未加入肽的T2-A24细胞作为靶细胞的结果。
[0270][图13]图13显示了用ELOSPOT通过检测INF-γ测量用Lengsin来源的肽刺激HLA-A*2402阳性的癌症患者的PBMC诱导的CTL响应。
[0271][图14]图14显示了通过用Lengsin_142(9)肽刺激癌症患者的PBMC诱导的CTL的细胞毒活性。在该图中，“T2A24+肽”和“T2A24”分别表示使用所述肽脉冲和未脉冲的T2-A24细胞作为靶细胞的结果。同样，“T2A24+HIV”和“K562”分别表示使用HIV来源的肽和HLA阴性K562细胞脉冲的T2-A24细胞作为靶细胞的结果。
[0272][图15]图15图示了通过用HIFPH3来源的肽(SEQ IDNO：177、178、179和183)的混合物刺激HLA-A*2402阳性的癌症患者的PBMC诱导CTL的结果。垂直轴指示细胞毒活性。在该图中，“E：T1Cr％”、“E：T3Cr％”和“E：T10Cr％”意指所述肽刺激的PBMC和癌细胞之间的比率分别为1、3和10。
序列表自由文本
[0273]SEQ ID NO：13-201的氨基酸序列是合成肽。
SEQ ID NO：202-213的碱基序列是引物。
序列表
<110>Sato，Noriyuki
Dainippon Sumitomo Pharma Co.，Ltd.公司
<120>新肿瘤抗原肽
<130>2007002W01
<150>JP 2006-086820
<151>2006-03-28
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<170>PatentIn version 3.1
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<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>57
<210>58
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>58
Figure A200780018810D01493
<210>59
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>59
Figure A200780018810D01501
<210>60
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>60
Figure A200780018810D01502
<210>61
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>61
Figure A200780018810D01503
<210>62
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>62
Figure A200780018810D01511
<210>63
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>63
<210>64
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>64
Figure A200780018810D01513
<210>65
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>65
<210>66
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>66
Figure A200780018810D01522
<210>67
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>67
Figure A200780018810D01523
<210>68
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>68
Figure A200780018810D01531
<210>69
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>69
Figure A200780018810D01532
<210>70
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>70
Figure A200780018810D01533
<210>71
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>71
Figure A200780018810D01541
<210>72
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>72
Figure A200780018810D01542
<210>73
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>73
Figure A200780018810D01543
<210>74
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>74
Figure A200780018810D01551
<210>75
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>75
Figure A200780018810D01552
<210>76
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>76
Figure A200780018810D01553
<210>77
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>77
Figure A200780018810D01561
<210>78
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>78
Figure A200780018810D01562
<210>79
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>79
Figure A200780018810D01563
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<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>80
Figure A200780018810D01571
<210>81
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>81
Figure A200780018810D01572
<210>82
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>82
Figure A200780018810D01573
<210>83
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>83
Figure A200780018810D01581
<210>84
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>84
Figure A200780018810D01582
<210>85
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>85
Figure A200780018810D01583
<210>86
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>86
Figure A200780018810D01591
<210>87
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>87
Figure A200780018810D01592
<210>88
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>88
<210>89
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>89
Figure A200780018810D01601
<210>90
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>90
Figure A200780018810D01602
<210>91
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>91
Figure A200780018810D01603
<210>92
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>92
Figure A200780018810D01611
<210>93
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>93
Figure A200780018810D01612
<210>94
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>94
Figure A200780018810D01613
<210>95
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>95
Figure A200780018810D01621
<210>96
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>96
Figure A200780018810D01622
<210>97
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>97
Figure A200780018810D01623
<210>98
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>98
Figure A200780018810D01631
<210>99
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>99
Figure A200780018810D01632
<210>100
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>100
<210>101
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>101
Figure A200780018810D01641
<210>102
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>102
Figure A200780018810D01642
