KR20130036246A - 사람 ｃｄ8+ ｔ 세포의 수지상 세포 면역수용체(ｄｃｉｒ)-매개 교차프라이밍 - Google Patents

사람 ｃｄ8+ ｔ 세포의 수지상 세포 면역수용체(ｄｃｉｒ)-매개 교차프라이밍 Download PDF

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Abstract

강력한 교차제시를 매개하기 위한 ITIM 모티프-함유 DC 면역수용체(DCIR)를 포함하는 면역자극 조성물 및 방법이 본원에 기재되어 있다. 본 발명자들은 다양한 렉틴 수용체를 통해 항원을 수지상 세포(DC)에 표적화시킴에 의해 생성된 사람 CD8+ T 세포 반응을 평가하였다. 저용량의 항-DCIR-항원 접합체에 대한 단일 노출은 생체외생성된 DC, 피부-분리된 랑게르한스 세포 및 혈액 mDC 및 pDC를 포함하는 모든 사람 DC 서브세트에 의해 항원-특이적 CD8+ T 세포 면역을 개시시켰다. 유리된 항원 또는 대조군 mAb에 접합된 항원에 의해 유도되거나 다른 렉틴 수용체인 DC-SIGN을 통해 전달되는 경우에 비해, FluMP, MART-1, 바이러스(HIV gag) 등과 같은 항원이 DCIR을 통해 DC로 전달되는 경우 증진된 특이적 CD8+ T 세포 반응이 관찰된다. 톨형 수용체(TLR) 7/8-효능제의 부가는 교차프라이밍 뿐만 아니라 DCIR-매개된 교차제시를 증진시켰다. 따라서, 사람 DCIR 수용체를 통한 항원 표적화는 특이적 CD8+ T 세포 면역의 활성화를 가능하게 한다.

Description

사람 ＣＤ8+ Ｔ 세포의 수지상 세포 면역수용체(ＤＣＩＲ)-매개 교차프라이밍{DENDRITIC CELL IMMUNORECEPTORS (DCIR)-MEDIATED CROSSPRIMING OF HUMAN CD8+ T CELLS}
본 발명은 일반적으로 면역학 분야, 보다 구체적으로는 사람 수지상 세포 면역수용체(DCIR)를 통해 강력한 교차제시를 매개하기 위한 항원 표적화에 관한 것이다.
본 발명의 범위의 제한 없이, 백신을 포함하는, 면역자극 방법들 및 조성물, 및 항원 제시에 있어서 증가된 효과와 연계하여 본 발명의 배경이 기재된다.
면역자극 조합의 한 예는 2008년 노엘 등(Noelle et al.)에게 허여된 미국 특허 제7,387,271호에 교시되어 있다. 노엘의 발명은, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, 및 TLR8 효능제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 톨(Toll)형 수용체(TLR) 효능제; CD40에 직접적으로 결합하는 하나 이상의 CD40 효능제; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 면역치료요법을 필요로 하는 사람 피검체에 투여하기에 적합한 면역자극 조성물을 기재하고 있다. 노엘의 발명에 기재된 바와 같은 상기 TLR 효능제 및 상기 CD40 효능제 각각은, 다른 것과 조합되어, 이들이 면역치료요법을 필요로 하는 사람 피검체에 투여시 항원에 대한 면역 반응을 상승적으로 증가시키는데 효과적인 양으로 존재한다.
미국 특허 공개공보 제20080267984호(반체로 등(Banchereau et al.) 2008)는 면역 세포 상의 LOX-1 수용체를 표적화하기 위한 조성물 및 방법, 및 항-LOX-1 항체에 대한 용도를 기재하고 있다. 반체로의 발명은 항-사람 LOX-1 모노클로날 항체(mAb)를 사용하여 표적화하기 위한 신규 조성물 및 방법을 포함하고 항체의 생물학적 기능을 특징으로 한다. 상기 항-LOX-1 mAb 및 이의 단편은 면역 세포의 표적화, 특징 분석 및 활성화에 유용하다.
미국 특허 공개공보 제20080241170호(주라우스키(Zurawski) 및 반체로(Banchereau), 2008)는 항원이 부착되어 항체-항원 복합체를 형성하는 DCIR-특이적 항체 또는 이의 단편을 사용하여 항원 제시 효과를 증가시키기 위한 조성물 및 방법을 포함하고, 여기서, 상기 항원은 항체-항원 복합체와 접촉하는 수지상 세포에 의해 가공되고 제시된다.
최종적으로, 델루시아(Delucia)가 출원한 미국 특허 공개공보 제20080241139호에서는 미생물 TLR 효능제, CD40 또는 4-1BB 효능제, 및 임의로 항원을 포함하는 보조제 조합 및 세포 면역에서 상승작용적 증진을 유도하기 위한 이의 용도를 기재하고 있다. 간략하게, 상기 출원은 전체 바이러스, 세균 또는 효모, 또는 이들의 일부분(예를 들어, 막, 스페로플라스트(spheroplast), 세포질체 또는 고스트(ghost))와 같은 하나 이상의 미생물 TLR 효능제, CD40 또는 4-1BB 효능제 및 임의의 항원(여기서, 모든 3개의 모이어티들은 별개이거나 동일한 재조합 미생물 또는 바이러스를 포함할 수 있다)을 포함하는 보조제 조합을 교시하고 있다. 암 및 HIV 감염과 같은 다양한 만성 질환을 치료하기 위한 면역 보조제의 용도가 또한 제공된다.
수지상 세포에 부착된 항원을 포함하는 백신은 이전에 본원 발명자에 의해 보고된 바 있다. 미국 특허 공개공보 제20100135994호(반체로 등, 2009)은 최대화된 Gag 및 Naf의 수지상 세포로의 표적화를 기초로 하는 HIV 백신을 기재하고 있다. 항원 제시 세포에 의한 항원 제시 효과는 유전자조작된 Gag 항원이 부착되어 항체-항원 복합체를 형성하는 DC-특이적 항체 또는 이의 단편을 분리하고 정제함에 의해 증가되고, 여기서, 상기 Gag 항원은 하나 이상의 단백질용해 부위를 제거하고; 상기 항체-항원 복합체가 T 세포 인식을 위해 가공되고 제시되는 조건하에서 항원 제시 세포를 접촉시킴에 의해 단백질용해에 덜 민감하다. 상기 항원 제시 세포는 수지상 세포를 포함하고 상기 DC-특이적 항체 또는 이의 단편은 코헤린(Coherin)/독케린(Dockerin) 쌍의 반쪽에 결합하거나 상기 DC-특이적 항체 또는 이의 단편은 코헤린/독케린 쌍의 반쪽에 결합하고, 상기 유전자조작된 Gag 항원은 코헤린/독케린 쌍의 상보적 반쪽에 결합하여 복합체를 형성한다. 미국 특허 공개공보 제20110081343호(반체로 등, 2009)의 발명자는 또한 고친화성 항-랑게린(Langerin) 모노클로날 항체 및 이와의 융합 단백질을 사용하는 항원 제시를 위해 항원을 표적화하고 랑게르한스 세포에 전달하기 위한 조성물 및 방법을 기재하였다.
본 발명은 강력한 교차제시를 매개하기 위해 ITIM 모티프-함유 DC 면역수용체(DCIR)를 포함하는 면역자극 조성물 및 방법을 기재한다. 주요 실시형태에서, 본 발명은 사람 또는 동물 피검체에서 예방, 치료, 또는 이들의 조합을 위해 면역 반응을 생성하기 위한 면역 자극 조성물을 제공하고, 이때, 상기 조성물은 하나 이상의 항원성 펩타이드(여기서, 상기 항원성 펩타이드는 상기 면역 반응, 예방, 치료, 또는 이들의 임의의 조합이 요망되는 질환 또는 병태에 연루되거나 관여하는 하나 이상의 항원의 하나 이상의 에피토프를 대표한다)가 로딩되거나 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드와 화학적으로 결합된 하나 이상의 항-수지상 세포(DC)-특이적 항체 또는 이의 단편; TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, 및 TLR8 효능제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 톨형 수용체(TLR) 효능제; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하고, 여기서, 상기 접합체 및 효능제 각각은, 다른 것과 조합되어, 면역 자극을 필요로 하는 사람 또는 동물 피검체에서 예방, 치료, 또는 이들의 임의의 조합을 위해 면역 반응을 제공하기에 효과적인 양으로 포함된다. 본원에 기재된 바와 같은 상기 조성물은 효능성 항-CD40 항체, 효능성 항-CD40 항체 단편, CD40 리간드(CD40L) 폴리펩타이드, CD40L 폴리펩타이드 단편, 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 항체 단편, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드 단편, IFN-γ, TNF-α, 1형 사이토킨, 2형 사이토킨, 또는 이들의 조합 및 변형체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제제를 임의로 포함할 수 있다.
하나의 양상에서, 상기 항-DC-특이적 항체 또는 단편은 수지상 세포 면역수용체(DCIR), MHC 부류 I, MHC 부류 II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, 만노스 수용체, 랑게린, DECTIN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1, Fcγ 수용체, LOX-1, 및 ASPGR에 특이적으로 결합하는 항체로부터 선택된다. 또 다른 양상에서, 상기 항-DC-특이적 항체는 ATCC 수탁번호 PTA 10246 또는 PTA 10247로부터 선택되는 항-DCIR 항체이다. 또 다른 양상에서, 상기 DCIR은 면역수용체 티로신-기본 활성화 모티프(ITAM)를 포함한다.
본 발명의 조성물에 사용되는 항원성 펩타이드는 gag, pol, 및 env 유전자, Nef 단백질, 역전사효소, 일련의 HIV 펩타이드(Hipo5), PSA(KLQCVDLHV)-사량체(서열번호 10), HIVgag-유도된 p24-PLA HIV gag p24(gag), 및 기타 HIV 성분으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사람 면역 결핍 바이러스(HIV) 항원 및 유전자 생성물; 간염 바이러스 항원; 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, H1N1 Flu 종 기원의 인플루엔자 A 헤마글루티닌 HA-1, HLA-A201-FluMP (58-66) 펩타이드 (GILGFVFTL) 사량체(서열번호 1), 및 조류 Flu (HA5-1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스 항원; 씨. 써모셀룸(C. thermocellum) 기원의 독케린 도메인; 홍역 바이러스 항원; 풍진 바이러스 항원; 로타바이러스 항원; 사이토메갈로바이러스 항원; 호흡기 세포융합 바이러스 항원; 헤르페스 심플렉스 바이러스 항원; 바리셀라 조스터 바이러스 항원; 일본 뇌염 바이러스 항원; 광견병 바이러스 항원; 또는 이들의 조합 및 변형체를 포함한다. 상기 항원성 펩타이드는 또한 암 펩타이드를 포함할 수 있고, 백혈병 및 림프종, 신경 종양, 예를 들어, 성상세포종, 또는 교모세포종, 흑색종, 유방암, 폐암, 두경부 암, 위장 종양, 위암, 결장암, 간암, 췌장암, 비뇨생식기 종양, 예를 들어, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 질 암, 고환암, 전립선암 또는 음경암, 골 종양, 혈관 종양 또는 입술암, 비인두암, 인두암, 구강암, 식도암, 직장암, 담낭암, 담도암, 후두암, 폐 및 기관지암, 방광암, 신장암, 뇌암 및 신경계 부분의 기타 암, 갑상선암, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종 및 백혈병 기원의 항원을 포함하는 종양 관련 항원으로부터 선택된다. 상기 종양 관련 항원은 CEA, 전립선 특이적 항원(PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 및 12, MUC(뮤신)(예를 들어, MUC-1, MUC-2 등), GM2 및 GD2 갱글리오사이드, ras, myc, 티로시나제, MART(흑색종 항원), MARCO-MART, 사이클린 B1, 사이클린 D, Pmel 17(gp100), GnT-V 인트론 V 서열(N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라제 V 인트론 V 서열), 전립선 Ca psm, 전립선 혈청 항원(PSA), PRAME(흑색종 항원), β-카테닌, MUM-1-B(흑색종 편재 돌연변이된 유전자 생성물), GAGE(흑색종 항원) 1, BAGE(흑색종 항원) 2-10, c-ERB2 (Her2/neu), EBNA(엡스타인-바 바이러스 핵 항원) 1-6, gp75, 사람 유두종 바이러스(HPV) E6 및 E7, p53, 폐 내성 단백질 (LRP), Bcl-2, 및 Ki-67로부터 선택된다.
또 다른 양상에서, 상기 DC-특이적 항체는 사람화되고 상기 조성물은 경구 경로, 비강 경로, 국소적으로, 또는 주사(피하, 정맥내, 복강내, 근육내 또는 정맥내)로서 사람 또는 동물 피검체에 투여된다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 항원성 펩타이드가 로딩되거나 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드와 화학적으로 결합된 하나 이상의 항-수지상 세포(DC)-특이적 항체 또는 이의 단편; TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, 및 TLR8 효능제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 톨형 수용체(TLR) 효능제; 및 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 및 보조제를 포함하는 백신에 관한 것이고, 이때, 상기 항체 및 효능제 각각은, 다른 것과 조합되어, 사람 또는 동물 피검체에서 예방, 치료, 또는 이들의 임의의 조합을 위해 면역 반응을 생성하는데 효과적인 양으로 포함된다. 본 발명의 백신은 효능성 항-CD40 항체, 효능성 항-CD40 항체 단편, CD40 리간드(CD40L) 폴리펩타이드, CD40L 폴리펩타이드 단편, 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 항체 단편, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드 단편, IFN-γ, TNF-α, 1형 사이토킨, 2형 사이토킨, 또는 이들의 조합 및 변형체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 임의의 제제를 포함한다.
하나의 양상에서, 상기 항-DC-특이적 항체 또는 단편은 수지상 세포 면역수용체(DCIR), MHC 부류 I, MHC 부류 II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, 만노스 수용체, 랑게린, DECTIN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1, Fcγ 수용체, LOX-1, 및 ASPGR에 특이적으로 결합하는 항체로부터 선택된다. 또 다른 양상에서, 상기 항-DC-특이적 항체는 ATCC 수탁번호 PTA 10246 또는 PTA 10247로부터 선택되는 항-DCIR 항체이다. 또 다른 양상에서, 상기 항원성 펩타이드는 gag, pol, 및 env 유전자, Nef 단백질, 역전사효소, 일련의 HIV 펩타이드(Hipo5), PSA(KLQCVDLHV)-사량체(서열번호 10), HIVgag-유도된 p24-PLA HIV gag p24(gag), 및 기타 HIV 성분으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사람 면역 결핍 바이러스(HIV) 항원 및 유전자 생성물; 간염 바이러스 항원; 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, H1N1 Flu 종 기원의 인플루엔자 A 헤마글루티닌 HA-1, HLA-A201-FluMP (58-66) 펩타이드 (GILGFVFTL) 사량체(서열번호 1), 및 조류 Flu (HA5-1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스 항원; 씨. 써모셀룸(C. thermocellum) 기원의 독케린 도메인; 홍역 바이러스 항원; 풍진 바이러스 항원; 로타바이러스 항원; 사이토메갈로바이러스 항원; 호흡기 세포융합 바이러스 항원; 헤르페스 심플렉스 바이러스 항원; 바리셀라 조스터 바이러스 항원; 일본 뇌염 바이러스 항원; 광견병 바이러스 항원; 또는 이들의 조합 및 변형체를 포함한다. 또 다른 양상에서, 상기 항원성 펩타이드는 CEA, 전립선 특이적 항원(PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 및 12, MUC(뮤신)(예를 들어, MUC-1, MUC-2 등), GM2 및 GD2 갱글리오사이드, ras, myc, 티노시나제, MART(흑색종 항원), MARCO-MART, 사이클린 B1, 사이클린 D, Pmel 17(gp100), GnT-V 인트론 V 서열(N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라제 V 인트론 V 서열), 전립선 Ca psm, 전립선 혈청 항원(PSA), PRAME(흑색종 항원), β-카테닌, MUM-1-B (흑색종 편재 돌연변이된 유전자 생성물), GAGE (흑색종 항원) 1, BAGE (흑색종 항원) 2-10, c-ERB2 (Her2/neu), EBNA (엡스타인-바 바이러스 핵 항원) 1-6, gp75, 사람 유두종 바이러스(HPV) E6 및 E7, p53, 폐 내성 단백질(LRP), Bcl-2, 및 Ki-67로부터 선택되는 종양 관련 항원을 포함하는 암 펩타이드이다. 상기 백신 조성물의 특정 양상에서, 상기 DC-특이적 항체는 사람화되고, 상기 조성물은 경구 경로, 비강 경로, 국소적으로, 또는 주사로서 사람 또는 동물 피검체에 투여된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 항원 제시 세포에 의해 항원 제시의 효과를 증가시키기 위한 방법으로서, (i) 하나 이상의 수지상 세포(DC)-특이적 항체 또는 이의 단편을 분리하고 정제하는 단계, (ii) 하나 이상의 천연 또는 가공된 항원성 펩타이드를 DC-특이적 항체에 로딩하거나 화학적으로 결합시켜 항체-항원 접합체를 형성하는 단계, (iii) TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, 및 TLR8 효능제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 톨형 수용체(TLR) 효능제를 상기 접합체에 부가하는 단계, 및 (iv) 상기 항원 제시 세포를 상기 접합체 및 TLR 효능제와 접촉시키는 단계(이때, 상기 항체-항원 복합체는 T 세포 인식을 위해 프로세싱되고 제시된다)를 포함하는, 상기 항원 제시 세포에 의해 항원 제시의 효과를 증가시키기 위한 방법을 기재하고 있다.
상기된 바와 같은 방법은, (i) 효능성 항-CD40 항체, 효능성 항-CD40 항체 단편, CD40 리간드 (CD40L) 폴리펩타이드, CD40L 폴리펩타이드 단편, 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 항체 단편, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드 단편, IFN-γ, TNF-α, 1형 사이토킨, 2형 사이토킨, 또는 이들의 조합 및 변형체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 임의의 제제를, 상기 항원 제시 세포와 접촉시키기 전에 상기 항체-항원 접합체 및 TLR 효능제에 부가하는 단계, 및 (ii) IFN-γ, TNF-α, IL-12p40, IL-4, IL-5, 및 IL-13으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 제제의 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 하나 이상의 제제의 수준 변화는 상기 항원 제시 세포에 의한 항원 제시 효과의 증진의 지표이다)인 임의의 단계들을 추가로 포함한다.
하나의 양상에서, 상기 항원 제시 세포는 수지상 세포(DC)를 포함한다. 다른 양상에서, 상기 항-DC-특이적 항체 또는 이의 단편은 수지상 세포 면역수용체 (DCIR), MHC 부류 I, MHC 부류 II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, 만노스 수용체, 랑게린, DECTTN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1, Fcγ 수용체, LOX-1, 및 ASPGR에 특이적으로 결합하는 항체로부터 선택된다. 다른 양상에서, 상기 항-DC-특이적 항체는 ATCC 수탁번호 PTA 10246 또는 PTA 10247로부터 선택되는 항-DCIR 항체이다. 또 다른 양상에서, 상기 항원성 펩타이드는 gag, pol, 및 env 유전자, Nef 단백질, 역전사효소, 일련의 HIV 펩타이드(Hipo5), PSA(KLQCVDLHV)-사량체(서열번호 10), HIVgag-유도된 p24-PLA HIV gag p24(gag), 및 기타 HIV 성분으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사람 면역 결핍 바이러스(HIV) 항원 및 유전자 생성물; 간염 바이러스 항원; 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, H1N1 Flu 종 기원의 인플루엔자 A 헤마글루티닌 HA-1, HLA-A201-FluMP (58-66) 펩타이드 (GILGFVFTL) 사량체(서열번호 1), 및 조류 Flu (HA5-1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스 항원; 씨. 써모셀룸(C. thermocellum) 기원의 독케린 도메인; 홍역 바이러스 항원; 풍진 바이러스 항원; 로타바이러스 항원; 사이토메갈로바이러스 항원; 호흡기 세포융합 바이러스 항원; 헤르페스 심플렉스 바이러스 항원; 바리셀라 조스터 바이러스 항원; 일본 뇌염 바이러스 항원; 광견병 바이러스 항원; 또는 이들의 조합 및 변형체, 또는 CEA, 전립선 특이적 항원(PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 및 12, MUC(뮤신)(예를 들어, MUC-1, MUC-2 등), GM2 및 GD2 갱글리오사이드, ras, myc, 티로시나제, MART(흑색종 항원), MARCO-MART, 사이클린 B1, 사이클린 D, Pmel 17(gp100), GnT-V 인트론 V 서열(N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라제 V 인트론 V 서열), 전립선 Ca psm, 전립선 혈청 항원(PSA), PRAME (흑색종 항원), β-카테닌, MUM-1-B(흑색종 편재 돌연변이된 유전자 생성물), GAGE(흑색종 항원) 1, BAGE(흑색종 항원) 2-10, c-ERB2(Her2/neu), EBNA(엡스타인-바 바이러스 핵 항원) 1-6, gp75, 사람 유두종 바이러스 (HPV) E6 및 E7, p53, 폐 내성 단백질(LRP), Bcl-2, 및 Ki-67로부터 선택되는 종양 관련 항원을 포함하는 암 펩타이드를 포함한다. 특이적 양상에서, 상기 DC-특이적 항체는 사람화된다.
