WO2021100756A1 - 免疫チェックポイント阻害抗体 - Google Patents

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WO2021100756A1
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antibody
cancer
seq
cells
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克明 佐藤
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国立大学法人宮崎大学
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    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Definitions

  • the present invention relates to an immune checkpoint inhibitory antibody.
  • cancer antigens Since the discovery of cancer antigens, various studies have been underway toward the development of cancer immunotherapy. In conventional cancer immunotherapy, various adjuvants, cancer antigen proteins and cancer antigen peptides are used to induce an anti-tumor immune response. However, since most cancer antigens are normal self-antigens, their immunogenicity is weak, and in addition, the immune control mechanism that suppresses the immune response to the self-antigen (autoimmunity) also suppresses the immune response to the cancer antigen. It is becoming clear that there is. Such an immune control mechanism is carried by a molecule called an "immune checkpoint molecule".
  • Immune checkpoint molecules negatively regulate antitumor immune responses and autoimmune responses, and examples include CTLA-4 and PD-1 expressed on T cells (Non-Patent Document 1).
  • An immunotherapeutic method using an inhibitory antibody against these "immune checkpoint molecules” has been attempted (Non-Patent Document 1).
  • inhibition of the immune checkpoint molecule "CTLA-4 / PD-1 system” expressed on T cells causes adverse events such as autoimmune-like pathology caused by activation of immune response to self as well as cancer. It is feared that.
  • immune checkpoint inhibitors in addition to overcoming cancer non-responsiveness, reduction of immune-related adverse events (immune-related adverse events: irAEs) caused by disruption of autoimmune tolerance should be achieved. Is also required.
  • Dendritic cells are lineage marker-negative, major histocompatibility complex class II-positive antigen-presenting cells with dendritic processes, and are characterized by conventional dendritic cells (conventional DCs; cDCs). It is composed of subpopulations that are roughly divided into cell-like dendritic cells (plasmacytoid DCs; pDCs). In the inflammatory state, dendritic cells activate the immune system through the induction of antigen-specific effector T cells as the most powerful antigen-presenting cells that connect spontaneous immunity and adaptive immunity.
  • regulatory T regulatory T
  • Treg regulatory T
  • Non-Patent Documents 2 and 3 have succeeded in producing immunosuppressive dendritic cells having a remarkable T cell regulatory function even in an inflammatory state under specific culture conditions in humans and mice.
  • Clec4A4 (DCIR2)
  • DCIR2 C-type lectin receptor family
  • An object of the present invention is to provide an immune checkpoint inhibitory antibody based on a new mechanism, which is useful for activating an antitumor immune response.
  • the present invention includes the following.
  • a peptide fragment consisting of an amino acid sequence having a length of 15 amino acids including QNLQEESAYF (SEQ ID NO: 16) on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and SSNCYFISTESASW (SEQ ID NO: 18) on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are included.
  • the antitumor agent according to the above [9] which is used in combination with an inhibitor against an immune checkpoint molecule expressed on T cells.
  • the antitumor agent according to the above [9] further comprising an inhibitor against an immune checkpoint molecule expressed on T cells.
  • the antitumor agent according to the above [10] or [11], wherein the immune checkpoint molecule expressed on T cells is PD-1.
  • the antitumor agent according to any one of the above [10] to [12], wherein the inhibitor against the immune checkpoint molecule expressed on T cells is an anti-PD-1 antibody.
  • an antibody capable of activating an antitumor immune response by inhibiting an immune checkpoint and producing an antitumor effect.
  • FIG. 1 shows OVA-specific T cells (CD44 high OVA-MHC class I pentamer-binding CD8) in cancer-vaccinated or non-cancer-vaccinated WT mice and Clec4A4-deficient mice (non-cancer-bearing and cancer-bearing mice). + The results of analysis by the flow cytometry method for the induction of T cells) are shown.
  • a dot plot displays the OVA-MHC class I pentamer CD44, X axis to the Y axis, B denotes the percentage (%) of CD44 high OVA-MHC class I pentamer binding CD8 + T cells in CD8 + T cells ..
  • FIG. 2 shows OVA-specific T cells (OVA-specific IFN- ⁇ -producing CD8 + T) in cancer-vaccinated or non-cancer-vaccinated WT mice and Clec4A4-deficient mice (non-cancer-bearing and cancer-bearing mice). The results of analysis by the flow cytometry method for the induction of cells) are shown.
  • A represents CD8a
  • dot plot displays the IFN-gamma in the X axis
  • B is the percentage of OVA specific IFN-gamma-producing CD8 + T cells in CD8 + T cells (%) in the Y-axis.
  • * P ⁇ 0.01 (comparison with WT mice, or between non-cancer-bearing and cancer-bearing groups in WT and Clec4A4-deficient mice).
  • FIG. 3 shows the evaluation results of cancer progression in cancer-bearing WT mice and Clec4A4-deficient mice with or without cancer vaccine.
  • A shows a photograph of a cancer-bearing mouse 18 days after cancer cell transplantation and a tumor volume (mm 3 ).
  • FIG. 4 shows the regulatory function of Clec4A4 on immune cell dynamics. Immune cell dynamics in spleen (A) and cancer tissue (B) of non-cancer-bearing or cancer-bearing (B16-OVA) WT mice and Clec4A4-deficient mice (Clec4a4 - / -) 20 days after cancer cell transplantation I evaluated it later.
  • the proportion of each immune cell in the spleen cells was analyzed by flow cytometry (A).
  • the proportion of each immune cell in tumor-infiltrating leukocytes was analyzed by flow cytometry (B).
  • the expression of each cell surface molecule is shown in a dot plot.
  • the leftmost column is CD11c (X axis) and SiglecH (Y axis)
  • the second column from the left is B220 (X axis) and Gr-1 (Y axis)
  • the center column is F4 / 80 (X).
  • FIG. 5 shows the regulatory function of Clec4A4 on lymphoid tissue T cell activation.
  • T cell dynamics in the spleen of non-cancer-bearing or cancer-bearing (B16-OVA) WT mice and Clec4A4-deficient mice (Clec4a4 - / - ) were evaluated 20 days after cancer cell transplantation.
  • each cell surface molecule of spleen CD4 + T cells (A) and spleen CD8 + T cells (B) was analyzed by flow cytometry. The expression of each cell surface molecule is shown in a histogram. In A and B, the left column shows the expression of CD44 and the right column shows the expression of CD62L.
  • FIG. 6 shows the regulatory function of Clec4A4 on tumor infiltrating T cell activation. T cell dynamics in cancer tissues of cancer-bearing (B16-OVA) WT mice and Clec4A4-deficient mice (Clec4a4 - / - ) were evaluated 20 days after cancer cell transplantation.
  • each cell surface molecule of tumor infiltrating CD4 + T cell (A) and tumor infiltrating CD8 + T cell (B) was analyzed by flow cytometry. The expression of each cell surface molecule is shown in a histogram. In A and B, the left column shows the expression of CD44 and the right column shows the expression of CD62L.
  • FIG. 7 shows the regulatory function of Clec4A4 on splenic dendritic cell activation. Dendritic cell dynamics in the spleen of non-cancer-bearing or cancer-bearing (B16-OVA) WT mice and Clec4A4-deficient mice (Clec4a4 - / - ) were evaluated 20 days after cancer cell transplantation.
  • each cell surface molecule of spleen dendritic cells was analyzed by flow cytometry.
  • the expression of each cell surface molecule is shown in a histogram.
  • A the leftmost column shows the expression of MHC-I
  • the second column from the left shows the expression of MHC-II
  • the middle column shows the expression of CD40
  • the second column from the right shows the expression of CD80
  • the rightmost column shows the expression of CD86.
  • the leftmost column shows the expression of CD11c
  • the second column from the left shows the expression of Clec4A4
  • the middle column shows the expression of B7-H1
  • the second column from the right shows the expression of B7-H2
  • the rightmost column shows the expression of B7-DC.
  • Clec4A4 shows the regulatory function of Clec4A4 on tumor infiltrating dendritic cell activation.
  • Dendritic cell dynamics in cancer tissues of cancer-bearing (B16-OVA) WT mice and Clec4A4-deficient mice (Clec4a4 - / - ) were evaluated 20 days after cancer cell transplantation.
  • the expression of each cell surface molecule of tumor-infiltrated dendritic cells was analyzed by flow cytometry.
  • the expression of each cell surface molecule is shown in a histogram.
  • FIG. 9 is a diagram showing the expression state of CLEC4A in immune cells derived from healthy human peripheral blood.
  • A shows the expression of the cell surface molecule CLEC4A in CD3 + T cells, CD19 + B cells, CD11c + dendritic cells, CD14 + monocytes, and CD56 + NK cells in the peripheral blood mononuclear cell fraction in a histogram.
  • B shows the expression of cell surface molecules CD141, CD1c, CD303, CD11c, HLA-DR, and CLEC4A in the peripheral blood mononuclear bulb fraction in a histogram.
  • C is the cell surface molecules CD11c, CD40, CD80, CD86, HLA-DR, and CLEC4A in peripheral blood monocytes, peripheral blood monocyte-derived dendritic cells, and peripheral blood monocyte-derived immunosuppressive dendritic cells (DCreg).
  • FIG. 10 is a dot plot showing the expression of GFP and CLEC4A in transgenic cell lines.
  • A is a mouse dendritic cell line DC2.4 (DC2.4 in the figure), a control retrovirus-infected cell line (Mock-GFP in the figure), and a CLEC4A-expressing cell line (CLEC4A-GFP in the figure).
  • the expression of GFP (X-axis) and CLEC4A (Y-axis) is shown.
  • B is a mouse dendritic cell line DC2.4, a sugar chain modification site substitution mutant-expressing cell line (CLEC4A N185Q -GFP in the figure), and a CRD-EPS-deficient mutant-expressing cell line (CLEC4A ⁇ E195-S197-in the figure).
  • GFP extracellular region-deficient mutant-expressing cell line
  • ITIM Immunoreceptor tyrosine-based Inhibition motif sequence-deficient mutant-expressing cell line (CLEC4A ⁇ I5-V10 -GFP in the figure)
  • the expression of GFP and CLEC4A is shown.
  • A indicates the amount of IL-6 produced in the culture supernatant in LPS-stimulated or unstimulated CLEC4A or mutant transgenic cell lines.
  • B indicates the amount of TNF- ⁇ produced in the culture supernatant in LPS-stimulated or unstimulated CLEC4A or mutant transgenic cell lines.
  • C indicates the amount of IL-6 produced in the culture supernatant in CpG-B ODN 1668 stimulated or unstimulated CLEC4A or mutant transgenic cell lines.
  • D indicates the amount of TNF- ⁇ produced in the culture supernatant in CpG-B ODN 1668 stimulated or unstimulated CLEC4A or mutant transgenic cell lines.
  • FIG. 12 shows the position of the antibody binding sequence (thin underlined portion) constituting the epitopes of CLEC4A function-inhibiting antibodies # 1 to # 4 on the primary sequence of CLEC4A protein.
  • the EPS motif within the glycan recognition domain (CRD) is underlined thickly.
  • the N-type sugar chain modification site (N185) is indicated by an arrow.
  • FIG. 13 shows CLEC4A expression in pancreatic mononuclear cells of CLEC4A-expressing transgenic mice.
  • A is a histogram showing the expression of CLEC4A in CD3 + T cells, CD19 + B cells, CD11b + macrophages, CD11c + dendritic cells, and NK1.1 + NK cells in splenic mononuclear cells. From left to right, each column of A shows CD3 + T cells, CD19 + B cells, CD11b + macrophages, CD11c + dendritic cells, and NK1.1 + NK cells.
  • B shows the expression of CLEC4A in the spleen dendritic cell subpopulation (CD11c + CD8 ⁇ + cDC1 cells, CD11c + CD4 + cDC2 cells, and CD11c + SiglecH + pDC cells) in a histogram.
  • FIG. 14 shows the regulation of CLEC4A function-inhibiting antibodies # 1 to # 4 on cancer progression in cancer-bearing CLEC4A-expressing transgenic mice.
  • A is a photograph showing the appearance of the tumor 13 days after the cancer cell transplantation.
  • B and C indicate the tumor volume 13 days (B) and 22 days (C) after cancer cell transplantation. * P ⁇ 0.01 (compared to control mouse IgG-treated group).
  • FIG. 15 shows the time course of tumor volume 22 days after cancer cell transplantation in cancer-bearing CLEC4A-expressing transgenic mice.
  • FIG. 16 shows the change in body weight 22 days after cancer cell transplantation in cancer-bearing mice.
  • FIG. 17 shows the results of analysis of the accumulation of CD4 + T cells and CD8 + T cells in the cancer tissue derived from the cancer-bearing mouse by the flow cytometry method. The expression of each cell surface molecule is shown in a dot plot. The numbers indicate the percentage of CD4 + T cells or CD8 + T cells in the tumor infiltrating leukocytes.
  • FIG. 18 shows the results of tissue staining of each organ of the cancer-bearing mouse 21 days after the cancer cell transplantation.
  • FIG. 19 shows the results of cancer progression evaluation.
  • A shows the time course of the tumor volume of the cancer-bearing mouse for 21 days after the cancer cell transplantation.
  • B shows the tumor volume in the cancer-bearing mouse 21 days after the cancer cell transplantation.
  • C shows photographs of cancer-bearing mice and excised tumors 21 days after cancer cell transplantation. * P ⁇ 0.01; Comparison with untreated group, comparison between each experimental group.
  • FIG. 20 shows the analysis results of cells in cancer tissue. A: The expression of each cell surface molecule is shown by a dot plot.
  • the leftmost column of A is CD11c (X-axis) and SiglecH (Y-axis), the second column from the left is B220 (X-axis) and Gr-1 (Y-axis), and the third column from the left is F4 / 80 (F4 / 80 (Y-axis).
  • the third column from the right is NK1.1 (X-axis) and CD3 (Y-axis)
  • the second column from the right is CD4 (X-axis) and CD3 (Y-axis)
  • the rightmost column shows the expression of CD8 (X-axis) and CD3 (Y-axis).
  • B Shows the expression level of each immunosuppressive molecule in cancer tissue. * P ⁇ 0.01; Comparison with untreated group, comparison between each experimental group.
  • the present invention is based on the function of CLEC4A as an immune checkpoint molecule. More specifically, the present invention relates to an antibody having an immune checkpoint inhibitory action that specifically binds to the extracellular region of a human CLEC4A protein. The present invention also relates to the activation of an anti-tumor immune response based on immune checkpoint inhibition and the therapeutic or prophylactic use thereof for cancer using such an antibody, as well as an anti-tumor agent.
  • CLEC4A is a protein called C-type Lectin Domain Family 4 Member A (C-type Lectin Domain Family 4 Member A).
  • CLEC4A is an immune checkpoint molecule expressed in antigen-presenting cells such as dendritic cells, has an immunosuppressive function that negatively controls the activation of antigen-presenting cells, and negatively controls the cancer immune response.
  • the antibody having an immune checkpoint inhibitory action binds to the human CLEC4A protein and inhibits the function of CLEC4A as an immune checkpoint molecule. Therefore, hereinafter, it is also referred to as a CLEC4A function inhibitory antibody.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody according to the present invention binds to the extracellular region of human CLEC4A protein, and preferably specifically binds to inhibit its function.
  • a CLEC4A function-inhibiting antibody can bind to the endogenous CLEC4A protein of the subject to which it is administered and inhibit its function.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody binds to the CLEC4A protein expressed on the cell surface of antigen-presenting cells such as dendritic cells, B cells (CD19 + B cells), monocytes (CD14 + monocytes). It can inhibit the function of the CLEC4A protein as an immune checkpoint molecule.
  • antigen-presenting cells such as dendritic cells, B cells (CD19 + B cells), monocytes (CD14 + monocytes). It can inhibit the function of the CLEC4A protein as an immune checkpoint molecule.
  • the human CLEC4A protein may be a human CLEC4A protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a functional variant thereof.
  • the CLEC4A protein has 90% or more, 93% or more, 95% or more, or 98% or more, preferably 99% or more, for example, 99.5% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence thereof. It may consist of an amino acid sequence having, and preferably retains an immune checkpoint function (function as an immune checkpoint molecule in an antigen-presenting cell such as a dendritic cell).
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody according to the present invention may be one that specifically binds to the extracellular region of the human CLEC4A protein.
  • the extracellular region of the human CLEC4A protein is typically the region from position 69 to position 237 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 12), or the amino acid sequence of another CLEC4A protein. Refers to the area aligned with that area.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody may be one that binds (preferably specifically) to a carbohydrate-recognition domain (CRD) within the extracellular region of the CLEC4A protein.
  • CCD carbohydrate-recognition domain
  • the sugar chain recognition domain in the extracellular region of the CLEC4A protein is the region from the 107th (Phe) to the 237th (Leu) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or the amino acid sequence of another CLEC4A protein. In, it shall refer to the area aligned with that area.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody is an amino acid sequence (SEQ ID NO:) from position 113 (Phe) to position 192 (His) of the CLEC4A protein (preferably a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2). It may be one that binds (preferably specifically binds) to a region containing or consisting of 21).
  • the sugar chain recognition domain (CRD) in the extracellular region of the CLEC4A protein has an EPS motif (Glu-Pro-Ser) at positions 195 to 197 of the amino acid sequence (human CLEC4A protein) shown in SEQ ID NO: 2.
  • the ITIM sequence in the intracellular region of the human CLEC4A protein refers to the region located at the 5th to 10th positions of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody (antibody or antigen-binding fragment thereof) according to the present invention comprises an amino acid sequence having a length of 15 amino acids including WVDQTPYNESSTFW (SEQ ID NO: 15) on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. It can (specifically) bind to a peptide fragment, i.e., a peptide fragment consisting of QWVDQTPYNESSTFW (SEQ ID NO: 22) and a peptide fragment consisting of WVDQTPYNESSTFWH (SEQ ID NO: 23).
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody specifically binds to an epitope comprising the amino acid sequence WVDQTPYNESSTFW (SEQ ID NO: 15) of the human CLEC4A protein, preferably a linear (continuous) epitope.
  • the present invention is a peptide fragment containing or consisting of the amino acid sequence WVDQTPYNESSTFW (SEQ ID NO: 15) (for example, but not limited to, a peptide having a length of 14 to 20 amino acids, 14 to 15 amino acids, or 14 amino acids. ), which is an antibody that specifically binds to (), provides a CLEC4A function-inhibiting antibody.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody (antibody or antigen-binding fragment thereof) according to the present invention is derived from an amino acid sequence having a length of 15 amino acids including QNLQEESAYF (SEQ ID NO: 16) on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Can (specifically) bind to the peptide fragment.
  • this CLEC4A function-inhibiting antibody includes amino acid sequences QDFIFQNLQEESAYF (SEQ ID NO: 24), DFIFQNLQEESAYFV (SEQ ID NO: 25), FIFQNLQEESAYFVG (SEQ ID NO: 26), IFQNLQEESAYFVGL (SEQ ID NO: 27), FQNLQEESAYFVGLS (SEQ ID NO: 28), and QNLQ. It can bind to a peptide fragment consisting of each of 29).
  • the present invention is a peptide fragment containing or consisting of the amino acid sequence QNLQEESAYF (SEQ ID NO: 16) (for example, but not limited to, a peptide having a length of 10 to 20 amino acids, a length of 10 to 15 amino acids, or a length of 10 amino acids. ), which is an antibody that specifically binds to (), provides a CLEC4A function-inhibiting antibody.
  • QNLQEESAYF SEQ ID NO: 16
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody is a peptide fragment containing or consisting of the amino acid sequence QNLQEESAYF (SEQ ID NO: 16) (for example, but not limited to, 10 to 20 amino acids in length, 10).
  • QNLQEESAYF amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 16 amino acid sequence
  • a peptide fragment consisting of a 15 amino acid long amino acid sequence containing QNLQEESAYF (SEQ ID NO: 16) on the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 for example, a peptide having a length of ⁇ 15 amino acids or 10 amino acids.
  • Such CLEC4A function-inhibiting antibody is preferably an antibody that binds to a discontinuous epitope of human CLEC4A protein, and in particular, an amino acid sequence containing FSSNCYFISTESASW (SEQ ID NO: 17) and QNLQEESAYF (SEQ ID NO: 16) of human CLEC4A protein (SEQ ID NO: 16).
  • an antibody that (specifically) binds to a discontinuous epitope composed of (the 113th to 164th amino acid sequences of SEQ ID NO: 2) is more preferable.
  • Such a discontinuous epitope contains at least some amino acid residues of the amino acid sequences FSSNCYFISTESASW (SEQ ID NO: 17) and QNLQEESAYF (SEQ ID NO: 16) as sites recognized by the CLEC4A function-inhibiting antibody, preferably amino acids. It contains at least some amino acid residues of the sequence FSSNCYFISTESASW (SEQ ID NO: 17) and the entire amino acid sequence QNLQEESAYF (SEQ ID NO: 16).
  • This CLEC4A function-inhibiting antibody may not bind to the peptide fragment consisting of SSNCYFISTESASWQ (SEQ ID NO: 30).
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody is a peptide fragment containing or consisting of the amino acid sequence QNLQEESAYF (SEQ ID NO: 16) (not limited to the following, but for example, 10 to 20 amino acids in length). , 10-15 amino acid length, or 10 amino acid length peptide), for example, in addition to being able to bind to a peptide fragment consisting of a 15 amino acid length amino acid sequence containing QNLQEESAYF (SEQ ID NO: 16) on the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • a peptide fragment containing or consisting of the amino acid sequence SSNCYFISTESASW (SEQ ID NO: 18) (for example, but not limited to, a peptide having a length of 14 to 20 amino acids, 14 to 15 amino acids, or 14 amino acids).
  • SSNCYFISTESASW SEQ ID NO: 18
  • it may be capable of (specifically) binding to a peptide fragment consisting of an amino acid sequence having a length of 15 amino acids including SSNCYFISTESASW (SEQ ID NO: 18) on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody can bind to a peptide fragment consisting of the amino acid sequence FSSNCYFISTESASW (SEQ ID NO: 17) or SSNCYFISTESASWQ (SEQ ID NO: 30), respectively.
  • a CLEC4A function-inhibiting antibody is preferably an antibody that binds to a discontinuous epitope of the human CLEC4A protein, and contains an amino acid sequence (eg, SEQ ID NO: 16) containing the human CLEC4A protein SSNCYFISTESASW (SEQ ID NO: 18) and QNLQEESAYF (SEQ ID NO: 16).
  • a discontinuous epitope composed of (the 114th to 164th amino acid sequences of SEQ ID NO: 2).
  • a discontinuous epitope contains at least some amino acid residues of the amino acid sequences SSNCYFISTESASW (SEQ ID NO: 18) and QNLQEESAYF (SEQ ID NO: 16) as sites recognized by the CLEC4A function-inhibiting antibody, preferably SSNCYFISTESASW (SEQ ID NO: 16).
  • SSNCYFISTESASW SEQ ID NO: 16
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody (antibody or antigen-binding fragment thereof) according to the present invention has an amino acid sequence having a length of 15 amino acids including KKNMPVEETAWSCC (SEQ ID NO: 19) on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. It can (specifically) bind to a peptide fragment consisting of, i.e., a peptide fragment consisting of VKKNMPVEETAWSCC (SEQ ID NO: 31) and a peptide fragment consisting of KKNMPVEETAWSCCP (SEQ ID NO: 32).
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody specifically binds to an epitope (eg, consisting of that sequence), preferably a linear (continuous) epitope, comprising the amino acid sequence KKNMPVEETAWSCC (SEQ ID NO: 19) of the human CLEC4A protein. ..
