WO2023140385A1 - 炎症性腸疾患及び腸管腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を治療又は予防するための医薬組成物 - Google Patents

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dcir
mice
clec4a2
cells
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洋一郎 岩倉
スーヒョン 鄭
允人 久保
海陽 孫
力朗 矢部
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学校法人東京理科大学
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the present disclosure relates to pharmaceutical compositions for treating or preventing at least one disease selected from the group consisting of inflammatory bowel disease and intestinal tumors.
  • IBD Inflammatory bowel disease
  • CD Crohn's disease
  • UC ulcerative colitis
  • CLR C-type lectin receptors
  • TLR Toll-like receptors
  • Dectin-1 a CLR that recognizes ⁇ -glucan, induces the intestinal antibacterial protein S100A8 by recognizing ⁇ -glucan in food, and suppresses the growth of Lactobacillus murinus (L. murinus), a Treg-inducing bacterium. Therefore, blocking Dectin-1 may reduce L.
  • the development of colitis can be suppressed by promoting the proliferation of S. murinus and increasing Treg cells.
  • MGL1 another CLR expressed in colonic squamous epithelial (cLP) macrophages, also ameliorates chemical colitis by binding to Streptococcus and Lactobacillus species and inducing IL-10.
  • DCIR Dendritic cell immune receptor
  • Clec4a2 Dendritic cell immune receptor
  • ITIM immunoreceptor inhibitory tyrosine motif
  • Non-Patent Documents 1-3 the inventors reported that aged Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice spontaneously develop autoimmune sialadenitis and enthesitis (see Non-Patent Documents 1-3).
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice are highly susceptible to autoimmune diseases such as collagen-induced arthritis (CIA) and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).
  • CIA collagen-induced arthritis
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice the DC population is expanded and the antigen-presenting ability of DCs is enhanced, and it has been suggested that this enhanced antigen-presenting ability causes autoimmunity and hyperreactivity to antigen stimulation in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice.
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
  • BMC myeloid cells
  • Stat5 hyperphosphorylation of the intracellular signaling molecule signaling and transcriptional activator 5
  • DCIR-deficient mice the expression of IL-1 ⁇ and IL-23 is strongly induced by the components of intestinal bacteria such as LPS and DNA, and that these cytokines greatly enhance the expression of GM-CSF.
  • DCIR is thought to be involved in intestinal inflammation and anti-tumor immunity.
  • how DCIR is involved in intestinal inflammation and tumor development has not yet been elucidated.
  • the present disclosure relates to providing novel pharmaceutical compositions for treating or preventing at least one disease selected from the group consisting of inflammatory bowel disease and intestinal tumors.
  • Means for solving the above problems include the following aspects.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing at least one disease selected from the group consisting of inflammatory bowel disease and intestinal tumor comprising a dendritic cell immunoreceptor-double-chain asialo-N-glycan binding inhibitor or a dendritic cell immunoreceptor inhibitor, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing at least one disease selected from the group consisting of inflammatory bowel disease and intestinal tumor comprising a dendritic cell immunoreceptor-double-chain asialo-N-glycan binding inhibitor or a dendritic cell immunoreceptor inhibitor, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • ⁇ 2> The pharmaceutical composition according to ⁇ 1>, wherein the dendritic cell immunoreceptor-double-chain asialo N-glycan binding inhibitor or the dendritic cell immunoreceptor inhibitor is an antibody.
  • ⁇ 3> The pharmaceutical composition according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the dendritic cell immunoreceptor-double-chain asialo-N-glycan binding inhibitor is an anti-double-chain asialo-N-glycan antibody.
  • ⁇ 4> The pharmaceutical composition according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the binding inhibitor between dendritic cell immunoreceptors and two-chain asialo-N-glycans or the dendritic cell immunoreceptor inhibitor is an anti-dendritic cell immunoreceptor antibody.
  • ⁇ 5> The pharmaceutical composition according to ⁇ 2>, wherein the antibody is a mouse antibody, chimeric antibody, humanized antibody, or human antibody.
  • ⁇ 6> The pharmaceutical composition according to ⁇ 2>, wherein the antibody is a humanized antibody.
  • ⁇ 7> The pharmaceutical composition according to ⁇ 2>, wherein the antibody is a full-length antibody or a minibody selected from the group consisting of Fab, Fab', F(ab')2, scFv, and diabodies.
