CN103458924A - 含有4-1bbl的佐剂组合物 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Abstract
链霉亲和素（SA）-4-1BBL和TLR激动剂（例如单磷酰脂质A（MPL））作为佐剂在诱导针对弱抗原的免疫反应方面表现出意想不到的协同效应。因此，本发明提供一种包含4-1BBL和toll-样受体（TLR）激动剂（例如MPL）的佐剂组合物，本发明还提供在受治者体内诱导针对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括将（a）所述抗原，（b）TLR激动剂和（c）4-1BBL给药于所述受治者，并且本发明还提供治疗受治者体内的肿瘤或癌症的方法，所述方法包括将（a）与所述肿瘤或所述癌症有关的抗原，（b）TLR激动剂和（c）4-1BBL给药于所述受治者。
Description
美国政府的基金支持
本发明的工作部分受到NIH肯塔基肺癌研究项目W.M.Keck基金会和肯塔基研究测试信托基金（Kentucky Research Challenge Trust Fund）联合会给予的基金资助。本发明是在国家健康研究所（National Institutes of Health）颁发的款项R41CA121665，R44AI071618和R43AI074176的政府支持下做出的。政府享有本发明中的一些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年2月10日提交的美国临时申请第61/441,392号的申请日的权益。
技术领域
本发明总体上涉及当将诸如单磷酰脂质A（MPL）之类的toll-样受体（TLR）激动剂与4-1BBL联合作为佐剂时所观察到的意想不到的有效协同效应，以及加强针对抗原的免疫反应的相关组合物和方法，以及预防和治疗包括癌症在内的疾病的相关方法。
背景技术
治疗性疫苗为常规癌症治疗的优选替代方法，这主要是由于治疗性疫苗的安全特性以及治疗性疫苗产生长期免疫记忆，长期免疫记忆对于控制疾病的复发至关重要，复发是癌症死亡的主要原因。基于肿瘤相关抗原（TAA）的治疗性疫苗尤其受到关注，因为其易于生产、可规模化生产、易于储存以及可给药于众多患者群。然而，由于中枢和外周耐受机制，这种疫苗的效力因自身TAA的弱的抗原性质而被减弱（1，2）。尽管本领域中不断产生有良好前景的结果，但是也存在超过二十年的跟踪记录显示癌症疫苗失败。类似的失败结果还在其他免疫环境中发现，包括针对感染性疾病、自身抗原的疫苗和针对诸如毒素和成瘾性药物之类的半抗原的疫苗。
3-O-去酰基-4’-单磷酰脂质A（MPL）是FDA批准的无毒形式的脂多糖，其用作针对HPV感染的预防性疫苗的佐剂成分（5）。也将MPL作为其他环境中的佐剂进行研究。MPL是toll-样受体4（TLR-4）激动剂，该激动剂例如，脂质A，脂多糖和其他结构相关化合物。CpG是结构上不具有相似性的TLR激动剂。MPL主要靶向先天性免疫，导致诸如树突细胞（DC）之类的抗原呈递细胞（APC）的募集、活化和成熟，所述树突细胞促进获得性免疫反应的产生（6）。
4-1BBL为TNF家族的成员。4-1BBL为靶向CD8+T细胞的共刺激分子，从而活化CD8+T细胞、使CD8+T细胞获得效应功能、使CD8+T细胞存活并实现长期记忆（15-17）。4-1BBL还能够刺激CD4+Treg细胞，从而诱导针对给定抗原的耐受性（美国专利第7,745,215号）。4-1BBL在细胞表面表达并且在可溶形式中不起作用。4-1BBL的细胞外功能结构域可融合于链霉亲和素（SA）的改良形式以产生嵌合分子（SA-4-1BBL），该嵌合分子由于SA的结构特征而以四聚体和寡聚体的形式存在（12）。
发明内容
本发明涉及如下意想不到的发现：诸如单磷酰脂质A（MPL）之类的toll-样受体（TLR）激动剂和4-1BBL作为佐剂组合物在诱导针对联合施用的抗原的免疫反应方面的协同效应。在一些实施方式中，本发明提供含有4-1BBL和TLR激动剂的组合物。在一些实施方式中，TLR激动剂为TLR4激动剂，例如，脂多糖、脂质A或化学类似物（例如，MPL）。在一些实施方式中，本发明提供包含4-1BBL和MPL的组合物。4-1BBL可以为融合蛋白，例如，链霉亲和素-4-1BBL融合蛋白。在一些实施方式中，4-1BBL融合蛋白通过链霉亲和素部分形成更高级的结构，例如，三聚体和聚集体。在一些实施方式中，所述组合物还包括药学上可接受的赋形剂。
在其他实施方式中，所述组合物还包括抗原。所述抗原可存在于含有4-1BBL的结合体中，例如，含有与SA-4-1BBL复合的生物素化的抗原的结合体。合适的抗原包括肿瘤相关抗原或癌症相关抗原，自身抗原，与感染原相关的抗原或半抗原。合适的癌症相关抗原或肿瘤相关抗原包括：人端粒酶逆转录酶（hTERT），存活素，MAGE-1，MAGE-3，人绒毛膜促性腺激素，癌胚抗原，α甲胎蛋白，胰胎瘤抗原，MUC-1，CA125，CA15-3，CA19-9，CA549，CA195，前列腺特异性抗原，前列腺特异性膜抗原，Her2/neu，gp-100，突变的K-ras蛋白，突变的p53，截短的表皮生长因子受体，嵌合蛋白p210BCR-ABL，人乳头瘤病毒的E7蛋白，埃巴氏（Epstein-Barr）病毒的EBNA3蛋白，cTAGE-1和变体，BLA或酰基鞘氨醇三己糖（globotriaosylceramide）（Pk抗原），人T-细胞白血病病毒相关细胞膜抗原（HTLV-MA），胸腺细胞表面抗原JL1，成人T细胞白血病相关抗原，人逆转录病毒相关抗原（ATLA），间变性淋巴瘤激酶（ALK），融合蛋白（NPM/ALK和变体），常见急性淋巴母细胞性白血病抗原（CALLA），免疫球蛋白Id，II型糖蛋白（例如，HM1.24，KW-2，KW-4，KW-5，KW-12），胎瘤抗原未成熟层粘连蛋白受体蛋白（OFA-iLRP）以及EBV蛋白（例如，LMP2A）。
与感染原有关的抗原包括来自于HIV、流感、疟疾、肺结核、葡萄球菌和链球菌的那些抗原。
本发明还提供诱导受治者体内的针对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括将（a）所述抗原，（b）TLR激动剂和（c）4-1BBL（例如SA-4-1BBL）给药于所述受治者。合适的TLR激动剂包括TLR4激动剂，例如，脂多糖，脂质A和化学类似物（例如MPL）。还可进行再次给药和/或后续给药。而且，所述抗原可存在于含有4-1BBL的结合体中。在实施本发明的方法中，抗原、TLR激动剂（例如MPL）和4-1BBL中的任何两个或两个以上可作为同一组合物的一部分给药或可通过相同或不同的给药途径以单独组合物的形式同时或顺序给药。
本发明还提供治疗受治者体内的肿瘤或癌症的方法，所述方法包括将（a）与所述肿瘤或所述癌症有关的抗原，（b）TLR激动剂（例如MPL），（c）4-1BBL（例如SA-4-1BBL）给药于所述受治者。合适的TLR激动剂包括TLR4激动剂，例如，脂多糖，脂质A和化学类似物（例如MPL）。还可用相同或不同的抗原进行再次给药和/或后续给药。而且，所述抗原可存在于含有4-1BBL的结合体中。而且，所述抗原、TLR激动剂（例如MPL）和4-1BBL中的任何两种或两种以上可作为同一组合物的一部分给药或者可通过相同或不同的给药途径以单独组合物的形式同时或顺序给药。
在本文描述的任何实施方式中，除了4-1BBL之外，还可使用诸如OX-40L/CD137L之类的其他免疫共刺激分子。所述其他免疫共刺激分子（例如，OX-40L/CD137L）可存在于含有亲和素或链霉亲和素的融合蛋白中。在实施本发明的方法中，如同抗原、TLR激动剂（例如MPL）和4-1BBL中的任何一种或一种以上，所述其他免疫共刺激分子可作为同一组合物的一部分给药或者可通过相同或不同的给药途径以单独组合物的形式同时或顺序给药。
