ES2844049T3

ES2844049T3 - Adyuvante para vacunas contra el cáncer

Info

Publication number: ES2844049T3
Application number: ES16776655T
Authority: ES
Inventors: Tomoya Miyakawa; Shun Doi; Koji Tamada
Original assignee: Cytlimic Inc
Current assignee: Cytlimic Inc
Priority date: 2015-04-07
Filing date: 2016-04-07
Publication date: 2021-07-21
Anticipated expiration: 2036-04-07
Also published as: EP3281641B1; US10842848B2; AU2016244570A1; RU2709015C2; JPWO2016163489A1; RU2017134693A; AU2016244570B2; EP3797794A1; CN107530432A; US20180071362A1; CN107530432B; EP3281641A1; EP3281641A4; US11491204B2; JP6311094B2; TWI738646B; BR112017020404A2; DK3281641T3; CA2981468A1; WO2016163489A1

Abstract

Adyuvante, que comprende un agonista del receptor 3 tipo Toll y proteína LAG-3, una variante funcional o un derivado de la misma.

Description

DESCRIPCIÓN

Adyuvante para vacunas contra el cáncer

Campo técnico

La presente invención se refiere a un medicamento o similar que contiene un agonista del receptor tipo Toll y una proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma.

Antecedentes de la técnica

Recientemente, se han desarrollado inmunoterapias contra el cáncer que seleccionan como diana antígenos cancerígenos expresados específicamente en células cancerosas. De ellos, una “terapia de vacuna contra el cáncer” es un método para inducir la regresión del cáncer mediante la administración de un antígeno cancerígeno directamente a los pacientes para inducir una respuesta inmunitaria específica a un antígeno cancerígeno en el cuerpo del paciente. Como antígeno cancerígeno que va a administrarse a un paciente, por ejemplo, se usan una proteína de antígeno cancerígeno en sí, un péptido derivado de antígeno cancerígeno, un ácido nucleico que los codifica, una célula dendrítica que presenta un antígeno cancerígeno y una célula cancerosa en sí.

Para potenciar la inducción de una respuesta inmunitaria por un antígeno cancerígeno, se administra un adyuvante junto con el antígeno cancerígeno. Como adyuvante, por ejemplo, se usan citocinas que estimulan diversas células inmunocompetentes y agonistas del receptor tipo Toll (TLR).

Como agonista de TLR que sirve como adyuvante, puede usarse uno cualquiera de los agonistas de TLR1 a TLR10 (por ejemplo, documentos no de patentes 1 y 2). Por ejemplo, TLR3, que reconoce el ARN bicatenario derivado de un virus y acelera la producción de interferón tipo I ejerciendo una fuerte acción antiviral, es una molécula del sistema inmunitario innato. Se sabe que un análogo de ARN bicatenario, poli I:C (también denominado ácido poliinosínico:policitidílico), que se conoce como agonista de TLR3, se usa como adyuvante de vacuna (por ejemplo, documento de patente 1). Además, TLR9, que reconoce un ADN de CpG no metilado derivado de una bacteria o un virus y ejerce una acción, es una molécula del sistema inmunitario innato. Se sabe que ODN CpG (oligodesoxinucleótido CpG de ácido nucleico sintético), que sirve como ligando de TLR9, tiene un efecto adyuvante para la vacuna.

Se sabe que LAG-3 también se usa como adyuvante para vacunas (por ejemplo, documento de patente 2). LAG-3 es un producto postraduccional del gen 3 de activación de linfocitos y también se denomina CD223. LAG-3 se une a una molécula del CMH de clase II para controlar negativamente la proliferación de células T activadas y el mantenimiento de la homeostasis de las células T, desempeña un papel importante en la función de las células T reguladoras (Treg) y también se sabe que participa en la regulación homeostática de células dendríticas plasmocitoides. El documento EP 1002 108 divulga adyuvantes para vacunas contra el cáncer basados en una proteína LAG-3.

Lista de referencias

Bibliografía de patentes

Documento de patente 1: Publicación nacional de solicitud de patente internacional n.° 2011-506309 Documento de patente 2: Publicación nacional de solicitud de patente internacional n.° 2001-510806 Bibliografía no de patentes

Documento no de patente 1: Oncolmmunology 1: 5, 699-716; agosto de 2012

Documento no de patente 2: Oncolmmunology 2: 8, e25238; agosto de 2013

Sumario de la invención

Problema técnico

Un objeto de la presente invención es proporcionar un medicamento que contenga una nueva combinación de adyuvantes, tal como se define en las reivindicaciones.

Solución al problema

Los presentes inventores realizaron diversos estudios usando diversos adyuvantes de manera individual o en combinación. Como resultado, hallaron una nueva combinación de adyuvantes que sirve como un medicamento útil, por ejemplo, para inducir la inmunidad contra el cáncer.

Más específicamente, la presente divulgación es tal como sigue.

[1] Un medicamento, que comprende

un agonista del receptor tipo Toll y

proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma.

[2] El medicamento según [1], para la administración combinada de

el agonista del receptor tipo Toll y

proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma.

[3] El medicamento según [1] o [2], en el que el agonista del receptor tipo Toll es un agonista del receptor 3 tipo Toll o un agonista del receptor 9 tipo Toll.

[4] El medicamento según uno cualquiera de [1] a [3], en el que el agonista del receptor tipo Toll es poli I:C o una sal del mismo.

[5] El medicamento según uno cualquiera de [1] a [4], en el que la proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma es una proteína de fusión de proteína LAG-3 e IgG.

[6] El medicamento según uno cualquiera de [1] a [5], que comprende además una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a al menos una célula cancerosa.

[7] El medicamento según [6], para la administración combinada de

el agonista del receptor tipo Toll,

proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma, y

la sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a al menos una célula cancerosa.

[8] El medicamento según [6] o [7], en el que la sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa es un péptido derivado de antígeno cancerígeno.

[9] El medicamento según [8], que comprende dos o más péptidos derivados de antígeno cancerígeno.

[10] El medicamento según uno cualquiera de [1] a [9], para uso en una terapia de vacuna contra el cáncer.

[11] El medicamento según uno cualquiera de [1] a [10], en el que el medicamento es un antineoplásico.

[12] Un adyuvante, que comprende

un agonista del receptor tipo Toll y

proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma, para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa o para su uso en una terapia de vacuna contra el cáncer.

[13] Una combinación, que comprende

un agonista del receptor tipo Toll y

proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma, para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa o en una terapia de vacuna contra el cáncer.

[14] Un método para tratar o prevenir una enfermedad en un paciente, que comprende administrar

un agonista del receptor tipo Toll y

proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma a un paciente que lo necesita.

[15] Un método para inducir una respuesta inmunitaria específica, que comprende administrar

un agonista del receptor tipo Toll y

Efectos ventajosos de la invención

Según la presente divulgación, es posible proporcionar un medicamento que contiene una nueva combinación de adyuvantes.

Breve descripción de los dibujos

[Figura 1] La figura 1 muestra un protocolo esquemático de un experimento para comparar los efectos de los adyuvantes en una vacuna contra el cáncer usando un péptido derivado de antígeno cancerígeno.

[Figura 2] La figura 2 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral del grupo 1, en el que se usó PBS como control en el experimento de la figura 1.

[Figura 3] La figura 3 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral en el grupo 2, en el que se usó IFA como adyuvante en el experimento de la figura 1.