  • ⁇ 8> The pharmaceutical composition according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the intestinal tumor comprises at least one selected from the group consisting of colon cancer, rectal cancer, and small intestine cancer.
  • ⁇ 9> The pharmaceutical composition according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the inflammatory bowel disease includes at least one selected from the group consisting of Crohn's disease and ulcerative colitis.
  • novel pharmaceutical compositions for treating or preventing at least one disease selected from the group consisting of inflammatory bowel disease and intestinal tumor are provided.
  • FIGS. 1A-1 to 1I are diagrams showing that Clec4a gene expression is locally enhanced in inflammatory colitis, and Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice exhibit resistance to DSS-induced colitis, regardless of the intestinal resident microbial community.
  • Data in FIGS. 1B-D are representative of 4 independent experiments and data in FIGS. 1E-G are representative of 2 independent experiments.
  • Data in Figures 1B, C, E, F are shown as mean ⁇ SD. *p ⁇ 0.05;**p ⁇ 0.01;***p ⁇ 0.001.
  • FIG. 1A-1) Wild-type (WT) mice were fed drinking water containing 4% dextran sulfate sodium (DSS) for 7 days, followed by normal drinking water for an additional 5 days.
  • RNA was extracted from the large intestine on the 12th day, and the expression intensity of Clec4a2 was measured by real-time PCR (n 5/group).
  • C-CD Crohn's disease
  • IC-CD rectal type
  • UC ulcerative colitis
  • FIGS. 2A-F show that monocyte and neutrophil infiltration, but not Treg cell infiltration, is reduced in the colonic lamina intestinal (cLP) of Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice after induction of DSS-induced colitis.
  • Data in Figures 2A-D are representative of three independent experiments and data in Figures 2E,F are representative of two independent experiments. Data are shown as mean ⁇ SD. **P ⁇ 0.01.
  • Figures 3A-L show that expression of inflammatory cytokine and chemokine genes such as Il17a, Cxcl2 is reduced in Clec4a2 -/- mice after induction of DSS-induced colitis.
  • Figures 3C-H are representative of three independent experiments and Figures 3K,L are representative of two independent experiments. Data in FIGS. 3C-H,L are presented as mean ⁇ SD. *p ⁇ 0.05, ***p ⁇ 0.001.
  • FIG. 3A Large intestine gene expression in untreated or DSS-treated WT and Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice was analyzed by RNA-seq, and the expression levels were shown in a heat map.
  • FIG. 3A Large intestine gene expression in untreated or DSS-treated WT and Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice was analyzed by RNA-seq, and the expression levels were shown in a heat map.
  • Cxcl2 expression level after DSS treatment in WT and Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice (n 8).
  • FIGS. 4A-J show that the GM-CSF-Stat5 axis is activated in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice after DSS treatment.
  • FIGS. 4A-J show that the GM-CSF-Stat5 axis is activated in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice after DSS treatment.
  • FIG. 4A After WT and Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice were treated with DSS, the expression level of the Csf2 gene encoding GM-CSF was examined by real-time PCR. The expression level of the Csf2 gene was examined by real-time PCR after WT mice were treated with or were not treated with DSS. The expression level of Csf2 mRNA was examined by real-time PCR in DSS-untreated WT or Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice.
  • M2 macrophages CD206 + CD11b +
  • M1 macrophages Nos2 + CD11b +
  • Colonic cells (1 ⁇ 10 6 cells) of WT and Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice were treated with rmGM-CSF (0, 1, or 10 ng/ml) for 1 hour, then proteins were extracted and the expression levels of pStat5a and total Stat5a were measured by Western blot analysis.
  • FIGS. 5A-I show that GM-CSF suppresses the development of DSS-induced colitis. Data are shown as mean ⁇ SD. *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001.
  • FIGS. 5A-C WT mice were administered 4% DSS for 7 days followed by 5 days of normal water. PBS or rmGM-CSF (1 mg/mouse) was administered intraperitoneally daily until day 6 during DSS administration.
  • FIG. 6A shows that colon tumor development by the AOM-DSS mouse model is suppressed in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice in a commensal-independent manner.
  • Figures 6A-H are representative of four independently performed experiments. Data in FIGS. 6A, B, D, E, F, H are shown as mean ⁇ SD. *p ⁇ 0.05;**p ⁇ 0.01;***p ⁇ 0.001.