  • the present invention is a peptide fragment containing or consisting of the amino acid sequence KKNMPVEETAWSCC (SEQ ID NO: 19) (for example, but not limited to, a peptide having a length of 14 to 20 amino acids, 14 to 15 amino acids, or 14 amino acids. ), which is an antibody that specifically binds to (), provides a CLEC4A function-inhibiting antibody.
  • the "peptide fragment” may refer to a peptide that is a fragment of a predetermined protein (particularly, a full-length CLEC4A protein) or a synthetic peptide corresponding thereto.
  • the term “peptide fragment” can be used interchangeably with the term "peptide”.
  • the peptide fragment or peptide in the present invention may be an oligopeptide.
  • the oligopeptide refers to a peptide having a length of 2 to 20 amino acids.
  • amino acid residues and amino acid sequences are described according to the one-letter notation or three-letter notation generally used in the art.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody according to the present invention may be any class of immunoglobulin molecule, such as IgG, IgE, IgM, IgA, IgD, or IgY, and further any subclass, such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, It may be IgA1, IgA2 or the like.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody may be in any antibody form, for example, multispecific antibody (such as bispecific antibody), recombinant antibody, human antibody, humanized antibody, chimeric antibody, single chain antibody, mini. It may be a body, a diamond body, a tria body, or the like.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody may also be a total antibody or an antigen-binding fragment of the total antibody, such as Fab, F (ab') 2 , Fab', Fv, scFv, sdFv and the like.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody may be subjected to any modification such as glycosylation, acetylation, formylation, amidation, phosphorylation, or PEGylation.
  • CLEC4A function-inhibiting antibody can be prepared by a conventional method.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody can be produced based on a known antibody production method.
  • an antigen capable of inducing the production of CLEC4A function-inhibiting antibody is administered subcutaneously, in the footpad, intraperitoneally, or the like of an animal for immunization.
  • an antigen is an antigen comprising a target sequence (eg, an epitope or part thereof) in a human CLEC4A protein to which a CLEC4A function-inhibiting antibody binds, and is not limited to, but is limited to, a full-length human CLEC4A protein, the above.
  • a human CLEC4A protein fragment containing a target sequence a polypeptide consisting of the target sequence, an antigen containing the target sequence (eg, a polypeptide consisting of a human CLEC4A protein partial sequence containing the target sequence and an immunoglobulin Fc molecule).
  • an antigen containing the target sequence eg, a polypeptide consisting of a human CLEC4A protein partial sequence containing the target sequence and an immunoglobulin Fc molecule.
  • the antigen may be administered with any adjuvant.
  • the antigen may be administered once, but is preferably administered a plurality of times (for example, 2 to 10 times, preferably 2 to 5 times).
  • immune cells eg, lymph node cells or spleen cells
  • parent cells eg, immortalized cells such as myeloma cells
  • the parent cell of the fusion partner is preferably derived from the same species as the immune cell.
  • mouse-derived myeloma cells used as the parent cells of the fusion partner include, but are limited to, P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653), P3x63Ag8U.1, NS-1, MPC-11, etc. Not done.
  • Cell fusion between immune cells and parent cells can be performed according to, for example, the method of Kohler and Milstein (Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). Specifically, such cell fusion is performed in normal nutrient culture in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG) having an average molecular weight of about 1000 to 6000 (for example, PEG4000), Sendai virus (HVJ), or the like can be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • HVJ Sendai virus
  • Auxiliary agents such as dimethyl sulfoxide can also be used to increase fusion efficiency.
  • the usage ratio of immune cells and parent cells can be arbitrarily set.
  • Monoclonal antibody-producing cells can be obtained by screening the obtained fusion cells for the ability to produce the target CLEC4A function-inhibiting antibody and cloning them.
  • a CLEC4A function-inhibiting antibody can be prepared by recovering the antibody from the culture supernatant obtained by culturing the hybridoma.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody is a polyclonal antibody
  • it can be obtained by collecting serum from an immunized animal (non-human animal) as described above.
  • a human antibody-producing non-human animal can be used as the immunized animal.
  • the screening of the CLEC4A function-inhibiting antibody may be performed, for example, by examining the binding property of the CLEC4A function-inhibiting antibody to the antigen and / or peptide fragment to which the CLEC4A function-inhibiting antibody binds.
  • CLEC4A function inhibition by detecting antibody binding to a polypeptide consisting of the extracellular region of the human CLEC4A protein and / or the region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 within the extracellular region of the human CLEC4A protein.
  • Antibodies may be screened.
  • CLEC4A function-inhibiting antibody can be screened by detecting the binding of the antibody to.
  • the peptide fragment consisting of the amino acid sequence QNLQEESAYF (SEQ ID NO: 16) described above and / or QDFIFQNLQEESAYF (SEQ ID NO: 24), DFIFQNLQEESAYFV (SEQ ID NO: 25), FIFQNLQEESAYFVG (SEQ ID NO: 26), IFQNLQEESAYFVGL (SEQ ID NO: 26).
  • at least one eg, at least 2, at least 3, at least 4, or all 5) amino acid sequences selected from the group consisting of FQNLQEESAYFVGLS (SEQ ID NO: 28), and QNLQEESAYFVGLSD (SEQ ID NO: 29).
  • CLEC4A function-inhibiting antibody can be screened by detecting the binding of the antibody to the peptide fragment consisting of each of the above. In addition to the binding to the peptide fragment described above, the CLEC4A function-inhibiting antibody can also be screened by further detecting the binding of the antibody to the peptide fragment consisting of the amino acid sequence FSSNCYFISTESASW (SEQ ID NO: 17) described above.
  • CLEC4A function-inhibiting antibodies can also be screened by detecting the binding of the antibody to the peptide fragment consisting of each of the above.
  • it comprises a peptide fragment consisting of the amino acid sequence KKNMPVEETAWSCC (SEQ ID NO: 19) described above and / or one or both amino acid sequences of VKKNMPVEETAWSCC (SEQ ID NO: 31) and KKNMPVEETAWSCCP (SEQ ID NO: 32).
  • CLEC4A function-inhibiting antibodies can also be screened by detecting antibody binding to peptide fragments.
  • the binding of the antibody to the peptide fragment can be detected by any method that can detect the antigen-antibody reaction, but for example, the target peptide fragment may be detected using a peptide array immobilized on the array. ..
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody can also be produced as a recombinant antibody by cloning the antibody gene, incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and producing it using gene recombination technology. .. Specifically, the cDNA in the variable region (V region) of the antibody is ligated with the DNA encoding the antibody constant region (C region), incorporated under the control of an expression control region of an expression vector, for example, an enhancer or a promoter.
  • a CLEC4A function-inhibiting antibody can be prepared as a recombinant antibody by introducing an expression vector into a host cell, transforming it, and causing the host cell to produce an antibody.
  • the antibodies, nucleic acids, etc. obtained as described above can be isolated, purified, and recovered by a known purification method.
  • Purification methods include affinity purification, reverse phase chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), chromatographic methods such as ion exchange chromatography, gel filtration, column purification, and polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Etc., or any combination thereof, but is not limited thereto.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody according to the present invention has an immune checkpoint inhibitory effect.
  • CLEC4A function-inhibiting antibody causes immune checkpoint inhibition in antigen-presenting cells such as dendritic cells by inhibiting CLEC4A function, and releases the suppression of antitumor immune response (cancer immune response) contributed by immune checkpoint molecules. It can activate the tumor immune response and enhance the effective anti-tumor immune response (cancer immune response).
  • the antigen-presenting cell in which immune checkpoint inhibition is caused by the CLEC4A function-inhibiting antibody according to the present invention is an antigen-presenting cell expressing the CLEC4A protein on the cell surface, and such an antigen-presenting cell is used.
  • an antigen-presenting cell is a cell that activates T cells by presenting an antigen on the cell surface.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody according to the present invention is against an immune checkpoint inhibitor, preferably an antigen-presenting cell such as a dendritic cell, a B cell (for example, CD19 + B cell), or a monocyte (for example, CD14 + monocyte). It can be used as an immune checkpoint inhibitor.
  • an immune checkpoint inhibitor preferably an antigen-presenting cell such as a dendritic cell, a B cell (for example, CD19 + B cell), or a monocyte (for example, CD14 + monocyte). It can be used as an immune checkpoint inhibitor.
  • the immune checkpoint inhibitory action and the ability to activate the antitumor immune response of the CLEC4A function-inhibiting antibody according to the present invention are the same in antigen-presenting cells treated with the CLEC4A function-inhibiting antibody, for example, dendritic cells.
  • Increased production of inflammatory cytokines eg, IL-6, TNF- ⁇ , IL-12p40, etc.
  • a control antibody that does not inhibit CLEC4A function can be used as an index for evaluation.
  • the evaluation of the immune checkpoint inhibitory effect of CLEC4A function-inhibiting antibody and the activation ability of antitumor immune response is performed on antigen-presenting cells, preferably dendritic cells, TLR ligands such as TLR4 ligand and TLR9 ligand.
  • antigen-presenting cells preferably dendritic cells, TLR ligands such as TLR4 ligand and TLR9 ligand.
  • it can be carried out by adding a CLEC4A function-inhibiting antibody and culturing in the presence of LPS or CpG-B ODN1668, measuring the amount of cytokines in the culture solution, and comparing with a control.
  • the antibody is an immune checkpoint. It can be judged that it has an inhibitory action (immune checkpoint inhibitory activity) and an ability to activate an antitumor immune response.
  • inflammatory cytokines eg, IL-6, TNF- ⁇ , IL-12p40, etc.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody according to the present invention can be used as an active ingredient of an antitumor drug.
  • the present invention also provides an antitumor agent or a pharmaceutical composition containing a CLEC4A function-inhibiting antibody according to the present invention.
  • the antitumor drug or pharmaceutical composition preferably contains the CLEC4A function-inhibiting antibody according to the present invention in a therapeutically effective amount.
  • Such an antitumor agent or pharmaceutical composition may be for the treatment or prevention of cancer, for example, for suppressing the progression of cancer or preventing the recurrence of cancer.
  • the antitumor drug or pharmaceutical composition according to the present invention is a treatment for cancer based on immune checkpoint inhibition against antigen-presenting cells such as dendritic cells, B cells (CD19 + B cells), and monocytes (CD14 + monocytes). Alternatively, it is useful for prevention, for example, suppression of cancer progression or prevention of cancer recurrence.
  • suppression of cancer progression includes delaying or preventing the worsening of the condition of cancer (particularly, increase in tumor size), or recovering the condition.
  • suppression of cancer progression can be evaluated using tumor size (eg, tumor volume) as an index.
  • tumor size eg, tumor volume
  • the tumor size for example, tumor volume
  • the control group present.
  • Cancers or tumors to be treated or prevented by activating the antitumor immune response by the CLEC4A function-inhibiting antibody according to the present invention include, but are not limited to, malignant melanoma, lung cancer, and renal cells. Head and neck cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, liver cancer, esophageal cancer, biliary tract cancer, colon cancer, urinary tract epithelial cancer, glioblastoma, multiple myeloma, ovary , Cervical cancer, uterine body cancer, breast cancer, malignant pleural mesenteric tumor, soft sarcoma, lymphoma (Hojikin lymphoma, central nervous system primary lymphoma, testicular primary lymphoma, etc.), virus-positive or negative solid cancer, Merkel cells Cancer and the like can be mentioned.
  • head and neck cancer bladder cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, liver cancer, esophageal cancer, biliary tract cancer, colon cancer, urinary tract
  • the antitumor drug or pharmaceutical composition according to the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable additive in addition to the CLEC4A function-inhibiting antibody.
  • a pharmaceutically acceptable additive include, but are not limited to, carriers, suspending agents, binders, excipients, lubricants, disintegrants, wetting agents, stabilizers, buffers, preservatives, colorants, pH. Regulators and the like can be mentioned.
  • the additive can be used alone or in combination of two or more, and can be appropriately used depending on the dosage form of the preparation.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody according to the present invention, or an antitumor drug or pharmaceutical composition containing the same can be administered by any administration route such as parenteral administration or oral administration, but parenteral administration is preferable, for example, intravenous administration. It can be administered intra-arterial, intramuscular, intraperitoneal, intrathecal, epidural, subcutaneous, intradermal, nasal, transpulmonary, intratumoral, etc.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody according to the present invention, or an antitumor drug or pharmaceutical composition containing the same may be administered systemically or topically.
  • the present invention also provides a method for inhibiting an immune checkpoint, which comprises administering a CLEC4A function-inhibiting antibody according to the present invention, or an antitumor drug or a pharmaceutical composition containing the same, to a subject (patient).
  • the present invention also comprises a method (or method) of activating an antitumor immune response based on immune checkpoint inhibition, which comprises administering to a subject (patient) an antibody that inhibits CLEC4A function, or an antitumor drug or pharmaceutical composition containing the same. Methods for inducing an antitumor immune response) are also provided.
  • the present invention also provides a method for treating or preventing cancer, which comprises administering a CLEC4A function-inhibiting antibody or an antitumor drug or a pharmaceutical composition containing the same to a subject.
  • the method for treating or preventing cancer may be a method for suppressing the progression of cancer or a method for preventing recurrence of cancer.
  • the target is preferably a mammal, for example, primates such as humans, chimpanzees and gorillas, rodents such as mice, rats and guinea pigs, cows, horses, pigs, sheep, goats, llamas, camels, dogs and cats. , Rabbits and other mammals, but preferably humans.
  • the subject may be a subject who has or is suspected of having immunosuppression due to an immune checkpoint molecule.
  • the subject may typically be a subject who has or is suspected of having cancer.
  • the subject may be a subject who is refractory to cancer immunotherapy or has reduced responsiveness to cancer immunotherapy.
  • Such resistance to cancer immunotherapy, or reduced responsiveness is an immune checkpoint, especially dendritic cells, B cells (eg, CD19 + B cells), monocytes (eg, CD14 + monocytes).
  • Etc. can be caused by immune checkpoints in antigen-presenting cells.
  • the subject may also be a patient with cancer who is refractory or resistant to inhibitors of immune checkpoint molecules expressed on T cells (CTLA-4, PD-1, PD-L1, etc.).
  • the subject may be a cancer patient who is refractory or resistant to existing immune checkpoint inhibitors.
  • the subject is a cancer that does not have refractory or resistance to an immune checkpoint inhibitor (eg, an inhibitor of an immune checkpoint molecule expressed on T cells; hereinafter also referred to as a T cell-expressed immune checkpoint molecule inhibitor). It may be a patient.
  • an immune checkpoint inhibitor eg, an inhibitor of an immune checkpoint molecule expressed on T cells; hereinafter also referred to as a T cell-expressed immune checkpoint molecule inhibitor.
  • the administration method can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the species, age, weight, gender, symptoms, etc. of the target (patient).
  • the dose of the CLEC4A function-inhibiting antibody can be set, for example, in the range of 0.0001 mg to 1000 mg / kg body weight and / or in the range of 0.001 mg to 100,000 mg per subject. Not limited to the range of.
  • a CLEC4A function-inhibiting antibody or an antitumor drug or pharmaceutical composition containing it, to a subject enhances the production of inflammatory cytokines in antigen-presenting cells, such as dendritic cells, which can lead to T cells and other immunity. It activates / enhances cell function and activates (induces) an anti-tumor immune response, resulting in effects such as suppression of cancer progression, tumor regression, or prevention of cancer recurrence in a subject.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody of the present invention, or an antitumor drug or pharmaceutical composition containing the same (i) induces and / or accumulates bone marrow-derived inhibitory cells in lymphoid tissue and / or cancer tissue.
  • Suppression (ii) induction and / or accumulation of effector T cells, tumor infiltrating T cells (eg, CD4 + T cells and CD8 + T cells), and activated dendritic cells in lymphoid tissue and / or cancer tissue. It can result in at least one of promotion, (iii) suppression of immune tolerance in the cancer microenvironment, and (iv) activation of the antitumor immune response.
  • tumor infiltrating T cells eg, CD4 + T cells and CD8 + T cells
  • activated dendritic cells in lymphoid tissue and / or cancer tissue.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody of the present invention is used for immune-related adverse events (eg, autoimmune conditions such as autoimmune diseases or disorders, weight loss, tissue damage, etc.), in particular, immune checkpoint molecules expressed on T cells.
  • immune-related adverse events eg, autoimmune conditions such as autoimmune diseases or disorders, weight loss, tissue damage, etc.
  • immune checkpoint molecules expressed on T cells e.g., immune checkpoint molecules expressed on T cells.
  • High antitumor effects can be achieved while reducing the risk of developing immune-related adverse events resulting from inhibition. Therefore, the CLEC4A function-inhibiting antibody of the present invention, or an antitumor drug or pharmaceutical composition containing the same, can realize higher safety as well as high antitumor effect.
  • the above-mentioned CLEC4A function-inhibiting antibody, or an antitumor drug or pharmaceutical composition containing the same may be used in combination (combined administration) with another immune checkpoint inhibitor.
  • Other immune checkpoint inhibitors typically include, but are not limited to, inhibitors of immune checkpoint molecules expressed on T cells. Examples of immune checkpoint molecules expressed on T cells include, but are not limited to, PD-1, CTLA-4, PD-L1, Tim-3, BTLA, LAG-3, TIGHT and the like.
  • the inhibitor against the immune checkpoint molecule is any substance having an action (antagonist action) of inhibiting the function of the immune checkpoint molecule (protein) itself or the function of the gene encoding the immune checkpoint molecule, and is, for example, an antibody ( Preferably, it may be a neutralizing antibody) or a nucleic acid molecule that inhibits the expression of an immune checkpoint molecule (expression of a gene encoding the molecule).
  • Such inhibitory nucleic acid molecules may be siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), hpRNA (hairpin RNA), or longer nucleic acids containing them, but not limited to: ..
  • the inhibitor against an immune checkpoint molecule expressed on T cells may be an existing immune checkpoint inhibitor, eg, an anti-CTLA-4 antibody. It may be an anti-PD-1 antibody (such as nibolumab), an anti-PD-L1 antibody (such as avelumab), or the like.
  • the above-mentioned CLEC4A function-inhibiting antibody, or an antitumor drug or pharmaceutical composition containing the same is compared with the case where the above-mentioned CLEC4A function-inhibiting antibody is used alone, for example, by using it in combination with a T cell-expressing immune checkpoint molecule inhibitor. Even so, it can bring about a remarkably high synergistic cancer therapeutic effect.
  • the present invention also provides the above-mentioned CLEC4A function-inhibiting antibody, or an antitumor drug or pharmaceutical composition containing the same, for use in combination with a T cell-expressed immune checkpoint molecule inhibitor. Furthermore, the present invention also provides an antitumor agent or a pharmaceutical composition containing a T cell-expressed immune checkpoint molecule inhibitor in addition to the above-mentioned CLEC4A function-inhibiting antibody. Such an antitumor drug or pharmaceutical composition preferably contains the above-mentioned CLEC4A function-inhibiting antibody and T cell-expressing immune checkpoint molecule inhibitor in therapeutically effective amounts, respectively.
  • Anti-tumor agents or pharmaceutical compositions that use the above CLEC4A function-inhibiting antibody and T cell-expressed immune checkpoint molecule inhibitor in combination, or subjects to whom the combination therapy is applied (administered) are not suitable for existing immune checkpoint inhibitors. It may be a cancer patient who is responsive or resistant, or may be a cancer patient who is not refractory or resistant to an immune checkpoint inhibitor (eg, a T cell-expressed immune checkpoint molecule inhibitor).
  • the above-mentioned CLEC4A function-inhibiting antibody, or an anti-tumor drug or pharmaceutical composition containing the same, and other immune checkpoint inhibitors (T cell-expressed immune checkpoint molecule inhibitors, etc.) can be used at any time. For example, they may be administered simultaneously, continuously or at different times, as separate agents, or included in a single agent.
  • the above CLEC4A function-inhibiting antibody can suppress the expression of immunosuppressive molecules in cancer tissues.
  • the above CLEC4A function-inhibiting antibody can suppress the expression of IL (interleukin) -10, IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase), arginase, and mPGES (membrane-related prostaglandin E2 synthase), for example. it can.
  • the combined administration of the above-mentioned CLEC4A function-inhibiting antibody and T cell-expressing immune checkpoint molecule inhibitor can more strongly suppress the expression of immunosuppressive molecules in cancer tissues, for example, IL-10, IDO, arginase, etc.
  • immunosuppressive molecules for example, IL-10, IDO, arginase, etc.
  • At least one expression selected from the group consisting of COX-2, mPGES, TGF (transforming growth factor) - ⁇ , and iNOS (inducible nitric oxide synthase) can be significantly suppressed.
  • a method comprising administration of the above-mentioned CLEC4A function-inhibiting antibody or an antitumor drug or pharmaceutical composition containing the same, for example, a method for activating an antitumor immune response or a method for treating or preventing cancer is used for cancer. It may be used in combination with vaccine therapy.
  • the combined cancer vaccine therapy include a method of administering to a patient a cancer antigen, a combination of a cancer antigen and an agonist TLR ligand, or a combination of a cancer antigen and an agonist TLR ligand and an agonist anti-CD40 antibody. ..
  • Cancer antigens include, for example, WT1, MAGE-A1, MAGE-A3, gp100, Melan A, NY-ESO-1, MUC1, LMP2, HPV E6 E7, EGFRvIII, HER-2 / neu, iditopes, p53 non.
  • Mutants (p53 nonmutant), BAGE, tyrosinase, CEA, bcr / abl, ras and the like can be mentioned, but are not limited thereto.
  • Agonist TLR ligands also called agonistic TLR ligands or TLR agonists
  • an agonist TLR9 ligand which is an oligonucleotide containing an unmethylated CpG dinucleotide motif such as CpG ODN 2006 and CpG-B ODN 1668 can be mentioned.
  • Agonist TLR ligands suitable for administration to human subjects can be agonist ligands for human TLRs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10.
  • a method comprising administration of the above-mentioned CLEC4A function-inhibiting antibody or an antitumor drug or pharmaceutical composition containing the same, for example, a method for activating an antitumor immune response or a method for treating or preventing cancer is used for cancer. It may be used in combination with standard therapies (surgical treatment for tumor resection, radiation therapy, chemotherapy).
  • the flow cytometry method in the following examples was carried out as follows. ⁇ Flow cytometry method> The following fluorescently labeled monoclonal antibodies were used for staining cells in flow cytometric analysis.
  • Anti-mouse CD3 ⁇ antibody (clone 145-2C11; BD Biosciences), anti-mouse CD4 antibody (clone RM4-5; BD Biosciences), anti-mouse CD8 ⁇ antibody (clone 53.6.7; BD Biosciences), anti-mouse CD11b antibody (clone M1 / 70; Biolegend), anti-mouse CD11c antibody (clone HL3; BD Biosciences), anti-mouse CD40 antibody (clone 3/23; BD Biosciences), anti-mouse CD44 antibody (clone IM7; BD Biosciences), anti-mouse CD80 antibody (clone 16) -10A1; BD Biosciences), anti-mouse CD86 antibody (clone GL1; BD Biosciences), anti-mouse CD62L antibody (clone MEL-14; Biolegend), anti-mouse B220 antibody (clone RA3-6B2; BD Biosciences), anti-
  • Anti-human CD3 antibody (clone UCHT1; TOMBO), CD8 ⁇ (clone SK1; BD Biosciences), anti-human CD11c antibody (clone 3.9; TOMBO), anti-human CD14 antibody (clone 61D3; TOMBO), anti-human CD19 antibody (clone HIB19; TOMBO), anti-human CD56 antibody (clone MY31; TOMBO), anti-human CD1c antibody (clone L161; Biolegend), anti-human CD40 antibody (clone 5C3; BD Biosciences), anti-human CD80 antibody (clone L307.4; BD Biosciences) , Anti-human CD86 antibody (clone IT2.2; BD Biosciences), anti-human CD141 antibody (clone M80; Biolegend), anti-human CD303 antibody (clone 201A; Biolegend), anti-human HLA-DR antibody (clone L243; Biolegend), Anti-human CLEC4A antibody (
  • Cell surface molecules were stained by incubating cells (1-5 x 10 5 cells) with a fluorescently labeled monoclonal antibody at 4 ° C. for 30 minutes.