또 다른 실시형태는 하나 이상의 항원성 펩타이드가 로딩되거나 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드와 화학적으로 결합된 항-수지상 세포 면역수용체(DCIR) 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 포함하는 항-수지상 세포 면역수용체(DCIR) 모노클로날 항체 접합체; TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, 및 TLR8 효능제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 톨형 수용체(TLR) 효능제; 및 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 및 보조제를 포함하는 백신을 기재하고, 여기서, 상기 접합체 및 효능제 각각은, 다른 것과 조합되어, 이를 필요로 하는 사람 또는 동물 피검체에서 하나 이상의 질환 또는 병태에 대해 예방, 치료, 또는 임의의 이들의 조합을 위해 면역 반응을 생성시키는데 효과적인 양으로 포함된다. 상기된 백신은 사람 피검체에서 인플루엔자, HIV, 암, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 질환 또는 병태에 대한 치료, 예방, 또는 이들의 조합에 사용하기 위해 조정된다. 상기된 백신에 관련된 양상에서, 하나 이상의 항원성 펩타이드는 FluMP 펩타이드(서열번호 1), 서열번호 2를 포함하는 MART-1 펩타이드, 및 HIV gagp24 펩타이드(서열번호 3)이다.
하나의 양상에서, 상기 백신은 효능성 항-CD40 항체, 효능성 항-CD40 항체 단편, CD40 리간드 (CD40L) 폴리펩타이드, CD40L 폴리펩타이드 단편, 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 항체 단편, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드 단편, IFN-γ, TNF-α, 1형 사이토킨, 2형 사이토킨, 또는 이들의 조합 및 변형체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 임의의 제제를 포함한다. 다른 양상에서, 상기 백신은 MHC 부류 I, MHC 부류 II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, 만노스 수용체, 랑게린, DECTIN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1, Fcγ 수용체, LOX-1, 및 ASPGR에 특이적으로 결합하는 항체로부터 선택되는 임의의 항-DC-특이적 항체 또는 이의 단편을 추가로 포함한다.
본 발명은, 사람 피검체에서 하나 이상의 질환 또는 병태에 대한 치료, 예방, 또는 이들의 조합을 위한 방법을 추가로 기재하고, 상기 방법은 하나 이상의 질환 또는 병태에 대한 상기 치료, 예방, 또는 이들의 조합을 필요로 하는 피검체를 선별하는 단계, 및 (i) 예방, 치료 또는 이 모두가 요망되는 하나 이상의 질환 또는 병태에 연루되거나 관여된 하나 이상의 항원의 하나 이상의 에피토프를 대표하는 하나 이상의 항원성 펩타이드가 로딩되거나 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드와 화학적으로 결합된 항-수지상 세포 면역수용체(DCIR) 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 포함하는 항-수지상 세포 면역수용체(DCIR) 모노클로날 항체 접합체, (ii) TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, 및 TLR8 효능제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 톨형 수용체(TLR) 효능제, 및 (iii) 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 및 보조제를 포함하는, 백신 조성물(여기서, 상기 접합체 및 효능제 각각은, 다른 것과 조합되어, 사람 피검체에서 상기 하나 이상의 질환 또는 병태에 대한 예방, 치료, 또는 이들의 임의의 조합을 위해 면역 반응을 생성시키는데 효과적인 양으로 포함된다)을 투여하는 단계를 포함한다.
상기된 방법에 의해 치료되는 하나 이상의 질환 또는 병태는 인플루엔자, 암, HIV, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고, 여기서, 상기 암은 백혈병 및 림프종, 신경 종양, 예를 들어, 성상세포종, 또는 교모세포종, 흑색종, 유방암, 폐암, 두경부 암, 위장 종양, 위암, 결장암, 간암, 췌장암, 비뇨생식기 종양, 예를 들어, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 질 암, 고환암, 전립선암 또는 음경암, 골 종양, 혈관 종양 또는 입술암, 비인두암, 인두암, 구강암, 식도암, 직장암, 담낭암, 담도암, 후두암, 폐 및 기관지암, 방광암, 신장암, 뇌암 및 신경계 부분의 기타 암, 갑상선암, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종 및 백혈병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 양상에서, 상기 백신은 효능성 항-CD40 항체, 효능성 항-CD40 항체 단편, CD40 리간드 (CD40L) 폴리펩타이드, CD40L 폴리펩타이드 단편, 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 항체 단편, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드 단편, IFN-γ, TNF-α, 1형 사이토킨, 2형 사이토킨, 또는 이들의 조합 및 변형체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 임의의 제제를 포함한다. 다른 양상에서, 상기 백신은 경구 경로, 비강 경로, 국소적으로, 또는 주사로서 사람 피검체에 투여된다. 또 다른 양상에서, 상기 백신은 MHC 부류 I, MHC 부류 II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, 만노스 수용체, 랑게린, DECTIN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1, Fcγ 수용체, LOX-1, 및 ASPGR에 특이적으로 결합하는 항체로부터 선택되는 임의의 항-DC-특이적 항체 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 상기된 방법에 기재된 백신과 관련된 양상에서, 하나 이상의 항원성 펩타이드는 FluMP 펩타이드(서열번호 1), 서열번호 2를 포함하는 MART-1 펩타이드, 및 HIV gagp24 펩타이드(서열번호 3)이다.
본 발명은 또한 사람 피검체에서 하나 이상의 수지상 세포(DC)에 의한 항원 제시 효과를 증가시키기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은, 사람으로부터 하나 이상의 DC를 분리하는 단계, 하나 이상의 항원성 펩타이드가 로딩되거나 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드와 화학적으로 결합된 항-수지상 세포 면역수용체(DCIR) 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 포함하는 항-수지상 세포 면역수용체(DCIR) 모노클로날 항체 접합체; TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, 및 TLR8 효능제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 톨형 수용체(TLR) 효능제; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 활성화 양의 조성물 또는 백신에, 상기 분리된 DC를 노출시켜 활성화된 DC 복합체를 형성하는 단계, 및 상기 활성화된 DC 복합체를 사람 피검체에게 재도입하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 IFN-γ, TNF-α, IL-12p40, IL-4, IL-5, 및 IL-13으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 제제의 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 하나 이상의 제제의 수준의 변화는 상기 하나 이상의 DC의 효과가 증가하였음의 지표이다), 효능성 항-CD40 항체, 효능성 항-CD40 항체 단편, CD40 리간드 (CD40L) 폴리펩타이드, CD40L 폴리펩타이드 단편, 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 항체 단편, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드 단편, IFN-γ, TNF-α, 1형 사이토킨, 2형 사이토킨, 또는 이들의 조합 및 변형체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 임의의 제제를, 상기 DC 노출 전에 상기 접합체 및 상기 TLR 효능제에 부가하는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 양상에서, 상기 방법은 MHC 부류 I, MHC 부류 II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, 만노스 수용체, 랑게린, DECTIN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1, Fcγ 수용체, LOX-1, 및 ASPGR에 특이적으로 결합하는 항체로부터 선택된 하나 이상의 항-DC-특이적 항체 또는 이의 단편을 부가하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법의 다른 양상에서, 상기 항원성 펩타이드는 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 항원 및 유전자 생성물, 하나 이상의 암 펩타이드 및 종양 관련 항원 또는 이 모두를 포함한다.
본 발명은 추가로 하나 이상의 바이러스, 세균, 진균류, 기생충, 원생동물, 기생충 질환 및 알레르기 장애에 대한 예방, 치료, 또는 이들의 조합을 위해 하나 이상의 수지상 세포(DC)의 활성화에 의한 면역자극을 사람 피검체에게 제공하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (i) 바이러스, 세균, 진균류, 기생충, 원생동물, 기생충 질환 및 알레르기 장애에 대한 예방, 치료, 또는 이들의 조합을 위해 면역자극을 필요로 하는 사람 피검체를 선별하는 단계, (ii) 상기 사람 피검체로부터 하나 이상의 DC를 분리하는 단계, (iii) 하나 이상의 항원성 펩타이드가 로딩되거나 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드와 화학적으로 결합된 항-수지상 세포 면역수용체(DCIR) 모노클로날 항체 또는 이의 단편; TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, 및 TLR8 효능제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 톨형 수용체(TLR) 효능제; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항-수지상 세포 면역수용체(DCIR) 모노클로날 항체 접합체를 포함하는 활성화 양의 조성물 또는 백신에, 상기 분리된 DC를 노출시켜 활성화된 DC 복합체를 형성하는 단계, 및 (iv) 상기 활성화된 DC 복합체를 상기 사람 피검체로 재도입하는 단계를 포함한다. 상기 면역자극 방법은 IFN-γ, TNF-α, IL-12p40, IL-4, IL-5, 및 IL-13으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 제제의 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 하나 이상의 제제의 수준 변화는 상기 항원 제시 세포에 의한 항원 제시 효과의 증진의 지표이다)인 임의의 단계들을 추가로 포함한다.
하나의 양상에서, 상기 방법은 효능성 항-CD40 항체, 효능성 항-CD40 항체 단편, CD40 리간드 (CD40L) 폴리펩타이드, CD40L 폴리펩타이드 단편, 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 항체 단편, 4-IBB 리간드 폴리펩타이드, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드 단편, IFN-γ, TNF-α, 1형 사이토킨, 2형 사이토킨, 또는 이들의 조합 및 변형체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 임의의 제제를, 상기 DC 노출 전에 상기 접합체 및 TLR 효능제에 부가하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 양상에서, 상기 방법은 MHC 부류 I, MHC 부류 II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, 만노스 수용체, 랑게린, DECTTN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1, Fcγ 수용체, LOX-1, 및 ASPGR에 특이적으로 결합하는 항체로부터 선택되는 하나 이상의 임의의 항-DC-특이적 항체 또는 이의 단편을 부가하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 항원성 펩타이드는 백일해 독소, 필라멘트형 헤마글루티닌, 퍼탁틴, FIM2, FIM3, 아데닐레이트 사이클라제 및 다른 백일해 세균 항원 성분, 디프테리아 세균 항원, 디프테리아 독소 또는 톡소이드, 다른 디프테리아 세균 항원 성분, 파상풍 세균 항원, 파상풍 독소 또는 톡소이드, 다른 파상풍 세균 항원 성분, 스트렙토코커스 세균 항원, 그람-음성 바실리 세균 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 세균 항원, 마이콜산, 열 쇼크 단백질 65 (HSP65), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 세균 항원 성분; 폐렴 구균성 세균 항원, 헤모필러스 인플루엔자 세균 항원, 탄저병 세균 항원 및 리케치아 세균 항원으로부터 선택되는 세균성 항원, 캔디다 진균류 항원 성분, 히스토플라스마 진균류 항원, 크립토코커스 진균류 항원, 콕시디오이데스 진균류 항원 및 백선 진균류 항원으로부터 선택되는 진균류 항원, 플라스모디움 팔시파룸(plasmodium falciparum), 포자소체 표면 항원, 외주포자소체(circumsporozoite) 항원, 생식모세포/생식세포(gametocyte/gamete) 표면 항원, 혈액-단계 항원 pf 155/RESA, 톡소플라스마, 주혈흡충(schistosomae) 항원, 리슈마니아 메이저(leishmania major) 및 기타 리슈마니아 항원 및 트리파노소마 크루지(trypanosoma cruzi) 항원으로부터 선택되는 원생동물 및 기생충 항원, 자가면역 질환에; 알레르기에; 및 당뇨병, 진성 당뇨병, 관절염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 전신 홍반성 낭창, 자가면역 갑상선염, 피부염, 건선, 쇼그렌 증후군, 원형탈모증, 곤충 물림 반응으로 인한 알레르기 반응, 크론 질환, 아프타 궤양(aphthous ulcer), 홍채염, 결막염, 각결막염, 궤양성 대장염, 천식, 알레르기성 천식, 피부 홍반성 낭창, 경피증, 질염, 직장항문염, 약진, 나병 역전 반응, 나성 결절 홍반, 자가면역 포도막염, 알레르기성 뇌막염, 급성 괴사 출혈 뇌병변, 특발성 양측 진행성 감각신경성 난청, 재생불량 빈혈, 순수 적혈구 세포 빈혈, 특발성 혈소판감소증, 다발연골염, 베게너 육아종증, 만성 활성 간염, 스티븐스-존슨 증후군, 특발성 스푸루(idiopathic sprue), 편평 태선, 크론 질환, 그레이브스 안병증(Graves ophthalmopathy), 유육종증, 원발성 담즙성 간경변증, 후부 포도막염, 및 간질성 폐 섬유증으로부터 선택된 이식 거부, 및 일본 삼나무 꽃가루(Japanese cedar pollen) 항원, 두드러기쑥(ragweed) 꽃가루 항원, 호밀 잔디 꽃가루 항원, 동물 유도된 항원, 먼지 진드기 항원, 고양이 항원, 조직적합성 항원, 및 페니실린 및 기타 치료학적 약물로부터 선택되는 알레르기 장애에 관여하는 항원을 포함할 수 있다. 또 다른 양상에서, 상기 DC-특이적 항체는 사람화된다.
본 발명의 특징 및 이점에 대한 보다 완전한 이해를 위해 첨부된 도면과 함께 발명의 상세한 설명을 참조한다:
도 1a 내지 도 1d는 DCIR의 세포 분포를 보여준다: (도 1a) 말초 혈액 단핵 세포 상의 DCIR 발현의 유동 세포측정 분석. 순환 단핵 세포를 10μg/ml의 항-DCIR mAb로 염색시킴에 이어서 PE-접합된 염소 항-마우스 IgG로 염색시켰다. 세포는 FITC-접합된 항-CD19, 항-CD4, 항-CD8(림프구에 대해), 항-CD16, 항-CD56(NK 세포에 대해), 항-CD14 mAb(단핵구에 대해) 또는 항-CD11c, 항-HLA-DR 및 항-CD123 mAb(pDC 또는 mDC에 대해)로 항온처리하고 유동 세포측정기로 분석하였다. 제시된 데이터는 3개의 상이한 공여자에 대해 수행된 3회의 독립적인 수행을 대표한다. (도 1b) 피부-유도된 DC 서브세트: 상피 LC, 진피 CD1a+ DC 및 진피 CD14+ DC에 대한 유동 세포측정에 의한 DCIR의 발현 분석. (도 1c) 사람 상피 시트를 항-DCIR로 염색하고 형광 현미경으로 분석하고 HLA-DR+ LC상의 DCIR의 발현을 밝혔다. (도 1d) CD34+-유도된 DC 서브세트인 CD1a+ LC 및 CD14+ DC에 대한 유동 세포측정에 의한 DCIR의 발현 분석;
도 2a는 I: 표적 항원 FluMP에 가교결합된 마우스 IgG1의 다이아그램, II-III: coh.항원 (FluMP II 또는 MART-1 III)에 접합된 키메라 mAb(IgG4).doc의 다이아그램, IV-V: 키메라 융합 mAb IgG4-항원(HIV gag MART-1 IV 또는 p24 V)의 다이아그램을 도시한다;
도 2b 및 도 2c는 항-DCIR 접합체 mAb에 의한 FluMP 단백질의 교차제시를 보여준다: (도 2b) 화학적으로 가교결합된 항-DCIR-FluMP, 가교결합된 대조군 IgG-FluMP 단백질, 또는 유리된 FluMP와 함께 배양된 CD1a+ LC에 의한 FluMP의 CD8+ T 세포로의 증진된 교차제시. 도트 플롯은 HLA-A201-FluMP(58-66) 펩타이드 사량체-양성 CD8+ T 세포의 비율을 보여준다. 데이터는 3개의 독립적인 연구를 대표한다. (도 2c)는 가교결합된 mAb-FluMP 작제물 또는 유리된 FluMP의 감소하는 농도와 함께 표적화에 응답하는 FluMP-특이적 CD8+ T 세포의 백분율을 도시한다. 그래프는 2회의 평균을 도시한다;
도 2d 및 도 2e는 표적화된 단백질의 DCIR mAb로의 가공 및 특징 분석을 보여준다: (도 2d) 독케린 도메인(mAb.Doc)에 융합된 마우스 항-DCIR mAb(클론 9E8 및 24A5), 키메라 마우스/사람 항-DCIR(IgG4) 및 대조군 IgG4의 SDS-PAGE-환원 겔. 코헤신 도메인에 융합된 FluMP 및 MART-1(coh.FluMP 및 coh.MART-1), 및 융합 단백질 항-DCIR-p24 및 대조군 IgG4-p24. 상기 겔은 코마시 블루로 염색하였다. 상기 단백질의 분자량은 도면의 좌측상에 나타낸다. (도 2e) 항-DCIR.doc-coh.FluMP 복합체 mAb의 단핵구-유도된 DC로의 결합 분석. 6일째의 미성숙한 GM-IL4 DC를 50nM의 비오티닐화된 항-DCIR-FluMP, 및 대조군 IgG4-FluMP 접합체 mAb로 처리하였다. 상기 복합체는 피코에리트린-접합된 스트렙트아비딘으로 검출하였다. 상기 항-DCIR.doc- coh.FluMP 복합체 mAb는 DC에 결합하는 반면(검정 히스토그램), 각각의 대조군 접합체 mAb는 DC에 결합하지 않았다(회색 히스토그램);
도 2f는 펄스되지 않거나(대조군 DC, 회색 히스토그램), 또는 50nM DCIR-표적화된 FluMP로 펄스된 CD34+-유도된 DC 상의 HLA-A201-FluMP 복합체의 염색을 나타낸다. 세포는 5μg/ml의 항-CD40 mAb(12E12, Baylor Research Institute; BIIR)로 활성화시키고 24시간 후에 PE-표지된 사량체화된 항-HLA-A201 -FluMP Fab (M1D12)50으로 염색하였다;
도 2g는 8nM(상부 패널) 또는 0.8nM(하부 패널)의 항-DCIR.doc-coh.FluMP 또는 IgG4.doc-coh.FluMP 접합체 mAb와 함께 배양된 자가 HLA-A201+ CD34+-유도된 LC에 의한 FluMP의 CD8+ T 세포로의 교차제시를 도시한다. 도트 플롯은 10일 후 HLA-A201-FluMP(58-66) 펩타이드 사량체-양성 CD8+ T 세포의 비율을 나타낸다;
도 2h는 10일 동안 세척되고 자가 CD8+ T 세포와 함께 배양된 8nM 항-DCIR.doc-coh.FluMP 또는 대조군 IgG2a.doc-coh.FluMP 접합체 mAb로 18시간 동안 펄스된 DC에 의해 유도된 HLA-A201-FluMP (58-66) 사량체-양성-CD8+ T 세포의 비율을 그래프로 나타낸 것이다. 그래프는 HLA-A201-FluMP(58-66) 사량체-양성 CD8+ T 세포의 비율을 나타내고, 평균 ± sd, N=3이다;
도 3a 및 도 3b는 DCIR이 LC에 의한 단백질의 교차제시를 가능하게 함을 보여준다: (도 3a) HLA-A201+ 공여자 기원의 피부-유도된 LC를 각각 8nM의 항-DCIR.doc-coh.FluMP 또는 IgG4.doc-coh.FluMP 접합체 mAb로 표적화하고, CD40L로 성숙화시키고 자가 CD8+ T 세포와 함께 공동 배양하였다. 10일 후, CD8+ T 세포 증식을 특이적 HLA-A201-FluMP (58-66) 사량체 염색으로 평가하였다. 데이터는 2개의 상이한 공여자 기원의 세포로 수행된 2개의 독립적인 실험을 대표한다. (도 3b) CD8+ T 세포의 배양 상청액 중에서 루미넥스(Luminex)에 의해 측정된 바와 같은 IFN-γ 수준은 항-DCIR.doc-coh.FluMP 또는 IgG4.doc-coh.FluMP 접합체 mAb로 표적화된 자가 피부 LC에 의해 10일 동안 증가된다. 그래프는 평균 ± sd, N=3을 보여준다; 도 4a 내지 도 4c는 DCIR이 모든 혈액 DC 서브세트에 대해 범용 표적임을 보여준다: (도 4a) HLA-A201 공여자 기원의 혈액-유도된 mDC는 각각 8nM, 0.8nM 또는 80pM의 항-DCIR.doc-coh.FluMP(클론 24A5), IgG4.doc-coh.FluMP 접합체 mAb, 또는 유리된 coh.FluMP로 표적화하고, CD40L로 성숙화시키고 자가 CD8+ T 세포와 공동-배양하였다. 10일 후에, CD8+ T 세포 증식은 특이적 HLA-A201-FluMP (58-66) 사량체 염색으로 평가하였다. 데이터는 3개의 독립적인 연구를 대표한다. (도 4b) HLA-A201 공여자 기원의 혈액-유도된 pDC는 각각 8nM, 0.8nM 또는 80pM의 항-DCIR.doc-coh.FluMP(클론 24A5), IgG4.doc-coh.FluMP, 또는 유리된 coh.FluMP로 표적화하고, CD40L로 성숙화시키고 자가 CD8+ T 세포와 공동-배양하였다. 10일 후, T 세포 증식은 특이적 HLA-A201-FluMP (58-66) 사량체 염색으로 평가하였다. 데이터는 3개의 독립적인 연구를 대표한다. (도 4c) 8nM의 DCIR.doc-coh.FluMP 복합체 mAb-표적화된 mDC 또는 pDC에 의해 유도된 FluMP-특이적 CD8+ T 세포의 백분율. 그래프는 2개의 상이한 클론의 DCIR mAb(p = 0.02)를 사용하는 3개의 독립적인 연구 결과를 나타낸다;