[Figura 4] La figura 4 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral en el grupo 3, en el que se usó PT como adyuvante en el experimento de la figura 1.

[Figura 5] La figura 5 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral en el grupo 4, en el que se usó poli I:C como adyuvante en el experimento de la figura 1.

[Figura 6] La figura 6 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral en el grupo 5, en el que se usó una combinación de poli I:C y CpG como adyuvante en el experimento de la figura 1.

[Figura 7] La figura 7 es un gráfico que muestra el cambio en el tamaño tumoral en el grupo 6, en el que se usó LAG-3 como adyuvante en el experimento de la figura 1.

[Figura 8] La figura 8 es un gráfico que muestra el cambio en el tamaño tumoral en el grupo 7, en el que se usaron LAG-3 y poli I:C como adyuvantes en el experimento de la figura 1.

[Figura 9A] La figura 9A muestra imágenes de un tejido tumoral teñido con hematoxilina-eosina en el mismo experimento que en la figura 1.

[Figura 9B] La figura 9B muestra imágenes de núcleos celulares y células inmunitarias de un tejido tumoral teñido con un colorante fluorescente en el mismo experimento que en la figura 1.

[Figura 10] La figura 10 es un gráfico que muestra los resultados de medición (aumento) del tamaño tumoral después de que las células tumorales se inocularon de nuevo a un ratón en el que se logró suprimir una vez con éxito el aumento del tamaño tumoral con una vacuna contra el cáncer (se usaron LAG-3 y poli I:C como adyuvantes) en el mismo experimento que en la figura 1.

[Figura 11A] La figura 11A es un gráfico que muestra los resultados de medición de la capacidad proliferativa de las células inmunitarias, que se prepararon extrayendo un ganglio linfático de un ratón inoculado con una vacuna contra el cáncer en el mismo experimento que en la figura 1, separando las células inmunitarias del ganglio linfático, y que se cultivaron conjuntamente con células tumorales previamente inactivadas por exposición a radiación.

[Figura 11B] La figura 11B muestra gráficos que muestran los resultados de medición de citocinas en el sobrenadante celular del mismo cultivo conjunto que en el experimento de la figura 11A.

[Figura 12A] La figura 12A muestra los resultados de medición de la expresión de moléculas de marcadores de superficie celular, PD-1, BTLA, TIGIT y LAG-3, presentes en la superficie de células inmunitarias positivas para CD8, que se prepararon extrayendo un ganglio linfático de un ratón inoculado con una vacuna contra el cáncer en el mismo experimento que en la figura 1 y separando las células inmunitarias del ganglio linfático.

[Figura 12B] La figura 12B muestra los resultados de medición de la expresión de moléculas de marcadores de superficie celular, PD-1, BTLA, TIGIT y LAG-3, presentes en la superficie de células inmunitarias positivas para CD4, que se prepararon extrayendo un ganglio linfático de un ratón inoculado con una vacuna contra el cáncer en el mismo experimento que en la figura 1 y separando las células inmunitarias del ganglio linfático.

[Figura 13] La figura 13A es un gráfico que muestra los resultados de medición de la capacidad proliferativa de las células inmunitarias y la figura 13B es un gráfico que muestra los resultados de medición de la producción de FN gamma.

[Figura 14] La figura 14 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral del grupo 1, en el que se usó PBS como control.

[Figura 15] La figura 15 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral del grupo 2, en el que se usó poli I:C como adyuvante.

[Figura 16] La figura 16 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral del grupo 3, en el que se usaron LAG-3 y poli I:C como adyuvantes.

[Figura 17] La figura 17 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral del grupo 4, en el que se usaron LAG-3 y poli I:C solos sin usar el péptido P1A.

[Figura 18] La figura 18 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral del grupo 5, en el que se usó RIBOXXOL como adyuvante.

[Figura 19] La figura 19 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral del grupo 6, en el que se usó una combinación de LAG-3 y RIBOXXOL como adyuvante.

[Figura 20] La figura 20 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral del grupo 7, en el que se usó una combinación de LAG-3 y MPL como adyuvante.

[Figura 21] La figura 21 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral del grupo 8, en el que se usó una combinación de LAG-3 e imiquimod como adyuvante.

[Figura 22] La figura 22 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral del grupo 9, en el que se usó una combinación de LAG-3 y CpG como adyuvante.

[Figura 23] La figura 23 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral del grupo 1, en el que se usó IFA como adyuvante.

[Figura 24] La figura 24 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral del grupo 2, en el que se usó poli I:C como adyuvante.

[Figura 25] La figura 25 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral del grupo 3, en el que se usó LAG-3 como adyuvante.

[Figura 26] La figura 26 es un gráfico que muestra cambios en el tamaño tumoral del grupo 4, en el que se usaron LAG-3 y poli I:C como adyuvantes.

Descripción de realizaciones

La presente invención y divulgación se describirá más específicamente a continuación a modo de realizaciones; sin embargo, la presente invención y divulgación no se limita a las realizaciones y puede modificarse y llevarse a cabo de diversas formas.

Un medicamento según la presente divulgación incluye un agonista del receptortipo Toll (agonista de TLR) y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma.

En la memoria descriptiva, el “agonista del receptortipo Toll (agonista de TLR)” se refiere a una molécula que se une a uno cualquiera de los receptores tipo Toll y proporciona el mismo estímulo que el estímulo proporcionado por un ligando natural unido a TLR. Como agonista de TLR, se conocen los agonistas de TLP descritos en Trends in Immunology vol. 30 n.° 1, 23-32, Immunity 33, 29 de octubre de 2010, 492-503 y World Journal of Vaccines, 2011, 1, 33-78. Estos TLR conocidos en la técnica pueden usarse cada uno en el agonista de TLR de la presente divulgación; por ejemplo, puede usarse un agonista de TLR3, un agonista de TLR4, un agonista de TLR7, un agonista de TLR8, un agonista de TLR9 o un agonista de TLR10. De ellos, puede usarse un agonista de TLR3 o un agonista de TLR9 como agonista de TLR.

En la memoria descriptiva, el “agonista de TLR3” se refiere a una molécula que se une a TLR3 y proporciona el mismo estímulo que el estímulo proporcionado por un ligando natural unido a t LR3. TLR3 reconoce un ARN bicatenario derivado de un virus para activar el sistema inmunitario innato. Como agonista de TLR3, se conoce un polinucleótido de bicatenario sintético, poli I:C, que tiene una estructura análoga al ARN de bicatenario; sin embargo, el agonista de TLR3 no se limita a este. Puede usarse una sal de poli I:C en la presente invención; por ejemplo, puede usarse una sal de sodio del mismo. Como agonista de TLR3, puede usarse RIBOXXOL.

En la memoria descriptiva, el “agonista de TLR4” se refiere a una molécula que se une a TLR4 y proporciona el mismo estímulo que el estímulo proporcionado por un ligando natural unido a TLR4. TLR4 reconoce un lipopolisacárido (LPS) derivado de una bacteria para activar el sistema inmunitario innato. Como agonista de TLR4, se conoce MPL; sin embargo, el agonista de TLR4 no se limita a este. Puede usarse una sal de MPL en la presente divulgación; por ejemplo, puede usarse una sal de sodio del mismo.

