ES2900262T3

ES2900262T3 - Un medicamento para el uso en un método para inducir o extender una respuesta inmunitaria citotóxica celular

Info

Publication number: ES2900262T3
Application number: ES17204421T
Authority: ES
Inventors: Richard Kroczek
Original assignee: Robert Koch Institute
Current assignee: Robert Koch Institute
Priority date: 2014-03-17
Filing date: 2015-03-17
Publication date: 2022-03-16
Anticipated expiration: 2035-03-17
Also published as: WO2015140172A2; US10688165B2; EP3160495B1; JP2017509642A; US20210077601A1; US20170087232A1; JP6698541B2; CA2942610A1; WO2015140175A9; AU2015233542B2; EP3119422A2; AU2015233554B2; AU2015233554A1; CA2942610C; EP3320916B1; CA2942609A1; US12090194B2; WO2015140172A3; JP2017509652A; US20170080067A1

Abstract

Un medicamento que comprende una célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad cargada con péptido de clase I (MHC-I), la cual es una célula PBMC, para uso en un método para extender una respuesta inmunitaria citotóxica celular contra una proteína que comprende antígeno para tratar profilácticamente o tratar un tumor o una infección, el método que comprende el paso de: i) administrar a un paciente que tiene células T activadas contra un antígeno una célula presentadora del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC-I) cargada de péptidos, la cual es una célula PBMC, y un adyuvante que soporta una respuesta mediada por Th-1 y que es una señal de peligro, la cual se selecciona del grupo que consta de agonistas RIG- I sintéticos o recombinantes, ligandos TLR, montanidas, saponinas, ácido polinosínico ácido policidílico (poli I:C), un lipopolisacárido (LPS), y un oligodeoxinucleótido de CpG, en donde el péptido se deriva de la proteína que contiene el antígeno, reactivando de esta manera la célula T activada, en donde el reactivador del paso i) se administra sólo una vez, y se administra en un marco de tiempo de 5 días a 9 días después de que las células T se activaron contra un antígeno, y en donde el reactivador se administra por inyección i.v.

Description

DESCRIPCION

Un medicamento para el uso en un método para inducir o extender una respuesta inmunitaria citotóxica celular

La presente invención se refiere a un medicamento que comprende una célula presentadora del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC I) cargada de péptidos, que es una célula PBMC, para uso en un método para extender una respuesta inmunitaria citotóxica celular contra una proteína que comprende antígeno para tratar profilácticamente o tratar un tumor o una infección, como se especifica en las reivindicaciones.

El sistema inmunológico protege al cuerpo contra patógenos y células tumorales por una variedad de mecanismos. Para funcionar apropiadamente, tiene que discriminar entre “propios” y “extraños” (patógenos/tumores). Detecta y combate una variedad de patógenos, incluidos bacterias, virus, parásitos, hongos y toxinas. Los sistemas inmunitarios de vertebrados tal como humanos consisten en muchos tipos de proteínas, células, tejidos, y órganos que interactúan en una red dinámica. Como parte de esta respuesta inmunitaria compleja, el sistema inmunitario vertebrado se adapta a través del tiempo para reconocer patógenos particulares de manera más eficiente. El proceso de adaptación crea memoria inmunológica y permite una protección más eficaz durante encuentros futuros con estos patógenos. La vacunación se basa en este proceso de inmunidad adquirida.

Las células dendríticas (DC) forman parte del sistema inmunitario. Su función principal es procesar el material de antígeno y presentarlo sobre su superficie a otras células del sistema inmunitario, funcionando de esta manera como células que presentan antígeno.

Las células auxiliares T (también conocidas como células T efectoras o células Th) también son un miembro importante del sistema inmunitario en que desempeñan una función fundamental en establecer y maximizar las capacidades del sistema inmunitario. Las células Th se implican en activar y dirigir otras células inmunitarias. Son esenciales en determinar el cambio de clase de anticuerpos de células B, en la activación y expansión de células T citotóxicas, y maximizar la actividad bactericida de los fagocitos tal como macrófagos. Es esta diversidad de función y su papel en influir otras células que le da a las células auxiliares T su nombre.

Las células T auxiliares proliferantes que se desarrollan en las células T efectoras se diferencian en dos subtipos principales de células conocidas como células Th1 y Th2 (también conocidas como células T auxiliares Tipo 1 y Tipo 2, respectivamente), en donde las células Th2 promueven principalmente el sistema inmunitario humoral (estimulación de células B en la proliferación, inducción del cambio de clase del anticuerpo de células B, e incremento de la producción de anticuerpos), donde las células Th1 promueven principalmente el sistema inmunitario celular (maximización de la eficacia de exterminio de los macrófagos y células T CD8+ citotóxicas). Dependiendo de la naturaleza del patógeno invasor, el sistema inmunitario desarrolla una respuesta inmunitaria Th1 o Th2. En el caso de la respuesta inmune Th1, las células T CD8+ muestran una fuerte tendencia a diferenciación en las células T citotóxicas. Al mismo tiempo, tanto las células T auxiliares CD8+ como CD4+ de la respuesta inmunitaria Th1 secretan grandes cantidades de IFN-y (y otras citocinas/quimiocinas Th1) e inducen la generación de anticuerpos predominantemente del isotipo IgG2a e IgG2b en el ratón y predominantemente del isotipo IgG en el humano. La respuesta inmunitaria Th1 es particularmente eficaz para defender al cuerpo contra virus, bacterias (intracelulares) y tumores.

Las vacunas actualmente disponibles y sistemas adyuvantes dirigidos contra componentes patogénicos vivos, atenuados o inactivados inducen principalmente una respuesta inmunitaria de anticuerpo, pero no una respuesta citotóxica Th1 eficaz (Steinman et al., 2007, Nature 449, 419-26). Los anticuerpos inducidos se unen a los componentes del patógeno y de esta manera lo inactivan biológicamente (“anticuerpos neutralizantes”). Sin embargo, existe una variedad de enfermedades, donde los anticuerpos neutralizantes no son suficientes para proteger de la enfermedad o para controlar la enfermedad y no es eficaz la tecnología actual de la vacuna. Estas son enfermedades que pueden requerir una respuesta inmunitaria Th1 eficaz para la contención y/o erradicación de la infección. Ejemplos son tuberculosis, malaria, leishmania, enfermedades priónicas, ortomixovirus y en particular influenza, hepatitis A, hepatitis B, virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y otros lentivirus, citomegalovirus, virus de herpes, virus de papiloma, bunyavirus, calicivirus, filovirus, flavivirus y en particular virus de hepatitis C, virus de papiloma, paramixovirus, una variedad de virus respiratorios y otros virus que necesitan para contener y erradicar una respuesta inmunitaria Th1 eficaz, y en particular una respuesta citotóxica Th1. El desarrollo de una metodología de vacunación que induce esta respuesta de Th1 eficaz por lo tanto es altamente deseable. Además, el direccionamiento del mecanismo de “presentación cruzada” (ver lo siguiente) es de suma importancia para la inducción de una respuesta inmunitaria Th 1 contra patógenos virales, bacterianos, parasíticos y fúngicos, puesto que las células dendríticas más frecuentemente no se infectan directamente en el curso de una infección. Sin el desarrollo de una respuesta inmunitaria Th1, muchas infecciones virales, bacterianas, parasíticas o fúngicas no se pueden contener o erradicar en el cuerpo humano.

Nestle F.O. et al. (Nature Medicine, 1998, 4(3): 328-332) divulga la vacunación de pacientes con melanoma con células dendríticas impulsadas con lisado tumoral.

Se ha encontrado en WO 2009/065561, que las células desempeñan una función principal en la inducción de la respuesta Th1 que pueden ser dirigidas selectivamente. Se encontró que el receptor 1 de quimiocina (motivo C) (XCR1) está presente sobre la superficie de la célula que presenta antígeno profesional, particularmente células dendríticas (DC), y se puede utilizar para suministrar selectivamente la sustancia en estas células. El suministro dirigido de una sustancia a CD que lleva XCR1 permite la inducción de una potente reacción inmunitaria Th1 en mamíferos/humanos. Las vacunas actuales dirigen principalmente la ruta de presentación de antígeno Th2 y conducen principalmente a la generación de anticuerpos tipo Th2 (neutralizantes) y reacciones inmunitarias. En particular, a través del direccionamiento a DC que lleva XCR1, se puede inducir una reacción inmunitaria humoral y celular tipo Th1 (citotóxica) para un inmunógeno dado. Se puede anticipar que las células NK, células T CD8+ y células T Th1CD4+ participan en esta reacción, pero otras células T CD4+ también pueden contribuir a este tipo de reacción. Un adyuvante, ya sea solo o en combinación con un inmunógeno o cualquier compuesto farmacéutico, se puede dirigir selectivamente a células que presentan antígeno que llevan XCR1 (APC).

En la periferia, el sistema inmunitario tiene que discriminar entre antígenos extraños o auto-antígenos no perjudiciales, por una parte, y antígenos peligrosos (virales, bacterianos, fúngicos, parasíticos, similar a toxina) por otra parte. El antígeno es captado por la DC y descompone los péptidos (“procesados”). Los péptidos resultantes se “presentan” a los linfocitos T (células T) en el contexto de la MHC clase I o MHC clase II. El subconjunto de CD4+ de las células T reconoce el antígeno en el contexto de MHC clase II, el subconjunto CD8+ de células T reconoce el antígeno en el contexto de MHC clase I. Concomitante con la captación de antígeno, el DC es capaz de detectar a través de un conjunto grande de receptores de reconocimiento de “señal de peligro” (por ejemplo, receptores similar a Toll, receptores similar a NOD), donde el antígeno es de naturaleza peligrosa por si es inofensivo. Los patrones reconocidos por los receptores de reconocimiento “de señal peligrosa” (también designados “receptores de reconocimiento de patrones”) son usualmente estructuras moleculares que son únicas para los microorganismos. Estos pueden ser componentes de pared celular (por ejemplo, lipopolisacárido, péptidoglicano) o modificaciones de ácido nucleico (por ejemplo, motivos CpG no metilados) en caso de microbios, o características estructurales y modificaciones que son únicas para el ADN viral o ARN viral (por ejemplo, ARN de doble hebra). También las células moribundas de la apoptosis en el cuerpo liberan moléculas que son capaces de activar los receptores de reconocimiento “de señal peligrosa” (por ejemplo, proteína B1 del grupo de alta movilidad, proteínas de choque térmico).

En el caso de un antígeno peligroso, la DC activa un programa de respuesta específica (“maduración”). El antígeno se presenta a las células T CD4+ y CD8+, que se reciben simultáneamente de las señales adicionales DC indicando la naturaleza peligrosa del antígeno. Como resultado, ambos subconjuntos de células T se activan, se expanden extensivamente con una vida útil prolongada y se desarrollan “células T efectoras”. Estas pueden ser células T c D4+ que proporcionan “ayuda” a otras células DC o B u otras células del sistema inmunitario, o aún pueden ser células citotóxicas CD4+. Dentro del subconjunto de células T CD8+, nuevamente se desarrollan células auxiliares T, pero una gran proporción de células T CD8+ se vuelven células efectoras capaces de eliminar el patógeno invasor a través de la secreción de IFN-y y otros factores solubles o a través del exterminio de células corporales infectadas. Como resultado de la célula T que ayuda a las células B, las células B específicas de antígeno se diferencian de las células plasmáticas que secretan anticuerpos dirigidos al antígeno (patógeno). Estos anticuerpos ayudan a combatir el patógeno a través de una variedad de mecanismos (por ejemplo, neutralización, captación de antígeno mejorada, opsonización, fijación de complemento).

Una cierta variedad de células T CD4+ y CD8+ efectoras sobreviven a la fase aguda de una respuesta inmunitaria a un patógeno y se vuelven en “células T de memoria” de larga duración. Las células T de memoria y las células plasmáticas de larga duración orquestan tras la re-exposición al mismo patógeno (antígeno) una respuesta inmunitaria muy rápida que permite que el sistema inmunitario elimine el patógeno (antígeno) de manera muy eficaz. Esta capacidad mejorada de la respuesta inmunitaria de células T y células B tras la re-exposición al mismo patógeno es llamada “inmunidad” y los antígenos que inducen inmunidad son “inmunogénicos”.

En resumen, el compartimento de células T del sistema inmunitario contiene células T CD4+ y células T CD8+. En el organismo sin tratamiento previo, solo pocos cientos de células T CD4+ o CD8+ reconocen un antígeno dado. Siempre y cuando no se hayan encontrado con el antígeno, las células T están en un estado sin tratamiento previo y pueden no ejercer las funciones efectoras. Las células T CD4+ y CD8+ sin tratamiento previo solo se pueden activar por APC mediante proteína soluble o antígeno de polipéptido, que se capta por la APC, procesada, y “presentada” sobre la superficie celular en el contexto de MHC. La fuente de la exposición del antígeno primario puede ser una proteína soluble o polipéptido o cualquier tipo de vacuna, tal como agentes infecciosos atenuados, vectores virales o bacterianos que codifican para una proteína o péptido antigénico deseado, o vectores de expresión de ADN o ARN que codifican para una proteína o péptido antigénico. Como resultado de la exposición primaria al antígeno en el contexto de señales peligrosas, existirá dentro de días una población de células T CD4+ y CD8+ “cebadas”.

Cuando un antígeno de proteína se dirige a una APC, se degradará (“procesará”) a los péptidos y estos péptidos se presentarán sobre la superficie de la APC en el contexto de MHC-II (presentación clásica) y MHC-I (“presentación cruzada”). Las células T CD4+ sin tratamiento previo reconocen su antígeno peptídico en el contexto de MHC-II, células T CD8+ sin tratamiento previo en el contexto de MHC-I. Se activan, proliferan, y adquieren funciones efectoras. Si los péptidos se presentan por la DC en el contexto de una “señal peligrosa”, las células T CD8+ expandidas se diferenciarán en las células T citotóxicas. Solo las APC profesionales son capaces de inducir esta función citotóxica en las células T CD8+ sin tratamiento previo (“cebado”, “inmunización primaria”). Una vez que las células T CD8+ han adquirido su potencial citotóxico, serán capaces de exterminar células en el cuerpo que expresan los mismos péptidos en el contexto de MHC-I. De esta manera, exterminarán células infectadas por un agente infeccioso dado o células tumorales.

Los antígenos que son captados por las células capaces de presentación a antígeno no solo se presentan en el contexto de MHC-I (“presentación cruzada”), sino también en el contexto de MHC-II (“presentación clásica”). Por lo tanto, cualquier suministro de antígeno en las células que presentan antígeno, junto con una señal peligrosa, no solo activarán las células T CD8+, sino también las células T CD4+. Las células T CD4+ se diferenciarán en las células Th1 T que secretan TNF-a e IFN-y, y algunas también se desarrollarán en las células T citotóxicas.

La activación de células T CD8+ primarias se puede lograr al proporcionar un antígeno soluble, o por direccionamiento directo o indirecto de o los antígenos en APC (células B, macrófagos, DC) y, en particular en XCR1+ DC de un hospedero sin tratamiento previo. El direccionamiento indirecto se logra al proporcionar el antígeno en las células que no son APC, pero que pueden transferir el antígeno a APC, en particular a XCR1+ DC in vivo. Cuando el antígeno se aplica conjuntamente con una “señal peligrosa” (por ejemplo, LPS, Poli I:C, CpG, etc.), esto inducirá inmunidad citotóxica de células T CD8+ primarias.

La activación de células T temprana similar se puede esperar la re-estimulación del antígeno (en presencia de señales peligrosas) de un hospedero, que se ha cebado con un antígeno antes y cuyas células T CD8+ específicas de antígeno y células T CD4+ están en un estado de memoria no activado.

Se puede esperar la activación de células T similar en los hospederos que alojan infecciones crónicas de grado bajo que no se podrían eliminar por el hospedero (por ejemplo, CMV, VHC, VIH).

El antígeno se puede dirigir a APC. Este direccionamiento puede ser mediado por anticuerpos monoclonales (mAb) o fragmentos de anticuerpo que se unen a las estructuras de superficie en la APC, o por cualquiera de los ligandos que se unen a los receptores sobre la superficie de APC. Estos ligandos pueden ser porciones de azúcar, quimiocinas, ligandos de proteínas solubles, o cualquier otra estructura que permita la internalización del antígeno en la APC. El antígeno captado por cualquier DC es presentado tanto en el contexto de MHC-I como MHC-II. El direccionamiento directo o indirecto del antígeno en las células dendríticas (DC) mejora sustancialmente la presentación cruzada sobre los otros modos de aplicación de antígeno. La mejor presentación cruzada y de esta manera, el cebado de las células T CD8+ se puede lograr por el direccionamiento del antígeno en XCR1+ DC (Bachem et al. 2010, J Exp Med 207, 1273-1281, Bachem et al., 2012 , Front Immunol 3, 214; Caminschi et al.2013, Radford et al.2013, Kreutz et al.2013).

Después de un cebado eficiente de las células T CD8+ en el contexto de una señal peligrosa (que también es un primer adyuvante), estas células T citotóxicas representarán aproximadamente 1% a 5% del repertorio de células T CD8+ y mostrarán un potencial citotóxico significativo. Por ejemplo, la citotoxicidad lograda puede proteger al hospedero contra un patógeno, del cual el antígeno se derivó, y este nivel de protección también puede ser eficaz para tejido canceroso que se desarrolla recientemente (Fig. 2B).

Sin embargo, cuando se intenta establecer inmunidad a largo plazo contra un antígeno dado o para proporcionar niveles más altos de protección citotóxica contra infecciones inminentes, o proporcionan altos niveles de citotoxicidad contra tumores ya establecidos, el potencial citotóxico inducido por un cebado inicial de células T CD8+ sin tratamiento previo o la reactivación de las células T CD8+ pueden no ser suficientes. Bajo estas circunstancias, es necesaria una amplificación adicional de las células T CD8+ específicas de antígeno activadas.

Después de reconocer el antígeno expresado en el contexto de MHC-I, las células T CD8+ se activan, expresan de novo o regulan por incremento en gran medida una variedad de moléculas de superficie celular, tal como CD69, 4-1BB, ICOS, CD25, CD40L, OX40 y proliferan por hasta aproximadamente 8 días en el ratón (el marco de tiempo de alguna manera puede ser diferente en el humano). Después, las células T CD8+ inicialmente activadas regresan gradualmente durante aproximadamente 2-3 semanas en un estado de “memoria” en reposo. Al mismo tiempo, la población de células T específicas de antígeno expandidas contraataca en gran medida. Una proporción de las células T CD8+ sobrevivirá a este proceso de contracción y se volverán células T de memoria (Cui et al., 2010, Immunol. Rev. 236, 151-166).

Los esquemas de vacunación clásicos se pueden dividir en un paso de cebado inicial, seguido por uno o varios “refuerzos”. El principio de refuerzo se basa en la activación de novo de las células B inicialmente expandidas o células T que se han sometido a una modulación por decremento de la activación inicial o ya se han revestido en el estado en reposo.

El problema subyacente a la presente invención es la provisión de un medicamento mejorado para el uso en un método para inducir una respuesta inmunitaria citotóxica celular y/o en un método para extender una respuesta inmunitaria citotóxica celular comparada con las tecnologías de la técnica anterior.

El problema se resuelve por la presente invención.