  • FIGS. 6A-H WT and Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice were housed separately to perform the AOM-DSS mouse model.
  • FIGGS. 6E-H The AOM-DSS mouse model was performed after cohabiting WT and Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice for 4 weeks.
  • Figures 7A-J show the expression of Clec4a2 and cytokines in polyp and non-polyp sites and the abundance ratio of MDSCs. Data are representative of three independent experiments and are shown as mean ⁇ SD. *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001. WT and Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice housed separately were subjected to AOM-DSS treatment, the large intestine was excised, and total RNA was extracted from the polyp and non-polyp portions of the large intestine. (Fig.
  • Proteins were extracted from non-polyp and polyp sites of WT and Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice, and pStat5a and total Stat5a protein (90 kDa) expression levels were determined by Western blot analysis.
  • FIGS. 8A-F are diagrams showing that administration of anti-NA2 antibodies ameliorates the onset of colitis. Data are shown as mean ⁇ SD. *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01.
  • FIGS. 8A-E WT mice were administered 4% DSS for 7 days, followed by normal water for 4 days.
  • FIG. 8A Body weight change. Indicates disease severity.
  • Anti-NA2 antibody (633_1G3) binds to NA2.
  • Anti-NA2 antibody (633_1G3) selectively associates with asialo-glycan-expressing cell lines among N-glycans.
  • the 633_1G3 antibody bound to Lec2 cells (asialo sugar chain) with higher strength than wild-type CHO cells (expressing many sugar chains with sialic acid at the non-reducing end), Lec1 cells (terminal high mannose), and Lec8 (agalacto sugar chain).
  • the binding activity of the anti-DCIR antibody to mouse and human DCIR can be evaluated as a result.
  • 1 shows the binding activity of anti-DCIR antibodies to mouse and human DCIR.
  • the anti-DCIR antibody showed binding activity to mouse DCIR-Fc and human DCIR-Fc. It shows the binding inhibitory activity of the anti-DCIR antibody between NA2-expressing cells (Lec2) and DCIR.
  • DCIR-Fc and isotype or anti-DCIR antibody were added to Lec2 cells (asialo-glycan) to measure the effect on the binding of DCIR-Fc to Lec2 cells.
  • the anti-DCIR antibody was shown to have binding inhibitory activity between NA2-expressing cells (Lec2) and DCIR.
  • An example of the base sequence of an anti-DCIR antagonist antibody is shown.
  • An example of the amino acid sequence of an anti-DCIR antagonist antibody is shown. Bone marrow cells from wild-type or DCIR-deficient mice were cultured with M-CSF (20 ng/mL) for 2 days, followed by M-CSF (20 ng/mL), RANKL (100 ng/mL) for 4 days.
  • FIG. 15A is micrographs after TRAP staining of osteoclasts in wild-type and DCIR-deficient mice upon addition of isotype or anti-DCIR antibody.
  • FIG. 15B represents the number of osteoclasts with each cell diameter ( ⁇ m) indicated in wild-type and DCIR-deficient mice. The graph shows the mean and standard deviation of the number of osteoclasts in 4 wells and tested by student's t-test. *; p ⁇ 0.05, iso VS anti-DCIR antibody.
  • each component may contain multiple types of applicable substances.
  • the content rate or content of each component means the total content rate or content of the multiple types of substances present in the composition, unless otherwise specified.
  • Treatment of a disease in the present disclosure includes elimination, amelioration, etc. of a disease or symptoms associated with the disease.
  • prevention of a disease includes preventing the onset of the disease or symptoms associated with the disease, delaying the onset of the disease or symptoms associated with the disease, and alleviating the disease or symptoms associated with the disease.
  • DCIR dendritic cell immunoreceptors
  • a pharmaceutical composition containing a dendritic cell immune receptor (DCIR)-double-chain asialo-N-glycan (NA2) binding inhibitor hereinafter also referred to as DCIR-NA2 binding inhibitor
  • DCIR-NA2 binding inhibitor a pharmaceutically acceptable carrier
  • DCIR (gene symbol: Clec4a2) is a type of myeloid C-type lectin receptor that contains ITIM in the cytoplasmic domain.