En la memoria descriptiva, el “agonista de TLR5” se refiere a una molécula que se une a TLR5 y proporciona el mismo estímulo que el estímulo proporcionado por un ligando natural unido a TLR5. TLR5 reconoce una flagelina derivada de una bacteria para activar el sistema inmunitario innato. Como agonista de TLR5, se conocen (proteínas) flagelina derivada(s) de diversas bacterias o proteínas flagelina recombinantes; sin embargo, el agonista de TLR5 no se limita a estas.

En la memoria descriptiva, el “agonista de TLR7” se refiere a una molécula que se une a TLR7 y proporciona el mismo estímulo que el estímulo proporcionado por un ligando natural unido a TLR7.

Además, en la memoria descriptiva, el “agonista de TLR8” se refiere a una molécula que se une a TLR8 y proporciona el mismo estímulo que el estímulo proporcionado por un ligando natural unido a TLR8.

TLR7 y TLR8 reconocen ARN monocatenario derivado de un virus para activar el sistema inmunitario innato. Como agonista de TLR7/8, se conoce el imiquimod; sin embargo, el agonista de TLR7/8 no se limita a este. Puede usarse una sal de imiquimod en la presente divulgación; por ejemplo, puede usarse una sal de sodio del mismo.

En la memoria descriptiva, el “agonista de TLR9” se refiere a una molécula que se une a TLR9 y proporciona el mismo estímulo que el estímulo proporcionado por un ligando natural unido a TLR9. TLR9 reconoce el ADN de CpG derivado de una bacteria y un virus para activar el sistema inmunitario innato. Como agonista de TLR9, se conoce ODN CpG; sin embargo, el agonista de TLR9 no se limita a este. Puede usarse una sal de ODN CpG en la presente divulgación; por ejemplo, puede usarse una sal de sodio del mismo.

En la memoria descriptiva “proteína LAG-3, una variante funcional o un derivado de la misma” se refiere a la proteína LAG-3, una variante funcional o derivado de la misma. La proteína LAG-3 que va a usarse en la presente invención puede derivarse de cualquier animal, por ejemplo, la proteína puede derivarse del mismo animal que el sujeto al que va a administrarse un medicamento según la presente divulgación. Más específicamente, si se administra un medicamento según la presente divulgación a un humano, puede usarse LAG-3 humana. La proteína LAG-3 humana es una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada por el n.° de registro de NCBI P18627.5.

Los ejemplos de la variante funcional de la proteína LAG-3 incluyen (i) una variante de LAG-3 que consiste en una secuencia de aminoácidos, que es la secuencia de aminoácidos de LAG-3 que tiene adición, sustitución o deleción de uno o varios aminoácidos, y que tiene una función de la proteína LAG-3 requerida para ejercer los efectos de la presente invención, (ii) una variante de LAG-3 que tiene una identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de LAG-3 de al menos el 80% o más, o el 85 % o más, el 90% o más, el 95% o más, el 98% o más o el 99% o más y que tiene una función de la proteína LAG-3 requerida para ejercer los efectos de la presente invención, y (iii) un polipéptido parcial de la proteína LAG-3, una variante definida en el punto (i) anterior o una variante definida en el punto (ii) anterior que tiene una función de proteína LAG-3 requerida para ejercer los efectos de la presente invención.

En la memoria descriptiva, “uno o varios aminoácidos” se refiere a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos.

En la memoria descriptiva, el “aminoácido” se usa en el sentido más amplio del mismo e incluye aminoácidos naturales y variantes y derivados de aminoácidos artificiales. En la memoria descriptiva, los ejemplos del aminoácido incluyen L-aminoácidos proteicos naturales; D-aminoácidos; aminoácidos químicamente modificados tales como variantes y derivados de aminoácidos; aminoácidos no proteicos naturales tales como norleucina, p-alanina y ornitina; y compuestos sintetizados químicamente que tienen características de aminoácidos conocidas en la técnica. Los ejemplos de aminoácidos no naturales incluyen a-metil aminoácido (por ejemplo, a-metilalanina), D-aminoácido, aminoácido similar a histidina (por ejemplo, p-hidroxi-histidina, homohistidina, a-fluorometil-histidina y a-metilhistidina), aminoácidos con metileno eXtra en una cadena lateral (“homo”aminoácidos) y aminoácidos (por ejemplo, ácido de cisteína) en los que el aminoácido del grupo funcional ácido carboxílico en una cadena lateral está sustituido por un grupo ácido sulfónico.

Los ejemplos del derivado funcional de la proteína LAG-3 incluyen una proteína de fusión de la totalidad o parte de la proteína LAG-3 y otra proteína o un polipéptido, y la proteína LAG-3 unida con una cadena de azúcar y/o un lípido. Como ejemplo del derivado funcional de la proteína lAG-3, una proteína de fusión de LAG-3 e IgG. Los ejemplos del derivado funcional de la proteína LAG-3 incluyen los derivados descritos en Journal of Translational Medicine 2014, 12: 97.

Un medicamento según la presente divulgación puede contener un agonista de TLR, proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma y una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa.

En la memoria descriptiva, la “sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa” no está particularmente limitada siempre que sea una sustancia capaz de inducir una respuesta inmunitaria necesaria para romper las células cancerosas in vivo e inducir la apoptosis de las células cancerosas; por ejemplo, se mencionan una proteína de antígeno cancerígeno, un péptido derivado de antígeno cancerígeno, ácidos nucleicos que los codifican, una célula presentadora de antígeno cancerígeno y una célula tumoral en sí.

En la memoria descriptiva, la “proteína de antígeno cancerígeno” es una proteína expresada especialmente en una célula cancerosa y reconocida/atacada por el sistema inmunitario como un cuerpo extraño. La “proteína de antígeno cancerígeno” puede expresarse en células cancerosas de todos los tipos y un tipo específico de cáncer. Como proteína de antígeno cancerígeno, es preferible una proteína que tenga una fuerte inmunogenicidad y que nunca se exprese en células normales. Los ejemplos de la proteína de antígeno cancerígeno incluyen, pero no se limitan particularmente a, las descritas en Clin Cancer Res 2009; 15 (17) 5323. Los ejemplos específicos de las mismas incluyen, pero no se limitan particularmente a, WT1, MUC1, LMP2, HPVE6, HPVE7, EGFRv III, HER-2/neu, MAGE-A3, p53 no mutante, HSP70, GPC3, MUC1, Casp8, CDAM1, cMyb, EVC1, EVC2, Helios, Fas, NY-ESO-1, PSMA, GD2, CEA, MelanA/MART1, Ras mutante, gp100, p53 mutante, proteinasa 3 (PR1), bcr-abl, tirosinasa, survivina, PSA, hTERT, puntos de corte de translocación de sarcoma, EphA2, PAP, ML-IAP, A f P, EpCAM, ERG, NA17, PAX3, ALK, receptor de andrógenos, ciclina B1, ácido polisiálico, MYCN, PhoC, TRP-2, GD3, fucosil GM1, mesotelina, PSCA, MAGE A1, sLe, CYP1B1, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GloboH, ETV6-AML, NY-BR-1, RGS5, SART3, STn, anhidrasa carbónica IX, PAX5, OY-TES1, proteína de esperma 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE1, B7H3, legumaína, Tie2, Page4, VEGFR2, MAD-c T-1, FAP, PDGFR, MAD-CT-2 y antígeno 1 relacionado con Fos.