Se describe un medicamento para el uso en un método para introducir una respuesta inmunitaria citotóxica celular, el método que comprende los pasos de:

i) administrar a un paciente un sistema de suministro que comprende (a) una molécula que se une a un receptor sobre la superficie de una célula dendrítica, (b) una proteína que comprende antígeno unida a la molécula de (a) y (c) un primer adyuvante, en donde tras la unión de la molécula de (a) al receptor, la proteína de (b) se internaliza y se procesa en la célula dendrítica y el antígeno comprendido en la proteína se presenta sobre la superficie de la célula dendrítica, activando de esta manera una célula T en el paciente; y

ii) administrar al paciente un re-activador seleccionado del grupo que consiste de (d) interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx), (e) una célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y un segundo adyuvante, y (f) una combinación de (d) y (e), en donde el péptido se deriva de la proteína que comprende el antígeno como se define en el paso i), re-activando de esta manera la célula T activada en el paso i),

en donde el re-activador del paso ii) se administra en un marco de tiempo de 0 h a 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

En una divulgación preferida, el medicamento es para el uso en un humano.

El paciente es de manera preferente un paciente mamífero, de manera más preferente un paciente humano. El paciente puede padecer de una infección o tumor o, en caso de tratamiento profiláctico, no padece de una infección o tumor, pero va a ser protegido de una infección respectiva o enfermedad tumoral.

De manera preferente, el receptor sobre la superficie de una célula dendrítica es un receptor humano sobre la superficie de una célula dendrítica.

Una posibilidad de proporcionar una fuerte citotoxicidad de células T dentro de un tiempo corto sería interferir con el mecanismo regulador negativo que se vuelve eficaz pocos días de la activación inicial o reactivación de las células T CD8+ por el antígeno. Para prevenir esta modulación por decremento de la respuesta de células T CD8+, los inventores razonaron que tienen que proporcionar otro estímulo que implique el complejo del receptor de células T en las células T CD8 y/o factores de crecimiento apropiados dentro de un marco de tiempo corto de la activación inicial o reactivación. Este concepto va en contra del dogma actual que enseña que la activación repetida de las células T a través del receptor de células T dentro de un corto tiempo dará por resultado “muerte celular inducida por activación” (Gorak-Stolinska et al., 2001, J Leukoc Biol 70, 756-766).

Para probar el concepto de los inventores, ratones C57BL/6 se inmunizaron (“se cebaron”) al dirigir un antígeno a XCR1 DC en presencia de un primer adyuvante que soporta una respuesta Th-1 (poli I:C, LPS, CpG, o equivalente). Como antígeno para esta inmunización primaria se utiliza el antígeno modelo ovalbúmina (OVA), o una secuencia de péptido derivada de ovalbúmina (SIINFEKL (SEQ ID NO: 11)). Esta secuencia de péptidos es conocida por ser presentada de manera preferente en el contexto del MHC-I de los ratones C57BL/6 después del procesamiento de o Va por la APC diana. Para esta inmunización inicial, la proteína OVA o el péptido SIINFEKL (SEQ ID NO: 11) se fusionaron recombinantemente ya sea a un anticuerpo monoclonal (mAb) específico para XCR1 o al ligando de quimiocina XCL1 que se une a XCR1, como se describe en lo anterior (WO 200/065561). En varios puntos de tiempo (3-20 días) después de este paso de cebado, los ratones se volvieron a exponer al antígeno. Los inventores no inyectaron la proteína o péptidos en el hospedero, puesto que anticiparon que cualquier procedimiento conduciría a la presentación de péptidos antigénicos en el contexto del MHC-I en las células hospederas, que luego se exterminarían por las células T CD8+ específicas de antígeno ya activadas (comparar la Fig. 1A), un efecto altamente indeseable. En cambio, las células esplénicas singénicas se aislaron de ratones C57BL/6, se incubaron con el péptido SIINFEKL (SEQ ID NO: 11) in vitro (“carga” de MHC-I), se lavaron, y se inyectaron i.v. en los ratones que se habían cebado anteriormente.

Inesperadamente, y contrario al conocimiento actual, los inventores podrían lograr con este régimen una amplificación del número de células T CD8+ específicas de antígeno, cuando las células T CD8+ se re-expusieron al antígeno dentro de un marco de tiempo reducido. No se observó amplificación, cuando la re-exposición fue muy temprana, en el día 3, y se observó una amplificación muy limitada cuando la re-exposición al antígeno se hizo después del día 9 de la activación de las células T CD8+ inicial (Fig. 3). La inyección de células esplénicas singénicas cargadas con SIINFEKL en los animales cebados solos no expandió la población de células T CD8+ cebadas, solo cuando un segundo adyuvante (poli I:C, LPS, CpG o equivalente) se co-aplicó para proporcionar una señal “peligrosa”, se logró el efecto deseado. Cuando la inyección de los esplenocitos cargados con péptidos se llevó a cabo en un punto de tiempo óptimo, la población de células T CD8+ sensibles al antígeno se expandieron aproximadamente 10 veces, de 0.2 x 106 después del cebado sin amplificación, a 2 x 106 células con amplificación (Fig. 4). Estas células CD8+ expandidas expresaron altos niveles de moléculas efectoras tal como Granzima B, perforina, TNF-a y IFN-^y, moléculas implicadas en la defensa de células T CD8+ de agentes infecciosos o en la erradicación de tumores. En el humano, el marco de tiempo óptimo para la amplificación de la activación de células T inicial puede diferir del marco de tiempo óptimo en el ratón (aproximadamente día 5-8 después de la activación de células T CD8+ inicial).

Cuando se comparan varios puntos de tiempo de amplificación, se volvió evidente que una re-exposición con el antígeno 5-8 días después del cebado inicial da el grado más alto de expansión de células T CD8+ y la expresión más alta de moléculas efectoras citotóxicas (TNF-a y IFN-^y, granzima B, perforina) en las células T CD8+. El día 5-8 es un punto de tiempo temprano después del reconocimiento del antígeno por las células T CD8+ en reposo y de esta manera, un punto de tiempo en el cual las células T aún se activan en gran medida. Por lo tanto, esta amplificación no representa un sistema de refuerzo clásico. En cambio, este tipo de amplificación proporciona señales que permiten que las células T continúen su activación inicial y fase de expansión en lugar de entrar a la fase usual de regulación por decremento y contracción. Debido a este efecto particular, los inventores han llamado esta amplificación, cuando se aplica conjuntamente con un adyuvante, como “Sistema de Amplificación Dependiente de Antígeno” (ADAS).

Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, “Sistema de Amplificación Dependiente de Antígeno” o “ADAS” se entiende como el segundo paso ii) del medicamento para el uso de la presente invención que se relaciona con la administración al paciente de un reactivador, en donde el reactivador es una célula presentadora del complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargado con péptido y un segundo adyuvante, y en donde el péptido se deriva de la proteína que comprende antígeno como se define en el paso i) de la presente invención, reactivando de esta manera la célula T activada en el paso i). Opcionalmente, el reactivador en ADAS comprende además interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx).

A fin de examinar los requisitos celulares para la eficacia de ADAS, varias poblaciones linfocíticas (esplenocitos, células B, células T, y DC) se cargaron para comparación con SIINFEKL (SEQ ID NO: 11) in vitro y se inyectaron dentro del marco de tiempo óptimo en los ratones (día 5) junto con un segundo adyuvante (poli I:C, LPS, CpG, o equivalente). Este experimento determinó que todas estas poblaciones linfocíticas que expresan MHC-I fueron capaces de proporcionar las señales necesarias para continuar la activación inicial, expansión y diferenciación funcional de las células T CD8+ a las células efectoras citotóxicas (Fig. 3B). Mientras que el cebado solo resultó en el día 10 en 1%-5% de células T CD8+ específicas de antígeno dentro de la población de células T CD8 esplénicas, la aplicación de ADAS elevó esta frecuencia a aproximadamente 15%-25%.

A partir de los resultados obtenidos, se puede concluir que el ADAS funcionará in vivo con cualquier sistema capaz de proporcionar una densidad suficientemente alta de moléculas MHC-I cargadas con péptidos sobre la superficie de células linfocíticas o aún células no linfocíticas. En lugar de cargar las moléculas MHC-I con péptidos externamente in vitro, se podría prever sistemas en los cuales las células se alimentarían in vitro con proteína que comprende antígeno completa, permitiendo que las células procesen el antígeno y presenten los péptidos antigénicos en el contexto de MHC-I. También se podría prever sistemas en los cuales las células se expondrían in vitro a sistemas virales capaces de infectar las células que dan por resultado la expresión de altas cantidades de péptido en el contexto de MHC-I. Además, las células que llevan m HC-I se podrían transfectar con vectores de expresión que codifican para una secuencia de proteínas o péptidos dada, dando por resultado nuevamente una presentación eficiente de péptidos en el contexto de MHC-I.

Puesto que el antígeno entero suministrado a APC no solo se presentará en el contexto de MHC-I a las células T CD8+, sino también en el contexto de MHC-II a las células T CD4+, ADAS también se puede utilizar para amplificar la respuesta de células T CD4+. Para esta amplificación particular, las células utilizadas para ADAS tienen que expresar moléculas MHC-II sobre la superficie celular, los cuales se podrían cargar con los péptidos apropiados. Esta carga se podría hacer por exposición externa a los péptidos adecuados, o las células que llevan MHC-II se podrían transfectar por vectores de expresión que codifican para una secuencia de proteínas o péptidos dados, nuevamente dando por resultado una presentación eficiente de péptidos en el contexto de MHC-II.

Aunque los inventores aplicaron ADAS a través de inyección i.v., son posibles otras vías de aplicación de las células cargadas con péptido. Esto podría hacer por inyección subcutánea, intracutánea, intramuscular, intraperitoneal, intratecal o por inyección directa en el tejido tumoral.

Por lo tanto, la administración de un reactivador del paso ii) se puede llevar a cabo por métodos de administración conocidos, en particular seleccionados de inyección subcutánea (s.c.), intracutánea, i.v., intramuscular, intraperitoneal, intratecal, o por inyección directa en el tejido tumoral, de manera más preferente por inyección i.v. o s.c.

También, la administración de un sistema de suministro del paso i) del medicamento para el uso divulgado anteriormente se puede llevar a cabo por métodos de administración conocidos, en particular seleccionados de inyección subcutánea, intracutánea, i.v., intramuscular, intraperitoneal, intratecal administración en el pulmón, o por inyección directa en un tejido tumoral, de manera más preferente por inyección i.v. y s.c.

La molécula que se une a un receptor sobre la superficie de una célula dendrítica, (b) una proteína que comprende antígeno unida a la molécula de (a) y (c), un primer adyuvante se administra de manera preferente como una preparación farmacéutica individual. Esta preparación farmacéutica es de manera preferente un líquido que puede contener además excipientes aceptables farmacéuticos como compuestos amortiguadores. Esta preparación farmacéutica se esteriliza de manera preferente.

El volumen de la dosis del sistema de suministro del paso i) para administración intramuscular es de manera preferente hasta aproximadamente 5 mL, por ejemplo, entre 0,3 mL y 3 mL, entre 1 mL y 3 mL, aproximadamente 0,5 a 1 mL o aproximadamente 2 mL. La cantidad de ingrediente activo en cada dosis debe ser suficiente para proporcionar el tratamiento o prevención. En diferentes divulgaciones, la dosis unitaria de la sustancia que se suministra debe ser de hasta aproximadamente 5 |jg de sustancia/kg de peso corporal, entre aproximadamente 0,2 a 3 |jg, entre aproximadamente 0,3 a 1,5 jg , entre aproximadamente 0,4 a 0,8 jg , o aproximadamente 0,6 jg . En las divulgaciones alternativas las dosis unitarias podrían ser de hasta aproximadamente 6 jg de sustancia/kg de peso corporal, entre aproximadamente 0,05 a 5 jg , o entre aproximadamente 0,1 a 4 jg . Las cantidades representativas de la proteína por dosis son de aproximadamente 1 |jg a aproximadamente 1 jg , de manera más preferente de aproximadamente 5 |jg a aproximadamente 500 jg , aún de manera más preferente de aproximadamente 1o jg a aproximadamente 250 jg , y de manera mucho más preferente de aproximadamente 25 jg a aproximadamente 100 jg .

El número de células de un reactivador que comprende una célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I cargada con péptido (MHC-I) y un segundo adyuvante a ser administrado en el paso ii) pueden variar y es habitualmente en el intervalo de 1x106 a 400x106 células, de manera preferente es en el intervalo de 1x106 a 200x106 células.

La IL-2 formada en complejo como reactivador se administra de manera preferente como una solución y/o en una dosificación en el intervalo de 1 jg/kg de peso corporal a 200 jg/kg de peso corporal, de manera más preferente de 1 jg/kg de peso corporal a 50 jg/kg de peso corporal, aún de manera más preferente de 1 jg/kg de peso corporal a 20 jg/kg de peso corporal en donde las cantidades se refieren al contenido de IL-2 en la composición.

Aunque se probó el efecto de ADAS después del direccionamiento del antígeno la XCR1 DC, se puede concluir a partir de los resultados que cualquier sistema que conduzca a una activación inicial significativa “cebado” o reactivación de células TCD8+ y/o células T CD4+ por la activación del receptor de células T in vivo se puede amplificar con el procedimiento ADAS.

La linfocina IL-2 se ha utilizado en el pasado a fin de expandir las poblaciones de células T y células NK y mostró que es eficaz, cuando se proporciona en una forma “formado en complejo”, es decir, unida a un anticuerpo que bloquea su unión a la cadena del receptor IL-2 de alta afinidad CD25, Boyman et al., 2006, Science 311, 1924-1927).

De acuerdo con la presente invención, “IL-2 formada en complejo” o “IL-2cx” se entiende como IL-2 que se une no covalentemente a una molécula de unión, en particular un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que está bloqueando su unión a la cadena de receptor IL-2 de alta afinidad (CD25). En una modalidad preferida, el anticuerpo es humanizado o humano. De manera preferente, IL-2 es IL-2 humana. La IL-2 se puede sintetizar sintética o recombinantemente, utilizando un hospedero adecuado. En una modalidad preferida IL-2 se prepara recombinantemente.

Se probó IL-2 formada en complejo (IL-2cx) en el sistema de la activación de células T a través del direccionamiento del antígeno a la XCR1+ DC. Contrario a las expectaciones, el cebado de la respuesta de células T seguido por la aplicación de IL-2cx sola no incrementó significativamente el número de células T CD8+ específicas de antígeno (Fig. 4). La aplicación del ADAS solo en el día 5 incrementó el número de células T CD8+ específicas de antígeno de aproximadamente 0.2 x 106 después del cebado solo a aproximadamente 2 x 106 y de esta manera aproximadamente 10 veces, como se describe en lo anterior. Sin embargo, y muy sorprendentemente, cuando se aplicó en el contexto de ADAS, la IL-2cx aumentó en gran medida la amplificación de las células T CD8+ específicas de antígeno a aproximadamente 100-200 x 106 CD8+ específica de antígeno, es decir, aproximadamente por un factor de 50-100. Este efecto altamente sinérgico indicó que ADAS creó condiciones favorables para los efectos biológicos de IL-2, cuando IL-2 se aplicó en una forma formada en complejo. La combinación de ADAS e IL-2cx fue amplificar el cebado inicial a tal grado que ahora la gran mayoría de todas las células inmunitarias esplénicas están compuestas de células T CD8+ específicas de antígeno. Cuando se examinó adicionalmente, esta población de células T masivamente expandidas expresó granzima B a aproximadamente 60-70% indicando un alto potencial citotóxico.

A fin de probar la capacidad citotóxica de las células T CD8+ amplificadas bajo varias condiciones los inventores eligieron un modelo de tumor, en el cual una línea de tumor transfectado con OVA altamente agresivo se inyectó s.c. en los ratones C57BL/6 singénicos y se dejó crecer durante 6 días a un tamaño sustancial (aproximadamente 20 mm2). A partir del día 6, los grupos de ratones a sea se dejaron sin tratar, o se trataron por diferentes regímenes. El cebado de los ratones portadores de tumor en el día 6 solos por el direccionamiento de OVA en XCR1+ DC tuvo escasamente cualquier efecto del crecimiento del tumor (Fig. 5) y lo mismo fue cierto si los ratones no se cebaron, pero se trataron con IL-2cx sola. Sorprendentemente, el cebado de los ratones en el día 6, seguido por un tratamiento con IL-2cx solo por los días consecutivos redujo significativamente el crecimiento del tumor hasta el día 22, indicando la inducción de la capacidad de exterminio sustancial in vivo. Sin embargo, el tumor reanudó su crecimiento aproximadamente el día 22 indicando que no toda la masa tumoral se podría eliminar. También la aplicación de ADAS en el día 6 después del cebado redujo muy sustancialmente el crecimiento del tumor que, sin embargo, volvió a crecer aproximadamente el día 18 (Fig. 5). Interesantemente, la aplicación de ADAS en el día 6 después del cebado combinado con la aplicación consecutiva de IL-2cx fue claramente más eficaz en reducir el tamaño del tumor hasta el final del experimento (Fig. 5). Los resultados obtenidos indicaron que la inyección de IL-2cx sola dentro de un marco de tiempo dado después del direccionamiento del antígeno APC fue ya muy eficaz en controlar el crecimiento del tumor. Además, el resultado indicó que ADAS, cuando se aplicó dentro de un marco de tiempo dado después de la activación inicial de las células T CD8+ por el antígeno, también indujo actividad de exterminio potente contra un tumor que expresa este antígeno. Más eficaz en controlar el crecimiento de un tumor agresivo fue una combinación de ADAS e IL-2cx (Fig. 5). Aunque en este experimento el ADAS se aplicó primero y fue seguido por IL-2cx, la secuencia de tratamiento también se podría revertir. En este caso, IL-2cx se podría aplicar primero, seguido en un tiempo apropiado por el ADAS.

En una divulgación preferente del paso i) del medicamento para el uso en un método se describe en WO 2009/065561 para XCR1 como receptor de la superficie de una célula dendrítica. Como se divulga en WO 2009/065561, un anticuerpo anti-XCR1 o fragmento del mismo, o XCL1 o un fragmento funcionalmente activo del mismo se puede emplear de manera preferente como una molécula que se une a un receptor sobre la superficie de una célula dendrítica. Las modalidades descritas en WO 2009/065561 también aplican para el paso i) de los medicamentos para el uso en la presente divulgación.

Son conocidas proteínas que comprenden antígeno adecuadas por la persona experta.

Por ejemplo, se conocen numerosas proteínas que comprenden antígeno adecuadas en el contexto de enfermedades tumorales. Por otra parte, los péptidos adecuados como vacunas se describen, por ejemplo, se resumen por Aranda et al., Oncolmmunology 2:12, e26621; Diciembre de 2013 para neoplasmas sólidos, incluido glioma, carcinoma de pulmón, sarcoma, melanoma, carcinoma de células escamosas esofágicas, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular, cáncer pancreático, carcinoma colorectal, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, carcinoma de ovario, neoplasias malignas ginecológicas y varios otros tumores. Las proteínas que comprenden antígeno dirigidas específicamente en estos ensayos clínicos abarcan antígenos de testículos cancerosos tal como NY-ESO-1, proteína cinasa TTK (también conocida como MOS), complejo de linfocitos de antígeno 6, sitio K (LY6K, mejor conocido como URLC10), proteína 3 de unión a ARNm de factor 2 de crecimiento similar a insulina (IGF2BP3, mejor conocido como IMP3), proteína de saliente de anillo (RNF43), y translocasa de la membrana mitocondrial exterior 34 (TOMM34); antígenos carcinoembriónicos similar a glipican-3; antígenos de diferenciación tal como melan-A (MLANA) y proteína premelanosoma (PMEL, mejor conocida como gp100); antígenos restringidos a tumor, tal como la fusión SYT-SSX (que se expresa selectivamente por sarcomas sinoviales como resultado de t(X; 18)(p11; q11) (translocación cromosómica); así como los así llamados “antígenos asociados a tumor compartidos” (antígenos que se sobreexpresan por células malignas pero también se producen en cantidades normales por uno de varios tejidos sanos), incluido el receptor de factor de crecimiento endotelial vascular 1 (VEGFR1) y VEGFR2, survivina, tumor de Wilms 1 (WT1), telomerasa transcriptasa inversa (TERT), y p53. Estas proteínas por lo tanto son proteínas que comprenden antígeno adecuadas en el contexto del tumor. Un resumen adicional en las vacunas de péptido en el cáncer es Yamada et al., Cancer Sci, 2013, 104(1): 15-21.

