CN106794230A - 用于诱导或延长细胞之细胞毒性免疫应答的方法的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物，其用于诱导细胞之细胞毒性免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：i)向患者施用递送系统，所述递送系统包含：(a)与树突细胞表面上的受体结合的分子，(b)与(a)的分子结合的包含抗原之蛋白质和(c)第一佐剂，其中在(a)的分子与所述受体结合后，(b)的蛋白质被内化并在所述树突细胞中被加工，并且包含在所述蛋白质中的所述抗原被呈递到所述树突细胞的表面上，从而活化所述患者中的T细胞；以及ii)向所述患者施用选自以下的再活化剂：(d)复合的白介素‑2(IL‑2cx)、(e)加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC‑I)呈递细胞和第二佐剂，以及(f)(d)和(e)的组合，其中所述肽来自于步骤i)中所限定的包含抗原之蛋白质，从而使步骤i)中活化的T细胞再活化，其中步骤ii)的再活化剂在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天的时间框架内施用。
Description
技术领域
本发明涉及药物，其用于诱导细胞之细胞毒性免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：
i)向患者施用递送系统，所述递送系统包含：(a)与树突细胞表面上的受体结合的分子，(b)与(a)的分子结合的包含抗原之蛋白质和(c)第一佐剂，其中在(a)的分子与所述受体结合后，(b)的蛋白质被内化并在所述树突细胞中被加工，并且包含在所述蛋白质中的所述抗原被呈递到所述树突细胞的表面上，从而活化所述患者中的T细胞；以及
ii)向所述患者施用选自以下的再活化剂：(d)复合的白介素-2(complexedinterleukin 2，IL-2cx)、(e)加载肽的I类主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex class I，MHC-I)呈递细胞和第二佐剂，以及(f)(d)和(e)的组合，其中所述肽来自于步骤i)中所限定的包含抗原之蛋白质，从而使步骤i)中活化的T细胞再活化，
其中在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天的时间框架(time frame)内施用步骤ii)的再活化剂。
免疫系统通过多种机制对身体提供针对病原体和肿瘤细胞的保护。为了正常工作，它必须区分“自己”和“异己”(病原体/肿瘤)。它检测多种病原体(包括细菌、病毒、寄生虫、真菌和毒素)并与其斗争。脊椎动物(例如人)的免疫系统由在动态网络中相互作用的许多类型的蛋白质、细胞、组织和器官组成。作为这种复杂的免疫应答的一部分，脊椎动物的免疫系统随时间适应以更有效地识别特定的病原体。适应过程产生免疫记忆并使将来遇到这些病原体时有更有效的保护。疫苗接种基于这种获得性免疫的过程。
树突细胞(dendritic cell，DC)构成免疫系统的一部分。它们的主要功能是加工抗原物质并在它们的表面上将其呈递至免疫系统的其他细胞上，从而充当抗原呈递细胞。
T辅助细胞(也称为效应T细胞或Th细胞)也是免疫系统中的重要成员，因为它们在建立和最大化免疫系统的能力中发挥基础性作用。Th细胞参与活化和指导其他免疫细胞。它们在确定B细胞抗体类别转换、活化和扩增细胞毒性T细胞以及最大化吞噬细胞(例如巨噬细胞)的杀菌活性中是必需的。正是这种功能的多样性以及它们在影响其他细胞中的作用使其取得T辅助细胞的这一名称。发展成效应T细胞的增殖辅助T细胞分化为两种主要细胞亚型，称为Th1和Th2细胞(也分别称为1型和2型辅助T细胞)，其中Th2细胞主要促进体液免疫系统(刺激B细胞增殖、诱导B细胞抗体类别转换和提高抗体产生)，而Th1细胞则主要促进细胞免疫系统(使巨噬细胞和细胞毒性CD8+T细胞的杀伤效力最大化)。根据入侵病原体的性质，免疫系统产生Th1或Th2免疫应答。在Th1免疫应答的情况下，CD8+T细胞显示出分化为细胞毒性T细胞的强烈倾向。同时，Th1免疫应答的CD8+和CD4+辅助T细胞两者均分泌大量的IFN-γ(以及另一些Th1细胞因子/趋化因子)并在小鼠中主要引起产生IgG2a和IgG2b同种型的抗体并且在人中主要产生IgG同种型的抗体。Th1免疫应答对于对身体提供针对病毒、(细胞内)细菌和肿瘤的防御特别有效。
目前针对活的、减毒的或灭活的致病组分可用的疫苗和佐剂系统主要引发抗体免疫应答，但并不引发有效的Th1细胞毒性应答(Steinman等，2007，Nature 449，419-26)。被诱导出的抗体与病原体的组分结合，因此使其在生物学上失活(“中和抗体”)。然而，存在许多疾病，其中中和抗体不足以保护免受疾病或控制所述疾病并且目前的疫苗技术不太有效。这些是对于抑制和/或根除感染可需要有效的Th1免疫应答的疾病。实例是肺结核、疟疾、利什曼原虫、朊病毒病、正黏病毒(orthomyxovirus)以及特别是流感、甲型肝炎、乙型肝炎、人免疫缺陷病毒(HIV)和其他慢病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒、乳头瘤病毒、布尼亚病毒(bunyavirus)、杯状病毒、丝状病毒、黄病毒(flavivirus)以及特别是丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒、副黏病毒、多种呼吸道病毒以及需要有效的Th1免疫应答(且特别是Th1细胞毒性应答)抑制和根除的其他病毒。因此非常希望开发诱导这样的有效Th1应答的疫苗接种方法。此外，靶向“交叉呈递”机制(见下文)对于针对病毒、细菌、寄生虫和真菌病原体诱导Th1免疫应答极其重要，因为在感染的过程中，树突细胞通常并不直接被感染。若不发生Th1免疫应答，人体中许多病毒、细菌、寄生虫或真菌感染则不能被抑制或根除。
在WO 2009/065561中已发现，可以选择性地靶向在诱导Th1应答中发挥主要作用的细胞。发现趋化因子(C基序)受体1(XCR1)存在于专职抗原呈递细胞(特别是树突细胞(DC))的表面上，并且可用于选择性地将物质递送到这些细胞中。物质向带有XCR1的DC的靶向递送使得在哺乳动物/人中诱导强大的Th1免疫反应。目前的疫苗主要针对Th2抗原呈递途径且主要导致产生Th2型(中和)抗体和免疫反应。特别地，通过靶向至带有XCR1的DC，可以针对给定的免疫原引发Th1型体液和细胞(细胞毒性)免疫反应。可以预期NK细胞、CD8+T细胞和Th1CD4+T细胞参与该反应，但是其他CD4+T细胞也可有助于这种类型的反应。可以选择性地将佐剂(单独的或与免疫原或任何药物化合物组合)靶向至带有XCR1的抗原呈递细胞(APC)。
在外周中，免疫系统一方面必须区分有害的外来或自身抗原，另一方面必须区分危险的(病毒、细菌、真菌、寄生虫、毒素样)抗原。抗原被DC摄取并分解为肽(“加工”)。所得的肽在MHC I类或MHC II类的情况下“呈递”至T淋巴细胞(T细胞)。在MHC II类的情况下，T细胞的CD4+亚群识别抗原，在MHC I类的情况下，T细胞的CD8+亚群识别抗原。伴随着抗原的摄取，DC能够通过一大组“危险信号”识别受体(例如，toll样受体、NOD样受体)感测抗原是否具有危险性或它是否无害。通过“危险信号”识别受体(也称为“模式识别受体”)所识别的模式通常是微生物特有的分子结构。在微生物的情况下，这些可以是细胞壁组分(例如，脂多糖、肽聚糖)或核酸修饰物(例如，非甲基化的CpG基序)或者病毒DNA或病毒RNA(例如，双链RNA)特有的结构特征和修饰物。另外，体内死于凋亡的细胞释放能够触发“危险信号”识别受体的分子(例如，高速泳动族蛋白B1(High Mobility Group Protein B1)、热休克蛋白)。
在危险的抗原的情况下，DC活化特异性应答程序(“成熟”)。抗原被呈递至CD4+和CD8+T细胞，其同时接收到表明所述抗原的危险性质的DC额外信号。结果，两个T细胞亚群被活化、以延长的寿命广泛扩增并发展为“效应T细胞”。这些可以是为免疫系统的其他DC或B细胞或其他细胞提供“帮助”的CD4+T细胞，或者甚至可以是CD4+细胞毒性细胞。在CD8+T细胞亚群中，再次产生T辅助细胞，但是大部分的CD8+T细胞变成效应细胞，其能够通过分泌IFN-γ和其他可溶性因子或通过杀伤被感染的体细胞消除入侵的病原体。由于T细胞对B细胞的帮助，抗原特异性B细胞分化为针对抗原(病原体)分泌抗体的浆细胞。这些抗体通过许多机制(例如中和、改善抗原摄取、调理作用、补体结合)帮助对抗病原体。
一定数量的效应CD4+和CD8+T细胞在针对病原体之免疫应答的急性期存活下来，并成为长寿命的“记忆T细胞”。在重新暴露于相同的病原体(抗原)时，记忆T细胞和长寿命的浆细胞协同合作组织(orchestrate)非常快速的免疫应答使免疫系统非常有效地消除病原体(抗原)。T细胞和B细胞在重新暴露于相同的病原体后的这种增强的免疫应答的能力称为“免疫”，诱导免疫的抗原是“免疫原性的”。
总之，免疫系统的T细胞划分含有CD4+T细胞和CD8+T细胞。在初始的生物体中，仅几百个CD4+或CD8+T细胞识别给定的抗原。只要它们还没有遇到抗原，T细胞处于初始状态并且不能发挥效应物功能。初始CD4+和CD8+T细胞只能通过可溶性蛋白或多肽抗原由APC活化，在MHC的情况下，其被APC摄取、加工并“呈递”到细胞表面上。初级抗原暴露的来源可以是可溶性蛋白或多肽或任何类型的疫苗，例如减毒的感染原、编码期望抗原蛋白质或肽的病毒或细菌载体，或编码抗原蛋白质或肽的DNA或RNA表达载体。在危险的信号的情况下，对抗原的初级暴露的结果是在几天内将存在“致敏(primed)”CD4+和CD8+T细胞群。
当蛋白质抗原被靶向到APC中时，它将被降解(“加工”)成肽并且这些肽在MHC-II(经典呈递)和MHC-I(“交叉呈递”)的情况下被呈递到APC的表面上。在MHC-II的情况下，初始CD4+T细胞识别其肽抗原，在MHC-I的情况下，初始CD8+T识别其肽抗原。它们被活化、增殖并获得效应物功能。如果肽在“危险信号”的情况下由DC呈递，则扩增的CD8+T细胞将分化为细胞毒性T细胞。只有专职的APC能够在初始CD8+T细胞中诱导这种细胞毒性功能(“致敏”、“初次免疫”)。一旦CD8+T细胞获得其细胞毒性潜力，在MHC-I的情况下它们将能够杀伤体内表达相同肽的细胞。因此，它们将杀伤被给定感染原感染的细胞或肿瘤细胞。
由能够呈递抗原的细胞摄取的抗原不仅在MHC-I(“交叉呈递”)的情况下呈递，而且在MHC-II(“经典呈递”)的情况下呈递。因此，任何与危险信号一起递送到抗原呈递细胞中的抗原将不但活化CD8+T细胞，而且也活化CD4+T细胞。CD4+T细胞将分化为分泌TNF-α和IFN-γ的Th1 T细胞，有的也将发展为细胞毒性T细胞。
可通过提供可溶性抗原或者通过将抗原直接或间接靶向到APC(B细胞、巨噬细胞、DC)中并且特别是初始宿主的XCR1+DC中来实现初级CD8+T细胞活化。通过在不是APC但在体内可将抗原交给APC(特别是XCR1+DC)的细胞中提供抗原来实现间接靶向。当抗原与“危险的信号”(例如LPS、聚I：C、CpG等)一起施用时，这将诱导初级CD8+T细胞的细胞毒性免疫。
通过(在危险信号的存在下)宿主的抗原性再攻击可预期类似的早期T细胞活化，所述宿主之前已用抗原致敏并且其抗原特异性CD8+T细胞和CD4+T细胞处于未活化的记忆状态。
在其中带有不能由宿主清除的低度慢性感染(例如，CMV、HCV、HIV)的宿主中可以预期类似的T细胞活化。
抗原可靶向到APC中。可通过与APC上的表面结构结合的单克隆抗体(mAb)或抗体片段，或通过与APC表面上的受体结合的任何配体来介导该靶向。这些配体可以是糖部分(sugar moiety)、趋化因子、可溶性蛋白配体或使抗原内化到APC中的任何其他结构。由任意DC摄取的抗原在MHC-I和MHC-II两种情况下呈递。相对于抗原应用的其他模式，将抗原直接或间接地靶向到树突细胞(DC)中显著地改善了交叉呈递。可通过将抗原靶向到XCR1+ DC中来实现最好的交叉呈递，并因此致敏CD8+T细胞(Bachem等2010，J Exp Med 207，1273-1281，Bachem等，2012，Front Immunol 3，214；Caminschi等，2013，Radford等，2013，Kreutz等2013)。
在危险信号(其也是第一佐剂)的情况下有效致敏CD8+T细胞之后，这些细胞毒性T细胞将占CD8+T细胞库的约1％至5％，并表现出显著的细胞毒性潜力。例如，所获得的细胞毒性可对宿主提供针对病原体(抗原从其来源)的保护，并且这种保护水平对于新形成的癌性组织也是有效的(图2B)。
然而，当试图针对给定的抗原建立长期免疫时或针对迫在眉睫的感染提供高水平的细胞毒性保护或者针对已建立的肿瘤提供高水平的细胞毒性时，通过初次致敏初始CD8+T细胞诱导的细胞毒性潜力或CD8+T细胞的再活化可不足。在这些情况下，必需进一步扩增已活化的抗原特异性CD8+T细胞。
识别在MHC-I的情况下表达的抗原后，CD8+T细胞被活化，从头表达或强烈上调多种细胞表面分子，例如CD69、4-1BB、ICOS、CD25、CD40L、OX40并在小鼠中增殖多至约8天(在人中该时间框架可以有所不同)。此后，初级活化的CD8+T细胞在约2至3周逐渐恢复到静息的“记忆”状态。同时，扩增的抗原特异性T细胞群强烈地缩小。一定比例的CD8+T细胞将在该缩小过程中存活下来，并且将成为记忆T细胞(Cui等，2010，Immunol.Rev.236，151-166)。
经典的疫苗接种方案可分为初次致敏步骤，然后是一次或几次“加强”。加强的原理是基于已经历初次活化的下调或已经回复到静息状态的最初扩增的B细胞或T细胞的从头活化。
本发明的问题在于，与现有技术相比，提供用于诱导细胞之细胞毒性免疫应答的方法和/或延长细胞之细胞毒性免疫应答的方法中的改进的药物。
通过本发明解决了该问题。
在一个实施方案中，本发明涉及药物，其用于诱导细胞之细胞毒性免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：
i)向患者施用递送系统，所述递送系统包含：(a)与树突细胞表面上的受体结合的分子，(b)与(a)的分子结合的包含抗原之蛋白质和(c)第一佐剂，其中在(a)的分子与所述受体结合后，(b)的蛋白质被内化并在树突细胞中被加工，并且包含在所述蛋白质中的所述抗原被呈递到树突细胞的表面上，从而活化所述患者中的T细胞；以及
ii)向所述患者施用选自以下的再活化剂：(d)复合的白介素-2(IL-2cx)、(e)加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂，以及(f)(d)和(e)的组合，其中所述肽来自于步骤i)中所限定的包含抗原之蛋白质，从而使步骤i)中活化的T细胞再活化，
其中在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天的时间框架内施用步骤ii、)的再活化剂。
在一个优选的实施方案中，所述药物用于人。
所述患者优选哺乳动物患者，更优选人患者。所述患者可患有感染或肿瘤，或者，在预防性治疗的情况下，不患有感染或肿瘤，但是将被保护免受各自的感染或肿瘤疾病。
在另一个优选的实施方案中，树突细胞表面上的受体是树突细胞表面上的人受体。
干扰通过抗原初次活化或再活化CD8+T细胞在数天内变得有效的下调机制，可能在短时间内提供强的T细胞的细胞毒性。为了防止CD8+T细胞应答的这种下调，我们推断我们必须在初次活化或再活化后的短时间内提供包括CD8T细胞上的T细胞受体复合物和/或合适的生长因子的其他刺激。这个观念违背了教导在短时间内通过T细胞受体反复活化T细胞将导致“活化诱导的细胞死亡”的现有信条(Gorak-Stolinska等，2001，J Leukoc Biol70，756-766)。
为了测试我们观念，在支持Th-1应答的第一佐剂(聚I：C、LPS、CpG或等同物)的存在下，通过将抗原靶向到XCR1+DC中而免疫接种(“致敏”)C57BL/6小鼠。对于用于这种初次免疫接种的抗原，我们使用模型抗原卵清蛋白(OVA)或来自于卵清蛋白的肽序列(SIINFEKL(SEQ ID NO：11))。已知该肽序列在由被靶向的APC加工OVA后，在C57BL/6小鼠的MHC-I的情况下优先呈递。对于该初次免疫接种，蛋白质OVA或肽SIINFEKL(SEQ ID NO：11)与XCR1特异性的单克隆抗体(mAb)或与XCR1结合的趋化因子配体XCL1重组融合，如前所述(WO 200/065561)。在此致敏步骤之后的不同时间点(3至20天)，将小鼠再次暴露于抗原。我们没有将蛋白质或肽注入宿主中，因为我们预期任一过程将导致在MHC-I的情况下在宿主细胞上呈递抗原肽，然后其将被已活化的抗原特异性CD8+T细胞杀伤(对比图1A)，一个非常不期望的效果。相反，从C57BL/6小鼠分离同基因(syngeneic)脾细胞，在体外与肽SIINFEKL(SEQ IDNO：11)孵育(“加载”MHC-I)、洗涤并i.v.注射到之前已致敏的小鼠中。