  • the research group of the inventors previously reported that DCIR recognizes a double-stranded asialo-N-glycan (NA2) and suppresses the differentiation and activation of dendritic cells (Kaifu et al., J. Exp. Med., 218(12), e20210435, 2021).
  • the inventors have found that blocking DCIR signals enhances the GM-CSF-Stat5 signaling pathway, thereby ameliorating diseases such as inflammatory bowel disease and intestinal tumors.
  • DSS-induced colitis is an animal disease model for human ulcerative colitis and Crohn's disease.
  • AOM-DSS-induced tumors are a model of colorectal cancer, in which proto-oncogenes such as K-ras gene and ⁇ -catenin gene are mutated to generate polyps in the colon, and DSS-induced inflammation promotes tumorigenesis.
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice were found to be more resistant to DSS-induced colitis than wild-type (WT) mice.
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice Furthermore, in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice, the development of AOM-DSS-induced intestinal tumors, a model for colon cancer, was suppressed. The phenotype of Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice was mild even under cohabitation conditions with WT mice, suggesting that the phenotype of Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice is independent of intestinal resident microbes. In the large intestine of Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice, the expression of GM-CSF and its downstream phosphorylation of Stat5 were enhanced, the expression of Il17a and Cxcl2 was suppressed, and the infiltration of neutrophils and myeloid-derived suppressor cells was suppressed.
  • the present inventors have found that the DCIR-NA2 axis plays a role in controlling immune responses in the intestine induced by innate immune receptors such as TLR8 and TLR9. Under physiological conditions, DCIR regulates excessive differentiation and activation of DCs and prevents autoimmunity. However, in the intestine, DCIR signals regulate innate immune signals and suppress GM-CSF induction, making the intestine vulnerable to inflammation and tumorigenesis. Therefore, inhibition of DCIR activation can suppress intestinal inflammation and tumor development via the innate immune system.
  • a DCIR-NA2 binding inhibitor is a substance that inhibits (including reduces binding) the binding between DCIR and NA2.
  • a DCIR inhibitor is a substance that inactivates DCIR.
  • the DCIR-NA2 binding inhibitor or DCIR inhibitor may be an antibody.
  • the DCIR-NA2 binding inhibitor can be an anti-NA2 antibody.
  • the DCIR-NA2 binding inhibitor or DCIR inhibitor can be an anti-DCIR antibody.
  • inhibition of the binding between DCIR and NA2 can be confirmed by a method according to the method detailed in the section on anti-NA2 antibody and anti-DCIR antibody below.
  • inactivation of DCIR can be confirmed by a method according to the method detailed in the section on anti-DCIR antibodies.
  • Anti-NA2 antibodies and anti-DCIR antibodies that may be included in the pharmaceutical composition of the present disclosure are described in detail below.
  • An anti-NA antibody is an antibody that specifically binds to NA2.
  • the anti-NA2 antibody may be an antibody that inhibits binding between DCIR-two-chain asialo-N-glycans.
  • NA2 is a double-stranded asialo N-glycan that is a ligand of DCIR.
  • NA2 includes a sugar chain having a basic structure of a structure represented by the following formula (where sialic acid is not present at the two non-reducing ends of the structure of formula (A) below, and x and y each independently represent 3 or 4).
  • NA2 to which the anti-NA2 antibody specifically binds has a sugar chain with the structure represented by the above formula as a basic structure, and may have one branched chain at any site of the above basic structure, or may have fucose added. However, there is no sialic acid at the two non-reducing ends of the structure above. Examples of such sugar chain structures include the following sugar chains.
  • NA2s represented by the above formula are DCIR ligands, and antibodies that bind to these NA2s are thought to inhibit the binding of these NA2s to DCIR.
  • the anti-NA2 antibody may be an antibody that recognizes NA2-modified proteins (including peptides) or other NA-modified macromolecular compounds.
  • NA2-modified proteins include NA2-modified bovine serum albumin (BSA), ovalbumin (OVA), transferrin, and the like.
  • NA2-modified polymer compounds include NA-modified polyallylamine (PAA) and the like. These proteins or other macromolecular compounds to which the reducing end of the sugar chain structure of NA2 is bound can be used.
  • NA2 can be obtained by collection from living organisms, production by genetic engineering methods, production by synthetic organic chemistry methods, and the like. NA2 can also be made from commercially available materials.