En caso de inducir una respuesta inmunitaria citotóxica celular en un paciente con tumor o un paciente que se trata profilácticamente con respecto a un tumor, se puede utilizar una proteína comprendida de antígeno adecuado implicada en la enfermedad tumoral. Estas proteínas son conocidas en la técnica. Como se describe, por ejemplo, en Tacken and Figdor (Tacken P.J., Figdor C.G.; Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: Steps towards cost effective vaccines. Semin. Immunol., 2011, 23(1):12-20), los antígenos tumorales ideales son aquellos conocidos como antígenos específicos de tumor compartidos debido a que se expresan selectivamente en las células tumorales, de varios histotipos, y no en los tejidos normales que expresan MHC. Ejemplos de este tipo de antígenos son los antígenos MAGE-A o NY-ESO-1. Los diversos miembros en esta categoría de antígenos se expresan en proporciones variables dependiendo del tipo de tumor y la etapa de la enfermedad. De esta manera, las vacunas basadas en esos antígenos requieren la selección de pacientes que llevan tumores que expresan el antígeno diana. Otra categoría de antígenos tumorales que se consideran valiosos para el desarrollo de vacunas son aquellos derivados de proteínas oncogénicas que se sobreexpresan en los tumores. Los antígenos tumorales no propios de buena fe se derivan de dos fuentes principales: antígenos virales en el caso de tumores de origen viral oncogénico tal como carcinomas cervicales provocados por la infección de HPV, y mutaciones somáticas.

En caso de inducir una respuesta inmunitaria citotóxica celular en un paciente que padece de una infección o un paciente que se trata profilácticamente con respecto a una enfermedad infecciosa (o infección), proteínas comprendidas de antígeno adecuadas de un patógeno se pueden utilizar, en particular un patógeno seleccionado de malaria, tuberculosis, leishmania o un virus en particular un virus seleccionado de ortomixovirus, virus de influenza, virus de hepatitis A, virus de hepatitis B, virus de hepatitis C crónico, un lentivirus, en particular Virus HI, citomegalovirus, un virus de herpes, un virus de papiloma, un bunyavirus, un calicivirus, un filovirus, un flavivirus, o un virus respiratorio. En una modalidad aún más preferida, una proteína comprendida de antígeno es una proteína de un virus seleccionado de un virus de hepatitis C, un virus de papiloma, un paramixovirus, o un virus respiratorio.

Los virus, en particular virus ARN, muestran habitualmente una velocidad de mutación alta. Sin embargo, existen regiones habitualmente conservadas encontradas en particular en los segmentos genómicos que codifican las proteínas no estructurales y/o internas, estas regiones que codifican una polimerasa viral o una nucleoproteína. Estas regiones no son adecuadas para tecnologías de vacunación clásicas, ya que estas proteínas conservadas no se exponen a la superficie de recubrimiento viral. En contrate, estas proteínas comprendidas de antígeno y/o comprendidas de antígeno en la proteína se pueden utilizar en el medicamento para el uso.

En una modalidad preferida, la proteína comprendida de antígeno y/o el antígeno comprendido en la proteína de un virus se conserva.

En una modalidad adicional aún preferida, la proteína comprendida de antígeno es una proteína no estructural y/o el antígeno está comprendido en una proteína no estructural y/o interna.

En una modalidad aún preferida, la proteína comprendida de antígeno es una proteína de un virus de ARN.

Una proteína “no estructural” o “interna” es una proteína que no es parte del recubrimiento o envoltura de una partícula de virus.

En una divulgación adicional, el antígeno está comprendido en la proteína en el paso i) que es inmunodominante. Inmunodominante significa que aunque muchos complejos de pMHC son disponibles para un cierto patógeno, las respuestas de células T se enfocan reproduciblemente en uno o pocos antígenos claves, y tal que el antígeno es uno de los antígenos claves.

Las proteínas y antígenos comprendidos de antígeno adecuados de virus de influenza A se describen por ejemplo por Wu et al. (PNAS, 2011, 108(22): 9178-9183), y abarcan NP (nucleoproteína), polimerasa 1 básica y M1.

El paso ii) se refiere al administrar al paciente un reactivador seleccionado del grupo que consiste de (d) interleucina 2 formada en complejo (Il-2cx), (e) una célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y un segundo adyuvante, y (f) una combinación de (d) y (e), en donde el péptido se deriva de la proteína que comprende antígeno como se define en el paso i), reactivando de esta manera la célula T activada en el paso i).

En una divulgación, en el caso de (e), la célula y el segundo adyuvante se administran en un marco de tiempo o de 0 h a 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

En una divulgación, en el caso de (e), la célula y el segundo adyuvante se administran solo una vez en un marco de tiempo o de 0 h a 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

En una divulgación, en el caso de (e), la célula y el segundo adyuvante se administran en un marco de tiempo de 48 h a 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

Por ejemplo, la célula y el segundo adyuvante se administran 48 h, 72 h, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

En una divulgación adicional, en el caso de (e), la célula y el segundo adyuvante se administran en un marco de tiempo de 3 días a 9 días, aún de manera más preferente de 4 días a 8 días, por ejemplo 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

En otra divulgación, en el caso de (e), la célula y el segundo adyuvante se administran solo una vez en un marco de tiempo de 0 h a 14 días, de manera preferente en un marco de tiempo de 48 h a 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

Por ejemplo, la célula y el segundo adyuvante se administran solo una vez 48 h, 72 h, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

En una divulgación adicional. en el caso de (e), la célula y el segundo adyuvante se administran solo una vez en un marco de tiempo de 3 días a 9 días, aún de manera más preferente de 4 días a 8 días, por ejemplo 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

En el caso de (d), la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra en un marco de tiempo de 0 h a 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

En el caso de (d), la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra de manera preferente repetidamente después de la administración del sistema de suministro del paso i) en un marco de tiempo de 0 h a 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i). Es posible además, que la administración adicional de la IL-2 formada en complejo se lleve a cabo después de 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i); sin embargo, al menos una administración se lleva a cabo en un marco de tiempo de 0 h a 14 días.

En una divulgación adicional, en el caso de (d), la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra de manera preferente en un marco de tiempo de 48 h a 9 días, aún de manera más preferente de 3 días a 8 días, por ejemplo 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

En todavía una divulgación adicional, en el caso de (d), la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra de manera preferente repetidamente en un marco de tiempo de 48 h a 9 días, aún de manera más preferente de 3 días a 8 días, por ejemplo 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i). De esta manera, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra de manera preferente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces en un marco de tiempo de 48 h a 9 días, aún de manera más preferente de 3 días a 8 días, por ejemplo 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i). Por ejemplo, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se puede administrar diario o cada dos días. Por ejemplo, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se puede administrar 48 h, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días y 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i). En otro ejemplo, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se puede administrar 48 h, 4 días, 6 días y 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

Es posible además, que la administración adicional de la IL-2 formada en complejo se lleve a cabo después del tiempo indicado de por ejemplo 14 días, de manera preferente 9 u 8 días, después de la administración del sistema de suministro del paso i); sin embargo, al menos una administración está en el marco de tiempo indicado.

En el caso de (f), una combinación de interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) y una célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y un segundo adyuvante se administra. En una divulgación preferida, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se puede administrar antes, concomitantemente, o después de la administración de la célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y un segundo adyuvante. De manera preferente, la célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y un segundo adyuvante se administran solamente una vez, y la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra repetidamente en un marco de tiempo de 0 h a 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i). En una modalidad preferida, la ⁱL-2 formada en complejo se puede administrar tanto antes, concomitantemente y/o después de la administración de la célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y una segundo adyuvante.

Para la alternativa (f), las misma divulgación preferida para la a administración de IL-2 formada en complejo y célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y un segundo adyuvante, respectivamente, aplican para las alternativas (e) y (f).

En una divulgación, en el caso de (f), la célula y el segundo adyuvante se administran solo una vez en un marco de tiempo de 0 h a 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

En una divulgación preferida, en el caso de (f), la célula y el segundo adyuvante se administran en un marco de tiempo de 48 h a 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

Por ejemplo, en el caso de (f), la célula y el segundo adyuvante se administran 48 h, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

En una divulgación más preferida, en el caso de (f), la célula y el segundo adyuvante se administran en un marco de tiempo de 3 días a 9 días, aún de manera más preferente de 4 días a 8 días, por ejemplo 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

En otra divulgación preferida, en el caso de (f), la célula y el segundo adyuvante se administran solo una vez en un marco de tiempo de 0 h a 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

Por ejemplo, la célula y el segundo adyuvante se administran solo una vez 48 h, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

En una divulgación adicional preferida, en el caso de (f), la célula y el segundo adyuvante se administran solo una vez en un marco de tiempo de 3 días a 9 días, aún de manera más preferente de 4 días a 8 días, por ejemplo 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de la administración del sistema de entrega del paso i).

En el caso de (f), la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra de manera preferente repetidamente después de la administración del sistema de suministro del paso i) en un marco de tiempo de 0 h a 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i). Es posible además, que la administración adicional de la IL-2 formada en complejo se lleve a cabo después de 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i); sin embargo, al menos una administración está en un marco de tiempo de 0 h a 14 días.

En una divulgación adicional preferida, en el caso de (f), la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra de manera preferente en un marco de tiempo de 48 h a 9 días, aún de manera más preferente de 3 días a 8 días, por ejemplo 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

En una divulgación aún adicional preferida , en el caso de (f), la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra de manera preferente repetidamente en un marco de tiempo de 48 h a 9 días, incluso de manera más preferente de 3 días a 8 días, por ejemplo 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i). De esta manera, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra de manera preferente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces en un marco de tiempo de 48 h a 9 días, aún de manera más preferente de 3 días a 8 días, por ejemplo 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i). Por ejemplo, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se puede administrar diario o cada dos días. Por ejemplo, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se puede administrar 48 h, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días y 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i). En otro ejemplo, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se puede administrar 48 h, 4 días, 6 días y 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

Es posible además, que la administración adicional de IL-2 formada en complejo se lleve a cabo después del tiempo indicado de, por ejemplo, 14 días, de manera preferente 9 u 8 días, después de la administración del sistema de suministro del paso i); sin embargo, al menos una administración está en el marco de tiempo indicado.

Por lo tanto, en una divulgación preferida adicional, en el caso de (f),

(A) la célula y el segundo adyuvante se administran en un marco de tiempo de 0 h a 14 días, de manera preferente de 48 h a 14 días, de manera más preferente en un marco de tiempo de 3 días a 9 días, aún de manera más preferente de 4 días a 8 días, por ejemplo 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i), aún de manera más preferente solo una vez en un marco de tiempo de 48 h a 14 días, de manera más particular solo una vez en un marco de tiempo de 3 días a 9 días, aún de manera más particular solo una vez en un marco de tiempo de 4 días a 8 días, por ejemplo 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después la administración del sistema de suministro del paso i), y

(B) la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra en un marco de tiempo de 0 h a 14 días, de manera más preferente de 48 ha 9 días, aún de manera más preferente de 3 días a 8 días, por ejemplo 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i), de manera mucho más preferente se administran repetidamente en un marco de tiempo de 0 h a 14 días, de manera más preferente de 48 ha 9 días, aún de manera más preferente de 3 días a 8 días, por ejemplo 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

Es posible además, que la administración adicional de la IL-2 formada en complejo se lleve a cabo después de 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i); sin embargo, al menos una administración está en un marco de tiempo de 0 h a 14 días.

En una divulgación aún preferida adicional, en el caso de (f), la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra de manera preferente repetidamente en un marco de tiempo de 48 h a 9 días, aún de manera más preferente de 3 días a 8 días, por ejemplo 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i). De esta manera, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra de manera preferente 1 , 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces en un marco de tiempo de 48 h a 9 días, aún de manera más preferente de 3 días a 8 días, por ejemplo 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i). Por ejemplo, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se puede administrar diario o cada dos días. Por ejemplo, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se puede administrar 48 h, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días y 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i). En otro ejemplo, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se puede administrar 48 h, 4 días, 6 días y 8 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

Es posible además, que la administración adicional de la IL-2 formada en complejo se lleve a cabo después del tiempo indicado de, por ejemplo, 14 días, de manera preferente 9 u 8 días, después de la administración del sistema de suministro del paso i); sin embargo, al menos una administración está en el marco de tiempo indicado.

La célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y el segundo adyuvante se administran de manera preferente como una sola preparación farmacéutica. Esta preparación farmacéutica es de manera preferente un líquido que puede contener además excipientes aceptables farmacéuticos como compuestos amortiguadores. De manera preferente, esta preparación farmacéutica se esteriliza de manera preferente.

En una divulgación preferente del medicamento para el uso,

(x) la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra repetidamente, en particular 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 veces, aún de manera más preferente en donde la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra cada 1 o 2 días, y/o se administra repetidamente durante 5 días a 1 mes, aún de manera más preferente 1 a 2 semanas, y/o

(xx) el péptido derivado de la proteína que comprende antígeno tiene una longitud de 8, 9 o 10 aminoácidos y/o es un péptido presentado por un MHC-I, de manera preferente por el alelo HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-B7, HLA-B35, HLA-A24 o HLA-A30, de manera más preferente por el alelo HLA-A2.

En una divulgación preferida, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra repetidamente, en particular 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 veces, aún de manera más preferente en donde la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra cada 1 o 2 días, y/o se administra repetidamente durante 5 días a 1 mes. Por lo tanto, es posible, como se describe en lo anterior, que la o las administraciones adicionales de la IL-2 formada en complejo se lleve a cabo después del marco de tiempo de 14 días, o 9 u 8 días.

Como se describe en lo anterior, una célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC I) cargada con péptido y un segundo adyuvante se administran de manera preferente como reactivador en el paso ii) de los medicamentos para el uso. Por otra parte, el péptido se deriva de la proteína que comprende antígeno como se define en el paso i) “el péptido se deriva de la proteína que comprende el antígeno” se entiende como que la secuencia del péptido es parte de la secuencia de proteína que comprende antígeno (es decir, es una subsecuencia de la secuencia de proteínas que comprende antígenos).

Una “célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC I) cargada con péptido” se entiende como una célula que presenta péptidos deseados sobre la superficie de las células por la unión a MHC-I.

En una modalidad, la carga se puede lograr por carga in vitro de moléculas MHC I con los péptidos como se describe internamente en los ejemplos. Alternativamente, las células se pueden alimentar in vitro con la proteína que comprende antígeno entero, permitiendo que las células procesen el antígeno y presenten los péptidos antigénicos en el contexto de MHC I, o que se expongan in vitro a sistemas virales capaces de infectar las células que dan por resultado la expresión de altas cantidades de péptido en el contexto de MHC I, o las células portadoras de MHC I que se pueden transfectar con los vectores de expresión que codifican una secuencia de proteínas o péptidos dada, nuevamente dando por resultado una presentación eficiente de péptidos en el contexto de m Hc I.

Los métodos para determinar un péptido para la carga de células en el contexto de MHC-I son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos descritos en Wu et al. (PNAS, 2011, 108 (22):9178-9183) se pueden utilizar.

En el caso de aplicar péptidos definidos para cargar, por ejemplo, al cargar externamente las células in vitro, la secuencia de péptidos se puede elegir por los métodos conocidos en la técnica. Las células que se cargan externamente in vitro se pueden llevar a cabo por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo al proporcionar una solución acuosa de los péptidos, agregando solución a las células, que están de manera preferente en una solución o medio amortiguado, incubar las células con el péptido para lograr una alta saturación del MHC-I y/o MHC-II con el péptido respectivo, y opcionalmente lavar las células, por ejemplo, con una solución acuosa.

En una modalidad preferente, las células se cargan in vitro con un péptido que tiene una secuencia que es una subsecuencia de la proteína que comprende antígeno. Por ejemplo, una solución acuosa que comprende uno de estos péptidos se puede agregar in vitro a una población células, que es de manera preferente una población de células del paciente.

Alternativamente, una mezcla de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más poblaciones de células diferentes se pueden utilizar en la célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido en el paso ii), en donde las células se cargan con diferentes péptidos, y en donde las células son de manera preferente células del paciente.

Esta mezcla de células se puede obtener al incubar una población de células, como las células PBMC, con una mezcla de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más péptidos diferentes, obteniendo de esta manera células cargadas con diferentes péptidos en el contexto de MHC-I. Alternativamente, las poblaciones de células separadas, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más poblaciones de células, se pueden incubar in vitro con diferentes péptidos, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más péptidos diferentes. De esta manera, las poblaciones de células presentadoras de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC I) separadas, cargadas cada una con un péptido diferente se obtienen de esta manera. Las diferentes poblaciones de células presentadoras de complejo mayor de histocompatibilidad cargadas con péptidos de clase I (MHC I) se pueden administrar separadamente en el paso ii), o una mezcla de las diferentes poblaciones de células presentadoras de complejo mayor de histocompatibilidad de células cargadas de péptidos clase I (MHC I) se pueden preparar, las cuales luego se pueden administrar en el paso ii).

En un caso diferente se emplean péptidos, en particular si 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más péptidos diferentes se emplean, estos péptidos se pueden derivar de la misma o diferente proteína que comprende antígeno. En una modalidad preferente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más péptidos diferentes derivados de un antígeno tumoral se pueden utilizar. Esto significa que la secuencia de cada péptido es una subsecuencia del antígeno tumoral. Las secuencias de estos péptidos diferentes se pueden traslapar o no traslapar. En una modalidad adicional, se pueden utilizar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más péptidos diferentes derivados de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más antígenos tumorales diferentes. En esta modalidad, los antígenos tumorales diferentes se relacionan con el mismo o diferente tumor, de manera preferente al mismo tumor.

De manera preferente, se elige una secuencia de péptidos de una longitud de 8, 9 o 10 aminoácidos, ya que los péptidos presentados por MHC-I son habitualmente de esta longitud.

Como se describe además en Wu et al., los alelos HLA son extremadamente polimórficos. Por lo tanto, el péptido cargado es de manera preferente un péptido presentado por alelos HLA frecuentes. Por lo tanto, es particularmente preferido un péptido que presentó el alelo más frecuente HLA-A2. Alternativamente, los péptidos presentados por HLA-A1, -A3, -B7, -B35, que son los alelos relevantes para individuos de origen caucásico pueden ser utilizados. HLA-A24 se puede utilizar para individuos asiáticos y HLA-A30 para individuos africanos

Se describen varios péptidos relacionados con tumores adecuados en Speiser y Romero (Seminars in Immunology 22 (2010) 144-154) y las referencias de la misma. La mayoría de ellos son HLA-A2 restringidos, por ejemplo, péptidos derivados de Melan-A/MART-1, uno de los epítopos gp100 y tirosinasa para los antígenos de diferenciación de melanocitos; antígeno de superficie de próstata y PSAP para próstata; antígeno carcinoembriónico y MUC-1 para tumores de la mucosa; HER-2/neu para carcinoma de mama; G250 para carcinoma de células renales; p R1 compartido por dos antígenos asociados a leucemia mieloide, PR3 y neutrófilo elastasa, que se expresan normalmente en los granulocitos y se sobreexpresan en las células de leucemia mieloide; los antígenos específicos de tumor compartidos MAGE-A y NY-ESO-1 para varios tipos de tumor; y las proteínas sobre-expresadas survivina y telomerasa. Los péptidos derivados de influenza A adecuados se describen por Wu et al (supra).