En la memoria descriptiva, el “péptido derivado de antígeno cancerígeno” se refiere a un péptido que tiene una parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína de antígeno cancerígeno, o a un péptido que tiene una secuencia, que es la misma secuencia de aminoácidos que antes y que tiene una adición, sustitución o deleción de 1 ó 2 aminoácidos, o a un péptido que tiene una identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos anterior del 90% o más, el 95% o más, el 98% o más o el 99% o más y que induce inmunitario que ataca a células cancerosas. El péptido derivado de antígeno cancerígeno puede consistir en 8 o más y 11 o menos residuos de aminoácidos. Un péptido de este tipo, si se administra por vía subcutánea a un paciente, se incorpora a las células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas y macrófagos, y se presenta en la superficie de las célulasjunto con moléculas de HLA. Las células precursoras de células T citotóxicas (CTL) que tienen reactividad con el péptido presentado, que son CTL maduras y proliferadas clonalmente que proliferaron y se diferenciaron, migran a través del flujo linfático hacia un tejido canceroso. Las CTL maduras atacan a una célula cancerosa en la que se expresa un péptido que tiene la misma secuencia que el péptido administrado para inducir la apoptosis.

En la memoria descriptiva, el “ácido nucleico” no está particularmente limitado siempre que sea un ácido nucleico que codifique para una proteína de antígeno cancerígeno o un péptido derivado de antígeno cancerígeno, e incluye a Rn , ADN, PNA, LNA o una quimera de dos o más de estos. Estos ácidos nucleicos pueden insertarse, por ejemplo, en un vector, según un método conocido, y luego administrarse a pacientes y expresar in vivo una proteína de antígeno cancerígeno o un péptido derivado de antígeno cancerígeno.

En la memoria descriptiva, la “célula presentadora de antígeno cancerígeno” se refiere a una célula presentadora de antígeno que presenta un péptido derivado de antígeno cancerígeno en la superficie de la misma mediante la unión a una molécula de HLA. Como célula presentadora de antígeno, pueden usarse células dendríticas y macrófagos. Las células dendríticas tienen una inducibilidad de CTL particularmente alta. Las células dendríticas presentadoras de antígeno pueden obtenerse, por ejemplo, separando células mononucleares de la sangre periférica del propio paciente, diferenciando las células mononucleares en células dendríticas inmaduras y luego diferenciando aún más las células dendríticas maduras mediante la adición de una proteína de antígeno cancerígeno o un péptido derivado de antígeno cancerígeno a un medio.

Como vacuna contra el cáncer actualmente en desarrollo, se conocen vacunas que usan células dendríticas sensibilizadas con un extracto de células tumorales, células dendríticas sensibilizadas con un antígeno cancerígeno/proteína de fusión GM-CSF y una combinación de partículas similares a virus no infecciosos de una proteína L1 derivada del VPH y un adyuvante. Estos se incluyen en la “sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa”.

Un medicamento según la presente invención puede contener al menos dos tipos de “sustancias que inducen una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa”. Por ejemplo, un medicamento según la presente divulgación puede contener dos o más péptidos derivados de antígeno cancerígeno diferentes.

Puede usarse un medicamento según la presente divulgación como terapia de vacuna contra el cáncer. En este caso, un agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma, sirven como adyuvantes y potencian la inducción de una respuesta inmunitaria por una “sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa”. Tal como se muestra en los ejemplos (descritos más adelante), cuando el agonista de TLR y la proteína LAG-3 se usan en combinación, puede obtenerse un efecto antitumoral extremadamente alto incluso a una dosis baja a la que no se obtiene ningún efecto cuando se usan solos.

En la memoria descriptiva, el “adyuvante” se refiere a una(s) molécula(s) que se administra(n) junto con una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria para potenciar la inducción de la respuesta inmunitaria.

Puede usarse una terapia de vacuna contra el cáncer para la prevención o el tratamiento del cáncer. En la memoria descriptiva, la prevención o el tratamiento del cáncer se refiere a provocar al menos uno de los siguientes fenómenos: una disminución del tamaño tumoral, retraso o terminación del aumento del tamaño tumoral, inhibición (retraso o terminación) de la metástasis del cáncer, inhibición (retraso o terminación) de la proliferación de células cancerosas, inhibición (retraso o terminación) de la recidiva del cáncer y mitigación de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer.

En la memoria descriptiva, el término “cáncer” se usa en el sentido más amplio del mismo. Los ejemplos del cáncer incluyen, pero no se limitan a, astrocitoma, oligodendroglioma, meningioma, neurofibroma, glioblastoma, ependimoma, neurilemoma, neurofibrosarcoma, neuroblastoma, tumor hipofisario (por ejemplo, para adenoma hipofisario), meduloblastoma, melanoma, tumor cerebral, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer de riñón, carcinoma de células renales, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de estómago, cáncer de piel, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, fibrosarcoma, carcinoma de células escamosas, tumor neuroectodérmico, tumor de tiroides, linfoma, leucemia, mieloma múltiple, carcinoma hepatocelular, mesotelioma y carcinoma epidermoide.

La presente divulgación incluye un adyuvante que incluye un agonista de TLR y una proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma, para su uso en una terapia de vacuna contra el cáncer. El agonista de TLR es un adyuvante que va a administrarse en combinación con la proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma; mientras que la proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma puede ser un adyuvante que va a administrarse en combinación con el agonista de TLR. Tales adyuvantes pueden administrarse a un paciente junto con diversas “sustancias que inducen una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa”. El término “juntos” usado en el presente documento no significa administración simultánea, sino que significa que un agonista de t Lr y una proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma se administran a un paciente de manera que el agonista de TLR y la proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma pueden funcionar como adyuvantes según una terapia de vacuna contra el cáncer, in vivo (del cuerpo de un paciente) y ex vivo.

En la presente divulgación, puede proporcionarse un medicamento que contiene un agonista de TLR para la administración combinada con la proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma; o puede proporcionarse un medicamento que contiene proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma para la administración combinada con un agonista de TLR.

Además, en la presente divulgación, puede proporcionarse un medicamento que contiene un agonista de TLR para la administración combinada con una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa y una proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma. El medicamento que contiene un agonista de TLR puede actuar, con la proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma, como adyuvantes para potenciar la inducción de la respuesta inmunitaria por una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa, preferiblemente un péptido derivado de antígeno cancerígeno. En la presente divulgación, puede proporcionarse un medicamento que contiene la proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma para la administración combinada con una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa y un agonista de TLR. El medicamento que contiene la proteína lAG-3, una variante o un derivado de la misma puede actuar, con un agonista de TLR, como adyuvantes para potenciar la inducción de la respuesta inmunitaria por una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa, preferiblemente un péptido derivado de antígeno cancerígeno.

En un medicamento que contiene un agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma según la presente divulgación, el agonista de TLR y la proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma pueden usarse como principios activos del medicamento. El medicamento que contiene un agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma como principios activos según la presente divulgación, tal como se muestra en los ejemplos (descritos más adelante), puede usarse como un antineoplásico que tiene un alto efecto antitumoral. En la memoria descriptiva, el “antineoplásico” se refiere a un agente que puede usarse para prevenir o tratar el cáncer. El medicamento que actúa como antineoplásico puede contener un agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma como principios activos, y puede contener además una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa.

En la presente divulgación, un medicamento que sirve como antineoplásico contiene una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa, preferiblemente un péptido derivado de antígeno cancerígeno, como principio activo, y puede contener un agonista de TLR y proteína lAG-3, una variante o un derivado de la misma como adyuvantes.