  • SA Multivalent Biotinylated Polymer
  • G Gal
  • GN GlcNAc
  • M Man
  • NA2 may be of biological origin or non-biological origin.
  • NA2 may be derived from a biological glycoprotein (including glycopeptide). Glycoproteins include the examples described above. Details of NA2 can be referred to, for example, International Publication No. 2016/006700.
  • the anti-NA2 antibody has at least one selected from the group consisting of heavy chain CDRs 1-3, light chain CDRs 1-3, heavy chain FRs 1-4, and light chain FRs 1-4 of the following sequence. In one aspect, the anti-NA2 antibody has all of the heavy chain CDRs 1-3 of the sequence below. In one aspect, the anti-NA2 antibody has all of the light chain CDRs 1-3 of the sequence below. In one aspect, the anti-NA2 antibody has all of the heavy chain FR1-4 of the sequence below. In one aspect, the anti-NA2 antibody has all of the light chain FR1-4 of the sequence below. In one aspect, the anti-NA2 antibody has all of the heavy chain CDRs 1-3 and light chain CDRs 1-3 of the sequence below.
  • the anti-NA2 antibody has all of the heavy chain FR1-4 and light chain FR1-4 sequences below. In one aspect, the anti-NA2 antibody has all of the heavy chain CDRs 1-3, light chain CDRs 1-3, heavy chain framework (FR) 1-4, and light chain FRs 1-4 of the following sequence.
  • Heavy chain FR1 (SEQ ID NO:51) gaggtgaagcttctcgagtctggaggtggcctggtgcagcctggaggatccctgaaactctcctgtgcagcctca Heavy chain CDR1 (SEQ ID NO:52) ggattcgattttagtagatactgg Heavy chain FR2 (SEQ ID NO:53) atgagttgggtccggcaggctccagggaaagggctagaatggattggagaa Heavy chain CDR2 (SEQ ID NO:54) attaatccagatagcagtacgata Heavy chain FR3 (SEQ ID NO:55) aactatacgccatctctaaaggataaattcatcatctccagagacaacgccaaaaatacgctgtacctgcaaatgagcaaagtgagatctgagg
  • Light chain FR1 (SEQ ID NO:58) gatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtctgggagatcaagcctccatctcttgcagatctagt light chain CDR1 (SEQ ID NO:59) cagagtcttgcacacagtaatggaaacacctat Light chain FR2 (SEQ ID NO: 60) ttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctac light chain CDR2 aaaatttcc Light chain FR3 (SEQ ID NO: 61) aaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattttcttt
  • Heavy chain FR1 (SEQ ID NO: 64) EVKLLESGGGGLVQPGGSLKLSCAAS Heavy chain CDR1 (SEQ ID NO:65) GFDFSRYW Heavy chain FR2 (SEQ ID NO: 66) MSWVRQAPGKGLEWIGE Heavy chain CDR2 (SEQ ID NO: 67) INPDSSTI Heavy chain FR3 (SEQ ID NO: 68) NYTPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYC Heavy chain CDR3 (SEQ ID NO: 69) ARPD GTIYYYGCWYFDV Heavy chain FR4 (SEQ ID NO:70) WGA GT TV
  • Light chain FR1 (SEQ ID NO:71) DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSS light chain CDR1 (SEQ ID NO: 72) QSLAHSNGNTY Light chain FR2 (SEQ ID NO:73) LHWYLQKPGQSPKLLIY light chain CDR2 KIS Light chain FR3 (SEQ ID NO:74) NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC Light chain CDR3 (SEQ ID NO:75) SQSTHVPWT Light chain FR4 (SEQ ID NO:76) FGGG TKLEIK
  • Heavy chain variable region gaggtgaagcttctcgagtctggaggtggcctggtgcagcctggaggatccctgaaactctcctgtgcagcctcaggattcgattttagtagatactggatgagttgggtccggcaggctccagggaaagggctagaatggagaaattaccagatagcagtacgataaactatacgccatctctaaaggataaattcatcatctccagagacaacgccaaaaatacgctgtacc tgcaaatgagcaaagtgagatctgaggacacagccctttattactgtgcaagacctgatgggacgattgctggtggtggtggggcgcagggaccac
  • Heavy chain variable region (SEQ ID NO:79) EVKLLESGGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYTPSLKDKFISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARPDGTIYYYGCWYFDVWGAGTTV
  • the anti-NA2 antibody is not limited to the antibody having the sequence shown in FIG. 10, and may be any antibody that exhibits binding activity to NA2 and has the ability to inhibit binding between NA2 and DCIR.