Por consiguiente, en una modalidad adicional, el péptido derivado de la proteína que comprende antígeno es un péptido presentado por un MHC-I, de manera preferente por el alelo HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-B7, HLA-B35, HLA-A24, o HLA-A30, de manera más preferente por el alelo HLA-A2. Los métodos para identificar estos péptidos se describen y se resumen por Wu et al. (supra). Por ejemplo, el procedimiento de identificación sistemático de Wu et al. (supra) se puede utilizar, o los algoritmos adecuados descritos en la presente.

Por consiguiente, en una modalidad adicional, el péptido derivado de la proteína que comprende antígeno tiene una longitud de 8, 9 o 10 aminoácidos y es un péptido presentado por un MHC-I, de manera preferente por el alelo HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-B7, HLA-B35, HLA-A24 o HLA-A30, de manera más preferente por el alelo HLA-A2.

En una divulgación preferida adicional del medicamento para el uso, el receptor sobre la superficie de una célula dendrítica es un receptor sobre la superficie de las células dendríticas de presentación cruzada.

Las células dendríticas de presentación cruzada son particularmente adecuadas para presentar péptidos en el contexto de MHC-I. Una DC de presentación cruzada es capaz de captar una proteína soluble o diana, procesarla y presentarla en el contexto de MHC-I. Todas las DC convencionales son capaces de presentación cruzada de antígeno. La presentación cruzada de antígeno cuantitativamente óptima se hace por XCR1 DC en el ratón y por XCR1 DC dentro de la población BDCA3+ DC en el humano. Por lo tanto, por XCR1+ DC se prefieren DC de presentación cruzada murina, y XCR1+ DC dentro de una población de BDCA3+ DC se prefieren la DC de presentación cruzada humana.

En una divulgación preferida adicional del medicamento para el uso, el receptor sobre la superficie de una célula dendrítica es el receptor de quimiocina 1 (motivo C) (XCR1), molécula 2 similar a nectina, lectina tipo c (CLEC) tal como como CLEC9A. Las lectinas tipo C son proteínas de unión a glicano dependientes de Ca++ que comparten homología estructural y primaria y secundaria en sus dominios de reconocimiento de carbohidratos (CRD). Estas proteínas tienen un plegamiento de lectina tipo C, que es un plegamiento con una secuencia de proteínas altamente variable que también está presente en muchas proteínas que no unen carbohidratos.

La secuencia del receptor humano CLEC9A es por ejemplo, se describe por Caminschi et al., 2008, Blood 112, 3264 3273. Una molécula adecuada que se une a CLEC9A es por ejemplo un anticuerpo anti-CLEC9A monoclonal específico.

La molécula 2 similar a nectina de receptor humano se describe por Takai et al., 2003, Cancer Sci 94, 655-667. Una molécula adecuada que se une a la molécula 2 similar a nectina es por ejemplo un anticuerpo monoclonal de molécula 2 similar a anti-nectina específico.

El sistema de suministro es particularmente adecuado para influir en la respuesta Th1, y opcionalmente también en la respuesta Th2, en el sistema inmunitario. XCR1 es un receptor de quimiocina y hasta ahora el único miembro de la subfamilia “C” de receptores de quimiocina. También es conocido como GPR5 o CCXCR1. GPR5, clonado previamente como un receptor acoplado a proteína G huérfana, ha sido reconocido primero en el humano y luego en el ratón como un receptor monoespecífico para XCL1 y fue por consiguiente referido como XCR1.

El ligando natural de XCR1 es XCL1, que también es conocido como ATAC, linfotactina o SCM-1. Es el único miembro de la familia C de quimiocinas. La citocina (ATAC) inducida por activación, derivada por células T, y relacionada con quimiocina se clonó en el humano (Muller et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25, 1744-48), e independientemente como linfotactina (Kelner et al. al., 1994, Science 266, 1395-99) en el ratón y SCM-1 (Yoshida et al., 1995, FEBS Lett. 360, 155 9) en el humano. De acuerdo con la nomenclatura en las quimiocinas, ATAC/linfotactina/SCM-1 ahora es designada “XCL1”. XCL1 se secreta principalmente por las células T CD8+ activadas, la células T Th1 CD4+ y por las células NK. En el humano, una variante de XCL1 designada XCL2 se ha descrito en la cual los aminoácidos aspartato y lisina en la posición 28 y 29 de la proteína de longitud completa se intercambian por histidina y arginina, respectivamente (Yoshida et al., 1996, FEBS Lett. 395, 82-8), que también se pueden utilizar. Un método ejemplar para producir XCL1 en forma biológicamente activa se describe en el Ejemplo 8 de WO 2009/065561. Se pueden utilizar métodos análogos a fin de producir otras formas biológicamente activas de XCL1, por ejemplo aquellas de otras especies.

En una modalidad aun mas preferida, el receptor sobre la superficie de una célula dendritica es XCR1.

Es conocida la secuencia de aminoácidos de la XCR1 humana (NCBI; acceso NP_001019815):

MESSGNPEST TFFYYDLQSQ PCENQAWVFA TLATTVLYCL VFLLSLVGNS LVLWVLVKYE SL ESLT N IFI LNLCLSDLVF ACLLPVWISP YHWGWVLGDF LCKLLNMIFS IS L Y SS IF F L TIMT1HRYLS VVSPLSTLRV PTLRCRVLVT MAVWVASILS SILDTIFHKV LSSGCDYSEL TWYLTSVYQH NLFFLLSLGI ILFCYVEILR TLFRSRSKRR HRTVKLIFAI VVAYFLSWGP YNFTLFLQTL FRTQIIRSCE AKQQLEYALL ICRNLAFSHC CFNPVLYVFV GVKFRTHLKH VLRQFWFCRL QAPSPASIPH SPGAFAYEGA SFY

(SEQ ID NO: 12)

En una divulgación preferida adicional del medicamento para el uso, la molécula de a) es un ligando al receptor o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra el receptor. En una divulgación aún más preferida, el receptor es el receptor 1 de quimiocina (motivo C) (XCR1) y la molécula de a) es el anticuerpo anti-XCR1 o fragmento del mismo o ligando 1 de quimiocina (motivo C) (XCL1) o una variante funcionalmente activa del mismo, que comprende o que consiste particularmente de la secuencia de cualquiera de SEQ ID NOs: 7 a 10, de manera preferente, de SEQ ID NOs: 8 a 10, de manera más preferente de SEQ ID NOs: 9 o 10, especialmente de la SEQ D NO: 10.

Las secuencias de aminoácidos de XCL1 (ATAC) de varias especies (incluidas humanas: SEQ ID NO: 1, acceso de GenBank P47992; ratón: SEQ ID NO: 2, acceso de GenBank P47993; y rata SEQ ID NO: 3, acceso de GenBank P51672) son conocidas y se conocen como SEQ ID NO: 1 a 3 (ver lo siguiente). Adicionalmente, un agonista de XCLR1 específico referido como un K4.1 HHV8 (SEQ ID NO: 4, acceso de GenBank AAB62672.1) (ver lo siguiente), que es una proteína similar a quimiocina viral también es conocida. Cualquiera de estos ligandos XCR1 de origen natural o cualquier otro ligando XCR1 de origen natural se puede utilizar.

Alternativamente, se puede utilizar una variante funcionalmente activa de cualquier XCL1 de origen natural. El término variante abarca fragmentos, variantes derivadas por una o más adiciones de aminoácidos, deleciones y/o sustituciones y moléculas, particularmente proteínas, que comprenden cualquier XCL1 de origen natural o parte del mismo tal como proteínas de fusión. La porción XCL1 de la proteína de fusión se puede flanquear por el o los residuos de aminoácidos en C-terminales, N-terminales, o C- y N-terminales.

El fragmento funcionalmente activo se caracteriza por ser derivado de cualquier ligando XCR1 de origen natural, particularmente XCL1, especialmente aquellos de SEQ ID NO: 1 a 4, por una o más deleciones de aminoácidos. La o las deleciones pueden ser C-terminales, N-terminales y/o internos. De manera preferente, el fragmento se obtiene como máximo por 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 60, de manera más preferente como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 15, 20, 25 o 30, aún de manera más preferente como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15, aún de manera más preferente como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, de manera más preferente 1,2, 3, 4 o 5 deleciones de aminoácidos. El fragmento funcionalmente activo se caracteriza por tener una actividad biológica similar a aquella mostrada por el ligando del cual se deriva, incluida la capacidad para unirse a XCR1 y mediar en la internalización de una proteína de (b). El fragmento del ligando XCR1 de origen natural, particularmente XCL1, especialmente a aquellos de SEQ ID NO: 1 a 4, es funcionalmente activo en el contexto de la presente divulgación, si la actividad (unión así como la internalización) del fragmento equivale al menos 10%, de manera preferente al menos 25%, de manera más preferente al menos 50%, aún de manera más preferente al menos 70%, aún de manera más preferente al menos 80%, especialmente al menos 90%, particularmente al menos 95%, de manera mucho más preferente al menos 99% de la actividad del XCL1 sin la alteración de secuencia. Estos fragmentos se pueden diseñar u obtener en cualquier longitud deseada, incluido tan pequeño como aproximadamente 18 a 50 aminoácidos en longitud.

El fragmento funcionalmente activo del ligando XCR1 de origen natural, particularmente XCL1, especialmente aquellos de SEQ ID NO: 1 a 4, también se pueden caracterizar por otras características estructurales. Por consiguiente, en una divulgación preferida, los fragmentos funcionalmente activos consisten de al menos 60%, de manera preferente divulgación al menos 70%, de manera más preferente al menos 80%, aún de manera más preferente al menos 90%, aún de manera más preferente al menos 95%, de manera mucho más preferente 99% de los aminoácidos del ligando XCR1 de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 4. El fragmento activo funcional como se define en lo anterior puede derivar del péptido por una o más deleciones de aminoácidos. Las deleciones pueden ser C-terminal, N-terminal y/o internas. La alineación de secuencia anterior de las SEQ ID NO: 1 a 4 muestra los dominios de los ligandos de origen natural que parecen que se conservan. En una divulgación preferida, estos dominios se deben mantener en el fragmento.

Los dominios conservados incluyen aquellos aminoácidos de la N-terminal procesada (la N-terminal procesada que comienza con el aminoácido 22 de la N-terminal no procesada) para SEQ ID NO: 1 a 3 y con el aminoácido 27 para SEQ ID NO. 4) en las posiciones 1-2 (V/S G), 13-27 (S/N L X T/S Q/A R L P V/P X K/R I/L K/I X T/G X Y, X = cualquiera o ningún aminoácido; SEQ ID NO: 5), 35 a 51 (R/K A V I F I/V T K/H R/S G L/R K/R I/V C A/G D/S P; SEQ ID NO: 6) y un puente de disulfuro entre los residuos de cisteína en las posiciones 11 y 48 (ver también la alineación anterior). Una secuencia consenso para las secuencias de SEQ ID NO: 1 a 4 es XGXXXXXXXXXXCXXXLXXXRLPXXXXXXXXYXXXXXXXXXXAVIFXTXXGXX-XCXXP (SEQ ID NO: 7 ⁾ si solo se consideran los aminoácidos idénticos y (V/S)GX(E/A)(V/T)XXXXXXXC(V/E)X(S/N)LX(T/S)(Q/A) RLP(V/P)X(K/R)(I/L)(K/I)-X(T/G)XYX(I/T)X(E/T)(G/V)XXXX(R/K) AVIF(V/I)T(K/H)(R/S)G(L/R)(K/R)XC(A/G)-(D/S)P (SEQ ID NO: 8) si los aminoácidos idénticos y la mayoría de aminoácidos (es decir, aminoácidos que están presentes en 3 de las 4 secuencias, el aminoácido alternativo se lista después de diagonal) se consideran. Una secuencia consenso para las secuencias de SEQ ID NO: 1 a 3 es VGXEVXXXXXCVXLXTQRLPVXXIK-TYXIXEGXXRAVIFXTKRGLXXCADPXAXWVXXXXXXXDXXXXXXXXXXXTXPTXXQXSXXTAXT-LTG (SEQ ID NO: 9) si se consideran los aminoácidos idénticos VG(T/S)EV-(L/S)X(E/K)(S/R)XCV-(S/N)LXTQRLPV(Q/S) (K/R)IKTY(T/I)IXEG(A/S)(M/L)RAVIF(V/I)TKRGL(K/R)(I/V)-CADP (Q/E)A(K/T)WV(K/R)X(A/V)(I/V)(K/R)(T/S)(V/M)D(G/R)(R/K)(A/S) (S/N)(T/A)-(R/S)(K/N)(N/S)(M/K)(A/I)(E/Q)TXPT(G/Q)(A/T)Q(R/Q) S(T/A)(S/N)TA(V/I)TLTG (SEQ ID NO: 10) si se consideran los aminoácidos idénticos y la mayoría de aminoácidos (es decir, los aminoácidos que están presentes en 2 de las 3 secuencias, el aminoácido alternativo se lista después de la diagonal).

Por consiguiente, en un sistema de suministro preferido para el uso, la variante funcionalmente activa, de manera preferente el fragmento funcionalmente activo, de XCL1 comprende o consiste de la secuencia de cualquiera de SEQ ID NOs: 7 a 10, de manera preferente de SEQ ID NOs: 8 a 10, de manera más preferente de SEQ ID NOs: 9 o 10, especialmente de SEQ ID No : 10.

En una divulgación preferida adicional, se utiliza una variante XCL1 como se define en lo anterior, en donde el ligando XCR1 es una variante funcionalmente activa de un ligando XCR1 de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 4 y en donde la variante tiene al menos 50% de identidad de secuencia al ligando XCR1 de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 4. En una divulgación más preferida, la variante funcionalmente activa tiene una identidad de secuencia de al menos 60%, de manera preferente al menos 70%, de manera más preferente al menos 80%, aún de manera más preferente al menos 90%, aún de manera más preferente al menos 95%, de manera mucho más preferente 99% al antígeno de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 4.

El porcentaje de la identidad de secuencia se puede determinar por ejemplo por la alineación de secuencia. Son bien conocidos en la técnica métodos de alineación de las secuencias para comparación. Se han descrito varios programas y algoritmos de alineación por ejemplo, en Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981 o Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444-2448, 1988.

La Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica NCBI (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990) está disponible de varias fuentes, incluido el Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI, Bethesda, MD) y en el Internet, para el uso en relación con los programas de análisis de secuencia blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Las variantes de un antígeno de cualquiera de las secuencias de SEQ ID NOS: 1 a 4 se caracterizan habitualmente utilizando el NCBI Blast 2.0, gapped establecido para parámetros predeterminados. Para las comparaciones de las secuencias de aminoácidos de al menos 35 aminoácidos, se emplea la función de las secuencias Blast 2 utilizando la matriz BLOSUM62 predeterminada establecida para parámetros predeterminados (costo de la existencia del hueco de 11, y un costo de hueco por residuo de 1). Cuando se alinean los péptidos cortos (poco menos de aproximadamente 35 aminoácidos), la alineación se lleva a cabo utilizando la función de las secuencias Blast 2, que emplean la matriz PAM30 que se establece para parámetros predeterminados (hueco abierto 9, penalizaciones del hueco de extensión 1). Los métodos para determinar la identidad de secuencia sobre estas ventanas cortas tal como 15 aminoácidos o menos se describen en el sitio de la red que es mantenido por el Centro Nacional para Información de Biotecnología en Bethesda, Maryland (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Alternativamente, la alineación de múltiples secuencias se puede llevar a cabo utilizando el Software MegAlign de DNAStar (Madison, WI, USA) que emplea el algoritmo de alineación ClustalV (Higgins et al., 1992, Comput. Appl. Biosci.

8, 189-91). En la alineación anterior este software se utilizó y se estableció a los siguientes parámetros predeterminados: penalización de hueco 10, penalización de longitud del hueco 10. Debido a la homología muy baja, fueron necesarios ajustes manuales para la inclusión de SEQ ID NO 4 en la alineación.

Se obtiene la variante activa funcional por las alteraciones de secuencia en el ligando XCR1 de origen natural, en donde el ligando XCR1 con las alteraciones de secuencia retiene una función del ligando XCR1 no alterado, por ejemplo, que tiene una actividad biológica similar aquella mostrada por el ligando XCR1 de origen natural, incluida la capacidad de unirse a XCR1 y mediar la internalización de una proteína de (b) en el paso i). Estas alteraciones de secuencia pueden incluir, pero no se limitan a, sustituciones, deleciones, mutaciones e inserciones conservadoras. Estas características de la variante activa funcional se pueden evaluar por ejemplo, como se detalla en lo anterior.

En una divulgación aún más preferida la variante funcionalmente activa de XCL1 para el uso se deriva del ligando XCR1 de origen natural de cualquiera de las secuencias de SEQ ID NOS: 1 a 4 por sustituciones conservadoras. Las sustituciones conservadoras son aquellas que se llevan a cabo dentro de una familia de aminoácidos que se relacionan en sus cadenas laterales y propiedades químicas. Ejemplos de estas familias son aminoácidos con cadenas laterales básicas, con cadenas laterales ácidas, con cadenas laterales alifáticas no polares, con cadenas laterales aromáticas no polares, con cadenas laterales polares no cargadas, con cadenas laterales pequeñas, con cadenas laterales grandes etcétera. En una divulgación, una sustitución conservadora se incluye en el péptido. En otra divulgación, dos sustituciones conservadoras o menos se incluyen en el péptido. En una divulgación adicional, tres sustituciones conservadoras o menos se incluyen en el péptido.

Ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen, pero no se limitan a, aquellas listadas a continuación:

Residuo original_______ Sustituciones conservadoras

Ala Ser

Arg Lys

Asn Gln; His

Asp Glu

Cys Ser

Gln Asn

Glu Asp

His Asn; Gln

lie Leu, Val

Leu lie; Val

Lys Arg; Gln; Asn

Met Leu; lie

Phe Met; Leu; Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp; Phe

Val lie; Leu

Un anticuerpo anti-XCR1 monoclonal adecuado para el uso de acuerdo es por ejemplo mAb 6F8 divulgado en WO 2009/065561 o MARX10 (Bachem et al., 2012, Front Immunol 3, 214).

Un anticuerpo anti-XCR1 o fragmento funcionalmente activo del mismo puede utilizar en una divulgación preferida como una molécula que se une a XCR1 como receptor en el paso i). Un anticuerpo anti-XCR1 o fragmento funcionalmente activo del mismo es capaz de unirse específicamente al XCR1. El fragmento funcionalmente activo del anticuerpo se define análogamente al fragmento funcionalmente activo de XCL1 (ver lo anterior), es decir el fragmento funcionalmente activo (a) se caracteriza por ser derivado de cualquier anticuerpo anti-XCR1 por una o más deleciones de aminoácidos, tal como deleciones C-terminales, N-terminales y/o internas y (b) se caracteriza por tener una actividad biológica similar aquella mostrada por el anticuerpo anti-XCR1 del cual se deriva, incluida la capacidad de unirse a XCL1. Los anticuerpos de origen natural son proteínas utilizadas por el sistema inmunitario para identificar y neutralizar objetos extraños. Cada anticuerpo de origen natural tiene dos cadenas pesadas grandes y dos cadenas ligeras pequeñas y se pueden unir a un antígeno diferente. La presente divulgación incluye, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales y policlonales, quiméricos, de cadena individual; y anticuerpos humanizados, así como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 ', Fv, o el producto de la biblioteca de expresión Fab. El anticuerpo o componente de anticuerpo se puede modificar adicionalmente para prolongar su vida media biológica o de otras formas para hacerlos más adecuados para direccionamiento. Los anticuerpos generados contra XCR1 se pueden obtener por inyección directa de XCR1 o un fragmento del mismo en un animal o al administrar XCR1 o un fragmento del mismo a un animal, de manera preferente un no humano. El anticuerpo obtenido de esta manera luego se unirá a XCR1. Para la preparación de los anticuerpos monoclonales, cualquier técnica conocida en el campo, que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas de células continuas, por ejemplo, una línea de células de hibridoma, se puede utilizar. La producción del anticuerpo monoclonal adecuado también se detalla en WO 2009/065561. Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena individual (Patente de los Estados Unidos No. 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena individual a XCR1. También, los ratones transgénicos u otros organismos tal como otros mamíferos se pueden utilizar para expresar los anticuerpos humanizados a XCR1.