Los componentes de un medicamento según la presente divulgación se disuelven en un disolvente soluble en agua para preparar sales farmacéuticamente aceptables, y puede administrarse a los pacientes una preparación que contenga los componentes en forma de sal. Los ejemplos de tales sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales solubles en agua fisiológicamente aceptables tales como una sal de sodio, una sal de potasio, una sal de magnesio y una sal de calcio, que se ajustan para que tengan un pH fisiológico mediante un tampón. Aparte de los disolventes solubles en agua, puede usarse un disolvente no acuoso. Los ejemplos del disolvente no acuoso incluyen alcoholes tales como etanol y propilenglicol.

Puede usarse un medicamento según la presente divulgación como composición farmacéutica, que tiene cualquier forma de dosificación administrada por vía oral o parenteral. La forma de dosificación no está particularmente limitada. Los ejemplos de la forma de dosificación de una composición farmacéutica pueden incluir un líquido (por ejemplo, una inyección), un dispersante, una suspensión, un comprimido, una pastilla, un fármaco en polvo, un supositorio, un polvo, un grano fino, un gránulo, una cápsula, un jarabe, una gota nasal y una gota para los oídos.

Un medicamento según la presente divulgación, si se usa como vacuna contra el cáncer, puede administrarse por vía oral o parenteral. Como administración parenteral, por ejemplo, pueden emplearse administración intraperitoneal, administración subcutánea, administración intradérmica, administración intramuscular, administración intravenosa o administración intranasal.

Puede producirse una preparación de un medicamento según la presente divulgación según un método conocido en la técnica. En la preparación de un medicamento según la presente divulgación, pueden usarse portadores y aditivos farmacéuticamente aceptables (tales como un excipiente, un aglutinante, un dispersante, un disgregante, un lubricante, un disolvente, un solubilizante, un agente colorante, un agente aromatizante, un estabilizante, un emulsionante, un agente de suspensión, un promotor de la absorción, un tensioactivo, un regulador del pH, un conservante y un antioxidante). Los ejemplos de los portadores y aditivos incluyen disolventes orgánicos farmacéuticamente aceptables tales como agua, solución salina, un tampón fosfato, dextrosa, glicerol y etanol, colágeno, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, un polímero de carboxivinilo, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilato de sodio, alginato de sodio, dextrano soluble en agua, carboximetil almidón de sodio, pectina, ácido glutámico, ácido aspártico, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, goma xantana, goma arábiga, caseína, agar, polietilenglicol, diglicerina, glicerina, propilenglicol, vaselina, parafina, alcohol estearílico, ácido esteárico, albúmina sérica humana, manitol, sorbitol, lactosa, glucosa, almidón de maíz, celulosa microcristalina, un tensioactivo, bisulfito de sodio, bisulfato de sodio, tiosulfato de sodio, cloruro de benzalconio, clorobutanol, timerosal, acetato fenilmercúrico, nitrato fenilmercúrico, metilparabeno, alcohol feniletílico, amoníaco, ditiotreitol, beta mercaptoetanol, carbonato de sodio, borato de sodio, fosfato de sodio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, sacarosa, azúcar en polvo, sacarosa, fructosa, glucosa, lactosa, jarabe de azúcar de malta reducido, jarabe de azúcar de malta reducido en polvo, jarabe de glucosa y fructosa, azúcar de fructosa y glucosa, miel, eritritol, aspartamo, sacarina, sacarina de sodio y gelatina.

Cuando un medicamento según la presente divulgación contiene un péptido, puede usarse un potenciador de la absorción para mejorar la absorción de un fármaco poco absorbible (fármaco difícil de absorber por vía transmucosa), tal como un péptido. Los ejemplos del mismo incluyen tensioactivos tales como lauril éter de polioxietileno, laurilsulfato de sodio y saponina; sales biliares tales como ácido glicocólico, ácido desoxicólico y ácido taurocólico; agentes quelantes tales como EDTA y sal biliar salicílica; ácidos grasos tales como ácido caproico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido oleico, ácido linoleico y micelas mixtas; un derivado de enamina, un péptido de N-acil colágeno, un N-acil aminoácido, una ciclodextrina, un quitosano y un donante de óxido nítrico.

Cuando un medicamento según la presente divulgación contiene un péptido, el medicamento se encapsula en, por ejemplo, microcápsulas de poli(ácido láctico/ácido glicólico) (PLGA) o se deja adsorber en partículas finas de hidroxiapatita porosa para preparar un medicamento de liberación sostenida, o se aplica el medicamento a un sistema de parche de iontoforesis de liberación pulsada para preparar un absorbente transdérmico.

Un medicamento según la presente divulgación puede ser una sola preparación que contiene un agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma, o puede ser una combinación de diferentes preparaciones, es decir, una preparación que contiene un agonista de TLR y una preparación que contiene proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma.

Además, un medicamento según la presente divulgación puede ser una sola preparación que contiene una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa, un agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma, o puede ser una combinación de diferentes preparaciones, es decir, una preparación que contiene una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa, una preparación que contiene un agonista de TLR y una preparación que contiene proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma. Más específicamente, una preparación que contiene dos tipos de componentes seleccionados de una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa, un agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma puede usarse en combinación con una preparación que contiene el otro componente restante. Siempre que se proporcione una combinación de tres tipos de componentes, puede usarse en combinación una preparación que contenga dos tipos de componentes y una preparación que contenga dos tipos de componentes.

Puede proporcionarse un medicamento según la presente divulgación en forma de kit. En el caso de un kit, el kit puede contener un agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma, o puede contener una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa, un agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma.

Un medicamento según la presente divulgación, si se usa como vacuna contra el cáncer, puede contener adyuvantes adicionales. Los ejemplos no limitativos de los adyuvantes adicionales incluyen adyuvantes sedimentarios, tales como hidróxido de aluminio, hidróxido de sodio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio, polímero de alumbre y carboxivinilo, y adyuvantes oleosos, tales como adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, parafina líquida, lanolina, montanida ISA763AV y montanida ISA51.

Un medicamento según la presente divulgación puede usarse en combinación con otros antineoplásicos en cualquier realización, y puede usarse en combinación con radioterapia y un tratamiento quirúrgico. Los ejemplos de otros antineoplásicos incluyen compuestos de bajo peso molecular tales como adriamicina, daunomicina, mitomicina, cisplatino, vincristina, epirrubicina, metotrexato, 5-fluorouracilo, aclacinomicina, mostaza nitrogenada, ciclofosfamida, bleomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vinblastina, vindesina, tamoxifeno y dexametasona; y proteínas tales como citocinas que activan células inmunocompetentes (por ejemplo, interleucina 2 humana, factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos humanos, factor estimulante de colonias de macrófagos humanos e interleucina 12 humana).

La presente divulgación incluye un método para tratar el cáncer mediante la administración de un medicamento según la presente divulgación en una dosis terapéuticamente eficaz. Los expertos en la técnica pueden determinar de manera apropiada la dosis terapéuticamente eficaz dependiendo de, por ejemplo, los síntomas, la edad, el sexo, el peso corporal y la diferencia de sensibilidad del paciente, el método de administración, el intervalo de administración y el tipo de preparación.

En la presente invención, es posible tratar o prevenir la enfermedad de un paciente mediante la administración de un agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma a un paciente que lo necesita. En la presente divulgación, se proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa mediante la administración de un agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma a un paciente que lo necesita.