  • Fluorescence staining analysis was performed using FACSVerse TM flow cytometer (BD Biosciences) and FlowJo software (Tree star).
  • Example 1 1) Mouse In this example, a C57BL / 6 mouse (Japan Clea) was used as a wild-type (WT) mouse. According to the description in Non-Patent Document 4, with C57BL / 6 mice, Clec4A4 deficient mice (Clec4a4 - / - mice) was prepared. Clec4A4-deficient mice (strain name B6.Cg-Clec4a4 ⁇ tm1.1Ksat>) have been deposited and available at RIKEN BioResource Center (RIKEN BRC; Japan) under accession number RBRC09657. Clec4A4 is a mouse ortholog of CLEC4A.
  • OVA ovalbumin
  • TLR Toll-like receptor
  • OVA-specific cytotoxic T cells CD44 high OVA-MHC class I pentamer-bound CD8 + T cells
  • OVA-specific IFN- ⁇ -producing CD8 + T cells in the spleen 6 days after immunization , Analyzed by the above-mentioned flow cytometry method.
  • CTL cytotoxic T cells
  • IFN- ⁇ -producing CD8 + T cells in the spleen 6 days after immunization
  • CD44 high OVA-MHC class I pentamer-bound CD8 + is an antigen-specific CTL in the cancer vaccine (OVA, CpG-B ODN 1668, agonist anti-CD40 antibody) immune group compared to the non-vaccinated group. It was shown that the induction of T cells (FIGS. 1A and B) and antigen-specific IFN- ⁇ -producing CD8 + T cells (FIGS. 2A and B) was enhanced.
  • Cancer-bearing WT mice and cancer-bearing Clec4A4-deficient mice were immunized by intraperitoneal administration of a cancer vaccine 7 days after cancer cell transplantation. Thirteen days after cancer cell transplantation, the induction of CD44 high OVA-MHC class I pentamer-binding CD8 + T cells, which are OVA-specific CTLs, and OVA-specific IFN- ⁇ -producing CD8 + T cells was performed by the above-mentioned flow cytometry. It was analyzed by the method.
  • Cancer-bearing WT mice and cancer-bearing Clec4A4-deficient mice produced antigen-specific CTL and antigen-specific IFN- ⁇ in the cancer vaccine immune group compared to non-cancer-bearing WT mice and Clec4A4-deficient mice. Induction of CD8 + T cells was enhanced (Figs. 1 and 2). Furthermore, in the cancer vaccine immunity group of cancer-bearing Clec4A4-deficient mice, induction of antigen-specific CTL and antigen-specific IFN- ⁇ -producing CD8 + T cells was compared with the cancer vaccine immunity group of cancer-bearing WT mice. Was significantly enhanced (FIGS. 1 and 2).
  • cancer-bearing Clec4A4-deficient mice After 15 days of cancer cell transplantation, cancer-bearing Clec4A4-deficient mice (non-vaccinated) showed no occurrence of immune-related adverse events compared to cancer-bearing WT mice (non-vaccinated). Progression was significantly suppressed (FIGS. 3A-C).
  • cancer vaccine immune group of cancer-bearing WT mice cancer regression was clearly observed after 15 days after cancer cell transplantation.
  • the cancer vaccine immunity group of cancer-bearing Clec4A4 deficient mice the cancer progression inhibitory effect of the cancer vaccine 23 days after cancer cell transplantation was compared with the cancer vaccine immunity group of cancer-bearing WT mice. Was observed (Fig. 3).
  • mouse Clec4A4 is an immune checkpoint molecule expressed on dendritic cells and acts to brake the antitumor immune response.
  • the spleen mononuclear cells of non-cancer-bearing mice and cancer-bearing mice were prepared from spleen cells using a erythrocyte lysis buffer (Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max TM ; Sigma-Aldrich) (Non-Patent Document 4).
  • Spleen mononuclear cells and cancer tissues of cancer-bearing mice were prepared 20 days after cancer cell transplantation.
  • non-cancer-bearing WT mice and non-cancer-bearing Clec4A4-deficient mice were similarly analyzed by the flow cytometry method. The results of the analysis are shown in FIGS. 4 to 8.
  • tumor-bearing Clec4A4-deficient mice have tumor-infiltrated CD4 + / CD8 + lymphocytes (TILs) and NK1.1 in cancer tissue compared to cancer-bearing WT mice. + Increased accumulation of NK cells was observed (Fig. 4B).
  • cancer-bearing WT mice showed an increase in CD44 + CD62L - effector CD4 + T cells in the spleen (Fig. 5A), but the increase in CD8 + T cells was observed. Not observed (Fig. 5B).
  • CD44 + CD62L - effector CD4 + T cells / CD8 + T cells increased in the spleen (Fig. 5) and cancer tissue (Fig. 6) compared to cancer-bearing WT mice.
  • B CD8 + T cells
  • MHC I MHC class I
  • CD80 CD86
  • B7-H1 and B7-H2 spleen cDCs
  • cancer-bearing Clec4A4-deficient mice showed enhanced expression of MHC I, MHC class II (MHC II), CD80, CD86, and B7-H1 in tumor infiltrating cDCs, and B7-H2 and B7-H2. Decreased expression of B7-DC was observed (Fig. 8).
  • Clec4A4 deficiency enhances the cancer immune response and suppresses cancer progression. Therefore, Clec4A4 is expressed in dendritic cells and is an "immune checkpoint molecule" that controls the cancer immune (autoimmune) response. was proved to be.
  • Peripheral blood mononuclear cells were separated from human peripheral blood (healthy human peripheral blood) by specific gravity centrifugation using Ficoll-Paque TM PLUS (GE Healthcare Life Sciences).
  • Peripheral blood monocytes were purified from the isolated peripheral blood mononuclear cell fraction using a monocyte isolation kit II (Miltenyi Biotec) and a cell separator autoMACS (R) Pro Separator (Miltenyi Biotec). ..
  • the obtained human peripheral blood monocytes were subjected to human recombinant granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) (50 ng / ml, Wako) and human recombinant IL-4 (100 ng).
  • Human peripheral blood monocyte-derived dendritic cells were prepared by culturing in the presence of / ml, Wako) for 1 week.
  • human recombinant GM-CSF 50 ng / ml, Wako
  • human recombinant IL-4 100 ng / ml, Wako
  • human recombinant IL-4 100 ng / ml, Wako
  • human recombinant IL-4 100 ng / ml, Wako
  • Human peripheral blood monocyte-derived immunosuppressiveness by culturing for 1 week in the presence of human recombinant IL-10 (50 ng / ml, Wako) and human recombinant TGF- ⁇ 1 (50 ng / ml, Wako).
  • Dendritic cells were prepared. Peripheral blood monocyte-derived immunosuppressive dendritic cells are known to be produced in a cancerous environment.
  • CLEC4A cell surface molecule
  • CD141 + cDC1 cells CD1c + cDC2 cells
  • CD303 + pDC cells peripheral blood mononuclear cell fractions obtained from healthy subjects by the above-mentioned flow cytometry method.
  • the expression of each cell surface molecule is shown in a histogram in FIG. 9B.
  • Peripheral blood dendritic cells subpopulation of peripheral blood mononuclear fraction from a healthy person CD1c + CD11c + HLA-DR + cDC2 cells, CD141 + CD11c + HLA-DR + cDC1 cells, and CD303 + CD11c - It showed higher expression for CLEC4A compared to HLA-DR + pDC cells (Fig. 9B).
  • the CD1c + peripheral blood mononuclear cells obtained by flow cytometric analysis were designated as cDC2
  • the CD141 + peripheral blood mononuclear cells were designated as cDC1
  • the CD303 + peripheral blood mononuclear cells were designated as pDC.
  • peripheral blood monocytes obtained from healthy individuals produced peripheral blood monocyte-derived dendritic cells (in the figure, monocyte-derived DC), and peripheral blood monocyte-derived immunosuppressive dendritic cells (in the figure, The expression of CD11c, CD40, CD80, CD86, HLA-DR, and CLEC4A in monocyte-derived DCreq) was analyzed by the above-mentioned flow cytometry method. The expression of each cell surface molecule is shown in a histogram in FIG. 9C.
  • Peripheral blood monocyte-derived immunosuppressive dendritic cells showed lower expression for CD11c, CD86, and HLA-DR compared to peripheral blood monocyte-derived dendritic cells, but equally high expression for CLEC4A. Shown (Fig. 9C).
  • Clec4A4 in mice is limited to CD1c + peripheral blood mononuclear cells (cDC2) (Non-Patent Document 4), but in humans cDC2 is CD141 + peripheral blood mononuclear cells (cDC1) or CD303 + peripheral blood mononuclear cells.
  • CLEC4A expression was higher than that of nuclear spheres (pDC), and CLEC4A expression was also observed in monocytes and B cells.
  • Expression of CLEC4A is also expressed in immunosuppressive dendritic cells generated in a cancer environment (Non-Patent Document 3, and Nagayama H., et al., Melanoma Res., (2003) 13, pp.521-530). Was recognized. From these results, CLEC4A was considered to be a function-regulating molecule expressed in antigen-presenting cells in humans.
  • BamHI recognition sequence (5'-ggatcc-) at the 5'end of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) encoding the full length (SEQ ID NO: 2; NCBI accession number NP_057268.1; M1-L237; 237 amino acid length) of the human CLEC4A protein.
  • a cDNA (SEQ ID NO: 11) with an XhoI recognition sequence (5'-ctcgag-3') added to the 3') and 3'ends was synthesized by GeneArt (R) (Life Technologies).
  • human CLEC4A ITIM immunoglobulin-based Inhibition motif sequence-deficient mutant (SEQ ID NO: 4; ⁇ I5-V10; 231 amino acid length), CLEC4A extracellular region-deficient mutant. (SEQ ID NO: 6; ⁇ F69-L237; 68 amino acid length), CLEC4A sugar chain recognition domain (CRD) -EPS-deficient mutant (SEQ ID NO: 8; ⁇ E195-S197; 234 amino acid length), and CLEC4A.
  • these cDNAs were treated with restriction enzymes BamHI and XhoI and introduced into the BamHI-XhoI site in the multicloning site of the pMX-IRES-GFP retroviral vector to prepare a CLEC4A or mutant expression retroviral vector.
  • these retroviral vectors, or control retroviral vectors are infected with retrovirus packaging cells (Phoenix) using LipofectAMINE Plus Reagent (Life Technologies) for 24 hours. Later, the retrovirus was collected from the culture supernatant and concentrated by centrifugation (8,000 g, 16 hours, 4 ° C).
  • the obtained retrovirus was applied to a mouse dendritic cell line DC2.4 (Shen Z, et al., J. Immunol., (1997) 158: p.2723-2730) with a DOTAP liposomal transfection reagent (DOTAP). Liposomal Transfection Reagent; Roche) was infected by treatment for 2 days. From the obtained cells, transgenic cell lines were purified and isolated using a FACSAria TM II cell sorter (BD Biosciences) using GFP expression as an index.
  • DOTAP DOTAP liposomal transfection reagent
  • the above-mentioned flow cytometry shows the expression of GFP and CLEC4A in the isolated transgenic cell line (CLEC4A expression cell line or CLEC4A mutant expression cell line, control retrovirus-infected cell line) and mouse dendritic cell line DC2.4. It was analyzed by the method.
  • GFP and CLEC4A in mouse dendritic cell lines DC2.4 DC2.4 in the figure
  • control retrovirus-infected cell lines mock-GFP in the figure
  • CLEC4A-expressing cell lines CLEC4A-GFP in the figure
  • Mouse dendritic cell line DC2.4 control retrovirus-infected cell line, CLEC4A-expressing cell line, sugar chain modification site substitution mutant-expressing cell line, CRD-EPS-deficient mutant-expressing cell line, extracellular region-deficient mutant-expressing cell
  • the strain and the ITIM sequence-deficient mutant-expressing cell line were seeded on a 48-well culture plate (BD Bioscience), respectively, and the TLR4 ligand lipopolysaccharide (LPS; 0.1 ⁇ g / ml; Sigma-Aldrich) or the TLR9 ligand CpG.
  • -B ODN 1668 (0.1 ⁇ M) was added for stimulation and cultured for 16 hours, and then IL-6 (interferon-6; eBioscience) and TNF- ⁇ (tumor necrosis factor- ⁇ ; eBioscience) in the culture supernatant. The amount of was measured by the ELISA method.
  • IL-6 interferon-6
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇ ; eBioscience
  • the amount of was measured by the ELISA method.
  • the same cell line was cultured for 16 hours without stimulation without adding lipopolysaccharide or CpG-B ODN1668, and then the amounts of IL-6 and TNF- ⁇ in the culture supernatant were similarly measured by the ELISA method. .. The result is shown in FIG.
  • CLEC4A-expressing cell line CLEC4A-GFP in the figure
  • IL-6 and TNF- were stimulated by LPS or CpG-B ODN1668.
  • the production of ⁇ was significantly attenuated (Fig. 11).
  • CLEC4A-expressing cell line CLEC4A-GFP in the figure
  • CRD-EPS-deficient mutant-expressing cell line CLEC4A ⁇ E195-S197- GFP in the figure
  • extracellular region-deficient mutant-expressing cell line in the figure
  • CLEC4A ⁇ F69-L237 -GFP CLEC4A ⁇ F69-L237 -GFP
  • ITIM sequence-deficient mutant-expressing cell lines (CLEC4A ⁇ I5-V10- GFP in the figure) produce IL-6 and TNF- ⁇ by stimulation with LPS or CpG-B ODN 1668.
  • LPS or CpG-B ODN 1668 was significantly enhanced, and their production was almost the same as that of the control retrovirus-infected cell line (mock-GFP in the figure) (Fig. 11). It was shown that the CLEC4A mutants introduced into these cell lines do not retain CLEC4A activity.
  • CLEC4A is a function-regulating molecule of antigen-presenting cells, and the molecular basis of function control of CLEC4A in antigen-presenting cells such as dendritic cells is the sugar chain recognition domain (CRD) and N in the extracellular region.
  • CRD sugar chain recognition domain
  • N sugar chain recognition domain
  • An ITIM-dependent inhibitory signaling pathway based on automolecular (internal / inter) binding through association with type-modified sugar chains is involved, and induction of this pathway suppresses cytokine production ability and T cell activation ability.
  • Rukoto has been shown. That is, it was shown that the extracellular space, CRD, and ITIM sequence are important for the function control activity of CLEC4A.
  • Example 4 1) Preparation of soluble CLEC4A-mouse IgFc chimeric molecule
  • the nucleotide sequence encoding the CLEC4A extracellular region (SEQ ID NO: 12; F69-L237; 169 amino acid length) (corresponding to the nucleotide sequence at positions 205 to 711 of SEQ ID NO: 1)
  • a cDNA with a BamHI recognition sequence (5'-ggatcc-3') added to the 5'end and an EcoRV recognition sequence (5'-gatatc-3') added to the 3'end was synthesized by GeneArt (R) (Life Technologies). did.
  • the obtained cDNA is treated with restriction enzymes BamHI and XhoI and introduced into the BamHI-EcoRV site in the multicloning site of the mouse IgFc chimeric molecule expression vector (pFUSEN-mG2A-Fc vector; InvivoGen).
  • a lysate CLEC4A-mouse IgFc chimeric molecule expression vector was prepared. Soluble CLEC4A- mouse IgFc chimeric molecule expression vector, 293fectin TM Transfection Reagent; was transfected into FreeStyle TM 293-F cells (Life Technologies) using (293fectin TM Transfection Reagent Life Technologies) . Subsequently, the transgenic cells were cultured, and a soluble CLEC4A-mouse IgFc chimeric molecule was purified from the culture supernatant using HiTrap TM Protein G HP (GE Healthcare Life Sciences).
  • mice The footpad was immunized twice at 2-week intervals. Furthermore, on the 31st day after the initial immunization, a soluble CLEC4A-mouse IgFc chimeric molecule (25 ⁇ g / animal) was administered into the tail vein of the mouse.
  • Lymph nodes of mice were collected 34 days after the initial immunization, and the obtained lymph node cells and P3U1 myeloma cell line were fused with polyethylene glycol 4000 (Wako) to prepare a large number of hybridomas.
  • the prepared hybridoma culture supernatant was added to mixed cells (mixing ratio 1: 1) of the mouse dendritic cell line DC2.4 and the CLEC4A-expressing cell line (CLEC4A-GFP) prepared in Example 3. Then, the reactivity between the antibody and the cells was examined by the above flow cytometry method. By using a mixed cell line, it becomes possible to analyze the reactivity of the mouse dendritic cell line DC2.4 (parental line) and the CLEC4A expressing cell line at once.
  • control mouse IgG antibody or anti-CLEC4A antibody (clone 9E8) was mixed with mouse dendritic cell line DC2.4 and CLEC4A-expressing cell line (CLEC4A-GFP) prepared in Example 3 (mixing ratio 1: 1). ), And the reactivity between the antibody and the cells was examined by the above flow cytometry method.
  • Mouse anti-CLEC4A antibody was purified from the hybridoma culture supernatant selected as a highly reactive clone using HiTrap TM Protein G HP.
  • mice anti-CLEC4A antibodies # 1, # 2, # 3, and # 4 As a result, in the presence of mouse anti-CLEC4A antibodies # 1, # 2, # 3, and # 4, the production of the inflammatory cytokine IL-6 stimulated by LPS of peripheral blood monocyte-derived dendritic cells resulted in the production of the anti-CLEC4A antibody. It was enhanced about 1.5-fold as compared to the absence of and in the presence of control mouse IgG antibody. It was considered that these anti-CLEC4A antibodies acted as CLEC4A function-inhibiting antibodies and regulated (inhibited) the cytokine production-suppressing function of CLEC4A in dendritic cells. That is, it was shown that these antibodies have an immune checkpoint inhibitory effect.
  • Example 5 Using the PEPperMAP (R) (PEPperPRINT) peptide microarray contract analysis service, epitope mapping of anti-CLEC4A antibodies # 1, # 2, # 3, and # 4, which are CLEC4A function-inhibiting antibodies, was performed.
  • a group of overlapping peptides having a length of 15 amino acids shifted by 1 amino acid (overlapping length) covering the entire length of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 12; F69-L237; 169 amino acid length) of the extracellular region of CLEC4A. : 14 amino acids; 155 peptides) were printed on a microarray.
  • anti-CLEC4A antibodies # 1, # 2, # 3, and # 4 and labeled secondary antibodies were used to hybridize with peptide probes on microarrays by antigen-antibody reaction.
  • the reactivity was analyzed using PepSlide (R) Analyzer (PEPperPRINT) to identify the epitope.
  • R PepSlide
  • PEPperPRINT PepSlide (R) Analyzer
  • the amino acid sequence commonly contained in the continuously overlapping peptide probes that showed strong binding to the anti-CLEC4A antibody was used as the consensus motif.
  • the consensus motif indicates the presence of a linear (continuous) epitope portion contained within a linear (continuous) epitope or a discontinuous epitope.
  • WVDQTPYNESSTFW (SEQ ID NO: 15; W178-W191 of SEQ ID NO: 2) was identified as a consensus motif by epitope mapping.
  • the epitope of antibody # 1 was shown to be composed of a peptide sequence containing the consensus motif WVDQTPYNESSTFW (SEQ ID NO: 15) on the CLEC4A protein.
  • the epitope of antibody # 2 is QNLQEESAYF (SEQ ID NO: 17). It is considered to be a discontinuous epitope (three-dimensional structure epitope) containing 16) and at least a part of the amino acids in FSSNCYFISTESASW (SEQ ID NO: 17).
  • SSNCYFISTESASW SEQ ID NO: 18; S114-W127 of SEQ ID NO: 2 and QNLQEESAYF (SEQ ID NO: 16; Q155-F164 of SEQ ID NO: 2) were identified as consensus motifs by epitope mapping, respectively.
  • the epitope of antibody # 3 was shown to be composed of a peptide sequence containing the consensus motif SSNCYFISTESASW (SEQ ID NO: 18) and a peptide sequence containing QNLQEESAYF on the CLEC4A protein.
  • antibody # 3 can bind to two distant peptide sequences SSNCYFISTESASW (SEQ ID NO: 18) and QNLQEESAYF (SEQ ID NO: 16) on the primary sequence of CLEC4A protein, the epitope of antibody # 3 is SSNCYFISTESASW (SEQ ID NO: 18).
  • QNLQEESAYF SEQ ID NO: 16 are considered to be discontinuous epitopes (three-dimensional structure epitopes).
  • KKNMPVEETAWSCC SEQ ID NO: 19; K93-C106 of SEQ ID NO: 2
  • the epitope of antibody # 4 was shown to be composed of a peptide sequence on the CLEC4A protein containing the consensus motif KKNMPVEETAWSCC (SEQ ID NO: 19).
  • FIG. 12 shows the positions of the antibody binding sequences constituting the epitopes of antibodies # 1 to # 4 on the primary sequence of the CLEC4A protein.
  • antibodies # 1 to # 4 which are CLEC4A function-inhibiting antibodies, are present in the C-type lectin-like domain in the extracellular region of CLEC4A.
  • the epitope of antibody # 1 was shown to contain an N-type sugar chain modification site (N185) in the CRD (Fig. 12).
  • a pDOI-6 vector van Santen H containing the promoter region and enhancer region of the mouse invariant chain gene for the purpose of inducing the expression of the CLEC4A transgene in mouse MHC class II expressing cells. ., Et al., J. Immunol. Methods, (2000) 245: 133-137) was used.
  • the above synthetic cDNA was treated with the restriction enzyme ClaI, it was introduced into the ClaI site in the multicloning site of the pDOI-6 vector to prepare a CLEC4A expression pDOI-6 vector.
  • the CLEC4A expression pDOI-6 vector was treated with restriction enzymes XhoI and PvuI to linearize and purify.
  • the linearized CLEC4A expression pDOI-6 vector was microinjected into the pronucleus of a fertilized egg of the mouse C57BL / 6 strain (CLEA Japan, Inc.), and then the fertilized egg was transplanted into the oviduct of a pseudo-pregnant mouse. After weaning, the tail was collected from the offspring obtained through pregnancy and childbirth, and genomic DNA was extracted.
  • Genotyping PCR analysis using the obtained genomic DNA was performed to identify the founder mouse (F0) into which CLEC4A was introduced. Furthermore, F1 mice were produced by mating founder mice (F0) with C57BL / 6 mice, and human CLEC4A transgenic mice were established by genotyping PCR analysis. The genetic recombination experiments and animal experiments conducted were approved by the institution to which they belong.
  • CLEC4A expression in immune cells of human CLEC4A transgenic mice Erythrocyte lysis buffer (Red) from spleen cells obtained from wild-type mice (WT; C57BL / 6) and CLEC4A-expressing transgenic mice (CLEC4A Tg) established in 1) above. Spleen mononuclear cells were prepared using Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max TM ; Sigma-Aldrich) (Non-Patent Document 4).
  • FIG. 13A shows the expression of CLEC4A in cells positive for each cell surface molecule (CD3, CD19, CD11b, CD11c, and NK1.1) as a histogram. The numerical value indicates the average fluorescence intensity.
  • CLEC4A Tg splenic mononuclear cells of CLEC4A-expressing transgenic mice
  • FIG. 13B is a histogram showing the expression of CLEC4A in each spleen dendritic cell subpopulation. The numerical value indicates the average fluorescence intensity.