도 5a 내지 도 5d는 항-DCIR 융합 mAb에 의한 Mart-1 및 HIV gag p24 단백질의 교차프라이밍을 보여준다: (도 5a) HLA-A201+ 공여자 기원의 피부-유도된 LC를 정제하고 30nM의 항-DCIR.doc-coh.MART-1 또는 IgG4.doc-coh.MART-1 접합체 mAb의 존재하에 자가 정제된 T 세포와 10일 동안 배양하였다. DC는 CD40L로 활성화시켰다. MART-1-특이적 CD8+ T 세포 증식은 특이적 HLA-A201-MART-1 (26-35) 사량체로 측정하였다; (도 5b) 항-DCIR-MART-1 또는 IgG4-MART-1 (25nM) 융합 단백질을 사용하여 단핵구-유도된 IFN-α DC를 표적화하였다. DC는 CD40L로 활성화시키고 순수 자가 CD8+ T 세포와 배양하였다. 10일 후, 세포를 24시간 동안 MART-1 단백질로부터 유도된 펩타이드가 로딩된 새로운 DC 또는 대조군으로서의 로딩되지 않은 DC로 재자극시켰다. 플롯은 특이적 MART-1 펩타이드 클러스터에 응답하여 IFN-γ 및 CD107a를 동시발현하는 프라이밍된 CD8+ T 세포의 백분율을 보여준다. (도 5c) CD34+-유도된 LC는 DCIR-MART-1 또는 대조군 IgG4-MART-1 융합 단백질로 표적화하고 9일 동안 순수 CD8+ T 세포와 배양하였다. 그래프는 유동 세포 측정기에 의한 배양 말기에서의 분석시 그랜자임 B 및 퍼포린을 동시 발현하는 세포의 백분율을 보여준다. (도 5d) 항-DCIR-p24 또는 대조군 IgG4-p24 (25nM) 융합 단백질을 사용하여 CD34+-유도된 LC를 표적화하였다. DC는 CD40L로 활성화시키고 순수 자가 CD8+ T 세포와 배양하였다. 2회 연속 자극 후, 상기 증식된 세포를 분류하고 24시간 동안 새로운 LC 및 HIV gag p24 단백질로 재자극하여 루미넥스에 의해 IFN-γ 분비를 평가하였다. 어떠한 단백질도 갖지 않는 세포를 대조군으로서 사용하였다. 값은 2회의 평균이다. 데이터는 2개의 독립적인 연구를 대표한다;
도 6a 내지 도 6c는 TLR7/8-시그널 전달이 mDC에 의한 DCIR-매개된 2차 CD8+ T 세포 반응을 증진시킴을 보여준다: (도 6a) HLA-A201+ 공여자 기원의 혈액-유도된 mDC는 12nM, 2nM 또는 200pM의 항-DCIR.doc-coh.FluMP 복합체 mAb로 표적화하고, TLR3 TLR4 또는 TLR7/8-효능제(Poly I:C, LPS 또는 CL075)로 활성화시키고, 10일 동안 자가 CD8+ T 세포와 공동-배양하였다. 그래프는 항-DCIR.doc-coh.FluMP 복합체 mAb의 각각의 양에 대한 특이적 HLA-A201-FluMP (58-66) 사량체 및 시험된 각각의 DC-활성화제와 함께 측정된 FluMP-특이적 CD8+ T 세포의 백분율을 보여준다. 활성화되지 않은 DC를 대조군으로 사용하였다(각각, 활성화되지 않음-(--), TLR7/8-(◆) TLR3- (*), TLR4-(o), 효능제; CL075, Poly I:C 및 LPS). 데이터는 4개의 상이한 공여자를 사용한 4개의 독립적인 실험을 대표한다. 상기 그래프는 평균 ± s.d, N=3을 보여준다; (도 6b)는 HLA-A201+ 공여자 기원의 혈액-유도된 mDC가 8nM의 항-DCIR.doc-coh.FluMP 또는 IgG4.doc-coh.FluMP 복합체 mAb로 표적화되고, TLR7/8-, TLR3-, TLR4-효능제(각각 CL075, Poly I:C 및 LPS)로 활성화되고 10일 동안 자가 CD8+ T 세포와 함께 공동배양됨을 보여준다. 그래프는 특이적 HLA-A201-FluMP (58-66) 사량체를 사용한 측정시 FluMP-특이적 CD8+ T 세포의 백분율을 보여준다. 그래프에 나타낸 조건은: 활성화되지 않음; CL075 1㎍/ml; Poly I:C 10μg/ml; LPS 50ng/ml이다. 상기 그래프는 평균 ± s.d, N=3을 보여준다. (도 6c) 도 6b에서와 동일한 연구. 그래프는 특이적 HLA-A201-FluMP (58-66) 사량체를 사용한 측정시 FluMP-특이적 CD8+ T 세포의 평균 백분율을 나타낸다. 그래프에 나타낸 조건은: 활성화되지 않음; CL075 - 0.2㎍/ml 및 2μg/ml; Poly I:C - 5μg/ml 및 25μg/ml; LPS - 10ng/ml 및 100ng/ml이다;
도 7a 내지 도 7g는 TLR7/8-시그널 전달이 mDC에 의한 DCIR-매개된 원발성 CD8+ T 세포 반응을 증진시킴을 보여준다: (도 7a) HLA-A201+ 공여자 기원의 IFNα-DC는 17nM의 항-DCIR-MART-1 또는 대조군 IgG4-MART-1 융합 단백질로 표적화하고, CD40L(100ng/ml), CL075(1μg/ml), Poly I:C(5μg/ml) 또는 LPS(50ng/ml)로 활성화시키고 10일 동안 자가 순수 CD8+ T 세포와 공동-배양한다. MART-1-특이적 CD8+ T 세포의 증식은 특이적 HLA-A201-MART-1 (26-35) 사량체를 사용하여 측정하였다. 데이터는 2개의 상이한 공여자를 사용한 2개의 독립적인 실험을 대표한다. (도 7b) HLA-A201+ 공여자 기원의 혈액-유도된 mDC는 30nM의 항-DCIR-MART-1 융합 단백질 또는 항-DCIR-p24로 표적화하고, CD40L 또는 TLR7/8-효능제로 활성화시키고 10일 동안 자가 순수 CD8+ T 세포와 공동-배양하였다. 상부 패널은 항-DCIR-MART-1 융합 단백질과 함께 배양되고 CD40L 또는 TLR7/8-효능제로 활성화된 정제된 혈액 mDC에 의해 증식된 HLA-A201-MART-1 (26-35) 펩타이드 사량체-양성 CD8+ T 세포의 비율을 나타낸다. 하부 패널은 항-DCIR-p24 융합 단백질로 표적화되고 CD40L 또는 TLR7/8-효능제로 활성화된 정제된 혈액 mDC에 의해 증식된 HLA-A201-HIV gag p24 (151-159) 펩타이드 사량체-양성 CD8+ T 세포의 비율을 나타낸다. 데이터는 2개의 상이한 공여자를 사용한 2개의 독립적인 연구를 대표한다. (도 7c)는 세포내 이펙터 분자 그랜자임 B 및 퍼포린의 발현이 10nM의 항-DCIR-MART-1 또는 IgG4-MART-1 융합 단백질로 표적화되고 CD40L, CL075 또는 CD40L 및 CL075의 조합으로 활성화된 IFNα-DC에 의해 프라이밍된 CD8+ T 세포에 대한 유동 세포측정에 의해 평가함을 보여준다. 항원 특이적 MART-1 (26-35)-양성 세포 상의 발현은 상응하는 HLA-A201-사량체로 동시 염색시킴에 의해 분석하였다. 데이터는 2개의 독립적인 연구를 대표한다. (도 7d)는 항-DCIR-MART-1-표적화된 DC, 대조군 IgG4-MART-1 또는 항원 부재와 함께 증식 후, 특이적 HLA-A201-MART-1 (26-35) 사량체를 사용한 측정시 CD40L, TLR7/8-리간드 또는 CD40L 및 TLR7/8-리간드의 조합으로 활성화된 MART-1-특이적 CD8+ T 세포의 빈도수를 보여준다. 각각의 도트는 단일 연구를 나타낸다. (도 7e) 상부 패널: IFNα-DC는 17nM의 항-DCIR-MART-1 또는 대조군 IgG4-MART-1 융합 단백질로 표적화하고, CD40L(100ng/ml), CL075(1μg/ml), Poly I:C(10㎍/ml) 또는 LPS(50ng/ml)로 활성화하고 자가 순수 CD8+ T 세포와 공동-배양하였다. 10일 후, 세포는 MART-1 단백질로부터 유도된 15량체 중첩 펩타이드가 로딩된 새로운 DC로 재자극시켰다. 플롯은 모넨신의 존재하에 5시간 자극 후 CD8+ T 세포에 의한 세포질내 IFN-γ의 수준을 보여준다. 하부 패널: 항-DCIR-p24 또는 대조군 IgG4-p24 융합 단백질을 모델 항원으로서 사용하였다. (도 7f) IFNα-DC는 113nM의 항-DCIR-MART-1 융합 단백질로 표적화하고 CD40L(100ng/ml) 또는 CL075(1㎍/ml)로 활성화시키고 자가 순수 CD8+ T 세포와 함께 공동-배양하였다. 10일 후, 세포는 MART-1 단백질로부터 유도된 15량체 중첩 펩타이드가 로딩된 새로운 DC로 재자극하였다. IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ, TNF-α 및 IL-12p40의 수준은 24시간 후 배양 상청액 중에서 루미넥스로 측정하였다. 상기 그래프는 평균 ± s.d, N=3을 나타낸다. (도 7g) IFNα-DC는 10nM의 항-DCIR-MART-1 융합 단백질로 표적화하고, CD40L(100ng/ml) 또는 CL075(1μg/ml), 또는 CD40L 및 CL075의 조합으로 활성화하고 자가 순수 CD8+ T 세포와 공동-배양하였다. 10일 후, 세포는 MART-1 단백질로부터 유도된 15량체 중첩 펩타이드가 로딩된 새로운 DC 또는 로딩되지 않은 DC로 재자극시켰다. 플롯은 모넨신의 존재하에 5시간 자극 후 CD8+ T 세포에 의한 세포질내 IFN-γ 및 TNF-α의 수준을 보여준다;
도 8a 내지 도 8c는 항-DCIR 항체가 사람 DC에 억제 시그널을 전달하지 못함을 보여준다: (도 8a 및 도 8b) CD40L의 존재 또는 부재하에 DCIR-연결된 또는 대조군-CD1a+ LC의 표면 상에 CD86의 발현을 보여주는 도해적 유동 세포측정 데이터. (도 8c) IL-6에 대한 루미넥스 분석은 24시간 동안 CD40L 또는 TLR7/8-효능제로 활성화된 DCIR 또는 대조군-연결된 피부 DC 서브세트 기원의 상청액에 대해 수행하였다. 2개의 독립적인 연구 중 하나를 나타낸다;
도 9a 내지 도 9d는 DCIR 연결이 CD8+ T 세포 프라이밍을 억제하지 못함을 보여준다: (도 9a) DCIR-연결된 DC는 CD40 활성화의 존재 또는 부재하에 [3H]-티미딘의 혼입에 의한 측정시 대조군 DC와 비교하여 유사한 수준의 동종 CD8+ T 세포 증식을 유도한다. 상기 그래프는 평균 ± s.d, N=3을 보여준다. (도 9b) DCIR-연결된 DC(청색 라인) 또는 대조군 DC(적색 라인)에 의해 프라이밍된 동종 CD8+ T 세포 상의 PD-1, CTLA-4 또는 CD28의 발현에 대한 유동 세포측정 분석. (도 9c) 그래프는 동종 DCIR-연결된 DC 또는 대조군 DC에 의해 프라이밍된 활성화된 CD8+ T 세포에 의한 사이토킨인 IFN-γ, IL-2, TNF-α 및 IL-10의 분비 수준을 나타낸다. 사이토킨은 항-CD3/CD28 마이크로비드 자극에 대한 응답으로 측정하고 24시간 후 루미넥스로 분석하였다. (도 9d) DCIR-연결된- 또는 대조군-MART-1 펩타이드-로딩된 LC에 의해 프라이밍된 MART-1-특이적 CD8+ T 세포에 대한 유동 세포측정(우측 패널)에 의한 평가시 이펙터 분자: 그랜자임 A, 그랜자임 B 및 퍼포린의 발현. 데이터는 3개의 독립적인 연구를 대표한다.
본 발명의 다양한 실시형태의 수행 및 사용이 하기에 상세하게 논의되지만 이것은 본 발명이 광범위한 특정 문단에서 구현될 수 있는 많은 적용가능하는 발명의 개념을 제공하는 것으로 이해되어야만 한다. 본원에서 논의된 특정 실시형태는 발명을 수행하고 사용하기 위한 특정 방식을 단지 설명하고자 하는 것이지 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어가 하기에 정의된다. 본원에서 정의된 용어는 본 발명과 관련된 분야의 통상적인 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 부정관사("a", "an") 및 정관사("the")와 같은 용어는 단지 단수의 실체를 언급하고자 하는 것이 아니고 특정 예가 설명을 위해 사용될 수 있는 일반적인 부류를 포함한다. 본원의 용어는 본 발명의 특정 실시형태를 기재하기 위해 사용되지만 이들의 사용은 청구항에 제시된 것을 제외하고는 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
본 발명은 또한 항체(또는 "Ab") 또는 이의 단편의 변형 및 기타 변형 어구, 예를 들어, 항-CD40 융합 단백질(항체는 용어 "면역글로불린"과 상호교환적으로 사용된다)를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 또는 이의 단편"은 전체 항체 또는 항체의 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fc, 및 단일쇄 Fv 단편 (ScFv) 또는 예를 들어, CD40에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 생물학적으로 효과적인 단편을 포함한다. 사람 기원의 항체 또는 사람화된 항체는 비-사람 항체와 비교하여 사람에서 저하된 면역원성을 갖거나 면역원성이 부재하고 보다 낮은 수의 에피토프 또는 면역원성이 아닌 에피토프를 갖는다. 항체 및 이들의 단편은 일반적으로 사람에서 감소된 수준의 항원성을 갖거나 항원성이 없는 것으로 선택될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "Ag" 또는 "항원"은 면역글로불린 분자의 항원 결합 영역에 결합하거나 면역 반응, 예를 들어, 주요 조직적합성 항원(MHC) 세포 단백질 상에 항원을 제시함에 의한 T 세포-매개 면역 반응을 유발할 수 있는 물질을 언급한다. 본원에 사용된 바와 같이, "항원"은 펩타이드, 소분자, 탄수화물, 지질, 핵산 또는 이들의 조합일 수 있는 항원성 결정인자, 합텐 및 면역원을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 숙련된 면역학자는 T 세포로의 제시를 위해 프로세싱되는 항원을 논하는 경우, 용어 "항원"이 MHC에 의해 T 세포 수용체로 제시되는 T 세포 에피토프인 항원 부분(예를 들어, 펩타이드 단편)을 언급하는 것임을 인지할 것이다. "항원"에 대해, 즉 항체의 가변 도메인(경쇄 및 중쇄)의 상보성 결정 영역에 결합하는 항원 부분에 대해 특이적인 항체 형태로 B 세포 매개 면역 반응과 관련하여 사용되는 경우, 상기 결합된 부분은 선형 또는 3차원 에피토프일 수 있다. 본 발명과 관련하여, 상기 용어 항원은 2개의 개념으로 사용되고, 즉, 상기 항체는 단백질 항원(CD40)에 대해 특이적이고, 또한 MHC에 의한 T 세포로의 제시를 위해 하나 이상의 펩타이드 에피토프를 갖는다. 특정 경우에, 본 발명의 백신 또는 융합 단백질에 의해 전달되는 항원은 내재화되고 제시 전에 항원 제시 세포에 의해, 예를 들어, 항체 또는 융합 단백질의 하나 이상의 부분의 절단에 의해 프로세싱된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "접합체"는 하나 이상의 표적화 도메인을 갖는 단백질, 예를 들어, 항체 및 하나 이상의 항원, 예를 들어, 소형 펩타이드 또는 단백질을 언급한다. 이들 접합체는, 융합 단백질과 같이, 재조합 방법에 의해 제조되는 것들, 화학적 방법, 예를 들어, 설프하이드릴 그룹에 결합시키는 화학적 결합에 의해 제조되는 것들, 및 하나 이상의 항체 표적화 도메인 및 하나 이상의 항원이 링커(들)를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 표적화 제제에 연결되도록 하는 임의의 다른 방법에 의해 제조되는 것들을 포함한다. 링커의 예는 코헤신-독케린(coh-doc) 쌍, 비오틴-아비딘 쌍, Zn에 의해 결합된 히스티딘 태그 등이다.
본 발명과 함께 사용하기 위한 바이러스 항원의 예는 예를 들어, HIV, HCV, CMV, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 피코르나바이러스 등을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 레트로바이러스 항원의 비제한적인 예는 예를 들어, gag, pol, 및 env 유전자의 유전자 생성물, Nef 단백질, 역전사효소, 및 기타 HIV 성분과 같은 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 항원 기원의 레트로바이러스 항원; 간염 바이러스 항원, 예를 들어, B형 간염 바이러스의 S, M, 및 L 단백질, B형 간염 바이러스의 전구-S 항원, 및 기타 간염 바이러스, 예를 들어, A형, B형 및 C형 바이러스 성분, 예를 들어, C형 간염 바이러스 RNA; 인플루엔자 바이러스 항원, 예를 들어, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 및 다른 인플루엔자 바이러스 성분; 홍역 바이러스 항원, 예를 들어, 홍역 바이러스 융합 단백질 및 기타 홍역 바이러스 성분; 풍진 바이러스 항원, 예를 들어, 단백질 E1 및 E2 및 기타 풍진 바이러스 성분; 로타바이러스 항원, 예를 들어, VP7sc 및 기타 로타바이러스 성분; 사이토메갈로바이러스 항원, 예를 들어, 외피 당단백질 B 및 기타 사이토메갈로바이러스 항원 성분; 호흡기 세포융합 바이러스 항원, 예를 들어, RSV 융합 단백질, M2 단백질 및 기타 호흡기 세포융합 바이러스 항원 성분; 헤르페스 심플렉스 바이러스 항원, 예를 들어, 즉발성 초기 단백질(immediate early proteins), 당단백질 D, 및 기타 헤르페스 심플렉스 바이러스 항원 성분; 바리셀라 조스터 바이러스 항원, 예를 들어, gpI, gpII, 및 기타 바리셀라 조스터 바이러스 항원 성분; 일본 뇌염 바이러스 항원, 예를 들어, 단백질 E, M-E, M-E-NS1, NS1, NS1-NS2A, 80% E, 및 기타 일본 뇌염 바이러스 항원 성분; 광견병 바이러스 항원, 예를 들어, 광견병 당단백질, 광견병 핵단백질 및 기타 광견병 바이러스 항원 성분이다. 바이러스 항원에 대한 추가의 예는 문헌[Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991)]을 참조한다. 하나 이상의 바이러스 항원은 아데노바이러스, 레트로바이러스, 피코르나바이러스, 헤르페스바이러스, 로타바이러스, 한타바이러스, 코로나바이러스, 토가바이러스, 플라비르바이러스, 라브도바이러스, 파라믹소바이러스, 오르토믹소바이러스, 분야바이러스, 아레나바이러스, 레오바이러스, 유두종 바이러스, 파르보바이러스, 폭스바이러스, 헤파드나바이러스, 또는 스폰지형 바이러스 기원의 펩타이드일 수 있다. 특정 비제한적인 예에서, 하나 이상의 바이러스 항원은 HIV, CMV, A형, B형 및 C형 간염 바이러스, 인플루엔자, 홍역, 폴리오, 천연두, 풍진; 호흡기 세포융합, 헤르페스 심플렉스, 바리셀라 조스터, 엡스타인-바, 일본 뇌염, 광견병, 플루 바이러스, 및/또는 감기 바이러스 중 하나 이상으로부터 수득된 펩타이드이다.
본원에 기재된 DCIR과 함께 사용하기 위한 세균 항원은 세균 항원, 예를 들어, 백일해 독소, 필라멘트형 헤마글루티닌, 퍼탁틴, FIM2, FIM3, 아데닐레이트 사이클라제 및 기타 백일해 세균 항원 성분; 디프테리아 세균 항원, 예를 들어, 디프테리아 독소 또는 톡소이드 및 기타 디프테리아 세균 항원 성분; 파상풍 세균 항원, 예를 들어, 파상풍 독소 또는 톡소이드 및 기타 파상풍 세균 항원 성분; 스트렙토코커스 세균 항원, 예를 들어, M 단백질 및 기타 스트렙토코커스 세균 항원 성분; 그람-음성 바실리 세균 항원, 예를 들어, 지질 다당류 및 기타 그람-음성 세균 항원 성분, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 세균 항원, 예를 들어, 마이콜산, 열 쇼크 단백질 65(HSP65), 30 kDa 주요 분비된 단백질, 항원 85A 및 기타 마이코박테리아성 항원 성분; 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 세균 항원 성분; 뉴모코커스 세균 항원, 예를 들어, 뉴모라이신, 뉴모코커스 캡슐 다당류 및 기타 뉴모코커스 세균 항원 성분; 해모필러스 인플루엔자 세균 항원, 예를 들어, 캡슐 다당류 및 기타 해모필러스 인플루엔자 세균 항원 성분; 탄저병 세균 항원, 예를 들어, 탄저병 보호 항원 및 기타 탄저병 세균 항원 성분; 리케치아 세균 항원, 예를 들어, rompA 및 기타 리케치아 세균 항원 성분을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 또한, 본원에 기재된 세균 항원과 함께 임의의 다른 세균 항원, 마이코박테리아 항원, 마이코플라스마 항원, 리케치아 항원, 또는 클라미디아 항원이 포함된다. 부분 또는 전체 병원체는 또한 해모필러스 인플루엔자; 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum); 나이세리아 메닝기티디스(neisseria meningitidis); 스트렙토코커스 뉴모니아(streptococcus pneumoniae); 나이세리아 고노로에아(neisseria gonorrhoeae); 혈청형 살모넬라 타이피(salmonella typhi); 쉬겔라(shigella); 비브리오 콜레라(vibrio cholerae); 뎅기 열(Dengue Fever); 뇌염; 일본 뇌염; 라임 질환; 여시니아 페스티스; 웨스트 나일 바이러스; 황열; 툴라레미아(tularemia); 간염(바이러스성; 세균성); RSV(호흡기 세포융합 바이러스); HPIV 1 및 HPIV 3; 아데노바이러스; 천연두; 알레르기 및 암일 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용하기 위한 진균류 항원은 예를 들어, 캔디다 진균류 항원 성분; 히스토플라스마 진균류 항원, 예를 들어, 열 쇼크 단백질 60(HSP60) 및 기타 히스토플라스마 진균류 항원 성분; 크립토코커스 진균류 항원, 예를 들어, 캡슐 다당류 및 기타 크립토코커스 진균류 항원 성분; 콕시디오이데스 진균류 항원, 예를 들어, 소구체(spherule) 항원 및 기타 콕시디오이데스 진균류 항원 성분; 및 백선 진균류 항원, 예를 들어, 트리코피틴 및 기타 콕시디오이데스 진균류 항원 성분을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
원생동물 및 기타 기생충 항원의 예는 예를 들어, 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum) 항원, 예를 들어, 낭충 표면 항원, 포자소체 표면 항원, 외주포자소체(circumsporozoite) 항원, 생식모세포/생식세포(gametocyte/gamete) 표면 항원, 혈액-단계 항원 pf 155/RESA 및 기타 플라스모디아 항원 성분; 톡소플라스마 항원, 예를 들어, SAG-1, p30 및 기타 톡소플라스마 항원 성분; 주혈흡충 항원, 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 파라미오신, 및 기타 주혈흡충 항원 성분; 리슈마니아 메이저 및 기타 리슈마니아 항원, 예를 들어, gp63, 리포포스포글리칸 및 이의 연합 단백질 및 기타 리슈마니아 항원 성분; 및 트리파노소마 크루지 항원, 예를 들어, 75-77kDa 항원, 56kDa 항원 및 기타 트리파노소마 항원 성분을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
전달을 위한 세포 표면 상의 표적 항원은 종양 조직의 세포 표면, 세포질, 핵, 기관 등으로부터 유래될 종양 항원의 특징을 포함한다. 본 발명의 항체 부분에 대한 종양 표적의 예는 혈액학적 암, 예를 들어, 백혈병 및 림프종, 신경학적 종양, 예를 들어, 성상세포종 또는 교모세포종, 흑색종, 유방암, 폐암, 두경부암, 위장 종양, 예를 들어, 위암 또는 결장암, 간암, 췌장암, 비뇨생식기 종양, 예를 들어, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 질암, 고환암, 전립선 암 또는 음경암, 골 종양, 혈관 종양, 또는 입술암, 비인두암, 인두암 및 구강암, 식도암, 직장암, 담낭암, 담도암, 후두암, 폐 및 기관지암, 방광암, 신장암, 뇌암 및 신경계의 기타 암, 갑상선암, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종 및 백혈병을 제한없이 포함한다.