  • Various antibodies that exhibit binding activity to NA2 and have the ability to inhibit the binding of NA2 to DCIR can be produced by those skilled in the art based on the methods described in the present disclosure and known antibody acquisition techniques. Humans are known to have NA2 having sugar chains similar to mouse NA2, and the mouse anti-NA2 antibody is similarly effective in humans.
  • an anti-NA2 antibody can be an antibody having a heavy chain variable region with 80% or greater, 85% or greater, 90% or greater, or 95% or greater amino acid sequence identity with SEQ ID NO:79.
  • the anti-NA2 antibody can be an antibody having a light chain variable region with 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more amino acid sequence identity with SEQ ID NO:80.
  • the anti-NA2 antibody may also be an antibody having heavy chain CDRs 1 to 3, light chain CDRs 1 to 3, or a combination thereof, and having a heavy chain variable region having 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more amino acid sequence identity with SEQ ID NO:79, and a light chain variable region having 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more amino acid sequence identity with SEQ ID NO:80.
  • the anti-NA2 antibody may be an antibody having heavy chain CDRs 1-3, light chain CDRs 1-3, or a combination of these sequences, having a heavy chain variable region having 90% or more amino acid sequence identity with SEQ ID NO:79, and having a light chain variable region having 90% or more amino acid sequence identity with SEQ ID NO:80.
  • identity refers to the ratio of the number of matching amino acid residues to the total number of amino acid residues when two amino acid sequences to be compared are aligned by appropriately inserting gaps in one or both of them so as to maximize the number of matching amino acid residues. Alignments can be performed using well-known alignment tools such as BLAST, FASTA, CLUSTAL W, and the like. For example, alignments can be evaluated with the default parameters of BLAST.
  • the binding activity of the anti-NA2 antibody can be confirmed by the following procedure.
  • a 96-well plate is coated with ovalbumin (OVA) or NA2-OVA (10 ⁇ g/ml), left overnight at 4° C., and plate-coated with antigen. After that, the plate is washed and blocked with 10% (w/v) FCS-containing PBS for 1 hour at room temperature. Subsequently, the plate is washed, an isotype antibody or anti-NA2 antibody is added, and the plate is allowed to stand at room temperature for 1 hour. After washing the plate, a labeled antibody is used to detect the isotype antibody. Specifically, the binding activity of the anti-NA2 antibody can be confirmed by the method described in Examples.
  • the ability of the anti-NA2 antibody to inhibit the binding of NA2 and DCIR can be confirmed by the following procedure.
  • NA2-OVA or OVA (10 ⁇ g/ml) is added to the bottom of a 96-well plate and left overnight at 4° C. to bind to the plate.
  • Block with PBS containing 10% (w/v) FCS add Fc or DCIR-Fc (5 ⁇ g/ml), and anti-NA2 antibody.
  • Fc or DCIR-Fc associated with the plate is detected with Peroxidase-conjugated anti-human Fc (Jackson Immunoresearch).
  • the ability of the anti-NA2 antibody to inhibit the binding of NA2 and DCIR can be confirmed by the method described in Examples (Fig. 9A).
  • Anti-NA2 antibodies can be produced by any suitable method.
  • anti-NA2 antibodies can be produced in vivo, in cultured cells, in vitro translation reactions, recombinant DNA expression systems, and the like.
  • anti-NA2 antibodies can be produced by immunizing nude mice with monoclonal antibody-producing hybridomas and purifying them from ascites.
  • the isotype of the anti-NA2 antibody may be, for example, IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE, although IgM is most preferred.
  • the anti-NA2 antibody may be a full-length antibody or a minibody such as an antibody fragment that specifically binds to NA2.
  • Antibody fragments include Fab, Fab', F(ab') 2 , scFv, diabodies, and the like. Methods for obtaining these antibody fragments include constructing genes encoding these antibody fragments, introducing them into expression vectors, and expressing them in suitable host cells.
  • the anti-NA2 antibody may also be a modified antibody. Antibodies bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) and biotin can also be used as modified antibodies. Such antibody modifications can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Methods known in this field can be used for antibody modification.