  • Example 7 Cancer progression inhibitory effect of CLEC4A function-inhibiting antibody on cancer-bearing mice
  • WT wild-type mice
  • CLEC4A-expressing transgenic mice CLEC4A Tg
  • ovalbumin CLEC4A Tg
  • control mouse IgG antibody (cont. Ig (Sigma-Aldrich); 100 ⁇ g / animal) or CLEC4A Function-inhibiting antibodies (antibodies # 1 to # 4; 100 ⁇ g / animal) were intraperitoneally administered 6 times at 3-day intervals.
  • Cancer progression was evaluated by measuring the tumor volume of cancer-bearing mice daily using a Digimatic Caliper (Mitutoyo) until 22 days after cancer cell transplantation, and using this as an index.
  • FIG. 14A shows a photograph of the tumor 13 days after cancer cell transplantation.
  • 14B and C show the tumor volume 13 days (B) and 22 days (C) after cancer cell transplantation.
  • FIG. 15 shows the time course of tumor volume 22 days after cancer cell transplantation.
  • the result of the flow cytometry analysis is shown in FIG.
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody-administered group a marked accumulation of tumor-infiltrating CD4 + T cells and tumor-infiltrating CD8 + T cells was observed in the cancer tissue as compared with the control antibody-administered group. It was shown that the CLEC4A function-inhibiting antibody has an effect of promoting tumor infiltration T cell accumulation into cancer tissues.
  • Example 7 Considering the results shown in Example 7 together with the results of Examples 1 to 6, the peptide sequences in the C-type lectin-like domain in which CLEC4A function-inhibiting antibodies # 1 to # 4 are present in the extracellular region of CLEC4A. By binding to, it inhibits the ITIM-dependent inhibitory signaling pathway based on automolecular binding through the association of CRD and N-type modified sugar chains, and enhances the function of dendritic cells, especially CLEC4A-expressing dendritic cells. It has been shown that the enhancement of the antigen-presenting function of the drug amplifies the induction of cancer antigen-specific cytotoxic T cells (CTL) and suppresses the progression of cancer.
  • CTL cancer antigen-specific cytotoxic T cells
  • antibodies # 1 to # 4 are safer than existing immune checkpoint inhibitors against CTLA-4 / PD-1 because they do not cause the occurrence of immune-related adverse events (irAEs). it was thought.
  • CLEC4A is an "immune checkpoint molecule" that controls the cancer immune (autoimmune) response, and antibodies # 1 to # 4, which have an immune checkpoint inhibitory effect, are used for cancer immunotherapy as an immune checkpoint inhibitor. It is promising for the application of. CLEC4A function-inhibiting antibodies # 1 to # 4 induce immune checkpoint inhibition by a mechanism of action different from existing immune checkpoint inhibitors for the CTLA-4 / PD-1 system, and thus existing immune checkpoint inhibitors. It can be expected to have an effective antitumor effect against cancer types that show non-responsiveness and resistance acquisition.
  • Example 8 Cancer progression inhibitory effect of CLEC4A function-inhibiting antibody and anti-PD-1 neutralizing antibody in cancer-bearing mice Wild-type mice (WT; C57BL / 6) and CLEC4A-expressing transgenic mice established in Example 6 (CLEC4A Tg) ), A recombinant malignant melanoma cell line expressing ovalbumin (OVA) (B16-OVA melanoma; Brown DM, et al., Immunology. (2001) 102: 486-497) was subcutaneously transplanted (1x10 5). A cancer-bearing mouse (cancer-bearing CLEC4A-expressing transgenic mouse) was prepared by using cells (1 animal).
  • OVA ovalbumin
  • the cancer-bearing mouse was euthanized after cancer progression evaluation, and skin tissue, lung tissue, liver tissue, and small intestinal tissue were collected from the cancer-bearing mouse, and 4% paraformaldehyde was collected.
  • skin tissue, lung tissue, liver tissue, and small intestinal tissue were collected from the cancer-bearing mouse, and 4% paraformaldehyde was collected.
  • phosphate buffered saline it was embedded in paraffin.
  • tissue sections (5 ⁇ m thick) were prepared and stained with hematoxylin and eosin.
  • FIG. 18 shows the results of tissue staining.
  • administration of CLEC4A function-inhibiting antibody (antibody # 1) was more effective than administration of untreated or control mouse IgG antibody (cont. Ig). It did not cause tissue damage in the small intestine (Fig. 18).
  • irAEs immune-related adverse events
  • CLEC4A function-inhibiting antibody also causes the occurrence of immune-related adverse events (irAEs) using tissue injury as an index. Since there is no such thing, it was shown that it contributes to high safety.
  • FIG. 19 shows the results of cancer progression evaluation.
  • FIG. 19A shows the time course of the tumor volume of the cancer-bearing mouse for 21 days after the cancer cell transplantation.
  • FIG. 19B shows the tumor volume in the cancer-bearing mouse 21 days after the cancer cell transplantation, and
  • FIG. 19C shows the photograph of the cancer-bearing mouse 21 days after the cancer cell transplantation and the excised tumor.
  • administration of CLEC4A function-inhibiting antibody (antibody # 1) alone showed a remarkable inhibitory effect on cancer progression, and also in anti-PD-1.
  • clone 29F.1A12 it showed a higher cancer progression inhibitory effect (FIGS.
  • Example 6 Cancer tissue infiltration immune cell control effect and cancer microenvironment control effect of CLEC4A function-inhibiting antibody and anti-PD-1 neutralizing antibody in cancer-bearing mice
  • CLEC4A-expressing transgenic mouse established in Example 6 (CLEC4A Tg) Subcutaneous transplantation (1x10 5 cells) of a recombinant malignant melanoma cell line (B16-OVA melanoma; Brown DM, et al., Immunology. (2001) 102: 486-497) expressing ovalbumin (OVA) on the back of the tumor.
  • a cancer-bearing mouse was prepared.
  • Cancer tissue was collected from the tumor excised 21 days after cancer cell transplantation from the cancer-bearing CLEC4A-expressing transgenic mouse that was subjected to the cancer progression evaluation test in 1) above, and the cells in the tissue were obtained.
  • FIG. 20A shows the expression of each cell surface molecule in a dot plot.
  • CLEC4A function-inhibiting antibody (antibody # 1) alone or anti-PD-1 neutralizing antibody (clone 29F.1A12) was compared with untreated or controlled mouse IgG administration. It was shown that administration alone resulted in suppression of the accumulation of Gr1-1 + CD11b + F4 / 80 + bone marrow-derived inhibitory cells (MDSCs) in cancer tissues (Fig. 20A).
  • the single dose administered alone or anti-PD-1 neutralizing antibodies of CLEC4A function-blocking antibody (Antibody # 1) (clone 29F.1A12), CD11c + SiglecH - cDCs ( usually type dendritic cells), CD11c low SiglecH + Increased accumulation of pDCs (plasmacytoid dendritic cells), NK1.1 + NK cells, and cancer tissue (tumor) infiltrating CD4 + TILs / CD8 + TILs was observed in the cancer tissue (Fig. 20A).
  • IL-10 gene-specific primer set (il10): 5'-TGCAGCAGCTCAGAGGGTT-3'(SEQ ID NO: 33) 5'-TGGCCACAGTTTTCAGGGAT-3' (SEQ ID NO: 34)
  • TGF- ⁇ gene-specific primer set (tgfb): 5'-ACCATGCCAACTTCTGTCTG-3' (SEQ ID NO: 35) 5'-CGGGTTGTGTTGGTTGTAGA-3'(SEQ ID NO: 36)
  • IDO gene-specific primer set (ido): 5'-TCGGAAGAGCCCTCAAATGTGGAA-3' (SEQ ID NO: 37) 5'-TGGAGCTTGCTACACTAAGGCCAA-3' (SEQ ID NO: 38)
  • Arginase gene-specific primer set (ariginase): 5'-AAGACAGCAGAGGAGGTGAAG-3' (SEQ ID NO: 39) 5'-TAGTCAGTCCCTGGCTTATGG-3' (SEQ ID NO:
  • FIG. 20B The analysis result is shown in FIG. 20B.
  • CLEC4A function-inhibiting antibody antibody # 1
  • IDO indoleamine 2,3-dioxygenase
  • arginase indoleamine 2,3-dioxygenase
  • mPGES membrane-related prostaglandin E2 synthase
  • the CLEC4A function-inhibiting antibody suppresses the expression of immunosuppressive molecules in cancer tissues, and the CLEC4A function-inhibiting antibody and anti-PD, which is an inhibitor of the immune checkpoint molecule PD-1 expressed on T cells.
  • the combined use of -1 neutralizing antibody was shown to more strongly suppress the expression of immunosuppressive molecules.
  • CLEC4A function-inhibiting antibody and anti-PD-1 neutralizing antibody brings about a cancer microenvironment control effect, especially suppresses the expression of immunosuppressive molecules in cancer tissues, and makes immunogenicity in the cancer microenvironment.
  • an immune checkpoint inhibitor such as an inhibitor against an immune checkpoint molecule expressed on T cells inhibits the function of immune checkpoint molecules of different immune cell systems and creates a cancer microenvironment. It can be said that a synergistic cancer therapeutic effect can be brought about by strongly improving (inducing) immunogenicity from immunotolerance.
  • the present invention is a novel cancer capable of effectively inducing immune checkpoint inhibition through functional inhibition of CLEC4A, which is an immune checkpoint molecule, activating an antitumor immune response, and having high safety. It can be used as a therapeutic means.
  • SEQ ID NO: 1 Full-length CLEC4A coding sequence
  • SEQ ID NO: 2 Full-length CLEC4A protein
  • SEQ ID NO: 3 ITIM (I5-V10) -deficient variant coding sequence
  • SEQ ID NO: 4 ITIM (I5-V10) -deficient variant
  • SEQ ID NO: 5 Extracellular region (F69-L237)
  • Defect variant coding sequence SEQ ID NO: 6: Extracellular region (F69-L237)
  • SEQ ID NO: 8 CRD-EPS ( E195-S197)
  • SEQ ID NO: 10 N185Q variant
  • SEQ ID NO: 11 BamHI and XhoI site addition sequence
  • SEQ ID NO: 12 CLEC4A extracellular region (F69-L237)

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Abstract

本発明は、抗腫瘍免疫応答の活性化に有用な、新たな機序に基づく免疫チェックポイント阻害抗体を提供する。本発明は、ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域に特異的に結合する、免疫チェックポイント阻害作用を有する抗体又はその抗原結合性断片とその抗腫瘍用途、及びT細胞発現免疫チェックポイント分子阻害剤を併用するその抗体又はその抗原結合性断片の抗腫瘍用途に関する。

Description

免疫チェックポイント阻害抗体
　本発明は、免疫チェックポイント阻害抗体に関する。
　がん抗原の発見以来、がん免疫療法開発に向けて様々な研究が進行している。従来のがん免疫療法では、様々なアジュバント、がん抗原タンパク質やがん抗原ペプチドが、抗腫瘍免疫応答の誘導のために使用されている。しかし、がん抗原の多くが正常自己抗原であるため免疫原性が弱く、加えて自己抗原に対する免疫応答（自己免疫）を抑制する免疫制御機構が、がん抗原に対する免疫応答をも抑制していることが明らかになりつつある。このような免疫制御機構は「免疫チェックポイント分子」と呼ばれる分子により担われている。免疫チェックポイント分子は、抗腫瘍免疫応答及び自己免疫応答を負に制御しており、例としてT細胞に発現するCTLA-4やPD-1が挙げられる（非特許文献１）。これら「免疫チェックポイント分子」に対する阻害抗体を用いた免疫治療法が試みられている（非特許文献１）。しかしながら、そのような免疫治療法では一定の臨床効果が認められてはいるものの、多くのがん種では依然として不応答性であることが指摘されており、未だ満足すべき結果が得られているとはいえない。さらにT細胞に発現する免疫チェックポイント分子「CTLA-4・PD-1系」の阻害では、がんのみならず自己に対する免疫応答の活性化により発生する、自己免疫様病態等の有害事象が生じることが危惧されている。このように免疫チェックポイント阻害剤の開発では、がん不応答性の克服に加えて、自己免疫寛容の破綻に起因する免疫関連有害事象（immune-related adverse events: irAEs）の軽減を達成することも求められている。
　樹状細胞（dendritic cells; DCs）は樹状突起を有する、系統マーカー陰性、かつ主要組織適合遺伝子複合体クラスII陽性の抗原提示細胞であり、通常型樹状細胞（conventional DCs; cDCs）と形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid DCs; pDCs）に大別される亜集団から構成される。樹状細胞は炎症状態では自然免疫と適応免疫を繋ぐ最も強力な抗原提示細胞として抗原特異的エフェクターT細胞の誘導を介して免疫系を賦活し、定常状態では抗原特異的クローンの除去、不応答性の誘導や免疫抑制能を有する制御性T（regulatory T; Treg）細胞の生成・増幅を介した免疫寛容を誘導する制御細胞として、免疫学的恒常性の維持に重要な役割を果たしている。一方、がん環境下での樹状細胞の機能阻害によるがん免疫応答の低下が推察されているが、その作用機序には不明な点が多く残されている。
　本発明者らは、ヒトとマウスにおいて特定の培養条件で炎症状態においても顕著なT細胞制御機能を有する免疫抑制性樹状細胞の作製に成功している（非特許文献２、３）。
　また本発明者らは、Cタイプレクチンレセプターファミリーに属する「Clec4A4 (DCIR2)」を同定し、Clec4A4が細胞内シグナル伝達を介して樹状細胞の機能を制御し、炎症及びT細胞免疫を減弱することを示した（非特許文献４）。Clec4A4欠損マウスでは自己反応性T細胞の過剰な増幅・活性化により自己免疫疾患の発症が早まり、自己免疫病態が増悪することも見出された（非特許文献４）。
Topalian S.L., et al., Cancer Cell. (2015) 27:450-461 Sato K., et al., Immunity. (2003) 18:367-379 Sato K., et al., Blood. (2003) 101:3581-3589 Uto T., et al., Nat. Commun., (2016) 7:11273
　本発明は、抗腫瘍免疫応答の活性化に有用な、新たな機序に基づく免疫チェックポイント阻害抗体を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域内に結合する所定の抗体が、免疫チェックポイント阻害作用により高い抗腫瘍効果をもたらすことを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］　ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域に特異的に結合する、免疫チェックポイント阻害作用を有する抗体又はその抗原結合性断片。
［２］　ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域内の配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなる領域に特異的に結合する、上記[1]に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
［３］　アミノ酸配列WVDQTPYNESSTFW（配列番号１５）を含むペプチド断片に特異的に結合する、上記[1]又は[2]に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
［４］　配列番号２で示されるアミノ酸配列上のWVDQTPYNESSTFW（配列番号１５）を含む15アミノ酸長のアミノ酸配列からなるペプチド断片に結合することができる、上記[1]～[3]のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性断片。
［５］　配列番号２で示されるアミノ酸配列上のQNLQEESAYF（配列番号１６）を含む15アミノ酸長のアミノ酸配列からなるペプチド断片とアミノ酸配列FSSNCYFISTESASW（配列番号１７）からなるペプチド断片に結合することができ、ヒトCLEC4Aタンパク質の不連続エピトープに結合する、上記[1]又は[2]に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