본 발명을 사용하여 항원 제시를 위해 단독으로 또는 면역 세포와 조합하여 전달될 수 있는 항원의 예는 종양 단백질, 예를 들어, 돌연변이된 발암 유전자; 종양 관련 바이러스 단백질; 및 종양 뮤신 및 당지질을 포함한다. 상기 항원은 상기된 바이러스 부류 기원의 항원인 종양 관련 바이러스 단백질일 수 있다. 특정 항원은 종양의 특징(하나의 서브세트는 통상적으로 종양 전구체 세포에 의해 발현되지 않는 단백질이다)일 수 있거나, 종양 전구체 세포에서 통상적으로 발현되지만 종양 돌연변이의 특징을 갖는 단백질일 수 있다. 기타 항원은 변형된 활성 또는 준세포 분포를 갖는 정상 단백질의 돌연변이체(들), 예를 들어, 종양 항원을 유도하는 유전자의 돌연변이체를 포함한다.
자가면역 질환, 알레르기, 및 이식 거부에 관여하는 항원들이 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기의 자가면역 질환 또는 장애 중 어느 하나 이상에 관여하는 항원이 본 발명에 사용될 수 있다: 당뇨병, 진성 당뇨병, 관절염(류마티스 관절염, 유년기 류마티스 관절염, 골 관절염, 건선 관절염을 포함함), 다발성 경화증, 중증 근무력증, 전신 홍반성 낭창, 자가면역 갑상선염, 피부염(아토피 피부염 및 습진성 피부염을 포함함), 건선, 쇼그렌 증후군(쇼그렌 증후군에 속발성인 건성 각결막염을 포함함), 원형탈모증, 곤충 물림 반응으로 인한 알레르기 반응, 크론 질환, 아프타 궤양(aphthous ulcer), 홍채염, 결막염, 각결막염, 궤양성 대장염, 천식, 알레르기성 천식, 피부 홍반성 낭창, 경피증, 질염, 직장항문염, 약진, 나병 역전 반응, 나성 결절 홍반, 자가면역 포도막염, 알레르기성 뇌막염, 급성 괴사 출혈 뇌병변, 특발성 양측 진행성 감각신경성 난청, 재생불량 빈혈, 순수 적혈구 세포 빈혈, 특발성 혈소판감소증, 다발연골염, 베게너 육아종증, 만성 활성 간염, 스티븐스-존슨 증후군, 특발성 스푸루(idiopathic sprue), 편평 태선, 크론 질환, 그레이브스 안병증(Graves ophthalmopathy), 유육종증, 원발성 담즙성 간경변증, 후부 포도막염, 및 간질성 폐 섬유증. 자가면역 질환에 관여하는 항원의 예는 글루탐산 데카복실라제 65(GAD 65), 고유 DNA, 마이엘린 염기성 단백질, 마이엘린 단백질지질 단백질, 아세틸콜린 수용체 성분, 티로글로불린, 및 기타 갑상선 자극 호르몬(TSH) 수용체를 포함한다.
알레르기에 관여하는 항원의 예는 일본 삼나무 꽃가루(Japanese cedar pollen) 항원, 두드러기쑥 꽃가루 항원, 호밀 잔디 꽃가루 항원과 같은 꽃가루 항원, 동물 유도된 항원, 예를 들어, 먼지 진드기 항원, 고양이 항원, 조직적합성 항원, 및 페니실린 및 기타 치료학적 약물을 포함한다. 이식 거부에 관여하는 항원들의 예는 심장, 폐, 간, 췌장, 신장 및 신경 이식 성분과 같은, 이식 수용자에게 이식될 이식의 항원성 성분을 포함한다. 상기 항원은 자가면역 질환을 치료하는데 유용한 변형된 펩타이드 리간드일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원성 펩타이드"는 B 세포 또는 T 세포에 의해 특이적으로 인식되는 폴리펩타이드 항원의 부분을 언급한다. B 세포는 항체 생성을 통해 외래 항원성 결정인자에 반응하는 반면, T 림프구는 세포 매개 면역원성이다. 따라서, 항원성 펩타이드는 항체, 또는 MHC와 관련하여 T 세포 수용체에 의해 인식되는 항원의 부분이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "에피토프"는 면역글로불린에 특이적으로 결합할 수 있거나 주요 조직적합성 복합체(MHC) 단백질(예를 들어, 부류 I 또는 부류 II)에 의해 T-세포 수용체에 제시될 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 언급한다. 에피토프성 결정인자는 일반적으로, 예를 들어, 그루브, 펩타이드 측쇄 그룹 및 T 세포 수용체의 특정 하전 특성으로 인해, T 세포 수용체 방향으로 특정 아미노산 측쇄 그룹을 제시하고 그루브내 다른 특정 잔기를 갖는 MHC 분자의 그루브내에 조립되는 5개 내지 30개 아미노산 길이의 짧은 펩타이드이다. 일반적으로, 해리 상수가 1mM, 100nM, 또는 10nM인 경우, 항체가 항원에 특이적으로 결합한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 2개의 상이한 의미로 사용된다. 백신과 관련하여 용어 "벡터"를 사용하는 경우, 벡터는 상기 백신의 항원성 부분을 지시하거나 전달하기 위해 사용되는 비-항원성 부분을 기재하기 위해 사용된다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 면역 반응을 유발하는 항원에 결합할 수 있거나 이와 함께 융합 단백질을 형성할 수 있다. 세포 백신에 대해, 항원의 전달 및/또는 제시를 위한 벡터는 항원 제시 세포이고, 항원이 로딩된 세포에 의해 전달된다. 특정 경우에, 상기 세포 벡터 자체는 또한 항원(들)을 프로세싱하거나 T 세포에 제시하여 항원-특이적 면역 반응을 활성화시킬 수 있다. 핵산과 관련하여 사용되는 경우, "벡터"는 숙주 세포 내에서 목적하는 하나 이상의 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 전달하고, 바람직하게는 발현할 수 있는 작제물을 언급한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 나출(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 양이온성 응축제와 관련된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캅셀화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 생산자 세포와 같은 특정 진핵 세포를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 단백질을 언급할 경우의 용어 "안정한" 및 "불안정한"은 이의 3차원 구조 및/또는 활성을 유지하거나(안정한) 즉각적으로 또는 시간 경과에 따라 이의 3차원 구조 및/또는 활성을 상실하는(불안정한) 펩타이드 또는 단백질을 기재하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "불용성"은 세포내에서 제조되는 경우, 변성 조건 또는 제제(예를 들어, 각각 열 또는 화학 변성제)의 사용이 부재인 용액내에서 불용성인 단백질(예를 들어, 진핵 또는 원핵 세포 또는 시험관내에서 발현되는 재조합 단백질)을 언급한다. 본원에 교시된 상기 항체 또는 이의 단편 및 링커는 펩타이드와의 항체 융합 단백질을 불용성 및/또는 불안정성으로부터 안정하고/하거나 가용성인 단백질로 전환시키는 것으로 밝혀졌다. 안정성 대 불안정성의 다른 예는 안정한 형태를 갖는 단백질의 도메인이 동일한 용액내에서의 측정시 단백질의 불안정한 도메인보다 높은 용융 온도(Tm)를 갖는 경우이다. 도메인이 Tm의 차이가 동일한 용액내에서의 측정시 적어도 약 2℃, 보다 바람직하게는 약 4℃, 여전히 보다 바람직하게는 약 7℃, 더 바람직하게는 약 10℃, 보다 더 바람직하게는 약 15℃, 더 바람직하게는 약 20℃, 더욱 바람직하게는 약 25℃, 및 가장 바람직하게는 약 30℃인 경우 다른 도메인과 비교하여 안정하다.
본원에 사용된 바와 같은 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 단일가닥 또는 이중가닥 형태(공지되어 있는 천연 뉴클레오타이드 유사체를 포함함)의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드의 가닥을 언급한다. 이중가닥 핵산 서열은 상보적 서열을 포함할 것이다. 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 링커와 함께 융합 단백질을 형성하는 면역글로불린의 가변 및/또는 불변 영역 도메인을 암호화할 수 있다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 다중 클로닝 부위(MCS)는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 카복시 말단에 위치하도록 가공되어 발현을 위해, 펩타이드가 링커 사이의 프레임내로 삽입될 수 있도록 한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 게놈, cDNA 또는 합성 기원 또는 이의 일부 조합의 폴리뉴클레오타이드를 언급한다. 이의 기원에 따라, 상기 "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 (1) 상기 "분리된 폴리뉴클레오타이드"가 천연에서 발견되는 모든 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부과 연합되어 있지 않거나, (2) 천연에서는 연결되어 있지 않은 폴리뉴클레오타이드와 작동적으로 연결되거나, (3) 보다 큰 서열의 일부로서 천연에 존재하지 않는다. 당업자는 디자인하고 사용하기 위해, 벡터가 당업계에 공지된 기술을 사용하여, 예를 들어, 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology, 2007 by John Wiley and Sons, 관련 부분이 본원에 참조로서 인용됨]에 교시된 기술을 사용하여 핵산 수준에서 유전자 조작될 수 있음을 인지할 것이다. 간략하게, 상기 암호화 핵산 서열은 폴리머라제 연쇄 반응, 발현 벡터일 수 있는 벡터내에서 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리머라제 연쇄 반응 단편의 효소적 삽입을 사용하여 삽입될 수 있다. 항체 경쇄, 중쇄 또는 이들 둘 다의 카복시 말단에서 삽입체의 삽입을 촉진하기 위해 다중 클로닝 부위(MCS)가 항체 서열과 함께 서열내 유전자 조작될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩타이드"는 아미노산의 중합체를 언급하고, 특정 길이의 생성물을 언급하지 않으므로; 펩타이드, 올리고펩타이드 및 단백질은 폴리펩타이드의 정의에 포함된다. 상기 용어는 또한 발현 후 변형된 폴리펩타이드(예를 들어, 당화, 아세틸화, 인산화 등)를 언급하지 않거나 배제한다. 상기 정의내에 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함하는)를 함유하는 폴리펩타이드, 치환된 연결체를 갖는 폴리펩타이드 및 천연 및 비천연적으로 존재하는 당업계에 공지된 기타 변형체가 포함된다. 상기 용어 "도메인" 또는 "폴리펩타이드 도메인"은 이의 천연 형태에서 단일의 구형 영역으로 폴딩하고 명백한 결합 또는 기능성 성질을 나타낼 수 있는 폴리펩타이드의 서열을 언급한다.
변성된 핵산 서열"로부터 유도된" 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 서열내 암호화된 폴리펩타이드의 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 상기 서열내 암호화된 폴리펩타이드와 함께 면역학적으로 동정가능한 이의 부분을 언급하고, 이때, 상기 부분은 적어도 3 내지 5개 아미노산, 바람직하게는 적어도 4개 내지 7개의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 8 내지 10개의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 11개 내지 15개의 아미노산으로 이루어진다. 상기 용어는 또한 지정된 핵산 서열로부터 발현되는 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "약제학적으로 허용되는 담체"는 본 발명의 면역글로불린(Ig) 융합 단백질과 조합되는 경우 상기 Ig가 생물학적 활성을 보유하도록 하고 일반적으로 피검체의 면역계에 비반응성인 임의의 물질을 언급한다. 이의 예는 표준 약제학적 담체, 예를 들어, 인산 완충 식염 용액, 물, 에멀젼, 예를 들어, 오일/물 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 특정 희석제는 예를 들어, 에어로졸 또는 비경구 투여용으로 본 발명과 함께 사용될 수 있고, 인산 완충 식염수 또는 정상(0.85%) 식염수일 수 있다.
수지상 세포(DC)는 순응 면역 반응1 ,2의 정도 및 질을 개시하고 제어하는데 주요 역할을 한다. DC는 상기 시그널을 해독하고 통합하고 상기 정보를 순응 면역계의 세포에 전달한다. DC는 공유된 기능뿐만 아니라 특수화된 기능을 소유하는 서브세트로 구성된다3 -5. 미생물은 다양한 패턴 인식 수용체(PRR), 예를 들어, 톨형 수용체(TLR)6, 세포 표면 C형 렉틴 수용체(CLR)1, 및 세포질내 NOD형 수용체(NLR)8 ,9를 통해 DC를 직접적으로 활성화시킬 수 있다. 사람에서, 특정 CLR은 BDCA210를 발현하는 형질세포성 DC(pDC), 랑게린11을 발현하는 랑게르한스 세포(LC) 및 DC-SIGN12을 발현하는 간질 DC와 DC 서브세트를 구별한다. 다른 C형 렉틴은 내피 세포 및 호중구를 포함하는 다른 세포 유형에서 발현된다. CLR, 예를 들어,DC-SIGN7은 다수의 미생물에 대한 앵커로서 작용할 수 있고 이들의 내재화를 가능하게 한다. 추가로, CLR은 또한 DC와, 내피 세포, T 세포 및 호중구를 포함하는 기타 세포 유형간의 접착 분자로서 작용한다12 ,13. 미지의 기능의 렉틴, DEC-205/CD205는 리간드를 세포내이입하는 능력에 대해 마우스에서 광범위하게 연구되었다. DC 활성화의 부재하에 DEC-205를 통한 항원의 마우스 DC로의 표적화는 내성 유도를 유발한다14 ,15. 대조적으로, DC 활성화(CD40 및 TLR3 효능제)의 존재하에 표적화 항원은 다양한 항원에 대한 면역성을 생성시킨다14,16. DEC-205를 통해 전달된 항원에 대한 CD4+ T 세포 반응 또는 1차 CD8+ T 세포 반응의 유도를 입증하는 대부분의 연구는 형질전환된 마우스 OT-I/II 시스템으로 제한되었다.
항원은 LOX-1(HSP7017에 결합하는 II형 C형 렉틴 수용체), 만노스 수용체18, 덱틴-119, 덱틴-220, CD4021, 랑게린22, Gb3(쉬가 독소23에 대한 수용체), DEC-20524 및 최근에 마우스에서 순수 CD8+ T 세포를 프라이밍하는 것으로 기재된 CLEC9A를 포함하는 기타 표분자를 통해 마우스 DC에 표적화되었다25 ,26,27. 상이한 뮤린 DC 서브세트 상에 발현된 수용체를 통한 항원의 표적화는 상이한 기능적 결과를 초래한다28 ,29. 항-DC-SIGN과 KLH30의 사람 DC 접합체, 항-DEC-205와 HIV gag31의 사람 DC 접합체 및 항-만노스 수용체와 사람 융모성 성선자극 호르몬(hCGb)32 의 사람 DC 접합체에 대한 표적화 항원은 각각 혈액 CD4+ 및 CD8+ T 세포로, 또는 T 세포 클론으로 제시되거나/교차제시되는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 혈액 기원의 DC를 포함하는 상이한 유형의 DC 상에서 광범위하게 발현되는 렉틴 DCIR33에 집중하였다. 실제로, DCIR은 처음에 혈액 단핵구, B 세포, 호중구, 과립구 및 피부 DC(LC는 아닌) 상에서 발현되는 것으로 기재되었고 또한 최근에는 pDC34 상에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 기능적으로 이것은 HIV에 대해 수용체로서 작용할 수 있다.35 사람 게놈은 단지 단일 DCIR 유전자를 암호화하지만 마우스 게놈은 4개의 DCIR-유사 유전자 DCIR2, DCIR3, DCIR4 및 DCAR1을 제시한다. DCIR 및 DCAR은 이들의 세포외 도메인에서 상당한 서열 상동성을 공유하지만, DCAR은 면역수용체 계열 타이로신계 활성화 모티프(ITAM)-함유 FcRγ 쇄와 연합하는 반면, DCIR은 SHP-1 및 SHP-2 포스파타제를 조정하는 면역수용체 타이로신계 억제 모티프(ITIM)를 함유한다36. 마우스 DCAR에 대한 사람 동족체는 지금까지 동정되지 않았다.
본 발명은, 사람 CD8+ T 세포의 교차제시 및 교차프라이밍을 가능하게 하는, 항-DCIR 접합체 mAb에 의한 항원의 광범위한 DC 서브세트로의 항원의 성공적인 전달을 보고한다. DCIR-특이적 항체의 예는 (이전에 미국 특허 공개번호 제20080241170호 및 제20080206262호에 기재된 수탁번호 PTA 10246 및 PTA 10247), 서열을 포함하는 관련 부분(본원에 참조로서 인용됨)을 포함한다.
DC 서브세트: CD34+-유도된 DC는 전구체 세포를 이동시키기 위해 G-CSF가 투여된 건강한 지원자의 혈액으로부터 분리된 CD34+-HPC로부터 시험관내 생성시켰다. HPC는 5% 자가 혈청, 50μM의 β-머캅토에탄올, 1%의 L-글루타민, 1%의 페니실린/스트렙토마이신, GM-CSF(50ng/ml; Berlex), Flt3-L(100ng/ml; R&D), 및 TNF-α(10ng/ml; R&D)가 보충된 이슬 배지(Yssel's medium)(Irvine Scientific, CA)에서 9일 동안 0.5 x 106 세포/ml로 배양하였다. 배지 및 사이토킨은 배양 5일째에 새로이 교체하였다. 이어서, DC의 서브세트인 CD1a+CD14--LC 및 CD1a-CD14+ DC를 분류하여 순도가 95 내지 99%가 되게 하였다. 단핵구-유도된 DC는 10% 태아 소 혈청(FBS), GM-CSF(100ng/ml; Immunex Corp.) 및 IL-4(25ng/ml R&D)가 보충된 RPMI에서 단핵구를 5일 동안 배양하거나, GM-CSF(100ng/ml; Immunex Corp.) 및 IFN-α2b(500U/ml; Intron A; Schering-Plough)가 보충된 RPMI에서 3일 동안 단핵구를 배양함에 의해 생성시켰다. mDC 및 pDC는 각각 Lin-HLA-DR+CD11c+CD123- 및 Lin-HLA-DR+CD11c-CD123+으로서 새로운 PBMC로부터 분류하였다.
상피 LC, 진피 CD1a+ DC, 및 진피 CD14+ DC는 정상 사람 피부 표본으로부터 정제하였다. 표본은 18시간 동안 4℃에 이어서 및 2시간 동안 37℃에서 세균 프로테아제 디스파제 2형 중에서 항온처리하였다. 이어서, 상피 및 진피 시트를 분리하고 작은 조각으로 절단하고(약 1 내지 10mm) 10% FBS가 보충된 RPMI 1640에 위치시켰다. 2일 후에, 배지로 이동한 상기 세포를 수거하고 1.077 g/dl의 밀도로 피콜-디아트리조에이트를 사용하여 집적시켰다. DC는 항-CD1a FITC(DAKO) 및 항-CD14 APC mAb(Invitrogen)로 염색시킨 후 세포 분류에 의해 정제하였다. 모든 프로토콜은 기관의 검토 부서에 의해 검토되어 승인되었다.