En el tratamiento o la prevención de la enfermedad de un paciente o en un método para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa, puede administrarse adicionalmente una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa, preferiblemente, un péptido derivado de antígeno cancerígeno.

Un efecto medicinal de una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa, preferiblemente un péptido derivado de un antígeno cancerígeno, puede ejercerse con más fuerza induciendo una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa.

Un medicamento según la presente divulgación se usa preferiblemente para la administración combinada.

El uso de un medicamento según la presente divulgación en la administración combinada significa que un agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma pueden administrarse a un paciente en cualquier combinación al mismo tiempo o en momentos diferentes. Si un medicamento según la presente divulgación contiene una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa, la sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa, un agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma pueden administrarse en cualquier combinación al mismo tiempo o en momentos diferentes.

En la administración de los componentes al mismo tiempo, los componentes pueden administrarse en forma de dosificación única al mismo tiempo; más específicamente, un agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma pueden mezclarse en el momento de la administración para preparar una preparación de dosificación y administrarse al mismo tiempo.

En la administración de los componentes en momentos diferentes, se administra un agonista de TLR y, posteriormente, puede administrarse proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma; o se administra proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma y, posteriormente, puede administrarse un agonista de TLR.

En la administración de los componentes al mismo tiempo, si un medicamento según la presente divulgación contiene una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa, los componentes pueden administrarse en forma de dosificación única al mismo tiempo; más específicamente, la sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa, un agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma pueden mezclarse en el momento de la administración para preparar una preparación de dosificación y administrarse al mismo tiempo.

En la administración de los componentes en momentos diferentes, se administra la sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa y, posteriormente, se administra un agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma al mismo tiempo o en momentos diferentes; o el agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma pueden administrarse al mismo tiempo o en momentos diferentes y, posteriormente, puede administrarse la sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa. Alternativamente, se administra uno del agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma y, posteriormente, se administra la sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa y luego puede administrarse el otro del agonista de TLR y proteína LAG-3, una variante o un derivado de la misma. En la administración de los componentes en momentos diferentes, los componentes pueden administrarse basándose en las propiedades y el intervalo de dosis de los componentes individuales, dicho de otro modo, basándose en las pautas posológicas de los componentes individuales.

Ejemplo 1

Ahora, la presente invención se describirá basándose en el ejemplo; sin embargo, la presente invención no se limita a este.

1. Vacuna contra el cáncer

Según el protocolo mostrado en la figura 1, se compararon los efectos de los adyuvantes en las vacunas contra el cáncer que usan un péptido derivado de antígeno cancerígeno.

Material

Como ratones de modelo de cáncer, se usaron ratones DBA/2, a los que se les injertaron células P815 (mastocitoma de ratón derivado de DBA/2mous).

Como péptido derivado de antígeno cancerígeno, se usó un péptido (denominado a continuación en el presente documento “péptido P1A”) que consiste en una secuencia parcial de proteína P1A, que es un antígeno tumoral del tumor P815 y se sabe que se presenta de forma restrictiva por un CMH H-2Ld. La secuencia de aminoácidos del péptido P1A está representada por LPYLGWLVF (SEQ ID NO: 1).

Como P1A CTL, se usó una célula T que expresa un receptor de células T y reconoce el péptido P1A. En el experimento, se extrajo el bazo de un ratón transgénico P1A-CTL que poseían los presentes inventores y se comprobó una razón positiva mediante TCR Va 8.3 (marcador de TCR obtenido mediante introducción de genes). Basándose en la razón positiva, se determinó y administró el número de células P1A-CTL.

Como adyuvantes, se usaron las siguientes sustancias.

Célula bacteriana de tosferina completa (PT) (BioFarma, Bandung, Indonesia)

Poli I:C (agonista de TLR3) (Invivogen, San Diego, EE.UU.)

CpG (agonista de TLR9) (Invivogen, San Diego, EE.UU.)

IFA (adyuvante incompleto de Freund) (Seppic, París, Francia)

LAG-3 (Adipogen, San Diego, EE.UU.)

Método

Se inocularon por vía subcutánea células tumorales P815 a ratones DBA/2 en una cantidad de 5 x 105 células por ratón. El día de la inoculación se especificó como día 0. El día 8, se inyectaron P1A CTL (2,5 * 105 células por ratón) por vía intravenosa. El día 9 y el día 16, se inyectó por vía subcutánea una mezcla de péptido P1A (50 |ig por ratón) y un adyuvante en PBS. Los ratones se dividieron en 9 grupos, consistiendo cada uno en 5 ratones, y se usaron los siguientes adyuvantes, respectivamente.

Grupo 1: PBS (control)

Grupo 2: IFA (50 |il/ratón)

Grupo 3: PT(1 * 108/ratón)

Grupo 4: poli I:C (50 |ig/ratón)

Grupo 5: poli I:C (50 |ig/ratón) CPG (10 |ig/ratón)

Grupo 6: LAG-3 (1 |ig/ratón)

Grupo 7: LAG-3 (1 |ig/ratón) poli I:C (50 |ig/ratón)

Resultados

Los cambios en el tamaño tumoral (mm3) de todos los ratones en y después del día 7 se muestran en las figuras 2 a 8.

En todos los grupos 1 a 6, los tamaños tumorales aumentaron gradualmente y la mayoría de los ratones murieron a la mitad. El número de ratones que sobrevivieron hasta el día 70 sin aumentar el tamaño tumoral fue 0 en los grupos 2, 3 y 6, 1 en los grupos 1 y 4, y 3 en el grupo 5; sin embargo, en el grupo 7, no se observó ningún aumento en el tamaño tumoral en los 5 ratones y los ratones sobrevivieron hasta el día 115.

2. Infiltración de células inmunitarias en tejido canceroso

Se prepararon ratones de modelo de cáncer mediante la inoculación subcutánea de células tumorales P815 (5 x 105 células por ratón) a ratones DBA/2. El día de la inoculación se especificó como día 0. El día 8, se inyectaron P1A CTL (2,5 x 105 células por ratón) por vía intravenosa. El día 9 y el día 14, se inyectó por vía subcutánea una mezcla de péptido P1A (50 |ig por ratón) y un adyuvante en PBS. Se usaron los siguientes adyuvantes en los respectivos grupos de ratones.

Grupo 1: IFA(50 |il/ratón)

Grupo 2: poli I:C (50 |ig/ratón)

Grupo 3: LAG-3 (1 |ig/ratón)

Grupo 4: LAG-3 (1 |ig/ratón) poli I:C (50 |ig/ratón)

El día 21, se extrajo un tejido tumoral y se prepararon portaobjetos de secciones de tejido tumoral. Posteriormente, se observó una imagen de tejido mediante tinción con hematoxilina-eosina; al mismo tiempo, los núcleos celulares y las células inmunitarias (células CD4 y células CD8) se tiñeron con un colorante fluorescente.

Se usaron los siguientes reactivos en la tinción fluorescente de tejido.