出乎意料地，并且与当前的知识相反，当CD8+T细胞再次暴露于抗原的窄时间框架内，我们用这种方案可实现抗原特异性CD8+T细胞数量的扩增。当再次暴露非常早(在第3天)时，没有观察到扩增，当在初始CD8+T细胞活化的第9天重新暴露于抗原时，观察到非常有限的扩增(图3)。将加载SIINFEKL的同基因脾细胞单独注入到致敏的动物中不扩增致敏的CD8+T细胞群，只有当共施用第二佐剂(聚I：C、LPS、CpG或等同物)以提供“危险”信号时，才能达到期望的效果。当在最佳时间点注射加载肽的脾细胞时，抗原反应性CD8+T细胞群扩增约10倍，从致敏后无扩增的0.2×106至扩增的2×106个细胞(图4)。这些表达高水平效应分子(例如颗粒酶B(Granzyme B)、穿孔蛋白、TNF-α和IFN-γ)之扩增的CD8+细胞参与CD8+T细胞防御感染原或根除肿瘤。在人中，初始T细胞活化扩增的最佳时间框架可与小鼠中的最佳时间框架不同(初始CD8+T细胞活化后约5至8天)。
当比较不同的扩增时间点时，很明显，在初始致敏后5至8天再次暴露于抗原得到最高程度的CD8+T细胞扩增和在CD8+T细胞中最高表达的细胞毒性效应分子(TNF-α、IFN-γ、颗粒酶B、穿孔蛋白)。第5至8天是通过静止息CD8+T细胞识别抗原后的较早时间点，因此在这样的时间点T细胞仍然被强烈地活化。因此，这种扩增并不代表经典的加强系统。相反，这种类型的扩增的提供使T细胞继续其初始活化和扩增阶段的信号，而不是进入通常的下调和缩小阶段。因为这种特殊的作用，当与佐剂一起施用时，我们将这种扩增称之为“抗原依赖性扩增系统”(Antigen-Dependent Amplification System，ADAS)。
因此，根据本发明，“抗原依赖性扩增系统”或“ADAS”理解为涉及向患者施用再活化剂的本发明的第二步骤ii)，其中所述再活化剂是加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂，并且其中所述肽来自于本发明的步骤i)中限定的包含抗原之蛋白质，从而使步骤i)中活化的T细胞再活化。任选地，在ADAS中的再活化剂还包含复合的白介素-2(IL-2cx)。
为了检查ADAS效力的细胞需求，对多种淋巴细胞群(脾细胞、B细胞、T细胞和DC)体外加载SIINFEKL(SEQ ID NO：11)进行了比较并在最佳的时间框架内(第5天)将其与第二佐剂(聚I：C、LPS、CpG，或等同物)一起注入小鼠。本实验确定所有表达MHC-I的这些淋巴细胞群均能够提供继续CD8+T细胞的初始活化、扩增和功能分化为细胞毒性效应细胞所必需的信号(图3B)。而在第10天的单独致敏导致在脾CD8 T细胞群中产生1％至5％的抗原特异性CD8+T细胞，应用ADAS将该频率提高到约15％至25％。
从得到的结果可以得出结论，在体内ADAS将与能够在淋巴细胞或者甚至非淋巴细胞的表面上提供足够高密度的加载肽的MHC-I分子的任何系统一起起作用。除了在体外用肽外部加载MHC-I分子，人们可考虑这样的系统，其中将细胞在体外与整个包含抗原之蛋白质一起培养，使细胞加工抗原并在MHC-I的情况下呈递抗原肽。人们也可考虑这样的系统，其中将细胞在体外暴露于能够感染细胞的病毒系统，导致在MHC-I的情况下表达大量的肽。此外，可用编码给定蛋白质或肽序列的表达载体转染带有MHC-I的细胞，同样导致在MHC-I的情况下高效呈递肽。
因为递送至APC的全抗原不仅在MHC-I的情况下呈递至CD8+T细胞，而且在MHC-II的情况下呈递至CD4+T细胞，ADAS还可用于扩增CD4+T细胞应答。对于这种特定的扩增，用于ADAS的细胞必须在细胞表面上表达MHC-II分子，MHC-II分子将加载有适当的肽。这种加载可通过外部暴露于合适的肽完成，或可通过编码给定的蛋白质或肽序列的表达载体转染带有MHC-II的细胞，同样导致在MHC-II分子的情况下高效呈递肽。
虽然我们通过i.v.注射施用ADAS，但是施用加载肽的细胞的其他途径也可以。这可通过皮下、皮内、肌内注射、腹膜内、鞘内或通过直接注射到肿瘤组织中来完成。
因此，本发明步骤ii)的再活化剂的施用可通过已知的施用方法进行，特别是选自：皮下(s.c.)、皮内、i.v.、肌内注射、腹膜内、鞘内或通过直接注射到肿瘤组织中，更优选通过i.v.或s.c.注射。
另外，本发明步骤i)的递送系统的施用可通过已知的施用方法进行，特别选自皮下、皮内、i.v.、肌内注射、腹膜内、鞘内、施用到肺部，或者通过直接注射到肿瘤组织中，更优选通过i.v.和s.c.注射。
与树突细胞表面上的受体结合的分子、(b)与(a)的分子结合的包含抗原之蛋白质以及(c)第一佐剂优选作为单一药物制剂施用。这样的药物制剂优选为还可含有可药用赋形剂(如缓冲化合物)的液体。这样的药物制剂优选是灭菌的。
用于肌内施用的步骤i)的递送系统的剂量体积优选多至约5mL，例如0.3mL至3mL、1mL至3mL、约0.5至1mL或约2mL。在各个剂量中活性成分的量应足以提供治疗或预防。在一些不同的实施方案中，待递送的物质的单位剂量应为多至5μg物质/kg体重，约0.2至3μg、约0.3至1.5μg、约0.4至0.8μg，或者约0.6μg。在一些替代的实施方案中，单位剂量可以是多至约6μg物质/kg体重，约0.05至5μg，或约0.1至4μg。每剂蛋白质的代表量为约1μg至约1mg，更优选约5μg至约500μg，还更优选为约10μg至约250μg，并且最优选约25μg至约100μg。
在步骤ii)中待施用的包含加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂之再活化剂的细胞的数目可以改变，并且通常为1×106至400×106个细胞，优选为1×106至200×106个细胞。
作为再活化剂的复合的IL-2优选作为溶液施用和/或以1μg/kg体重至200μg/kg体重、更优选1μg/kg体重至50μg/kg体重、甚至更优选的1μg/kg体重至20μg/kg体重的剂量施用，其中所述量是指组合物中的IL-2含量。
虽然我们在抗原靶向到XCR1+DC后测试了ADAS的效果，但是人们可以从我们的结果中得出结论，即，可用ADAS过程来扩增通过体内T细胞受体触发而导致显著初始活化(“致敏”)或再活化CD8+T细胞和/或CD4+T细胞的任何系统。
为了扩增T细胞和NK细胞群，在过去已经使用了淋巴因子IL-2并且示出其是有效的，当以“复合的”形式(即，与抗体结合)提供时，阻断其与高亲和力IL-2受体链(CD25，Boyman等，2006年，Science 311，1924-1927)的结合。
根据本发明，“复合的IL-2”或“IL-2cx”理解为与结合分子(特别是阻断其与高亲合力IL-2受体链(CD25)结合的抗体或抗体片段)非共价结合的IL-2。在一个优选的实施方案中，所述抗体是人源化的或人的。在一个优选的实施方案中，IL-2是人IL-2。IL-2可使用适当的宿主合成地或重组地合成，更优选IL-2重组地制备。
我们在通过将抗原靶向XCR1+DC中在我们的活化T细胞的系统中测试了复合的IL-2(IL-2cx)。与预期相反，在致敏T细胞应答后，单独应用IL-2cx并不显著提高抗原特异性CD8+T细胞的数量(图4)。在第5天单独应用ADAS将抗原特异性CD8+T细胞的数量从单独致敏后的约0.2×106个提高至约2×106个，因而提高约10倍，如上所述。然而，非常出人意料的是，当在ADAS的情况下应用时，IL-2cx将抗原特异性CD8+T细胞的扩增非常强烈地提高至约100×106至200×106个抗原特异性CD8+，即，约50至100倍。这种高度协同作用表明当以复合的形式应用IL-2时，ADAS为IL-2的生物效应创建了有利条件。ADAS和IL-2cx的组合将初始致敏放大到这样的程度：现在所有脾脏免疫细胞的大部分由抗原特异性CD8+T细胞构成。当进一步检查时，该大规模扩增的T细胞群表达颗粒酶B至约60％至70％，表明高细胞毒性潜力。
为了测试在不同条件下扩增的CD8+T细胞的细胞毒性能力，我们选择了肿瘤模型，其中将高侵袭性OVA-转染的肿瘤系(tumor line)s.c.注射到同基因C57BL/6小鼠中，并使其生长6天以达到基本尺寸(约20mm2)。从第6天开始，小鼠组不处理，或者通过不同的方案处理。通过将OVA靶向到XCR1+DC中在第6天单独致敏荷瘤小鼠对肿瘤的生长几乎没有任何影响(图5)，如果不致敏小鼠但用IL-2cx单独处理，同样也是如此。出人意料的是，在第6天致敏小鼠，随后用IL-2cx连续数天单独处理显著地降低肿瘤的生长直到第22天，表明在体内诱导了显著的杀伤能力。然而，肿瘤在第22天左右恢复其生长，表明不是所有的肿瘤块均可被去除。同样，在致敏后第6天应用ADAS非常显著降低肿瘤的生长，但是，在第18天左右重新开始生长(图5)。有趣的是，在致敏后第6天与连续应用IL-2cx组合应用ADAS显然最有效地降低了肿瘤的尺寸，直到实验结束(图5)。所得的结果表明，在将抗原靶向到APC中后在给定的时间框架内单独注射IL-2cx在控制肿瘤的生长中已非常有效。此外，结果表明，当在通过抗原初始活化CD8+T细胞后的给定的时间框架内应用ADAS时，也针对表达该抗原的肿瘤诱导强杀伤活性。ADAS和IL-2cx的组合对于控制侵袭性肿瘤的生长最有效(图5)。虽然在本实验中首先施用ADAS，随后为IL-2cx，但是也可颠倒处理顺序。在这种情况下，可首先施用IL-2cx，然后在适当的时间施用ADAS。
在本发明的用于方法中的药物之步骤i)的一个优选实施方案中，WO 2009/065561中公开了XCR1为树突细胞表面上的受体。如在WO 2009/065561中所公开的，抗XCR1抗体或其片段，或XCL1或其功能活性片段可优选用作与树突细胞表面上的受体结合的分子。WO2009/065561的公开内容涉及递送系统，其中XCR1是树突细胞的表面上的受体，其通过引用并入本文并且其中公开的一些实施方案也适于用于本发明的药物的步骤i)。
合适的包含抗原之蛋白质是本领域技术人员已知的。
例如，在肿瘤疾病的情况下，许多合适的包含抗原之蛋白质是已知的。此外，描述了作为疫苗的合适的肽，如例如在Aranda等，OncoImmunology 2：12，e26621，2013年12月中总结的实体瘤，包括神经胶质瘤、肺癌、肉瘤、黑素瘤、食管鳞状细胞癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、结直肠癌、肾细胞癌、前列腺癌、卵巢癌、妇科恶性肿瘤和多种其他肿瘤。
在这些临床试验中被特异性靶向的包含抗原之蛋白质包括癌症-睾丸抗原(cancer-testis antigen)例如NY-ESO-1、TTK蛋白激酶(也称为MOS)、淋巴细胞抗原6复合物、locus K(LY6K，最知名的为URLC10)、胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3(IGF2BP3，最知名的为IMP3)、环指蛋白(RNF43)和线粒体外膜的移位酶34(TOMM34)；癌胚抗原如磷脂酰肌醇聚糖-3；分化抗原例如melan-A(MLANA)和前黑色素体蛋白(PMEL，最知名的为gp100)；肿瘤限制性抗原，例如SYT-SSX融合物(由于t(X；18)(P11；Q11)染色体易位，其由滑膜肉瘤选择性地表达)；以及所谓的“共享的肿瘤相关抗原”(由恶性细胞过表达，但也由一种或几种健康组织以正常量产生的抗原)，包括血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)和VEGFR2、存活蛋白(survivin)、肾母细胞瘤1(Wilms tumor 1，WT1)、端粒酶逆转录酶(TERT)和p53。因此，在肿瘤的情况下，这样的蛋白质为合适的包含抗原之蛋白质。Yamada等，Cancer Sci，2013，104(1)：15-21进一步总结了关于癌症中的肽疫苗。
在肿瘤患者或针对肿瘤待预防性地治疗的患者中诱导细胞之细胞毒性免疫应答的情况下，可以使用参与肿瘤疾病的合适的包含抗原之蛋白质。这样的蛋白质是本领域中已知的。如例如在Tacken和Figdor(Tacken PJ，Figdor CG；Targeted antigen deliveryand activation of dendritic cells in vivo：Steps towards cost effectivevaccines.Semin.Immunol.，2011，23(1)：12-20)中描述的，理想的肿瘤抗原是称为共享的肿瘤特异性抗原的那些，因为它们在多种组织型的肿瘤细胞中选择性表达，但在表达MHC的正常组织中不选择性表达。这种类型的抗原的实例是MAGE-A或NY-ESO-1抗原。这类抗原中多个成员根据肿瘤类型和疾病阶段以可变的比例表达。因此，基于这些抗原的疫苗需要选择表达靶抗原的带有肿瘤的患者。认为对疫苗开发有价值的其他类别的肿瘤抗原是来自在肿瘤中过表达的致癌蛋白的那些。真正的非自体肿瘤抗原来自两个主要来源：在致癌病毒源(例如由HPV感染引起的宫颈癌)的肿瘤的情况下的病毒抗原，以及体细胞突变。
在患有感染的患者或针对感染性疾病(或感染)待预防性治疗的患者中诱导细胞之细胞毒性免疫应答的情况下，可使用病原体的合适的包含抗原之蛋白质，特别是选自以下的病原体：疟疾、结核病、利什曼原虫或病毒，特别是选自以下的病毒：正黏病毒、流感病毒、甲肝病毒、乙肝病毒、慢性丙肝病毒、慢病毒，特别是HI-病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒、乳头瘤病毒、布尼亚病毒、杯状病毒、纤维病毒、黄病毒或呼吸道病毒。在一个甚至更优选的实施方案中，包含抗原之蛋白质是选自以下病毒的蛋白质：丙肝病毒、乳头瘤病毒、副黏病毒或呼吸道病毒。
病毒(特别是RNA病毒)通常表现出高突变率。然而，在特别是编码非结构和/或内部蛋白质的基因组区段中通常存在保守区域，这样的区域编码病毒聚合酶或核蛋白。这样的区域不适合经典的疫苗接种技术，因为这样的保守蛋白不暴露于病毒外壳的表面上。与此相反，这样的包含抗原之蛋白质和/或包含在蛋白质中的抗原可用于在根据本发明应用的药物中。
在一个优选的实施方案中，病毒的包含抗原之蛋白质和/或包含在蛋白质中的抗原是保守的。
在另一个优选的实施方案中，包含抗原之蛋白质是非结构蛋白和/或抗原包含在非结构和/或内部蛋白质中。
在又一个优选的实施方案中，包含抗原之蛋白质是RNA病毒的蛋白质。
“非结构”或“内部”蛋白质是不为病毒颗粒的外壳或包膜的一部分的蛋白质。
在另一个实施方案中，步骤i)中包含在蛋白质中的抗原是免疫显性的。免疫显性意味着尽管许多pMHC复合物可用于特定的病原体，T细胞应答可再现地集中在一个或几个关键的抗原上，并且这样的抗原是一种这样的关键抗原。
例如在Wu等(PNAS，2011，108(22)：9178-9183)中描述了合适的包含抗原之蛋白质和甲型流感病毒的抗原，并且涵盖NP(核蛋白)、碱性聚合酶1和M1。
步骤ii)涉及向患者施用选自以下的再活化剂：(d)复合的白介素2(IL-2cx)、(e)加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂，和(f)(d)和(e)的组合，其中所述肽来自于步骤i)中所限定的包含抗原之蛋白质，从而使步骤i)中活化的T细胞再活化。
在一个实施方案中，在(e)的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天的时间框架内施用。
在一个优选的实施方案中，在(e)的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天的时间框架内施用仅一次。
在一个优选的实施方案中，在(e)的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后48小时至14天的时间框架内施用。
例如，所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后48小时、72小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天施用。