DC/T 세포 공동배양물에서 항원-특이적 T 세포의 증식: FluMP- 또는 MART-1-유도된 항원을 제시하는데 있어서 DC의 기능을 평가하기 위해, 본 발명자들은 HLA-A201+ 공여자 기원의 DC를 사용하였다. 세포는 지적된 농도에서 접합체 mAb와 함께 배양하였다. 동질유전자적 정제된 CD8+ T 세포는 1:20의 DC/T 비율로 항원-펄스된 DC와 함께 배양하였다. CD40L(100ng/ml; R&D)는 DC에 의한 교차제시를 증진시키기 위해 24시간 후 배양물에 첨가하였다49. 공동배양물은 8 내지 10일 동안 37℃에서 항온처리하였다. IL-2는 3일째에 10 U/ml로 첨가하였다. 지적된 경우, DC는 TLR 효능제: LPS(10, 50 또는 200ng/ml; Invivogen), Poly I:C(5, 10 또는 25μg/ml) 또는 티아졸로퀴놀린 화합물 CL075(0.2, 1 또는 2μg/ml; Invivogen)로 활성화시켰다. FluMP-, MART-1-, 및 HIV gag p24-특이적 CD8+ T 세포의 증식은 각각 HLA-A201-FluMP (58-66) 펩타이드(GILGFVFTL)(서열번호 1), HLA-A201-MART-1 (26-35) 펩타이드 (ELAGIGILTV) (서열번호 2) 및 HLA-A201-p24 (151-155) 펩타이드 (TLNAWVKVV) (서열번호 3) - 사량체를 사용하여 평가하였다(Beckman Coulter). 다중 CD8+ T 세포-특이적 에피토프로의 교차프라이밍의 평가를 위해, CD34+-유도된 DC를 항-DCIR-p24 또는 IgG4-p24 융합 mAb와 함께 배양하고, 1:30의 DC/T 비율로 CFSE-표지된 CD8+ T 세포와 함께 배양하였다. 항원-펄스된 DC는 CD40L (100ng/ml)로 활성화시켰다. 2회 연속 자극 후, CFSElow 증식 세포를 분류하고 24시간 동안 HIV gag p24 단백질(2μg/ml)이 로딩된 새로운 DC로 재자극시켰다. 상기 분비된 IFN-γ는 루미넥스에 의해 배양 상청액에서 측정하였다. 대안으로, mDC 또는 IFN-α DC는 항-DCIR-MART-1 또는 IgG4-MART-1 융합 단백질로 표적화하고 지적된 바와 같이 활성화시키고 10일 동안 순수 CD8+ T 세포와 함께 배양하였다. 지적된 경우 CD107a(BD Biosciences)의 이동 뿐만 아니라 세포내 IFN-γ의 생성은 단백질 수송 억제제 모넨신(GolgiStop; BD Biosciences)의 존재하에 MART-1 단백질(2.5μM)로부터 유도된 15개 아미노산 중첩 펩타이드가 로딩된 새로운 자가 DC로 재자극시킨지 5시간 후에 측정하였다. IFN-γ, TNF-α, IL-12p40, IL-4, IL-5 및 IL-13의 분비는 루미넥스에 의해 40시간 후 상청액에서 측정하였다.
본 발명의 추가의 방법은 항-DCIR mAb의 생성 및 재조합 DCIR의 생산, 키메라 마우스/사람 IgG4 재조합 mAb의 클로닝 및 발현, APC에 대한 DCIR 발현 분석, DC 표현형 및 기능에 대한 DCIR-시그널 전달 효과, 및 융합 단백질 mAb의 클로닝 및 생산, DC 상에서의 펩타이드-MHC 복합체 검출, CD8+ T 세포의 정제 및 화학적으로 결합된 항-DCIR mAb에 의한 FluMP 단백질의 교차제시에 대해 하기에 제공된 세부 사항을 포함한다.
항-DCIR mAb의 생성 및 재조합 DCIR의 제조: 마우스 mAb는 종래 세포 융합 기술에 의해 생성시켰다. 간략하게, 6주령 BALB/c 마우스는 Ribi 보조제와 함께 20μg의 수용체 엑토도메인.hIgG Fc 융합 단백질을 사용하여 복강내 면역화시키고, 이어서 10일 및 15일 후에 20μg의 항원으로 부스팅하였다. 3개월 후에, 상기 마우스는 비장을 취득하기 3일 전에 다시 부스팅하였다. 대안으로, 30일 내지 40일의 기간 동안 3 내지 4일마다 Ribi 보조제 중의 1 내지 10μg의 항원을 풋패드에서 마우스에 주사하였다. 비장 또는 림프절 세포 기원의 B 세포는 종래 기술을 사용하여 SP2/O-Ag 14 세포51 와 융합시켰다. ELISA를 사용하여 AP33에 융합된 수용체 엑토도메인 또는 단독의 융합 파트너와 비교하여 수용체 엑토도메인 융합 단백질에 대해 하이브리도마 상청액을 스크리닝하였다. 이어서, 양성 웰은 전장 수용체 cDNA를 암호화하는 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 HEK293F 세포를 사용하는 유동 세포측정으로 스크리닝하였다. 선택된 하이브리도마는 단일 세포 클로닝된 것이고 CELLine 플라스크(Intergra)에 증식시켰다. 하이브리도마 상청액은 동일 용적의 1.5M 글라이신, 3M NaCl, 1x PBS, pH 7.8(결합 완충액)과 혼합하고 MabSelect 수지(eBiosciences)(800㎕/5ml 상청액)과 텀블링시켰다. 상기 수지를 세척하고 0.1M 글라이신, pH 2.7로 용출시켰다. 2M Tris로 중화시킨 후, mAb를 PBS에 대해 투석시켰다. 상기 항-DCIR 항체 AB8-26.9E8.1E3(HS854), 수탁번호 PTA-10246을 수탁기관[American Type Culture Collection(ATCC)]에 기탁하고 항-DCIR 항체 수탁번호 PTA 10247을 기탁하였다.
cDNA 클로닝 및 키메라 마우스/사람 재조합 IgG4 mAb의 발현. 총 RNA는 하이브리도마 세포(RNeasy kit, Qiagen)로부터 제조하고 공급된 5' 프라이머 및 유전자-특이적 3' 프라이머 mIgGκ(5'ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc3')(서열번호 4) 및 mIgG1(5'gtcactggctcagggaaatagcccttgaccaggcatc3')(서열번호 5)를 사용하는 cDNA 합성 및 PCR(SMART RACE kit, BD Biosciences)을 위해 사용하였다. 이어서, PCR 생성물을 클로닝하고(pCR2.1 TA kit, Invitrogen) DNA 서열 분석으로 특징 분석하였다. 마우스 중쇄(H) 및 경쇄(L) 가변(V) 영역 cDNA에 대해 유도된 서열을 사용하여, 시그널 펩타이드 및 V-영역을 PCR 증폭시키기 위해 특이적 프라이머를 사용하고, 한편 다운스트림 사람 IgGκ 또는 IgG4H 영역을 암호화하는 발현 벡터내로 클로닝하기 위한 플랭킹 제한 부위를 도입하였다. 키메라 mVκ-hIgGκ의 발현을 위한 벡터는 Xho I 및 Not I 부위에 의해 플랭킹된 잔기 401-731(gi|63101937|)을 증폭시키고 이를 벡터 pIRE7A-DsRed2(BD Biosciences)의 Xho I - Not I 구간으로 삽입시킴에 의해 제조하였다. PCR을 사용하여 개시인자 코돈으로부터 mAb Vκ 영역을 증폭시키고 Nhe I 또는 Spe I 부위에 이어서 CACC를 암호화 영역(예를 들어, gi|76779294|의 잔기 26)에 부착시키고, Xho I 부위를 부착시킨다. 이어서, 상기 PCR 단편을 상기 벡터의 Nhe I - Not I 구간으로 클로닝하였다. 상기 대조군 hIgG4H 벡터는 디설파이드 결합을 안정화시키고 잔기 FcR 상호작용38을 차단시키는 7A29P 및 L236E 치환을 갖는 gi|19684072|의 잔기 12-1473에 상응하고, 상기 치환은 정지 코돈 대신에 서열 5'-gctagctgattaattaa-3'(서열번호 6)을 첨가하면서 pIRE7A-DsRed2(BD Biosciences)의 Bgl II와 Not I 부위 사이에 삽입하였다. PCR을 사용하여 개시인자 코돈 기원의 mAb VH 영역을 증폭시키고 CACC에 이어서 Bgl II 부위를 gi|19684072|의 잔기 473을 암호화하는 영역에 부착시킨다. 이어서, 상기 PCR 단편을 상기 벡터의 Bgl II - Apa I 구간에 클로닝하였다. mSLAM 리더를 사용하는 키메라 mVH-hIgG4 서열에 대한 벡터는 서열 5'ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggccc3'(서열번호 7)을 상기 벡터의 Nhe I - Apa I 구간에 삽입함에 의해 제조하였다. PCR을 사용하여 5'tcgtacgga3'를 부착시키면서 예측된 성숙한 N-말단 코돈과 mVH 영역 말단 사이의 구간을 증폭시켰다. Bsi WI 및 Apa I로 분해된 단편은 상기 벡터의 상응하는 부위로 삽입하였다. 정지 코돈 이후에 근위 Nhe I 부위 및 원위 Not I 부위에 의해 플랭킹된 항원 암호화 서열은 각각의 H 쇄 벡터의 Nhe I - Pac I - Not I 구간으로 삽입하였다. 독케린(Doc)은 근위 Nhe I 부위와 원위 Not I 부위와 함께 gi|40671| 씨. 써모셀룸(C. thermocellum) CelD 잔기 1923-2150에 의해 암호화되었다. HIV gag p24는 근위 Nhe I 부위 및 gi|125489020| 잔기 60-75 기원의 서열 및 원위 Not I 부위와 함께 gi|77416878| 잔기 133-363에 의해 암호화되었다. 재조합 항체는 제조업자의 프로토콜(각각 1.3ml의 293 펙틴 시약과 함께 1mg의 총 플라스미드 DNA 또는 1ml FREESTYLE MAX 시약/트랜스펙틴 L과 함께 1mg의 총 플라스미드 DNA)에 따라 FreeStyle™ 293 또는 CHO-S 발현 시스템(Invitrogen)을 사용하여 제조하였다. H 및 L 쇄를 암호화하는 동일량의 벡터는 동시-형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 3일 동안 배양하고, 이어서 배양 상청액을 수거하고 0.5% 페니실린/스트렙토마이신(Biosource)을 갖는 새로운 배지를 첨가하여 2일 동안 계속 배양하였다. 풀링된 상청액을 여과에 의해 청징하고 1ml HiTrap MabSelect™ 컬럼 상으로 로딩하고, 0.1M 글라이신 pH 2.7로 용출시키고, 2mM Tris로 중화시키고, 이어서 Ca++/Mg++를 갖는 PBS에 대해 투석하였다. 단백질은 280nm에서의 흡광도로 정량하였다.
DCIR 발현 분석: DCIR 발현은 PBMC, 시험관내 생성되거나 피부-유도된 DC에 대해 평가하였다. 세포는 항-DCIR mAb(보충 방법에 기재된 바와 같이 생성된) 또는 마우스 IgG1(BD)로 이중 염색하고, 세척하고, 이어서 PE-접합된 염소 항-마우스 IgG(BD Pharmingen)로 염색하고, 이어서 세척하고 FITC 또는 APC-접합된 항-CD3, 항-CD19, 항-CD11c, 항-HLA-DR, 항-CD11c, 항-CD123, 항-CD56, 항-CD16(BD Pharmingen), 항-CD1a(DAKO) 또는 항-CD14(Invitrogen) mAb와 항온처리하였다. 상피 시트는 보충 방법에 상세히 기재된 바와 같이 염색시켜 미성숙한 LC 상에서의 DCIR 발현을 평가하였다.
미성숙한 LC 상에서의 DCIR 발현을 위해, 상피 시트를 대략 10mm 평방으로 절단하고 30분 동안 4% 파라포름알데하이드 중에 놓았다. 시트를 PBS 중에서 세척하고 30분 동안 백그라운드 버스터(Background Buster)(Innovex)로 블록킹하였다. 이어서, 상피 시트를 0.5μg의 정제된 마우스 항-DCIR(클론 9E8) 또는 대조군 IgG1과 밤새 항온처리하고, PBS/0.05% 사포닌으로 2회 세척하고, 2차 염소 항 마우스 IgG-Alexa568(Molecular Probes)(1:500 희석)과 1시간 동안 항온처리하였다. 핵을 1:5000에서 DAPI(Invitrogen; Molecular Probes)로 염색시킴에 이어서, 항-HLA-DR-FITC와 2시간 항온처리하였다. 시트를 PBS로 세정하고 벡타마운트(Vectamount) (Vector Laboratories)에 탑재하였다. 모든 항체를 CytoQ 희석액 및 블록(Innovex)중에 희석시키고 모두 4℃에서 약하게 일정한 교반과 함께 항온처리하였다. 카메라 (Olympus Planapo 20/0.7, Coolsnap HQ)로 사진촬영하고, 메타모프 소프트웨어( Metamorph software)를 사용하여 분석하였다.
DC-기능에 대한 DCIR-시그널 전달 효과: CD34+-유도된 DC를, CD40L(R&D; 100ng/ml) 또는 LPS(Invivogen; 50ng/ml)의 존재 또는 부재하에 항-DCIR(클론 24A5 또는 9E8) 또는 이소형 대조군 피복된 플레이트 중에서 배양하였다. 24시간 후, 세포를 수거하고 표면 표현형을 위해 염색시켰다. 상기 분비된 사이토킨은 멀티플렉스 비드 검정(multiplex bead assay)(Luminex)으로 분석하였다. 전반적인 유전자 특징 분석을 위해, 정상적인 사람 피부로부터 정제된 0.5 x 106 상피 세포를 24시간 동안 5μg/ml에서 가용성 교차-결합되거나 플레이트 피복된 형태로 항-DCIR(클론 24A5 또는 9E8), 항-CD40(클론 12E12) 또는 IgG1 이소형 매치된 대조군에 노출시켰다. 이중가닥의 cDNA를 총 200ng의 RNA로부터 수득하고 시험관내 전사 후 제조업자의 지침에 따라 증폭시키고 표지화시키는 단계를 수행하였다. 1.5μg의 증폭된 비오틴-표지된 cRNA를 일루미나(Illumina)(Ambion, Inc, Austin, TX)에 의해 추천된 샘플 표지화 과정에 따라 일루미나 센트릭스(Illumina Sentrix) Hu6 비드칩에 하이브리드화시켰다. 비드칩은 48,687개의 프로브를 대표하는 유리 슬라이드의 표면 상의 마이크로웰 내에서 3㎛ 비드에 부착된 50량체의 올리고뉴클레오타이드 프로브로 이루어진다. 슬라이드를 일루미나 비드스테이션 500 상에서 스캐닝하고 비드스튜디오 소프트웨어를 사용하여 형광 하이브리드화 시그널을 평가하였다. 동종유전자 CD8+ T 세포 프라이밍에 대한 DCIR 시그널 전달의 효과를 연구하기 위해, LC를 CD40L의 존재 또는 부재하에 1:20의 DC:T 비율로 항-DCIR mAb 또는 IgG1 대조군(10μg/ml)으로 피복된 플레이트에서 동종유전자 순수 CD8+ T 세포와 배양하였다. T 세포 증식 반응은 6일 배양의 마지막 12시간 동안에 [3H]-티미딘 혼입을 측정함에 의해 검정하였다. 상기 증식 CD8+ T 세포 (CFSElow)를, CD3/CD28 mAb 자극 후 이들의 표현형 및 이들의 사이토킨 분비 패턴에 대해 분석하였다. 자가 CD8+ T 세포 프라이밍에 대한 DCIR 시그널 전달 효과를 연구하기 위해, CD34+-유도된 DC 서브세트에 HLA-A201-제한된 MART-1(26-35) 펩타이드를 로딩하고 가용성 형태의 항-DCIR mAb 또는 IgG1 대조군(10μg/ml) 및 CD40L의 존재하에 순수 CD8+ T 세포와 함께 공동배양하였다. 10일 후, 세포를 수거하고 특이적 사량체에 의한 MART-1-특이적 CD8+ T 세포의 빈도수에 대해서 및 이펙터 분자 그랜자임 A(BD Pharmingen), 그랜자임 B(eBiosciences) 및 퍼포린(Fitzgerald)의 발현에 대해 분석하였다.
융합 단백질 mAb의 클로닝 및 제조: 제조업자의 프로토콜에 따라 FluMP를, 설포숙신이미딜 6-[3'(2-피리딜디티오)-프로피온아미드] 헥사노에이트(설포-LC-SPDP; Pierce)를 사용하여 mAb에 화학적으로 가교결합시켰다. 키메라 마우스/사람 재조합 mAb 항-DCIR 및 대조군 IgG4를 rAb H 쇄를 프레임내에 갖는 약 9.5kDa 독케린 도메인에 융합시켰다. 주변 천연 MART-1 잔기: DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAE ELAGIGILTV I LGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRP(서열번호 8)를 갖는 흑색종 MART-1 항원 기원의 면역-우성 HLA-A201-제한된 FluMP (58-66) 펩타이드(GILGFVFTL)(서열번호 1), 및 면역-우성 HLA-A201-제한된 MART-1 (26-35) 펩타이드(ELAGIGILTV)(서열번호 2)를 암호화하는 서열을 함유하는 전체 FluMP를 각각 약 17.5 kDa 코헤신 도메인에 융합시키고, 이. 콜라이 균주 BL21(DE3)(Novagen) 또는 T7 익스프레스(Express)(NEB)중에서 발현시켰다. 재조합 mAb (rAb)-항원 접합체는 rAb.Doc 융합 단백질을 2몰 등량의 코헤신.항원 융합 단백질과 혼합함에 의해 형성하였다. 상기 독케린 및 코헤신 도메인을 자기-연합시켜 안정한 [rAb.doc-coh.항원] 접합체(문헌(참조: Flamar et al.)에 기재된 바와 같음)를 형성한다. 상기 키메라 rAb 항-DCIR 또는 IgG4 대조군 항체를 HIV gag p24 단백질52 또는 MART-1 단백질의 재조합 형태 부분에 융합시켰다. 사용된 상기 항-DCIR-MART-1(클론 9E8) 융합 단백질은 H 쇄 C-말단에 부착된 하기의 펩타이드 단위[각각의 단위는 AS 잔기에 의해 플랭킹되어 있다]를 가졌다: T672N 치환을 갖는, 박테로이드 셀룰로솔벤스(Bacteroides cellulosolvens) 셀룰로솜(cellulosomal) 부착 스캐폴딩 B 전구체[gb|AAT79550.1|] 잔기 651-677; MART-1|gb|BC014423.1| 잔기 1-38; gb|AAT79550.1| 잔기 1175-1199; MART-1 잔기 78-118. mAb-FluMP 접합체의 세포-표면 염색을 위해, coh.FluMP는 제조업자의 과정에 따라 EZ-링크 NHS-SS-PEO4-비오틴(Pierce)을 사용하여 비오티닐화하였다. 단핵구-유도된 DC는 20분 동안 빙상에서 10μg/ml의 rAb.doc-coh.FluMP.비오틴 복합체로 염색시켰다. PE-접합된 스트렙트아비딘(1:200; BD Biosciences)을 사용하여 세포-표면 결합을 검출하고 유동 세포 측정기로 분석하였다.
DC 상에서의 펩타이드-MHC 복합체 검출: HLA-A201+ 공여자 기원의 CD34+-유도된 DC는 10% 사람 혈청, 50ng/ml의 GM-CSF 및 10ng/ml TNF-α가 보충된 배양 배지에서 50nM DCIR.doc-coh.FluMP 접합체 또는 유리된 coh.FluMP 융합 단백질과 항온처리하였다. 5μg/ml의 항-CD40 mAb(12E12, BIIR)는 2시간 후 첨가하였다. 세포는 24시간 후에, PE-접합된 사량체화된 M1D12 모노클로날 항체53를 사용하는 유동 세포측정에 의해 FluMP (58-66) 펩타이드 (GILGFVFTL)-HLA-A201 복합체에 대해 평가하였다.
CD8+ T 세포의 정제: CD8+ T 세포는 CD14, CD19, CD16, CD56 및 CD4 자기 비드를 사용하여 PBMC로부터 네가티브하게 선택하거나 순수 CD8+ T 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 정제하였다. 몇몇 실험에서, 순수 CD8+ T 세포는 CD8+CCR7+CD45RA+로서 분류되었고 기억 CD8+ T 세포는 CD8+CCR7-CD45RA-로서 분류되었다. 지적된 경우, 세포는 5μM 카복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CFSE; Invitrogen)로 표지시켰다.
화학적으로-연결된 항-DCIR mAb에 의한 FluMP 단백질의 교차제시: HLA-A201+ 공여자 기원의 CD34+-유도된 LC는 증가하는 농도의 항-DCIR-FluMP 또는 IgG1-FluMP 및 유리된 FluMP 단백질을 포함하는 대조군과 함께, 정제된 CD8+ T 세포와 8일 동안 배양하였다. 단독으로 전달되는 경우, FluMP는 FluMP (58-66)-특이적 HLA-A201-사량체로 염색시킴에 의해 평가된 바와 같이, FluMP-특이적 CD8+ T 세포(도 2b)의 매우 제한된 증식을 유도하였다. IgG1-FluMP는 유리된 FluMP 단백질보다 효율적이고 이는 Fc-매개된 취득54을 시사하였다. 도 2c에 설명된 용량-적정 곡선은 항-DCIR-FluMP가 대조군 IgG1-FluMP 또는 유리된 FluMP보다 적어도 50배 미만의 항원을 이용한 반응을 유발함을 보여주고, 따라서, 항원의 실제 표적화를 입증한다. 상기 유리된 항원은 항-DCIR-FluMP와 함께 관찰된 FluMP-특이적 CD8+ T 세포의 높은 빈도수를 결코 유도하지 않음을 주지한다(도 2c).