Núcleo celular: reactivo antidesvanecimiento dorado ProLongR con DAPI (Invitrogen)

Anticuerpo primario de células CD4: IgG2b purificada de rata anti-CD4 de ratón. Clon: GK1.5 (eBioscience) Anticuerpo secundario de células CD4: cadena pesada monoclonal de ratón (2B 10A8) anti-IgG2b de rata (Alexa FluorR 647) (abcam)

Anticuerpo primario de células CD8: IgG2a purificada de rata anti-CD8a de ratón. Clon: 53-6.7 (eBioscience) Anticuerpo secundario de células CD8: cadena pesada monoclonal de ratón (2A 8F4) anti-IgG2a de rata (Alexa FluorR 488) (abcam)

Las imágenes de tejido teñidas con hematoxilina-eosina se muestran en la figura 9A y las imágenes del núcleo celular y las células inmunitarias teñidos con un colorante fluorescente se muestran en la figura 9B. Cuando se usaron LAG-3 y poli I:C en combinación como adyuvante, se observó una infiltración significativa de células CD4 y células CD8 en el tejido tumoral.

3. Mantenimiento de la capacidad para rechazar el mismo tumor en ratones una vez rechazado un tumor

Se inocularon por vía subcutánea células tumorales P815 a ratones DBA/2 en una cantidad de 5 x 105 células por ratón y se usaron como ratones de modelo de cáncer. El día de la inoculación se especificó como día 0. El día 8, se inyectaron P1ACTL (2,5 x 105 células por ratón) por vía intravenosa. El día 9 y el día 14, se inyectó por vía subcutánea una mezcla de péptido P1A (50 |ig por ratón) y un adyuvante en PBS. Como adyuvante, se usó LAG-3 (1 |ig/ratón) poli I:C (50 |ig/ratón).

Posteriormente, a los ratones DBA/2 no se les provocó ningún aumento en el tamaño tumoral, incluso si se inocularon células tumorales P815, y se determinó que rechazaban un tumor, y los ratones DBA/2 sin tratamiento previo a los que no se les aplicó tratamiento, se les inocularon por vía subcutánea de nuevo células tumorales P815 (1 x 106 células por ratón) o células tumorales L1210 (1 x 106 células por ratón). A los ratones DBA/2 que se determinó que rechazaban un tumor, se les inoculó de nuevo las células tumorales el día 115 después de la primera inoculación de células tumorales P815.

La figura 10 (izquierda) muestra cambios en el tamaño tumoral promedio (mm3) de ratones después de la inoculación de células L1210; mientras que la figura 10 (derecha) muestra cambios en el tamaño tumoral promedio (mm3) de ratones después de la inoculación de células P815. En ambas figuras, el círculo abierto representa ratones DBA/2 determinados como ratones con rechazo de tumores y el círculo cerrado representa ratones DBA/2 sin tratamiento previo.

En ratones DBA/2 sin tratamiento previo, se observó un aumento en el tamaño tumoral incluso si se inoculaba una cualquiera de las células P815 y las células L1210. Por el contrario, en ratones que se determinó que rechazaban un crecimiento tumoral de células P815, se observó un aumento en el tamaño tumoral por inoculación de otro tipo de células tumorales, es decir, células L1210; sin embargo, no se observó ningún aumento en el tamaño tumoral por la inoculación de células P815. Se confirmó que se mantiene la capacidad de rechazar el mismo tumor.

4. Determinación de la capacidad proliferativa de células inmunitarias y medición de las citocinas en el sobrenadante celular

Se inocularon por vía subcutánea células tumorales P815 a ratones DBA/2 en una cantidad de 5 x 105 células por ratón para preparar ratones de modelo de cáncer. El día de la inoculación se especificó como día 0. El día 8, se inyectaron P1ACTL (2,5 x 105 células por ratón) por vía intravenosa. El día 9 y el día 14, se inyectó por vía subcutánea una mezcla de péptido P1A (50 |ig por ratón) y un adyuvante en PBS. Se usaron los siguientes adyuvantes en los respectivos grupos de ratones.

Grupo 1: IFA(50 |il/ratón)

Grupo 2: poli I:C (50 |ig/ratón)

Grupo 3: LAG-3 (1 |ig/ratón)

Grupo 4: LAG-3 (1 |ig/ratón) poli I:C (50 |ig/ratón)

De los ganglios linfáticos de la axila y la región inguinal, el día 21 se extrajo el ganglio linfático cercano al sitio del tumor y se separaron las células inmunitarias. Las células inmunitarias (1,5 x 105 células) y las células P815 (4 x 104 células) irradiadas con 100 Gy se cultivaron conjuntamente durante 3 días.

La capacidad proliferativa de las células inmunitarias se determinó añadiendo 3H-timidina (37 KBq/pocillo) al sobrenadante del cultivo y midiendo la radiactividad de 3H-timidina incorporada en las células, 4 horas después. Las cantidades de citocinas en el sobrenadante celular se midieron usando el kit de inmunoensayo Bio-Plex Pro mouse cytokine 23-Plex (BIO-RAD).

Los resultados de medición de la capacidad proliferativa de las células inmunitarias se muestran en la figura 11Ay los resultados de medición de las citocinas se muestran en la figura 11B.

En el caso de usar una combinación de LAG-3 y poli I:C como adyuvante, aumentó la capacidad proliferativa de las células inmunitarias. Entre las citocinas, se encontró que IFN-gamma, GM-CSF, IL-4, IL-5 e IL-17A aumentaron en producción cuando se usaron LAG-3 y poli I:C en combinación como adyuvante.

5. Medición de moléculas de marcadores de superficie celular de células inmunitarias

Grupo 1: IFA(50 |il/ratón)

Grupo 2: poli I:C (50 |ig/ratón)

Grupo 3: LAG-3 (1 ^g/ratón)

Grupo 4: LAG-3 (1 ^g/ratón) poli I:C (50 ^g/ratón)

De los ganglios linfáticos en la axila o región inguinal, el día 21 se extrajo el ganglio linfático cercano al sitio del tumor, se recogieron el grupo de células positivas para la expresión de CD8 y Va 8.3 (células T destructoras) o el grupo de células positivas para la expresión de CD4 y Va 8.3 (células T cooperadoras).

Se midieron los niveles de expresión de moléculas de marcadores de superficie celular (en células CD4 y células CD8), es decir, PD-1, BTLA, TIGIT y LAG-3. Como anticuerpos contra las moléculas de marcadores de superficie celular, se usaron las siguientes moléculas.

PD-1: PE anti-CD279 de ratón (PD-1). Clon: J43 (eBioscience)

BTLA: PE anti-CD272 de ratón (BTLA). Clon: 8F4 (eBioscience)

TIGIT: anticuerpo anti-TIGIT de ratón PE (Vstm3). Clon: 1G9 (BioLegend)

LAG-3: PE anti-CD223 de ratón (Lag-3). Clon: eBioC9B7W (C9B7W) (eBioscience)

Los resultados de las células CD8 se muestran en la figura 12A y los resultados de las células CD4 se muestran en la figura 12B.

Cuando se usó una combinación de LAG-3 y poli I:C como adyuvante, se observaron disminuciones significativas en el nivel de expresión de PD-1, TIGIT y LAG-3 tanto en células positivas para CD4 como en células positivas para CD8; sin embargo, la disminución en el nivel de expresión de BTLA fue baja.

6. Medición de citocinas usando ratones de modelo de inoculación de melanoma B16-F10

A ratones C57BL/6 se les inoculó por vía subcutánea células de melanoma B16-F10 (1 * 105 células por ratón) para preparar ratones de modelo de cáncer. El día de inoculación se especificó como día 0. El día 8, se inyectó por vía subcutánea una mezcla de péptido gp100 (50 |ig por ratón) y un adyuvante en PBS. Se usaron los siguientes adyuvantes en los respectivos grupos de ratones. La secuencia de aminoácidos del péptido gp100 está representada por KVPRNQDWL (SEQ ID NO: 2).