在一个更优选的实施方案中，在(e)的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后3天至9天，甚至更优选4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用。
在另一个优选的实施方案中，在(e)的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天的时间框架内、优选48小时至14天的时间框架内施用仅一次。
例如，所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后48小时、72小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天施用仅一次。
在另一个优选的实施方案中，在(e)的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后3天至9天、甚至更优选4天至8天、例如4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用仅一次。
在(d)的情况下，复合的白介素-2(IL-2cx)在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天的时间框架内施用。
在(d)的情况下，复合的白介素-2(IL-2cx)在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天的时间框架内优选反复施用。还可以在施用步骤i)的递送系统后14天后再施用复合的IL-2；但是，在0小时至14天的时间框架内至少施用一次。
在另一个优选的实施方案中，在(d)的情况下，复合的白介素-2(IL-2cx)优选在施用步骤i)的递送系统后48小时至9天，甚至更优选3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用。
在又一个优选的实施方案中，在(d)的情况下，复合的白介素-2(IL-2cx)优选在施用步骤i)的递送系统后48小时至9天，甚至更优选3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内反复施用。因此，复合的白介素-2(IL-2cx)优选在施用步骤i)的递送系统后48小时至9天，甚至更优选3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。例如，复合的白介素-2(IL-2cx)可每天或每两天施用。例如，复合的白介素-2(IL-2cx)可在施用步骤i)的递送系统后48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天施用。在另一个实例中，复合的白介素-2(IL-2cx)可在施用步骤i)的递送系统后48小时、4天、6天和8天施用。
还可以在施用步骤i)的递送系统后例如14天，优选为9或8天的指定时间后再施用复合的IL-2；但是，在指定的时间框架内至少施用一次。
在(f)的情况下，施用复合的白介素2(IL-2cx)与加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂的组合。在一个优选的实施方案中，所述复合的白介素-2(IL-2cx)可在施用加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂之前、同时或之后施用。优选地，所述加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂施用仅一次，并且所述复合的白介素-2(IL-2cx)在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天的时间框架内反复施用。在这样的一个实施方案中，复合的IL-2可在施用加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂之前、同时和/或之后施用。
对于替代的(f)，施用复合的IL-2和加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂的一些相同的优选实施方案分别适用于替代物(e)和(f)。
在一个实施方案中，在(f)的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天的时间框架内施用仅一次。
在一个优选的实施方案中，在(f)的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后48小时至14天的时间框架内施用。
例如，在(f)的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天施用。
在一个更优选的实施方案中，在(f)的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后3天至9天，甚至更优选4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用。
在另一个优选的实施方案中，在(f)的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天的时间框架内施用仅一次。
例如，所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天施用仅一次。
在另一个优选的实施方案中，在(f)的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后3天至9天，甚至更优选4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用仅一次。
在(f)的情况下，复合的白介素2(IL-2cx)优选在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天的时间框架内反复施用。还可以在施用步骤i)的递送系统后14天后再施用复合的IL-2；但是，在0小时至14天的时间框架内至少施用一次。
在另一个优选的实施方案中，在(f)的情况下，复合的白介素-2(IL-2cx)优选在施用步骤i)的递送系统后48小时至9天，甚至更优选3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用。
在又一个优选的实施方案中，在(f)的情况下，复合的白介素-2(IL-2cx)优选在施用步骤i)的递送系统后48小时至9天，甚至更优选3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内反复施用。因此，复合的白介素-2(IL-2cx)优选在施用步骤i)的递送系统后48小时至9天，甚至更优选3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。例如，复合的白介素-2(IL-2cx)可每天或每两天施用。例如，复合的白介素-2(IL-2cx)可在施用步骤i)的递送系统后48小时、3天、4天、5天、6天、7天和8天施用。在另一个实例中，复合的白介素-2(IL-2cx)可在施用步骤i)的递送系统后48小时、4天、6天和8天施用。
还可以在施用步骤i)的递送系统后例如14天，优选9或8天的指定时间后再施用复合的IL-2；但是，在指定的时间框架内至少施用一次。
因此，在另一个优选的实施方案中，在(f)的情况下，
(A)所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天，优选48小时至14天的时间框架内，更优选3天至9天，甚至更优选4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用，甚至更优选在施用步骤i)的递送系统后48小时至14天的时间框架内施用仅一次，更特别地在3天至9天的时间框架施用仅一次，甚至更特别地在4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用仅一次，以及
(B)复合的白介素-2(IL-2cx)在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天，更优选48小时至9天，甚至更优选3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用，最优选在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天，更优选48小时至9天，甚至更优选3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内反复施用。
还可以在施用步骤i)的递送系统后14天后再施用复合的IL-2；但是，在0小时至14天的时间框架内至少施用一次。
在又一个优选的实施方案中，在(f)的情况下，复合的白介素-2(IL-2cx)优选在施用步骤i)的递送系统后48小时至9天，甚至更优选3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内反复施用。因此，复合的白介素-2(IL-2cx)优选在施用步骤i)的递送系统后48小时至9天，甚至更优选3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。例如，复合的白介素-2(IL-2cx)可每天或每两天施用。例如，复合的白介素-2(IL-2cx)可在施用步骤i)的递送系统后48小时、3天、4天、5天、6天、7天和8天施用。在另一个实例中，复合的白介素-2(IL-2cx)可在施用步骤i)的递送系统后48小时、4天、6天和8天施用。
还可以在施用步骤i)的递送系统后例如14天，优选9或8天的指定时间后再施用复合的IL-2；但是，在指定的时间框架内至少施用一次。
在另一个优选的实施方案中，在(f)的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天的时间框架内施用仅一次。
加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂优选作为单一药物制剂施用。这样的药物制剂优选为还可含有可药用赋形剂(如缓冲化合物)的液体。这样的药物制剂优选是灭菌的。
在应用的药物的一个优选的实施方案中，
(x)所述复合的白介素-2(IL-2cx)反复施用特别是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14次，甚至更优选其中所述复合的白介素-2(IL-2cx)每1或2天施用，和/或在5天至1个月，甚至更优选1至2周期间内反复施用，和/或
(xx)来自于包含抗原之蛋白质的肽的长度为8、9或10个氢基酸和/或为由MHC-I，优选由等位基因HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24或HLA-A30，更优选由等位基因HLA-A2呈递的肽。
在一个优选的实施方案中，复合的白介素-2(IL-2cx)反复施用特别是施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14次，甚至更优选其中复合的白介素-2(IL-2cx)每1天或2天施用，和/或在5天至1个月期间反复施用。因此，如上所述，可在14天，或9或8天的时间框架后再施用复合的IL-2。
如上所述，加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂优选作为本发明应用的药物的步骤ii)的再活化剂施用。此外，所述肽来自于步骤i)中所限定的包含抗原之蛋白质。“所述肽来自于包含抗原之蛋白质”理解为所述肽序列是包含抗原之蛋白质序列的一部分(即是包含抗原之蛋白质序列的子序列)。
“加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞”理解为在细胞的表面上通过与MHC-I结合呈递期望的肽的细胞。
在一个实施方案中，如实施例中所述，可通过在体外用肽外部加载MHC-I分子来实现所述加载。或者，可在体外将细胞与整个包含抗原之蛋白质一起培养，使细胞加工抗原并在MHC-I的情况下呈递抗原肽，或其在体外暴露于能够感染细胞的病毒系统，导致在MHC-I的情况下表达高量的肽或可用编码给定蛋白质或肽序列的表达载体转染带有MHC-I的细胞，同样导致在MHC-I的情况下高效呈递肽。
用于确定在MHC-I的情况下用于加载细胞的肽的方法是本领域已知的。例如，可使用在Wu等(PNAS，2011，108(22)：9178-9183)中所描述的方法。
在应用用于加载(例如，通过在体外外部加载细胞)的限定的肽的情况下，可通过本领域中已知的方法选择肽序列。可通过本领域已知的方法在体外外部加载细胞，例如，通过提供肽的水溶液，向细胞添加所述溶液，其优选在缓冲的溶液或介质中，将细胞与肽一起孵育以实现高饱和度的具有各自肽的MHC-I和/或MHC-II，以及任选地(例如，用水溶液)洗涤所述细胞。
在一个优选的实施方案中，在体外用序列为包含抗原之蛋白质的亚序列的一种肽加载细胞。例如，可在体外向细胞群(其优选是患者的细胞群)添加包含一种这样的肽的水溶液。
或者，可在步骤ii)中使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的加载肽的细胞I类细胞主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞群的混合物，其中所述细胞用不同的肽加载，且其中所述细胞优选为患者的细胞。
可通过将细胞群(如PBMC细胞)与2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的肽的混合物一起孵育获得这样细胞的混合物，从而获得在MHC-I的情况下加载有不同肽的细胞。或者，可在体外将单独的细胞群(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个细胞群)与不同的肽(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的肽)一起孵育。因此，如此获得各自加载有不同肽的单独的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞群。在步骤ii)中可单独施用不同的加载肽的细胞I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞群，或者可以制备不同的加载肽的细胞I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞群的混合物，其随后可在步骤ii)中施用。
在使用不同肽的情况下，特别是如果使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的肽，这样的肽可以来自于相同或不同的包含抗原之蛋白质。在一个优选的实施方案中，可使用来自于一种肿瘤抗原的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的肽。这意味着，每种肽的序列是肿瘤抗原的子序列。这样的不同的肽的序列可以是重叠或不重叠的。在另一个实施方案中，可使用来自于2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的肿瘤抗原的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的肽。在这样的一个实施方案中，不同的肿瘤抗原都与相同或不同的肿瘤(优选相同的肿瘤)相关。
优选地，选择8、9或10个氨基酸长度的肽序列，因为通过MHC-I呈递的肽通常是这个长度。
如在Wu等中进一步描述的，HLA等位基因是极其多态性的。因此，加载的肽优选为由常见的HLA等位基因呈递的肽。因此，在人中，特别优选由最常见的等位基因HLA-A2呈递的肽。或者，可使用由HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35(其是白种人来源个体相关的等位基因)呈递的肽。对于亚洲个体可使用HLA-A24且对于非洲个体可使用HLA-A30。