표 1은 CD40L의 존재 또는 부재하에 항-DCIR 또는 이소형 대조군으로 24시간 동안 자극된 CD1a+ LC의 표면 상에 CD80, CD86, CD40, ICOS-L, HLA-ABC 및 HLA-DR의 평균 형광 발현을 지적한다. 도 2b는 가교결합된 항-DCIR-FluMP, 가교결합된 대조군 IgG-FluMP 단백질, 또는 유리된 FluMP와 함께 배양된 CD1a+ LC에 의해 증식된 HLA-A201-FluMP (58-66) 펩타이드 사량체-양성 CD8+ T 세포의 비율을 보여준다. 도 2c는 감소하는 농도의 가교결합된 mAb-FluMP 작제물 또는 유리된 FluMP에 응답하는 FluMP-특이적 CD8+ T 세포의 백분율을 보여준다. 도 2d는 본 연구에 사용된 단백질 항원 뿐만 아니라 마우스 및 키메라 항-DCIR mAb의 SDS-PAGE-환원 겔을 보여준다. 도 2e는 단핵구-유도된 DC의 표면으로의 항-DCIR.doc-coh.FluMP 접합체 mAb의 결합을 보여준다. 도 8a는 CD1a+ LC(S3A)의 표면 상의 CD86의 발현에 대한 유동 세포측정 분석을 보여주고, CD40L의 존재 또는 부재하에 항-DCIR 또는 이소형 대조군으로 24시간 동안 자극된 피부 분리된 DC(LC, 진피 CD1a+ DC 및 진피 CD14+ DC)(도 8b)에 의한 IL-6 분비를 루미넥스에 의해 보여준다. 데이터는 상기 항-DCIR 항체가 배양된 DC의 표현형을 변형시키지 않고 이것이 CD40- 또는 CL075-유도된 활성화를 억제하지 않음을 보여준다. 도 8c는 DCIR 연결이 아닌 CD40-연결만이 가용성, 가교결합된 또는 플레이트 피복된 형태의 mAb에 노출된 상피 피부 세포에 의한 전반적인 활성화 유전자 특징을 유도함을 보여준다. 도 9a는 상기 항-DCIR 항체가 동종유전자 CD1a+ LC에 의해 유발된 순수 T 세포의 증식을 변형시키지 않음을 보여준다. 도 9b 및 도 9c는 항-DCIR 항체의 첨가가 동종유전자 DC에 의해 활성화된 순수 CD8+CD45RA+ T 세포의 표현형(PD-1, CTLA-4 및 CD28) 및 사이토킨 분비(IFN-γ, IL-2, TNF-α 및 IL-10)를 변형시키지 않음을 보여준다. 도 9d는 항-DCIR 항체가, 특이적 사량체를 사용한 유동 세포측정 및 이펙터 분자의 수준(그랜자임 A, 그랜자임 B 및 퍼포린)에 의해 분석된 바와 같이 MART-1-특이적 이펙터 CD8+ T 세포를 프라이밍하는 MART-1 펩타이드-로딩된 DC의 능력을 변형시키지 않음을 보여준다.
Figure pct00001
DCIR은 단핵구, B 세포 및 모든 DC 서브세트에 의해 발현된다: 2개의 모노클로날 항-DCIR 클론은 연구 전반에 걸쳐 사용되었다: 9E8 및 24A5. 이들은 표면 플라스몬 공명 분석에 의한 평가시 고친화성(각각 약 850pM 및 약 560pM)인 것으로 입증되었다. 이들은 PBMC의 비교가능한 염색을 나타냈고(도 1a) 본 연구 전반에 걸쳐 비교가능한 기능적 결과를 나타냈다.
DCIR은 HLA-DR 발현에 의해 지적된 바와 같이 모든 순환 APC에 의해 발현되는 것으로 밝혀졌다. 이들 APC는 CD14+ 단핵구(CD14+CD16- 및 CD14+CD16+ 서브세트 둘 다), LIN-HLA-DR+CD11c+ 혈액 골수 DC(mDC), LIN-HLA-DR+CD11c-CD123+ 형질세포성 DC(pDC) 및 CD19+ B 림프구를 포함한다. DCIR은 CD3+ T 세포(도 1a) 또는 CD16+ 및 CD56+ NK 세포(나타내지 않음) 상에서 검출되지 않았다. DCIR은 정제된 상피 LC, 진피 CD14-CD1a+, 및 진피 CD14+CD1a-DC 상에서 발현되었다(도 1b). 상피 시트의 면역형광 분석은 추가로 동일계에서 HLA-DR+ LC 상에서의 DCIR의 발현을 확인시켜주었다(도 1c). DCIR은 9일 동안 GM-CSF, FLT3-L 및 TNF-α의 조합체와 함께 CD34+ 조혈 선구 세포(HPC)를 배양함에 의해 시험관내 생성된 CD1a+ LC 및 CD14+ 간질 DC 상에서 발현되고37(도 1d), GM-CSF 및 IL-4, 또는 GM-CSF 및 I형 IFN(나타내지 않음)과 함께 배양된 단핵구-유도된 DC 상에서도 발현된다.
따라서, 본 발명의 발견은 단핵구, B 세포, 진피 DC, mDC 및 pDC 상에서의 DCIR 발현의 조기 발견을 확인시켜 주고33 34, 추가로 피부 LC 상에서의 이의 발현을 보여준다.
항-DCIR 접합체에 의한 FluMP 단백질의 교차제시: 항-DCIR 항체에 화학적으로 결합된 FluMP 단백질을 사용한 연구(도 2a, 작제물 I)는, 항원에 결합되는 경우 DCIR은 면역우성 HLA-A201-제한된 FluMP (58-66) 펩타이드의 교차제시를 가능하게 함을 입증하였다(도 2b 및 도 2c). 이것은 본 발명들이 재조합 항-DCIR(또는 대조군 IgG4 항체) 및 FluMP를 기초로 융합 단백질을 작제할 수 있도록 하였지만 이들은 형질감염된 HEK293F 세포로부터 효율적으로 분비되는데 실패하였다. 따라서, 본 발명자들은 클로스트리디움 써모셀룸(Clostridium thermocellum) 기원의 셀룰로솜의 2개의 단백질인 코헤신과 독케린 사이의 고친화성 상호작용(약 30pM)을 기초로 하는 전략을 디자인하였다(문헌참조: Flamar et al.). 상기 mAb.독케린 융합 단백질(mAb. doc)(도 2a 작제물 II 및 도 2d)은 형질감염된 포유동물 세포에 의해 용이하게 분비되고, 단백질 A 친화성 컬럼 상에서 정제되었다. 상기 대조군 hIgG4H 및 재조합 항-DCIR 항체는 각각 S229P 및 L236E 치환을 함유하고, 상기 치환은 디설파이드 결합을 안정화시키고 잔여 FcR 상호작용을 정지시킨다38. FluMP는 가용성 코헤신 융합 단백질(coh.FluMP)(도 2a 작제물 II 및 도 2d)로서 이. 콜라이에서 제조되었다. 표적화 접합체는 DC로 전달되기 전에 15분 동안 동몰량의 mAb.doc 및 coh.FluMP를 항온처리함에 의해 제조되었다. 재조합 항-DCIR.doc-coh.FluMP 복합체 mAb(흑색 화살표)는 사람 단핵구-유도된 DC의 표면에 결합하였지만 대조군 접합체 IgG4-FluMP(백색 화살표)는 상기 세포와 결합하지 않았다(도 2e).
재조합 항-DCIR.doc-coh.FluMP 복합체 mAb가 DC에 의해 프로세싱되고 제시되었는지의 여부를 결정하기 위해, HLA-A201+ 공여자 기원의 DC를 24시간 동안 50nM 접합체 mAb와 배양하고 HLA-A201에 결합된 FluMP (58-66) 펩타이드를 검출하는 모노클로날 항체(M1D12)로 염색시켰다. 항-DCIR-FluMP 접합체 mAb에 노출된 DC는 이들 표면(검정 히스토그램) 상에 HLA-A201-FluMP (58-66) 펩타이드 복합체를 나타낸다(도 2f).
정제된 CD8+ T 세포로의 항원의 제시를 평가하기 위해, 재조합 접합체 mAb는 2개의 농도(8nM 및 0.8nM)로 CD34+-HPC-유도된 LC에 제공하였다. 8nM의 항-DCIR.doc-coh.FluMP는, IgG4.doc-coh.FluMP(10.5%의 사량체 양성 세포에 비해 0.9%)보다 FluMP-특이적 CD8+ T 세포의 증식을 유도하는데 효능적이었다(도 2g, 상부 패널). DCIR을 통한 표적화 효능은 보다 낮은 접합체 mAb 농도(0.8nM)에서 확인되었고, 여기서, 상기 대조군 접합체 mAb는 거의 교차제시되지 않았다(0.2% 양성 세포에 대해 2.8%)(도 2g, 하부 패널). DC가 단지 18시간 동안 접합체 mAb(8nM)에 노출된 경우 및 CD8+ T 세포와 배양하기 전에 세척되는 경우에 항원을 DC로 표적화하는 DCIR의 능력이 추가로 설명된다(4.12 ± 2.13% 대 0.05 ± 0.02% 사량체 양성 세포)(도 2h).
따라서, DCIR을 통한 생체외-생성된 DC로의 항원의 표적화된 전달은 단백질의 CD8+ T 세포에의 효율적인 교차제시를 보여준다.
항-DCIR 접합체는 피부 랑게르한스 세포 혈액 mDC 및 혈액 pDC에 의한 단백질의 교차제시를 가능하게 한다: 이들 융합 단백질이 백신으로서 사용되도록 의도되는 만큼, 본원 발명자들은 작제물이 피부 또는 혈액으로부터 분리된 사람 DC 서브세트에 의해 교차제시되는지의 여부를 평가하였다. 따라서, 8nM의 재조합 항-DCIR.doc-coh.FluMP 복합체를 10일 동안 5 x l03개의 분류된 상피 HLA-A201+ LC 및 1 x 105 정제된 혈액 CD8+ T 세포의 배양물에 첨가하였다(도 3). 이것은 IgG4 대조군 복합체 mAb(3.4% 대 0.7%)와 비교하는 경우 DCIR-표적화된 LC에 의한 FluMP-특이적 CD8+ T 세포의 증식을 유도하였다. LC에 의해 발현되지 않는 렉틴에 대한 유리된 coh.FluMP(1%) 또는 복합체, 즉 DC-SIGN.doc-coh.FluMP(0.6%)(도 3a)는 전혀는 아니지만 매우 약하게 교차제시되었다. 랑게르한스 세포-특이적 렉틴, 랑게린에 대한 항체 항원 복합체는 LC(8.2%)에 의한 FluMP-특이적 CD8+ T 세포의 증식을 유도하였다. 사량체-특이적 CD8+ T 세포의 증식(도 3a)는 배양 상청액에서 측정된 IFN-γ 수준과 상호관련이 있었다 (도 3b).
혈액 DC의 서브세트인 CD11c+ mDC 및 BDCA2+ pDC 둘 다는 DCIR을 발현한다(도 1a). 따라서, 동일한 세포분리반출 샘플39로부터 정제된 mDC 및 pDC는 DCIR을 통해 전달된 FluMP를 교차제시하는 이들의 능력에 대해 시험되었다. 5 x 103 DC는 1 x 105 자가 CD8+ T 세포 및 감소하는 농도의 유리된 coh.FluMP, 또는 IgG4.doc-coh.FluMP 접합체 또는 항-DCIR coh.FluMP 접합체와 함께 배양하였다.
상기 항-DCIR.doc-coh.FluMP 복합체 mAb(도 4a)는 80pM의 낮은 농도가 1.8%의 사량체 양성 세포를 생성시키기 때문에 FluMP를 mDC로 효율적으로 표적화시켰다. Coh.FluMP 자체 및 대조군 IgG4.doc-coh.FluMP 접합체는 단지 8nM에서만 항원-특이적 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있었다.
pDC는 또한 8nM의 농도에서 3개의 형태의 재조합 FluMP를 교차제시할 수 있었다. 0.8nM 및 80pM에서, 항-DCIR.doc-coh.FluMP 복합체 mAb는 FluMP 항원 교차제시를 가능하게 하였지만 유리된 coh.FluMP, 또는 IgG4.doc-coh.FluMP 접합체는 교차제시하지 않았다(도 4b). pDC와 비교하는 경우, 8nM의 항-DCIR.doc-coh.FluMP 복합체 mAb로 표적화된 mDC는 FluMP-특이적 CD8+ T 세포의 보다 강한 증식을 유도할 수 있었다(특이적 HLA-A201 사량체를 사용한 측정시)(도 4c)(p=0.02).
이를 종합했을 때, 이들 데이터는 항-DCIR mAb가 피부 랑게르한스 세포인 혈액 mDC 및 pDC에 의한 교차제시를 위해 단백질을 강력하게 표적화시킴을 지적한다.
항-DCIR 접합체에 의한 MART-1 및 HIV gag 단백질의 교차프라이밍: 본 발명자들은 하기를 사용하여 DCIR이 순수 CD8+ T 세포의 교차프라이밍을 가능하게 하는지의 여부를 추가로 시험하였다: i) 10량체 MART-1 (26-35) HLA-A201-제한된 펩타이드(EAAGIGILTV)에 융합된 항-DCIR.독케린 및 코헤신(도 2a, III)(서열번호 9); ii) MART-1 재조합 단백질에 직접적으로 융합되거나(도 2a, IV) 또는 HIV gag p24 단백질에 직접적으로 융합된(도 2a, V) 항-DCIR. 상피 HLA-A201+ LC는 30nM의 항-DCIR.doc-coh.MART-1 또는 IgG4.doc-coh.MART-1 복합체 mAb와 함께 자가 T 세포와 배양하였다. 10일 후, MART-1 (26-35)-HLA-A201+ 사량체의 결합은 항-DCIR.doc-coh.MART-1 복합체 mAb가 피부-유도된 LC가 CD8+ T 세포를 프라이밍하고 MART-1-특이적 CD8+ T 세포를 증식시키도록 함을 지적하였다(도 5a).
항-DCIR-MART-1 융합 단백질의 성공적인 발현(도 2a, IV)은 본 발명자들이 상기 MART-1 단백질의 다른 에피토프로의 교차프라이밍을 평가할 수 있도록 하였다. 따라서, DC는 항-DCIR-MART-1 또는 IgG4-MART-1 융합 단백질에 노출시키기거나 단백질에 노출시키지 않고 CD40L로 활성화시키고 자가 정제된 순수 CD8+ T 세포와 함께 배양하였다. 10일 후, 세포를, MART-1 단백질로부터 유도된 개별 펩타이드의 클러스터가 로딩된 DC 또는 로딩되지 않은 DC로 5시간 동안 재자극시켰다. 세포독성 활성 측정을 위한 마커인 CD107a의 세포 표면으로의 이동, 및 세포질내 IFN-γ의 발현은 특이적 CTL 반응을 평가하기 위해 측정하였다. 항-DCIR-MART-1 융합 단백질은 MART-1 단백질의 클러스터 1, 클러스터 4 및 클러스터 5 기원의 펩타이드에 대해 MART-1-특이적 CD8+ T 세포의 증식을 유도하였다(도 5b). DCIR-MART-1 융합 단백질을 사용한 DC의 표적화는 고수준의 이펙터 분자 그랜자임 B 및 퍼포린을 발현하는 CD8+ T 세포의 증식을 유도하였다(도 5c).
항-DCIR-p24 및 IgG4-p24 융합 단백질(도 2a, V)은 또한 널리 분비된 형태의 HEK293F 세포이다. 따라서, 건강한 개체로부터 정제된 순수 CD8+ T 세포는 CFSE로 표지시키고 DC 및 이들 융합 단백질 또는 단백질 부재 중 어느 하나와 함께 2회 연속 7일 배양에 의해 프라이밍시켰다. 증식 CFSElowCD8+ T 세포를 분류하고 HIV gag p24 (p24) 단백질-로딩된 DC와 함께 재투여하였다. 항-DCIR-p24 융합 단백질(흑색 막대)로 프라이밍된 CD8+ T 세포는 p24 투여에 대한 반응하에서 IFN-γ를 분비할 수 있었지만, 대조군 융합 단백질은 그렇지 않았다(회색 막대)(도 5d). 이것은 항-DCIR-p24 융합 단백질에 의한 순수 CD8+ T 세포의 특이적 프라이밍을 지적한다.
본 발명의 연구의 발견은 DCIR을 통한 표적화 항원이 자기 및 비자기 항원에 특이적인 CD8+ T 세포의 프라이밍을 가능하게 함을 입증한다.
TLR7/8-효능제는 DCIR-매개된 교차제시를 증진시킨다: TLR 유발이 DC를 활성화시키기 때문에 본 발명자들은 TLR 리간드가 항-DCIR 복합체로 표적화된 mDC에 의해 유도된 항원-특이적 CD8+ T 세포 반응을 증진시키는지의 여부를 분석했다. 5 x 103 개의 정제된 혈액 HLA-A201+ mDC는 증가하는 양의 항-DCIR.doc-coh.FluMP 복합체 mAb, 및 TLR3(Poly I:C; 5μg/ml), TLR4(LPS; 50ng/ml) 또는 TLR7/8(CL075; 1μg/ml) 및 1 x lO5 자가 정제된 CD8+ T 세포와 함께 배양하였다. 상기 특이적 -FluMP CD8+ T 세포 반응은 HLA-A201-FluMP (58-66) 사량체를 사용하여 8 내지 10일 후 측정하였다. TLR3-효능제(Poly I:C)는 표적화 복합체의 낮은 농도(2nM 및 0.2nM)에서 FluMP-특이적 반응을 증진시켰지만 TLR4를 통한 활성화는 증진시키지 못했다. TLR7/8-효능제(CL075)는 FluMP-특이적 CD8+ T 세포를 증식시키는데 가장 강력한 것으로 밝혀졌다(도 6a). CL075-증진된 반응은 모든 시험된 농도의 항-DCIR.doc-coh.FluMP 복합체에 대해 관찰되었고, mAb 표적화 복합체(도 6a 및 도 6b)의 존재에 의존하였다. 5μg/ml로부터 25μg/ml의 Poly I:C의 농도 증가 또는 50ng/ml로부터 200ng/ml으로의 LPS의 농도 증가는 DCIR.doc-coh.FluMP 복합체 mAb에 응답하는 항원-특이적 CD8+ T 세포의 증식을 상당히 증진시키지 않았다. 그러나, TLR3-활성화는 TLR4-활성화보다 높은 FluMP-특이적 반응을 유도하였다(도 6c). 0.2μg/ml의 TLR7/8-효능제의 낮은 농도는 FluMP-특이적 반응을 증진시키는데 충분하였다(도 6c). 가용성 CD40L이 TLR-효능제에 추가로 첨가되는 경우 어떠한 상당한 상승작용적 효과가 나타나지 않았다(나타내지 않음).
매 시험된 농도 또는 시험된 활성화제의 조합에 대해, 항-DCIR.doc-coh.FluMP에 대한 FluMP-특이적 반응은 대조군 IgG4.doc-coh.FluMP (도 6b 및 도 6c), 또는 유리된 coh.FluMP(나타내지 않음)에 의해 유도된 것들보다 상당히 높았다. 따라서, TLR7/8 활성화는 mDC에 의한 단백질 항원의 DCIR-의존성 교차제시를 증진시킨다.
TLR7/8-효능제는 DCIR-매개된 교차프라이밍을 증진시킨다: 본 발명자들은 추가로 TLR7/8-리간드가 또한 DCIR-매개된 주요 CD8+ T 세포 반응을 증진시키는지의 여부를 조사하였다. 혈액 HLA-Α201+ mDC는 항-DCIR-MART-1 또는 IgG4-MART-1 융합 단백질과 함께 배양하였다(도 2a, 작제물 IV). 상기 DC는 CD40L, TLR3-L, TLR4-L 또는 TLR7/8-L로 활성화시키고 정제된 CFSE-표지된 순수 CD8+ T 세포와 공동배양하였다. MART-1 (26-35)-HLA-A2-제한된 CFSElow CD8+ T 세포의 증식은 10일 후 특이적 사량체를 사용하여 평가하였다(도 7a). TLR7/8-활성화된 DC는 MART-1-특이적 CD8+ T 세포(0.18%)의 최고의 증식을 유도하였다(도 7a). CD40L이 아닌 TLR7/8 효능제와 함께 혈액 mDC 및 단일 용량의 항-DCIR-MART-1 또는 항-DCIR-p24 융합 단백질(도 2a, 작제물 IV 및 V) 둘 다를 사용하는 제 2 실험에서, MART-1 및 HIV gag p24-HLA-A201-사량체 결합 CD8+ T 세포의 증식이 유도되었다(0.18% 대 0.01% 및 0.15% 대 0.01%)(도 7b). 그러나 제2 반응과는 다르게, CD40- 및 TLR7/8 둘 다를 통한 공동-시그널 전달은 CD40L 또는 TLR7/8 효능제 단독과 비교하여 상승작용적 효과 및 보다 큰 사량체-결합 CD8+ T 세포의 증식을 유도하였다(0.3% 대 0.37% 대 0.83%)(도 7c 및 도 7d). 따라서, TLR7/8-효능제는 항원-특이적 CD8+ T 세포의 교차프라이밍 및 교차제시를 증진시킨다.