  • the anti-NA2 antibody may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a derivative of an antibody, such as an antibody that retains the ability to specifically bind to an antigenic determinant.
  • Polyclonal antibodies can be obtained by isolating antibody-containing antisera from GalT-deficient mice immunized with NA2 derivatives, and screening for the presence of antibodies having the desired specificity using well-known methods such as NA2 sugar chain ELISA assay and asialo sugar chain-expressing cells staining.
  • well-known methods and methods devised for production of the present antibodies can be employed.
  • an NA2-BSA derivative in which 10 or more molecules of NA2 are bound to BSA can be used as an immunogen to immunize a mouse (GalT1-deficient mouse), which does not contain asialo-glycans in the body due to deficiency of Galactosyl transferase glycosyltransferase, by subcutaneously injecting NA2-BSA complex (GT-111157, Glyco-engineering Laboratory). Wild-type animals may also be immunized.
  • An adjuvant (Titermax gold; manufactured by TiterMax USA, Inc.) may be used for immunization. Adjuvants known in the art can be used as such adjuvants.
  • Monoclonal antibodies can be obtained by excising spleen cells from an immunized animal and fusing them with myeloma cells to produce hybridoma cells that produce monoclonal antibodies.
  • Hybridoma cells that produce an antibody that recognizes the NA2 sugar chain of interest are selected using well-known methods such as ELISA assay using a 96-well plate bound NA2 sugar chain to OVA and detection of binding to an asialo sugar chain-expressing cell line (Lec2 cells) by staining.
  • a hybridoma that secretes the desired antibody is cloned, cultured under appropriate conditions, the secreted antibody is collected, and purified using a well-known method such as ion exchange column, affinity chromatography, protein L-associated beads, and the like. It is also possible to implant hybridomas into immunodeficient mice, collect secreted antibody-containing ascitic fluid, and similarly purify. In addition, based on the sequence of the obtained BCR VDJ region, antibody production in cultured cells, production of human monoclonal antibodies using XenoMouse strain (See Green, J. Immunol. Methods 231: 11-23, 1999; Wells, Eek, Chem Biol 2000 Aug; 7(8): R185-6), phage display without immunization. It is also possible to generate monoclonal antibodies based on
  • mouse antibodies, human antibodies, rat antibodies, rabbit antibodies, sheep antibodies, camel antibodies, avian antibodies, etc. may be used, and artificially modified genetically modified antibodies (e.g., chimeric antibodies, humanized antibodies, etc.) for the purpose of reducing heteroantigenicity against humans may also be used.
  • artificially modified genetically modified antibodies e.g., chimeric antibodies, humanized antibodies, etc.
  • Mouse antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies are preferred as anti-NA2 antibodies, and humanized antibodies are more preferred.
  • a chimeric antibody is an antibody composed of a non-human mammal, for example, a heavy chain and a light chain variable region of a mouse antibody and a heavy chain and a light chain constant region of a human antibody, and can be obtained by ligating the DNA encoding the variable region of a mouse antibody to the DNA encoding the constant region of a human antibody, incorporating this into an expression vector, and introducing it into a host for production.
  • Humanized antibodies are obtained by grafting the complementarity determining regions (CDRs) of mammals other than humans, such as mouse antibodies, to the complementarity determining regions of human antibodies, and general techniques for genetic recombination are also known.
  • CDRs complementarity determining regions
  • a DNA sequence designed to link the CDRs of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody is synthesized by PCR from several oligonucleotides prepared to have overlapping portions at the ends.
  • the resulting DNA is ligated with a DNA encoding a human antibody constant region, then incorporated into an expression vector, which is then introduced into a host for production.
  • the FRs of the human antibody linked via the CDRs are selected such that the complementarity determining regions form good antigen-binding sites.
  • amino acids in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the humanized antibody forms a suitable antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856.).
  • Human antibodies can also be produced using known methods.
  • human lymphocytes can be sensitized in vitro with a desired antigen or cells expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocytes can be fused with human myeloma cells such as U266 to obtain a desired human antibody having antigen-binding activity.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having the entire repertoire of human antibody genes with a desired antigen.
  • a technique for obtaining human antibodies by panning using a human antibody library is also known.