在Speiser和Romero(Seminars in Immunology 22(2010)144-154)及其中的参考文献中描述了几种合适的肿瘤相关肽。其中大多数是HLA-A2限制性的，例如来自于Melan-A/MART-1的肽，对于黑素细胞分化抗原为一种gp100表位和酪氨酸酶；对于前列腺是前列腺表面抗原和PSAP；对于黏膜肿瘤是癌胚抗原和MUC-1；对于乳腺癌是HER-2/neu；对于肾细胞癌是G250；由两种髓性白血病相关抗原共享的PR1，在粒细胞中正常表达和在髓性白血病细胞中过度表达的PR3和中性粒细胞弹性蛋白酶；多种肿瘤类型共享的肿瘤特异性抗原MAGE-A和NY-ESO-1；和过表达的蛋白质存活蛋白和端粒酶。在Wu等(同上)中描述了合适的来自于甲型流感的肽。
因此，在另一个实施方案中，来自于包含抗原之蛋白质的肽是由MHC-I，优选由等位基因HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24或HLA-A30，更优选由等位基因HLA-A2呈递的肽。在Wu等(同上)中描述和汇总了用于鉴定此类肽的方法。例如，可使用Wu等(同上)的系统鉴定方法，或其中所描述的合适的算法。
因此，在另一个实施方案中，来自于包含抗原之蛋白质的肽的长度为8、9或10个氨基酸并且是由MHC-I，优选由等位基因HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24或HLA-A30，更优选由等位基因HLA-A2呈递的肽。
在应用药物的另一个优选实施方案中，树突细胞表面上的受体是交叉呈递树突细胞表面上的受体。
交叉呈递树突细胞特别适合于在MHC-I的情况下呈递肽。交叉呈递DC能够摄取可溶性或靶向的蛋白、对其进行加工，并在MHC-I的情况下呈递。所有常规的DC均能够进行抗原交叉呈递。在小鼠中通过XCR1+DC完成定量地最佳抗原交叉呈递和在人中通过在BDCA3+DC群中的XCR1+DC完成定量地最佳抗原交叉呈递。因此，鼠交叉呈递DC优选通过XCR1+DC，人交叉呈递DC优选通过BDCA3+DC群内的XCR1+DC。
在应用药物的另一个优选实施方案中，树突细胞表面上的受体是趋化因子(C基序)受体1(XCR1)、连接蛋白样分子2、c型凝集素(CLEC)(例如CLEC9A)。
C型凝集素为Ca++-依赖性聚糖结合蛋白，其在它们的糖类识别结构域(carbohydrate-recognition domain，CRD)中共享初级和次级结构同源性。这些蛋白质具有C-型凝集素折叠，其是与也存在于不与糖类结合的许多蛋白质中的具有高度可变蛋白质序列的折叠。
例如在Caminschi等，2008，Blood 112，3264-3273中描述了人受体CLEC9A的序列。与CLEC9A结合的合适分子是例如特异性单克隆抗CLEC9A抗体。
在Takai等，2003，Cancer Sci 94，655-667中描述了人受体连接蛋白样分子2。与连接蛋白样分子2结合的合适的分子是例如特异性抗连接蛋白样分子2单克隆抗体。
在免疫系统中，所述递送系统特别适合于影响Th1应答以及任选还影响Th2应答。
XCR1是趋化因子受体并且是迄今为止趋化因子受体“C”亚家族的唯一成员。它也被称为GPR5或CCXCR1。GPR5，先前作为孤儿G蛋白偶联受体克隆得到，已在人中首次被识别，然后在小鼠中被识别为XCL1的单特异性受体，并且因此称为XCR1。
XCR1的天然配体是XCL1，其也被称为ATAC、淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)或SCM-1。它是C家族趋化因子的唯一成员。在人中克隆了活化诱导的、T细胞衍生的和趋化因子相关的细胞因子(ATAC)(Muller等，1995，Eur.J.Immunol.25，1744-1748)，并在小鼠中独立地作为淋巴细胞趋化因子(Kelner等，1994，Science 266，1395-1399)并且在人中为SCM-1(Yoshida等，1995，FEBS Lett.360，155-9)。根据对趋化因子的命名，ATAC/淋巴细胞趋化因子/SCM-1现在称为“XCL1”。XCL1主要由活化的CD8+T细胞、Th1 CD4+T细胞和NK细胞分泌。在人中，已经描述了命名为XCL2的XCL1的变体，其中在全长蛋白质的28位和29位的氨基酸天冬氨酸和赖氨酸分别被交换为组氨酸和精氨酸(Yoshida等，1996，FEBS Lett.395，82-8)，这也可用于本发明。在WO 2009/065561的实施例8中描述了产生生物活性形式的XCL1的示例性方法。可使用类似的方法以产生其他生物活性形式的XCL1，例如，其他物种的那些。
在一个甚至更优选的实施方案中，树突细胞表面上的受体是XCR1。
人XCR1的氨基酸序列是已知的(NCBI；登录号NP_001019815)：
在应用药物的另一个优选实施方案中，a)的分子是针对受体的配体或针对受体的抗体或抗体片段。在一个甚至更优选的实施方案中，所述受体是趋化因子(C基序)受体1(XCR1)且a)的分子是抗XCR1抗体或其片段或趋化因子(C基序)配体1(XCL1)或其功能活性变体，其特别地包含以下任意序列或由其组成：SEQ ID NO：7至10，优选地，SEQ ID NO：8至10，更优选SEQ ID NO：9或10，尤其是SEQ ID NO：10。
几个物种的XCL1(ATAC)的氨基酸序列(包括人：SEQ ID NO：1，GenBank登录P47992；小鼠：SEQ ID NO：2，GenBank登录P47993；和大鼠SEQ ID NO：3，GenBank登录P51672)是已知的，并且示为SEQ ID NO：1至3(见下文)。此外，称为K4.1 HHV8的特异性XCLR1激动剂(SEQ ID NO：4，GenBank登录AAB62672.1)(见下文)，其是病毒趋化因子样蛋白质，也是已知的。可使用任何这些天然XCR1配体或任何其他天然XCR1配体。
或者，可使用任何天然XCL1的功能活性变体。术语变体包括片段，通过一个或更多个氨基酸添加、缺失和/或替换得到的变体，和分子，特别是蛋白质，其包含任何天然XCL1或其一部分，例如融合蛋白。融合蛋白的XCL1部分的侧翼可以是氨基酸残基C末端、N末端或C和N末端。
功能活性片段的特征在于是通过一个或更多个氨基酸的缺失从任何天然XCR1配体、特别是XCL1、尤其是SEQ ID NO：1至4的那些得到的。所述缺失可以是C末端、N末端和/或内部。优选地，通过至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或60，更优选至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30，甚至更优选至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，更优选至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，最优选1、2、3、4或5个氨基酸缺失获得的片段。本发明的功能活性片段的特征在于具有与从其来源的配体显示的生物活性类似的生物活性，包括能够与XCR1结合并介导(b)的蛋白质的内化。在本发明的情况下，如果无序列改变，片段的活性(结合以及内化)达到XCL1活性的至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，甚至更优选至少70％，还更优选至少80％，尤其是至少90％，特别是至少95％，最优选至少99％，则天然XCR1配体、特别是XCL1、尤其是SEQ ID NO：1至4的那些的片段是有功能活性的。可设计或获得任何期望长度的这些片段，包括小至长度约18至50个氨基酸。
天然XCR1配体、特别是XCL1、尤其是SEQ ID NO：1至4的那些的功能活性片段的特征还可在于其他结构特征。因此，在本发明的一个优选实施方案中，功能活性片段由至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，还更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选99％的SEQ ID NO：1至4中任一XCR1配体的氨基酸组成。可通过一个或更多个氨基酸缺失从所述肽得到如上所定义的功能性活性片段。所述缺失可以在C末端、N末端和/或内部。上述SEQ ID NO：1至4的序列比对示出似乎是保守的天然配体的结构域。在本发明的一个优选实施方案中，这些结构域应维持在片段中。
保守的结构域包括经加工的N-末端的那些氨基酸(对于SEQ ID NO：1至3，加工的N-末端从非加工的N-末端的22位氨基酸开始；对于SEQ ID NO：4从27位氨基酸开始)1至2位(V/S G)、13-27(S/NL X T/S Q/A R L P V/PX K/R I/L K/I X T/G X Y，X＝任意或无氨基酸；SEQ ID NO：5)、35至51(R/K A V I F I/V T K/H R/S G L/R K/R I/V C A/G D/S P；SEQ ID NO：6)以及在11和48位的半胱氨酸残基之间的二硫键(也参见上述比对)。如果只考虑相同的氨基酸，SEQ ID NO：1至4的序列的共有序列是XGXXXXXXXXXXCXXXLXXXRLPXXXXXXXXYXXXXXXXXXXAVIFXTXXGXXXCXXP(SEQ ID NO：7)，以及如果考虑相同的氨基酸和多数氨基酸(即，在4个序列中的3个中存在的氨基酸，斜线后列出替代氨基酸)，则为(V/S)GX(E/A)(V/T)XXXXXXXC(V/E)X(S/N)LX(T/S)(Q/A)RLP(V/P)X(K/R)(I/L)(K/I)X(T/G)XYX(I/T)X(E/T)(G/V)XXXX(R/K)AVIF(V/I)T(K/H)(R/S)G(L/R)(K/R)XC(A/G)(D/S)P(SEQ IDNO：8)。如果只考虑相同的氨基酸，SEQ IDNO：1至3序列的共有序列是VGXEVXXXXXCVXLXTQRLPVXXIKTYXIXEGXXRAVIFXTKRGLXXCADPXAXWVXXXXXXXDXXXXXXXXXXXTXPTXXQXSXXTAXTLTG(SEQ ID NO：9)，以及如果考虑相同的氨基酸和多数氨基酸(即，在3序列的2个中存在的氨基酸，斜线后列出替代的氨基酸)则为VG(T/S)EV(L/S)X(E/K)(S/R)XCV(S/N)LXTQRLPV(Q/S)(K/R)IKTY(T/I)IXEG(A/S)(M/L)RAVIF(V/I)TKRGL(K/R)(I/V)CADP(Q/E)A(K/T)WV(K/R)X(A/V)(I/V)(K/R)(T/S)(V/M)D(G/R)(R/K)(A/S)(S/N)(T/A)(R/S)(K/N)(N/S)(M/K)(A/I)(E/Q)TXPT(G/Q)(A/T)Q(R/Q)S(T/A)(S/N)TA(V/I)TLTG(SEQ IDNO：10)。
因此，在本发明中应用的一个优选的递送系统中，XCL1的功能活性变体、优选功能活性片段包含以下任意序列或由其组成：SEQ ID NO：7至10，优选SEQ ID NO：8至10，更优选SEQ ID NO：9或10，尤其是SEQ ID NO：10。
在本发明的另一个优选实施方案中，使用如上定义的XCL1变体，其中所述XCR1配体是SEQ ID NO：1至4中任一个的XCR1配体的功能活性变体，且使用其中与SEQ ID NO：1至4中任一个的XCR1配体具有至少50％的序列同一性的变体。在一个更优选的实施方案中，所述功能活性变体与SEQ ID NO：1至4中任一个的抗原具有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，还更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选99％的序列同一性。
例如可通过序列比对确定序列同一性的百分比。用于比较的序列比对方法是本领域中公知的。例如，在Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981或Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444-2448，1988中已描述了多种程序和比对算法。
NCBI基础局部比对检索工具(BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)可从几个来源获得，包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)以及在互联网上，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx一起使用。使用NCBIBlast 2.0将有缺口的blastp设置为默认参数可一般性表征任意SEQ ID NO：1至4的任一序列的抗原的变体。对于比较至少35个氨基酸的氨基酸序列，使用默认的BLOSUM62矩阵设为默认参数(空位存在罚分为11且每个残基的空位罚分为1)以采用BLAST 2序列函数。当比对短肽(少于约35个氨基酸)时，利用Blast2序列功能进行比对，采用设置成默认参数的PAM30矩阵(缺口开放9，延长缺口1罚分)。Bethesda，Maryland的国家生物技术信息中心维护的网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上描述了用于在这样短的窗口(例如15个氢基酸或更少)上确定序列同一性的方法。
或者，也可采用ClustalV比对算法使用来自DNAStar(Madison，WI，USA)的MegAlign软件进行多序列的比对(Higgins et al.，1992，Comput.Appl.Biosci.8，189-91)。在上述比对中使用该软件，并设置为以下默认参数：缺口罚分10，缺口长度罚分10。由于非常低的同源性，需要手动调整将SEQ ID NO：4加入比对。
通过在天然XCR1配体中的序列改变来获得功能活性变体，其中，具有序列改变的XCR1配体保留未改变的XCR1配体的功能，例如具有与天然XCR1配体显示的生物活性类似的生物活性，包括能够与XCR1结合并介导步骤i)中(b)的蛋白质的内化。这样的序列改变可包括但不限于：保守的替换、缺失、突变和插入。例如，如上所述可以评估功能活性变体的这些特征。
在一个更优选的实施方案中，应用的XCL1的功能活性变体通过保守替换而来自于SEQ ID NO：1至4的任一序列的天然XCR1配体。保守替换是与其侧链和化学性质相关的那些氨基酸家族中发生的替换。这样的家族的实例是具有碱性侧链、具有酸性侧链、具有非极性脂肪族侧链、具有非极性芳香侧链、具有不带电荷的极性侧链、具有小侧链、具有大侧链等的氨基酸。在一个实施方案中，在肽中包含一个保守的替换。在另一个实施方案中，在肽中包含两个保守的替换或更少。在另一个实施方案中，在肽中包含三个保守的替换或更少。
保守的氨基酸替换的实例包括，但不限于下面列出的：
根据本发明应用的合适的单克隆抗XCR1抗体是例如在WO 2009/065561中公开的mAb 6F8或MARX10(Bachem等，2012，Front Immunol 3，214)。
在一个优选的实施方案中，可使用抗XCR1抗体或其功能活性片段作为与步骤i)中作为受体的XCR1结合的分子。抗XCR1抗体或其功能活性片段能够与XCR1特异性结合。该抗体的功能活性片段的定义为类似于XCL1(见上文)的功能活性片段，即，功能活性片段(a)的特征在于通过一个或更多个氨基酸缺失(例如C-末端、N-末端和/或内部缺失)来自于任何抗XCR1抗体，和(b)的特征在于与通过其来源的抗XCR1抗体显示的生物活性具有类似的生物活性，包括与XCL1结合的能力。天然抗体是免疫系统用来识别和中和外来物的蛋白质。每个天然抗体具有两个大的重链和两个小的轻链，并且可与不同抗原结合。本发明包括例如单克隆和多克隆抗体，嵌合的、单链的和人源化抗体，以及Fab片段Fab、Fab′、F(ab′)2′、Fv或Fab表达文库的产物。还可修饰抗体或抗体组分以延长其生物半衰期或以其他方式使之更适合于靶向。可通过直接将XCR1或其片段注射到动物中或通过向动物(优选非人动物)施用XCR1或其片段来获得针对XCR1产生的抗体。然后这样获得的抗体将与XCR1结合。对于单克隆抗体的制备，可使用本领域已知的提供通过连续的细胞系培养物(例如，杂交瘤细胞系)产生抗体的任何技术。在WO 2009/065561中还详细地描述了合适的单克隆抗体的产生。描述用于产生单链抗体的技术(U.S.专利4,946,778)可适用于产生XCR1的单链抗体。此外，也可使用转基因小鼠或其他生物体(例如其他哺乳动物)来表达针对XCR1的人源化抗体。
在应用药物的另一个优选实施方案中，