TLR7/8-리간드는 CTL 이펙터 분자를 증가시키고, 2형 사이토킨 생산을 감소시킨다: 다음 세트의 연구는 DCIR-표적화 동안에 TLR7/8 유발이 유도된 반응의 질을 변화시키는지의 여부를 결정하기 위해 디자인하였다. 따라서, 순수 CD8+ T 세포는 활성화하지 않거나 또는 CD40L 또는 CL075 단독 또는 CD40L + CL075와 함께 자가 HLA-A201+ mDC 및 항-DCIR-MART-1 융합 단백질과 함께 배양하였다. 10일 후, 세포는 HLA-A201-MART-1 (26-35) 사량체 및 그랜자임 B 또는 퍼포린-특이적 mAb로 염색시켰다. 단독의 각각의 활성화제와 비교하여, CD40L 및 TLR7/8 효능제의 조합은 증식된 CD8+ T 세포에 의해 이펙터 분자 그랜자임 B(도 7c; 좌측 패널) 및 퍼포린(도 7c: 우측 패널)의 보다 높은 발현을 유도하였다. CD40L-, Poly I:C- 또는 LPS-조건화된 DC와 비교하여, 항-DCIR-MART-1 융합 단백질 및 TLR7/8-효능제로 표적화된 DC에 의해 프라이밍된 CD8+ T 세포는 MART-1 단백질 기원의 펩타이드가 로딩된 자가 DC를 사용한 특이적-재자극에 응답하여 보다 큰 양의 IFN-γ를 발현하였다(도 7e; 상부 패널). 제2 모델 항원, HIV gag p24는 본 발명자들이 프라이밍된 CD8+ T 세포의 질에 대한 TLR7/8-리간드의 효과를 추가로 입증하도록 하였다. 따라서, 항-DCIR-p24 융합 단백질-표적화된 DC에 의해 프라이밍되고 TLR7/8 효능제로 활성화된 CD8+ T 세포는 HIV gag p24 단백질 기원의 15개 아미노산-중첩 펩타이드가 로딩된 자가 DC를 사용한 특이적 재자극에 응답하는 CD40L-, Poly I:C- 또는 LPS-활성화된 DC와 비교하여 보다 큰 양의 IFN-γ를 발현하였다(도 7e; 하부 패널). 예상된 바와 같이, 세포질내 IFN-γ의 수준은 항원이 DCIR를 통해 전달되는 경우 대조군 IgG4 mAb와 비교하여 보다 높았다(도 7e). 흥미롭게도, DCIR-프라이밍된 CD8+ T 세포는 이들이 처음에 CD40L- 또는 CL075-유발된 DC 노출의 여부에 따라 MART-1 펩타이드-로딩된 DC를 사용한 재활성화에 응답하여 상이한 세트의 사이토킨을 생성하였다(도 7f). CD40L-성숙화된 IFN-α DC가 순수 CD8+ T 세포가 높은 양의 2형 사이토킨(IL-4, IL-5 및 IL-13)을 발현하고, TLR7/8-노출된 DC에 의해 교시된 순수 CD8+ T 세포가 현저히 감소된 양의 IL-4, IL-5 및 IL-13과 함께 우선적으로 IFN-γ 및 TNF-α를 분비하도록 유도하였다(도 7f). 추가로, 단독의 각각의 활성화제와 비교하여, TLR7/8 및 CD40L의 조합은 세포내 염색에 의해 관찰된 바와 같이, MART-1 단백질로부터 유도된 15개 아미노산-중첩 펩타이드를 사용한 재자극에 응답하여 IFN-γ 및 TNF-α-생산 CD8+ T 세포의 가장 강한 증식을 유도하였다(도 7g). 따라서, TLR7/8-활성화는 DCIR-표적화된 mDC에 의해서, 및 IFN-γ 분비를 증진시키고 2형 사이토킨 분비를 감소시킴에 의해 1차 CD8+ T 세포 반응의 질을 변경시킨다.
상기 제공된 연구는 ITIM 모티프를 발현하는 표면 렉틴인 DCIR의 연결이 DC의 불활성화, 및 활성화의 차단을 유도할 것이라는 전제하에 개시하였다. 앞서 기재된 바와 같이, DCIR은 혈액 단핵구 상에 고밀도로 및 B 세포 상에서 보다 낮은 수준으로 발현된다33. DCIR은 또한 조기 면역조직화학 데이터에 따르면 정제된 진피 CD14+ DC 상에서 고밀도로 발현된다33. 그러나, 이들 데이터와의 변량에서, DCIR은 이들의 정제 후에 상피 랑게르한스 세포 상에서 및 온전한 상피 시트 상에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. LC에 관한 2개 연구의 모순은 DCIR 발현이 또한 GM-CSF 및 TNF-α와 함께 CD34+ HPC를 배양함에 의해 시험관내 생성된 LC와 함께 관찰되므로 흥미롭다3 7. 본 발명자들 및 기타 연구자들은 또한 DCIR이 혈액 골수 DC40 및 혈액 형질세포성 DC34 상에서 고밀도로 발현됨을 밝혔다. 따라서, DCIR은 혈액 및 피부 DC의 모든 사람 DC 서브세트에 의해 발현된다.
12개의 상이한 항-DCIR 항체와 함께 DCIR의 사용은 CD80, CD83 및 CD86의 발현 또는 사이토킨(예를 들어, IL-6 또는 IL-12)의 분비에 의한 측정시 DC 활성화를 억제하거나 증진시키지 않았다. DCIR 가교-결합은 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 DC-매개된 증식을 증진시키거나 억제하지 않았다. 추가로, 마이크로어레이 분석에 의해 평가된 바와 같이, CD40과는 반대로 DCIR의 연결은 분리된 상피 세포에 의한 활성화 유전자 특징을 밝히지 못했다(데이터는 나타내지 않음). 그러나, DCIR의 억제 역할에 대한 증거는 콜라겐-유도된 관절염에 대해 악화된 반응을 보여주고 활성화된 DC 및 활성화된 CD4+ T 세포의 수가 증가된 dcir-결핍 마우스에서 보고되었다 41. 그러나, 마우스 및 사람은 마우스 게놈이 4개의 DCIR-유사 분자: DCIR-2, DCIR-3, DCIR-4 및 DCAR-1을 암호화하고, 한편 상기 사람 게놈이 단지 하나를 암호화하는 바와 같이 DCIR 유전자 복합체의 수준에서 상당한 차이가 있음을 주지해야 한다. 대안의 설명은 본원 발명자들이 제조한 mAb가 음성 시그널을 제공할 수 없거나 본 발명의 항체가 마우스 활성화 수용체 DCAR에 대해 아직 동정되지 않은 사람 대응물과 상호반응할 가능성을 포함한다. 또 다른 가능성은 DCIR의 억제 시그널이 DC, 즉 단핵구 또는 B 세포와는 다른 세포로 전달되는 것일 수 있다36. 사람에서, 최근 연구34는 동시-자극 분자의 발현에 영향을 미치지 않고 pDC에 의한 TLR9-유도된 IFN-γ 생산의 약간의 억제 및 TLR8-활성화된 mDC에 의한 감소된 IL-12 및 TNF-α 생산을 입증하였다4 0. 최종적으로, BDCA-210 및 DCAL-242와 같은 다른 렉틴에 대해 입증된 바와 같이, 세포에 따라 ITIM은 때때로 세포 활성화를 억제하기보다는 오히려 자극할 수 있다4 3.
수용체 DCIR을 통해 전달되는 항원은 기억 T 세포에 효율적으로 교차제시되는 것으로 밝혀졌다. 80pM의 낮은 항-DCIR.doc-coh.FluMP 복합체 mAb의 농도는 FluMP-특이적 CD8+ T 세포의 상당한 증식을 유도하기 위해 충분하였다. 이것은 내인성 항원 제시 능력의 약 100배 증진을 나타낸다. 상기 효과는 DEC-20516의 융합 단백질을 사용한 뮤린 연구에서 일찍이 보고되었다. 현저한 발견은 모든 시험된 DC 서브세트가 DCIR 융합 단백질에 의해 표적화되고 특이적 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다는 것이다. 실제로, 이전의 연구33 ,34의 다양성에서, 항-DCIR은 항원을 상피 랑게르한스 세포뿐만 아니라 혈액 pDC로 효율적으로 전달할 수 있었고 특이적 CD8+ T 세포 반응의 발생을 가능하게 하였다. DCIR을 통한 항원 전달은 기억 FluMP-특이적 CD8+ T 세포의 증식을 가능하게 할 뿐만 아니라 흑색종 분화 항원 MART-1 및 HIV gag p24 단백질에 대한 순수 CD8+ T의 프라이밍을 유도하였다. 추가로, DCIR 매개 반응은 광범위하고 MART-1 단백질의 다중 에피토프에 특이적이다. 최근에 DCIR2에 대한 모노클로날 항체는 마우스에서 CD8-DCIR2+ 서브세트를 우선적으로 표적화하여 CD4+ T 세포의 MHC 부류 II-제한된 재활성화의 유도를 우선적으로 발생시키는 것으로 밝혀졌다28. 또한 항-DCIR은 KLH를 사람 pDC에 표적화함으로써 KLH-특이적 CD4+ T 세포주의 증식을 가능하게 하는 것으로 나타났다34. 본 발명은 DCIR이 또한 항원-특이적 CD8+ T 세포 반응을 확립하고 재활성화시키는 강력한 수단임을 입증한다. 피부 랑게르한스 세포, 혈액 mDC 및 pDC를 포함하는 모든 DC는 DCIR을 통해 전달되는 항원을 교차제시하는데 효율적이었다. 모두 함께 이들 데이터는 DEC-205와 같은 DCIR을 통한 항원 전달이 MHC 부류 I 및 MHC 부류 II 제한된 면역 반응 둘 다를 유도할 수 있음을 지적한다.
향후 백신이 보조제와 함께 이들 표적화된 항원으로 구성될 것이므로, 본 발명자들은 또한 미생물(TLR) 자극이 mDC에 의한 DCIR-매개 항원 교차제시를 개선시킬 것인지를 해결하였다. 모든 시험된 활성화제 중에서, TLR7/8 효능제가 상기 과정에서 가장 효과적임이 입증되었고 1차 및 2차 반응, 특히 CD40 시그널과 함께 전달되는 1차 반응의 경우에 항원-특이적 이펙터 CD8+ T 세포의 최고의 증식을 유도하였다. 특이적 CD8+ T 세포 반응을 증폭시키는 것 뿐만 아니라, TLR7/8-유발은 또한 IFN-γ, 및 그랜자임 A, 그랜자임 B 및 퍼포린과 같은 이펙터 분자의 고발현을 촉진시킴에 의해 유도된 T 세포의 질에 영향을 미쳤다. 더욱이, DCIR-표적화된 IFN-α DC를 높은 양의 2형(IL-4, IL-5 및 IL-13) 사이토킨을 생성하도록 CD40L-프라이밍된 CD8+ T 세포로 활성화시키고, TLR7/8-효능제는 염증 촉진 사이토킨 IFN-γ 및 TNF-α의 증진된 생성 및 현저히 감소된 수준의 IL-4, IL-5, 및 IL-13과 연관된 1형 반응쪽으로 균형을 이동시켰다. 본 발명자들의 발견은 TLR7/8-유발에 대한 증진된 단백질계 백신 유도된-T 세포 반응에 기여하는 이전의 관찰에 따른 것이다44 ,45. SIV의 비사람 영장류 모델에서, TLR7/8-리간드와 함께 전달된 단백질 항원은 다-기능성 CD8+ T 세포의 증진되고 지속적인 증식뿐만 아니라 Th1 반응의 유도를 촉진시켰다. IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 동시에 생성하는 상기 세포는 프로그레서에 비해 HIV 비프로그레서에서 풍부하고 장기 보호와 관련된다. 따라서, 표적화된 단백질계 백신과 TLR7/8-효능제의 조합은 CD8+ T 세포가 이펙터 기능을 매개하는 만성 질환을 치료하는데 유익해야만 한다.
본 발명의 세팅에서, 본 발명자들이 사용한 TLR 효능제가 또한 CD8+ T 세포상에 직접적인 효과를 가질 가능성은 배제될 수 없다. 이전의 몇몇 연구가 입증한 바와 같이, CD4+ T 세포에 대한 직접적인 TLR-유발은 동시자극 분자의 상향조절을 유도할 수 있고 이들의 증식을 조절할 수 있다46 ,47. 그럼에도 불구하고, 가장 효과적인 다-기능성 CD8+ T 세포 반응이 상기 항원이 별도로 전달되기보다는 오히려 보조제에 융합되는 경우 유도되는 것으로 입증되었고44, 이러한 발견은 NY-ESO 및 국소적 TLR7 효능제로 백신 접종된 흑색종 환자에서 CD8+ T 세포 반응의 부재를 설명할 수 있다48. 따라서, 본 발명자들의 데이터는 항원 및 보조제를 DC에 직접적으로 전달하는 가장 효율적인 방법으로서, TLR-효능제를 표적화 항원 백신, 예를 들면 DCIR에 접합시키는 방법을 지지한다. 그러나, 어느 활성화제 또는 어느 활성화제의 조합 및 어느 백신 제형이 생체내에서 가장 강력하고 오래 지속되는 CD8+ T 세포 반응을 생성시킬 것인가를 공식적으로 결정하기 위해서는 추가의 연구가 요구된다.
요약하여, DCIR을 통한 임상적 관련 항원의 다양한 DC 서브세트로의 표적화는 만성 질환의 예방 및 치료에 필수적인 강한 세포독성 CD8+ T 세포 반응의 유도를 허용할 것이다.
본 명세서에서 논의된 임의의 실시형태는 본 발명의 임의의 방법, 키트, 시약 또는 조성물과 관련하여, 그리고 그 반대로 수행될 수 있는 것으로 고려된다. 추가로, 본 발명의 조성물은 본 발명의 방법을 성취하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 특정 실시형태는 예시를 통해 나타내지만 본 발명을 제한하는 것이 아님을 이해할 것이다. 본 발명의 원칙적인 특징은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 실시형태로 사용될 수 있다. 당업자는 단지 통상적인 실험, 본원에 기재된 특정 과정에 대한 다수의 등가물을 사용하여 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 상기 등가물은 본 발명의 범위내에 있는 것으로 사료되고 본원 청구항에 의해 보호된다.
본원 명세서 언급된 모든 공보 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 분야의 기술자의 기술 수준의 지표이다. 모든 공보 및 특허 출원은 본원에서 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로서 인용되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로서 인용된다.
청구항 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 연계하여 사용되는 부정관사 "a" 또는 "an"의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, 이것은 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과의"의 의미와도 상통한다. 청구항에서 용어 "또는"의 사용은 명백하게 달리 언급되지 않는 경우 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용되거나 다르게는 상호 배타적이지만 본원에 기재된 내용은 단지 대안으로 및 "및/또는"을 언급하는 정의를 지지한다. 본원 전반에 걸쳐, 상기 용어 "약"은 값이 장치, 값을 결정하기 위해 사용되는 방법에 대한 오류로 인한 고유 변동 또는 연구 피검체 중에 존재하는 변동을 포함함을 지적하기 위해 사용된다.
본 명세서 및 청구항(들)에 사용된 바와 같은, 용어 "포함하는"(및 "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)"와 같은 임의의 형태의 포함하는), "갖는"(및 "갖다(have)" 및 "갖다(has)"와 같은 임의의 형태의 갖는), "포함하는(include)"("포함하다(includes)" 및 "포함하다(include)"와 같은 임의의 형태의 포함하는) 또는 "함유하는"("함유하다(contains)" 및 "함유하다(contain)"와 같은 임의의 형태의 함유하는)은 포괄적이거나 개방적 표현(open-ended)이고 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "또는 이들의 조합"은 용어 앞에서 열거된 항목의 모든 순열 및 조합을 언급한다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 이들의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC 중 하나 이상을 포함하는 것으로 의도되고, 순서가 특정 문단에서 중요한 경우, 또한 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB이다. 상기 예와 연속적으로 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복, 예를 들어, BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등을 포함하는 조합이 표현적으로 포함된다. 당업자는 문단에서 달리 명백하지 않는 경우 임의의 조합으로 다수의 항목 또는 용어에 대해 전형적으로 제한되지 않는 것으로 이해할 것이다.
본원에 기재되고 청구된 조성물 및/또는 방법 모두는 본원에 기재된 측면에서 과도한 실험 없이 만들어지고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 실시형태의 관점에서 기재되었지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 기재된 조성물 및/또는 방법 및 상기 방법의 단계 또는 일련의 단계들에 적용될 수 있다. 당업자에게 자명한 모든 상기 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같이 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참조문헌
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) PTA-10246 20090730 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) PTA-10247 20090730
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Claims (56)

  1. 사람 또는 동물 피검체에서 예방, 치료, 또는 이들의 조합을 위해 면역 반응을 생성하기 위한 면역 자극 조성물로서,
    상기 면역 반응, 예방, 치료, 또는 이들의 임의의 조합이 요망되는 질환 또는 병태에 연루되거나 관여하는 하나 이상의 항원의 하나 이상의 에피토프를 대표하는 하나 이상의 항원성 펩타이드가 로딩되거나 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드와 화학적으로 결합된 하나 이상의 항-수지상 세포(DC) 특이적 항체 또는 이의 단편;
    TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, 및 TLR8 효능제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 톨형 수용체(TLR) 효능제; 및
    약제학적으로 허용되는 담체를 포함하고,
    여기서, 상기 접합체 및 효능제 각각은, 다른 것과 조합되어, 면역 자극을 필요로 하는 상기 사람 또는 동물 피검체에서 예방, 치료, 또는 이들의 임의의 조합을 위해 면역 반응을 제공하기에 효과적인 양으로 포함되는,
    사람 또는 동물 피검체에서 예방, 치료, 또는 이들의 조합을 위해 면역 반응을 생성하기 위한 면역 자극 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 효능성 항-CD40 항체, 효능성 항-CD40 항체 단편, CD40 리간드(CD40L) 폴리펩타이드, CD40L 폴리펩타이드 단편, 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 항체 단편, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드 단편, IFN-γ, TNF-α, 1형 사이토킨, 2형 사이토킨, 또는 이들의 조합 및 변형체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 임의의 제제를 포함하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항-DC-특이적 항체 또는 단편이 수지상 세포 면역수용체(DCIR), MHC 부류 I, MHC 부류 II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, 만노스 수용체, 랑게린, DECTIN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1, Fcγ 수용체, LOX-1, 및 ASPGR에 특이적으로 결합하는 항체로부터 선택되는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항-DC-특이적 항체가 ATCC 수탁번호 PTA 10246 또는 PTA 10247로부터 선택되는 항-DCIR 항체인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항원성 펩타이드가, gag, pol, 및 env 유전자, Nef 단백질, 역전사효소, 일련의 HIV 펩타이드(Hipo5), PSA-사량체, HIVgag-유도된 p24-PLA HIV gag p24 (gag), 및 기타 HIV 성분으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사람 면역 결핍 바이러스(HIV) 항원 및 유전자 생성물; 간염 바이러스 항원; 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, H1N1 Flu 종 기원의 인플루엔자 A 헤마글루티닌 HA-1, HLA-A201-FluMP (58-66) 펩타이드 사량체, 및 조류 Flu (HA5-1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스 항원; 씨. 써모셀룸(C. thermocellum) 기원의 독케린 도메인; 홍역 바이러스 항원; 풍진 바이러스 항원; 로타바이러스 항원; 사이토메갈로바이러스 항원; 호흡기 세포융합 바이러스 항원; 헤르페스 심플렉스 바이러스 항원; 바리셀라 조스터 바이러스 항원; 일본 뇌염 바이러스 항원; 광견병 바이러스 항원; 또는 이들의 조합 및 변형체를 포함하는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항원성 펩타이드가 백혈병 및 림프종, 신경 종양, 예를 들어, 성상세포종, 또는 교모세포종, 흑색종, 유방암, 폐암, 두경부 암, 위장 종양, 위암, 결장암, 간암, 췌장암, 비뇨생식기 종양, 예를 들어, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 질 암, 고환암, 전립선암 또는 음경암, 골 종양, 혈관 종양 또는 입술암, 비인두암, 인두암, 구강암, 식도암, 직장암, 담낭암, 담도암, 후두암, 폐 및 기관지암, 방광암, 신장암, 뇌암 및 신경계 부분의 기타 암, 갑상선암, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종 및 백혈병 기원의 항원을 포함하는 종양 관련 항원으로부터 선택되는 암 펩타이드인, 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 종양 관련 항원이 CEA, 전립선 특이적 항원(PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 및 12, MUC(뮤신)(예를 들어, MUC-1, MUC-2 등), GM2 및 GD2 갱글리오사이드, ras, myc, 티로시나제, MART(흑색종 항원), MARCO-MART, 사이클린 B1, 사이클린 D, Pmel 17(gp100), GnT-V 인트론 V 서열(N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라제 V 인트론 V 서열), 전립선 Ca psm, 전립선 혈청 항원 (PSA), PRAME (흑색종 항원), β-카테닌, MUM-1-B (흑색종 편재 돌연변이된 유전자 생성물), GAGE (흑색종 항원) 1, BAGE (흑색종 항원) 2-10, c-ERB2 (Her2/neu), EBNA (엡스타인-바 바이러스 핵 항원) 1-6, gp75, 사람 유두종 바이러스(HPV) E6 및 E7, p53, 폐 내성 단백질 (LRP), Bcl-2, 및 Ki-67로부터 선택되는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항-DC-특이적 항체가 사람화된, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 경구 경로, 비강 경로, 국소적으로, 또는 피하 주사, 정맥내 주사, 복강내 주사, 근육내 주사 또는 정맥내 주사로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 주사로서 사람 또는 동물 피검체에 투여되는, 조성물.
  10. 하나 이상의 항원성 펩타이드가 로딩되거나 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드와 화학적으로 결합된 하나 이상의 항-수지상 세포(DC)-특이적 항체 또는 이의 단편;
    TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, 및 TLR8 효능제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 톨형 수용체(TLR) 효능제; 및
    하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 및 보조제를 포함하고,
    상기 항체 및 효능제 각각은, 다른 것과 조합되어, 사람 또는 동물 피검체에서 예방, 치료, 또는 이들의 임의의 조합을 위해 면역 반응을 생성하는데 효과적인 양으로 포함되는, 백신.
  11. 제10항에 있어서, 상기 백신이 효능성 항-CD40 항체, 효능성 항-CD40 항체 단편, CD40 리간드(CD40L) 폴리펩타이드, CD40L 폴리펩타이드 단편, 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 항체 단편, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드 단편, IFN-γ, TNF-α, 1형 사이토킨, 2형 사이토킨, 또는 이들의 조합 및 변형체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 임의의 제제를 포함하는, 백신.