附图说明
图1：单次接种SA-4-1BBL/MPL佐剂体系根除了小鼠中构建的TC-1肿瘤。（A）以皮下的方式用1x105个活TC-1细胞对C57BL/6小鼠进行肿瘤激发。不接种疫苗（PBS）或者在肿瘤激发后第6天皮下接种一次混合有对照SA蛋白（10μg）的E7（50μg）、混合有SA-4-1BBL（25μg）的E7（50μg）、混合有MPL（25μg）的E7（50μg）或者混合有SA-4-1BBL和MPL这两种试剂（25μg/试剂）的组合的E7（50μg）。用log-rank测试和Kaplan-Meier方法进行分析。与所有其他组比较的*P<0.05，但是SA-4-1BBL没有显著性（ns）。（B）给出每一组中的动物个体的来自于（A）的数据。
图2：接种SA-4-1BBL/MPL佐剂体系诱导很强的抗肿瘤CD8+T细胞效应和与疫苗效力相关的记忆反应。使用与首次接种所使用的疫苗制剂相同的指定疫苗制剂对长期（>90天）存活的小鼠进行加强接种。7天后收获淋巴结细胞并且评估（A）表达细胞内IFN-γ单细胞因子的E749-57肽特异性CD8+T细胞，（B）表达IFN-γTNF-α双细胞因子的E749-57肽特异性CD8+T细胞和（C）表达IFN-γTNF-αIL-2三细胞因子的E749-57肽特异性CD8+T细胞。（D）对来自相同组的脾细胞进行表型鉴定以测试效应记忆CD44hiCD62L低CD8+T细胞的百分比。每个插图中的数据为两个独立实验的代表性数据，所述独立实验中的每一组包括3至4只小鼠。P值如所示的并且使用单因素ANOVA和TukeyHSD测试计算P值（ns=没有显著性）。
图3：接种SA-4-1BBL/MPL佐剂体系使肿瘤内Teff/Treg细胞比例提高。带有TC-1肿瘤（直径为约3mm至4mm，n=4/组）的小鼠皮下接种单独的E7蛋白（50μg）或者含有SA-4-1BBL（25μg）的E7蛋白（50μg）、含有MPL（25μg）的E7蛋白（50μg）或者含有SA-4-1BBL和MPL这两种试剂（25μg/试剂）的组合的E7蛋白（50μg）。接种后一周，收获肿瘤，并对肿瘤内CD8+T细胞和CD4+Foxp3+Treg细胞进行染色，随后使用共聚焦显微镜进行分析。（A）肿瘤切片的共聚焦图片显示用抗-CD4抗体、抗-Foxp3抗体和Hoechst染色的CD4+Foxp3+Treg细胞（上图，明亮细胞）以及用抗-CD8抗体和Hoechst染色的CD8+T细胞（下图，明亮斑点）；（B）肿瘤内CD4+Foxp3+Treg细胞的定量分析；（C）CD8+T细胞；（D）CD8+Teff/Treg细胞比例。P值如所显示的并且使用单因素ANOVA和TukeyHSD测试计算P值（ns=没有显著性）。
图4：实现SA-4-1BBL/MPL佐剂体系的疗效需要CD8+T细胞，而Treg细胞破坏MPL单一治疗的疗效。在使用构建的TC-1肿瘤模型，接种E7TAA和指定的佐剂体系的前一天，分别使用抗CD8分子的抗体和抗CD4分子的抗体消除CD8+T细胞和Treg细胞。PBS组、E7+MPL组和E7+MPL+SA-4-1BBL组的数据来自图1。
图5：接种SA-4-1BBL/MPL佐剂体系在3LL肺转移模型中产生有效的治疗反应。通过静脉内尾部注射，用2x105个活3LL细胞对小鼠（n=4-5/组）进行肿瘤激发，并且在肿瘤激发后第6天使小鼠皮下接种一次单独的存活素（SVN）（50μg）或者含有SA-4-1BBL（25μg）的抗原、含有MPL（25μg）的抗原或者含有SA-4-1BBL和MPL这两种试剂（25μg/试剂）的组合的抗原，或者在肿瘤激发后第6天和第13天皮下接种两次单独的存活素（SVN）（50μg）或者含有SA-4-1BBL（25μg）的抗原、含有MPL（25μg）的抗原或者含有SA-4-1BBL和MPL这两种试剂（25μg/试剂）的组合的抗原。（A）在肿瘤激发后27天收获肺部并且通过肿瘤结节的重量和宏观表现评价肿瘤生长。（B）在用12-十四酸佛波酯13-乙酸酯（PMA）和离子霉素刺激获自（A）中的小鼠的淋巴细胞之后，评价CD8+T细胞的细胞内IFN-γ反应。（C）如（A）中那样，对进行两次接种的小鼠的肺部进行评价。P值如所示的并且使用单因素ANOVA和Post Hoc LSD测试计算P值（ns=没有显著性）。
图6：接种SA-4-1BBL/MPL佐剂体系没有促进自体免疫。在实验结束点，从图5A所示的使用3LL肿瘤细胞激发肿瘤的小鼠和图1A所示的使用TC-1肿瘤细胞激发肿瘤的小鼠体内收集血清并且用ELISA测试针对单链DNA（ssDNA）的自身抗体的存在。将从最少三只原始小鼠和最少三只患有狼疮的小鼠体内收集的血清分别用作阴性对照和阳性对照。
图7：接种SA-4-1BBL/MPL佐剂体系诱导很强的初级CD8+T细胞效应功能。（A）用E749-57肽刺激图3所示的小鼠（n=4）中的肿瘤引流淋巴细胞并且分析所述肿瘤引流淋巴细胞的CD8+T细胞的细胞内IFN-γ表达。（B）用E749-57肽和IL-2刺激（A）中的小鼠的脾细胞持续5天，所述脾细胞用作针对TC-1肿瘤的效应细胞。3LL肿瘤细胞用作不相关靶标。数据为三个独立实验的代表性数据。P值如所示的并且使用单因素ANOVA和Tukey HSD测试计算P值（ns=没有显著性）。
图8描述代表性的融合蛋白的氨基酸序列，所述代表性的融合蛋白为（A）带有鼠4-1BBL的细胞外结构域的核心链霉亲和素（CSA）和（B）带有人4-1BBL的细胞外结构域的核心链霉亲和素（CSA）。下划线部分为核心链霉亲和素的序列。（C）融合的六聚组氨酸-链霉亲和素-ALA3标记于鼠4-1BBL（6XHis-SA-ALA3-m4-1BBL）上。下划线部分为6XHis-SA-ALA3标签。（D）融合的Flag链霉亲和素和Ala3标记于人CD137配体（1XFlag-SA-Ala3-CD137L）上。下划线部分为1XFlag-SA-Ala3标签。
具体实施方式
对于本发明的目的而言，下列术语具有如下这些定义：
如本文中所使用的，不指明具体数目（“a”或“an”）是指一个（一种）或一个（一种）以上，除非具体指明仅仅一个（一种）。
本文使用的术语“给药”包括向患者提供物质的所有合适的方式。常见途径包括口服给药、舌下给药、跨粘膜给药、透皮给药、直肠给药、阴道给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药、动脉内给药、鞘内给药、通过导管给药、通过植入物给药，等等。在一些实施方式中，例如，通过直接注射进肿瘤内或者注射进血液内（例如当肿瘤为血液肿瘤时），将组合物给药于肿瘤附近的位置或者直接给药于肿瘤。
“佐剂”提高了针对抗原的免疫反应，所述抗原在所述佐剂存在的条件下呈递。佐剂是本领域所知晓的并且包括氢氧化铝、磷酸铝、单磷酰脂质A、油类、细胞因子，等等。水包油和油包水乳液也用作佐剂。诸如病毒颗粒和免疫刺激复合物（例如，ISCOM和ISCOMATRIX）之类的抗原载体也可产生提高的抗原呈递（参见，Leroux-Roels,Vaccine28S:C25-C36(2010)中的表1）。
在不受限制的条件下，在本文中使用“抗原”。抗原包括蛋白质、脂质、糖类、核酸、化学基团和诱导免疫反应的其他部分。抗原包括可被修饰或未被修饰的蛋白质，所述修饰例如糖基化或甲基化，例如，所述蛋白质被环化或连接至脂质。与感染原或疾病有关的抗原包括作为感染原的一部分的抗原，例如，包膜蛋白、衣壳蛋白、表面蛋白、毒素、细胞壁、抗原脂质，等等。其他抗原可仅仅在宿主存在的条件下表达。在一些实施方式中，其他合适的抗原可包括宿主的抗原，其包括被诱导、修饰或过表达为感染或疾病的标志物的那些抗原。从感染原、感染、病症或疾病衍生得到的所有这些抗原或者与感染原、感染、病症或疾病有关的所有这些抗原适用于本发明。根据本发明，肽也适于用作“抗原”，所述肽包括全长蛋白质的抗原部分，例如，包含诱导免疫反应的蛋白质的一部分的肽（例如免疫原性表位）。例如，合适的抗原可包括诱导免疫反应的合成肽。