-(b)的包含抗原之蛋白质与a)的分子处于融合蛋白中；和/或
-(b)的包含抗原之蛋白质的抗原是免疫原、病原体来源的抗原或肿瘤抗原。
因此，在一个优选的实施方案中，(b)的包含抗原之蛋白质与a)的分子处于融合蛋白中。可以合成这样的融合蛋白，例如合成或重组地(优选重组地)合成。这样的融合蛋白能够高效地靶向至树突细胞。例如，在实施例中成功地使用了抗体MARX10与OVA以及XCL1与OVA的融合蛋白。
免疫原是刺激免疫应答的抗原。抗原是免疫系统中由T细胞上的特异性受体(T细胞受体)和B细胞上的特异性受体(B细胞受体)识别的物质，通常为蛋白质或多糖。这包括细菌、病毒和其他微生物的一部分(包衣、夹膜、细胞壁、鞭毛、纤毛和毒素)。一般来说，只有当与蛋白质和多糖组合时，脂质和核酸才是抗原性的。非微生物外源性(异己)抗原可包括花粉、蛋清(egg white)和来自移植的组织和器官或在输注的血细胞表面上的蛋白质。
抗原可被分类为内源性的或外源性的。本发明的一种优选抗原是外源性抗原。
在使用病原体来源的抗原的情况下，优选病毒、细菌和/或真核寄生生虫，所述药物优选用于针对这种病原体的感染诱导细胞之细胞毒性免疫应答。
在使用肿瘤抗原的情况下，所述药物优选用于针对这样的肿瘤诱导细胞之细胞毒性免疫应答。
树突细胞可通过MHC-I类分子呈递外源性抗原，该过程称为“交叉呈递”。
在应用药物的另一个优选实施方案中，c)的第一佐剂和第二佐剂独立地为支持Th-1介导的应答的佐剂，优选地其独立地选自：合成的或重组的RIG-I激动剂；TLR配体，如聚ICLC和瑞喹莫德(R848)；Montanide，如ISA51、ISA720；皂苷，如Quil-A、ISCOM、QS-21、AS02和AS01；聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)、脂多糖(LPS)和CpG寡脱氧核苷酸，更优选地选自：RIG-I-激动剂，以及TLR配体，例如瑞喹莫德(R848)、聚ICLC和聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)。
如果使用c)的第一佐剂和第二佐剂两者，则它们可以彼此相同或彼此不同。
聚ICLC由用聚-L-赖氨酸和羧甲基纤维素稳定的聚IC组成并且在支持Th1应答中有效。
在小鼠中R848为TLR7的选择性配体且在人中为TLR7和TLR8的选择性配体，并且活化含有NLR pryin结构域3(NLRP3)的炎性体(inflammasome)。
对于聚ICLC和R848，在Tacken和Figdor(同上)及其中引用的参考文献中提及。
Montanide(如ISA51和ISA720)是含有角鲨烯和二缩甘露醇-单油酸酯(mannide-monooleate)作为乳化剂的油包水型乳剂，如在Speiser和Romero及其中引用的参考文献中公开的。
皂苷(如Quil-A、ISCOM、QS-21、AS02和AS01)是从植物中分离的三萜皂苷，如在Speiser和Romero及其中引用的参考文献中所公开的。
佐剂是这样的药剂，其改变其他药剂的作用，而当其本身施用时几乎没有直接作用。在药理学上，佐剂是本身具有很少或不具有药理学作用，但是当在同一时间给予时可提高其他药物的疗效或效力的药物。在免疫学上，佐剂是这样的药剂，虽然本身不具有任何特定的抗原作用，但可以刺激免疫系统，提高对疫苗的应答。本发明中使用的佐剂优选支持Th1应答。支持或诱导Th1应答(或1型T细胞应答)的佐剂理解为能够在DC中诱导IL-12，并通过响应性抗原反应性CD8+和CD4+T细胞导致IL-2、INF-γ和TNF-α的分泌以及通过抗原反应性细胞毒CD8+和CD4+T细胞产生细胞毒性分子颗粒酶B和穿孔蛋白的佐剂。支持Th1应答的合适的优选的第一和第二佐剂是本领域中已知的，并且例如在Tacken和Figdor以及在Speiser和Romero中描述(Tacken PJ，Figdor CG；Targeted antigen delivery andactivation of dendritic cells in vivo：Steps towards cost effectivevaccines.Semin.Immunol.(2011)，doi：10.1016/j.smim.2011.01.001；Speiser D.E.和Romero P.Seminars in Immunology，P.22(2010)144-154)。
树突细胞(DC)能够通过一大组“危险信号”识别受体(例如，toll样受体、NOD样受体)感测抗原是否具有危险性或其是否无害。由“危险信号”识别受体(也称为“模式识别受体”)识别的模式通常是微生物特有的分子结构。这些可以是细胞壁组分(例如脂多糖、肽聚糖)或在微生物的情况下为核酸修饰物(例如，非甲基化CpG基序)，或者病毒DNA或病毒RNA(例如，双链RNA)所特有的结构特征和修饰物。此外，体内死于细胞凋亡的细胞释放能够触发“危险信号”模式识别受体(例如，高流动组蛋白B1、热休克蛋白)的分子。这样的危险信号是本发明优选的第一和第二佐剂。
在应用药物的另一个优选实施方案中，所述再活化剂是加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂，其中所述细胞是血细胞，尤其是外周血单个核细胞(peripheral blood mononucleated cell，PBMC)，优选与IL-2cx组合。
在应用药物的另一个优选实施方案中，T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞，优选CD8+T细胞。
特别地，CD8+T细胞的再活化对于获得强烈且增强的细胞毒性免疫应答特别有利。
在应用药物的另一个优选实施方案中，时间框架为72小时至12天、72小时至9天，特别是5天至8天，5天至9天或5天至12天。
在一个优选的实施方案中，只进行一次所述方法步骤i)和ii)。
然而，当免疫系统再次稳定下来后，可以用相同的递送系统和相同再活化剂重复方法步骤。在根据本发明如上所述诱导细胞之细胞毒性免疫应答后至少一个月、优选至少两个月后，通常是这种情况。
因此，在另一个优选的实施方案中，在进行本发明的方法步骤后至少1、2或3个月后重复具有与根据步骤i)的相同递送系统和根据步骤ii)的相同再活化剂的方法步骤。
或者，可用根据步骤i)的不同的递送系统重复所述方法步骤，优选其中所述不同的递送系统包含不同的包含抗原之蛋白质(b)和任选地与树突细胞表面上的受体结合的不同分子(a)。在这样的一个实施方案中，没有必要等到免疫系统再次稳定。所以，因此，可在用第一递送系统第一次进行本发明的方法步骤后例如7天或14天用不同的递送系统重复所述方法。在这样的一个实施方案中，可在步骤ii)中使用相同或不同的再活化剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于针对包含抗原之蛋白质延长细胞之细胞毒性免疫应答的方法中的药物，所述方法包括以下步骤：
i)向已针对抗原活化了T细胞的患者施用加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂，其中所述肽来自于包含抗原之蛋白质，从而使活化的T细胞再活化，并任选地还施用复合的白介素-2(IL-2cx)，
其中在针对抗原活化T细胞后0小时至14天的时间框架中施用步骤i)的再活化剂。
“细胞之细胞毒性免疫应答”理解为针对给定抗原可引起的Th1型体液和细胞(细胞毒性)免疫反应。这与主要针对Th2抗原呈递途径的典型疫苗应答相反且主要导致产生Th2型(中和)抗体和免疫反应。
“延长的”细胞之细胞毒性免疫应答理解为与通过本发明应用的药物的步骤i)的递送系统获得的细胞之细胞毒性免疫应答相比，发生时间更长的细胞之细胞毒性免疫应答。例如，所述应答可延长1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。
对于该实施方案，在适用的情况下，相同的一些优选实施方案应用于上述本发明应用的药物。
在一个实施方案中，所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后0小时至14天的时间框架内施用。
在一个优选的实施方案中，所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后0小时至14天的时间框架内施用仅一次。
在另一个优选实施方案中，所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后48小时至14天的时间框架内施用。
例如，所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天施用。
在一个更优选的实施方案中，所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后5天至9天、5天至12天或3天至9天，甚至更优选为4天至8天或5天至12天，例如4天、5天、6天、7天、8天后的时间框架内施用。
在另一个优选的实施方案中，所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后0小时至14天的时间框架内施用仅一次。
在另一个优选的实施方案中，所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后48小时至14天的时间框架内施用仅一次。
例如，所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天施用仅一次。
在另一个优选的实施方案中，所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后5天至9天、5天至12天或3天至9天，甚至更优选4天至8天或5天至12天，例如4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用仅一次。
在一个优选的实施方案中，施用复合的白介素2(IL-2cx)与加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂的组合。在一个更优选的实施方案中，复合的白介素-2(IL-2cx)可在施用加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂之前、同时或之后施用。优选地，所述加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂施用仅一次，并且复合的白介素-2(IL-2cx)在针对抗原活化T细胞后0小时至14天的时间框架内重复施用。在这样的一个实施方案中，复合的IL-2在施用加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂之前、同时和/或之后均可施用。
对于所述组合，用于施用加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂的相同的一些优选实施方案适用于仅施用所述细胞。
在一个实施方案中，在组合的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后0小时至14天的时间框架内内施用仅一次。
在一个优选的实施方案中，在组合的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后48小时至14天的时间框架施用。
例如，在组合的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天施用。
在一个更优选的实施方案中，在组合的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后3天至9天，甚至更优选4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用。
在另一个优选的实施方案中，在组合的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后0小时至14天的时间框架内施用仅一次。
例如，所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天施用仅一次。
在另一个优选的实施方案中，在组合的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后3天至9天，甚至更优选4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用仅一次。
在组合的情况下，复合的白介素-2(IL-2cx)优选在针对抗原活化T细胞后0小时至14天的时间框架内反复施用。还可以在针对抗原活化T细胞后14天后进一步施用复合的IL-2；但是，在0小时至14天的时间框架内至少施用一次。
在另一个优选的实施方案中，在组合的情况下，复合的白介素-2(IL-2cx)优选在针对抗原活化T细胞后48小至9天，甚至更优选3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用。
在又一个优选的实施方案中，在组合的情况下，复合的白介素-2(IL-2cx)优选在针对抗原活化T细胞后48小时至9天，甚至更优选3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内反复施用。因此，复合的白介素-2(IL-2cx)优选在针对抗原活化T细胞后48小时至9天，甚至更优选3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。例如，复合的白介素-2(IL-2cx)可以每天或每两天施用。例如，复合的白介素-2(IL-2cx)可在针对抗原活化T细胞后48小时、3天、4天、5天、6天、7天和8天施用。在另一个实例中，复合的白介素-2(IL-2cx)可在针对抗原活化T细胞后48小时、4天、6天和8天施用。
还可以在施用步骤i)的递送系统后的指定时间(例如，14天，优选9或8天)后进一步施用复合的IL-2；但是，在指定的时间框架内至少施用一次。
因此，在另一个优选的实施方案中，在组合的情况下，
(A)所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后0小时至14天，优选48小时至14天的时间框架内，更优选3天至9天，甚至更优选4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用，甚至更优选在针对抗原活化T细胞后48小时至14天的时间框架内施用仅一次，更特别地在3天至9天的时间框架内施用仅一次，甚至更特别地在4天至8天，例如4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用仅一次，以及
(B)复合的白介素-2(IL-2cx)在针对抗原活化T细胞后0小时至14天，更优选48小时至9天，甚至更优选3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用，最优选在针对抗原活化T细胞后0小时至14天，更优选48小时至9天，甚至更优选3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内重复施用。
在组合的情况下，还可在针对抗原活化T细胞后14天后进一步施用复合的IL-2；但是，在0小时至14天的时间框架内至少施用一次。
在又一个优选的实施方案中，在组合的情况下，复合的白介素-2(IL-2cx)优选在针对抗原活化T细胞后48小时至9天，甚至更优选3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内反复施用。因此，复合的白介素-2(IL-2cx)优选在针对抗原活化T细胞后48小时至9天，甚至更优选3天至8天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天的时间框架内施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。例如，复合的白介素-2(IL-2cx)可以每天或每两天施用。例如，复合的白介素-2(IL-2cx)可在针对抗原活化T细胞后48小时、3天、4天、5天、6天、7天和8天施用。在另一个实例中，复合的白介素-2(IL-2cx)可在针对抗原活化T细胞后0小时、48小时、4天、6天和8天施用。
还可以在针对抗原活化T细胞后的指定时间(例如，14天，优选9或8天)后进一步施用复合的IL-2；但是，在指定的时间框架内至少施用一次。