［６］　配列番号２で示されるアミノ酸配列上のQNLQEESAYF（配列番号１６）を含む15アミノ酸長のアミノ酸配列からなるペプチド断片と配列番号２で示されるアミノ酸配列上のSSNCYFISTESASW（配列番号１８）を含む15アミノ酸長のアミノ酸配列からなるペプチド断片に結合することができ、ヒトCLEC4Aタンパク質の不連続エピトープに結合する、上記[1]又は[2]に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
［７］　アミノ酸配列KKNMPVEETAWSCC（配列番号１９）を含むペプチド断片に特異的に結合する、上記[1]に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
［８］　配列番号２で示されるアミノ酸配列上のKKNMPVEETAWSCC（配列番号１９）を含む15アミノ酸長のアミノ酸配列からなるペプチド断片に結合することができる、上記[1]又は[7]に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
［９］　上記[1]～[8]のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性断片を含む、抗腫瘍薬。
［１０］　T細胞に発現する免疫チェックポイント分子に対する阻害剤と併用するための、上記[9]に記載の抗腫瘍薬。
［１１］　T細胞に発現する免疫チェックポイント分子に対する阻害剤をさらに含む、上記[9]に記載の抗腫瘍薬。
［１２］　T細胞に発現する免疫チェックポイント分子がPD-1である、上記[10]又は[11]に記載の抗腫瘍薬。
［１３］　T細胞に発現する免疫チェックポイント分子に対する阻害剤が、抗PD-1抗体である、上記[10]～[12]のいずれかに記載の抗腫瘍薬。
［１４］　がんの進展抑制用である、上記[9]～[13]のいずれかに記載の抗腫瘍薬。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-209977号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、免疫チェックポイント阻害により抗腫瘍免疫応答を活性化し、抗腫瘍効果をもたらすことができる抗体を提供することができる。
図１は、がんワクチン接種又はがんワクチン非接種のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（非担がん及び担がんマウス）における、OVA特異的T細胞（CD44highOVA-MHCクラスIペンタマー結合CD8+ T細胞）の誘導についての、フローサイトメトリー法による解析結果を示す。ＡはY軸にCD44、X軸にOVA-MHCクラスIペンタマーを表示したドットプロット、ＢはCD8+ T細胞中のCD44highOVA-MHCクラスIペンタマー結合CD8+ T細胞のパーセンテージ（％）を示す。*P <0.01（WTマウスと比較、又はWTマウス及びClec4A4欠損マウスにおける非担がん群と担がん群間の比較）。 図２は、がんワクチン接種又はがんワクチン非接種のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（非担がん及び担がんマウス）における、OVA特異的T細胞（OVA特異的IFN-γ産生CD8+ T細胞）の誘導についての、フローサイトメトリー法による解析結果を示す。ＡはY軸にCD8α、X軸にIFN-γを表示したドットプロット、ＢはCD8+ T細胞中のOVA特異的IFN-γ産生CD8+T細胞のパーセンテージ（％）を示す。*P <0.01（WTマウスと比較、又はWTマウス及びClec4A4欠損マウスにおける非担がん群と担がん群間の比較）。 図３は、がんワクチン接種又はがんワクチン非接種の担がん状態のWTマウス及びClec4A4欠損マウスにおけるがん進展の評価結果を示す。Ａはがん細胞移植の18日後の担がんマウスの写真と腫瘍体積（mm3）を示す。Ｂは、がん細胞移植後23日間の腫瘍体積値の経時的変化を示す。Ｃはがん細胞移植の23日後の腫瘍体積を示す。*P <0.01（WTマウスのワクチン接種群又はワクチン非接種群との比較、又はWTマウス及びClec4A4欠損マウスにおける非担がん群と担がん群間の比較）。 図４は、Clec4A4の免疫細胞動態に対する制御機能を示す。非担がん又は担がん（B16-OVA）のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-）の脾臓（Ａ）とがん組織（Ｂ）における免疫細胞動態をがん細胞移植の20日後に評価した。脾臓細胞中の各免疫細胞の割合をフローサイトメトリー法により解析した（Ａ）。腫瘍浸潤白血球中の各免疫細胞の割合をフローサイトメトリー法により解析した（Ｂ）。各細胞表面分子の発現をドットプロットで示す。Ａ、Ｂにおいて、最左列はCD11c（X軸）及びSiglecH（Y軸）、左から２番目の列はB220（X軸）及びGr-1（Y軸）、中央列はF4/80（X軸）及びCD11b（Y軸）、右から２番目の列はNK1.1（X軸）及びCD3（Y軸）、最右列はCD8（X軸）及びCD4（Y軸）の発現を示している。 図５は、Clec4A4のリンパ組織T細胞活性化に対する制御機能を示す。非担がん又は担がん（B16-OVA）のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-）の脾臓におけるT細胞動態をがん細胞移植の20日後に評価した。脾臓CD4+ T細胞（Ａ）と脾臓CD8+ T細胞（Ｂ）の各細胞表面分子の発現をフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子の発現をヒストグラムで示す。Ａ、Ｂにおいて、左列はCD44、右列はCD62Lの発現を示している。 図６は、Clec4A4の腫瘍浸潤T細胞活性化に対する制御機能を示す。担がん（B16-OVA）のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-）のがん組織におけるT細胞動態をがん細胞移植の20日後に評価した。腫瘍浸潤CD4+ T細胞（Ａ）と腫瘍浸潤CD8+ T細胞（Ｂ）の各細胞表面分子の発現をフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子の発現をヒストグラムで示す。Ａ、Ｂにおいて、左列はCD44、右列はCD62Lの発現を示している。 図７は、Clec4A4の脾臓樹状細胞活性化に対する制御機能を示す。非担がん又は担がん（B16-OVA）のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-）の脾臓における樹状細胞動態をがん細胞移植の20日後に評価した。脾臓樹状細胞の各細胞表面分子の発現をフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子の発現をヒストグラムで示す。Ａにおいて、最左列はMHC-I、左から２番目の列はMHC-II、中央列はCD40、右から２番目の列はCD80、最右列はCD86の発現を示している。Ｂにおいて、最左列はCD11c、左から２番目の列はClec4A4、中央列はB7-H1、右から２番目の列はB7-H2、最右列はB7-DCの発現を示している。 図８は、Clec4A4の腫瘍浸潤樹状細胞活性化に対する制御機能を示す。担がん（B16-OVA）のWTマウス及びClec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-）のがん組織における樹状細胞動態をがん細胞移植の20日後に評価した。腫瘍浸潤樹状細胞の各細胞表面分子の発現をフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子の発現をヒストグラムで示す。Ａにおいて、最左列はMHC-I、左から２番目の列はMHC-II、中央列はCD40、右から２番目の列はCD80、最右列はCD86の発現を示している。Ｂにおいて、最左列はCD11c、左から２番目の列はClec4A4、中央列はB7-H1、右から２番目の列はB7-H2、最右列はB7-DCの発現を示している。 図９は、健常人末梢血由来免疫細胞でのCLEC4Aの発現状態を示す図である。Ａは、末梢血単核球画分中のCD3+ T細胞、CD19+ B細胞、CD11c+樹状細胞、CD14+単球、CD56+ NK細胞における細胞表面分子CLEC4Aの発現をヒストグラムで示す。Ｂは、末梢血単核球画分における細胞表面分子CD141、CD1c、CD303、CD11c、HLA-DR、及びCLEC4Aの発現をヒストグラムで示す。Ｃは、末梢血単球、末梢血単球由来樹状細胞、及び末梢血単球由来免疫抑制性樹状細胞（DCreg）における細胞表面分子CD11c、CD40、CD80、CD86、HLA-DR、及びCLEC4Aの発現をヒストグラムで示す。 図１０は、トランスジェニック細胞株におけるGFP及びCLEC4Aの発現を示すドットプロットである。Ａは、マウス樹状細胞株DC2.4（図中、DC2.4）、対照レトロウイルス感染細胞株（図中、モック-GFP）、及びCLEC4A発現細胞株（図中、CLEC4A-GFP）における、GFP（X軸）及びCLEC4A（Y軸）の発現を示す。Ｂは、マウス樹状細胞株DC2.4、糖鎖修飾部位置換変異体発現細胞株（図中、CLEC4AN185Q-GFP）、CRD-EPS欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔE195-S197-GFP）、細胞外領域欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔF69-L237-GFP）及びITIM（Immunoreceptor tyrosine-based Inhibition motif）配列欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔI5-V10-GFP）における、GFP及びCLEC4Aの発現を示す。 図１１は、トランスジェニック細胞株におけるサイトカイン産生能を示す。Ａは、LPS刺激又は無刺激のCLEC4A又は変異体トランスジェニック細胞株における、培養上清中のIL-6産生量を示す。Ｂは、LPS刺激又は無刺激のCLEC4A又は変異体トランスジェニック細胞株における、培養上清中のTNF-α産生量を示す。Ｃは、CpG-B ODN 1668刺激又は無刺激のCLEC4A又は変異体トランスジェニック細胞株における、培養上清中のIL-6産生量を示す。Ｄは、CpG-B ODN 1668刺激又は無刺激のCLEC4A又は変異体トランスジェニック細胞株における、培養上清中のTNF-α産生量を示す。*P <0.01（対照レトロウイルス感染細胞株と比較、又はCLEC4A発現細胞株と糖鎖修飾部位置換変異体発現細胞株間の比較）。 図１２は、CLEC4A機能阻害抗体#1～#4のエピトープを構成する抗体結合配列（細い下線部）の、CLEC4Aタンパク質の一次配列上の位置を示す。糖鎖認識ドメイン（CRD）内のEPSモチーフに太い下線を引いた。N型糖鎖修飾部位（N185）を矢印で示した。 図１３は、CLEC4A発現トランスジェニックマウスの膵臓単核球におけるCLEC4A発現を示す。Ａは、脾臓単核球中のCD3+ T細胞、CD19+ B細胞、CD11b+マクロファージ、CD11c+樹状細胞、及びNK1.1+ NK細胞におけるCLEC4Aの発現をヒストグラムで示す。Ａの各列は左から順に、CD3+T細胞、CD19+ B細胞、CD11b+マクロファージ、CD11c+樹状細胞、及びNK1.1+ NK細胞を示している。Ｂは、脾臓樹状細胞亜集団（CD11c+CD8α+cDC1細胞、CD11c+CD4+cDC2細胞、及びCD11c+SiglecH+pDC細胞）におけるCLEC4Aの発現をヒストグラムで示す。Ｂの各列は左から順に、cDC1: CD11c+CD8α+cDC1細胞、cDC2: CD11c+CD4+cDC2細胞、及びpDC: CD11c+SiglecH+pDC細胞を示している。 図１４は、担がんCLEC4A発現トランスジェニックマウスにおけるCLEC4A機能阻害抗体#1～#4のがん進展に対する制御を示す。Ａは、がん細胞移植の13日後の腫瘍の外観を示す写真である。Ｂ及びＣは、がん細胞移植の13日後（Ｂ）及び22日後（Ｃ）の腫瘍体積を示す。*P <0.01（対照マウスIgG処理群と比較）。 図１５は、担がんCLEC4A発現トランスジェニックマウスにおけるがん細胞移植後22日間の腫瘍体積の経時的変化を示す。 図１６は、担がんマウスにおけるがん細胞移植の22日後の体重変化を示す。 図１７は、担がんマウス由来のがん組織中のCD4+ T細胞及びCD8+ T細胞の集積をフローサイトメトリー法により解析した結果を示す。各細胞表面分子の発現をドットプロットで示す。数値は腫瘍浸潤白血球中のCD4+ T細胞又はCD8+ T細胞の割合を示す。 図１８は、がん細胞移植の21日後の担がんマウスの各臓器の組織染色の結果を示す。 図１９は、がん進展評価の結果を示す。Ａはがん細胞移植後21日間の担がんマウス腫瘍体積の経時変化を示す。Ｂはがん細胞移植の21日後の担がんマウスにおける腫瘍体積を示す。Ｃはがん細胞移植の21日後の担がんマウス及び摘出した腫瘍の写真を示す。*P <0.01; 未処理群と比較、各実験群間の比較。 図２０は、がん組織中の細胞の解析結果を示す。Ａ：各細胞表面分子の発現をドットプロットで示す。Ａの最左列はCD11c（X軸）及びSiglecH（Y軸）、左から２番目の列はB220（X軸）及びGr-1（Y軸）、左から３番目の列はF4/80（X軸）及びCD11b（Y軸）、右から３番目の列はNK1.1（X軸）及びCD3（Y軸）、右から２番目の列はCD4（X軸）及びCD3（Y軸）、最右列はCD8（X軸）及びCD3（Y軸）の発現を示している。Ｂ：がん組織における各免疫抑制分子の発現レベルを示す。*P <0.01; 未処理群と比較、各実験群間の比較。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、CLEC4Aの免疫チェックポイント分子としての機能に基づくものである。より具体的には、本発明は、ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域に特異的に結合する、免疫チェックポイント阻害作用を有する抗体に関する。本発明はまた、そのような抗体を用いた、免疫チェックポイント阻害に基づく抗腫瘍免疫応答の活性化及びそれによるがんの治療又は予防用途、並びに抗腫瘍薬に関する。
　本発明において、CLEC4Aは、Cタイプ（カルシウム依存性）レクチンドメインファミリー4メンバーA（C-type Lectin Domain Family 4 Member A）と称されるタンパク質である。CLEC4Aは樹状細胞などの抗原提示細胞で発現する免疫チェックポイント分子であり、抗原提示細胞の活性化を負に制御する免疫抑制機能を有し、がん免疫応答を負に制御する。
　本発明に係る免疫チェックポイント阻害作用を有する抗体は、ヒトCLEC4Aタンパク質に結合し、CLEC4Aの免疫チェックポイント分子としての機能を阻害することから、以下、CLEC4A機能阻害抗体とも称する。本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体は、ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域に結合し、好ましくは特異的に結合してその機能を阻害する。CLEC4A機能阻害抗体は、それが投与される対象の内因性CLEC4Aタンパク質に結合し、その機能を阻害することができる。好ましい実施形態では、CLEC4A機能阻害抗体は、樹状細胞、B細胞（CD19+ B細胞）、単球（CD14+ 単球）などの抗原提示細胞の細胞表面上に発現したCLEC4Aタンパク質に結合し、そのCLEC4Aタンパク質の免疫チェックポイント分子としての機能を阻害することができる。
　ヒトCLEC4Aタンパク質の全長アミノ酸配列の例を配列番号２に、それをコードする塩基配列の例を配列番号１に示す。ヒトCLEC4Aタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるヒトCLEC4Aタンパク質又はその機能性変異体であってよい。CLEC4Aタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列に対して90％以上、93％以上、95％以上、又は98％以上、好ましくは99％以上、例えば99.5％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるものであってよく、免疫チェックポイント機能（樹状細胞などの抗原提示細胞における免疫チェックポイント分子としての機能）を保持することが好ましい。
　本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体は、ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域に特異的に結合するものであってよい。本発明において、ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域とは、典型的には、配列番号２で示されるアミノ酸配列の69位から237位までの領域（配列番号１２）、又は他のCLEC4Aタンパク質のアミノ酸配列においてその領域とアラインメントされる領域を指す。一実施形態では、CLEC4A機能阻害抗体は、CLEC4Aタンパク質の細胞外領域内の糖鎖認識ドメイン（carbohydrate-recognition domain; CRD）に結合する（好ましくは、特異的に結合する）ものであってよい。本発明では、CLEC4Aタンパク質の細胞外領域内の糖鎖認識ドメインは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の107番目（Phe）から237番目（Leu）までの領域、又は他のCLEC4Aタンパク質のアミノ酸配列においてその領域とアラインメントされる領域を指すものとする。
　より好ましい一実施形態では、CLEC4A機能阻害抗体は、CLEC4Aタンパク質（好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質）の113番目（Phe）から192番目（His）までのアミノ酸配列（配列番号２１）を含むか又はそれからなる領域に結合する（好ましくは、特異的に結合する）ものであってよい。
　CLEC4Aタンパク質の細胞外領域内の糖鎖認識ドメイン（CRD）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列（ヒトCLEC4Aタンパク質）の195位～197位にEPSモチーフ（Glu-Pro-Ser）を有する。ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞内領域内のITIM配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列の5位～10位に位置する領域を指す。
　一実施形態では、本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体（抗体又はその抗原結合性断片）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列上のWVDQTPYNESSTFW（配列番号１５）を含む15アミノ酸長のアミノ酸配列からなるペプチド断片、すなわち、QWVDQTPYNESSTFW（配列番号２２）からなるペプチド断片及びWVDQTPYNESSTFWH（配列番号２３）からなるペプチド断片に（特異的に）結合することができる。好ましい実施形態では、このCLEC4A機能阻害抗体は、ヒトCLEC4Aタンパク質のアミノ酸配列WVDQTPYNESSTFW（配列番号１５）を含むエピトープ、好ましくは線状（連続）エピトープに特異的に結合する。本発明は、アミノ酸配列WVDQTPYNESSTFW（配列番号１５）を含むか又はそれからなるペプチド断片（以下に限定するものではないが、例えば、14～20アミノ酸長、14～15アミノ酸長、又は14アミノ酸長のペプチド）に特異的に結合する抗体である、CLEC4A機能阻害抗体を提供する。
　別の実施形態では、本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体（抗体又はその抗原結合性断片）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列上のQNLQEESAYF（配列番号１６）を含む15アミノ酸長のアミノ酸配列からなるペプチド断片に（特異的に）結合することができる。すなわちこのCLEC4A機能阻害抗体は、アミノ酸配列QDFIFQNLQEESAYF（配列番号２４）、DFIFQNLQEESAYFV（配列番号２５）、FIFQNLQEESAYFVG（配列番号２６）、IFQNLQEESAYFVGL（配列番号２７）、FQNLQEESAYFVGLS（配列番号２８）、及びQNLQEESAYFVGLSD（配列番号２９）のそれぞれからなるペプチド断片に結合することができる。本発明は、アミノ酸配列QNLQEESAYF（配列番号１６）を含むか又はそれからなるペプチド断片（以下に限定するものではないが、例えば、10～20アミノ酸長、10～15アミノ酸長、又は10アミノ酸長のペプチド）に特異的に結合する抗体である、CLEC4A機能阻害抗体を提供する。
　CLEC4A機能阻害抗体（抗体又はその抗原結合性断片）は、アミノ酸配列QNLQEESAYF（配列番号１６）を含むか又はそれからなるペプチド断片（以下に限定するものではないが、例えば、10～20アミノ酸長、10～15アミノ酸長、又は10アミノ酸長のペプチド）、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列上のQNLQEESAYF（配列番号１６）を含む15アミノ酸長のアミノ酸配列からなるペプチド断片に結合できることに加えて、アミノ酸配列FSSNCYFISTESASW（配列番号１７）からなるペプチド断片に（特異的に）結合することができるものであってよい。このようなCLEC4A機能阻害抗体は、ヒトCLEC4Aタンパク質の不連続エピトープに結合する抗体であることが好ましく、特に、ヒトCLEC4Aタンパク質のFSSNCYFISTESASW（配列番号１７）とQNLQEESAYF（配列番号１６）を含むアミノ酸配列（例えば、配列番号２の113番目～164番目のアミノ酸配列）により構成される不連続エピトープに（特異的に）結合する抗体であることがより好ましい。そのような不連続エピトープは、当該CLEC4A機能阻害抗体によって認識される部位として、アミノ酸配列FSSNCYFISTESASW（配列番号１７）及びQNLQEESAYF（配列番号１６）の少なくとも一部のアミノ酸残基を含み、好ましくは、アミノ酸配列FSSNCYFISTESASW（配列番号１７）の少なくとも一部のアミノ酸残基とアミノ酸配列QNLQEESAYF（配列番号１６）の全体とを含む。このCLEC4A機能阻害抗体は、SSNCYFISTESASWQ（配列番号３０）からなるペプチド断片に結合しないものであってもよい。
　あるいは、CLEC4A機能阻害抗体（抗体又はその抗原結合性断片）は、アミノ酸配列QNLQEESAYF（配列番号１６）を含むか又はそれからなるペプチド断片（以下に限定するものではないが、例えば、10～20アミノ酸長、10～15アミノ酸長、又は10アミノ酸長のペプチド）、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列上のQNLQEESAYF（配列番号１６）を含む15アミノ酸長のアミノ酸配列からなるペプチド断片に結合できることに加えて、アミノ酸配列SSNCYFISTESASW（配列番号１８）を含むか又はそれからなるペプチド断片（以下に限定するものではないが、例えば、14～20アミノ酸長、14～15アミノ酸長、又は14アミノ酸長のペプチド）、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列上のSSNCYFISTESASW（配列番号１８）を含む15アミノ酸長のアミノ酸配列からなるペプチド断片に（特異的に）結合することができるものであってもよい。すなわちそのCLEC4A機能阻害抗体は、アミノ酸配列FSSNCYFISTESASW（配列番号１７）又はSSNCYFISTESASWQ（配列番号３０）のそれぞれからなるペプチド断片に結合することができる。このようなCLEC4A機能阻害抗体は、ヒトCLEC4Aタンパク質の不連続エピトープに結合する抗体であることが好ましく、ヒトCLEC4Aタンパク質のSSNCYFISTESASW（配列番号１８）とQNLQEESAYF（配列番号１６）を含むアミノ酸配列（例えば、配列番号２の114番目～164番目のアミノ酸配列）により構成される不連続エピトープに（特異的に）結合する抗体であることがより好ましい。そのような不連続エピトープは、当該CLEC4A機能阻害抗体によって認識される部位として、アミノ酸配列SSNCYFISTESASW（配列番号１８）及びQNLQEESAYF（配列番号１６）の少なくとも一部のアミノ酸残基を含み、好ましくはSSNCYFISTESASW（配列番号１８）の全体とQNLQEESAYF（配列番号１６）の全体とを含む。
　さらに別の実施形態では、本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体（抗体又はその抗原結合性断片）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列上のKKNMPVEETAWSCC（配列番号１９）を含む15アミノ酸長のアミノ酸配列からなるペプチド断片、すなわち、VKKNMPVEETAWSCC（配列番号３１）からなるペプチド断片及びKKNMPVEETAWSCCP（配列番号３２）からなるペプチド断片に（特異的に）結合することができる。好ましい実施形態では、このCLEC4A機能阻害抗体は、ヒトCLEC4Aタンパク質のアミノ酸配列KKNMPVEETAWSCC（配列番号１９）を含む（例えば、その配列からなる）エピトープ、好ましくは線状（連続）エピトープに特異的に結合する。本発明は、アミノ酸配列KKNMPVEETAWSCC（配列番号１９）を含むか又はそれからなるペプチド断片（以下に限定するものではないが、例えば、14～20アミノ酸長、14～15アミノ酸長、又は14アミノ酸長のペプチド）に特異的に結合する抗体である、CLEC4A機能阻害抗体を提供する。
　ここで「ペプチド断片」とは、所定のタンパク質（特に、全長CLEC4Aタンパク質）の断片であるペプチド又はそれに相当する合成ペプチドを指すものであり得る。本発明において「ペプチド断片」という用語は、用語「ペプチド」と互換的に使用することができる。本発明におけるペプチド断片又はペプチドは、オリゴペプチドであってもよい。本発明においてオリゴペプチドとは、2～20アミノ酸長を有するペプチドを指す。
　なお本明細書において、アミノ酸残基やアミノ酸配列は当該分野で一般的に使用される一文字表記又は三文字表記に従って記載されている。
　本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス、例えばIgG、IgE、IgM、IgA、IgD、又はIgYであってよく、さらに任意のサブクラス、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等であってよい。
　CLEC4A機能阻害抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。CLEC4A機能阻害抗体は、任意の抗体形態であってよく、例えば、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ等であってよい。CLEC4A機能阻害抗体はまた、全抗体であってもよいし、全抗体の抗原結合性断片、例えばFab、F(ab')2、Fab'、Fv、scFv、sdFv等であってもよい。CLEC4A機能阻害抗体は、グリコシル化、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、又はペグ（PEG）化等の任意の修飾がされていてもよい。