  12. 제10항에 있어서, 상기 항-DC-특이적 항체 또는 단편이 수지상 세포 면역수용체(DCIR), MHC 부류 I, MHC 부류 II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, 만노스 수용체, 랑게린, DECTIN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1, Fcγ 수용체, LOX-1, 및 ASPGR에 특이적으로 결합하는 항체로부터 선택되는, 백신.
  13. 제10항에 있어서, 상기 항-DC-특이적 항체가 ATCC 수탁번호 PTA 10246 또는 PTA 10247로부터 선택되는 항-DCIR 항체인, 백신.
  14. 제10항에 있어서, 상기 항원성 펩타이드가, gag, pol, 및 env 유전자, Nef 단백질, 역전사효소, 일련의 HIV 펩타이드(Hipo5), PSA-사량체, HIVgag-유도된 p24-PLA HIV gag p24 (gag), 및 기타 HIV 성분으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사람 면역 결핍 바이러스(HIV) 항원 및 유전자 생성물; 간염 바이러스 항원; 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, H1N1 Flu 종 기원의 인플루엔자 A 헤마글루티닌 HA-1, HLA-A201-FluMP (58-66) 펩타이드 사량체, 및 조류 Flu (HA5-1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스 항원; 씨. 써모셀룸(C. thermocellum) 기원의 독케린 도메인; 홍역 바이러스 항원; 풍진 바이러스 항원; 로타바이러스 항원; 사이토메갈로바이러스 항원; 호흡기 세포융합 바이러스 항원; 헤르페스 심플렉스 바이러스 항원; 바리셀라 조스터 바이러스 항원; 일본 뇌염 바이러스 항원; 광견병 바이러스 항원; 또는 이들의 조합 및 변형체를 포함하는, 백신.
  15. 제10항에 있어서, 상기 항원성 펩타이드가 CEA, 전립선 특이적 항원(PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 및 12, MUC(뮤신)(예를 들어, MUC-1, MUC-2 등), GM2 및 GD2 갱글리오사이드, ras, myc, 티로시나제, MART(흑색종 항원), MARCO-MART, 사이클린 B1, 사이클린 D, Pmel 17(gp100), GnT-V 인트론 V 서열(N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라제 V 인트론 V 서열), 전립선 Ca psm, 전립선 혈청 항원(PSA), PRAME(흑색종 항원), β-카테닌, MUM-1-B(흑색종 편재 돌연변이된 유전자 생성물), GAGE(흑색종 항원) 1, BAGE(흑색종 항원) 2-10, c-ERB2(Her2/neu), EBNA(엡스타인-바 바이러스 핵 항원) 1-6, gp75, 사람 유두종 바이러스(HPV) E6 및 E7, p53, 폐 내성 단백질(LRP), Bcl-2, 및 Ki-67로부터 선택되는 종양 관련 항원을 포함하는 암 펩타이드인, 백신.
  16. 제10항에 있어서, 상기 DC-특이적 항체가 사람화된, 백신.
  17. 제10항에 있어서, 상기 조성물이 경구 경로, 비강 경로, 국소적으로 또는 주사로서 사람 또는 동물 피검체에 투여되는, 백신.
  18. 항원 제시 세포(APC)에 의해 항원 제시의 효과를 증가시키기 위한 방법으로서,
    하나 이상의 항-수지상 세포(DC)-특이적 항체 또는 이의 단편을 분리하고 정제하는 단계;
    하나 이상의 천연 또는 가공된 항원성 펩타이드를 상기 DC-특이적 항체에 로딩하거나 화학적으로 결합시켜 항체-항원 접합체를 형성하는 단계;
    TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, 및 TLR8 효능제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 톨형 수용체(TLR) 효능제를 상기 접합체에 부가하는 단계; 및
    상기 항원 제시 세포를 상기 접합체 및 TLR 효능제와 접촉시키는 단계(이때, 상기 항체-항원 복합체가 T 세포 인식을 위해 프로세싱되고 제시된다)를 포함하는, 항원 제시 세포(APC)에 의해 항원 제시의 효과를 증가시키기 위한 방법.
  19. 제18항에 있어서, 효능성 항-CD40 항체, 효능성 항-CD40 항체 단편, CD40 리간드 (CD40L) 폴리펩타이드, CD40L 폴리펩타이드 단편, 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 항체 단편, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드 단편, IFN-γ, TNF-α, 1형 사이토킨, 2형 사이토킨, 또는 이들의 조합 및 변형체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 임의의 제제를, 상기 항원 제시 세포와 접촉시키기 전에 상기 항체-항원 접합체 및 TLR 효능제에 부가하는 단계; 및
    IFN-γ, TNF-α, IL-12p40, IL-4, IL-5, 및 IL-13으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 제제의 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 하나 이상의 제제의 수준 변화는 상기 항원 제시 세포에 의한 항원 제시 효과의 증진의 지표이다)인 임의의 단계들을 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 APC가 수지상 세포(DC)를 포함하는, 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 항-DC-특이적 항체 또는 이의 단편이 수지상 세포 면역수용체(DCIR), MHC 부류 I, MHC 부류 II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, 만노스 수용체, 랑게린, DECTTN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1, Fcγ 수용체, LOX-1, 및 ASPGR에 특이적으로 결합하는 항체로부터 선택되는, 방법.
  22. 제18항에 있어서, 상기 항-DC-특이적 항체가 ATCC 수탁번호 PTA 10246 또는 PTA 10247로부터 선택되는 항-DCIR 항체인, 방법.
  23. 제18항에 있어서, 상기 항원성 펩타이드가 gag, pol, 및 env 유전자, Nef 단백질, 역전사효소, 일련의 HIV 펩타이드(Hipo5), PSA-사량체, HIVgag-유도된 p24-PLA HIV gag p24(gag), 및 기타 HIV 성분으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사람 면역 결핍 바이러스(HIV) 항원 및 유전자 생성물; 간염 바이러스 항원; 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, H1N1 Flu 종 기원의 인플루엔자 A 헤마글루티닌 HA-1, HLA-A201-FluMP (58-66) 펩타이드 사량체, 및 조류 Flu (HA5-1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스 항원; 씨. 써모셀룸(C. thermocellum) 기원의 독케린 도메인; 홍역 바이러스 항원; 풍진 바이러스 항원; 로타바이러스 항원; 사이토메갈로바이러스 항원; 호흡기 세포융합 바이러스 항원; 헤르페스 심플렉스 바이러스 항원; 바리셀라 조스터 바이러스 항원; 일본 뇌염 바이러스 항원; 광견병 바이러스 항원; 또는 이들의 조합 및 변형체를 포함하는, 방법.
  24. 제18항에 있어서, 상기 항원성 펩타이드가 CEA, 전립선 특이적 항원(PSA), HER-2/neu, BAGE, GAGE, MAGE 1-4, 6 및 12, MUC(뮤신)(예를 들어, MUC-1, MUC-2 등), GM2 및 GD2 갱글리오사이드, ras, myc, 티로시나제, MART(흑색종 항원), MARCO-MART, 사이클린 B1, 사이클린 D, Pmel 17(gp100), GnT-V 인트론 V 서열(N-아세틸글루코아미닐트랜스퍼라제 V 인트론 V 서열), 전립선 Ca psm, 전립선 혈청 항원(PSA), PRAME(흑색종 항원), β-카테닌, MUM-1-B(흑색종 편재 돌연변이된 유전자 생성물), GAGE(흑색종 항원) 1, BAGE(흑색종 항원) 2-10, c-ERB2(Her2/neu), EBNA(엡스타인-바 바이러스 핵 항원) 1-6, gp75, 사람 유두종 바이러스(HPV) E6 및 E7, p53, 폐 내성 단백질(LRP), Bcl-2, 및 Ki-67로부터 선택되는 종양 관련 항원을 포함하는 암 펩타이드인, 방법.
  25. 제18항에 있어서, 상기 항-DC-특이적 항체가 사람화된, 방법.
  26. 하나 이상의 항원성 펩타이드가 로딩되거나 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드와 화학적으로 결합된 항-수지상 세포 면역수용체(DCIR) 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 포함하는 항-수지상 세포 면역수용체(DCIR) 모노클로날 항체 접합체;
    TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, 및 TLR8 효능제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 톨형 수용체(TLR) 효능제; 및
    하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 및 보조제를 포함하고,
    상기 접합체 및 효능제 각각은, 다른 것과 조합되어, 이를 필요로 하는 사람 또는 동물 피검체에서 하나 이상의 질환 또는 병태에 대해 예방, 치료, 또는 임의의 이들의 조합을 위해 면역 반응을 생성시키는데 효과적인 양으로 포함되는, 백신.
  27. 제26항에 있어서, 상기 백신이 사람 피검체에서 인플루엔자, HIV, 암, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 질환 또는 병태에 대한 치료, 예방, 또는 이들의 조합에 사용하기 위해 조정되는, 백신.
  28. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드가 서열번호 1을 포함하는 FluMP 펩타이드인, 백신.
  29. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드가 서열번호 2를 포함하는 MART-1 펩타이드인, 백신.
  30. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드가 서열번호 3을 포함하는 HIV gagp24 펩타이드인, 백신.
  31. 제26항에 있어서, 상기 백신이 효능성 항-CD40 항체, 효능성 항-CD40 항체 단편, CD40 리간드 (CD40L) 폴리펩타이드, CD40L 폴리펩타이드 단편, 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 항체 단편, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드 단편, IFN-γ, TNF-α, 1형 사이토킨, 2형 사이토킨, 또는 이들의 조합 및 변형체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 임의의 제제를 포함하는, 백신.
  32. 제26항에 있어서, 상기 백신이 MHC 부류 I, MHC 부류 II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, 만노스 수용체, 랑게린, DECTIN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1, Fcγ 수용체, LOX-1, 및 ASPGR에 특이적으로 결합하는 항체로부터 선택되는 임의의 항-DC-특이적 항체 또는 이의 단편을 추가로 포함하는, 백신.
  33. 사람 대상체에서 하나 이상의 질환 또는 병태에 대한 치료, 예방, 또는 이들의 조합을 위한 방법으로서, 상기 방법이
    하나 이상의 질환 또는 병태에 대한 상기 치료, 예방, 또는 이들의 조합을 필요로 하는 사람 피검체를 선별하는 단계; 및
    예방, 치료, 또는 이들 모두가 요망되는 하나 이상의 질환 또는 병태에 연루되거나 관여된 하나 이상의 항원의 하나 이상의 에피토프를 대표하는 하나 이상의 항원성 펩타이드가 로딩되거나 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드와 화학적으로 결합된 항-수지상 세포 면역수용체(DCIR) 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 포함하는 항-수지상 세포 면역수용체(DCIR) 모노클로날 항체 접합체; TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, 및 TLR8 효능제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 톨형 수용체(TLR) 효능제; 및 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 및 보조제를 포함하는 백신 조성물(여기서, 상기 접합체 및 효능제 각각은, 다른 것과 조합되어, 상기 사람 피검체에서 하나 이상의 질환 또는 병태에 대한 예방, 치료, 또는 이들의 임의의 조합을 위해 면역 반응을 생성시키는데 효과적인 양으로 포함된다)을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 하나 이상의 질환 또는 병태가 인플루엔자, 암, HIV, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 암이 백혈병 및 림프종, 신경 종양, 예를 들어, 성상세포종, 또는 교모세포종, 흑색종, 유방암, 폐암, 두경부 암, 위장 종양, 위암, 결장암, 간암, 췌장암, 비뇨생식기 종양, 예를 들어, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 질 암, 고환암, 전립선암 또는 음경암, 골 종양, 혈관 종양 또는 입술암, 비인두암, 인두암, 구강암, 식도암, 직장암, 담낭암, 담도암, 후두암, 폐 및 기관지암, 방광암, 신장암, 뇌암 및 신경계 부분의 기타 암, 갑상선암, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종 및 백혈병으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드가 서열번호 1을 포함하는 FluMP 펩타이드인, 방법.
  37. 제33항에 있어서, 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드가 서열번호 2를 포함하는 MART-1 펩타이드인, 방법.
  38. 제33항에 있어서, 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드가 서열번호 3을 포함하는 HIV gagp24 펩타이드인, 방법.
  39. 제33항에 있어서, 상기 백신이 효능성 항-CD40 항체, 효능성 항-CD40 항체 단편, CD40 리간드 (CD40L) 폴리펩타이드, CD40L 폴리펩타이드 단편, 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 항체 단편, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드 단편, IFN-γ, TNF-α, 1형 사이토킨, 2형 사이토킨, 또는 이들의 조합 및 변형체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 임의의 제제를 포함하는, 방법.
  40. 제33항에 있어서, 상기 백신이 MHC 부류 I, MHC 부류 II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, 만노스 수용체, 랑게린, DECTIN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1, Fcγ 수용체, LOX-1, 및 ASPGR에 특이적으로 결합하는 항체로부터 선택되는 임의의 항-DC-특이적 항체 또는 이의 단편을 추가로 포함하는, 방법.
  41. 제33항에 있어서, 상기 백신이 경구 경로, 비강 경로, 국소적으로 또는 주사로서 사람 피검체에게 투여되는, 방법.
  42. 사람 피검체에서 하나 이상의 수지상 세포(DC)에 의한 항원 제시 효과를 증가시키기 위한 방법으로서, 상기 방법이
    사람으로부터 하나 이상의 DC를 분리하는 단계;
    하나 이상의 항원성 펩타이드가 로딩되거나 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드와 화학적으로 결합된 항-수지상 세포 면역수용체(DCIR) 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 포함하는 항-수지상 세포 면역수용체(DCIR) 모노클로날 항체 접합체; TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, 및 TLR8 효능제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 톨형 수용체(TLR) 효능제; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 활성화 양의 조성물 또는 백신에, 상기 분리된 DC를 노출시켜 활성화된 DC 복합체를 형성하는 단계; 및
    상기 활성화된 DC 복합체를 사람 피검체에게 재도입하는 단계
    를 포함하는, 사람 피검체에서 하나 이상의 수지상 세포(DC)에 의한 항원 제공 효과를 증가시키기 위한 방법.
  43. 제42항에 있어서, IFN-γ, TNF-α, IL-12p40, IL-4, IL-5, 및 IL-13으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 제제의 수준을 측정하는 임의의 단계(여기서, 상기 하나 이상의 제제의 수준의 변화는 상기 하나 이상의 DC의 효과가 증가하였음의 지표이다)를 추가로 포함하는, 방법.
  44. 제42항에 있어서, 효능성 항-CD40 항체, 효능성 항-CD40 항체 단편, CD40 리간드 (CD40L) 폴리펩타이드, CD40L 폴리펩타이드 단편, 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 항체 단편, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드 단편, IFN-γ, TNF-α, 1형 사이토킨, 2형 사이토킨, 또는 이들의 조합 및 변형체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 임의의 제제를, 상기 DC 노출 전에 상기 접합체 및 상기 TLR 효능제에 부가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  45. 제42항에 있어서, MHC 부류 I, MHC 부류 II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, 만노스 수용체, 랑게린, DECTIN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1, Fcγ 수용체, LOX-1, 및 ASPGR에 특이적으로 결합하는 항체로부터 선택된 하나 이상의 임의의 항-DC-특이적 항체 또는 이의 단편을 부가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  46. 제42항에 있어서, 상기 항원성 펩타이드가 하나 이상의 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 항원 및 유전자 생성물, 하나 이상의 암 펩타이드 및 종양 관련 항원 또는 이 모두를 포함하는, 방법.
  47. 하나 이상의 바이러스, 세균, 진균류, 기생충, 원생동물, 기생충 질환 및 알레르기 장애에 대한 예방, 치료, 또는 이들의 조합을 위해 하나 이상의 수지상 세포(DC)의 활성화에 의한 면역자극을 사람 피검체에게 제공하는 방법으로서, 상기 방법이
    하나 이상의 바이러스, 세균, 진균류, 기생충, 원생동물, 기생충 질환 및 알레르기 장애에 대한 예방, 치료, 또는 이들의 조합을 위해 면역자극을 필요로 하는 사람 피검체를 선별하는 단계;
    상기 사람 피검체로부터 하나 이상의 DC를 분리하는 단계;
    하나 이상의 항원성 펩타이드가 로딩되거나 상기 하나 이상의 항원성 펩타이드와 화학적으로 결합된 항-수지상 세포 면역 수용체(DCIR) 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 포함하는 항-수지상 세포 면역수용체(DCIR) 모노클로날 항체 접합체; TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, 및 TLR8 효능제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 톨형 수용체(TLR) 효능제; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 활성화 양의 조성물 또는 백신에, 상기 분리된 DC를 노출시켜 활성화된 DC 복합체를 형성하는 단계; 및
    상기 활성화된 DC 복합체를 상기 사람 피검체로 재도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, IFN-γ, TNF-α, IL-12p40, IL-4, IL-5, 및 IL-13으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 제제의 수준을 측정하는 임의의 단계(여기서, 상기 하나 이상의 제제의 수준의 변화는 면역자극의 지표이다)를 추가로 포함하는, 방법.
  49. 제47항에 있어서, 효능성 항-CD40 항체, 효능성 항-CD40 항체 단편, CD40 리간드 (CD40L) 폴리펩타이드, CD40L 폴리펩타이드 단편, 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 항체 단편, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드, 4-1BB 리간드 폴리펩타이드 단편, IFN-γ, TNF-α, 1형 사이토킨, 2형 사이토킨, 또는 이들의 조합 및 변형체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 임의의 제제를, 상기 DC 노출 전에 상기 접합체 및 상기 TLR 효능제에 부가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  50. 제47항에 있어서, MHC 부류 I, MHC 부류 II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC- ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, 만노스 수용체, 랑게린, DECTIN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ 수용체 및 IL-2 수용체, ICAM-1, Fcγ 수용체, LOX- 1, 및 ASPGR에 특이적으로 결합하는 항체로부터 선택된 하나 이상의 임의의 항-DC-특이적 항체 또는 이의 단편을 부가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  51. 제47항에 있어서, 상기 항원성 펩타이드가 백일해 독소, 필라멘트형 헤마글루티닌, 퍼탁틴, FIM2, FIM3, 아데닐레이트 사이클라제 및 다른 백일해 세균 항원 성분, 디프테리아 세균 항원, 디프테리아 독소 또는 톡소이드, 다른 디프테리아 세균 항원 성분, 파상풍 세균 항원, 파상풍 독소 또는 톡소이드, 다른 파상풍 세균 항원 성분, 스트렙토코커스 세균 항원, 그람-음성 바실리 세균 항원, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 세균 항원, 마이콜산, 열 쇼크 단백질 65 (HSP65), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 세균 항원 성분; 폐렴 구균성 세균 항원, 해모필러스 인플루엔자 세균 항원, 탄저병 세균 항원 및 리케치아 세균 항원으로부터 선택되는 세균성 항원을 포함하는, 방법.
  52. 제47항에 있어서, 상기 항원성 펩타이드가 캔디다 진균류 항원 성분, 히스토플라스마 진균류 항원, 크립토코커스 진균류 항원, 콕시디오이데스 진균류 항원 및 백선 진균류 항원으로부터 선택되는 진균류 항원을 포함하는, 방법.
  53. 제47항에 있어서, 상기 항원성 펩타이드가, 플라스모디움 팔시파룸(plasmodium falciparum) 항원, 포자소체 표면 항원, 외주포자소체(circumsporozoite) 항원, 생식모세포/생식세포(gametocyte/gamete) 표면 항원, 혈액-단계 항원 pf 155/RESA, 톡소플라스마, 주혈흡충(schistosomae) 항원, 리슈마니아 메이저(leishmania major) 및 기타 리슈마니아 항원 및 트리파노소마 크루지(trypanosoma cruzi) 항원으로부터 선택되는 원생동물 및 기생충 항원을 포함하는, 방법.
  54. 제47항에 있어서, 상기 항원성 펩타이드가, 자가면역 질환에; 알레르기에; 및 당뇨병, 진성 당뇨병, 관절염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 전신 홍반성 낭창, 자가면역 갑상선염, 피부염, 건선, 쇼그렌 증후군, 원형탈모증, 곤충 물림 반응으로 인한 알레르기 반응, 크론 질환, 아프타 궤양(aphthous ulcer), 홍채염, 결막염, 각결막염, 궤양성 대장염, 천식, 알레르기성 천식, 피부 홍반성 낭창, 경피증, 질염, 직장항문염, 약진, 나병 역전 반응, 나성 결절 홍반, 자가면역 포도막염, 알레르기성 뇌막염, 급성 괴사 출혈 뇌병변, 특발성 양측 진행성 감각신경성 난청, 재생불량 빈혈, 순수 적혈구 세포 빈혈, 특발성 혈소판감소증, 다발연골염, 베게너 육아종증, 만성 활성 간염, 스티븐스-존슨 증후군, 특발성 스푸루(idiopathic sprue), 편평 태선, 크론 질환, 그레이브스 안병증(Graves ophthalmopathy), 유육종증, 원발성 담즙성 간경변증, 후부 포도막염, 및 간질성 폐 섬유증으로부터 선택된 이식 거부에 관여하는 항원들을 포함하는, 방법.
  55. 제47항에 있어서, 상기 항원성 펩타이드가 일본 삼나무 꽃가루(Japanese cedar pollen) 항원, 두드러기쑥 꽃가루 항원, 호밀 잔디 꽃가루 항원, 동물 유도된 항원, 먼지 진드기 항원, 고양이 항원, 조직적합성 항원, 및 페니실린 및 기타 치료학적 약물로부터 선택되는 알레르기 장애에 관여하는 항원을 포함하는, 방법.
  56. 제47항에 있어서, 상기 DC-특이적 항체가 사람화된, 방법.
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