在另一个优选的实施方案中，在组合的情况下，所述细胞和所述第二佐剂在针对抗原活化T细胞后0小时至14，优选48小时至14天的时间框架内施用仅一次。
虽然我们测试了将抗原靶向到XCR1+DC后ADAS的效果，人们可以从我们的结果得出这样的结论，可用ADAS过程来扩增通过体内T细胞受体触发导致CD8+T细胞和/或CD4+T细胞的显著初始活化(“致敏”)或再活化的任何系统。T细胞群也可在体外初始活化并随后在体内过继转移(adoptively transferred)，以使随后ADAS可用于扩增体内的T细胞效应器应答。
因此，在一个实施方案中，可通过使用递送系统进行如上所述在步骤i)应用的药物的方法获得针对抗原活化的T细胞。
在另一个优选实施方案中，可在体外获得针对抗原活化的T细胞。为此，未被选择的T细胞(优选从待治疗的患者获得)与抗原或包含抗原之蛋白质和APC共培养，并选择抗原响应性T细胞(例如，通过IFN-γ分泌测定)并用生长因子扩增。或者，使用适当的四聚体或其类似物分选抗原特异性T细胞，在APC的存在下暴露于抗原并用生长因子扩增。
在应用药物的一个优选实施方案中，MHC-I呈递细胞是血细胞，尤其是外周血单个核细胞(PBMC)。
MHC-I呈递细胞优选是从待治疗的患者获得的细胞。用于获得这样的细胞的方法是技术人员已知的。例如，可获取血液，然后可分离PBMC细胞。
在应用药物的另一个优选实施方案中，所述复合的白介素-2(IL-2cx)施用、优选反复施用特别是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14次，甚至更优选其中复合的白介素-2(IL-2cx)每1天或2天施用，和/或在5天至1个月、甚至更优选1至2周期间反复施用。
在应用药物的另一优选实施方案中，来自于包含抗原之蛋白质的肽的长度为8、9或10个氨基酸和/或是由MHC-I，优选由等位基因HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24或HLA-A30，更优选由等位基因HLA-A2呈递的肽。
在应用药物的另一个优选实施方案中，所述患者是哺乳动物，特别是人。
在应用药物的另一个优选实施方案中，诱导细胞之细胞毒性免疫应答的方法用于预防性治疗或治疗肿瘤和/或感染。
可提供应用的药物来保护免受感染(“预防性治疗”)。或者，这样的药物可用于治疗目的。对病原体可能无法产生足够Th1免疫应答的受感染个体可被施用设计用于诱导和/或延长细胞之细胞毒性应答的药物，并因此将变得能够抑制或根除感染(“治疗”)。实例可以是疟疾、肺结核、利什曼原虫、朊病毒病、正黏病毒以及特别是流感、甲型肝炎、乙型肝炎、慢性丙型肝炎、HIV和其他慢病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒、乳头瘤病毒、布尼亚病毒、杯状病毒、丝状病毒、黄病毒，并且特别是丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒、副黏病毒、多种呼吸道病毒等病毒，或在说明书中指明的任何其他感染。
疫苗也可用于保护健康个体免于发生具有已知抗原组分的肿瘤(例如黑素瘤、前列腺癌)(“预防性治疗肿瘤”)。或者，应用的药物可用于治愈已发生肿瘤的患者。这样的肿瘤的实例是人病毒诱导的肿瘤，特别是乳头瘤病毒诱导的肿瘤、HCV诱导的肿瘤、乙型肝炎病毒诱导的肿瘤和在慢性感染后诱导肿瘤的其他病毒。此外，待治疗的合适肿瘤自发地产生实体瘤(例如黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌、肠腺癌、肺癌)和白血病。
病原体或感染原是生物物质(biological agent)，尤其是对其宿主引起疾病或病症的活微生物。根据本发明，病原体优选意指病毒、细菌和/或真核寄生虫。病原体来源的抗原是来自病原体的抗原。
抗原的交叉呈递对于根除体内的肿瘤也是至关重要。肿瘤细胞和肿瘤抗原必须被DC摄取、加工和呈递以引发抗肿瘤免疫应答。由于消除大多数肿瘤需要有效的细胞毒性Th1T细胞应答，所以肿瘤抗原的交叉呈递是必须的。因此，对于有效的抗肿瘤应答，交叉呈递DC发挥突出的作用。如实施例5中所示，本发明应用的药物在肿瘤模型中显示出出人意料的有益效果。
在一个实施方案中，应用的药物包含以下(优选由以下组成)：(a)与树突细胞表面上的受体结合的分子，和(b)与(a)的分子结合的包含抗原之蛋白质。
在另一个实施方案中，应用的药物包含以下(优选由以下组成)：(a)与树突细胞表面上的受体结合的分子，(b)与(a)的分子结合的包含抗原之蛋白质和(c)第一佐剂。
在又一个实施方案中，应用的药物包含以下(优选由以下组成)：(A)(a)与树突细胞表面上的受体结合的分子，(b)与(a)的分子结合的包含抗原之蛋白质和(c)第一佐剂以及(B)(d)复合的白介素-2(IL-2cx)、(e)加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂，或(f)(d)和(e)的组合，其中所述肽来自于如(A)中定义的包含抗原之蛋白质。
在另一个实施方案中，本发明涉及药盒(kit-of-parts)，其包含以下(优选由以下组成)：如上所定义的递送系统和如上所定义的再活化剂。
在又一个实施方案中，本发明涉及药盒，其包含以下(优选由以下组成)：(A)复合的白介素2(IL-2cx)和(B)加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及延长针对包含抗原之蛋白质的细胞之细胞毒性免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：
ii)向已针对抗原活化了T细胞的患者施用加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂，其中所述肽来自于包含抗原之蛋白质，从而使活化的T细胞再活化，并任选地还施用复合的白介素-2(IL-2cx)，
其中在针对抗原活化T细胞后0小时至14天的时间框架内施用步骤i)的再活化剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及诱导细胞之细胞毒性免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：
i)向患者施用递送系统，所述递送系统包含：(a)与树突细胞表面上的受体结合的分子，(b)与(a)的分子结合的包含抗原之蛋白质和(c)第一佐剂，其中在(a)的分子与所述受体结合后，(b)的蛋白质被内化并在所述树突细胞中被加工，并且包含在蛋白质中的抗原被呈递到所述树突细胞的表面上，从而活化所述患者中的T细胞；以及
ii)向患者施用再活化剂，所述再活化剂选自：(d)复合的白介素-2(IL-2cx)、(e)加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂，和(f)(d)和(e)的组合，其中所述肽来自于步骤i)中所限定的包含抗原之蛋白质，从而使步骤i)中活化的T细胞再活化，
其中步骤ii)的再活化剂在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天的时间框架内施用。
对于本发明的方法和本发明的药盒，相同的一些实施方案应用于本发明应用的药物。
附图
图1示出了将抗原靶向到XCR1+ DC中后细胞毒活性的诱导。
图2示出了通过诱导的细胞毒活性保护免受感染或免于接种癌细胞。
图3示出了通过注射加载有抗原肽SIINFEKL(SEQ ID NO：11)的同基因淋巴细胞获得的CD8+T细胞之细胞毒性的增强。
图4示出了通过联合应用加载肽的细胞和复合的IL-2高度协同扩增细胞毒性CD8+T细胞。
图5示出了抗原靶向和共同应用加载肽的细胞和复合的IL-2在治疗已建立的肿瘤中的协同作用。
图6示出了在使用多种模式的疫苗接种进行致敏后，低频率的细胞毒性CD8+T细胞可用ADAS强烈地扩增。(A)在第0天用200μg的可溶性非靶向卵清蛋白(OVA)或用5μg的mAbMARX10-OVA、DEC-205-OVA、33D1-OVA、MOPC21-OVA注射C57BL/6动物；在所有情况下，共同注射10μg的聚I：C作为佐剂。在第5天，获取血样并使用特异性四聚体通过流式细胞术确定SIINFEKL特异性CD8+T细胞的频率。(B)在第5天，用ADAS过程增强针对来自OVA的肽SIINFEKL的免疫应答(将10×106个加载有SIINFEKL的同基因脾细胞与作为佐剂的50μg聚I：C一起注射)。在第10天，将动物处死并使用所述四聚体在脾中确定SIINFEKL特异性CD8+T细胞的频率。(C)如(A)中所述对C57BL/6 Batf3-KO动物进行免疫接种以及如(B)中所述进行ADAS处理，以及在第10天在脾中确定SIINFEKL特异性CD8+T细胞的频率。
图7(A)R9-SIINFEKL多肽不在外部与MHC-I沟结合：在37℃，5％的CO2下，在完全RPMI 1640培养基中用1μM的SIINFEKL肽以5×106个细胞/ml的密度将C57BL/6脾细胞孵育2小时，或用1μM的R9-SIINFEKL多肽在2×106个细胞/ml的密度下孵育4小时。将细胞洗涤两次并用抗-SIINFEKL-H2Kb mAb(克隆25-D1.16)染色以确定肽加载到MHC-I沟的效率。此外，将细胞与多种谱系标志物共染色来鉴定不同的脾细胞群并通过流式细胞术进行分析。(B)R9-SIINFEKL可用于将抗原转运到原代细胞的细胞质区室，因此使MHC-I加载衍生的肽：用多种浓度(1-30μM)的R9-SIINFEKL多肽以2×106个细胞的密度如上将C57BL/6脾细胞孵育7小时。此后，将细胞洗涤两次，用mAb 25-D1.16染色以确定肽加载到MHC-I沟的效率，与谱系标志物共染色，并通过流式细胞术进行分析。在30μM多肽时，观察到显著的细胞死亡(未示出)。(C)加载R9-SIINFEKL的原代细胞可用于进行ADAS：在第0天向C57BL/6小鼠i.v.注射10×106个加载R9-SIINFEKL(5μM，7小时)的脾细胞，或注射10×106个加载SIINFEKL(2μM，2小时)的脾细胞用于进行比较，或注射2μg MARX10-OVA(全部具有10μg聚I：C)用于致敏，并在第5天测定CD8+T细胞的频率和细胞毒性潜力(颗粒酶B、KLRG1，未示出)。或者，用2μg的MARX10-OVA和10μg的聚I：C致敏C57BL/6小鼠并通过i.v.注射加载SIINFEKL(2μM，2小时)的脾细胞和50μg的聚I：C(阳性对照)在第5天进行ADAS。同时，用2μg MARX10-OVA，或2μg33D1-OVA，或2μg 1D3-OVA或200μg非靶向OVA(所有都与10μg的聚I：C一起)i.v.注射在第0天致敏C57BL/6小鼠，并通过i.v.注射加载R9-SIINFEKL(5μM，7小时)的同基因脾细胞和50μg的聚I：C进行ADAS。在第10天使用特异性四聚体通过流式细胞术确定SIINFEKL特异性CD8+T细胞的ADAS诱导的扩增。所有的CD8+T细胞显示出指示细胞毒性的标志物(颗粒酶B、KLRG1，未示出)。
图8抗原的施用可与致敏步骤中佐剂的应用分开：(A)在第0天用混合在一份溶液中的2μg MARX10-OVA以及作为佐剂的10μg聚I：C i.v.注射C57BL/6小鼠。或者，在第-1天用10μg聚I：C和在第0天用2μg MARX10-OVA注射小鼠。或者，在第0天用2μg MARX10-OVA和在第1天用10μg聚I：C注射小鼠。在每个实验组中，在第5天获取血液样品并使用特异性四聚体通过流式细胞术测定SIINFEKL特异性CD8+ T细胞的频率。(B)使(A)中描述的小鼠进行ADAS扩增过程(i.v.注射外部加载有SIINFEKL的脾细胞以及50μg聚I：C)并通过流式细胞术确定脾中SIINFEKL特异性CD8+T细胞的频率。可将抗原的施用与在ADAS过程中佐剂的应用分开。
图9通过将ADAS与施用复合的IL-15组合高度协同扩增细胞毒性CD8+T细胞：在第0天用2μg MARX10-OVA和10μg聚I：C致敏C57BL/6动物并使用特异性四聚体和流式细胞术在第5天(致敏)分析脾中SIINFEKL特异性CD8+T细胞的总数。在第5天使一些致敏的动物仅进行ADAS(注射10×106个加载SIINFEKL的脾细胞以及50μg聚I：C)，一些接受ADAS并在第6、7和8天i.p.注射IL-2cx(如在实施例4和5中所述)，另一些小鼠在第5天接受ADAS并在第6、7和8天i.p.注射复合的IL-15(IL-15cx)。在所有的ADAS处理组中，在第9天确定SIINFEKL特异性细胞毒性CD8+T细胞的总数。通过在37℃下将2μg IL-15cx(Peprotech#210-15)与9.3μg的sIL 15R-Fc(R&D，#551-MR-100)孵育20分钟产生用于1只小鼠的IL-15cx的剂量，添加PBS至500μl，并将该溶液i.p.注射。
图10ADAS可以抗原特异性方式扩增静息的记忆CD8+T细胞：在第-1天向C57BL/6小鼠过继转移2,000或10,000个OT-IT细胞并在第0天用MARX10-OVA和10μg的聚I：C致敏。在第5天在所有动物中进行ADAS(注射10×106个加载SIINFEKL的脾细胞以及50μg聚I：C)，并在第10和40天分析动物(A)OT-I T细胞和(B)内源性Thy1.1-阴性SIIFEKL-特异性CD8+T细胞的频率。另一组小鼠在第69天再次进行ADAS并在第74天分析(A)OT-I T细胞和(B)内源性SIINFEKL特异性CD8+T细胞的频率。
图11通过ADAS体内扩增体外活化的抗原特异性CD8+T细胞：从OT-I小鼠中分离脾细胞，并在完全培养基中用1.4nM的SIINFEKL肽培养3天。此后，用PBS洗涤细胞并将5×105个OT-I T细胞(如通过流式细胞术确定的)过继转移到初始C57BL/6小鼠中并在转移后不同时间点用ADAS处理动物。示出的是在过继转移后第5天进行ADAS时，对转移的CD8+T细胞的频率的影响。在第9天使用流式细胞术确定血液中所有CD8+T细胞中过继转移的CD8+T细胞的比例。在这些实验中，在血液中的频率对应于在动物的脾中的频率。
实施例
实施例1
在抗原靶向到XCR1+DC中后细胞毒活性的诱导(图1)
将模型抗原OVA重组融合至XCR1特异性mAb MARX10(Bachem，A等，Front Immunol3(2012)214)或重组融合至与XCR1受体特异性结合的趋化因子配体XCL1(Hartung，E等，JImmunol 194(2015)1069-1079)。当将MARX10-OVA或XCL1-OVA以低水平i.v.注射到初始C57BL/6小鼠中时，所述抗原被靶向到XCR1+DC中。如果在佐剂(3μg LPS，CpG或10μg的聚I：C)存在的情况下发生这种抗原致敏，则会诱导显著的细胞毒活性(示出了用聚I：C作为佐剂的数据)。通过在第6天用靶细胞(脾淋巴细胞)i.v.注射已致敏的动物来测试细胞毒活性，所述靶细胞先前在体外加载了SIINFEKL(SEQ ID NO：11)，一种来自OVA的肽。在加载后用荧光团CFSE将靶细胞标记至较高程度，同时用CFSE将非加载的对照脾淋巴细胞标记至低程度。如图1A中所示，用OVA+佐剂致敏动物导致消除几乎所有加载SIINFEKL的靶细胞的细胞毒活性。图1B示出了用靶向至XCR1+DC的不同量的抗原获得的剂量响应曲线。在使用MARX10-SIINFEKL或XCL1-SIINFEKL将免疫原性肽靶向到XCR1+ DC中后获得了相同的结果。
实施例2
通过诱导的细胞毒活性保护免受感染或免于接种癌细胞(图2)
C57BL/6小鼠用MARX10-OVA(含有2μg的OVA)和佐剂(10μg的聚I：C)致敏或不进行处理。5天后，用1×106CFU(＝5×LD50)的单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)菌株感染所有小鼠，其中已将肽序列SIINFEKL(SEQ ID NO：11)重组工程化到该菌株中(Foulds等，2002，J.Immunol.168，1528-1532)。虽然所有未处理的小鼠在3至4天内死亡，但是通过抗原致敏诱导的细胞毒性水平充分地保护所有动物免受疾病(图2A)。
用MARX10-OVA或XCL1-OVA(各自含有0.16μg的OVA)和佐剂(3μg的LPS)i.v.致敏C57BL/6小鼠，对照动物用PBS注射。7天后，用5×105个EG.7细胞(一种工程化以表达OVA的侵袭性同基因肿瘤系)注射所有的动物(Moore，M.W.等，Cell 54(1988)777-785)。而PBS处理的动物在14天后均显示出强的肿瘤生长，所有经免疫接种的动物在注射部位或其他地方均没有任何肿瘤组织，这表明诱导的细胞毒性水平保护动物免于肿瘤接种(图2B)。