在一些实施方式中，抗原为“变应原”。变应原为诱导过敏性疾病的症状的抗原，所述过敏性疾病的症状例如，针对变应原的IgE抗体，变应原存在的条件下的MAST细胞脱颗粒和/或组胺释放。在这种实施方式中，可较少地考虑关于产生针对抗原的免疫反应本身这个目的，而考虑改变免疫反应的性质。例如，诱导针对刺激IgG抗体的生成的变应原的免疫反应，而不是诱导针对刺激IgE抗体生成的变应原的免疫反应。这可通过诱导TH1反应超过TH2反应而实现。
“赋形剂”包括介质、载体、稀释剂、pH调节剂和/或缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂、粘合剂，等等。本领域熟知药学上可接受的赋形剂。例如，明矾（水合的硫酸铝钾，KAl(SO4)2·12H2O）常用于疫苗制剂中，作为赋形剂以结合并稳定生物分子并作为佐剂。
“免疫共刺激多肽”是指增强针对病原体（包括感染原）或肿瘤的个体免疫反应的多肽分子。除了4-1BBL之外，OX40L也是可用于本文所述的组合物和方法中的示例性的免疫共刺激多肽。
本文使用的“免疫细胞”包括参与获得性或先天性免疫体系的产生、调节或作用的任何细胞。免疫细胞包括T细胞（例如，CD4+细胞，CD8+细胞和各种其他T细胞亚类），B细胞，天然杀伤细胞，巨噬细胞，单核细胞，树突细胞和嗜中性粒细胞。
本文使用的“患者”或“受治者”包括任何哺乳动物。在一些实施方式中，所述患者为人类。本领域普通技术人员会理解的是，针对一个物种所讨论的特定的免疫共刺激分子、信号转导分子、细胞标记物、细胞类型、感染原等等可在不同的物种中具有相应的类似物并且这些类似物及其在相应且相关物种中的应用包括在本发明中。
本文使用的“Toll-样受体激动剂（或TLR）”为结合并活化toll-样受体的分子。本领域已知不同的TLR的激动剂和拮抗剂。脂质A为在革兰氏阴性细菌的外膜中发现的脂多糖，其充当有效的TLR4激动剂。MPL为脂质A的化学类似物，其也充当TLR4激动剂。
本文使用的“肿瘤”包括实体瘤和非实体瘤（例如白血病），以及从癌前病变和良性肿瘤至癌性、恶性和转移性肿瘤的肿瘤发展的不同阶段。
“疫苗”是指设计为诱导针对抗原的免疫反应的制剂。疫苗可为治疗性的，在治疗过程中给予疫苗以加强免疫反应或驱动特定方向的反应，或者疫苗可为预防性的，在患上疾病之前或刚刚患上疾病不久给予疫苗。疫苗不需要诱导预防或根除所有疾病症状的完全保护性反应，因为不是所有疫苗在所有人体内都产生免疫反应，并且免疫反应的强度和特性因人而异。疫苗在治疗已存在的病症和预防将来会复发的疾病方面可同时既为治疗性的也为预防性的。
Toll-样受体激动剂
toll样受体为参与先天性免疫的蛋白质家族。
Toll-样受体和激动剂
（参见Takeuchi&Akira,Cell140:805-820(2010)中的表1）
临床使用或研发中的TLR激动剂包括：
（a）MPL，TLR4激动剂和脂质A/LPS的化学类似物。MPL还可与明矾或QS21（皂素）联合使用；
（b）dsRNA的合成衍生物（TLR3）；
（c）鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）鞭毛蛋白（TLR5）；
（d）咪唑并喹啉（imiquidazoquinoline）衍生物（TLR7和/或TLR8）；和
（e）免疫刺激序列，例如，合成的具有优化的CpG基序（motif）的连接有硫代磷酸酯的DNA寡核苷酸（TLR9）
参见Leroux-Roels,Vaccine28S:C25-C36(2010)的表1；还参见Coffman等人，Immunity33:492-503(2010)的表1。
4-1BBL
免疫共刺激分子参与初始T细胞和抗原呈递细胞之间的天然相互作用，所述相互作用导致它们相互活化并促进各种细胞表面配体和受体以及可溶性蛋白的表达，所述各种细胞表面配体和受体以及可溶性蛋白有助于免疫反应的启动、保持和长期记忆。开始活化初始T细胞需要至少三个信号。信号1通过T细胞受体（TCR）和由专职APC（例如树突细胞（DC））表面的主要组织相容性复合体（MHC）分子呈递的普通（nominal）肽之间的相互作用产生。信号2可由多种不同的分子介导并且对于持续的免疫反应而言是重要的。信号3通过由活化的T细胞和APC加工的细胞因子转导并且对于保持效应免疫反应而言至关重要。
4-1BBL（也称为4-BB-L，4-BB配体，TNFSF9，ILA配体）为活化后两天至三天在活化的B细胞、巨噬细胞和DC上表达的II型蛋白质。4-1BB/4-1BBL相互作用还以不依赖于CD28的形式将信号2转导至CD8+T细胞并且刺激CD8+T细胞生成细胞因子，使CD8+T细胞扩增并使CD8+T细胞获得效应功能。
4-1BBL包含254个氨基酸（26624Da）。参见Alderson等人，Eur J Immunol.1994Sep;24(9):2219-27。人4-1BBL的全长氨基酸序列可在Swiss-Prot数据库中的登录号P41273下找到。4-1BBL为II型糖蛋白，该II型糖蛋白具有形成潜在的细胞质结构域的残基1-28，形成单一的预测跨膜结构域的残基29-49，形成潜在的细胞外结构域的残基50-254以及呈现多聚Leu链的残基35-41。编码4-1BBL的人体内的核苷酸序列可在基因库登录号NM_003811中找到。4-1BBL的残基50-254或其片段可与结合对成员连接或与结合对成员一起表达为融合体，从而根据本发明使用，所述4-1BBL的残基50-254或其片段可结合至其同源受体4-1BB。美国专利第7,598,345号。
除非另有说明，本文使用的“全长”是指4-1BBL多肽包含表现出免疫共刺激功能的全长多肽及其片段或部分，包括但不限于下面特别指定的那些片段和部分。因此，例如，4-1BBL多肽是指包含表现出免疫共刺激功能的全长4-1BBL的片段或部分的多肽，所述多肽例如4-1BBL或全长4-1BBL蛋白质的细胞外结构域。在一些实施方式中，免疫共刺激多肽不包括4-1BBL的跨膜结构域。在一些实施方式中，免疫共刺激多肽包含至少4-1BBL的细胞外结构域或其受体结合片段。“IMMUNOSTIMULATORY COMPOSITIONS ANDMETHODS”中描述了4-1BBL和链霉亲和素之间的合适的融合蛋白。
其他免疫共刺激多肽
在本文所述的任何实施方式中，除了4-1BBL之外，组合物中还可包括其他免疫共刺激分子。所述其他免疫共刺激分子可存在于包含亲和素或链霉亲和素的融合蛋白中。
免疫共刺激多肽包括但不限于：LIGHT,CD80(B7-1),CD86(B7-2),ICOS,ICOSL(包括B7h,B7-H2,B7RP-1,GL-50和LICOS),CD94(KP43),CD40L(CD154),ICAM-1(CD54),ICAM-2,ICAM-3,SLAM(CD150),HAS(CD24),4-1BB(CDw137),OX40L,CD28,CD40(BP50),CD25(IL-2Rα),淋巴毒素(LTα或LTβ),TNF,Fas-L,GITR(活化可诱导的TNRF),GITR配体,CD11a(αL整合素),CD11b(αM整合素),L-选择蛋白(CD62L),CD69(非常早期活化抗原),CD70(CD27L),PD-L1,PD-L2,B7-H3,B7-H4,OX40L,4-1BBL,CD27L,CD30L,LIGHT,BAFF和APRIL。参见例如，Watts&DeBenedette,1999,Curr.Opin.Immunol.,11:286-93。