　CLEC4A機能阻害抗体は、常法により作製することができる。CLEC4A機能阻害抗体は、公知の抗体作製法に基づいて作製することができる。例えば、まず、CLEC4A機能阻害抗体の産生を惹起し得る抗原を、動物の皮下、足蹠、腹腔内等に投与して免疫する。そのような抗原は、CLEC4A機能阻害抗体が結合するヒトCLEC4Aタンパク質中の標的配列（例えば、エピトープ又はその一部）を含む抗原であり、以下に限定するものではないが、全長ヒトCLEC4Aタンパク質、上記標的配列を含有するヒトCLEC4Aタンパク質断片、上記標的配列からなるポリペプチド、上記標的配列を含む抗原（例えば、上記標的配列を含むヒトCLEC4Aタンパク質部分配列からなるポリペプチドと免疫グロブリンFc分子などの他のポリペプチドとの融合タンパク質）、及び上記標的配列を含むポリペプチドを細胞表面に発現する細胞等が挙げられる。抗原は、任意のアジュバントと共に投与してもよい。抗原の投与は１回でもよいが、複数回（例えば、２回～１０回、好ましくは２～５回）行うことが好ましい。免疫後、免疫細胞（例えば、リンパ節細胞、又は脾臓細胞）を通常の細胞融合法によって公知の親細胞（例えば、ミエローマ細胞などの不死化細胞）と融合させ、融合細胞を得る。融合相手の親細胞は、免疫細胞と同じ生物種に由来することが好ましい。融合相手の親細胞として用いられるマウス由来のミエローマ細胞としては、P3U1（P3-X63Ag8U1）、P3（P3x63Ag8.653）、P3x63Ag8U.1、NS-1、MPC-11等が挙げられるが、これらに限定されない。
　免疫細胞と親細胞との細胞融合は、例えば、ケーラーとミルステインの方法（Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981)73, 3-46）等に準じて行うことができる。具体的には、そのような細胞融合は、細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で実施される。細胞融合促進剤としては、例えば平均分子量1000～6000程度のポリエチレングリコール（PEG）（例えば、PEG4000）、センダイウイルス（HVJ）等を使用することができる。融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤をさらに使用することもできる。免疫細胞と親細胞（ミエローマ細胞等）との使用割合は任意に設定することができる。
　得られた融合細胞を、目的のCLEC4A機能阻害抗体の産生能についてスクリーニングし、クローン化することにより、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を取得することができる。そのハイブリドーマを培養して得られる培養上清から抗体を回収することによってCLEC4A機能阻害抗体を作製することができる。
　CLEC4A機能阻害抗体がポリクローナル抗体の場合には、上記のとおり免疫した動物（非ヒト動物）から血清を採取することにより取得することができる。この場合、免疫する動物として、ヒト抗体産生非ヒト動物を用いることができる。
　CLEC4A機能阻害抗体のスクリーニングは、例えば、CLEC4A機能阻害抗体が結合する抗原及び／又はペプチド断片への結合性を調べることにより行ってもよい。例えば、ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域、及び／又はヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域内の配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなる領域からなるポリペプチドに対する抗体の結合を検出することにより、CLEC4A機能阻害抗体をスクリーニングしてもよい。
　一実施形態では、上述のアミノ酸配列WVDQTPYNESSTFW（配列番号１５）からなるペプチド断片、並びに／又は、QWVDQTPYNESSTFW（配列番号２２）及びWVDQTPYNESSTFWH（配列番号２３）の一方又は両方のアミノ酸配列のそれぞれからなるペプチド断片に対する抗体の結合を検出することにより、CLEC4A機能阻害抗体をスクリーニングすることができる。
　別の実施形態では、上述のアミノ酸配列QNLQEESAYF（配列番号１６）からなるペプチド断片、並びに／又は、QDFIFQNLQEESAYF（配列番号２４）、DFIFQNLQEESAYFV（配列番号２５）、FIFQNLQEESAYFVG（配列番号２６）、IFQNLQEESAYFVGL（配列番号２７）、FQNLQEESAYFVGLS（配列番号２８）、及びQNLQEESAYFVGLSD（配列番号２９）からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は５つ全て）のアミノ酸配列のそれぞれからなるペプチド断片に対する抗体の結合を検出することにより、CLEC4A機能阻害抗体をスクリーニングすることができる。上記ペプチド断片に対する結合に加えて、上述のアミノ酸配列FSSNCYFISTESASW（配列番号１７）からなるペプチド断片に対する抗体の結合をさらに検出することにより、CLEC4A機能阻害抗体をスクリーニングすることもできる。あるいは、上記ペプチド断片に対する結合に加えて、上述のアミノ酸配列SSNCYFISTESASW（配列番号１８）からなるペプチド断片、並びに／又は、FSSNCYFISTESASW（配列番号１７）及びSSNCYFISTESASWQ（配列番号３０）の一方又は両方のアミノ酸配列のそれぞれからなるペプチド断片に対する抗体の結合を検出することにより、CLEC4A機能阻害抗体をスクリーニングすることもできる。
　さらに別の実施形態では、上述のアミノ酸配列KKNMPVEETAWSCC（配列番号１９）からなるペプチド断片、並びに／又は、VKKNMPVEETAWSCC（配列番号３１）及びKKNMPVEETAWSCCP（配列番号３２）の一方又は両方のアミノ酸配列のそれぞれからなるペプチド断片に対する抗体の結合を検出することにより、CLEC4A機能阻害抗体をスクリーニングすることもできる。
　ペプチド断片に対する抗体の結合は、抗原抗体反応を検出可能な任意の方法により検出することができるが、例えば、標的となるペプチド断片をアレイ上に固定したペプチドアレイを使用して検出してもよい。
　CLEC4A機能阻害抗体は、さらに、抗体遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させることにより、組換え抗体としても製造することができる。具体的には、抗体の可変領域（V領域）のcDNAを抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、発現ベクターの発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御下へ組み込み、その発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換し、宿主細胞により抗体を産生させることにより、CLEC4A機能阻害抗体を組換え抗体として作製することができる。
　以上のようにして得られた抗体や核酸等は、公知の精製法により単離精製し、回収することができる。精製法としては、アフィニティ精製法、逆相クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法、ゲル濾過、カラム精製、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）等、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体は、免疫チェックポイント阻害作用を有する。CLEC4A機能阻害抗体は、CLEC4A機能阻害により、樹状細胞などの抗原提示細胞において免疫チェックポイント阻害を引き起こし、免疫チェックポイント分子が寄与する抗腫瘍免疫応答（がん免疫応答）抑制を解除し、抗腫瘍免疫応答を活性化し、有効な抗腫瘍免疫応答（がん免疫応答）を増強することができる。
　ここで、本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体により、免疫チェックポイント阻害が引き起こされる抗原提示細胞は、CLEC4Aタンパク質を細胞表面上に発現している抗原提示細胞であり、そのような抗原提示細胞としては、樹状細胞、B細胞（例えば、CD19+ B細胞）、単球（例えば、CD14+ 単球）等が挙げられるが、これらに限定されない。なお抗原提示細胞は、抗原を細胞表面上に提示してT細胞を活性化する細胞である。したがって本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体は、免疫チェックポイント阻害剤、好ましくは樹状細胞、B細胞（例えば、CD19+ B細胞）、単球（例えば、CD14+ 単球）等の抗原提示細胞に対する免疫チェックポイント阻害剤として用いることができる。
　本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体の免疫チェックポイント阻害作用（免疫チェックポイント阻害活性）や抗腫瘍免疫応答の活性化能は、CLEC4A機能阻害抗体で処理した抗原提示細胞、例えば樹状細胞において、当該CLEC4A機能阻害抗体で処理しない場合（CLEC4A機能を阻害しない対照抗体を投与する場合）と比較して、炎症性サイトカイン（例えば、IL-6、TNF-α、IL-12p40等）の産生量が増加する（好ましくは統計学的に有意に増加する）ことを指標として、評価することができる。より具体的には、CLEC4A機能阻害抗体の免疫チェックポイント阻害作用や抗腫瘍免疫応答の活性化能の評価は、抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞を、TLR4リガンドやTLR9リガンド等のTLRリガンド、例えば、LPS又はCpG-B ODN 1668等の存在下で、CLEC4A機能阻害抗体を添加して培養し、培養液中のサイトカイン量を測定し、対照と比較することにより行うことができ、その際、炎症性サイトカイン（例えば、IL-6、TNF-α、IL-12p40等）の産生量が対照と比較して増加（好ましくは統計学的に有意に増加）した場合には当該抗体が免疫チェックポイント阻害作用（免疫チェックポイント阻害活性）及び抗腫瘍免疫応答の活性化能を有すると判断することができる。
　本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体は、抗腫瘍薬の有効成分として用いることができる。本発明は、本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体を含む、抗腫瘍薬又は医薬組成物も提供する。抗腫瘍薬又は医薬組成物は、本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体を治療上有効量で含むことが好ましい。そのような抗腫瘍薬又は医薬組成物は、がんの治療又は予防用、例えば、がんの進展抑制又はがんの再発予防用のものであってよい。本発明に係る抗腫瘍薬又は医薬組成物は、樹状細胞、B細胞（CD19+ B細胞）、単球（CD14+ 単球）等の抗原提示細胞に対する免疫チェックポイント阻害に基づくがんの治療又は予防、例えば、がんの進展抑制又はがんの再発予防のために有用である。
　本発明において「がんの進展抑制」とは、がんの病状の悪化（とりわけ、腫瘍サイズの増加）を遅らせるか若しくは防止する、又は病状を回復させることを含む。一実施形態では、がんの進展抑制は、腫瘍サイズ（例えば、腫瘍体積）を指標として評価することができる。例えば、本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体を投与した対象（がん患者）又は担がん動物モデルにおいて、腫瘍サイズ（例えば、腫瘍体積）を（好ましくは経時的に）測定し、対照群（本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体の代わりに抗腫瘍作用を有しない抗体を投与する）と比較して、腫瘍サイズの低下（好ましくは統計学的に有意な低下）が認められる場合にはがんの進展が抑制されたと判断することができる。
　本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体による、抗腫瘍免疫応答の活性化、及び治療又は予防の対象となるがん又は腫瘍としては、以下に限定されないが、例えば、悪性黒色腫、肺がん、腎細胞がん、頭頚部がん、膀胱がん、膵がん、胃がん、肝臓がん、食道がん、胆道がん、大腸がん、尿路上皮がん、膠芽腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、子宮頸がん、子宮体がん、乳がん、悪性胸膜中皮腫、軟部肉腫、リンパ腫（ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫、精巣原発リンパ腫等）、ウイルス陽性又は陰性固形がん、メルケル細胞がん等が挙げられる。
　本発明に係る抗腫瘍薬又は医薬組成物は、CLEC4A機能阻害抗体に加えて、製薬上許容される添加剤をさらに含んでもよい。そのような添加剤としては、以下に限定されないが、担体、懸濁剤、結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、保存剤、着色剤、pH調整剤等が挙げられる。添加剤は、単独でも２種以上を組み合わせても用いることができ、製剤の剤形に応じて適宜用いることができる。
　本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体、又はそれを含む抗腫瘍薬若しくは医薬組成物は、非経口又は経口投与などの任意の投与経路で投与することができるが、非経口投与が好ましく、例えば静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、皮下、皮内、経鼻、経肺、又は腫瘍内等に投与することができる。本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体、又はそれを含む抗腫瘍薬若しくは医薬組成物は、全身投与又は局所投与してもよい。
　本発明はまた、本発明に係るCLEC4A機能阻害抗体、又はそれを含む抗腫瘍薬若しくは医薬組成物を対象（患者）に投与することを含む、免疫チェックポイント阻害方法も提供する。本発明はまた、CLEC4A機能阻害抗体、又はそれを含む抗腫瘍薬若しくは医薬組成物を対象（患者）に投与することを含む、免疫チェックポイント阻害に基づく、抗腫瘍免疫応答の活性化方法（又は抗腫瘍免疫応答の誘導方法）も提供する。本発明はまた、CLEC4A機能阻害抗体、又はそれを含む抗腫瘍薬若しくは医薬組成物を対象に投与することを含む、がんの治療又は予防方法も提供する。がんの治療又は予防方法は、がんの進展抑制方法又はがんの再発予防方法であってもよい。
　対象は、好ましくは哺乳動物であり、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ等の霊長類、マウス、ラット、モルモット等のげっ歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、ラクダ、イヌ、ネコ、ウサギ等の哺乳動物由来であってよいが、好ましくはヒトである。対象は、免疫チェックポイント分子による免疫抑制が生じているか又は生じている疑いのある対象であってよい。対象は、典型的には、がんを有するか又はがんを有する疑いのある対象であってよい。対象は、がん免疫治療法に不応性となっているか又はがん免疫治療法への応答性が低下している対象であってよい。そのようながん免疫治療法への不応性、又は応答性の低下は、免疫チェックポイント、特に、樹状細胞、B細胞（例えば、CD19+ B細胞）、単球（例えば、CD14+ 単球）等の抗原提示細胞における免疫チェックポイントによって引き起こされるものであり得る。対象はまた、T細胞に発現する免疫チェックポイント分子（CTLA-4、PD-1、PD-L1等）に対する阻害剤への不応性又は耐性を有するがんに罹患した患者であってもよい。対象は、既存の免疫チェックポイント阻害剤への不応性又は耐性を有するがん患者であってもよい。あるいは、対象は、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、T細胞に発現する免疫チェックポイント分子に対する阻害剤；以下、T細胞発現免疫チェックポイント分子阻害剤とも称する）に対する不応性又は耐性を有しないがん患者であってもよい。
　投与方法は、対象（患者）の生物種、年齢、体重、性別、症状などにより、当業者が適宜選択することができる。CLEC4A機能阻害抗体の投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mg～1000mgの範囲で、及び／又は対象当たり0.001mg～100000mgの範囲で、投与量を設定することができるが、これらの範囲に限定されない。
　CLEC4A機能阻害抗体、又はそれを含む抗腫瘍薬若しくは医薬組成物の対象への投与により、抗原提示細胞、例えば樹状細胞において、炎症性サイトカインの産生が増強され、それがT細胞や他の免疫細胞の機能を活性化／増強し、抗腫瘍免疫応答を活性化（惹起）し、結果的に対象におけるがんの進展抑制、腫瘍退縮、又はがんの再発予防などの効果がもたらされる。好ましい実施形態では、本発明のCLEC4A機能阻害抗体、又はそれを含む抗腫瘍薬若しくは医薬組成物は、（i）リンパ組織及び／又はがん組織における、骨髄由来抑制細胞の誘導及び／又は集積の抑制、（ii）リンパ組織及び／又はがん組織における、エフェクターT細胞、腫瘍浸潤T細胞（例えば、CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞）、及び活性化樹状細胞の誘導及び／又は集積の促進、（iii）がん微小環境での免疫寛容の抑制、並びに（iv）抗腫瘍免疫応答の活性化の少なくとも１つをもたらすことができる。
　生体内で顕在化したがん細胞は免疫監視機構から逃れていると考えられており、免疫チェックポイント分子はその主要な逃避機序の一つであるとされる。近年、臨床応用された免疫チェックポイント阻害剤（抗CTLA-4抗体［イピリムマブ；ヤーボイ］、抗PD-1抗体［ニボルマブ；オプジーボ］、抗PD-L1抗体［アベルマブ；バベンチオ］等）は特定のがん種に対する高い奏功性が示されているが、多様ながんに対する不応答性や耐性獲得とともに、免疫関連有害事象（irAEs）の発症が問題とされている。それに対し、本発明のCLEC4A機能阻害抗体は、免疫関連有害事象（例えば、自己免疫疾患又は障害などの自己免疫病態、体重減少、組織傷害等）、特に、T細胞に発現する免疫チェックポイント分子の阻害に起因する免疫関連有害事象を生じるリスクを低減しながら高い抗腫瘍効果をもたらすことができる。したがって本発明のCLEC4A機能阻害抗体、又はそれを含む抗腫瘍薬若しくは医薬組成物は、高い抗腫瘍効果とともにより高い安全性も実現することができる。
　本発明では、上記のCLEC4A機能阻害抗体、又はそれを含む抗腫瘍薬若しくは医薬組成物を、他の免疫チェックポイント阻害剤と併用（併用投与）してもよい。他の免疫チェックポイント阻害剤としては、典型的には、T細胞に発現する免疫チェックポイント分子に対する阻害剤が挙げられるが、これに限定されない。T細胞に発現する免疫チェックポイント分子の例としては、以下に限定されないが、PD-1、CTLA-4、PD-L1、Tim-3、BTLA、LAG-3、TIGHT等が挙げられる。免疫チェックポイント分子に対する阻害剤は、免疫チェックポイント分子（タンパク質）自体の機能又は免疫チェックポイント分子をコードする遺伝子の機能を阻害する作用（アンタゴニスト作用）を有する任意の物質であり、例えば、抗体（好ましくは、中和抗体）であってもよいし、免疫チェックポイント分子の発現（当該分子をコードする遺伝子の発現）を阻害する核酸分子であってもよい。そのような阻害性核酸分子は、以下に限定するものではないが、siRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、hpRNA（hairpin RNA）、又はそれを含むより長い核酸であってもよい。一実施形態では、T細胞に発現する免疫チェックポイント分子に対する阻害剤（T細胞発現免疫チェックポイント分子阻害剤）は、既存の免疫チェックポイント阻害剤であってもよく、例えば、抗CTLA-4抗体（イピリムマブなど）、抗PD-1抗体（ニボルマブなど）、抗PD-L1抗体（アベルマブなど）等であってもよい。上記のCLEC4A機能阻害抗体、又はそれを含む抗腫瘍薬若しくは医薬組成物は、例えばT細胞発現免疫チェックポイント分子阻害剤と併用することにより、上記のCLEC4A機能阻害抗体を単独で使用する場合と比較しても顕著に高い、相乗的ながん治療効果をもたらすことができる。したがって本発明は、T細胞発現免疫チェックポイント分子阻害剤と併用するための、上記のCLEC4A機能阻害抗体、又はそれを含む抗腫瘍薬若しくは医薬組成物も提供する。さらに本発明は、上記のCLEC4A機能阻害抗体に加えて、T細胞発現免疫チェックポイント分子阻害剤を含む、抗腫瘍薬又は医薬組成物も提供する。そのような抗腫瘍薬又は医薬組成物は、上記のCLEC4A機能阻害抗体、及びT細胞発現免疫チェックポイント分子阻害剤を、それぞれ治療上有効量で含むことが好ましい。上記のCLEC4A機能阻害抗体とT細胞発現免疫チェックポイント分子阻害剤を併用する抗腫瘍薬若しくは医薬組成物、又は併用療法を適用（投与）する対象は、既存の免疫チェックポイント阻害剤に対して不応性又は耐性を有するがん患者であってもよいし、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、T細胞発現免疫チェックポイント分子阻害剤）に対する不応性又は耐性を有しないがん患者であってもよい。併用投与において、上記のCLEC4A機能阻害抗体、又はそれを含む抗腫瘍薬若しくは医薬組成物と、他の免疫チェックポイント阻害剤（T細胞発現免疫チェックポイント分子阻害剤等）は、任意の時期に、例えば、同時に、連続的に、又は別々の時期に投与してもよく、また、別個の薬剤として投与してもよいし単一の薬剤に含めて投与してもよい。
　上記のCLEC4A機能阻害抗体、又はそれを含む抗腫瘍薬若しくは医薬組成物の対象への投与は、がん組織における免疫抑制分子の発現を抑制することができる。上記のCLEC4A機能阻害抗体は、例えば、IL（インターロイキン）-10、IDO（インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ）、アルギナーゼ、及びmPGES（膜関連プロスタグランジンE2シンターゼ）の発現を抑制することができる。上記のCLEC4A機能阻害抗体とT細胞発現免疫チェックポイント分子阻害剤の併用投与は、がん組織における免疫抑制分子の発現をより強力に抑制することができ、例えば、IL-10、IDO、アルギナーゼ、COX-2、mPGES、TGF（トランスフォーミング増殖因子）-β、及びiNOS（誘導型一酸化窒素合成酵素）からなる群から選択される少なくとも１つの発現を顕著に抑制することができる。
　本発明では、上記のCLEC4A機能阻害抗体、又はそれを含む抗腫瘍薬若しくは医薬組成物の投与を含む方法、例えば、抗腫瘍免疫応答の活性化方法又はがんの治療若しくは予防方法を、がんワクチン療法と併用してもよい。併用するがんワクチン療法の例としては、がん抗原、がん抗原とアゴニストTLRリガンドの組み合わせ、又はがん抗原とアゴニストTLRリガンドとアゴニスト抗CD40抗体との組み合わせを患者に投与する方法が挙げられる。がん抗原としては、例えば、WT1、MAGE-A1、MAGE-A3、gp100、Melan A、NY-ESO-1、MUC1、LMP2、HPV E6 E7、EGFRvIII、HER-2/neu、イディオタイプ、p53非変異型（p53 nonmutant）、BAGE、チロシナーゼ、CEA、bcr/abl、ras等が挙げられるが、これらに限定されない。アゴニストTLRリガンド（アゴニスト作用性TLRリガンド又はTLRアゴニストとも呼ばれる）としては、TLR1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、及び／又は13等のアゴニストリガンド、例えば、CpG ODN 2006やCpG-B ODN 1668等の非メチル化CpGジヌクレオチドモチーフ含有オリゴヌクレオチドであるアゴニストTLR9リガンドなどが挙げられる。ヒト対象への投与に好適なアゴニストTLRリガンドは、ヒトTLR1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10に対するアゴニストリガンドであり得る。
　本発明では、上記のCLEC4A機能阻害抗体、又はそれを含む抗腫瘍薬若しくは医薬組成物の投与を含む方法、例えば、抗腫瘍免疫応答の活性化方法又はがんの治療若しくは予防方法を、がん標準治療法（腫瘍切除のための外科治療、放射線治療、化学療法）と併用してもよい。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
　なお、下記実施例におけるフローサイトメトリー法は以下のとおり実施した。
＜フローサイトメトリー法＞
　フローサイトメトリー解析における細胞の染色には、以下の蛍光標識モノクローナル抗体を用いた。
　抗マウスCD3ε抗体（クローン145-2C11; BD Biosciences）、抗マウスCD4抗体（クローンRM4-5; BD Biosciences）、抗マウスCD8α抗体（クローン53.6.7; BD Biosciences）、抗マウスCD11b抗体（クローンM1/70; Biolegend）、抗マウスCD11c抗体（クローンHL3; BD Biosciences）、抗マウスCD40抗体（クローン3/23; BD Biosciences）、抗マウスCD44抗体（クローンIM7; BD Biosciences)、抗マウスCD80抗体（クローン16-10A1; BD Biosciences）、抗マウスCD86抗体（クローンGL1; BD Biosciences）、抗マウスCD62L抗体（クローンMEL-14; Biolegend）、抗マウスB220抗体（クローンRA3-6B2; BD Biosciences）、抗マウスF4/80抗体（クローンBM8; Biolegend）、抗マウスNK1.1抗体（クローンPK136; BD Biosciences）、抗マウスMHCクラスI抗体（クローンAF6-88.5; BD Biosciences）、抗マウスMHCクラスII抗体（クローンM5/114.15.2; BD Biosciences）、抗マウスB7-H1抗体（クローンMIH5; eBioscience）、抗マウスB7-DC抗体（クローンTY25; eBioscience）、抗マウスB7-H2抗体（クローンHK5.3; eBioscience）、抗マウスSiglecH抗体（クローン551; Biolegend）、抗マウスGr-1抗体（クローンRB6-8C5; Biolegend）、抗マウスClec4A4抗体(クローン33D1; Biolegend)、抗マウスIFN-γ抗体（クローンXMG1.2; BD Biosciences）、抗マウスCD19抗体（クローン6D5; Biolegend）、又は対照ラットIgG抗体（BD Biosciences）。
　抗ヒトCD3抗体（クローンUCHT1; TOMBO）、CD8α（クローンSK1; BD Biosciences）、抗ヒトCD11c抗体（クローン3.9; TOMBO）、抗ヒトCD14抗体（クローン61D3; TOMBO）、抗ヒトCD19抗体（クローンHIB19; TOMBO）、抗ヒトCD56抗体（クローンMY31; TOMBO）、抗ヒトCD1c抗体（クローンL161; Biolegend）、抗ヒトCD40抗体（クローン5C3; BD Biosciences）、抗ヒトCD80抗体（クローンL307.4; BD Biosciences）、抗ヒトCD86抗体（クローンIT2.2; BD Biosciences）、抗ヒトCD141抗体（クローンM80; Biolegend）、抗ヒトCD303抗体（クローン201A; Biolegend）、抗ヒトHLA-DR抗体（クローンL243; Biolegend）、抗ヒトCLEC4A抗体（クローン9E8; Biolegend）、又は対照マウスIgG抗体（BD Biosciences）。
　細胞表面分子の染色は、細胞（1～5 x 105個）を、蛍光標識モノクローナル抗体と共に4℃で30分インキュベートすることにより染色した。
　なお一部のフローサイトメトリー解析では、細胞の染色に、蛍光標識モノクローナル抗体の代わりに、以下の蛍光標識したMHC-ペプチド複合体を用いた：マウスH-2Kb OVAペプチドペンタマー。
　蛍光染色解析はFACSVerseTMフローサイトメーター（BD Biosciences）及びFlowJoソフトウェア（Tree star）を用いて行った。
　また、下記実施例で得られたデータについて、統計学的解析は以下のとおり行った。
＜統計学的解析＞