<210>103
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>103
Figure A200780018810D01643
<210>104
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>104
Figure A200780018810D01651
<210>105
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>105
Figure A200780018810D01652
<210>106
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>106
Figure A200780018810D01653
<210>107
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>107
Figure A200780018810D01661
<210>108
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>108
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<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>109
<210>110
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>110
Figure A200780018810D01671
<210>111
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>111
Figure A200780018810D01672
<210>112
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>112
Figure A200780018810D01673
<210>113
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>113
Figure A200780018810D01681
<210>114
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>114
Figure A200780018810D01682
<210>115
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>115
Figure A200780018810D01683
<210>116
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>116
Figure A200780018810D01691
<210>117
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>117
Figure A200780018810D01692
<210>118
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>118
Figure A200780018810D01693
<210>119
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>119
Figure A200780018810D01701
<210>120
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>120
Figure A200780018810D01702
<210>121
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>121
Figure A200780018810D01703
<210>122
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>122
Figure A200780018810D01711
<210>123
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>123
Figure A200780018810D01712
<210>124
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>124
Figure A200780018810D01713
<210>125
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>125
Figure A200780018810D01721
<210>126
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>126
Figure A200780018810D01722
<210>127
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>127
Figure A200780018810D01723
<210>128
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>128
<210>129
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>129
Figure A200780018810D01732
<210>130
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>130
Figure A200780018810D01733
<210>131
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>131
Figure A200780018810D01741
<210>132
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>132
<210>133
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>133
Figure A200780018810D01743
<210>134
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>134
Figure A200780018810D01751
<210>135
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>135
Figure A200780018810D01752
<210>136
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>136
Figure A200780018810D01753
<210>137
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>137
Figure A200780018810D01761
<210>138
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>138
Figure A200780018810D01762
<210>139
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>139
Figure A200780018810D01763
<210>140
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>140
<210>141
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>141
<210>142
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>142
Figure A200780018810D01773
<210>143
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>143
Figure A200780018810D01781
<210>144
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>144
Figure A200780018810D01782
<210>145
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>145
Figure A200780018810D01783
<210>146
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>146
Figure A200780018810D01791
<210>147
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>147
Figure A200780018810D01792
<210>148
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>148
Figure A200780018810D01793
<210>149
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>149
Figure A200780018810D01801
<210>150
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>150
<210>151
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>151
Figure A200780018810D01803
<210>152
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>152
Figure A200780018810D01811
<210>153
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>153
<210>154
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>154
Figure A200780018810D01813
<210>155
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>155
Figure A200780018810D01821
<210>156
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>156
Figure A200780018810D01822
<210>157