在一些实施方式中，本发明的组合物和方法还包括OX40L。OX40L通过树突细胞和其他APC表达并且结合至在活化的T细胞上呈递的OX40。OX40L包括183个氨基酸（21950Da）。参见Miura等人,Mol.Cell.Biol.11:1313-1325(1991)。OX40L的全长氨基酸序列可在Swiss-Prot数据库中的登录号P23510下找到。OX40L为II型糖蛋白，该II型糖蛋白具有位于残基1-23处的细胞质结构域，位于残基24-50处的跨膜结构域和位于残基51-183处的细胞外结构域。OX40L的核苷酸序列为3510bp，编码序列为157-708（参见基因库登录号NM_003326.2）。OX40L的残基51-183或其片段可连接至结合对成员或表达为结合对成员的C端融合体，从而根据本发明使用，所述OX40L的残基51-183或其片段可与其同源受体OX40结合。美国专利第7,598,345号的“IMMUNOSTIMULATORY COMPOSITIONS AND METHODS”描述了合适的OX40L和链霉亲和素的融合蛋白质。
融合蛋白
在示例性的实施方式中，4-1BBL被包含在含有链霉亲和素（SA）或亲和素或其片段的融合蛋白中，所述片段保留了全长蛋白质的大部分性质。这些片段包括“核心链霉亲和素”（“CSA”），其为全长链霉亲和素多肽的截短形式，其可包括链霉亲和素残基13-138，14-138，13-139或14-139。编码链霉亲和素和亲和素的核酸序列以及链霉亲和素和亲和素的氨基酸序列可在例如基因库登录号X65082、X03591、NM_205320、X05343、Z21611和Z21554中找到。当使用另一免疫共刺激肽（例如OX-40L）时，其也可存在于含有SA或亲和素的融合蛋白中。
SA和CSA能够聚集成三聚体和更高级的结构，因此SA-4-1BBL结合体（或者其他免疫共刺激结合体，例如，SA-OX-40L结合体）可形成免疫共刺激所必需的三聚体和更高级的结构。SA、CSA和亲和素的另一性质为结合生物素，并且还可使用结合亲和性分别为初始SA或亲和素的结合亲和性的至少50%或更高的片段。生物素结合性质可用于使4-1BBL（或者其他免疫共刺激分子，例如OX-40L）靶向或定位于目标位点或表面，或者可用于结合另一分子（例如抗原）。
抗原&感染原
本文所述的方法和组合物用于产生或加强针对任何抗原或感染原的免疫反应，所述抗原或感染原包括TAA，与感染原有关的抗原和感染原自身。与靶定的肿瘤或感染原有关的抗原（或感染原自身）可被呈递至免疫细胞，从而产生或加强免疫反应。
1.TAA
在一种实施方式中，抗原为肿瘤相关抗原（TAA）并且本发明的组合物和方法提供有效产生或加强患者的抗肿瘤免疫反应的癌症免疫疗法。根据该实施方式，所述方法和组合物可减小肿瘤尺寸和/或抑制肿瘤细胞的生长。
可被靶定的代表性的肿瘤细胞包括但不限于：可来源于包括肺、肝脏、乳腺、膀胱、胃、结肠、胰脏、皮肤等在内的各种人体器官中的任一个的癌。癌可包括在器官或腺体中产生的腺癌和在鳞状上皮中生成的鳞状细胞癌。可被治疗的其他癌症包括肉瘤，例如骨肉瘤（骨）、软骨肉瘤（软骨）、平滑肌肉瘤（平滑肌）、横纹肌肉瘤（骨骼肌）、间皮肉瘤（体腔的膜衬）、纤维肉瘤（纤维组织）、血管肉瘤或血管内皮瘤（血管）、脂肪肉瘤（脂肪组织）、胶质瘤或星形细胞瘤（脑部发现的神经结缔组织）、粘液肉瘤（原始胚胎结缔组织）、间充质或混合的中胚层肿瘤（混合的结缔组织类型）。此外，骨髓瘤、白血病和淋巴瘤也易于受到治疗的影响。
多种与特定肿瘤类型相关的TAA已被识别。这些TAA包括人端粒酶逆转录酶（hTERT）、存活素、MAGE-1、MAGE-3、人绒毛膜促性腺激素、癌胚抗原、α甲胎蛋白、胰胎瘤抗原，MUC-1，CA125，CA15-3，CA19-9，CA549，CA195，前列腺特异性抗原，前列腺特异性膜抗原，Her2/neu，gp-100，突变的K-ras蛋白，突变的p53，截短的表皮生长因子受体，嵌合蛋白p210BCR-ABL，人乳头瘤病毒的E7蛋白，埃巴氏（Epstein-Barr）病毒的EBNA3蛋白。任何这些抗原，其抗原片段以及抗原和/或片段的混合物可根据本文所述的组合物和方法使用以产生或加强患者的抗肿瘤免疫反应。表5列出了一些示例性的TAA和与这些TAA有关的疾病。
表5
通过T-细胞识别的其他人TAA可在例如Novellino等人,“A listing of humantumor antigens recognized by T cells:March2004update”Cancer Immunologyand Immunotherapy,54:187-207(2005)中找到，该参考文献通过引用并入本文。对应于这些疾病的动物模型（animal corollaries）的许多动物TAA以及对应于其他动物疾病的许多动物TAA是本领域已知的并且也被包括在本发明的范围内。
在一种实施方式中，TAA选自：人端粒酶逆转录酶（hTERT）和存活素。hTERT在超过85%的人癌症中表达，虽然其表达被限制在正常组织中。参见例如，Vonderheide等人，Immunity1999,10:673-79。类似地，已被识别为细胞凋亡抑制剂的存活素不存在于正常组织中，但其在大多数肿瘤类型中表达，所述肿瘤类型包括肺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌。参见例如，Ambrosini等人，Nat.Med.1997,3:917-21。因为这些TAA在大多数癌症类型中表达并且很少存在于正常组织中或不存在于正常组织中，它们是用于根据本发明的癌症免疫疗法中的值得关注的抗原。
在另一实施方式中，TAA与子宫颈癌有关。病毒转化蛋白E6和E7（也称为“早期”蛋白质）在子宫颈癌细胞系中和HPV相关癌症中始终表达，并且在大多数子宫颈癌中始终表达。因为E6和E7为完全外源性病毒蛋白并且相对于突变蛋白其可带有更多的抗原肽或表位，所以E6和E7作为治疗用TAA具有多种优势。
TAA可与4-1BBL和MPL混合以进行给药。例如，TAA还可通过生物素键合与4-1BBL结合。
2.感染原
本文所述的组合物和方法所针对的代表性的感染原包括但不限于：任何病毒、细菌、真菌或原生动物。表6列出了感染原的实例。
表6
人类和禽类流感、HIV、丙型肝炎、肺结核、西尼罗河病毒、隐球菌（脑膜炎）疱疹、衣原体和炭疽是代表性的感染原。根据本发明，可使用任何与感染原有关的抗原。可使用诸如病毒之类的任何感染原，所述病毒包括人类或禽类流感病毒或HIV或者任何其他病毒。其他感染原和由其衍生得到的抗原包括A型肝炎病毒、C型肝炎病毒或E型肝炎病毒，日本脑炎病毒、登革热病毒、汉坦病毒、狂犬病病毒和SARS冠状病毒。感染原可被修饰或弱化以降低或消除其感染性。
根据本发明的一种实施方式，抗原或感染原可例如通过对所述抗原或感染原进行生物素化并结合至SA-4-1BBL上的SA部分而存在于含有4-1BBL的结合体中（例如形成抗原-生物素-SA-4-1BBL复合体）。
仅仅为了举例说明，以流感为例对这方面做出更加详细的描述。流感是由流感病毒引起的传染病并且其影响呼吸道，通常在鼻子、喉部和肺部产生症状并引起发烧、头疼、乏力和疼痛。流感也会导致诸如肺炎、支气管炎或鼻窦炎和耳部感染之类的并发症或者加剧慢性病症。流感病毒分为A型、B型或C型。属于A型和B型的毒株在人群中传播并且与大多数人流感病例有关。A型流感导致人群中绝大多数的公共健康问题。在该情况下，抗原可包括H1和N1（均为高度免疫原性的）中的一种或一种以上和/或核蛋白（NP）和基质蛋白1（MP1）和/或基质蛋白2（MP2）（均为高度保守的结构蛋白）中的一种或一种以上。根据本发明，流行毒株中的蛋白质（例如H5）也可用作抗原。
本文所述的组合物和方法可用于流感疫苗中，所述流感疫苗易于快速生成和制造，所述流感疫苗的抗原组分可基于目前健康需要发生改变和更新，而不会有任何难度，所述流感疫苗选择性地靶向病毒机制和被感染的细胞，所述流感疫苗可在感染后给药以产生疗效并且可在感染前给药以进行预防。