实施例3
通过注射加载有抗原肽SIINFEKL(SEQ ID NO：11)的同基因淋巴细胞获得CD8+T细胞之细胞毒性的增强(图3)
在第-20、-15、-10、-7、-5或-3天，C57BL/6小鼠用MARX10-OVA(含有2μg的OVA)和佐剂(聚I、CpG或LPS，示出的是使用10μg聚I：C的数据)致敏。在第0天，用注射前在体外加载有SIINFEKL(SEQ ID NO：11)的10×106个脾细胞(图3A)i.v.注射已致敏的动物(“抗原依赖性扩增系统”，ADAS)。与加载肽的细胞一起注射佐剂(多种量的LPS或聚I：C)，示出的是使用50μg聚I：C的数据。第10天处死动物，并使用SIINFEKL特异性四聚体和流式细胞术在脾中确定SIINFEKL特异性CD8+T细胞的总数(图3A)。结果表明，用于扩增抗原特异性CD8+T细胞的系统在初始抗原刺激后5至9天的窄时间框架内是有效的(图3A)。
C57BL/6小鼠用MARX10-OVA(含有2μg的OVA)和佐剂(10μg的聚I：C)致敏。5天后，将在注射前在体外加载有SIINFEKL(SEQ ID NO：11)的10×106个脾淋巴细胞或纯化的T细胞、树突细胞或B细胞i.v.注射到已致敏的动物中。与加载肽的细胞一起注射佐剂(50μg聚I：C)。在用MARX10-OVA致敏后第10天，将动物处死并使用SIINFEKL特异性四聚体和流式细胞术在脾中确定SIINFEKL特异性CDS+T细胞的总数。结果表明，可以用在细胞表面上表达MHC-I的多个细胞群实现细胞毒性CD8+T细胞应答的增强。扩增的细胞表达高水平的效应分子(TNF-α、IFN-γ、颗粒酶B)。
实施例4
通过共同应用加载肽的细胞和复合的IL-2高度协同地扩增细胞毒性CD8+T细胞(图4)
C57BL/6小鼠用MARX10-OVA(含有2μg OVA)和佐剂(10μg聚I：C)致敏。在致敏后的第1、2、3天，用通过在4℃下过夜孵育IL-2(2μg)和抗IL-2 mAb JES6-5H4(10 μg，Sander，B.J Immunol Methods 166(1993)201-214)获得的复合的IL-2(IL-2cx)注射一组已致敏的小鼠并在第6天处死小鼠(“致敏+IL-2cx”)。在第5天用加载SIINFEKL的脾细胞(10×106)和佐剂(50μg聚I：C)注射另一组小鼠并在第10天处死(“致敏+ADAS”)。另一组小鼠在第5天用加载SIINFEKL的脾细胞(10×106)和佐剂(50μg聚I：C)注射以及在第6、7、8和9天用IL-2cx注射，并在第10天处死(“致敏+ADAS+IL-2cx”)。在每个实验结束时，使用SIINFEKL特异性四聚体和流式细胞术在脾中确定SIINFEKL特异性CD8+T细胞的总数。实验确定了ADAS和IL-2cx在抗原特异性细胞毒性CD8+T细胞的扩增中的高度协同作用。
实施例5
抗原靶向和共同应用加载肽的细胞和复合的IL-2在治疗已建立的肿瘤中的协同作用(图5)
C57BL/6小鼠s.c.注射5×105个EG.7细胞(一种工程化以表达OVA的侵袭性同基因肿瘤系(Moore，M.W等，Cell 54(1988)777-785)。在肿瘤注射后第6天，用MARX10-OVA(含有2μg OVA)和佐剂(10μg聚I：C)致敏小鼠，一组不进行处理。致敏后6天(第11天)，用加载SIINFEKL的脾细胞(10×106)和佐剂(50μg聚I：C)注射一组小鼠(“致敏+ADAS”)。在第12、13、14、15、16、17、18、19、21和23天仅用IL-2cx注射另一组已致敏的小鼠(“致敏+IL-2cx”)。在第11天用加载SIINFEKL的脾细胞(10×106)和佐剂(50μg聚I：C)注射另一组致敏的小鼠，以及在第12、13、14、15、16、17、18、19、21和23天用IL-2cx注射(“致敏+ADAS+IL-2cx”)。在第25天处死全部小鼠(一些对照动物必须更早处死，原因是其肿瘤直径变得＞1cm)。所有数据代表每个处理组(n＝6)中肿瘤尺寸的平均值(以mm2计)。结果表明，用靶向的OVA单独致敏注射肿瘤的小鼠并没有效果。相反，单独的IL-2cx或ADAS在约7至10天内致敏的小鼠中可有效地强烈减小肿瘤块，但此后就不能阻止肿瘤的生长。当向致敏的动物应用ADAS和IL-2cx的组合时，强烈减小了肿瘤块并且完全控制肿瘤直到实验结束(一些小鼠已经完全没有肿瘤组织)。
实施例6
多种免疫接种模式导致低频率的致敏的抗原特异性CD8+T细胞。借助于ADAS过程，这些通常可强烈地扩增并分化为杀伤CD8+T细胞。
Mab MARX10(Bachem等，Front Immunol 3(2012)214，EP2641915A1)识别XCR1(XCR1+DC的谱系标志物)，Mab DEC-205(NLDC-145，Kraal等，1986，从Biolegend获得)识别在鼠XCR1+DC上表达的CD205分子，mAb 33D1(Nussenzweig等，PNAS 79(1982)161-165，从ATCC获得)识别SIRPα+DC上的DCIR2分子，mAb 1D3识别B细胞上的CD19(Krop等，Eur JImmunol 26(1996)238-242，从ATCC获得)，mAb MOPC-21(Potter等，J Natl Cancer Inst26(1961)1109-1137，从Biolegend获得)不识别小鼠中的任何分子，并因此被用作IgG1同种型对照。XCL1是XCR1的趋化因子配体并且可以用于在小鼠中和人中将抗原靶向至XCR1+DC(Hartung等，J Immunol 194(2015)1069-1079)。
通过质谱鉴定mAb DEC-205、33D1、1D3、MOPC-21的重链和轻链的抗原结合区并通过标准重组技术将其接枝到mAb DEC-205的骨架上，如对于mAb MARX10先前描述的(Hartung等，J Immunol 194(2015)1069-1079)。先前已对该骨架进行修饰使其与Fc受体结合最小化。然后以这样的方式修饰所有构建体使OVA适于每个抗体的C末端融合蛋白，如先前对于mAb MARX10所描述的(Hartung等，J Immunol 194(2015)1069-1079)。如前所述产生XCL1-OVA(Hartung等，J Immunol 194(2015)1069-1079)。
在第0天用高量(200μg)的可溶性非靶向的OVA，或用5μg的mAb MARX10-OVA、DEC-205-OVA、33D1-OVA、MOPC21-OVA注射C57BL/6动物；在所有情况下，共同注射10μg聚I：C作为佐剂。在第5天，获取血样并使用加载有SIINFEKL且能够与SIINFEKL特异性CD8+T细胞结合的H-2Kb四聚体通过流式细胞术确定OVA特异性CD8+T细胞的频率。如图6A所示，所有的抗原应用模式(非靶向或靶向到XCR1+DC、SIRPα+DC或B细胞)诱导SIINFEKL特异性CD8+T细胞的初始扩增(“致敏”)，导致在血液中所有CD8+T细胞中约2％至3％的频率。在第5天，通过ADAS过程扩增针对来自OVA的肽SIINFEKL的免疫应答(注射10×106个加载SIINFEKL的同基因脾细胞以及50μg聚I：C)。在第10天，将动物处死，并在脾中确定SIINFEKL特异性CD8+T细胞的频率。此外，确定表示细胞毒性的几种标志物(KLRG1、穿孔蛋白、颗粒酶B，数据未显示)。在所有的情况下，ADAS过程将SIINFEKL特异性CD8+T细胞的初始频率提高约10倍(图6B)并诱导指示细胞毒性T细胞的表型(未示出)。
同时，用非靶向的或靶向的OVA试剂致敏C57BL/6背景下的Batf3-KO动物(缺乏XCR1+DC的动物，Hildner等，Science 322(2008)1097-1100)，如上。在第5天也通过ADAS过程处理Batf3-KO动物，如上。在第10天，将所有动物处死并在脾中确定SIINFEKL特异性CD8+T细胞的频率。而致敏后接着进行ADAS在所有的C57BL/6动物中得到高频率的SIINFEKL特异性CD8+T细胞(图6B)，在ADAS后在任何Batf3-KO动物中均没有观察到显著的SIINFEKL特异性应答(图6C)。
从这些实验可以得出若干结论。当与Th1佐剂一起应用时，使用高水平的非靶向蛋白进行免疫接种将导致初始频率的抗原特异性细胞毒性CD8+T细胞，如我们和其他人先前所证明的(Hartung等，J Immunol 194(2015)，1069-1079)。将抗原靶向到DC中使这种初次免疫接种更加有效得多，因为只需要少量的抗原来达到相同的效果(Hartung等，2015，Caminschi等，Front Immunol 3(2012)13)。出人意料地，甚至是将抗原靶向B细胞(在这种情况下通过CD19，一种在B细胞上特异性表达的表面分子)与将抗原靶向DC同样有效。这种效果既可通过抗原从B细胞转移到DC(Allan等，Immunity 25(2006)153-162)，或通过靶向抗体与DC上Fc受体的“非特异性”结合来解释。当使用MOPC-21(一种不识别小鼠免疫系统中任何抗原的同种型对照抗体)，后者的作用最有可能是致敏效率的原因。这些结果与先前的结果完全相容，其中通过表面受体Siglec-1将抗原靶向边缘的嗜金属巨噬细胞(metallophilic macrophage)也导致产生低频率的细胞毒性CD8+T细胞，但在Batf3-KO动物中不是如此(Backer等，Proc Natl Acad Sci USA 107(2010)216-221)。我们用BAF3-KO动物的实验与一般的假设一致，即初始T细胞的致敏必须通过DC发生。特别地，这些实验表明，这种最初的CD8+T细胞致敏需要XCR1+DC。因此，将抗原靶向到XCR1+DC中有望成为靶向蛋白抗原、编码抗原的核酸，或者编码抗原的病毒系统以实现良好的初级CD8+T细胞应答(“致敏”)的最有效方式。
总之，这些结果表明，与应用非靶向抗原相比，使用抗体或使用受体配体(例如，XCL1-OVA)将抗原靶向到常规DC、皮肤DC或其他DC(例如单核细胞衍生的DC、pDC)、巨噬细胞或其他细胞对于诱导初始的细胞毒性应答更高效。可以预期用蛋白质抗原进行所有类型的致敏(例如但不限于：通过采用脂质体、纳米颗粒以及其他系统作为抗原载体(Saroja等，Int J Pharm Investig 1(2011)64-74)将得到类似的结果，只要在Th1佐剂的情况下应用该蛋白即可。在文献中也很好地证明可通过非蛋白免疫接种诱导类似低初始频率的细胞毒性CD8+T细胞，例如但不限于：使用多种系统(靶向的或非靶向的)向身体应用或注射DNA或基于DNA的疫苗，或RNA或基于RNA的疫苗(Saroja等，Int J Pharm Investig 1(2011)64-74，Koup等，Cold Spring HarbPerspect Med 1(2011)a007252，Ulmer等，Vaccine30(2012)4414-4418，Kramps等，Wiley Interdiscip Rev RNA 4(2013)737-749)。使用病毒系统或减毒的病毒可实现相似的CD8+T细胞的致敏(Draper等，Nat Rev Microbiol 8(2010)62-73)。注射或应用基于RNA或DNA的制剂或非复制型病毒系统或减毒的病毒并不一定需要额外的Th1佐剂，因为这些药剂是自身佐剂的；即，这些药剂本身还代表Th1佐剂。
很显然，在基本上将疫苗递送到体内的所有方式中，初始CD8+细胞毒性应答将相对较弱。在许多情况下这样的弱应答不足以预防感染、治疗感染或根除癌性组织。因此，需要可强烈增强初始致敏的系统。
在我们的实验中，我们证明在其中初始的CD8+细胞毒性应答(致敏)不足以清除感染或肿瘤的所有情况下，可使用ADAS过程进行扩增。
此外，具有肿瘤组织或死细胞的患者的免疫接种将导致致敏CD8+T细胞区室(deGruijl等，Cancer Immunol Immunother 57(2008)1569-1577)，并因此将使这些细胞易受ADAS过程。
或者，可通过从患者中分离先前存在的肿瘤或病原体特异性CD8+T细胞，将其在体外活化并扩增，并注回到患者中来实现初级CD8+T细胞活化。这些过继转移的(再注射的)CD8+T细胞将被再活化，并通过ADAS过程进一步扩增并分化为细胞毒性T细胞。
在所有的情况下，可通过随后注射复合的IL-2(实施例4、5)或复合的IL-15(参见实施例9)进一步协同增强ADAS扩增。
在我们的实验中，我们使用聚I：C作为佐剂。使用所有类型的Th1佐剂(例如但不限于：聚I：C、RIG-I激动剂和TLR8激动剂)可以实现类似的结果。
实施例7
ADAS将抗原递送到原代细胞的细胞质区室中导致MHC-I有效地加载来自于抗原的肽
我们已经证明，多种原代细胞(例如B细胞、T细胞、DC、脾细胞)的MHC-I外部加载来自于抗原的肽(例如，SIINFEKL)可用于ADAS。我们预期同样的方法也可用于将全蛋白质引入原代细胞中或在细胞内表达蛋白质的多种方法，如上所述。
为了进一步举例说明这个观念，我们已经使用作为细胞穿透肽(cell-penetrating peptide，CPP，Milletti 2012，Bechara等，2013)的一段9个精氨酸残基来将包含抗原的蛋白质(多肽)运送到原代细胞中。这37aa多肽(称为R9-SIINFEKL)的完整序列是RRRRRRRRRGYPYDVPDYALEQLESIINFEKLTEWTS(SEQ ID No.13)。
在MHC-I的情况下，在衍生的抗原肽(SIINFEKL)被呈递到细胞表面上之前，R9-SIINFNEKL需要蛋白酶体的细胞内加工。因此，该系统可作为将全蛋白引入到原代细胞中的模型，所述全蛋白随后被蛋白酶体加工成片段，其中一些片段在MHC-I的情况下随后被呈递在细胞表面上。
该多肽不可直接在外部结合到MHC-I的沟中。为了证明这一点，在37℃下在完全培养基中，我们用1μM的多肽R9-SIINFEKL孵育C57BL/6小鼠的脾细胞4小时。同时，用可在外部直接与MHC-I结合的1μM的肽SIINFEKL将脾细胞孵育仅2小时。孵育后，洗涤细胞并使用在MHC-I H2Kb的情况下识别SIINFEKL的mAb 25 D1.16通过流式细胞术进行分析(Porgador等，Immunity 6(1997)715-726)。同时用SIINFEKL孵育脾细胞，在巨噬细胞、B细胞、T细胞、PDC和DC中得到强信号，如所预期的(因为SIINFEKL在外部与MHC-I结合)，用R9-SIINFEKL多肽没有得到任何信号(图7A)。该实验直接证明了R9多肽不可直接装入MHC-I沟中并充当抗原。
在接下来的步骤中，以浓度提高的R9-SIINFEKL多肽(1-30μM)孵育脾细胞7小时。孵育和洗涤后，通过用mAb 25-D1.16染色确定加载SIINFEKL的MHC-I的量。如图7B所示，所有经检测的原代脾细胞表现出剂量依赖性信号。虽然无法直接测量，但可以假设MHC-II也以类似的方式加载。该实验证明，多肽一旦由CPP运送到原代细胞的细胞质区室中后，将被加工并在MHC-I(和MHC-II)的情况下呈递。
从该实验中，可以推断出同样的过程也适用于全蛋白质，其在MHC-I(和MHC-II)的情况下被呈递之前也需要被加工。事实上，用全OVA已经证明了MHC-I与SIINFEKL类似的加载，使用标准重组技术以使一段9个精氨酸残基N-末融合到所述全OVA上。在该实验中，OVA被正确地加工并在MHC-I的情况下呈递，如通过用mAb-25 D1.16染色确定的(Mitsui等，JInvestDermatol 126(2006)1804-1812)。因此，与文献一致的我们的实验证明，利用CPP原理将未加工的多肽或蛋白质引入到细胞中将有效地加载该细胞的MHC-I(和MHC-II)。
从该实验中可以推断出，任何类型的原代细胞内部加载蛋白质和未加工的肽将导致来自该材料的肽的有效MHC-I呈递。
原代细胞这样的内部加载可类似地用将肽或蛋白质引入到细胞中的其他方法实现，例如但不限于：电穿孔或通过多种方法(例如但不限于：转染、脂转染、转导、注射、弹道注射(ballistic injection)、感染)引入编码肽和蛋白质的核酸。