　データの統計学的有意差の解析は分散分析（analysis of variance: ANOVA）を用いた。P値が0.01未満のものを有意とした。図中のデータは平均値（±標準偏差）で示した。
［実施例１］
１）マウス
　本実施例では、野生型（WT）マウスとして、C57BL/6マウス（Japan Clea）を用いた。非特許文献４の記載に従い、C57BL/6マウスを用いて、Clec4A4欠損マウス（Clec4a4-/-マウス）を作製した。Clec4A4欠損マウス（系統名B6.Cg-Clec4a4<tm1.1Ksat>）は、国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンター（RIKEN BRC; 日本）にアクセッション番号RBRC09657の下で寄託され、入手可能である。なおClec4A4は、CLEC4Aのマウスオルソログである。
２）非担がんマウスモデルのがんワクチン接種後の免疫応答
　WTマウス、及びClec4A4欠損マウスに、がんワクチンとして卵白アルブミン（OVA）（500 μg/1匹; Sigma-Aldrich）、Toll様受容体（Toll-like receptor; TLR）9リガンドであるCpG-B ODN 1668（50 μg/1匹; Hokkaido System Science）、及びアゴニスト抗CD40抗体（10 μg/匹; クローン1C10; Biolegend）を腹腔内投与して免疫した。免疫後6日目に、脾臓におけるOVA特異的細胞傷害性T細胞（CTL）（CD44highOVA-MHCクラスIペンタマー結合CD8+ T細胞）及びOVA特異的IFN-γ産生CD8+T細胞の誘導を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。対照として、ワクチン接種していないWTマウス及びClec4A4欠損マウスの脾臓についても同様の細胞解析を行った。
　WTマウスでは、ワクチン非接種群と比較して、がんワクチン（OVA、CpG-B ODN 1668、アゴニスト抗CD40抗体）免疫群において抗原特異的CTLであるCD44highOVA-MHCクラスIペンタマー結合CD8+ T細胞（図１Ａ及びＢ）と抗原特異的IFN-γ産生CD8+ T細胞（図２Ａ及びＢ）の誘導が増強されていることが示された。一方、Clec4A4欠損マウスのがんワクチン免疫群では、抗原特異的CTLと抗原特異的IFN-γ産生CD8+ T細胞が誘導されただけでなく、WTマウスのがんワクチン免疫群と比較して、抗原特異的CTLと抗原特異的IFN-γ産生CD8+ T細胞の誘導が著しく増強された（図１、図２）。
３）担がんマウスモデルのがん進展評価及びがんワクチン接種後の免疫応答
　WTマウス、及びClec4A4欠損マウスの背部に、卵白アルブミン（OVA）を発現する組換え悪性黒色腫細胞株（B16-OVAメラノーマ; Brown DM, et al., Immunology. (2001) 102:486-497）を皮下移植（1x105細胞/1匹）することにより、担がんマウスを作製した。がんの進展は、担がんマウスの腫瘍体積をがん移植の23日後まで毎日、デジタルキャリパー（Digimatic Caliper, Mitutoyo）を用いて測定し、それを指標として評価した。
　担がんWTマウス及び担がんClec4A4欠損マウスに対し、がん細胞移植の7日後に、がんワクチンを腹腔内投与して免疫した。がん細胞移植の13日後に、OVA特異的CTLであるCD44highOVA-MHCクラスIペンタマー結合CD8+ T細胞、及びOVA特異的IFN-γ産生CD8+T細胞の誘導を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。
　担がんWTマウス及び担がんClec4A4欠損マウスでは、非担がん状態のWTマウス及びClec4A4欠損マウスと比較して、がんワクチン免疫群での抗原特異的CTL及び抗原特異的IFN-γ産生CD8+T細胞の誘導が増強された（図１、図２）。さらに、担がんClec4A4欠損マウスのがんワクチン免疫群では、担がんWTマウスのがんワクチン免疫群と比較して、抗原特異的CTL及び抗原特異的IFN-γ産生CD8+T細胞の誘導が著しく増強された（図１、図２）。
　がん細胞移植の15日後以降、担がんWTマウス（ワクチン非接種）と比較して、担がんClec4A4欠損マウス（ワクチン非接種）では、免疫関連有害事象の発生を示さずに、がん進展が著しく抑制された（図３Ａ～Ｃ）。一方、担がんWTマウスのがんワクチン免疫群では、がん細胞移植の15日後以降、がん退縮が明らかに認められた。さらに、担がんClec4A4欠損マウスのがんワクチン免疫群では、担がんWTマウスのがんワクチン免疫群と比較して、がん細胞移植の23日後にはがんワクチンのがん進展抑制効果の亢進が認められた（図３）。
　以上の結果から、マウスClec4A4は樹状細胞上に発現する、免疫チェックポイント分子であり、抗腫瘍免疫応答にブレーキをかける働きをしていることが示された。
４）担がんマウスモデルにおける免疫応答
　WTマウス、及びClec4A4欠損マウスの背部に、卵白アルブミン（OVA）を発現する組換え悪性黒色腫細胞株（B16-OVAメラノーマ; Brown DM, et al., Immunology. (2001) 102:486-497）を皮下移植（1x105細胞/1匹）することにより、担がんマウスを作製した。がん細胞移植の20日後に、担がんWTマウス及び担がんClec4A4欠損マウスの脾臓及びがん組織における各種免疫細胞の誘導を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。なお、非担がんマウス及び担がんマウスの脾臓単核球は脾臓細胞から赤血球溶解バッファー（Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-MaxTM; Sigma-Aldrich）を用いて調製した（非特許文献４）。担がんマウスの脾臓単核球及びがん組織の調製はがん細胞移植の20日後に行った。対照として、非担がんWTマウス及び非担がんClec4A4欠損マウスにおいても同様にフローサイトメトリー法による解析を行った。解析の結果を図４～８に示す。
　担がんWTマウスと比較して、担がんClec4A4欠損マウスでは、脾臓（図４Ａ）とがん組織（図４Ｂ）におけるGr1-1+CD11b+F4/80+骨髄由来抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells; MDSCs）の増加の抑制が認められた。
　また担がんWTマウスと比較して、担がんClec4A4欠損マウスでは、がん組織におけるCD11c+SiglecH-cDCs（通常型樹状細胞）とCD11clowSiglecH+pDCs（形質細胞様樹状細胞）の集積亢進が認められた（図４Ｂ）。
　さらに、担がんWTマウスと比較して、担がんClec4A4欠損マウスでは、がん組織における腫瘍浸潤CD4+/CD8+リンパ球（T細胞）（tumor-infiltrating lymphocytes; TILs）や、NK1.1+NK細胞の集積亢進が認められた（図４Ｂ）。
　担がんWTマウスでは、非担がんWTマウスと比較して、脾臓中のGr1-1+CD11b+F4/80+MDSCsの増加が認められるとともに（図４Ａ）、がん組織での顕著な集積が認められた（図４Ｂ）。
　担がんWTマウスでは、非担がんWTマウスと比較して、脾臓中のCD44+CD62L-エフェクターCD4+T細胞の増加が認められた（図５Ａ）が、CD8+T細胞のその増加は認められなかった（図５Ｂ）。一方、担がんClec4A4欠損マウスでは、担がんWTマウスと比較して、脾臓（図５）とがん組織（図６）におけるCD44+CD62L-エフェクターCD4+T細胞/CD8+ T細胞の増加が認められた（Ａ: CD4+T細胞、Ｂ: CD8+ T細胞）。
　担がんWTマウスでは、非担がんWTマウスと比較して、脾臓中のcDCsにおけるMHC I、CD40、CD80、B7-H1、及びB7-H2の発現低下が認められた（図７）。一方、担がんClec4A4欠損マウスでは、非担がんClec4A4欠損マウスと比較して、脾臓中のcDCsにおけるMHC I、CD80、CD86、B7-H1、及びB7-H2の発現増強が認められた（図７）。
　さらに、担がんWTマウスと比較して、担がんClec4A4欠損マウスでは脾臓cDCsにおけるMHCクラスI（MHC I）、CD80、CD86、B7-H1、及びB7-H2の発現増強が認められた（図７）。
　また担がんWTマウスと比較して、担がんClec4A4欠損マウスでは腫瘍浸潤cDCsにおけるMHC I、MHCクラスII（MHC II）、CD80、CD86、及びB7-H1の発現増強と、B7-H2及びB7-DCの発現低下が認められた（図８）。
　担がんClec4A4欠損マウスでは、担がんWTマウスと比較して、がん組織におけるcDCsのMHC I、MHC II、CD80、CD86、及びB7-H1の発現増強と、B7-H2及びB7-DCの発現低下が認められた（図８）。
　以上の解析結果から、Clec4A4による樹状細胞機能阻害は、リンパ組織とがん組織における、骨髄由来抑制細胞の誘導と集積の促進、並びにエフェクターT細胞、腫瘍浸潤T細胞、及び活性化樹状細胞の誘導と集積の抑制に基づいてがん微小環境での免疫寛容原性を誘発し、抗腫瘍免疫応答を抑制することにより、がん進展を促進することが示された（図４～図８）。上記解析結果は、Clec4A4機能の阻害が、抗腫瘍免疫応答の活性化、及びがん抑制につながることを示している。
　さらに、マウスにおいてClec4A4欠損によりがん免疫応答が増強し、がん進展が抑制されることから、Clec4A4は樹状細胞に発現し、がん免疫（自己免疫）応答を制御する「免疫チェックポイント分子」であることが証明された。
［実施例２］
　ヒト末梢血（健常人末梢血）から、末梢血単核球を、Ficoll-PaqueTM PLUS（GE Healthcare Life Sciences）を用いた比重遠心法により分離した。分離した末梢血単核球画分から、末梢血単球を、単球単離キットII（Monocyte Isolation Kit II; Miltenyi Biotec）及び細胞分離装置autoMACS(R) Pro Separator（Miltenyi Biotec）を用いて精製した。
　非特許文献３に記載の方法に従い、取得したヒト末梢血単球をヒト組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）（50 ng/ml、Wako）とヒト組換えIL-4（100 ng/ml、Wako）の存在下で1週間培養することにより、ヒト末梢血単球由来樹状細胞を作製した。また、非特許文献３に記載の方法に従い、取得したヒト末梢血単球をヒト組換えGM-CSF（50 ng/ml、Wako）、ヒト組換えIL-4（100 ng/ml、Wako）、ヒト組換えIL-10（50 ng/ml、Wako）、及びヒト組換えTGF-β1（50 ng/ml、Wako）の存在下で1週間培養することにより、ヒト末梢血単球由来免疫抑制性樹状細胞を作製した。末梢血単球由来免疫抑制性樹状細胞はがん環境で生成することが知られている。
　健常人から得られた末梢血単核球画分中の、CD3+T細胞、CD19+ B細胞、CD14+単球、CD11c+樹状細胞、CD56+ナチュラルキラー（NK）細胞におけるCLEC4Aの発現を上述のフローサイトメトリー法により解析した。各細胞における細胞表面分子（CLEC4A）の発現を図９Ａにヒストグラムで示す。
　末梢血単核球画分においてCLEC4Aの発現はCD3+ T細胞やCD56+ NK細胞では認められず、CD19+B細胞、CD14+単球、CD11c+樹状細胞では認められた（図９Ａ）。さらに、CD14+単球とCD11c+樹状細胞は、CD19+ B細胞と比較してCLEC4Aについてより高い発現を示した（図９Ａ）。
　健常人から得られた末梢血単核球画分中の、CD141+cDC1細胞、CD1c+cDC2細胞、CD303+pDC細胞におけるCD11c、HLA-DR、及びCLEC4Aの発現を上述のフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子（CD141、CD1c、CD303、CD11c、HLA-DR、及びCLEC4A）の発現を図９Ｂにヒストグラムで示す。
　健常人由来の末梢血単核球画分中の末梢血樹状細胞亜集団において、CD1c+CD11c+HLA-DR+cDC2細胞は、CD141+CD11c+HLA-DR+cDC1細胞、及びCD303+CD11c-HLA-DR+pDC細胞と比較して、CLEC4Aについてより高い発現を示した（図９Ｂ）。なお、フローサイトメトリー解析で得られた、CD1c+末梢血単核球をcDC2、CD141+末梢血単核球をcDC1、CD303+末梢血単核球をpDCとした。
　さらに、健常人から得られた末梢血単球、作製された末梢血単球由来樹状細胞（図中、単球由来DC）、及び末梢血単球由来免疫抑制性樹状細胞（図中、単球由来DCreq）におけるCD11c、CD40、CD80、CD86、HLA-DR、及びCLEC4Aの発現を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。各細胞表面分子の発現を図９Ｃにヒストグラムで示す。
　末梢血単球由来免疫抑制性樹状細胞は、末梢血単球由来樹状細胞と比較して、CD11c、CD86、HLA-DRについてより低い発現を示したが、CLEC4Aについては同等に高い発現を示した（図９Ｃ）。
　マウスにおいてClec4A4の発現はCD1c+末梢血単核球（cDC2）にのみ限定されるが（非特許文献４）、ヒトにおいてはcDC2がCD141+末梢血単核球（cDC1）やCD303+末梢血単核球（pDC）よりも高いCLEC4A発現を示すとともに、単球やB細胞でもCLEC4A発現が認められた。また、がん環境で生成される免疫抑制性樹状細胞（非特許文献３、及びNagayama H., et al., Melanoma Res., (2003) 13, pp.521-530）においてもCLEC4Aの発現が認められた。これらの結果からヒトにおいてCLEC4Aは抗原提示細胞に発現する機能制御分子であると考えられた。
［実施例３］
　ヒトCLEC4Aタンパク質の全長（配列番号２; NCBIアクセッション番号NP_057268.1; M1-L237; 237アミノ酸長）をコードする塩基配列（配列番号１）の5'末端にBamHI認識配列（5'-ggatcc-3'）、3'末端にXhoI認識配列（5'-ctcgag-3'）を付加したcDNA（配列番号１１）を、GeneArt(R)（Life Technologies）により合成した。
　同様に、ヒトCLEC4AのITIM（免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（Immunoreceptor tyrosine-based Inhibition motif））配列欠損変異体（配列番号４; ΔI5-V10; 231アミノ酸長）、CLEC4Aの細胞外領域欠損変異体（配列番号６; ΔF69-L237; 68アミノ酸長）、CLEC4Aの糖鎖認識ドメイン（carbohydrate-recognition domain; CRD）-EPS欠損変異体（配列番号８; ΔE195-S197; 234アミノ酸長）、及びCLEC4Aの糖鎖修飾部位置換変異体（配列番号１０; N185Q; 237アミノ酸長）をコードする塩基配列（それぞれ、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９）の5'末端にBamHI認識配列、3'末端にXhoI認識配列を上記と同様に付加したcDNAを、GeneArt(R)（Life Technologies）により合成した。
　次にこれらcDNAを、制限酵素BamHI及びXhoIで処理して、pMX-IRES-GFPレトロウイルスベクターのマルチクローニングサイト中のBamHI-XhoI部位に導入し、CLEC4A又は変異体発現レトロウイルスベクターを作製した。さらに、これらのレトロウイルスベクター、又は対照レトロウイルスベクター（CLEC4A又は変異体コード配列を含まない）を、レトロウイルスパッケージング細胞（Phoenix）にLipofectAMINE Plus Reagent（Life Technologies）を用いて感染させ、24時間後に培養上清からレトロウイルスを採取し、遠心法（8,000 g、16時間、4℃）により濃縮した。
　得られたレトロウイルスを、マウス樹状細胞株DC2.4（Shen Z, et al., J. Immunol., (1997) 158:p.2723-2730）に対し、DOTAPリポソーム性トランスフェクション試薬（DOTAP Liposomal Transfection Reagent; Roche）の2日間処理により感染させた。得られた細胞から、GFP発現を指標として、FACSAriaTMIIセルソーター（BD Biosciences）を用いてトランスジェニック細胞株を精製分離した。
　分離したトランスジェニック細胞株（CLEC4A発現細胞株又はCLEC4A変異体発現細胞株、対照レトロウイルス感染細胞株）、及びマウス樹状細胞株DC2.4における、GFP及びCLEC4Aの発現を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。
　マウス樹状細胞株DC2.4（図中、DC2.4）、対照レトロウイルス感染細胞株（図中、モック-GFP）、及びCLEC4A発現細胞株（図中、CLEC4A-GFP）における、GFP及びCLEC4Aの発現を、図１０Ａにドットプロットで示す。
　糖鎖修飾部位置換変異体発現細胞株（図中、CLEC4AN185Q-GFP）、CRD-EPS欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔE195-S197-GFP）、細胞外領域欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔF69-L237-GFP）及びITIM配列欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔI5-V10-GFP）における、GFP及びCLEC4Aの発現を、図１０Ｂにドットプロットで示す。
　マウス樹状細胞株DC2.4、対照レトロウイルス感染細胞株、CLEC4A発現細胞株、糖鎖修飾部位置換変異体発現細胞株、CRD-EPS欠損変異体発現細胞株、細胞外領域欠損変異体発現細胞株、及びITIM配列欠損変異体発現細胞株を、48ウェル培養プレート（BD Bioscience）にそれぞれ播種し、TLR4リガンドであるリポ多糖（LPS; 0.1 μg/ml; Sigma-Aldrich）又はTLR9リガンドであるCpG-B ODN 1668（0.1 μM）を刺激のために添加して16時間培養した後、培養上清中のIL-6（インターフェロン-6; eBioscience）とTNF-α（腫瘍壊死因子-α; eBioscience）の量をELISA法により測定した。対照として、同じ細胞株を、リポ多糖もCpG-B ODN 1668も添加せず無刺激で16時間培養後、同様に培養上清中のIL-6及びTNF-αの量をELISA法により測定した。その結果を図１１に示す。
　対照レトロウイルス感染細胞株（図中、モック-GFP）と比較して、CLEC4A発現細胞株（図中、CLEC4A-GFP）では、LPS又はCpG-B ODN 1668の刺激により、IL-6及びTNF-αの産生が著しく減弱した（図１１）。
　CLEC4A発現細胞株（図中、CLEC4A-GFP）と比較して、CRD-EPS欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔE195-S197-GFP）、細胞外領域欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔF69-L237-GFP）及びITIM配列欠損変異体発現細胞株（図中、CLEC4AΔI5-V10-GFP）では、LPS又はCpG-B ODN 1668の刺激により、IL-6及びTNF-αの産生が著しく亢進し、これらの産生量は対照レトロウイルス感染細胞株（図中、モック-GFP）とほぼ同等であった（図１１）。これらの細胞株に導入されたCLEC4A変異体はCLEC4A活性を保持しないことが示された。
　一方、糖鎖修飾部位置換変異体発現細胞株（図中、CLEC4AN185Q-GFP）では、CLEC4A発現細胞株と比較して、LPS又はCpG-B ODN 1668の刺激により、IL-6及びTNF-αの産生の部分的な増強が認められた（図１１）。この糖鎖修飾部位置換変異体は、CLEC4A活性を部分的に保持していると考えられた。Clec4A4の自己分子（内/間）結合には、CRD内の185位（N-186）におけるN-結合型糖鎖（N型修飾糖鎖）が必要とされている。
　以上の結果から、CLEC4Aは抗原提示細胞の機能制御分子であり、樹状細胞などの抗原提示細胞におけるCLEC4Aの機能制御の分子基盤には、その細胞外領域の糖鎖認識ドメイン（CRD）とN型修飾糖鎖との会合を介した自己分子（内/間）結合に基づくITIM依存性抑制性シグナル経路が関与しており、当該経路の誘導によりサイトカイン産生能及びT細胞活性化能が抑制されることが示された。すなわちCLEC4Aの機能制御活性には、細胞外領域、CRD、及びITIM配列が重要であることが示された。
［実施例４］
１）可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子の作製
　CLEC4A細胞外領域（配列番号１２; F69-L237; 169アミノ酸長）をコードする塩基配列（配列番号１の205～711位の塩基配列に相当）の5'末端にBamHI認識配列（5'-ggatcc-3'）、3'末端にEcoRV認識配列（5'-gatatc-3'）を付加したcDNAを、GeneArt(R)（Life Technologies）により合成した。次に、得られたcDNAを、制限酵素BamHI及びXhoIで処理して、マウスIgFcキメラ分子発現ベクター（pFUSEN-mG2A-Fcベクター; InvivoGen）のマルチクローニングサイト中のBamHI-EcoRV部位に導入し、可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子発現ベクターを作製した。可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子発現ベクターを、293fectinTMトランスフェクション試薬（293fectinTMTransfection Reagent; Life Technologies）を用いてFreeStyleTM293-F細胞（Life Technologies）に遺伝子導入した。続いて遺伝子導入細胞を培養し、培養上清より、HiTrapTMProtein G HP（GE Healthcare Life Sciences）を用いて可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子を精製した。
２）抗CLEC4A抗体の作製
　上記で作製した可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子（12.5 μg/１匹）及びTiterMax(R) Gold Adjuvant（27.5 μl/1匹; Sigma-Aldrich）を用いて、マウスの足蹠に対し2週間隔で2回免疫した。さらに、初回免疫後31日目にマウスの尾静脈内へ可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子（25 μg/１匹）を投与した。初回免疫後34日目にマウスのリンパ節を採取し、得られたリンパ節細胞と、P3U1ミエローマ細胞株を、ポリエチレングリコール4000（Wako）を用いて融合し、多数のハイブリドーマを作製した。
３）抗体のスクリーニング
　作製したハイブリドーマの培養上清について、CLEC4A発現細胞株に対する反応性を指標とし、二次抗体であるR-フィコエリスリン標識F(ab')2フラグメントヤギ抗マウスIgG(H+L)抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を用いて、上記フローサイトメトリー法により、抗体クローンのスクリーニングを行った。
　具体的には、作製したハイブリドーマの培養上清を、マウス樹状細胞株DC2.4と実施例３で作製したCLEC4A発現細胞株（CLEC4A-GFP）の混合細胞（混合比１：１）に添加し、抗体と細胞の反応性を上記フローサイトメトリー法により調べた。なお混合細胞系を使用することにより、マウス樹状細胞株DC2.4（親株）とCLEC4A発現細胞株のそれぞれに対する反応性を一度に解析することが可能になる。
　同様に、対照マウスIgG抗体又は抗CLEC4A抗体（クローン9E8）を、マウス樹状細胞株DC2.4と実施例３で作製したCLEC4A発現細胞株（CLEC4A-GFP）の混合細胞（混合比１：１）に添加し、抗体と細胞の反応性を上記フローサイトメトリー法により調べた。
　このようにして、CLEC4A発現細胞株に特異的な反応を高レベルで示した数十個のクローンを樹立した。高反応性クローンとして選択されたハイブリドーマの培養上清から、HiTrapTM Protein G HPを用いて、マウス抗CLEC4A抗体を精製した。
４）抗体の免疫チェックポイント阻害作用
　実施例２で得られた末梢血単球由来樹状細胞（1x105細胞）を、96ウェル培養プレートに播種し、対照マウスIgG抗体（cont. Ig）（10 μg/ml; Sigma-Aldrich）若しくは上記で得られたマウス抗ヒトCLEC4A抗体（10 μg/ml）の存在下又は非存在下にてLPS（0.1 ng/ml）で刺激して16時間培養した後、培養上清中のIL-6量をELISA法により測定した。
　その結果、マウス抗CLEC4A抗体#1、#2、#3、及び#4の存在下で、末梢血単球由来樹状細胞のLPSの刺激による炎症性サイトカインIL-6の産生が、抗CLEC4A抗体の非存在下及び対照マウスIgG抗体の存在下と比較して、約1.5倍に増強された。それらの抗CLEC4A抗体がCLEC4A機能阻害抗体として作用し、樹状細胞におけるCLEC4Aのサイトカイン産生抑制機能を制御（阻害）したと考えられた。すなわちそれらの抗体は免疫チェックポイント阻害作用を有していることが示された。
　ヒトCLEC4A発現マウス樹状細胞株DC2.4（4x105細胞）を、対照マウスIgG抗体（100 μg/ml）若しくは上記で得られたマウス抗ヒトCLEC4A抗体（100 μg/ml）の存在下又は非存在下にて60分間培養した後、可溶型ヒトCLEC4A-マウスIgFcキメラ分子（10 μg/ml）を添加して反応させた。その後、可溶型ヒトCLEC4A-マウスIgFcキメラ分子のCLEC4A発現マウス樹状細胞株DC2.4に対する反応性（結合）を指標に、二次抗体であるR-フィコエリスリン標識F(ab')2断片ヤギ抗マウスIgG(H+L)を用いたフローサイトメトリー法により結合阻害率を解析した。マウス抗CLEC4A抗体#1、#2、及び#3は、可溶型CLEC4A-マウスIgFcキメラ分子の、CLEC4A発現マウス樹状細胞株DC2.4に対する結合を80％以上阻害した。それらの抗CLEC4A抗体は、樹状細胞株DC2.4の細胞表面上に発現したCLEC4Aと可溶型CLEC4Aとの結合阻害を引き起こしたことが示された。
［実施例５］
　PEPperMAP(R)（PEPperPRINT）ペプチドマイクロアレイ受託解析サービスを利用して、CLEC4A機能阻害抗体である抗CLEC4A抗体#1、#2、#3、及び#4のエピトープマッピングを行った。
　具体的には、エピトープマッピングでは、CLEC4A細胞外領域のアミノ酸配列（配列番号１２; F69-L237; 169アミノ酸長）全長をカバーする、1アミノ酸ずつシフトさせた15アミノ酸長の重複ペプチド群（重複長: 14アミノ酸; 155個のペプチド）を、マイクロアレイ上にプリントした。さらに、抗CLEC4A抗体#1、#2、#3、及び#4及び標識二次抗体を用いて、抗原抗体反応により、マイクロアレイ上のペプチドプローブとハイブリダイゼーションした。マイクロアレイスキャナーを用いて、ハイブリダイゼーション後のマイクロアレイを走査後、PepSlide(R) Analyzer（PEPperPRINT）を用いて反応性を解析し、エピトープの同定を行った。抗CLEC4A抗体と強い結合を示した連続的に重複するペプチドプローブに共通して含まれるアミノ酸配列をコンセンサスモチーフとした。コンセンサスモチーフは、線状（連続）エピトープ、又は不連続エピトープ中に含まれる線状（連続）エピトープ部分の存在を示す。