本文所述的组合物和方法用作针对其他感染原的疫苗，所述针对其他感染原的疫苗可基于与那些感染原相关的抗原由本领域技术人员以类似的方式选择。例如，与HIV有关的抗原包括HIV包膜gp120表位（例如，诸如V3之类的可变环）或其他HIV蛋白质（例如，Gag蛋白质（Pr55gag，基质p17，衣壳p24，核衣壳p7），p5）；Pol(聚合酶)，Vif（病毒感染因子p23）；Vpr（病毒蛋白R p15）；Rev（病毒基因表达的调节因子p19）；Vpu（病毒蛋白U）；Env（gp160，gp120，gp41）；Tat（转录活化子p14）；以及Nef（负效应子p24）。参见例如，Peters,201,Vaccine2:688-705;Michael,2003,Clin.Med.3:269-72;Gandhi&Walker,2002,Ann.Rev.Med.53:149-72;Haseltine,1991,FASEB5:2349-60。在疫苗中有用的其他抗原包括b型流感嗜血杆菌（Haemophiliusinfluenzae）的荚膜多糖，脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）的荚膜多糖，肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的荚膜多糖，乙型肝炎的表面抗原，灭活的白喉外毒素和破伤风毒素。这些抗原可根据上面参考流感抗原所述的组合物和方法来使用。
变应原
术语“变应原”是指与过敏症有关的抗原。过敏反应的特征为释放炎症因子，特别是组胺，从而在个体体内产生病理性炎症。典型地，过敏症还与针对变应原的IgE抗体有关。变应原的实例包括但不限于：花粉（例如，草、豚草、桦树和山雪松）；室内尘埃和尘螨；哺乳动物表皮变应原和动物皮屑；霉菌和真菌；昆虫身体和昆虫毒液；羽毛；食物；以及药物（例如，青霉素）。本发明的组合物和方法适于诱导或调节针对变应原的免疫反应，所述针对变应原的免疫反应的特性与预先存在的免疫反应的特性不同。例如，具有针对变应原的TH2免疫反应的个体可通过本发明的实施方式被诱导产生针对该变应原的TH1免疫反应，TH1免疫反应抵消诱导过敏症的TH2反应，从而缓解过敏性疾病，其中，TH2免疫反应使所述个体在暴露于所述变应原之后产生IgE抗体。
组合物
如上所述，本发明的一些实施方式涉及组合物。这些实施方式包括含有4-1BBL和toll-样受体（TLR）激动剂（例如MPL）的组合物。4-1BBL可存在于融合蛋白中，例如，链霉亲和素-4-1BBL融合蛋白或核心链霉亲和素-4-1BBL融合蛋白。所述组合物还可包括本领域熟知的药学上可接受的赋形剂，并且所述组合物可被制备成和/或存在于用于储存（冷冻、冻干，等等）和/或给药的合适形式中。一些赋形剂还可表现出佐剂性质。这种赋形剂的实例为明矾（水合的硫酸铝钾（钾明矾），分子式为KAl(SO4)2·12H2O）。明矾可与多种不同的抗原结合并可稳定多种不同的抗原，明矾还可用作佐剂。4-1BBL/TLR激动剂组合物适于用作佐剂，因此，4-1BBL/TLR激动剂组合物可包括抗原或与抗原一同给药。抗原可在制备时被包括在4-1BBL/TLR激动剂组合物中，或者可稍后加入（在给药后或给药前加入）。抗原可为组合物的单独组分或者可为结合体的一部分，所述结合体还包括4-1BBL，例如，所述结合体可通过对抗原进行生物素化并结合至SA-4-1BBL的链霉亲和素部分来制备。如上所讨论的，可使用例如来自癌症、肿瘤和感染性疾病的任何抗原。
在本文所述的任何实施方式中，除了4-1BBL之外，组合物中还可包括其他免疫共刺激分子，例如，OX-40L/CD137L。所述其他免疫共刺激分子（例如，OX-40L/CD137L）可存在于含有亲和素或链霉亲和素的融合蛋白中。
方法
如上所述，本发明的一些实施方式涉及方法。例如，本文所述的方法用于诱导针对抗原的免疫反应，所述抗原例如与肿瘤或癌症有关的抗原或感染原。在一些实施方式中，这些方法包括将（a）抗原，（b）toll-样受体（TLR）激动剂（例如，MPL）以及（c）4-1BBL给药于受治者。本文所述的方法还用于通过将（a）抗原，（b）toll-样受体（TLR）激动剂（例如，MPL）以及（c）4-1BBL给药于受治者治疗肿瘤或癌症。在这些方法的任何一种中，可再次给药和/或后续给药相同或类似的药剂（例如相同或不同的抗原）。如上面参考组合物所述的，4-1BBL可存在于融合蛋白中，所述融合蛋白例如，链霉亲和素-4-1BBL融合蛋白或核心链霉亲和素-4-1BBL融合蛋白，和/或抗原可为单独的组分或者可存在于还包括4-1BBL的结合体中。进一步地，在实施所述方法的过程中，抗原、TLR激动剂和4-1BBL中的任何两种或两种以上可作为同一组合物的一部分给药，或者可通过相同或不同的给药途径以单独的组合物的形式同时或顺序给药。
在本文所述的实施方式中的任一种中，除了4-1BBL之外，还可给药诸如OX-40L/CD137L之类的其他免疫共刺激分子。所述其他免疫共刺激分子（例如，OX-40L/CD137L）可存在于含有亲和素或链霉亲和素的融合蛋白中并且可与4-1BBL一同存在于同一组合物中或可存在于单独的组合物中，所述单独的组合物与4-1BBL组合物同时给药或顺序（即，在4-1BBL组合物给药之前或之后）给药。
因此，在实施本文所述的方法的过程中，本领域技术人员可以相同或不同的组合物的形式同时给药抗原、TLR激动剂、4-1BBL和任选的其他共刺激分子，或者在相同或不同的时间，以不同的顺序，在相同或不同的位点顺序给药抗原、TLR激动剂、4-1BBL和任选的其他共刺激分子。
下列实施例更加详细地举例说明本发明，并且下列实施例无意在任何方面限定本发明的范围。
实施例
实施例1.4-1BBL/MPL协同效应
材料和方法
小鼠和细胞系
C57BL/6和C57BL/6.SJL小鼠饲养在路易斯维尔大学（University ofLouisville）的动物屏障设施中。根据机构和NIH的指南饲养所有动物。TC-1和3LL细胞系购自ATCC（Manassas,VA）并如（7）所公开的那样进行培养。
抗体和其他试剂
荧光染料结合的抗-CD8-APC-Cy7，抗-CD62L-PE，抗-CD44-APC，抗-TNF-PE，抗-IFN-γ-PE-Cy7和抗-IL-2-PerCp-Cy5.5以及同种型对照购自BDBioscience,eBioscience和BioLegend。MPL购自InvivoGen(San Diego,CA)。HPV16RAHYNIVTF E7肽（E749-57），SA-4-1BBL，E7和小鼠SVN蛋白质先前报道过（7）。
肿瘤模型和疫苗接种
使用1x105个活TC-1细胞以皮下的方式在C57BL/6小鼠的右侧进行肿瘤激发。对于治疗而言，在肿瘤激发后第6天，小鼠皮下接种各种不同的疫苗制剂：包含单独的E7蛋白（50μg）作为对照的疫苗制剂，或包含E7蛋白（50μg）和SA-4-1BBL（25μg）的疫苗制剂，包含E7蛋白（50μg）和MPL（25μg）的疫苗制剂，或者包含E7蛋白（50μg）以及SA-4-1BBL和MPL这两种试剂（25μg/试剂）的组合的疫苗制剂。在本研究中使用的E7，SA-4-1BBL和MPL的剂量基于先前公开的研究（7）。当肿瘤的尺寸达到直径为12mm，肿瘤产生溃疡或小鼠表现出不舒服的迹象时，对小鼠实施安乐死。在接种疫苗前一天，通过腹膜内注射500μg/小鼠的抗CD8的抗体（克隆53.6.72）和抗CD4的抗体（克隆GK1.5）消除CD8+T细胞和CD4+T细胞。