En una divulgación preferida adicional del medicamento para el uso,

-la proteína que comprende antígeno de (b) está en una proteína de fusión con la molécula de a); y/o

-el antígeno de la proteína que comprende antígeno de (b) es un inmunógeno, un antígeno derivado de patógeno o un antígeno tumoral.

Por consiguiente, en una divulgación preferida, la proteína que comprende antígeno de (b) está en una proteína de fusión con la molécula de a). Estas proteínas de fusión se pueden sintetizar por ejemplo, sintética o recombinantemente, de manera preferente recombinantemente. Estas proteínas de fusión permiten el direccionamiento eficiente a las células dendríticas. Por ejemplo, las proteínas de fusión del anticuerpo MARX10 con OVA y XCL1 con OVA se utilizaron exitosamente en los Ejemplos.

Un inmunógeno es un antígeno que estimula una respuesta inmunitaria. Los antígenos son sustancias reconocidas por receptores específicos en las células T (receptor de células T) y células B (receptor de células B) dentro del sistema inmunitario y son usualmente proteínas o polisacáridos. Esto incluye partes (recubrimientos, cápsulas, paredes celulares, flagelos, fimbras y toxinas) de bacterias, virus, y otros microorganismos. En general, los lípidos y ácidos nucleicos son antigénicos solamente cuando se combinan con proteínas y polisacáridos. Los antígenos exógenos no microbianos (no propios) pueden incluir polen, clara de huevo, y proteínas de tejidos trasplantados y órganos o en o sobre la superficie de las células sanguíneas transfundidas.

Los antígenos se pueden categorizar como endógenos o exógenos. Un antígeno preferido de la presente invención es un antígeno exógeno.

En caso de que se utilice un antígeno derivado de patógeno, de manera preferente de un virus, la bacteria y/o parásito eucariota, el medicamento es de manera preferente para el uso en inducir una respuesta inmunitaria citotóxica celular a una infección con este patógeno. En caso de que se utilice un antígeno tumoral, el medicamento es de manera preferente para el uso en inducir una respuesta inmunitaria citotóxica celular a este tumor.

Las células dendríticas pueden presentar antígenos exógenos a través de moléculas MHC clase I, un proceso conocido como “presentación cruzada”.

En el medicamento para el uso, el primer adyuvante de c) y el segundo adyuvante son independientemente un adyuvante que apoya una respuesta mediada por Th-1 y que son una señal de peligro, preferentemente se seleccionan independientemente del grupo que consiste de RIG-I-agonistas sintéticos o recombinantes, ligandos TLR, similar a poli ICLC y resiquimod (R848), Montanidos, como ISA51, ISA720, saponinas como Quil-A, ISCOM, QS-21, AS02 y AS01, ácido poliinosínico:policitidílico (poli I:C), un lipopolisacárido (LPS), y un oligodesoxinucleótido CpG, de manera más preferente seleccionados de un agonista RIG-I, y un ligando TLR, tal como resiquimod (R848), poli ICLC y ácido poliinosínico:policitidílico (poli I:C). Si tanto un primer adyuvante de c) como un segundo adyuvante se utilizan, también pueden ser los mismos o pueden ser diferentes entre sí.

Poli-ICLC consiste de poli-IC estabilizado con poli-L-lisina y carboximetilcelulosa y es potente en soportar una respuesta Th1.

El R848 es un ligando selectivo para TLR7 en los ratones y para TLR7 y TLR8 en humanos y activa el dominio de priina NLR que contiene 3 inflamasomas (NLRP3).

Para Poli-ICLC y R848, se prefiere Tacken y Figdor (supra) y las referencias citadas en la misma.

Los montanidos como ISA51 e ISA720 son emulsiones de agua en aceite que contienen escualeno y manida-monooleato como un emulsionante, como se divulga en Speiser y Romero y referencias citadas en la misma.

Las saponinas como Quil-A, ISCOM, QS-21, AS02 y AS01 son glicósidos de triterpeno aislados de plantas, como se divulga en Speiser y Romero y las referencias citadas en la misma.

Un adyuvante es un agente que modifica el efecto de otros agentes mientras que tiene pocos si los hay efectos directos cuando se administran solos. En la farmacología, los adyuvantes son fármacos que tienen poco o nada de efectos farmacológicos en sí mismo, pero pueden crear la eficacia o potencia de otros fármacos cuando se administran al mismo tiempo. En la inmunología un adyuvante es un agente que mientras que no tengan ningún efecto antigénico específico en sí mismo, puede estimular el sistema inmunitario, incrementando la respuesta a una vacuna. Los adyuvantes utilizados en la presente invención están de manera preferente respaldando una respuesta Th1. Un adyuvante que respalda o induce una respuesta Th1 (o respuesta de células T tipo 1) se entiende como un adyuvante que es capaz de inducir IL-12 en DC, y conduce a la secreción de IL-2, IFN-^yy TNF-a por la respuesta a las células T CD8+ y CD4+ reactivas de antígeno así como la producción de las moléculas citotóxicas granzima B y perforina por las células T CD8+ y CD4+ citotóxicas reactivas a antígeno. Los primeros y segundos adyuvantes preferidos adecuados que respaldan una respuesta Th1 son conocidos en la técnica, y se describen por ejemplo, por Tacken y Figdor, y por Speiser y Romero. (Tacken P.J., Figdor C.G.; Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: Steps towards cost effective vaccines. Semin. Immunol. (2011), doi:10.1016/j.smim.2011.01.001; Speiser D.E. y Romero P., Seminars in Immunology 22 (2010) 144-154).

La célula dendrítica (DC) es capaz de detectar a través de un conjunto grande de receptores de reconocimiento de “señal peligrosa” (por ejemplo, receptores similares a Toll, receptores similar a NOD), donde el antígeno es de naturaleza peligrosa o si es inofensivo. Los patrones reconocidos por los receptores de reconocimiento de “señal peligrosa” (también designados “receptores de reconocimiento de patrones”) son usualmente estructuras moleculares que son únicas para los microorganismos. Éstos pueden ser componentes de pared celular (por ejemplo, lipopolisacárido, peptidoglicano), o modificaciones de ácido nucleico (por ejemplo, motivos de CpG no metilados) en el caso de microbios, o características y modificaciones estructurales que son únicas al ADN viral o ARN viral (por ejemplo, ARN de doble hebra). También las células moribundas de la apoptosis en el cuerpo liberan moléculas que son capaces de activar los receptores de reconocimiento de “señal peligrosa” (por ejemplo, Proteína B1 del Grupo de Alta Movilidad, proteínas de choque térmico). Estas señales peligrosas son preferidas para el primer y segundo adyuvantes de la presente invención.

En una modalidad preferida adicional del medicamento para el uso, el reactivador es una célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y un segundo adyuvante, en donde la célula es una célula mononucleada de sangre periférica (PBMC), de manera preferente en combinación con IL-2cx.

En una modalidad preferida adicional del medicamento para el uso, la célula T es una célula T CD8+ o una célula T CD4+, de manera preferente una célula T CD8+.

En particular, la reactivación de las células T CD8+ es específicamente ventajosa para obtener una respuesta inmunitaria citotóxica fuerte y mejorada.

En una divulgación preferida adicional del medicamento para el uso, el marco de tiempo es de 72 h a 12 días, de 72 h a 9 días, particularmente de 5 días a 8 días, de 5 días a 9 días o de 5 días a 12 días.

En una divulgación, los pasos del método i) y ii) se llevan a cabo solo una vez.

Sin embargo, es posible repetir los pasos del método con el mismo sistema de suministro y el mismo reactivador cuando el sistema inmunitario se ha establecido nuevamente. Esto es habitualmente el caso después de al menos un mes, de manera preferente de al menos dos meses después de inducir una respuesta inmunitaria citotóxica celular como se describe en lo anterior.

Por lo tanto, en otra divulgación, los pasos del método con el mismo sistema de suministro de acuerdo con el paso i) y el mismo reactivador de acuerdo con el paso ii) se repite después de al menos 1, 2, o 3 meses después de llevar a cabo los pasos del método.

Alternativamente, los pasos del método se pueden repetir con un sistema de suministro diferente de acuerdo con el paso i), de manera preferente en donde el sistema de suministro diferente comprende una proteína que comprende antígeno diferente (b) y opcionalmente una unión de la molécula diferente a un receptor sobre la superficie de una célula dendrítica (a). En esta divulgación, no es necesario esperar hasta que el sistema inmunitario se haya asentado nuevamente. El método por lo tanto se puede repetir con un diferente sistema de suministro por ejemplo, 7 o 14 días después de llevar a cabo los pasos del método por primera vez con un primer sistema de suministro. En esta divulgación, el mismo o diferente reactivador se puede utilizar en el paso ii).

Se divulga un medicamento para el uso en un método para extender una respuesta inmunitaria citotóxica celular contra una proteína que comprende el antígeno, el método comprende el paso de:

i) administrar a un paciente que tiene células T activadas contra un antígeno, célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y un segundo adyuvante, en donde el péptido se deriva de la proteína que comprende el antígeno, reactivando de esta manera la célula T activada, y opcionalmente administrar además la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx),

en donde el reactivador del paso i) se administra en un marco de tiempo de 0 h a 14 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

La presente invención se refiere a un medicamento que comprende una célula presentadora del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC-I) cargada con un péptido, que es una célula PBMC, para el uso en un método de ampliación de una respuesta inmunitaria citotóxica celular contra una proteína que contiene un antígeno para tratar profilácticamente o tratar un tumor o una infección, el método que comprende el paso de:

i) administrar a un paciente que tiene células T activadas contra un antígeno una célula presentadora del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC-I) cargada de péptidos, la cual es una célula PBMC, y un adyuvante que soporta una respuesta mediada por Th-1 y que es una señal de peligro, la cual se selecciona del grupo que consta de agonistas RIG- I sintéticos o recombinantes, ligandos TLR, montanidas, saponinas, ácido polinosínico ácido policidílico (poli I:C), un lipopolisacárido (LPS), y un oligodeoxinucleótido de CpG, en donde el péptido se deriva de la proteína que contiene el antígeno, reactivando de esta manera la célula T activada,

en donde el reactivador del paso i) se administra sólo una vez, y se administra en un marco de tiempo de 5 días a 9 días después de que las células T se activaron contra un antígeno, y en donde el reactivador se administra por inyección i.v.

“Respuesta inmunitaria citotóxica celular” se entiende como reacción inmunitaria humoral y celular (citotóxica) tipo Th1 que se puede inducir por un antígeno dado. Esto es contraste a la respuesta de las vacunas clásicas que se dirigen principalmente la ruta de presentación del antígeno Th2 y conducen principalmente a la generación de anticuerpos tipo Th2 (neutralizantes) y reacciones inmunitarias.

Una respuesta inmunitaria citotóxica celular “extendida” se entiende como una respuesta inmunitaria citotóxica celular que se presenta por un tiempo más prolongado comparado con la respuesta inmunitaria citotóxica celular obtenida por un sistema de suministro del paso i) de un medicamento para el uso de la presente invención. Por ejemplo, la respuesta se puede extender por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o más días.

Para esta modalidad, las mismas modalidades y divulgaciones preferidas se aplican, donde sea aplicable, en cuánto a los medicamentos descritos en lo anterior para el uso.

Se divulga que, la célula y el segundo adyuvante se administran en un marco de tiempo de 0 h a 14 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

Se divulga que, la célula y el segundo adyuvante se administran solo una vez en un marco de tiempo de 0 h a 14 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

Se divulga que, la célula y el segundo adyuvante se administran en un marco de tiempo de 48 h a 14 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

Por ejemplo, la célula y el segundo adyuvante se administran 48 h, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

La célula y el segundo adyuvante se administran en un marco de tiempo de 5 días a 9 días después de que las células T se activaron contra un antígeno, por ejemplo 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

Se divulga que, la célula y el segundo adyuvante se administran solo una vez en un marco de tiempo de 48 h a 14 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

Por ejemplo, la célula y el segundo adyuvante se administran solo una vez 48 h, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días después de que las células T se activaron contra un antígeno. La célula y el segundo adyuvante se administran solo una vez en un marco de tiempo de 5 días a 9 días, por ejemplo 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

En una modalidad preferida, en el paso i), se administra además lo siguiente IL-2 unida de forma no covalente a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que bloquea su unión a la cadena de receptores de IL-2 de alta afinidad CD25 (IL-2 formada en complejo). En una modalidad más preferida, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se puede administrar antes, concomitantemente o después de la administración de célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y un segundo adyuvante. De manera preferente, la célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y un segundo adyuvante se administran solos una vez, y la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra repetidamente. En esta modalidad, la IL-2 formada en complejo se puede administrar tanto antes, concomitantemente y/o después de la administración de la célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y un segundo adyuvante.

Para la combinación, las mismas modalidades preferidas para la administración de la célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y un segundo adyuvante, aplican en cuanto la administración de las células solamente.

Se divulga que, en el caso de la combinación, la célula y el segundo adyuvante se administran una sola vez en un marco de tiempo de 0 h a 14 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

Se divulga que, en el caso de la combinación, la célula y el segundo adyuvante se administran en un marco de tiempo de 48 h a 14 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

Por ejemplo, en el caso de la combinación, la célula y el segundo adyuvante se administran 48 h, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

Se divulga que, en el caso de la combinación, la célula y el segundo adyuvante se administran en un marco de tiempo de 3 días a 9 días, aún de manera más preferente de 4 días a 8 días, por ejemplo 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

Se divulga que, en el caso de la combinación, la célula y el segundo adyuvante se administran solo una vez en un marco de tiempo de 0 h a 14 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

Por ejemplo, la célula y el segundo adyuvante se administran solo una vez 48 h, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

Se divulga que, en el caso de la combinación, la célula y el segundo adyuvante se administran solo una vez en un marco de tiempo de 3 días a 9 días, aún de manera más preferente de 4 días a 8 días, por ejemplo 4 días, 5 días, 6 días, 7 días,

8 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

En el caso de la combinación, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra de manera preferente repetidamente después de que las células T se activaron contra un antígeno en un marco de tiempo de 5 h a 9 días después de que las células T se activaron contra un antígeno. Es posible además que la administración adicional de la

IL-2 formada en complejo se lleve a cabo después de 14 días después de que las células T se activaron contra un antígeno;

sin embargo, al menos una administración es en un marco de tiempo de 5 h a 9 días.

Se divulga que, en el caso de la combinación, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra de manera preferente en un marco de tiempo de 48 h a 9 días, aún de manera más preferente de 3 días a 8 días, por ejemplo 3 días,

4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

Se divulga que, en el caso de la combinación, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra de manera preferente repetidamente en un marco de tiempo de 48 h a 9 días, aún de manera más preferente de 3 días a 8 días, por ejemplo, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de que las células T se activaron contra un antígeno. De esta manera, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra de manera preferente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o

10 veces en el marco de tiempo de 48 h a 9 días, aún de manera más preferente de 3 días a 8 días, por ejemplo 3 días,

4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de que las células T se activaron contra un antígeno. Por ejemplo, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se puede administrar diario o cada dos días. Por ejemplo, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se puede administrar 48 h, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días y 8 días después de que las células T se activaron contra un antígeno. En otro ejemplo, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se puede administrar 48 h, 4 días, 6 días y 8 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

Es posible además, que la administración adicional de la IL-2 formada en complejo se lleve a cabo después del tiempo indicado de, por ejemplo, 14 días, de manera preferente 9 u 8 días, después de la administración del sistema de suministro del paso i); sin embargo, al menos una administración es en el marco de tiempo indicado.

Por lo tanto, se divulga, en el caso de la combinación, que:

(A) la célula y el segundo adyuvante se administran en un marco de tiempo de 0 h a 14 días, de manera preferente de 48 h a 14 días, de manera más preferente en un marco de tiempo de 3 días a 9 días, aún de manera más preferente de 4 días a 8 días, por ejemplo 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de que las células T se activaron contra un antígeno, aún de manera más preferente solo una vez en un marco de tiempo de 48 h a 14 días, de manera más particular solo una vez en un marco de tiempo de 3 a 9 días, aún de manera más particular solo una vez en un marco de tiempo de

4 días a 8 días, por ejemplo 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de que las células T se activaron contra un antígeno, y

(B) la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administró en un marco de tiempo de 0 h a 14 días, de manera más preferente de 48 ha 9 días, aún de manera más preferente de 3 días a 8 días, por ejemplo 3 días, 4 días, 5 días, 6 días,

7 días, 8 días después de que las células T se activaron contra un antígeno, de manera más preferente se administraron repetidamente en un marco de tiempo de 0 h a 14 días, de manera más preferente de 48 h a 9 días, aún de manera más preferente de 3 días a 8 días, por ejemplo 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

Es además posible en el caso de la combinación, que la administración adicional de la IL-2 formada en complejo se lleve a cabo después de 14 días después de que las células T se activaron contra un antígeno; sin embargo, al menos una administración está en un marco de tiempo como se especifica en las reivindicaciones.

Se divulga que, en el caso de la combinación, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra de manera preferente repetidamente en un marco de tiempo de 48 h a 9 días, aún de manera más preferente de 3 días a 8 días, por ejemplo, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de que las células T se activaron contra un antígeno. Por consiguiente, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra de manera preferente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o

10 veces en un marco de tiempo de 48 h a 9 días, aún de manera más preferente de 3 días a 8 días, por ejemplo 3 días,

4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días después de que las células T se activaron contra un antígeno. Por ejemplo, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se puede administrar diario o cada dos días. Por ejemplo, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se puede administrar 48 h, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días y 8 días después de que las células T se activaron contra un antígeno. En otro ejemplo, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se puede administrar 0 h, 48 h, 4 días, 6 días y 8 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

Es posible además, que la administración adicional de la IL-2 formada en complejo se lleve a cabo después del tiempo indicado de, por ejemplo, 14 días, de manera preferente 9 u 8 días, después de que las células T se activaron contra un antígeno; sin embargo, al menos una administración está en el marco de tiempo indicado.

Se divulga que, en el caso de la combinación, la célula y el segundo adyuvante se administran solo una vez en un marco de tiempo de 0 h a 14, de manera preferente 48 h a 14 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

Aunque se probó el efecto de ADAS después del direccionamiento del antígeno en XCR1 DC, uno puede concluir de los resultados de los inventores que cualquier sistema que conduzca a una activación inicial significativa (“cebado”) o reactivación de células T CD8+ y/o células T CD4+ por la activación del receptor de células T in vivo se pueden amplificar con un procedimiento ADAS. La población de células T también se podría activar inicialmente in vitro y después transferir adoptivamente in vivo, de modo que ADAS entonces se puede utilizar para amplificar la respuesta efectora de células T in vivo.

Por lo tanto, en una modalidad, las células T activadas contra un antígeno se pueden obtener al llevar a cabo un método como se describe en lo anterior en un medicamento para el uso en el paso i) utilizando un sistema de suministro.

En otra modalidad preferente, las células T activadas contra un antígeno se pueden obtener in vitro. Para este fin, las células T no seleccionadas, de manera preferente obtenidas del paciente que se trata, se co-cultivan con antígeno o proteína que comprende antígeno y APC, y células T que responden al antígeno se seleccionan, por ejemplo, por un ensayo de secreción de IFN-y, y se expanden con factores de crecimiento. Alternativamente, las células T específicas de antígeno se clasifican utilizando tetrámeros apropiados o análogos de los mismos, expuestos a un antígeno en presencia de APC y se expandidos con factores de crecimiento.