　抗CLEC4A抗体の各クローンの解析結果は以下のとおりであった。
　- 抗体#1
　エピトープマッピングによりWVDQTPYNESSTFW（配列番号１５; 配列番号２のW178-W191）がコンセンサスモチーフとして同定された。抗体#1のエピトープは、CLEC4Aタンパク質上の、コンセンサスモチーフWVDQTPYNESSTFW（配列番号１５）を含むペプチド配列によって構成されることが示された。
　- 抗体#2
　エピトープマッピングによりQNLQEESAYF（配列番号１６; 配列番号２のQ155-F164）がコンセンサスモチーフとして同定された。ペプチドFSSNCYFISTESASW（配列番号１７; 配列番号２のF113-W127）への抗体#2の結合も示された。抗体#2のエピトープは、CLEC4Aタンパク質上の、コンセンサスモチーフQNLQEESAYF（配列番号１６）を含むペプチド配列とFSSNCYFISTESASW（配列番号１７）を含むペプチド配列によって構成されることが示された。抗体#2はCLEC4Aタンパク質の一次配列上で離れた位置にある２つのぺプチド配列QNLQEESAYF（配列番号１６）とFSSNCYFISTESASW（配列番号１７）に結合できることから、抗体#2のエピトープは、QNLQEESAYF（配列番号１６）と、FSSNCYFISTESASW（配列番号１７）中の少なくとも一部のアミノ酸とを含む不連続エピトープ（立体構造エピトープ）であると考えられる。
　- 抗体#3
　エピトープマッピングによりSSNCYFISTESASW（配列番号１８; 配列番号２のS114-W127）とQNLQEESAYF（配列番号１６; 配列番号２のQ155-F164）がそれぞれコンセンサスモチーフとして同定された。抗体#3のエピトープは、CLEC4Aタンパク質上の、コンセンサスモチーフSSNCYFISTESASW（配列番号１８）を含むペプチド配列とQNLQEESAYFを含むペプチド配列によって構成されることが示された。抗体#3はCLEC4Aタンパク質の一次配列上で離れた位置にある２つのペプチド配列SSNCYFISTESASW（配列番号１８）及びQNLQEESAYF（配列番号１６）に結合できることから、抗体#3のエピトープは、SSNCYFISTESASW（配列番号１８）及びQNLQEESAYF（配列番号１６）を含む不連続エピトープ（立体構造エピトープ）であると考えられる。
　- 抗体#4
　エピトープマッピングによりKKNMPVEETAWSCC（配列番号１９; 配列番号２のK93-C106）がコンセンサスモチーフとして同定された。抗体#4のエピトープは、CLEC4Aタンパク質上の、コンセンサスモチーフKKNMPVEETAWSCC（配列番号１９）を含むペプチド配列によって構成されることが示された。
　図１２に、抗体#1～#4のエピトープを構成する抗体結合配列の、CLEC4Aタンパク質の一次配列上の位置を示す。
　CLEC4A機能阻害抗体である抗体#1～#4のエピトープは、CLEC4A細胞外領域のC型レクチン様ドメイン内に存在することが明らかとなった。また、抗体#1のエピトープはCRD内のN型糖鎖修飾部位（N185）を含むことが示された（図１２）。
［実施例６］
１）CLEC4Aトランスジェニックマウスの作製
　ヒトCLEC4Aタンパク質の全長（配列番号２; NCBIアクセッション番号NP_057268.1; M1-L237; 237アミノ酸長）をコードする塩基配列（配列番号１）の5'末端と3'末端にClaI認識配列（5'-atcgat-3'）を付加したcDNA（配列番号２０）を、GeneArt(R)（Life Technologies）により合成した。
　ヒトCLEC4Aトランスジェニックマウスの作製には、マウスMHCクラスII発現細胞においてCLEC4A導入遺伝子の発現を誘導する目的で、マウスインバリアント鎖遺伝子のプロモーター領域及びエンハンサー領域を含有するpDOI-6ベクター（van Santen H., et al., J. Immunol. Methods, (2000) 245: 133-137）を用いた。
　上記合成cDNAを制限酵素ClaIによる処理後、pDOI-6ベクターのマルチクローニングサイト中のClaI部位に導入し、CLEC4A発現pDOI-6ベクターを作製した。CLEC4A発現pDOI-6ベクターを制限酵素XhoI及びPvuIで処理して直鎖化し、精製した。直鎖化CLEC4A発現pDOI-6ベクターをマウスC57BL/6系統（CLEA Japan, Inc.）の受精卵前核へ顕微注入した後、その受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植した。妊娠・出産を経て得た産仔から、離乳後、尻尾を採取し、ゲノムDNAを抽出した。得られたゲノムDNAを用いたジェノタイピングPCR解析を行い、CLEC4Aが導入されたファウンダーマウス（F0）を同定した。さらに、ファウンダーマウス（F0）とC57BL/6マウスとの交配により、F1マウスを作出し、ジェノタイピングPCR解析によりヒトCLEC4Aトランスジェニックマウスを樹立した。実施した遺伝子組換え実験及び動物実験は所属機関の承認済みであった。
２）ヒトCLEC4Aトランスジェニックマウスの免疫細胞におけるCLEC4A発現
　野生型マウス（WT; C57BL/6）及び上記１）で樹立したCLEC4A発現トランスジェニックマウス（CLEC4A Tg）より取得した脾臓細胞から赤血球溶解バッファー（Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-MaxTM; Sigma-Aldrich）（非特許文献４）を用いて脾臓単核球を調製した。脾臓単核球中のCD3+ T細胞、CD19+ B細胞、CD11b+マクロファージ、CD11c+樹状細胞、及びNK1.1+ NK細胞におけるCLEC4Aの発現を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。図１３Ａに各細胞表面分子（CD3、CD19、CD11b、CD11c、及びNK1.1）発現陽性細胞におけるCLEC4Aの発現をヒストグラムで示す。数値は平均蛍光強度を示す。
　野生型マウス（WT）の脾臓単核球では、CLEC4Aの発現は認められなかった。一方、CLEC4A発現トランスジェニックマウス（CLEC4A Tg）の脾臓単核球ではCLEC4Aの発現が認められ、特にCD11c+樹状細胞は他の免疫細胞と比較してもより高いCLEC4A発現レベルを示した（図１３Ａ）。
　さらに、野生型マウス（WT; C57BL/6）及びCLEC4A発現トランスジェニックマウス（CLEC4A Tg）由来の脾臓単核球中の脾臓樹状細胞亜集団（CD11c+CD8α+cDC1細胞、CD11c+CD4+cDC2細胞、及びCD11c+SiglecH+pDC細胞）におけるCLEC4Aの発現を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。図１３Ｂに各脾臓樹状細胞亜集団におけるCLEC4Aの発現をヒストグラムで示す。数値は平均蛍光強度を示す。
　野生型マウス（WT）の脾臓樹状細胞亜集団のいずれにおいても、CLEC4Aの発現は認められなかった。一方、CLEC4A発現トランスジェニックマウス（CLEC4A Tg）の脾臓樹状細胞亜集団ではCLEC4Aの発現が認められ、CD11c+CD8α+cDC1細胞、CD11c+SiglecH+pDC細胞、CD11c+CD4+cDC2細胞の順に高いCLEC4A発現レベルを示した（図１３Ｂ）。
　作製したヒトCLEC4Aトランスジェニックマウスは、免疫細胞においてヒトCLEC4Aを発現することが確認された。
［実施例７］
１）CLEC4A機能阻害抗体による担がんマウスのがん進展抑制効果
　野生型マウス（WT; C57BL/6）及び実施例６で樹立したCLEC4A発現トランスジェニックマウス（CLEC4A Tg）の背部に、卵白アルブミン（OVA）を発現する組換え悪性黒色腫細胞株（B16-OVAメラノーマ; Brown DM, et al., Immunology. (2001) 102:486-497）を皮下移植（1x105細胞／1匹）することにより、担がんマウスを作製した。
　担がんCLEC4A発現トランスジェニックマウスの腫瘍体積が約100m3に達した後（がん細胞移植の6日後）、対照マウスIgG抗体（cont. Ig（Sigma-Aldrich）; 100μg/1匹）又はCLEC4A機能阻害抗体（抗体#1～#4; 100μg/1匹）を3日間隔で計6回、腹腔内投与した。がんの進展は、担がんマウスの腫瘍体積をがん細胞移植の22日後まで毎日、デジタルキャリパー（Digimatic Caliper, Mitutoyo）を用いて測定し、それを指標として評価した。
　また、免疫関連有害事象の指標として、担がんマウスの体重変化、飲水摂餌不良の有無、及び外見上変化（不動化、立毛等）を、がん移植の22日後まで観察した。
　図１４Ａに、がん細胞移植の13日後の腫瘍の写真を示す。図１４Ｂ及びＣに、がん細胞移植の13日後（Ｂ）及び22日後（Ｃ）の腫瘍体積を示す。図１５にがん細胞移植後22日間の腫瘍体積の経時的変化を示す。
　担がんCLEC4A発現トランスジェニックマウスにおいて、CLEC4A機能阻害抗体（抗体#1～#4）の投与は、対照抗体（cont. Ig）の投与と比較して、がん進展を顕著に抑制し、がんに対する顕著な治療効果が認められた（図１４及び１５）。
　さらにCLEC4A機能阻害抗体投与群では、対照群と比較して、体重減少は認められず（図１６）、飲水摂餌不良や外見上変化（不動化、立毛等）も認められなかった。すなわち、CLEC4A機能阻害抗体は免疫関連有害事象（irAEs）をもたらさないことが示された。
２）CLEC4A機能阻害抗体による腫瘍浸潤T細胞集積促進効果
　上記１）と同様にして担がんマウスを作製し、腫瘍体積が約100m3に達した後、対照マウスIgG抗体（cont. Ig; 100μg/1匹）又はCLEC4A機能阻害抗体（抗体#1～#4; 100μg/1匹）を3日間隔で計6回、静脈内投与した。がん細胞移植の22日後に、がん組織を採取した。がん組織中の腫瘍浸潤CD4+ T細胞と腫瘍浸潤CD8+ T細胞の集積を、上述のフローサイトメトリー法により解析した。
　フローサイトメトリー解析の結果を図１７に示す。CLEC4A機能阻害抗体投与群では、対照抗体投与群と比較して、がん組織中に腫瘍浸潤CD4+ T細胞及び腫瘍浸潤CD8+ T細胞の著しい集積が認められた。CLEC4A機能阻害抗体が、がん組織中への腫瘍浸潤T細胞集積促進効果をもたらすことが示された。
　実施例７で示された結果は、実施例１～６の結果と併せて考慮すると、CLEC4A機能阻害抗体#1～#4がCLEC4Aの細胞外領域に存在するC型レクチン様ドメイン内のペプチド配列と結合することにより、CRDとN型修飾糖鎖との会合を介する自己分子結合に基づくITIM依存性抑制性シグナル経路を阻害し、樹状細胞の機能を増強すること、特にCLEC4A発現樹状細胞の抗原提示機能の増強によりがん抗原特異的細胞傷害性T細胞（CTL）の誘導を増幅し、がん進展を抑制することを示している。
　さらに、CLEC4A機能阻害抗体#1～#3はがん進展抑制効果が特に高かったことから、それらの抗体が結合する、ヒトCLEC4Aタンパク質のF113～H192の領域（配列番号２１）への抗体結合はより高い抗腫瘍活性をもたらすことが示された。
　また抗体#1～#4は、免疫関連有害事象（irAEs）の発生をもたらさないことから、既存のCTLA-4/PD-1に対する免疫チェックポイント阻害剤と比較して、安全性がより高いと考えられた。
　CLEC4Aはがん免疫（自己免疫）応答を制御する「免疫チェックポイント分子」であり、免疫チェックポイント阻害作用を有する抗体#1～#4は、免疫チェックポイント阻害剤としてのがん免疫治療法への応用に有望である。CLEC4A機能阻害抗体#1～#4は、CTLA-4/PD-1系に対する既存の免疫チェックポイント阻害剤とは異なる作用機序により免疫チェックポイント阻害を引き起こすことから、既存の免疫チェックポイント阻害剤による不応答性や耐性獲得を示すがん種に対しても、有効な抗腫瘍効果を期待できる。
［実施例８］
１）担がんマウスにおけるCLEC4A機能阻害抗体及び抗PD-1中和抗体のがん進展抑制効果
　野生型マウス（WT; C57BL/6）及び実施例６で樹立したCLEC4A発現トランスジェニックマウス（CLEC4A Tg）の背部に、卵白アルブミン（OVA）を発現する組換え悪性黒色腫細胞株（B16-OVAメラノーマ; Brown DM, et al., Immunology. (2001) 102:486-497）を皮下移植（1x105細胞／1匹）することにより、担がんマウス（担がんCLEC4A発現トランスジェニックマウス）を作製した。
　担がんCLEC4A発現トランスジェニックマウスの腫瘍体積が約100m3に達した後（がん細胞移植の8日後）、（i）対照マウスIgG抗体（cont. Ig（Sigma-Aldrich）; 100μg/1匹）、（ii）CLEC4A機能阻害抗体（抗体#1; 100μg/1匹）、（iii）抗PD-1中和抗体（クローン29F.1A12（Biolegend）; 200μg/1匹）、又は（iv）CLEC4A機能阻害抗体（抗体#1; 100μg/1匹）と抗PD-1中和抗体（クローン29F.1A12（Biolegend）; 200μg/1匹）の組み合わせ、を3日間隔で計5回、腹腔内投与した。対照として、担がんマウスに何も投与しない未処理群も用意した。がんの進展は、担がんマウスの腫瘍体積をがん細胞移植の21日後まで毎日、デジタルキャリパー（Digimatic Caliper, Mitutoyo）を用いて測定し、それを指標として評価した。
　がん細胞移植の21日後、がん進展評価を行った後に担がんマウスを安楽死させ、担がんマウスから皮膚組織、肺組織、肝臓組織、及び小腸組織を採取し、4％パラホルムアルデヒド-リン酸緩衝食塩水で固定した後、パラフィンに包埋した。さらに、それらのパラフィン包埋組織を薄切後、組織切片（5μm厚）を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。
　図１８に組織染色の結果を示す。担がんCLEC4A発現トランスジェニックマウスにおいて、未処理や対照マウスIgG抗体（cont. Ig）の投与と比較しても、CLEC4A機能阻害抗体（抗体#1）の投与は、皮膚、肺、肝臓、及び小腸において組織傷害を引き起こさなかった（図１８）。CLEC4A機能阻害抗体は、実施例７で示したように体重減少等の免疫関連有害事象（irAEs）をもたらさないことに加えて、組織傷害を指標とする免疫関連有害事象（irAEs）の発生ももたらさないことから、高い安全性に資することが示された。
　図１９に、がん進展評価の結果を示す。図１９Ａはがん細胞移植後21日間の担がんマウス腫瘍体積の経時変化を示す。図１９Ｂはがん細胞移植の21日後の担がんマウスにおける腫瘍体積を示し、図１９Ｃはがん細胞移植の21日後の担がんマウス及び摘出した腫瘍の写真を示す。未処理や対照マウスIgG抗体（cont. Ig）の投与と比較して、CLEC4A機能阻害抗体（抗体#1）の単独投与は、顕著ながん進展抑制効果を示し、また、抗PD-1中和抗体（クローン29F.1A12）の単独投与と比較してもさらに高いがん進展抑制効果を示した（図１９Ａ～Ｃ）。さらに、CLEC4A機能阻害抗体（抗体#1）と抗PD-1中和抗体（クローン29F.1A12）との併用投与は、CLEC4A機能阻害抗体（抗体#1）の単独投与と比較しても、より強力ながん進展抑制効果を示した（図１９Ａ～Ｃ）。CLEC4A機能阻害抗体と、T細胞に発現する免疫チェックポイント分子PD-1に対する抗PD-1中和抗体の併用は、より強力ながん治療効果を有することが示された。この結果から、CLEC4A機能阻害抗体と、T細胞に発現する免疫チェックポイント分子に対する阻害剤の併用は、相乗的ながん治療効果をもたらすことが示された。
２）担がんマウスにおけるCLEC4A機能阻害抗体及び抗PD-1中和抗体のがん組織浸潤免疫細胞制御効果とがん微小環境制御効果
　実施例６で樹立したCLEC4A発現トランスジェニックマウス（CLEC4A Tg）の背部に、卵白アルブミン（OVA）を発現する組換え悪性黒色腫細胞株（B16-OVAメラノーマ; Brown DM, et al., Immunology. (2001) 102:486-497）を皮下移植（1x105細胞／1匹）することにより、担がんマウス（担がんCLEC4A発現トランスジェニックマウス）を作製した。
　担がんCLEC4A発現トランスジェニックマウスの腫瘍体積が約100m3に達した後（がん細胞移植の8日後）、（i）対照マウスIgG抗体（cont. Ig（Sigma-Aldrich）; 100μg/1匹）、（ii）CLEC4A機能阻害抗体（抗体#1; 100μg/1匹）、（iii）抗PD-1中和抗体（クローン29F.1A12（Biolegend）; 200μg/1匹）、又は（iv）CLEC4A機能阻害抗体（抗体#1; 100μg/1匹）と抗PD-1中和抗体（クローン29F.1A12（Biolegend）; 200μg/1匹）の組み合わせ、を3日間隔で計5回、腹腔内投与した。対照として、担がんマウスに何も投与しない未処理群も用意した。
　上記１）でがん進展評価試験を行った担がんCLEC4A発現トランスジェニックマウスから、がん細胞移植の21日後に摘出した腫瘍より、がん組織を採取し組織中の細胞を取得した。
　がん組織中の免疫細胞動態を調べるため、取得した細胞についてがん浸潤白血球中の各免疫細胞の割合をフローサイトメトリー法により解析した。図２０Ａに、各細胞表面分子の発現をドットプロットで示す。
　担がんCLEC4A発現トランスジェニックマウスにおいて、未処理やコントロールマウスIgGの投与と比較して、CLEC4A機能阻害抗体（抗体#1）の単独投与や抗PD-1中和抗体（クローン29F.1A12）の単独投与では、がん組織におけるGr1-1+CD11b+F4/80+骨髄由来抑制細胞（MDSCs）の集積抑制がもたらされることが示された（図２０Ａ）。また、CLEC4A機能阻害抗体（抗体#1）の単独投与や抗PD-1中和抗体（クローン29F.1A12）の単独投与では、CD11c+SiglecH-cDCs（通常型樹状細胞）、CD11clowSiglecH+pDCs（形質細胞様樹状細胞）、NK1.1+NK細胞、がん組織（腫瘍）浸潤CD4+TILs/CD8+TILsのがん組織における集積亢進が認められた（図２０Ａ）。
　さらに、がん組織における免疫抑制分子発現状態を調べるため、がん細胞移植の21日後のがん組織における各免疫抑制分子の発現を定量的PCR（RT-PCR）法により解析した。がん組織から取得した細胞より、RNeasy plus micro kit（Qiagen）を用いて全RNAを調製した後、全RNAを鋳型としてoligo(dT)20プライマーを用いてPrimeScript RT reagent kit（Takara）を用いてcDNAを合成した。定量的PCRは、各免疫抑制分子に特異的な以下のプライマーセットとSYBR(R) Premix Ex Taq II（Takara）を用いて、Thermal Cycler Dice（Takara）により行った。定量的PCRにより得られた各免疫抑制分子の発現レベルは、参照遺伝子グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（gapdh）の発現レベルに対して標準化した。
a) IL-10遺伝子特異的プライマーセット（il10）：
  5'-TGCAGCAGCTCAGAGGGTT-3'（配列番号３３）
  5'-TGGCCACAGTTTTCAGGGAT-3'（配列番号３４）
b) TGF-β遺伝子特異的プライマーセット（tgfb）：
  5'-ACCATGCCAACTTCTGTCTG-3'（配列番号３５）
  5'-CGGGTTGTGTTGGTTGTAGA-3'（配列番号３６）
c) IDO遺伝子特異的プライマーセット（ido）：
  5'-TCGGAAGAGCCCTCAAATGTGGAA-3'（配列番号３７）
  5'-TGGAGCTTGCTACACTAAGGCCAA-3'（配列番号３８）
d) アルギナーゼ遺伝子特異的プライマーセット（ariginase）：
  5'-AAGACAGCAGAGGAGGTGAAG-3'（配列番号３９）
  5'-TAGTCAGTCCCTGGCTTATGG-3'（配列番号４０）
e) iNOS遺伝子特異的プライマーセット（inos）：
  5'-AACAATTCCTGGCGTTACCTT-3'（配列番号４１）
  5'-TGTATTCCGTCTCCTTGGTTC-3'（配列番号４２）
f) COX-2遺伝子特異的プライマーセット（cox2）：
  5'-TGGGTGTGAAGGGAAATAAGG-3'（配列番号４３）
  5'-CATCATATTTGAGCCTTGGGG-3'（配列番号４４）
g) mPGES遺伝子特異的プライマーセット（mpges）：
  5'-AGGATGCGCTGAAACGTGGAG-3'（配列番号４５）
  5'-CCGAGGAAGAGGAAAGGATAG-3'（配列番号４６）
h) GAPDH遺伝子特異的プライマーセット（gapdh）：
  5'-AAATTCAACGGCACAGTCAAG-3'（配列番号４７）
  5'-TGGTGGTGAAGACACCAGTAG-3'（配列番号４８）
　解析結果を図２０Ｂに示す。担がんCLEC4A発現トランスジェニックマウスにおいて、未処理や対照マウスIgGの投与と比較して、CLEC4A機能阻害抗体（抗体#1）の単独投与は、がん組織において、いずれも免疫抑制分子であるIL（インターロイキン）-10、IDO（インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ）、アルギナーゼ、及びmPGES（膜関連プロスタグランジンE2シンターゼ）の発現を抑制した。また抗PD-1中和抗体（クローン29F.1A12）の単独投与は、未処理や対照マウスIgGの投与と比較して、いずれも免疫抑制分子であるIL-10、IDO、アルギナーゼ、COX（シクロオキシゲナーゼ）-2、及びmPGESの発現を抑制した。そして、CLEC4A機能阻害抗体（抗体#1）と抗PD-1中和抗体（クローン29F.1A12）との併用投与は、TGF（トランスフォーミング増殖因子）-βとiNOS（誘導型一酸化窒素合成酵素）の発現を抑制し、IL-10、IDO、アルギナーゼ、COX-2、及びmPGESの発現に対し、それぞれの単独投与と比較してもより強力な抑制効果を示した。
　以上の結果から、CLEC4A機能阻害抗体はがん組織における免疫抑制分子の発現を抑制すること、さらに、CLEC4A機能阻害抗体とT細胞に発現する免疫チェックポイント分子PD-1に対する阻害剤である抗PD-1中和抗体の併用は、より強力に免疫抑制分子の発現を抑制することが示された。
　CLEC4A機能阻害抗体や抗PD-1中和抗体の投与は、がん微小環境制御効果をもたらし、特に、がん組織における免疫抑制分子の発現を抑制し、がん微小環境において免疫寛容原性を抑制してがん細胞（腫瘍）の免疫原性を誘導することにより、がん微小環境を改善し、がん免疫応答を増強すると考えられた。さらに、CLEC4A機能阻害抗体とT細胞に発現する免疫チェックポイント分子に対する阻害剤などの免疫チェックポイント阻害剤の併用は、異なる免疫細胞系の免疫チェックポイント分子の機能を阻害し、がん微小環境を免疫寛容原性から免疫原性により強力に改善（誘導）することにより、相乗的ながん治療効果をもたらすことができるといえる。
　本発明は、免疫チェックポイント分子であるCLEC4Aの機能阻害を介して免疫チェックポイント阻害を効果的に誘導し、抗腫瘍免疫応答を活性化することができ、かつ安全性も高い、新たながん治療手段として用いることができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
　配列番号１：全長CLEC4Aコード配列
　配列番号２：全長CLEC4Aタンパク質
　配列番号３：ITIM(I5-V10)欠損変異体コード配列
　配列番号４：ITIM(I5-V10)欠損変異体
　配列番号５：細胞外領域(F69-L237)欠損変異体コード配列
　配列番号６：細胞外領域(F69-L237)欠損変異体
　配列番号７：CRD-EPS(E195-S197)欠損変異体コード配列
　配列番号８：CRD-EPS(E195-S197)欠損変異体
　配列番号９：N185Q変異体コード配列
　配列番号１０：N185Q変異体
　配列番号１１：BamHI及びXhoI部位付加配列
　配列番号１２：CLEC4A細胞外領域(F69-L237)
　配列番号１３：CLEC4A ITIM配列(I5-V10)
　配列番号１４：OVA257-264ペプチド
　配列番号１５：抗体#1結合配列
　配列番号１６：抗体#2及び#3結合配列
　配列番号１７：抗体#2結合配列
　配列番号１８：抗体#3結合配列
　配列番号１９：抗体#4結合配列
　配列番号２０：ClaI部位付加断片
　配列番号２１：CLEC4A F113-H192
　配列番号２２～３２：合成ペプチド
　配列番号３３～４８：プライマー

Claims (14)

  1. 　ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域に特異的に結合する、免疫チェックポイント阻害作用を有する抗体又はその抗原結合性断片。
  2. 　ヒトCLEC4Aタンパク質の細胞外領域内の配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなる領域に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  3. 　アミノ酸配列WVDQTPYNESSTFW（配列番号１５）を含むペプチド断片に特異的に結合する、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  4. 　配列番号２で示されるアミノ酸配列上のWVDQTPYNESSTFW（配列番号１５）を含む15アミノ酸長のアミノ酸配列からなるペプチド断片に結合することができる、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  5. 　配列番号２で示されるアミノ酸配列上のQNLQEESAYF（配列番号１６）を含む15アミノ酸長のアミノ酸配列からなるペプチド断片とアミノ酸配列FSSNCYFISTESASW（配列番号１７）からなるペプチド断片に結合することができ、ヒトCLEC4Aタンパク質の不連続エピトープに結合する、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  6. 　配列番号２で示されるアミノ酸配列上のQNLQEESAYF（配列番号１６）を含む15アミノ酸長のアミノ酸配列からなるペプチド断片と配列番号２で示されるアミノ酸配列上のSSNCYFISTESASW（配列番号１８）を含む15アミノ酸長のアミノ酸配列からなるペプチド断片に結合することができ、ヒトCLEC4Aタンパク質の不連続エピトープに結合する、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  7. 　アミノ酸配列KKNMPVEETAWSCC（配列番号１９）を含むペプチド断片に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  8. 　配列番号２で示されるアミノ酸配列上のKKNMPVEETAWSCC（配列番号１９）を含む15アミノ酸長のアミノ酸配列からなるペプチド断片に結合することができる、請求項１又は７に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片を含む、抗腫瘍薬。
  10. 　T細胞に発現する免疫チェックポイント分子に対する阻害剤と併用するための、請求項９に記載の抗腫瘍薬。
  11. 　T細胞に発現する免疫チェックポイント分子に対する阻害剤をさらに含む、請求項９に記載の抗腫瘍薬。
  12. 　T細胞に発現する免疫チェックポイント分子がPD-1である、請求項１０又は１１に記載の抗腫瘍薬。
  13. 　T細胞に発現する免疫チェックポイント分子に対する阻害剤が、抗PD-1抗体である、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の抗腫瘍薬。
  14. 　がんの進展抑制用である、請求項９～１３のいずれか１項に記載の抗腫瘍薬。
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