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>157
Figure A200780018810D01823
<210>158
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
<400>158
Figure A200780018810D01831
<210>159
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成肽
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Claims (48)

1.一种含有来源于Lengsin(含谷氨酸-氨连接酶(谷氨酰胺合酶)结构域1，也称为GLULD1)、BJ-TSA-9(假定蛋白MGC14128)、C20orf42(URP1，也称为Kindlerin)、BUB1、C10orf3或HIFPH3(egl9同系物3，也称为EGLN3)的部分肽、能够结合HLA抗原并被CTL识别的肽。
2.权利要求1的肽，其中所述HLA抗原为HLA-A24或HLA-A2抗原。
3.权利要求2的肽，所述肽含有SEQ ID NO：13-201中任一项的氨基酸序列。
4.一种肽，所述肽含有一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ IDNO：13-31、42-49、59-78、89-117、158-165、176-183和195-201中任一项的氨基酸序列相同，只是2位的氨基酸被酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代，和/或C末端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代，所述肽能够结合HLA-A24抗原，并被CTL识别。
5.一种肽，所述肽含有一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ IDNO：32-41、50-58、79-88、118-157、166-175和184-194中任一项的氨基酸序列相同，只是2位的氨基酸被亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺取代，和/或C末端氨基酸被缬氨酸或亮氨酸取代，所述肽能够结合HLA-A2抗原，并被CTL识别。
6.一种表位肽，所述表位肽含有权利要求1-5中任一项的肽。
7.一种含有权利要求1-6中任一项的肽和在药学上可接受的载体的药物组合物。
8.一种含有编码权利要求1-6中任一项的肽的多核苷酸的核酸。
9.一种含有权利要求8的核酸和在药学上可接受的载体的药物组合物。
10.一种含有Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3和在药学上可接受的载体的药物组合物。
11.权利要求10的药物组合物，其中Lengsin含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
12.权利要求10的药物组合物，其中BJ-TSA-9含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
13.权利要求10的药物组合物，其中C20orf42含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
14.权利要求10的药物组合物，其中BUB1含有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
15.权利要求10的药物组合物，其中C10orf3含有SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
16.权利要求10的药物组合物，其中HIFPH3含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
17.一种含有核酸和在药学上可接受的载体的药物组合物，所述核酸包含编码Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸。
18.权利要求17的药物组合物，其中编码Lengsin的多核苷酸包含SEQ ID NO：1的碱基序列，或编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
19.权利要求17的药物组合物，其中编码BJ-TSA-9的多核苷酸包含SEQ ID NO：3的碱基序列，或编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
20.权利要求17的药物组合物，其中编码C20orf42的多核苷酸包含SEQ ID NO：5的碱基序列，或编码SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
21.权利要求17的药物组合物，其中编码BUB1的多核苷酸包含SEQ ID NO：7的碱基序列，或编码SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
22.权利要求17的药物组合物，其中编码C10orf3的多核苷酸包含SEQ ID NO：9的碱基序列，或编码SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
23.权利要求17的药物组合物，其中编码HIFPH3的多核苷酸包含SEQ ID NO：11的碱基序列，或编码SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
24.一种制备抗原提呈细胞的方法，其中使具有抗原提呈能力的细胞在体外与以下的任一种接触：
(a)权利要求1-6中任一项的肽，
(b)权利要求8的核酸，
(c)Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3，和
(d)含有编码Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸的核酸。
25.一种通过权利要求24的方法制备的抗原提呈细胞。
26.一种含有权利要求25的抗原提呈细胞和在药学上可接受的载体的药物组合物。
27.一种诱导CTL的方法，其中使外周血淋巴细胞在体外与以下的任一种接触：
(a)权利要求1-6中任一项的肽，
(b)权利要求8的核酸，
(c)Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3，和
(d)含有编码Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的多核苷酸的核酸。
28.通过权利要求27的方法诱导的CTL。
29.一种含有权利要求28的CTL和在药学上可接受的载体的药物组合物。
30.权利要求7、9-23、26或29中任一项的药物组合物，所述药物组合物用作CTL的诱导物。
31.权利要求7、9-23、26或29中任一项的药物组合物，所述药物组合物用作癌症疫苗。
32.一种特异性结合权利要求1-5中任一项的肽的抗体。
33.一种含有权利要求1-5中任一项的肽和HLA抗原的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体。
34.一种用于检测对肿瘤抗原肽特异性的CTL的试剂，所述肿瘤抗原肽来源于Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3，所述试剂含有作为组分的权利要求33的HLA单体、HLA二聚体、HLA四聚体或HLA五聚体。
35.一种由多核苷酸和/或其互补多核苷酸组成的疾病标志物，其中所述多核苷酸含有Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3基因的碱基序列的至少15个连续核苷酸。
36.权利要求35的疾病标志物，所述疾病标志物用作检测癌症的探针或引物。
37.权利要求35或36的疾病标志物，其中来源于Lengsin基因的疾病标志物用于肺腺癌、肺鳞状细胞癌或胃癌。
38.权利要求35或36的疾病标志物，其中来源于BJ-TSA-9基因的疾病标志物用于白血病、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、小细胞肺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌或淋巴瘤。
39.权利要求35或36的疾病标志物，其中来源于C20orf42基因的疾病标志物用于肺鳞状细胞癌、肺腺癌、肝癌、胃癌、白血病、恶性淋巴瘤组织、直肠癌、结肠癌或胰腺癌。
40.权利要求35或36的疾病标志物，其中来源于BUB1基因的疾病标志物用于乳腺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、卵巢癌、口腔鳞状细胞癌、肾癌、大肠癌(结肠癌、直肠癌)、胃癌、胰腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤或黑素瘤。
41.权利要求35或36的疾病标志物，其中来源于C10orf3基因的疾病标志物用于乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、小细胞肺癌或黑素瘤。
42.权利要求35或36的疾病标志物，其中来源于HIFPH3基因的疾病标志物用于乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、胰腺癌、肝癌、肺腺癌或肺鳞状细胞癌。
43.一种用于检测癌症的方法，所述方法包括以下步骤(a)、(b)和(c)：
(a)使由受试者的生物样品制备的RNA或由其转录的互补多核苷酸与权利要求35-42中任一项的疾病标志物杂交；
(b)通过使用所述疾病标志物作为指示剂检测与疾病标志物杂交的、由生物样品制备的RNA或由该RNA转录的互补多核苷酸；和
(c)基于(b)中的检测结果确定受试者是否患有癌症。
44.权利要求43的方法，其中步骤(C)中，对受试者的检测结果与健康个体的结果进行比较且在受试者中观察到的与疾病标志物的杂交水平高于在健康个体中观察到的水平时，则确定受试者患有癌症。
45.一种用于癌症的疾病标志物，所述疾病标志物包含特异性识别Lengsin、BJ-TSA-9、C20orf42、BUB1、C10orf3或HIFPH3的抗体。
46.权利要求45的疾病标志物，所述疾病标志物用作检测癌症的探针。
47.一种用于检测癌症的方法，所述方法包括以下步骤(a)、(b)和(c)：
(a)使由受试者的生物样品制备的蛋白与权利要求45或46中的疾病标志物结合；
(b)通过使用所述疾病标志物作为指示剂检测与疾病标志物结合的、由生物样品制备的蛋白或得自该蛋白的部分肽；和
(c)基于(b)中的检测结果确定受试者是否患有癌症。
48.权利要求47的方法，其中步骤(C)中，对受试者的检测结果与健康个体的结果进行比较且在受试者中观察到的与所述疾病标志物的结合水平高于在健康个体中观察到的水平时，则确定受试者患有癌症。
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