对于肺部肿瘤模型而言，将2x105个活3LL细胞静脉内注入小鼠的尾部静脉。在肿瘤激发后第6天，小鼠皮下接种一次各种不同的疫苗制剂，或者在肿瘤激发后第6天和第13天，小鼠皮下接种两次各种不同的疫苗制剂，所述疫苗制剂包括：含有单独的存活素（SVN）蛋白质（50μg）作为对照的疫苗制剂，含有存活素（SVN）蛋白质（50μg）和SA-4-1BBL（25μg）的疫苗制剂，含有存活素（SVN）蛋白质（50μg）和MPL（25μg）的疫苗制剂或者含有存活素（SVN）蛋白质（50μg）以及SA-4-1BBL和MPL这两种试剂（25μg/试剂）的组合的疫苗制剂。在肿瘤激发后27天对小鼠实施安乐死，如所描述（12，18）的分析肺部肿瘤负荷。
流式细胞仪和共聚焦显微镜分析
如先前所描述的（7），处理脾脏和/或肿瘤引流淋巴结（TdLN）。对于记忆T细胞分型而言，用抗-CD8-APC-Cy7抗体，抗-CD62L-FITC抗体和抗-CD44-APC抗体对淋巴细胞进行染色。对于细胞内细胞因子染色而言，用10μg/mL E749-57肽刺激淋巴细胞（1x106细胞/mL）持续2小时，随后用GolgiPlug（1μl/ml，BD PharMingen）过夜孵育，或者用12-十四酸佛波酯13-乙酸酯（PMA）（5ng/ml，Sigma）和离子霉素（500ng/ml，Sigma）刺激淋巴细胞（1x106细胞/mL）持续2小时，随后用GolgiPlug（1μl/ml）再孵育4小时。首先用抗-CD44-APC抗体和抗-CD8-APC-Cy7抗体对细胞进行染色，用4%多聚甲醛固定，随后用抗-IFN-γ-PE-Cy7抗体，抗-IL-2-Percp-Cy5.5抗体，抗-TNF-PE抗体或者同种型对照染色，随后如先前所报道的（12）收集并进行分析。如（12）所述，使用共聚焦显微镜对肿瘤内CD8+T细胞和CD4+Foxp3+Treg细胞进行分析。
ssDNA的自身抗体的分析
如（19）所述，进行单链DNA（ssDNA）ELISA以评价治疗过的小鼠体内的自身抗体的存在。简言之，用含有5%BSA+0.5%吐温20+0.1%初始C57BL/6血清的PBS封闭包被有1μg/孔的热变性小牛胸腺DNA（ssDNA，Sigma）的九十六孔滴定平板。将血清稀释液加至孔中并在4℃下过夜孵育。将孔洗涤三次，用抗小鼠IgG-HRP孵育，测量450nm的吸光度。
细胞毒性测试
带有直径为约3mm至4mm的TC-1肿瘤的小鼠皮下接种了如下几种疫苗制剂：仅含有E7蛋白（50μg）的疫苗制剂、含有E7蛋白（50μg）和SA-4-1BBL（25μg）的疫苗制剂、含有E7蛋白（50μg）和MPL（25μg）的疫苗制剂或者含有E7蛋白（50μg）以及SA-4-1BBL和MPL这两种试剂（25μg/试剂）的组合的疫苗制剂。接种疫苗后一周，在补充有50IU/mL的IL-2的完全MLR培养基中用10μg E749-57肽/mL培养脾细胞。如（41）所述，5天后使用Ficoll梯度收获活的淋巴细胞并且在不同的比例条件下，将该淋巴细胞用作针对TC-1靶细胞的效应细胞持续4小时。参见图7A和图7B。
结果
联合使用作为基于E7TAA的疫苗的佐剂成分的SA-4-1BBL和MPL在根除所构建的TC-1肿瘤方面具有很强的效力
单次接种SA-4-1BBL和E7蛋白有效根除超过70%的小鼠体内构建的表达E7的TC-1肿瘤（12）。虽然这个结果非常好，但是本发明的发明人已发现这种疫苗的疗效还可通过改良制剂使其包括作为第二佐剂的对先天性免疫具有初级效应的MPL来改善。单次皮下接种混合有SA-4-1BBL和MPL的E7蛋白根除所有小鼠中构建的TC-1肿瘤，这些小鼠在90天的观察期内没有产生肿瘤（图1A）。特别意想不到的是，接种混合有SA-4-1BBL和MPL的E7蛋白在所有小鼠中达到100%有效并且持续上述90天的观察期这样长的时间段。
通过比较可知，用SA-4-1BBL或MPL单一治疗仅分别根除80%小鼠和50%小鼠体内的肿瘤。然而，与PBS和E7蛋白对照组相比，单一药剂组中的因肿瘤而安乐死的小鼠具有缓慢的肿瘤发展动力学，在所述对照组中，所有小鼠在50天内因肿瘤负荷而安乐死（图1B）。总之，这些数据表明作为佐剂体系的SA-4-1BBL/MPL有效根除所构建的TC-1肿瘤，其相对于单独的药剂具有更好的疗效，并且SA-4-1BBL具有比MPL更好的疗效。
疫苗疗效与SA-4-1BBL和MPL在外周CD8+T细胞反应的产生方面的协同作用有关
在各种不同的肿瘤环境（包括TC-1模型）中，CD8+T细胞效应和记忆反应分别对于消除原发性肿瘤和控制复发而言至关重要（7，10，11，13）。由各种不同的疫苗制剂引发的CD8+T细胞效应和长期记忆反应如下评估。响应各种不同的疫苗制剂的已根除了肿瘤的小鼠被皮下注入相同的制剂以进行加强治疗，一周后对小鼠进行安乐死以测试CD8+T细胞对主要E749-57表位的细胞内细胞因子反应（10）。如通过表达IL-2，IFN-γ和TNF-α三细胞因子的CD8+T细胞进行评估的那样，与疗效一致，接种E7蛋白和SA-4-1BBL/MPL产生比单一佐剂治疗更好的抗原特异性细胞因子反应（图2A至图2C）。与治疗反应一致，接种了SA-4-1BBL制剂的小鼠产生比接种MPL制剂显著更好（P<0.05）的IFN-γ反应（图2A）。相对于包含作为单独的佐剂的SA-4-1BBL和MPL的那些疫苗制剂，含有SA-4-1BBL/MPL的疫苗制剂还产生最有效的CD8+T细胞记忆反应（图2D）。总之，这些数据说明SA-4-1BBL和MPL佐剂协同起效产生有效的CD8+T细胞效应和记忆反应，所述CD8+T细胞效应和记忆反应与针对TC-1肿瘤的疫苗的疗效有关。
用SA-4-1BBL/MPL佐剂体系接种产生良好的肿瘤内CD8+Teff/Treg细胞比例
肿瘤内CD4+Foxp3+Treg细胞水平的提高伴随CD8+Teff细胞水平的降低，这与癌症患者临床上不理想的预后有关（21，22）并且Treg细胞的消除使治疗性疫苗产生更好的免疫效力（23，24）。SA-4-1BBL/MPL佐剂体系对肿瘤内Treg和Teff细胞的状态的影响如下评估。
带有约3mm至4mm的TC-1肿瘤的小鼠皮下接种各种不同的疫苗制剂。接种后一周，收获肿瘤并使用共聚焦显微镜分析肿瘤内CD8+T细胞和CD4+FoxP3+Treg细胞的存在。当与PBS对照或单独的E7蛋白相比时，接种了作为单个佐剂的SA-4-1BBL的小鼠或接种了SA-4-1BBL和MPL的组合的小鼠体内的肿瘤内Treg细胞数显著减少（图3A，图3B）。有趣的是，与PBS对照相比，含有作为单独佐剂的MPL的疫苗制剂对肿瘤内Treg细胞数不具有可检测的影响，并且含有作为单独佐剂的MPL的疫苗制剂甚至比单独的E7蛋白更差，单独的E7蛋白使肿瘤内Treg细胞数明显降低，但不具有统计学上的显著性。
下面的数据说明由作为单一治疗的SA-4-1BBL/MPL或SA-4-1BBL所引起的Treg细胞数的降低与肿瘤内CD8+T细胞数负相关，这是成功的抗癌免疫疗法的标志（25）。接种SA-4-1BBL/MPL对肿瘤内CD8+T细胞浸润数目具有最显著的影响，其次是接种SA-4-1BBL，而MPL具有中等影响，类似于单独的E7蛋白（图3C）。通过SA-4-1BBL/MPL使肿瘤内CD8+T细胞增多，从而产生最理想的肿瘤内Teff/Treg细胞比例，其次是通过作为单一治疗的SA-4-1BBL所产生的肿瘤内Teff/Treg细胞比例（图3D）。形成鲜明对比的是，与PBS对照和E7蛋白对照相比，作为单独佐剂的MPL对肿瘤内Teff/Treg细胞比例没有影响。相对于接种了单独佐剂的小鼠而言，在接种了两种佐剂的小鼠体内观察到显著较好（P＜0.05）的E7TAA特异性CD8+T细胞IFN-γ反应（图7A）和TC-1杀伤反应（图7B）。与疗效和肿瘤内CD8+T细胞的浸润一致，作为单一治疗的SA-4-1BBL比单独的E7抗原产生更好的CD8+T细胞IFN-γ反应和杀伤反应，而MPL未能如此。总之，这些发现说明SA-4-1BBL和MPL协同起效以提高肿瘤内Teff/Treg细胞比例，该细胞比例与该佐剂体系在消除所构建的肿瘤方面的强效力相关联。