La célula que presenta MHC-I es una célula mononucleada de sangre periférica (PBMC).

La célula que presenta MHC-I es de manera preferente una célula obtenida del paciente que se trata. Los métodos para obtener de estas células son conocidos por la persona experta. Por ejemplo, la sangre se puede recuperar y las células PBMC luego se pueden aislar.

En una modalidad preferida adicional del medicamento para el uso, la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra, de manera preferente se administra repetidamente, en particular 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 veces, de manera aún más preferente en donde la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx) se administra cada 1 o 2 días, y/o se administra repetidamente durante 5 días a 1 mes, de manera aún más preferente 1 a 2 semanas.

En una modalidad preferente adicional del medicamento para el uso, el péptido derivado de la proteína que comprende antígeno tiene una longitud de 8, 9 o 10 aminoácidos y/o es un péptido presentado por un MHC-I, de manera preferente por el alelo HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-B7, HLA-B35, HLA-A24, o HLA-A30, de manera más preferente por el alelo HLA-A2.

En una modalidad preferente adicional del medicamento para el uso, el paciente es un mamífero, en particular un humano.

En el medicamento para el uso de la invención, el método para inducir una respuesta inmunitaria citotóxica celular es para tratar profilácticamente o tratar un tumor y/o una infección.

El medicamento para el uso se puede proporcionar para proteger de la infección (“tratar profilácticamente”). Alternativamente, este medicamento se puede utilizar para propósitos terapéuticos. El individuo infectado, que puede no ser capaz de montar una respuesta inmunitaria Th1 suficiente al patógeno, se le podría administrar un medicamento diseñado para inducir y/o extender una respuesta citotóxica celular y de esa manera sería capaz de contener o erradicar la infección (“tratar”). Ejemplos serían malaria, tuberculosis, leishmania, enfermedades priónicas, ortomixovirus y en particular influenza, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C crónica, VIH y otros lentivirus, citomegalovirus, virus de herpes, virus del papiloma, bunyavirus, calicivirus, filovirus, flavivirus y en particular virus de hepatitis C, virus de papiloma, paramixovirus, una variedad de virus respiratorios y otros virus, y cualquier otra infección específica en la divulgación.

La vacuna también se podría utilizar para proteger individuos sanos que desarrollen tumores con componentes antigénicos conocidos (por ejemplo melanoma, carcinoma de próstata) (“tratar profilácticamente un tumor”). Alternativamente, un medicamento para uso se podría utilizar para curar pacientes quienes ya tienen tumores desarrollados. Ejemplos de estos tumores serían tumores inducidos por virus humanos, en particular tumores inducidos por virus de papiloma, tumores inducidos por HCV, tumores inducidos por virus de hepatitis B y otros virus que pueden inducir tumores tras la infección crónica. Por otra parte, los tumores adecuados que se tratan son tumores sólidos que surgen espontáneamente (por ejemplo melanoma, cáncer de próstata, cáncer de mama, adenocarcinoma del intestino, cáncer de pulmón) y leucemias.

Un patógeno o agente infeccioso es un agente biológico, especialmente un microorganismo vivo, que provoca enfermedad o afección a su hospedero. El patógeno, de acuerdo con esta invención significa de manera preferente un virus, bacteria y/o parásito eucariota. Un antígeno derivado de patógeno es un antígeno derivado de un patógeno.

La presentación cruzada del antígeno también es de importancia central para la erradicación de tumores en el cuerpo. Las células tumorales y antígenos tumorales tienen que ser captados, procesados y presentados por la DC para inducir una respuesta inmunitaria anti-tumoral. Puesto que la eliminación de la mayoría de tumores requiere una respuesta de células T Th1 citotóxicas eficaz, la presentación cruzada de los antígenos tumorales es esencial. De esta manera, para una respuesta anti-tumoral eficaz, la DC de presentación cruzada desempeña una función pre-eminente. Como se muestra en el Ejemplo 5, los medicamentos para el uso de la presente invención muestran un efecto benéfico sorprendente en un modelo tumoral.

Se divulga que, el medicamento para el uso comprende, de manera preferente consiste de, (a) una molécula que se une a un receptor en la superficie de una célula dendrítica, y (b) una proteína que comprende antígeno unida a una molécula de (a).

Se divulga que, el medicamento para el uso comprende, consiste de manera preferente de, (a) una molécula que se une a un receptor en la superficie de una célula dendrítica, (b) una proteína que comprende antígeno unida a la molécula de (a) y (c) un primer adyuvante.

Se divulga que, el medicamento para el uso comprende, consiste de manera preferente de (A) (a) una molécula que se une a un receptor sobre la superficie de una célula dendrítica, (b) una proteína que comprende antígeno unida a la molécula de (a) y (c) un primer adyuvante y (B) (d) la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx), (e) una célula de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y un segundo adyuvante, o (f) una combinación de (d) y (e), en donde el péptido se deriva de la proteína que comprende antígeno como se define en (A).

Se divulga un kit de partes que comprenden, que consisten de manera preferente de, un sistema de suministro como se define en lo anterior y un reactivador como se define en lo anterior.

Se divulga un kit de partes que comprende, que consiste de manera preferente de (A) la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx), y (B) a célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y un segundo adyuvante.

Se describe un método para comprender una respuesta inmunitaria citotóxica celular contra una proteína que comprende antígeno, el método comprende el paso de:

ii) administrar a un paciente que tiene células T activadas contra un antígeno una célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y un segundo adyuvante, en donde el péptido se deriva de la proteína que comprende antígeno, reactivando de esta manera la célula T activada, y opcionalmente administrando además la interleucina 2 formada en complejo (IL-2cx), en donde el reactivador del paso i) se administra en un marco de tiempo de 0 h a 14 días después de que las células T se activaron contra un antígeno.

Se describe un método para inducir una respuesta inmunitaria citotóxica celular, el método comprende los pasos de:

i) administrar a un paciente un sistema de suministro que comprende (a) una molécula que se une a un receptor sobre la superficie de una célula dendrítica, (b) una proteína que comprende antígeno unida a la molécula de (a) y (c) un primer adyuvante, en donde tras la unión de la molécula de (a) al receptor, la proteína de (b) se internaliza y se procesa en una célula dendrítica y el antígeno comprende una proteína se presenta sobre la superficie de la célula dendrítica, activando de esta manera una célula T en el paciente; y

ii) administrar al paciente un reactivador seleccionado del grupo que consiste de (d) interleucina 2 formada en complejo (IL- 2cx), (e) a célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I) cargada con péptido y un segundo adyuvante, y (f) una combinación de (d) y (e), en donde el péptido se deriva de la proteína que comprende antígeno como se define en el paso i), reactivando de esta manera la célula T activada en el paso i), en donde el re activador del paso ii) se administra en un marco de tiempo de 0 h a 14 días después de la administración del sistema de suministro del paso i).

Para los métodos divulgados y los kit de partes divulgados, la misma divulgación aplica en cuanto a los medicamentos para el uso de la presente invención y los medicamentos divulgados para el uso.

Figuras

La Figura 1 muestra la inducción de la actividad citotóxica después del direccionamiento del antígeno en XCR1+ DC.

La Figura 2 muestra la protección de la infección de la siembra de células cancerosas por la actividad citotóxica inducida.

La Figura 3 muestra la amplificación de la citotoxicidad de células T CD8+ obtenida por inyección de linfocitos singénicos cargados con el péptido antigénico SIINFEKL (SEQ ID NO: 11).

La Figura 4 muestra la amplificación altamente sinérgica de las células T CD8+ citotóxicas mediante la aplicación de células cargadas con péptido e IL-2 formado en complejo.

La Figura 5 muestra efectos sinérgicos del direccionamiento del antígeno y co-aplicación de las células cargadas con péptido e IL-2 formada en complejo en el tratamiento de tumores establecidos.

La Figura 6 muestra que la baja frecuencia de las células T CD8+ citotóxicas después del cebado utilizando varios modos de vacunación se puede amplificar en gran medida con ADAS. (A) animales C57BL/6 se inyectaron en el día 0 con 200 |ig de ovalbúmina no diana, soluble, (OVA), o con 5 |ig de mAb MARX10-OVA, DEC-205-OVA, 33D1-OVA, MOPC21-OVA; en todos los casos, 10 |ig de poli I:C se co-inyectaron como adyuvante. En el día 5, se tomaron muestras de sangre y las frecuencias de células T c D8+ específicas de SIINFEKL se determinaron por citometría de flujo utilizando un tetrámero específico. (B) en el día 5, la respuesta inmunitaria al péptido derivado de OVA SIINFEKL se amplificó con el procedimiento ADAS (inyección de 10x106 esplenocitos singénicos cargados con SIINFEKL junto con 50 |ig de poli I:C como adyuvante). En el día 10, los animales se sacrificaron y las frecuencias de las células T CD8+ específicas de SIINFEKL se determinaron en el bazo utilizando el tetrámero. (C) animales C57BL/6 Batf3-KO se inmunizaron como se describe en (A) y se trataron con ADAS, como se describe en (B), y las frecuencias de las células T CD8+ específicas de SIINFEKL se determinaron en el bazo en el día 10.

Figura 7 (A) el polipéptido R9-SIINFEKL no se une externamente a la hendidura de MHC-I: los esplenocitos de C57BL/6 se incubaron en una densidad de 5x106 células/ml con el péptido SIINFEKL a 1 |iM durante 2 h a 37°C, CO2 al 5% en un medio de cultivo RPMI1640 completo, o en una densidad de 2x106 células/ml con el policétido R9-SIINFEKL en 1 |iM durante 4 h. Las células se lavaron dos veces, y se tiñeron con anti-SIINFEKL-H2Kb mAb (clon 25-D1.16) para determinar la eficiencia de la carga de péptido a la hendidura de MHC-I. Además, las células se co-tiñeron con varios marcadores de linaje para identificar diferentes poblaciones de células esplénicas y se analizaron por citometría de flujo. (B) R9-SIINFEKL se puede utilizar para transportar antígeno en el compartimiento citoplásmico de las células primarias y de esta manera permiten la carga de MHC-I con péptidos derivados: los esplenocitos C57BL/6 se incubaron en una densidad de 2x106 células con el polipéptido R9-SIINFEKL en varias concentraciones (1-30 |iM) durante 7 h como en lo anterior. Después, las células se lavaron dos veces, se tiñeron con mAb 25-D1.16 para determinar la eficiencia de la carga del péptido a la hendidura de MHC-I, se co-tiñeron con los marcadores de linaje, y se analizaron por citometría de flujo. Con 30 |iM de polipéptido se observó una muerte celular significativa (no mostrada). (C) las cellas primarias cargadas con R9-SIINFEKL se pueden utilizar para ADAS: los ratones C57BL/6 se inyectaron i.v. en el día 0 con 10x106 de esplenocitos cargados con R9-SIINFEKL (5 |iM durante 7 h), o para comparación con 10x106 esplenocitos cargados con SIINFEKL (2 |iM durante 2 h), o con 2 |ig de MARX10-OVA (todos con 10 |ig de poli I:C) para el cebado, y la frecuencia y el potencial citotóxico (granzima B, KLRG1, no mostrada) de las células T c D8+ se determinaron en el día 5. Alternativamente, los ratones C57BL/6 se cebaron con 2 |ig de MARX10-OVA y 10 |ig de poli I:C, y se sometieron a ADAS en el día 5 por inyección i.v. con esplenocitos cargados con SIINFEKL (2 mM durante 2 h) y 50 |ig de poli I:C (control positivo). En paralelo, los ratones C57BL/6 se cebaron i.v. con 2 |ig de MARX10-OVA, o 2 |ig 33D1-OVA, o 2 |ig 1D3-OVA, o 200 |ig de OVA no diana (todos juntos con 10 |ig de poli I:C) en el día 0, y se sometieron a ADAS por inyección i.v. de esplenocitos singénicos cargados con R9-SIINFEKL (5 |iM durante 7 h) y 50 |ig de poli I:C. La expresión inducida por ADAS de células T CD8+ específicas de SIINFEKL se determinó en el día 10 por citometría de flujo utilizando un tetrámero específico. Todas las células T CD8+ mostraron marcadores indicativos de la citotoxicidad (granzima B, KLRG1, no mostradas).

Figura 8 La administración del antígeno se puede disociar de la aplicación del adyuvante en el paso de cebado: (A) los ratones C57BL/6 se inyectaron i.v. en el día 0 con 2 |ig de MARX10-OVA junto con 10 |ig de poli I:C como adyuvante, se mezclaron en una solución. Alternativamente, los ratones se inyectaron en el día -1 con 10 |ig de poli I:C y en el día 0 con 2 |ig de MARX10-OVA. Alternativamente, los ratones se inyectaron en el día 0 con 2 |ig de MARX10-OVA y en el día 1 con 10 |ig de poli I:C. En cada grupo experimental, se tomaron muestras de sangre en el día 5 y las frecuencias de las células T CD8+ específicas de SIINFEKL se determinaron por citometría de flujo utilizando un tetrámero específico. (B) Los ratones descritos en (A) se sometieron al procedimiento de amplificación por ADAS (inyección i.v. de los esplenocitos cargados externamente con SIINFEKL junto con 50 |ig de poli I:C) y las frecuencias de células T CD8+ específicas de SIINFEKL en el bazo se determinaron por citometría de flujo. la administración del antígeno se puede disociar de la aplicación del adyuvante en el procedimiento ADAS.

Figura 9 La amplificación altamente sinérgica de las células T CD8+ citotóxicas al combinar ADAS y la administración de IL-15 formada en complejo: los animales C57BL/6 se cebaron en el día 0 con 2 |ig de MARX10-OVA y 10 |ig de poli I:C y se analizaron para el número total de células T CD8+ específicas de SIINFEKL en el bazo en el día 5 (cebado) utilizando un tetrámero especifico y citometría de flujo. Algunos de los animales cebados se sometieron en el día 5 ADAS solamente (inyección de 10x106 esplenocitos cargados con SIINFEKL junto con 50 |ig de poli I:C), algunos recibieron ADAS y se inyectaron i.p. con IL-2cx (como se describe en los Ejemplos 4 y 5) en los días 6, 7, y 8, otros ratones recibieron ADAS en el día 5 y se inyectaron i.p. con complejo IL-15 (IL-15cx) en el día 6, 7, y 8. En todos los grupos tratados con ADAS, el número total de células T CD8+ citotóxicas específicas de SIINFEKL se determinaron en el día 9. La dosis de IL-15cx para 1 ratón se generó al incubar 2 |ig de IL-15 (Peprotech # 210-15) con 9,3 |ig de sIL-15R-Fc (R&D, #551-MR-100) a 37°C durante 20 min, se agregó PBS a 500 ml y la solución se inyectó i.p.

Figura 10 El ADAS puede amplificar las células T CD8+ de memoria en reposo en una manera específica de antígeno: ratones C57BL/6 se transfirieron adoptivamente en el día -1 con 2.000 o 10.000 de células OT-I y se cebaron en el día 0 con MARX10-OVA y 10 |ig de poli I:C. El ADAS (inyección de 10x106 esplenocitos cargados con SIINFEKL junto con 50 |ig de poli I:C) se llevó a cabo en todos los animales en el día 5, y los animales se analizaron para la frecuencia de células de (A) células OT-I T y (B) endógenas, cellas T CD8+ específicas de SIIFEKL negativas 1.1 Thy en los días 10 y 40. Otro grupo de ratones se sometió a ADAS nuevamente en el día 69, y se analizaron para la frecuencia de (A) células T OT-I y (B) células T CD8+ específicas de SIINFEKL endógenas en el día 74.

Figura 11 Amplificación in vivo de las células T CD8+ específicas de antígeno activadas in vito por ADAS: los esplenocitos se aislaron de ratones OT-I y se cultivaron en un medio completo con el péptido SIINFEKL a 1,4 nM durante 3 días. Después, las células se lavaron con PBS y 5 x105 células T OT-I (como es determinado por citometría de flujo) se transfirieron adoptivamente en los ratones C57BL/6 sin tratamiento previo los animales se trataron por ADAS en varios puntos de tiempo después de la transferencia. Se muestra el efecto en la frecuencia de las células T CD8+ transferidas cuando el ADAS se llevó a cabo en el día 5 después de la transferencia adoptiva. La proporción de las células T CD8+ adoptivamente transferidas de todas las células T CD8+ se determinó en la sangre en el día 9 utilizando citometría de flujo. Las frecuencias en la sangre corresponden en esos experimentos en las frecuencias en los bazos de los animales.

Ejemplos

Ejemplo 1

Inducción de la actividad citotóxica después del direccionamiento del antígeno en XCR1+ DC (Fig. 1)

El antígeno modelo OVA se fusionó recombinantemente con mAb MARX10 específico de XCR1 (Bachem, A. et al. Front Immunol 3 (2012) 214) o se fusionó recombinantemente con el ligando de quimiocina XCL1 (Hartung, E. et al. J Immunol 194 (2015) 1069-1079), que se une específicamente al receptor XCRI. Cuando MARX10-OVA o XCL1-OVA se inyectaron i.v. en los ratones C57BL/6 sin tratamiento previo en niveles bajos, el antígeno se dirigió a XCR1+ DC. Si este cebado de antígeno se presentó en presencia de un adyuvante (3 |ig de LPS, CpG, o 10 |ig de poli I:C), se indujo la actividad citotóxica sustancial (se muestran datos con poli I:C como adyuvante). Esta actividad citotóxica se probó al inyectar los animales cebados en el día 6 i.v. con células diana (linfocitos esplénicos), que se cargaron previamente con SIINFEKL (SEQ ID NO: 11) in vitro, un péptido derivado de OVA. Las células diana se etiquetaron después de cargarse con el fluoróforo a un alto grado, mientras que los linfocitos esplénicos de control no cargados se etiquetaron con CFSE a un grado bajo. Como se muestra en la Fig. 1A, los animales de cebado con OVA+adyuvante dieron por resultado actividad citotóxica que eliminó casi todas las células diana cargadas con SIINFEKL. La Fig. 1B muestra una curva de dosisrespuesta obtenida con varias cantidades de antígeno dirigido a XCR1+ DC. Se obtuvieron resultados idénticos después de utilizar MARX10- SIINFEKL o XCL1-SIINFEKL para el direccionamiento del péptido inmunogénico a XCR1+ DC.

Ejemplo 2

Protección de la infección o de la siembra de células cancerosas por la actividad citotóxica inducida (Fig. 2)

Ratones C57BL/6 se cebaron con MARX10-OVA (que contiene 2 |ig de OVA) y adyuvante (10 |ig de poli I:C) o se dejaron sin tratar. Cinco días después, todos los ratones se infectaron con 1x106 CFU (= 5x LD⁵⁰) de una cepa de L. monocytogenes, en la cual la secuencia de péptido SIINFEKL (SEQ ID NO: 11) se había modificado recombinantemente (Foulds et al., 2002, J. Immunol. 168, 1528-1532). Mientras que todos los ratones no tratados murieron dentro de 3 a 4 días, el nivel inducido de citotoxicidad por el cebado antigénico protegió completamente a todos los animales de la enfermedad (Fig. 2A).

Los ratones C57BL/6 se cebaron con MARX10-OVA o XCL1-OVA (conteniendo cada uno 0,16 |ig de OVA) y adyuvante (3 |ig LPS) i.v., los animales de control se inyectaron con PBS. Siete días después, todos los animales se inyectaron con 5x105 células EG.7, una línea tumoral singénica agresiva modificada para expresar OVA (Moore, M.W. et al. Cell 54 (1988) 777-785). Mientras que los animales tratado con PBS mostraron fuerte crecimiento tumoral después de 14 días, ninguno de los animales inmunizados tuvo ningún tejido tumoral en el sitio de la inyección o en cualquier parte, indicando que el nivel inducido de la citotoxicidad protegió a los animales de la siembra del tumor (Fig. 2B).