然后，我们测试了使用R9-SIINFEKL内部加载的原代细胞的生物效价。为此，用5μM的R9-SIINFEKL将来自C57BL/6小鼠的脾细胞孵育7小时并洗涤。然后，在第0天将其i.v.注射到初始C57BL/6动物中并与i.v.注射加载SIINFEKL的脾细胞或i.v.注射MARX10-OVA进行比较。所有的制备物都与作为佐剂的聚I：C一起应用。正如图7C中可以看出，抗原递送的所有方法诱导低频率的SIINFEKL特异性细胞毒性CD8+T细胞，如用特异性四聚体和通过表型分析(表达颗粒酶B、KLRG1)评估的，MARX10-OVA是抗原递送的最高效的方法。
在下一步骤中，评估了加载R9-SIINFEKL的脾细胞在ADAS过程中的能力。在该实验中，用加载SIINFEKL的脾细胞由MARX10-OVA和ADAS致敏作为阳性对照，并产生约20％的SIINFEKL特异性细胞毒性CD8+T细胞(图7C)。在用MARX10-OVA、33D1-OVA、1D3-OVA或高量的非靶向OVA致敏后，加载R9-SIINFEKL的脾细胞在ADAS过程中与加载SIIFEKL的脾细胞类似地有效(也比较图7A)。该实验证明，原代细胞任何类型的抗原有效的内部加载对于ADAS将是高效的。这种加载可用未加工的多肽、全蛋白质或用与编码肽或蛋白质的核酸，或使用感染原或重组修饰以编码期望多肽或蛋白质的病毒或细菌载体系统进行。
实施例8
在致敏步骤和在ADAS过程二者中Th1佐剂的应用可在时间上与抗原的应用分开
目前一般认为，抗原必须与抗原一起应用来实现宿主的免疫接种。因此，抗原通常与佐剂混合并一起应用。目前一般认为，理想地，佐剂甚至应与抗原物理上连接以达到最佳结果。因此，我们非常出人意料地认识到，在致敏和ADAS过程中抗原施用与佐剂递送的分开产生良好的且甚至更好的免疫应答。
在第0天C57BL/6小鼠i.v.注射混合在一份溶液中的2μg MARX10-OVA与作为佐剂的10μg聚I：C。或者，小鼠在第-1天注射10μg 的聚I：C并在第0天注射2μg MARX10-OVA。或者，小鼠在第0天注射2μg MARX10-OVA并在第1天注射10μg的聚I：C。在每个实验组中，在第5天获取血液样品并通过流式细胞术确定SIINFEKL特异性CD8+T细胞的频率。如图8A中可以看出的，在第0天抗原和佐剂的联合施用产生所有CD8+T细胞的约2％的致敏频率。相反，在施用抗原前一天施用佐剂看来无效。非常出人意料的是，在第0天施用抗原且在第1天施用佐剂最有效，在第5天产生所有CD8+T细胞的约4％的频率。
当用ADAS过程(i.v.注射外部加载有SIINFEKL的脾细胞和50μg的聚I：C)处理所有的实验组时，联合应用抗原和佐剂的组有约15％的SIINFEKL特异性细胞毒性CD8+T细胞。显然，其中在抗原后1天应用佐剂的组获得最好的结果(约30％的SIINFEKL特异性CD8+T细胞)。有趣的是，即使在抗原之前1天应用聚I：C的组中，也只有低水平的SIINFEKL特异性T细胞(约5％)，这表明甚至在这一组中也实现了一定的致敏(其然后通过ADAS过程中实现的扩增变得可测量)。
这些实验清楚地证明，在致敏的过程中可在时间上分开应用抗原和佐剂。事实上，结果表明在施用抗原后一段时间应用佐剂相对于组分的联合应用是有利的。我们的结果表明，甚至是在抗原的应用后数天应用佐剂也是有效的。在人中不能确定确切的时间框架，需要估计也为1至2天，可能多至3天。
实施例9
通过将ADAS与施用复合的IL-15相组合高度协同地扩增细胞毒性CD8+T细胞
我们已经证明，在第0天用MARX10-OVA(2μg)和聚I：C(10μg)致敏后，在第1、2、和3天注射复合的IL-2(IL-2cx＝与阻断IL-2与其高亲和力受体CD25结合的抗体复合的鼠IL-2)，在第6天并没有显著提高致敏的CD8+T细胞的数目。然而，当在第0天用MARX10-OVA(2μg)和聚I：C(10μg)致敏动物并在第5天进行ADAS(与50μg的聚I：C一起注射加载有SIINFEKL的10×106个脾细胞)时，在6、7、8和9天注射IL-2cx显著地提高了第10天在脾中SIINFEKL特异性CD8+T细胞的数目(实施例4和图4)。
不进行ADAS，在第6、7、8和9天注射IL-2cx基本上不提高脾中SIINFEKL特异性CD8+T细胞的数目(未示出)，但在降低肿瘤负荷方面有效。显然，ADAS过程以这样的方式重新活化了致敏的CD8+T细胞，即，使其对IL-2cx的作用高度敏感，并且这导致细胞毒性CD8+T细胞的强烈扩增。然而，导致这种对IL-2cx敏感性高度增强的确切分子机制仍未确定。
C57BL/6动物在第0天用2μg MARX10-OVA和10μg聚I：C致敏并在第5天使其进行ADAS(注射与50μg聚I：C一起的10×106个加载SIINFEKL的脾细胞)。如前所述中，ADAS过程将SIINFEKL特异性CD8+T细胞的水平从第5天的约200,000提高至ADAS后第10天的约2×106个细胞(图9)。然后在第6、7和8天用复合的IL-15(IL-15cx)或IL-2cx(用于比较)注射ADAS处理的动物(如上所述)。在第9天，使用流式细胞术在脾中测定SIINFEKL特异性CD8+T细胞的总数。如图9中可以看出的，在ADAS过程后强烈扩增SIINFEKL特异性CD8+T细胞的数目方面，反复注射IL-15cx与反复注射IL-2cx类似地有效。可将IL-15cx(如IL-2cx)i.v.、s.c.、i.p.注射或注射到肿瘤中来达到这种效果。IL-15cx的注射也提高颗粒酶B的细胞水平和KLRG1的表达，表明提高的细胞毒性(未示出)。
出人意外地，因此该实验揭示IL-15cx与IL-2cx的作用类似，可强烈增强ADAS-再活化的抗原特异性CD8+T细胞的水平。从该实验可以推断，其中注射IL-2cx对细胞毒性免疫应答的增强有益的所有情况下(如上所述)，IL-15cx也将是有效的。
实施例10
ADAS过程可用于以抗原特异性的方式再活化和扩增记忆CD8+T细胞
对于在第0天用2μg MARX10-OVA和10μg聚I：C致敏的初始动物，我们可证明在第3天进行ADAS对于增强应答相当无效，但在此后变得有效且至少直到第20天仍一定程度地继续有效(实施例3和图3)，并且在小鼠中在第4天至第9天最有效。
在这些实验中，ADAS用于扩增新活化的初始抗原特异性CD8+T细胞。ADAS仅在CD8+T细胞初始活化后一定时间窗口内发挥最佳作用的事实表明，这些T细胞必须处于特定的活化阶段以对ADAS扩增敏感。
因此，我们想知道对静息记忆CD8+T细胞是否也可进行ADAS，其与新活化的CD8+T细胞相比具有明显不同的活化状态。为此，在第-1天用2,000或10,000的OT-I CD8+T细胞(其具有在H-2Kb的情况下呈递的SIINFEKL特异性的T细胞受体)过继转染C57BL/6小鼠。这些转移的OT-I T细胞带有遗传标志物Thy1.1(CD90.1)，使其有可能与内源性T细胞区分开(比较Dorner等，2009)。在第0天，用MARX10-OVA与10μg聚I：C一起致敏动物。在第5天进行ADAS(与50μg的聚I：C一起注射10×106个加载SIINFEKL的脾细胞)，导致在过继转移的这两组动物中在第10天脾中所有CD8+T细胞的30％频率的OT-I T细胞(图10A)。在第40天分析了来自相同实验组的动物，如所预期的，其OT-I CD8+T细胞的频率已经下降到1至2％(图10A)。在第69天，进行另一ADAS扩增(与50μg聚I：C一起注射10×106个加载有SIINFEKL的脾细胞)并在5天后(第74天)确定脾中OT-I T细胞的频率。通过ADAS扩增，OT-I T细胞的频率再次上升到脾中所有CD8+T细胞的30％-60％。
在用OT-I T细胞过继转移的所有动物中，我们还分析了内源性CD8+T细胞的应答，因为对于Thy 1.1标志物，这些可被鉴定为CD8+T细胞阴性，但用SIINFEKL-四聚体可染色。如图10B中所示，内源性SIINFEKL反应性CD8+T细胞显示出与OT-I T细胞类似的行为。特别地，ADAS过程可高度扩增内源性SIINFEKL-特异性记忆T细胞并且这些T细胞带有所有典型的细胞毒性CD8+T细胞(颗粒酶B阳性、KLRG1表达，数据未显示)的表型标志。
这些实验确定了ADAS过程可以抗原特异性方式再活化和大规模扩增静息记忆CD8+T细胞，以使它们再次变成CD8+细胞毒性效应物。由于ADAS过程产生其中应答于IL-2cx和IL-15cx的T细胞的状态，这两种细胞因子制备物将进一步强烈增强记忆CD8+T细胞对ADAS的应答。
总之，ADAS不仅可以在活化之后的一定时间窗口内以抗原特异性方式扩增新活化的初始CD8+T细胞，还可以扩增静息记忆CD8+T细胞。
实施例11
ADAS对于体外活化的过继转移的CD8+T细胞也有效
在过继性T细胞疗法中，抗原特异性CD8+T细胞(例如，针对CMV抗原或任何其他致病抗原的T细胞或针对指定的肿瘤抗原的T细胞)是从患者的PBMC中富集的。其通过例如用抗原肽或来自该病原体(例如CMV)的蛋白质或肿瘤体外刺激PBMC后使用IFN-γ分泌捕获与磁性细胞分选组合来实现。然后，通过添加全抗原或更通常是肽抗原进一步刺激富集的抗原特异性CD8+T细胞，然后在体外扩增。扩增后，然后再将活化的CD8+T细胞注入到患者以达到期望的治疗效果(消除病原体或肿瘤)。目前，重新注射的CD8+T细胞在体内的寿命期短，其分泌IFN-γ的能力有限，并且它们的细胞毒潜力不理想。我们已发现，使用ADAS过程可非常显著地改进过继T细胞疗法的这一缺点。
在体外用肽SIINFEKL将OT-I小鼠的脾细胞活化3天，没有佐剂。然而，CD8+T细胞的这种活化也可在Th1佐剂的存在下完成。培养后，第0天将细胞(此时由97％的OT-I CD8+T细胞构成)转移到同基因的C57BL/6小鼠中。在第0、1、2、3、4、5或6天的任一天应用ADAS(i.v.注射10×106个加载SIIFEKL的脾细胞和50μg聚I：C)。在1、2或3天ADAS对宿主动物中的过继转移的CD8+T细胞频率没有任何显著作用。然而，在第4天应用ADAS可以观察到转移的CD8+T细胞的明显扩增，并且在第5天进行ADAS看到最佳扩增(图11)。同时，表面标志物KLRG1的表达(其指示转移的CD8+T细胞向效应细胞的成熟)由在ADAS第1天的30％-40％提高至第5和6天的80％-90％，这些数据使得得出结论，ADAS过程能够强烈扩增体外活化和过继转移抗原特异性CD8+T细胞群。与此同时，ADAS诱导这些CD8+T细胞进一步分化为细胞毒性效应细胞。ADAS的最佳时间点在人中可以不同，因为在小鼠中的实验不允许在人中进行精确的预测。因此，对过继转移的CD8+T细胞最佳的ADAS作用的时期可以更长，例如直到12或14天。也可以预期ADAS不仅在过继转移后0小时至14天的短时间框架内有效，而且当过继转移的CD8+T细胞在已经恢复到记忆状态后的长时间之后也有效。
Claims (15)
1.药物，其用于诱导细胞之细胞毒性免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：
i)向患者施用递送系统，所述递送系统包含：(a)与树突细胞表面上的受体结合的分子，(b)与(a)的分子结合的包含抗原之蛋白质和(c)第一佐剂，其中在(a)的分子与所述受体结合后，(b)的蛋白质被内化并在所述树突细胞中被加工，并且包含在所述蛋白质中的所述抗原被呈递到所述树突细胞的表面上，从而活化所述患者中的T细胞；以及
ii)向所述患者施用选自以下的再活化剂：(d)复合的白介素-2(IL-2cx)、(e)加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂，以及(f)(d)和(e)的组合，其中所述肽来自于步骤i)中所限定的包含抗原之蛋白质，从而使步骤i)中活化的T细胞再活化，
其中步骤ii)的再活化剂在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天的时间框架内施用。
2.权利要求1所述应用的药物，其中
(x)所述复合的白介素-2(IL-2cx)反复施用，特别是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14次，甚至更优选其中所述复合的白介素-2(IL-2cx)每1或2天施用，和/或在5天至1个月、甚至更优选1至2周期间反复施用，和/或
(xx)来自于所述包含抗原之蛋白质的所述肽的长度为8、9或10个氨基酸和/或是由MHC-I，优选由等位基因HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24或HLA-A30，更优选由等位基因HLA-A2呈递的肽。
3.权利要求1或2所述应用的药物，其中树突细胞表面上的所述受体是交叉呈递树突细胞表面上的受体。
4.权利要求2或3所述应用的药物，其中树突细胞表面上的所述受体是趋化因子(C基序)受体1(XCR1)、连接蛋白样分子2、c型凝集素(CLEC)如CLEC9A，优选地树突细胞表面上的所述受体是XCR1。
5.权利要求1至4中任一项所述应用的药物，其中a)的分子是所述受体的配体或者针对所述受体的抗体或抗体片段，特别地其中所述受体是趋化因子(C基序)受体1(XCR1)，并且其中a)的分子是抗XCR1抗体或其片段或者趋化因子(C基序)配体1(XCL1)或其功能活性变体，其特别地包含以下任意序列或由其组成：SEQ ID NO：7至10，优选SEQ ID NO：8至10，更优选SEQ ID NO：9或10，尤其是SEQ ID NO：10。
6.权利要求1至5中任一项所述应用的药物，其中
-(b)的包含抗原之蛋白质与a)的分子处于融合蛋白中；和/或
-(b)的包含抗原之蛋白质的抗原是免疫原、病原体来源的抗原或肿瘤抗原。
7.权利要求1至6中任一项所述应用的药物，其中c)的第一佐剂和第二佐剂独立地为支持Th-1介导的应答的佐剂，优选地它们独立地选自：合成的或重组的RIG-I激动剂；TLR配体，例如瑞喹莫德(R848)、聚ICLC或聚肌苷酸∶聚胞苷酸(聚I∶C)；Montanide；皂苷；脂多糖(LPS)和CpG寡脱氧核苷酸，更优选地选自RIG-I-激动剂，以及TLR配体，例如瑞喹莫德(R848)、聚ICLC或聚肌苷酸∶聚胞苷酸(聚I∶C)。
8.权利要求1至7中任一项所述应用的药物，其中所述再活化剂是加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂，其中
-所述细胞优选为血细胞，尤其是外周血单个核细胞(PBMC)，更优选与IL-2cx组合，和/或
-所述细胞和所述第二佐剂在施用步骤i)的递送系统后0小时至14天的时间框架内施用仅一次。
9.权利要求1至8中任一项所述应用的药物，其中所述T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞，优选CD8+T细胞。
10.权利要求1至9中任一项所述应用的药物，其中所述时间框架为72小时至12天，优选72小时至9天，更优选5天至8天、5天至9天或5天至12天。
11.药物，其用于延长针对包含抗原之蛋白质的细胞之细胞毒性免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：
i)向已针对抗原活化了T细胞的患者施用加载肽的I类主要组织相容性复合体(MHC-I)呈递细胞和第二佐剂，其中所述肽来自于所述包含抗原之蛋白质，从而使活化的T细胞再活化，并任选地还施用复合的白介素-2(IL-2cx)，
其中步骤i)的再活化剂在针对抗原活化所述T细胞后0小时至14天的时间框架内施用，优选其中步骤i)的再活化剂在针对抗原活化所述T细胞后0小时至14天的时间框架内施用仅一次。
12.权利要求11所述应用的药物，其中
(x)所述MHC-I呈递细胞是血细胞，尤其是外周血单个核细胞(PBMC)，和/或
(xi)所述复合的白介素-2(IL-2cx)施用、优选反复施用特别是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14次，甚至更优选其中所述复合的白介素-2(IL-2cx)每1或2天施用，和/或在5天至1个月、甚至更优选1至2周期间反复施用，和/或
(xii)来自于所述包含抗原之蛋白质的所述肽的长度为8、9或10个氨基酸和/或是由MHC-I，优选由等位基因HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24或HLA-A30，更优选由等位基因HLA-A2呈递的肽。
13.权利要求1至12中任一项所述应用的药物，其中所述患者是人。
14.权利要求1至13中任一项所述应用的药物，其中所述诱导细胞之细胞毒性免疫应答的方法用于预防性治疗或治疗肿瘤和/或感染。
15.药盒，其包含权利要求1和5中任一项所限定的递送系统和权利要求1或8中所限定的再活化剂。
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