CD8+T细胞与SA-4-1BBL/MPL佐剂体系的疗效相关，而Treg细胞不利于MPL单一治疗的疗效
为了检测高CD8+Teff/Treg细胞比例是否可用作疫苗疗效的预测因素，我们分别使用抗CD8分子的抗体和抗CD4分子的抗体以消除CD8+Teff细胞和Treg细胞。在接种混合有SA-4-1BBL/MPL的E7蛋白或接种混合有作为单一治疗的MPL的E7蛋白的前一天，通过消除抗体对带有所构建的TC-1肿瘤的小鼠进行处理。如图4所示，CD8+T细胞的消除完全废除了SA-4-1BBL/MPL佐剂体系的疗效，而消除CD4+T细胞（包括Treg细胞）将MPL的疗效从50%提高至100%。总之，这些数据为如下事实提供了直接证据：CD8+T细胞和Treg细胞在疫苗效力中发挥相反作用并且这些数据说明了作为疫苗效力/失效的预测因素的Teff/Treg细胞比例的重要性。
接种SA-4-1BBL/MPL佐剂体系和存活素根除所构建的3LL肺部转移肿瘤
在3LL肺部转移模型中评估接种存活素（SVN，一种较弱的且潜在耐受的自身TAA）的疗效。通过致死剂量的活3LL细胞以静脉内的方式对小鼠进行肿瘤激发，随后在第6天皮下接种各种不同的制剂：含有SVN重组蛋白的制剂，含有SVN重组蛋白的制剂和含有作为佐剂的SA-4-1BBL和/或MPL的制剂。如图5A所示，如通过肺部重量和肿瘤结节的存在所证明的，含有两种佐剂的疫苗制剂相对于单独佐剂的组合物在控制肿瘤生长方面具有最佳疗效。类似于TC-1模型，含有作为单独佐剂的SA-4-1BBL的疫苗制剂在控制肿瘤生长方面相对于含有作为单独佐剂的MPL的疫苗制剂具有更好的疗效，含有作为单独佐剂的SA-4-1BBL的疫苗制剂相对于PBS对照或不含佐剂的SVN在控制肿瘤生长方面具有统计学上的显著作用（P<0.05）。与PBS对照和单独的SVN对照相比，SA-4-1BBL/MPL联合治疗或SA-4-1BBL单一治疗的疗效与表达IFN-γ+的CD8+T细胞数量显著较高（P<0.05）相关联，但MPL单一治疗没有这种相关性（图5B）。
虽然接种了SA-4-1BBL/MPL的小鼠的肺部重量与原始小鼠的肺部重量类似，但是一些肺部具有显微镜可检测的肿瘤结节。因此，我们测试了第一次接种后七天进行加强注射的疗效。如图5C所示，用含有SVN的SA-4-1BBL/MPL进行加强注射使所有小鼠体内的肺部肿瘤完全根除。用单独佐剂进行加强接种在根除和/或控制肿瘤负荷方面也有效，与PBS对照和单独的SVN对照相比，上述在根除和/或控制肿瘤负荷方面的有效性达到了统计学上的显著性（P<0.05）。总之，这些发现进一步证实了SA-4-1BBL/MPL作为有效佐剂体系在引起针对自身TAA的有效免疫反应方面的效用，所述效用在严格的肺部临床前转移模型中转变为有效免疫疗法。
在不存在可检测的临床毒性和自身免疫的条件下实现SA-4-1BBL/MPL佐剂体系的疗效
自身免疫是有效的基于自身TAA的治疗性疫苗制剂的潜在阻碍，所述基于自身TAA的治疗性疫苗制剂使用有效佐剂诱导针对这些抗原的免疫反应（26）。在本文所述的佐剂体系具有有效治疗活性的前提下，我们测试了获得成功的免疫治疗的TC-1模型小鼠和3LL模型小鼠的血清中针对作为全身性自身免疫标志的单链DNA（ssDNA）的抗体的存在。所有测试组中不存在大量ssDNA的自身抗体，而具有完全成熟的狼疮的小鼠的血清具有高水平的这种抗体（图6）。重要的是，在接种了疫苗的小鼠体内没有检测到急性毒性迹象，所述急性毒性迹象包括体重损失、意想不到的死亡率、大体解剖、身体器官的宏观分析，这说明该佐剂体系的安全特性。
讨论
作为基于HPV E7TAA的疫苗的佐剂成分的MPL和SA-4-1BBL协同起效产生很强的初级CD8+T细胞效应和长期记忆反应，所述初级CD8+T细胞效应和长期记忆反应在TC-1子宫颈癌小鼠模型中转化为改善的疗效。佐剂体系的疗效完全依赖于CD8+T细胞并且与理想的肿瘤内CD8+Teff/CD4+Foxp3+Treg细胞比例有关。而且，佐剂体系的协同作用不限于异种E7TAA。含有结合了SVN（作为真实的自身TAA）的佐剂的疫苗制剂在根除/控制3LL转移型肺癌模型中的肿瘤方面同样有效。
虽然不受理论的限制，但是在佐剂体系中MPL看起来与SA-4-1BBL协同起效以通过活化DC和抗原的交叉呈递来活化CD8+T细胞（27），从而上调CD8+T细胞表面的4-1BB受体，所述受体进而成为SA-4-1BBL的直接靶标。该方案受到本文所报道的数据的支持，这说明在存在两种不同的抗原（HPV E7异种抗原和SVN真实的自身TAA抗原）的条件下，MPL与SA-4-1BBL协同起效以产生很强的CD8+T细胞初级反应和长期记忆反应，所述很强的CD8+T细胞初级反应和长期记忆反应在所构建的两种不同的肿瘤模型（TC-1子宫颈癌和3LL肺癌）中转化为有效治疗。与该假设一致，在接种疫苗前一天消除CD8+T细胞完全废除了SA-4-1BBL/MPL佐剂体系在根除TC-1肿瘤方面的效力。除了对CD8+T细胞的直接作用之外，SA-4-1BBL还可通过改善DC的抗原摄取和交叉呈递来增强MPL对DC的作用。该假设得到了如下观察结果的支持：DC亚群组成性表达4-1BB受体（28，29），并且接种SA-4-1BBL提高了DC的抗原摄取和交叉呈递（7，12）。
CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞在急性（30）和慢性感染（31，32）以及癌症（2，23，33）所使用的免疫逃避机制中发挥重要作用，因此CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞用作疫苗效力的重要屏障。因此，在癌症和慢性感染的情况下，特异性控制Treg细胞的数目和/或功能而提高Teff细胞数目的疫苗制剂可具有期望的疗效。与该假设一致，研究表明Treg细胞的物理消除或使用针对各种细胞表面标志物的抗体对其调节功能进行调整对临床前模型中的各种肿瘤具有预防效果和治疗效果（33-37）。使用仅在Treg细胞中表达白喉毒素受体的转基因小鼠的最新研究表明这些细胞的特异性的且条件性的消除通过先天性免疫保护小鼠不受癌形成诱导的自发肿瘤的影响并且通过依赖CD8+T细胞和IFN-γ的反应根除所构建的肿瘤（36）。与临床前研究一致，Treg细胞表现出在患者体内的各种进行性癌症中累积并且高的肿瘤内Teff/Treg细胞比例被认为是理想预后的标志（21-23）。
在该情况下，本文所报道的结果非常重要，其说明肿瘤内CD8+Teff/Treg细胞比例响应SA-4-1BBL/MPL佐剂体系的接种而大大提高。接种作为单一治疗的SA-4-1BBL也显著提高肿瘤内CD8+Teff/Treg细胞比例。意想不到的是，作为单一治疗的MPL不仅仅在显著提高肿瘤内CD8+T细胞浸润频率方面无效，而且也无法降低肿瘤内Treg细胞的数目，这产生不理想的CD8+Teff/Treg细胞比例。Treg细胞对基于MPL的疫苗产生不利作用，因为接种前一天Treg细胞的消除导致根除所有肿瘤（图4）。证实了Treg细胞破坏MPL效力的这个观察结果非常重要，并且该结果为改善治疗性癌症疫苗提供了重要的机理性阐释。