Ejemplo 3

Amplificación de la citotoxicidad de células T CD8+ obtenida por inyección de linfocitos singénicos cargados con péptido antigénico SIINFEKL (SEQ ID NO: 11) (Fig. 3)

Los ratones C57BL/6 se cebaron con MARX10-OVA (que contiene 2 |ig de OVA) y un adyuvante (poli I, CpG, o LPS, se muestran los datos con 10 |ig de poli I:C) en los días - 20, -15, -10, -7, -5, o -3. En el día 0, los animales cebados se inyectaron i.v. con 10x106 de esplenocitos (Fig. 3A) que se cargaron antes de la inyección con SIINFEKL (SEQ ID NO: 11) in vitro (“Sistema de Amplificación Dependiente de Antígeno”, ADAS). Junto con las células cargadas con péptido se inyectó un adyuvante (varias cantidades de LPS o poli I:C), se muestran datos con 50 |ig de poli I:C. En el día 10 los animales se sacrificaron y el número total de células T CD8+ específicas de SIINFEKL se determinó en el bazo utilizando tetrámeros específicos de SIINFEKL y citometría de flujo (Fig. 3A). Los resultados mostraron que el sistema utilizado para la amplificación de las células T CD8+ específicas de antígeno fueron eficaces en un marco de tiempo reducido entre los días 5 y 9 después de la estimulación antigénica inicial (Fig. 3A).

Los ratones C57BL/6 se cebaron con MARX10-OVA (que contiene 2 |ig de OVA) y un adyuvante (10 |ig de poli I:C). Cinco días después, 10x106 linfocitos esplénicos, o células T purificadas, célula dendríticas, o células B que se cargaron antes de la inyección con SIINFEKL (SEQ ID NO: 11) in vitro se inyectaron i.v. en los animales cebados. Junto con las células cargadas con péptido se inyectó un adyuvante (50 |ig poli I:C). En el día 10 después del cebado con MARX10-OVA, los animales se sacrificaron y el número total de células T CD8+ específicas de SIINFEKL se determinó en el bazo utilizando tetrámeros específicos de SIINFEKL y citometría de flujo. Los resultados mostraron que la amplificación de la respuesta de células T CD8+ citotóxicas se puede lograr con varias poblaciones de células que expresan MHC-I sobre la superficie celular. Las células amplificadas expresaron altos niveles de moléculas efectoras (TNF-a, IFN-y, granzima B).

Ejemplo 4

Amplificación altamente sinérgica de células T CD8+ citotóxicas por co-aplicación de células cargadas con péptido e IL-2 formada en complejo (Fig. 4)

Los ratones C57BL/6 se cebaron con MARX10-OVA (que contiene 2 |ig de OVA) y un adyuvante (10 |ig de poli I:C). Un grupo de animales cebados se inyectó en los días 1,2, y 3 después del cebado con IL-2 (IL-2cx) obtenida al incubar IL-2 (2 |ig) y el anti-IL-2 mAb JES6-5H4 (10 |ig, (Sander, B. J Immunol Methods 166 (1993) 201-214) durante la noche a 4°C, y se sacrificaron en el día 6 (“Primed+IL-2cx”). Otro grupo de ratones se inyectó en el día 5 con esplenocitos cargados con SIINFEKL (10x106) y adyuvante (50 |ig poli I:C) y se sacrificaron en el día 10 (“Cebado+ADAS”). Otro grupo de ratones se inyectó en el día 5 con esplenocitos cargados con SIINFEKL (10x106) y adyuvante (50 |ig poli I:C), y con IL-2cx en los días 6, 7, 8, y 9, y se sacrificaron en el día 10 (“Cebado+ADAS+IL-2cx”). Al final de cada experimento, el número total de células T c D8+ específicas de SIINFEKL se determinó en el bazo utilizando tetrámeros específicos de SIINFEKL y citometría de flujo. El experimento determinó un efecto altamente sinérgico de ADAS e IL-2cx en la amplificación de las células T CD8+ citotóxicas específicas de antígeno.

Ejemplo 5

Efectos sinérgicos del direccionamiento y co-aplicación del antígeno de las células cargadas con péptido y IL-2 formada en complejo en el tratamiento de tumores establecidos (Fig. 5)

Los ratones C57BL/6 se inyectaron s.c. con 5x105 células EG.7, una línea tumoral singénico agresiva modificada para expresar OVA (Moore, M.W. et al. Cell 54 (1988) 777-785). En el día 6 después de la inyección tumoral, los ratones se cebaron con MARX10- OVA (que contiene 2 |ig de OVA) y adyuvante (10 |ig de poli I:C), un grupo se dejó sin tratar. Seis días después del cebado (día 11), un grupo de ratones se inyectó con esplenocitos cargados con SIINFEKL (10x106) y adyuvante (50 |ig poli I:C) (“Cebador+ADAS”). Otro grupo cebado de ratones se inyectó en los días 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, y 23 con IL-2cx solamente (“Primed+IL-2cx”). Otro grupo cebado de ratones se inyectó en el día 11 con esplenocitos cargados con SIINFEKL (10x106) y adyuvante (50 |ig de poli I:C), y con IL-2cx en los días 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, y 23 (“Cebado+ADAS+IL-2cx”). En el día 25 todos los animales se sacrificaron (algunos animales de control tuvieron que ser sacrificados antes, debido a que el tumor creció a > 1 cm en diámetro). Todos los datos representan el tamaño promedio de la media de los tumores (en mm2) en cada grupo de tratamiento (n=6). Los resultados muestran que el cebado de los ratones inyectados con tumor solo con OVA diana no fueron eficaces. En contraste, ya sea IL-2cx o ADAS solo fueron eficaces al reducir en gran medida la masa tumoral de aproximadamente 7-10 días en los ratones cebados, pero no podría prevenir el crecimiento del tumor después. Cuando una combinación de ADAS e IL-2cx se aplicó a los animales cebados, la masa tumoral se redujo en gran medida y el tumor se controló completamente hasta el final del experimento (algunos ratones habían rechazado completamente el tejido tumoral).

Ejemplo 6

Varios modos de inmunización, dan por resultado una frecuencia baja de células T CD8+ específicas de antígeno cebadas. Esto se puede expandir en general en gran medida y diferencial para exterminar células T CD8+ con el procedimiento ADAS

MAb MARX10 (Bachem et al., Front Immunol 3 (2012) 214, EP2641915A1) reconoce XCR1, el marcador de linaje para XCR1+ DC, Mab DEC-205 (NLDC-145, Kraal et al., 1986, obtenido de Biolegend) reconoce las molécula c D205 expresada en el XCR1+ DC murino, mAb 33D1 (Nussenzweig et al., PNAS 79 (1982) 161-165, obtenido de ATCC) reconoce la molécula DCIR2 en SIRPa+ DC, mAb 1D3 reconoce CD19 en las células B (Krop et al. Eur J Immunol 26 (1996) 238-242, obtenido de ATCC), mAb MOPC-21 (Potter et al., J Natl Cancer Inst 26 (1961) 1109-1137, obtenido de Biolegend) no reconoce ninguna molécula en el ratón y por lo tanto se utiliza como un control de isotipo IgG1. XCL1 es el ligando de quimiocina para XCR1 y se puede utilizar para direccionamiento del antígeno a XCR1+ DC en el ratón y en el humano (Hartung et al. J Immunol 194 (2015) 1069-1079.

Las regiones de unión a antígeno de las cadenas pesadas y ligeras de mAb DEC-205, 33D1, 1D3, MOPC-21 se identificaron por espectrometría de masas y se injertaron en la cadena principal de mAb DEC-205 por técnicas recombinantes estándares, como se describe previamente para mAb MARX10 (Hartung et al., J Immunol 194 (2015) 1069-1079). Esta cadena principal se ha modificado previamente para minimizar la unión a los receptores Fc. Todos los contractos luego se modificaron de tal manera para adaptar la OVA como una proteína de fusión C-terminal a cada uno de los anticuerpos, como se describe previamente para mAb MARX10 (Hartung et al., J Immunol 194 (2015) 1069-1079). XCL1-OVA se generó como se describe previamente (Hartung et al., J Immunol 194 (2015) 1069-1079).

Los animales C57BL/6 se inyectaron en el día 0 con una alta cantidad (200 |ig) de OVA no de diana, soluble o con 5 |ig de mAb MARX10-OVA, DEC-205-OVA, 33D1-OVA, MOPC21-OVA; en todos los casos, 10 |ig de poli I:C se co-inyectaron como un adyuvante. En el día 5, se tomaron muestras de sangre y las secuencias de las células T CD8+ específicas de OVA se determinaron por citometría de flujo utilizando un tetrámero H-2Kb cargado con SIINFEKL y capaz de unirse a las células T CD8+ específicas de SIINFEKL. Como se muestra en la Fig. 6A, todos los modos de aplicación de antígeno, ya sea no dirigidos o dirigidos a XCR1+ DC, a SIRPa+ DC, o a células B indujeron una expansión inicial de células T CD8+ específicas de SIINFEKL (“cebado”), dando por resultado una frecuencia de aproximadamente 2-3% de todas las células T CD8+ en la sangre. En el día 5, la respuesta inmunitaria al péptido derivado de OVA SIINFEKL se amplifico con el procedimiento ADAS (inyección de 10x106 esplenocitos singénicos cargados con SIINFEKL junto con 50 |ig de poli I:C). En el día 10, los animales se sacrificaron en la frecuencia de las células T CD8+ específicas de SIINFEKL se determinaron en el bazo. Además, se determinaron varios marcadores indicativos de citotoxicidad (KLRG1, perforina, granzima B, datos no mostrados). En todos los casos, el procedimiento ADAS amplificó la secuencia inicial de las células T CD8+ específicas de SIINFEKL a aproximadamente diez veces (Fig. 6B) e indujo un fenotipo indicativo de células T citotóxicas (no mostradas).

En paralelo, los animales Batf3-KO en el fondo C57BL/6 (animales que carecen de XCR1 DC, Hildner et al. Science 322 (2008) 1097-1100) se cebaron con los reactivos OVA no diana o diana, como en lo anterior. En el día 5, los animales Batf3-KO también se trataron por el procedimiento ADAS, como en lo anterior. En el día 10, todos los animales se sacrificaron y las frecuencias de las células T CD8+ específicas de SIINFEKL se determinaron en el bazo. Mientras que se cebaban, seguido por ADAS dio altas frecuencias de células T CD8+ específicas de SIINFEKL en todos los animales C57BL/6 (Fig. 6B), no se podría observar ninguna respuesta específica de SIINFEKL sustancial después de ADAS en cualquiera de los animales Batf3-KO (Fig. 6C).

Se pueden extraer varias conclusiones de estos experimentos. La inmunización que utiliza altos niveles de proteína no diana, cuando se aplica junto con un adyuvante Th1, dará por resultado una frecuencia inicial de células T CD8+ citotóxicas específicas de antígeno, como es mostramos por los inventores y otros previamente (Hartung et al., J Immunol 194 (2015) 1069-1079). El direccionamiento del antígeno en DC hace de esta inmunización primaria mucho más eficaz, puesto que solo bajas cantidades de antígeno son requeridas para lograr el mismo efecto (Hartung et al, 2015, Caminschi et al. Front Immunol 3(2012)13). Sorprendentemente, aún el direccionamiento del antígeno a las células B (en este caso a través de CD19, una molécula de superficie expresada específicamente en las células B) fue similarmente eficaz para direccionamiento del antígeno a DC. Este efecto puede ya ser explicado por la transferencia del antígeno de las células B a DC (Allan et al. Immunity 25 (2006) 153-162), o por la unión “no específica” del anticuerpo diana a los receptores Fc en DC. El último efecto es probablemente más responsable de la eficiencia del cebado cuando se utiliza MOPC-21, un anticuerpo de control de isotipo que no reconoce ningún antígeno en el sistema inmunitario de ratón. Estos resultados son completamente compatibles con los resultados anteriores, en los que el direccionamiento del antígeno a los macrófagos metaloofílicos marginales a través del receptor de superficie Siglec-1 también condujo a la generación de células T CD8+ citotóxicas de baja frecuencia, pero no en los animales Batf3-KO (Backer et al. Proc Natl Acad Sci EUA 107 (2010) 216 221). Los experimentos de los inventores con los animales Baf3-KO están en línea con la suposición general de que el cebado de las células T sin tratamiento previo se ha presentado por la DC. En particular, estos experimentos indican que la XCR1+ DC son requeridas para este cebado de células T CD8+ inicial. De esta manera, el direccionamiento del antígeno en XCR1+ DC promete ser la forma más eficaz de direccionamiento de antígenos de proteínas, ácidos nucleicos que codifican para antígenos o sistemas virales que codifican para antígenos a fin de lograr una buena respuesta de células T CD8+ primaria (“cebado”).

Conjuntamente, estos resultados indican que el direccionamiento del antígeno utilizando los anticuerpos o el direccionamiento utilizando ligandos receptores (por ejemplo XCL1-OVA) a la DC convencional, DC de piel u otra DC, tal como DC derivada de monocitos, pDC, a macrófagos u otras células es mucho más eficiente para la inducción de una respuesta citotóxica inicial comparada con la aplicación del antígeno no diana. Se puede anticipar que todas clases de cebado con los antígenos de proteína (por ejemplo, pero no limitados a, al emplear liposomas, nanopartículas y otros sistemas como portadores de antígeno (Saroja et al. Int J Pharm Investig 1(2011) 64-74) dará resultados similares, siempre y cuando la proteína se aplique en el contexto de un adyuvante Th1. También está bien documentado en la literatura que una frecuencia inicial similarmente baja de células T CD8+ citotóxicas se puede inducir por inmunización no de proteína, tal como, pero no limitado a, aplicación o inyección de ADN o vacunas basadas en ADN, o ARN o vacunas basadas en ARN, en el cuerpo utilizando una variedad de sistemas, ya sea dirigidos o no dirigidos (Saroja et al. Int J Pharm Investig 1(2011) 64-74, Koup et al. Cold Spring Harb Perspect Med 1(2011) a007252, Ulmer et al. Vaccine 30(2012) 4414-4418, Kramps et al. Wiley Interdiscip Rev RNA 4 (2013) 737-749). El cebado similar de las células T CD8+ se puede lograr con sistemas virales o virus atenuados (Draper et al. Nat Rev Microbiol 8(2010) 62-73). La inyección o aplicación de preparaciones basadas en ARN o ADN o sistemas virales no de replicación o virus atenuados no requiere necesariamente un adyuvante Th1 adicional, puesto que estos agentes se auto-adyuvan; es decir, estos agentes también representan adyuvantes Th1 mismos.

Es claro que en todas las formas esenciales del suministro de vacuna en el cuerpo, la respuesta citotóxica CD8+ inicial será relativamente débil. Esta respuesta débil en muchos casos será insuficiente para prevenir la infección, para tratar una infección, o para erradicar el tejido canceroso. Por lo tanto, existe la necesidad por un sistema que pueda amplificar en gran medida el cebado inicial.

En los experimentos de los inventores, los inventores mostraron que en todos los casos en los cuales la respuesta citotóxica CD8+ inicial (cebado) es insuficiente para eliminar la infección o el tumor, se puede amplificar utilizando el procedimiento ADAS.

También la inmunización de los pacientes con el tejido tumoral o células muertas conducirá a un cebado del compartimento de la célula T CD8+ (de Gruijl et al. Cancer Immunol Immunother 57 (2008) 1569-1577) y de esta manera hará estas células susceptibles al procedimiento ADAS.

Alternativamente, la activación de células T CD8+ primarias se puede lograr al aislar células T CD8+ específicas de tumor o patógenos preexistentes de un paciente, activando y expandiéndolas in vitro, e inyectándolas de nuevo en el paciente. Estas células T CD8+ adoptivamente transferidas (re-inyectadas) se reactivarán y se expandirán adicionalmente y se diferenciarán a las células T citotóxicas por el procedimiento ADAS.

La amplificación por ADAS puede ser en todos los casos sinérgicamente aumentado adicionalmente para inyecciones subsecuentes de IL-2 formada en complejo (Ejemplos 4, 5) o IL-15 formada en complejo (ver Ejemplo 9).

En los experimentos de los inventores utilizaron poli I:C como adyuvante. Se lograrán resultados similares con todos los tipos de adyuvantes Th1, tal como, pero no limitados a, poli I:C, agonistas de RIG-I y agonistas de TLR8.

Ejemplo 7

Suministro del antígeno en el compartimento citoplásmico de las células primarias para ADAS conduce a una carga eficaz de MHC-I con los péptidos derivados de antígeno.

Los inventores han mostrado que la carga externa del MHC-I de una variedad de células primarias (por ejemplo, células B, células T, DC, esplenocitos) con un péptido derivado de antígeno (por ejemplo, SIINFEKL) se pueden utilizar para ADAS. Los inventores han anticipado que el mismo procedimiento también funcionará con una variedad de métodos que introducen una proteína entera en las células primarias o que expresan una proteína dentro de la célula, como se describe en lo anterior.

Para ilustrar adicionalmente este concepto, los inventores han utilizado un estiramiento de 9 residuos de arginina como un péptido que penetración celular (CPP, Milletti 2012, Bechara et al., 2013) para transportar una proteína que comprende antígeno (polipéptido) en las células primarias. La secuencia completa de estos 37 polipéptidos aa (llamados R9-SIINFEKL) es RRRRRRRRRGYPYDVPDYALEQLESIIN-FEKLTEWTS (SEQ ID No. 13).

R9-SIINFNEKL necesita el procesamiento intracelular por el proteasoma antes de que se presente un péptido antigénico derivado (SIINFEKL) en la superficie celular en el contexto de MHC-I. De esta manera, el sistema puede servir como un modelo para introducir una proteína completa en una célula primaria que luego se procesa por el proteasoma en fragmentos, algunos de los cuales luego se presentan en la superficie celular en el contexto de m HC-I.

Este polipéptido no se puede unir directamente, externamente, en la hendidura del MHC-I. Para probar este punto, los inventores incubaron esplenocitos de ratones C57BL/6 con el polipéptido R9-SIINFEKL a 1 mM durante 4 h a 37°C en un medio completo. En paralelo, los esplenocitos se incubaron con el péptido SIINFEKL, que puede unirse directamente a MHC-I externamente, en 1 mM durante solo 2 h. Después de la incubación, las células se lavaron y analizaron por citometría de flujo utilizando mAb 25-D1.16, que reconoce SIINFEKL en el contexto de MHC-1H2Kb (Porgador et al. Immunity 6(1997) 715-726). Mientras que la incubación de los esplenocitos con SIINFEKL dio una fuerte señal con los macrófagos, células B, células T, pDC y DC, como se esperaba (puesto que SIINFEKL se une externamente a MHC-I), no se obtuvo señal con el polipéptido R9-SIINFEKL (Fig. 7A). Este experimento mostró directamente que el polipéptido R9 no puede ajustarse directamente en la hendidura de MHC-I y sirve como un antígeno.

En el siguiente paso, los esplenocitos se incubaron durante 7 h en concentraciones graduales (1-30 |j M) del polipéptido R9-SIINFEKL. Después de la incubación y lavado, la cantidad de MHC-I cargado con SIINFEKL se determinó al teñirse con mAb 25-D1.16. Como se muestra en la Fig. 7B, todas las células esplénicas primarias examinadas mostraron una señal dependiente de dosis. Aunque no medida directamente, se puede asumir que también el MHC-II se cargó en una manera similar. Este experimento mostró que un polipéptido, una vez transportado en un compartimento citoplásmico de una célula primaria por un CPP, será procesado y presentado en el contexto del MHC-I (y MHC-II).