Grupo 1: IFA(50 |il/ratón)

Grupo 2: poli I:C (50 |ig/ratón)

Grupo 3: LAG-3 (1 |ig/ratón)

Grupo 4: LAG-3 (1 |ig/ratón) poli I:C (50 |ig/ratón)

De los ganglios linfáticos en la axila o región inguinal, el día 14 se extrajo el ganglio linfático cercano al sitio del tumor (o ambos ganglios linfáticos) y se separaron las células inmunitarias. Las células inmunitarias (3 * 105 células por pocillo se cultivaron en presencia de péptido gp100 (10, 5, 2,5 ó 0 |ig/ml).

La capacidad proliferativa de las células inmunitarias se determinó añadiendo 3H-timidina (37 KBq/pocillo) al sobrenadante del cultivo y midiendo la radiactividad de 3H-timidina incorporada en las células en las últimas 10 horas del periodo de cultivo de 3 días.

La cantidad de producción de IFN-gamma en el sobrenadante celular obtenido mediante cultivo de 3 días en presencia de péptido gp100 (10 |ig/m) se midió mediante el kit de inmunoensayo Bio-Plex Pro mice cytokine 23-Plex (BIO-RAD). Los resultados de medición de la capacidad proliferativa de las células inmunitarias se muestran en la figura 13Ay los resultados de medición de la cantidad de producción de IFN-gamma se muestran en la figura 13B. En la figura 13A, el círculo cerrado representa los resultados del grupo 1, el rectángulo abierto el grupo 2, el rectángulo cerrado el grupo 3 y el círculo abierto el grupo 4.

Incluso cuando se usaron ratones de modelo de inoculación de melanoma B16-F10, si se usó una combinación de LAG-3 y poli I:C como adyuvante, se observó un aumento de la capacidad proliferativa de células inmunitarias específicas del antígeno tumoral gp100 y un aumento de la producción de IFN-gamma .

Se confirmó que cuando se usó una combinación de LAG-3 y poli I:C como adyuvante, puede ejercerse un efecto de activación significativo sobre el sistema inmunitario independientemente del sistema del modelo tumoral y del tipo de péptido que actúa como antígeno inmunitario.

7. Efecto supresor del crecimiento tumoral mediante combinación de inmunoadyuvantes

Se usaron las siguientes sustancias como adyuvantes.

Poli I:C (agonista de TLR3) (Invivogen, San Diego, EE.UU.)

RIBOXXOL (agonista de TLR3) (Riboxx, Radebeul, Alemania)

MPL (agonista de TLR4) (Invivogen, San Diego, EE.UU.)

Imiquimod (agonista de TLR7/8) (Invivogen, San Diego, EE.UU.)

CpG (agonista de TLR9) (Invivogen, San Diego, EE.UU.)

LAG-3 (Adipogen, San Diego, EE.UU.)

Se inocularon por vía subcutánea células tumorales P815 a ratones DBA/2 en una cantidad de 5 x 105 células por ratón para preparar ratones de modelo de cáncer. El día de la inoculación se especificó como día 0. El día 7, se inyectaron P1ACTL (2,5 * 105 células por ratón) por vía intravenosa. El día 8 y el día 15, se inyectó por vía subcutánea una mezcla de péptido P1A (50 |ig por ratón) y un adyuvante en PBS. Los ratones se dividieron en 9 grupos, consistiendo cada uno en 4 ó 5 ratones, y se usaron los siguientes adyuvantes, respectivamente.

Grupo 1: péptido P1A solo (control)

Grupo 2: poli I:C (50 |ig/ratón)

Grupo 3: poli I:C (50 |ig/ratón) LAG-3 (1 |ig/ratón)

Grupo 4: sin péptido P1A, poli I:C (50 |ig/ratón) LAG-3 (1 |ig/ratón) solo

Grupo 5: RIBOXXOL (100 |ig/ratón)

Grupo 6: RIBOXXOL (100 |ig/ratón) LAG-3 (1 |ig/ratón)

Grupo 7: MPL (10 |ig/ratón) LAG-3 (1 |ig/ratón)

Grupo 8: imiquimod (50 |ig/ratón) LAG-3 (1 |ig/ratón)

Grupo 9: CpG (10 |ig/ratón) LAG-3 (1 |ig/ratón)

Los cambios en el tamaño tumoral (mm3) con respecto a todos los ratones en y después del día 7 se muestran en las figuras 14 a 20.

En el grupo 1, 5 de cada 5 ratones murieron para el día 40. Sobrevivieron cuatro de cada 5 ratones en el grupo 2, 5 de cada 5 ratones en el grupo 3, 2 de cada 5 ratones en el grupo 4, y 1 de cada 5 ratones en los grupos 5 a 7. Además, en el grupo 3, 3 de cada 5 ratones sobrevivieron hasta el día 66. Se demostró un efecto de combinación de adyuvantes comparando entre los grupos 2 a 4 y los grupos 5 y 6. En el grupo 4, en el que no se administró péptido P1A, todos los ratones murieron para el día 43. Se demostró que es preferible la administración tanto de un adyuvante como del péptido P1A.

8. Efecto inhibidor del crecimiento tumoral mediante combinación de inmunoadyuvantes usando ratones de modelo de inoculación de melanoma B16-F10

A ratones C57BL/6 se les inoculó por vía subcutánea células de melanoma B16-F10 (1 * 105 células por ratón) para preparar ratones de modelo de cáncer

El día de inoculación se especificó como día 0. El día 5 y el día 12, dos veces en total, se inyectó por vía subcutánea una mezcla de péptido gp100 (50 |ig por ratón) y un adyuvante en PBS. Se usaron los siguientes adyuvantes en los respectivos grupos de ratones.

Grupo 1: IFA(50 ^l/ratón)

Grupo 2: poli I:C (50 ^g/ratón)

Grupo 3: LAG-3 (1 ^g/ratón)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Adyuvante, que comprende

un agonista del receptor 3 tipo Toll y

proteína LAG-3, una variante funcional o un derivado de la misma.

2. Adyuvante según la reivindicación 1, en el que el agonista del receptor 3 tipo Toll es poli l:C o una sal del mismo.

3. Adyuvante según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la proteína LAG-3, una variante funcional o un derivado de la misma es una proteína de fusión de proteína LAG-3 e lgG.

4. Adyuvante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en un método para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa, en el que dicho método comprende además la administración de una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a al menos un tipo de célula cancerosa.

5. Adyuvante para su uso según la reivindicación 4, para la administración combinada de

el agonista del receptor 3 tipo Toll y

proteína LAG-3, una variante funcional o un derivado de la misma.

6. Adyuvante para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, para la administración combinada de el agonista del receptor 3 tipo Toll,

proteína LAG-3, una variante funcional o un derivado de la misma, y

la sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a al menos un tipo de célula cancerosa.

7. Adyuvante para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que

la sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a una célula cancerosa es un péptido derivado de antígeno cancerígeno.

8. Adyuvante para su uso según la reivindicación 7, que comprende dos o más péptidos derivados de antígeno cancerígeno.

9. Medicamento, que comprende el adyuvante, o adyuvante para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el medicamento comprende además una sustancia para inducir una respuesta inmunitaria específica a al menos un tipo de célula cancerosa.