虽然MPL主要靶定先天性免疫细胞，但是最近的一系列研究已表明这种佐剂还可直接靶定获得性免疫细胞。TLR-4表现出在CD4+T效应细胞和Treg细胞上表达（38，39）。重要的是，该受体在CD4+Teff细胞上所产生的刺激作用表现出抑制ERK1/2信号转导通路，从而抑制其在实验性结肠炎模型中的作用（39）。形成鲜明对照的是，TLR-4激动剂脂多糖对Treg细胞的刺激使Treg细胞在体内存活、扩增并且改善调节作用（38），这可解释在MPL单一治疗组中看到的不理想的肿瘤内CD8+Teff/Treg细胞比例。虽然还不知晓在我们的模型中观察到的SA-4-1BBL和MPL对肿瘤内CD8+T/Treg细胞比例的协同作用的确切的机理基础，但是在不受理论限制的条件下，可应用下列结论：（i）如对于OX-40通路激动剂（TNFR共刺激家族的另一邻近成员）所报道的（40），SA-4-1BBL可优先诱导Treg细胞中的细胞凋亡；（ii）SA-4-1BBL可阻断肿瘤介导的Teff细胞向诱导的Treg细胞的转化；以及（iii）SA-4-1BBL和MPL这两者可提高CD8+Teff细胞的肿瘤内频率，从而理想地影响CD8+Teff/Treg细胞比例。这些机理受到额外的（未公布的）数据的支持，所述数据表明SA-4-1BBL通过IFN-γ阻断肿瘤诱导的和TGF-β-诱导的Teff细胞向诱导的Treg细胞的转化。IFN-γ的表达响应SA-4-1BBL/MPL佐剂体系而提高也与该理论一致。虽然在接种了作为单一治疗的MPL的小鼠的外周观察到表达IFN-γ的CD8+T细胞的E7TAA-特异性频率提高，但是该作用并未导致肿瘤中CD8+T细胞的数目的增加，这说明这些细胞可能没有运输进入肿瘤。相反，接种联合的SA-4-1BBL/MPL佐剂在外周和肿瘤内均产生显著较高的CD8+Teff细胞数目，这说明联合两种佐剂可影响CD8+Teff运输/进入肿瘤和/或改善其存活。因此，在不受理论限制的条件下，采用SA-4-1BBL进行免疫调节被认为阻断了T效应细胞向T调节细胞的转化，这可为MPL/SA-4-1BBL组合具有较强疗效的因素。
在不存在可检测的急性毒性和慢性自身免疫的条件下实现了联合的SA-4-1BBL/MPL佐剂的治疗活性。没有急性毒性与先前公开的研究一致，这说明用比这些研究中使用的治疗剂量高4倍的SA-4-1BBL治疗小鼠不会产生可检测的毒性，所述可检测的毒性如通过全身细胞因子反应、非特异性淋巴增生、改变的淋巴细胞运输、普遍的淋巴肿大（lymphomegaly）和脾肿大以及肝炎所评估的，所有这些均在类似剂量的4-1BB受体的激动性抗体条件下观察到（14）。MPL的安全性已在临床前和临床环境中得到验证（5，6，20）。尽管如此，鉴于佐剂组合的高效性，意想不到的是完全不存在急性或慢性病理学。
上述结果证明了用于诱导针对TAA的强效CD8+Teff初级反应和长期记忆反应的SA-4-1BBL/MPL佐剂组合的高效力以及理想的肿瘤内CD8+Teff/Treg细胞比例，所述SA-4-1BBL/MPL佐剂组合的高效力以及理想的肿瘤内Teff/Treg细胞比例在两种不同的肿瘤模型中转化为强有效的疗效，并且这是在不存在可检测的急性毒性或慢性自身免疫的条件下观察到的。
综上所述，作为佐剂的单磷酰脂质A（MPL）和4-1BBL的组合特别有效。当MPL/4-1BBL佐剂组合与抗原一同给药时，MPL/4-1BBL佐剂组合引起非常有效的免疫反应，例如，通过单次免疫100%治愈所有小鼠中的癌症，该结果先前并未报道过。MPL/4-1BBL佐剂组合不仅仅产生有效反应，而且还产生特别好的疗效和长期免疫性。值得注意的是，MPL/4-1BBL佐剂组合刺激CD8+Teff细胞的生成，并且产生理想的Teff/Treg比例。Teff/Treg比例为癌症长期存活的重要预测因素。并且，MPL/4-1BBL佐剂组合使CD8+Teff细胞浸润进入肿瘤，这与针对肿瘤的活化的免疫反应一致。尽管MPL/4-1BBL佐剂组合具有强的且有效的免疫反应，但是MPL/4-1BBL佐剂组合组合物不会产生任何可检测的急性或慢性毒性症状，例如自身免疫反应。因此，含有作为佐剂的MPL和4-1BBL的组合物在诱导针对癌症和肿瘤的免疫反应方面非常有效并且还可针对其他病症使用，例如，用于治疗或预防感染原。因为MPL为toll-样受体（TLR）激动剂，所以本发明的发明人认为当其他TLR激动剂佐剂与本文所述的4-1BBL一同使用时，其他TLR激动剂佐剂可表现出协同效应。
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Claims (23)
1.一种佐剂组合物，所述佐剂组合物包含4-1BBL和toll-样受体（TLR）激动剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，TLR激动剂为TLR4激动剂。
3.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中，TLR激动剂为脂质A或其化学类似物。
4.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中，TLR激动剂为单磷酰脂质A（MPL）。
5.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中，4-1BBL包含在链霉亲和素-4-1BBL融合蛋白中。
6.如上述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物还包括OX-40L。
7.如上述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物还包括抗原。
8.如权利要求7所述的组合物，其中，所述抗原为癌症相关抗原或肿瘤相关抗原，自身抗原或者与感染原相关的抗原。
9.如权利要求5所述的组合物，其中，所述抗原为生物素化的并且存在于含有链霉亲和素-4-1BBL融合蛋白的结合体中。
10.如权利要求5所述的组合物，其中，4-1BBL融合蛋白形成三聚体或更高级的结构。
11.如上述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物还包括药学上可接受的赋形剂。
12.如权利要求11所述的组合物，其中，所述赋形剂包含明矾。
13.一种在受治者体内诱导针对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括将（a）所述抗原，（b）TLR激动剂和（c）4-1BBL给药于所述受治者。
14.如权利要求13所述的方法，其中，TLR激动剂为单磷酰脂质A（MPL）。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中，4-1BBL包含在链霉亲和素-4-1BBL融合蛋白中。
16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中，所述组合物还包括OX-40L。
17.如权利要求13至16中任一项所述的方法，所述方法还包括将（a）所述抗原，（b）TLR激动剂和（c）4-1BBL再次给药于所述受治者。
18.一种治疗受治者体内的肿瘤或癌症的方法，所述方法包括将（a）与所述肿瘤或所述癌症相关的抗原，（b）TLR激动剂和（c）4-1BBL给药于所述受治者。
19.如权利要求18所述的方法，其中，TLR激动剂为单磷酰脂质A（MPL）。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中，4-1BBL包含在链霉亲和素-4-1BBL融合蛋白中。
21.如权利要求18至20中任一项所述的方法，其中，所述组合物还包括OX-40L。
22.如权利要求18至21中任一项所述的方法，所述方法还包括将（a）与所述肿瘤或所述癌症相关的抗原，（b）TLR激动剂和（c）4-1BBL再次给药于所述受治者。
23.如权利要求22所述的方法，其中，第一次给药的与所述肿瘤或所述癌症相关的抗原和第二次给药的与所述肿瘤或所述癌症相关的抗原不同。
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Application publication date: 20131218 |
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