A partir de este experimento, se puede deducir que el mismo procedimiento también funcionará con una proteína entera, que también sea procesado antes de ser presentada en el contexto del MHC-I (y MHC-II). De hecho, una carga similar del MHC-I con SIINFEKL se ha mostrado con la OVA completo, a la cual un estiramiento de 9 residuos de arginina se ha fusionado en N-terminal utilizando técnicas recombinantes estándares. En ese experimento, la OVA se procesó y se presentó correctamente en el contexto de MHC-I, como es determinado por la tinción con mAb 25-D1.16 (Mitsui et al. J Invest Dermatol 126(2006) 1804-1812). De esta manera, el experimento de los inventores, que está en línea con la literatura, muestra que la introducción de los polipéptidos o proteínas no procesadas en la célula utilizando el principio CPP cargará de manera eficaz el MHC-I (y m HC-II) de esta célula.

A partir de este experimento, se puede deducir que cualquier tipo de carga interna de células primarias con proteínas y péptidos no procesados conducirá a una presentación del MHC-I eficaz de péptidos derivados de este material.

Esta carga interna de células primarias se podría lograr similarmente con otros métodos que introducen péptidos o proteínas en las células, por ejemplo, pero no limitado a, electroporación, o al introducir ácidos nucleicos que codifican para péptidos y proteínas por una variedad de métodos tal como, pero no limitados a, transfección, lipofección, transducción, inyección, inyección balística, infección.

Los inventores luego probaron la potencia biológica de las células primarias cargadas internamente utilizando R9-SIINFEKL. Para este fin, los esplenocitos de ratones C57BL/6 se incubaron con R9-SIINFEKL a 5 |jM durante 7 horas y se lavaron. Luego se inyectaron el día 0 i.v. en los animales C57BL/6 sin tratamiento previo y se compararon con la inyección i.v. de los esplenocitos cargados con SIINFEKL, o en la inyección i.v. de MARX10-OVA. Toda las preparaciones se aplicaron conjuntamente con poli I:C como adyuvante. Como se puede observar en la Fig. 7C, todos los métodos de suministro antigénico indujo una baja frecuencia de células T c D8+ citotóxicas específicas de SIINFEKL, como es evaluado con un tetrámero específico y por análisis fenotípico (expresión de granzima B, KLRG1), que es MARX10-OVA el método más eficiente del suministro de antígenos.

En el siguiente paso, los esplenocitos cargados con R9-SIINFEKL se evaluaron por su capacidad en el procedimiento ADAS. En este experimento, el cebado por MARX10-OVA y ADAS con esplenocitos cargados con SIINFEKL sirvieron como el control positivo y proporcionaron aproximadamente 20% de células T CD8+ citotóxicas específicas de SIINFEKL (Fig. 7C). Los esplenocitos cargados con R9-SIINFEKL fueron similarmente eficaces en el procedimiento ADAS después de cebado con MARX10-OVA, 33D1-OVA, 1D3-OVA o altas cantidades de OVA no diana como esplenocitos cargados con SIIFEKL (comparar también la Fig. 7A). Este experimento mostró que cualquier tipo de carga interna eficaz de células primarias con el antígeno será eficiente para ADAS. Esta carga podría ser con polipéptidos no procesados, proteínas enteras, o con ácidos nucleicos que codifican para péptidos o proteínas, o utilizando agentes infecciosos, o sistemas de vectores virales o bacterianos modificados recombinantemente para codificar un polipéptido o proteína deseado.

Ejemplo 8

La aplicación del adyuvante Th1 se puede disociar en el momento de la aplicación del antígeno tanto en el paso de cebado como en el procedimiento ADAS.

Se asume en general actualmente que el antígeno tiene que ser aplicado junto con un antígeno a fin de lograr la inmunización del hospedero. Después, el antígeno se mezcla usualmente con el adyuvante y se aplica conjuntamente. Se asume en general actualmente que el adyuvante sería idealmente ligado uniformemente de manera física al antígeno para lograr resultados óptimos. Por lo tanto, fue muy sorprendente para los inventores darse cuenta de que una disociación de la administración del antígeno del suministro de adyuvante en el cebado y los procedimientos ADAS conduce a respuestas inmunitarias buenas y aún mejores.

Ratones C57BL/6 se inyectaron i.v. en el día 0 con 2 |ig de MARX10-OVA junto con 10 |ig de Poli I:C como adyuvante, mezclados en una solución. Alternativamente, los ratones se inyectaron el día -1 con 10 jg de poli I:C y en el día 0 con 2 |ig de MARX10-OVA. Alternativamente, los ratones se inyectaron el día 0 con 2 |ig de MARX10-OVA y en el día 1 con 10 |ig de poli I:C. En cada grupo experimental, se tomaron muestras de sangre en el día 5 y la frecuencia de las células T CD8+ específicas de SIINFEKL se determinó por citometría de flujo. Como se puede observar en la Fig. 8A, la administración conjunta del antígeno y el adyuvante en el día 0 dio una frecuencia de cebado de aproximadamente 2% de todas las células T CD8+. En contraste, la aplicación del adyuvante un día antes del antígeno pareció ineficaz. Muy sorprendentemente, la administración de antígeno en el día 0 y la aplicación de adyuvante en el día 1 fue más eficaz, dando una frecuencia de aproximadamente 4% de todas las células T CD8+ en el día 5.

Cuando todos los grupos experimentales se trataron por el procedimiento ADAS (inyección i.v. de esplenocitos cargados externamente con SIINFEKL y 50 jg de poli I:C), el grupo con la aplicación conjunta de antígeno y el adyuvante tuvieron aproximadamente 15% de células T CD8+ citotóxicas específicas de SIINFEKL. Claramente, el mejor resultado se logró con el grupo en el cual el adyuvante se aplicó 1 día después del antígeno (aproximadamente 30% de células T CD8+ específicas de SIINFEKL). Interesantemente, aún en el grupo en el cual poli I:C se aplicó 1 día antes del antígeno, hubo un bajo nivel de células T específicas de SIINFEKL (aproximadamente 5%), indicando que se ha logrado un cierto cebado aún en este grupo (que luego se volvió medible a través de la amplificación lograda en el procedimiento ADAS).

Estos experimentos muestran claramente que la aplicación de antígeno y el adyuvante se puede disociar en el tiempo en el procedimiento de cebado. De hecho, los resultados indican que la aplicación del adyuvante algún tiempo después de la administración del antígeno es ventajosa sobre una aplicación conjunta de los componentes. Los resultados delos inventores indican que la aplicación del adyuvante aún varios días después de la aplicación del antígeno será eficaz. El marco de tiempo exacto no se puede determinar en el humano y tiene que ser estimado también como 1 -2 , posiblemente hasta 3 días.

Ejemplo 9

Amplificación altamente sinérgica de células T CD8+ citotóxicas al combinar ADAS y administración de la IL-15 formada en complejo.

Los inventores han mostrado que la inyección de la IL-2 formada en complejo (IL-2cx = IL-2 murina formada en complejo con un anticuerpo que bloquea la unión de IL-2 a su receptor de alta afinidad CD25) en los días 1, 2 y 3 después del cebado con MARX10-OVA (2 |jg) y poli I:C (10 |jg) en el día 0, no elevó sustancialmente el número de células T CD8+ cebadas en el día 6. Sin embargo, cuando los animales se cebaron con MARX10-OVA (2 jg ) y poli I:C (10 jg ) en el día 0 y se sometieron a ADAS (inyección de 10x106 esplenocitos cargados con SIINFEKL junto con 50 jg de poli I:C) en el día 5, la inyección de IL-2cx en los días 6, 7 , 8 y 9 elevó notablemente el número de células T CD8+ específicas de SIINFEKL en el bazo en el día 10 (Ejemplo 4 y Figura 4).

Sin ADAS, la inyección de IL-2cx en los días 6, 7, 8 y 9 no elevó sustancialmente el número de células T CD8+ específicas de SIINFEKL en el bazo (no mostrado), pero fue eficaz en reducir una carga tumoral. Obviamente, el procedimiento ADAS reactiva las células T CD8+ cebadas de tal manera que se vuelven altamente sensibles a la acción de la IL-2cx y esto da por resultado una fuerte expansión de células T CD8+ citotóxicas. Sin embargo, el mecanismo molecular exacto que conduce a esta sensibilidad altamente elevada a IL-2cx sigo siendo indeterminada.

Los animales C57BL/6 se cebaron en el día 0 con 2 jg de MARX10-OVA y 10 jg de poli I:C y se sometieron a ADAS (inyección de 10x106 esplenocitos cargados con SIINFEKL junto con 50 jg de poli I:C) en el día 5. Como se describe en lo anterior, el procedimiento ADAS elevó el nivel de las células T CD8+ específicas de SIINFEKL de aproximadamente 200.000 en el día 5 a aproximadamente 2 x 106 células después de ADAS en el día 10 (Fig. 9). Los animales tratados con ADAS luego se inyectaron en los días 6, 7 y 8 con IL-15 formada en complejo (IL-15cx), o para comparación con IL-2cx (como se describe en lo anterior). El día 9, el número total de células T CD8+ específicas de SIINFEKL se determinó en el bazo utilizando citometría de flujo. Como puede observar en la Fig. 9, la inyección repetida de IL-15cx fue similarmente eficaz a la inyección repetida de IL-2cx en la amplificación en gran medida el número de células T CD8+ específicas de SIINFEKL después del procedimiento ADAS. IL-15cx se puede inyectar, como IL-2cx, i.v., s.c., i.p., o en un tumor para lograr este efecto. La inyección de IL-15cx también incrementó los niveles celulares de la granzima B y la expresión de KLRG1, indicando la citotoxicidad aumentada (no mostrada).

Sorprendentemente, este experimento reveló de esta manera que IL-15cx podría amplificar en gran medida los niveles de las células T CD8+ específicas de antígeno activadas con ADAS, similar a la acción de IL-2cx. A partir de este experimento se puede deducir que todos los casos en los cuales la inyección de IL-2cx fue benéfica para el aumento de la respuesta inmunitaria citotóxica (como se describe en lo anterior) también IL-15cx será eficaz.

Ejemplo 10

El procedimiento ADAS se puede utilizar para reactivar y expandir las células T CD8+ de memoria en una manera específica de antígeno.

Con animales sin tratamiento previo, que se cebaron con 2 jg de MARX10-OVA y 10 jg de poli I:C en el día 0, lo inventores mostraron que ADAS es más bien ineficaz para la amplificación de la respuesta cuando se llevó a cabo en el día 3, pero se volvió eficaz después, y continúa siendo eficaz a un cierto grado al menos hasta el día 20 (Ejemplo 3 y Figura 3), y es más eficaz entre los días 4 y 9 en los ratones.

En estos experimentos, ADAS se utilizó para amplificar las células T CD8+ específicas de antígeno sin tratamiento previo recientemente activadas. El hecho de que ADAS solo funciona óptimamente en cierta ventana de tiempo después de la activación primaria de las células T CD8+ indicó que estas células T deben estar en una etapa de activación particular a fin de ser sensibles para la amplificación de ADAS.

Por lo tanto los inventores se preguntaron si ADAS también se podría llevar a cabo en células T CD8+ de memoria en reposo, que tienen un estado de activación claramente diferente comparado con las células T CD8+ recién activadas. Para este fin, ratones C57BL/6 se transfirieron adoptivamente en el día -1 con 2.000 o 10.000 de células T OT-I CD8+, que portan un receptor de células T específico para SIINFEKL presentado en el contexto de H-2Kb. Estas células T OT-I transferidas portaron el marcador genético Thy1.1 (CD90.1), lo cual hizo posible discriminarlas de las células T endógenas (comparar Dorner et al., 2009). En el día 0, los animales se cebaron con MARX10-OVA junto con 10 jg de poli I:C. ADAS (inyección de 10x106 esplenocitos cargados con SIINFEKL junto con 50 |jg de poli I:C) se llevó a cabo en el día 5, dando por resultado una frecuencia de 30% de células T OT-I de todas las células T CD8+ en el bazo en el día 10 para ambos grupos de animales adoptivamente transferidos (Fig. 10A). Cuando los animales de los mismos grupos experimentales se analizaron en el día 40, la frecuencia de sus células T OT-I CD8+ ha disminuido a 1-2%, como es esperado (Fig. 10A). En el día 69 se llevó a cabo otra amplificación por ADAS (inyección de 10x106 esplenocitos cargados con SIINFEKL junto con 50 jg de poli I:C) y la frecuencia de células OT-I T se determinó en el bazo 5 días después (día 74). A través de la amplificación por ADAS, la frecuencia de las células OT-I T nuevamente se elevó a 30-60% de todas las células T CD8+ en el bazo.

En todos los animales adoptivamente transferidos con células OT-I T, los inventores también analizaron la respuesta de las células T CD8+ endógenas, puesto que esto se puede identificar como células T CD8+ negativas para el marcador Thy 1.1, pero la tinción con el tetrámero SIINFEKL-. Como se puede observar en la Fig. 10B, las células T CD8+ reactivas SIINFEKL endógenas mostraron un comportamiento similar a las células OT-I T. En particular, el procedimiento de ADAS podría amplificar altamente las células T de memoria específicas de SIINFEKL endógenas y estas células T portaron todos los marcadores fenotípicos típicos de las células T CD8+ citotóxicas (positividad de granzima B, expresión de KLRG1, datos no mostrados).

Estos experimentos determinaron que el procedimiento de ADAS puede reactivar y expandir masivamente las células T CD8+ de memoria en reposo en una manera específica de antígeno, de modo que nuevamente se vuelven efectores citotóxicos CD8+. Puesto que el procedimiento ADAS genera un estado de células T en las cuales son sensibles a IL-2cx e IL-15cx, ambas preparaciones de citocinas aumentarán en gran medida la respuesta de las células T CD8+ de memoria a ADAS.

En resumen, el ADAS no solo puede amplificar las células T CD8+ sin tratamiento previo recientemente activadas en una manera específica de antígeno en una cierta ventana de tiempo después de la activación, sino también las células T CD8+ de memoria en reposo.

Ejemplo 11

ADAS también es eficaz con las células T CD8+ adoptivamente transferidas, activadas in vitro

En la terapia de células T adoptivas, las células T CD8+ específicos de antígeno (por ejemplo, células T dirigidas a los antígenos CMV o cualquiera de otros antígenos patogénicos o células T dirigidas a agentes tumorales definidos) se enriquecen de las PBMC de un paciente. Esto se hace, por ejemplo, utilizando la captura de secreción de IFN-y después de la estimulación in vitro de las PBMC con un péptido o proteína antigénico de este patógeno (por ejemplo, CMV) o tumor, combinado con clasificación celular magnética. Las células T CD8+ específicas de antígeno enriquecidas luego se estimulan adicionalmente por la adición del antígeno entero o, más frecuente, antígeno peptídico, y luego se expanden in vitro. Después de la expansión, las células T CD8+ activadas luego se vuelven a inyectar en el paciente a fin de lograr el efecto terapéutico deseado (eliminación del patógeno o tumor). Actualmente, las células T CD8+ reinyectadas tienen una vida útil corta in vivo, su capacidad para secretar IFN-y se limita y su potencial citotóxico es subóptimo. Los inventores encontraron que esta desventaja de la terapia con células T adoptivas se puede mejorar muy sustancialmente utilizando el procedimiento ADAS.

Los esplenocitos de ratones OT-I se activaron in vitro con el péptido SIINFEKL durante 3 días, sin adyuvante. Esta activación de células T CD8+ sin embargo, también se podría hacer en presencia de un adyuvante Th1. Después del cultivo, las células (en este momento compuestas de 97% de células OT-I CD8+T) se transfirieron en ratones C57BL/6 singénicos en el día 0. El ADAS (inyección de 10x106 esplenocitos cargados con SIIFEKL y 50 jg de poli I:C i.v.) se aplicó en cualquier día 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El ADAS en los días 1, 2 o 3 no tuvo ningún efecto significativo en la frecuencia de las células T CD8+ adoptivamente transferidas en los animales hospederos. La clara amplificación de las células T CD8+ transferidas podría, sin embargo, ser observada con el ADAS aplicado en el día 4, y la amplificación óptima se observó con ADAS en el día 5 (Fig. 11). Al mismo tiempo, la expresión del marcador de superficie KLRG1, indicativo de la maduración de las células T CD8+ transferidas a las células efectoras, se elevó de 30-40% con ADAS en el día 1 a 80-90% en los días 5 y 6. Estos datos muestran la conclusión de que el procedimiento ADAS es capaz de amplificar en gran medida una población de células T CD8+ específicas de antígeno activadas in vitro y adoptivamente transferidas. Al mismo tiempo, el ADAS induce una diferenciación adicional de estas células T CD8+ a las células efectoras citotóxicas. El punto de tiempo óptimo para ADAS puede diferir en el humano, puesto que los experimentos en los ratones no permiten una predicción precisa en el humano. De esta manera, el período para los efectos ADAS óptimos en las células T CD8+ adoptivamente transferidas pueden ser más extendidas, por ejemplo, hasta 12 o 14 días. También se puede anticipar que ADAS no es solo eficaz dentro del marco de tiempo corto después de la transferencia adoptiva de 0 h a 14 días, sino también cuando las células T CD8+ adoptivamente transferidas han regresado al estado de memoria después de un período de tiempo prolongado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un medicamento que comprende una célula presentadora de complejo mayor de histocompatibilidad cargada con péptido de clase I (MHC-I), la cual es una célula PBMC, para uso en un método para extender una respuesta inmunitaria citotóxica celular contra una proteína que comprende antígeno para tratar profilácticamente o tratar un tumor o una infección, el método que comprende el paso de:

en donde el reactivador del paso i) se administra sólo una vez, y se administra en un marco de tiempo de 5 días a 9 días después de que las células T se activaron contra un antígeno, y

en donde el reactivador se administra por inyección i.v.

2. El medicamento para uso de la reivindicación 1, en donde en el paso i), se administra además lo siguiente: IL-2 que se une de manera no covalente a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo el cual bloquea su unión a la cadena del receptor de IL-2 de alta afinidad CD25 (IL-2 formada en complejo).

3. El medicamento para uso de la reivindicación 2, en donde la interleucina 2 formada en complejo se administra repetidamente.

4. El medicamento para uso de la reivindicación 2, en donde la interleucina 2 formada en complejo se administra 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 veces.

5. El medicamento para uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la interleucina 2 formada en complejo se administra cada 1 o 2 días.

6. El medicamento para uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la interleucina 2 formada en complejo se administra repetidamente durante 5 días a 1 mes.

7. El medicamento para uso de la reivindicación 6, en donde la interleucina 2 formada en complejo se administra repetidamente durante 1 a 2 semanas.

8. El medicamento para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el péptido derivado de la proteína que comprende el antígeno tiene una longitud de 8, 9 o 10 aminoácidos.

9. El medicamento para uso de la reivindicación 1 u 8, en donde el péptido derivado de la proteína que comprende el antígeno es un péptido presentado por un MHC-I.

10. El medicamento para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el péptido derivado de la proteína que comprende el antígeno es un péptido presentado por el alelo de MHC-I HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-B7, HLA-B35, HLA-A24, o HLA-A30.

11. El medicamento para uso de la reivindicación 10, en donde el péptido derivado de la proteína que comprende el antígeno es un péptido presentado por el alelo de MHC-I HLA-A2.

12. El medicamento para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el paciente es un humano.

13. El medicamento para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el adyuvante el cual soporta una respuesta mediada por Th-1 y que es una señal de peligro se selecciona de un agonista de RIG-I, y un ligando de TLR, tal como resiquimod (R848), poli ICLC y ácido poliinosínico:policitidílico (poli I:C).