  • variable region of a human antibody can be expressed on the surface of phage as a single chain antibody (scFv) by the phage display method, and phage that bind to the antigen can be selected. Genetic analysis of the selected phage allows determination of the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen. Since the DNA sequence of the scFv that binds to the antigen is known (see, for example, FIG. 10), an appropriate expression vector can be constructed using this sequence to obtain a human antibody. Methods for generating antibodies based on DNA sequences are well known.
  • An anti-DCIR antibody is an antibody that specifically binds to DCIR.
  • DCIR is one of the members of the CLR family, and is a membrane protein having an extracellular carbohydrate recognition domain and an intracellular immunoinhibitory tyrosine motif (ITIM).
  • the anti-DCIR antibody may be an antibody that inhibits binding between DCIR and NA2, or an inhibitory antibody that attenuates or inactivates the action of DCIR.
  • anti-DCIR antagonist antibodies are preferred.
  • the anti-DCIR antagonist antibody may be a competitive antagonist antibody that competes with NA2 or a non-competitive antagonist antibody.
  • binding activity of the anti-DCIR antibody can be confirmed by the following procedure. Binding activity to DCIR-expressing cell lines is measured as follows. Isotype or anti-DCIR antibody (10 ⁇ g/ml) is added to DCIR-expressing cell lines or empty cells (HEK293 cells), suspended, and allowed to stand on ice for 30 minutes. The cells are washed, a fluorescent substance-labeled anti-mouse IgM antibody is added (0.5 ⁇ g/ml), and the cells are allowed to stand on ice for 30 minutes. Cells are washed and antibody binding to cells is measured by flow cytometry. Alternatively, the binding activity to the DCIR protein is measured as follows.
  • An isotype antibody or an anti-DCIR antibody (5 ⁇ g/ml) is coated on a 96-well plate and allowed to stand overnight at 4° C. to coat the plate. After that, the plate is washed and blocked with 10% (w/v) FCS-containing PBS for 1 hour at room temperature. Subsequently, the plate is washed, Fc or DCIR-Fc protein (5 ⁇ g/ml) is added and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After washing the plate, HRP-labeled anti-human Fc antibody is used to detect DCIR-Fc protein bound to the coated antibody.
  • an anti-DCIR antibody which is a DCIR-NA2 binding inhibitor, to inhibit the binding of NA2 and DCIR
  • DCIR-Fc and anti-DCIR antibody or isotype antibody (10 ⁇ g/ml) are added to Lec2 cells expressing asialo-glycans (mainly NA2), suspended, and allowed to stand on ice for 30 minutes. Cells are washed and binding of DCIR-Fc protein to Lec2 cells is detected using a fluorescently labeled anti-human Fc antibody.
  • the anti-DCIR antibody which is a DCIR inhibitor, inactivates DCIR.
  • the degree of osteoclast differentiation can be evaluated by adding M-CSF and sRANKL to wild-type mouse bone marrow cells, culturing them for about a week, performing TRAP staining, and counting TRAP-positive multinucleated cells (50).
  • An anti-DCIR antibody is added to this differentiation induction system, the degree of osteoclast differentiation is measured, and the effect on osteoclast differentiation is evaluated by comparing with the case where an isotype antibody is added.
  • Anti-DCIR antibodies can be produced by any suitable method, for example, anti-DCIR antibodies can be produced by cultured cells. More specifically, for example, an anti-DCIR antibody can be produced by the following method. Antibodies are established by the following procedure. A DCIR-expressing cell line (HEK293 cells into which a DCIR expression vector was introduced and DCIR was expressed on the cell surface) was mixed with an immune adjuvant (Titer Max), DCIR-deficient mice were immunized twice, and the mice were euthanized when an increase in the antibody titer against DCIR was observed.
  • a DCIR-expressing cell line HEK293 cells into which a DCIR expression vector was introduced and DCIR was expressed on the cell surface
  • an immune adjuvant Titer Max
  • Spleen cells are collected and fused with myeloma cells according to a standard method to prepare hybridoma cells, and a monoclonal library is prepared by limiting dilution. Next, a DCIR-specific antibody is identified from DCIR-expressing cells and DCIR protein-binding activity. The established monoclonal antibody-producing hybridomas are conditioned in a serum-free medium, and finally the antibodies are purified from the cell culture medium using Protein-L associated beads. For administration to humans, it may be humanized.
  • the items described in the anti-NA2 antibody section can be applied, except for items specific to the anti-NA2 antibody.
  • the anti-DCIR antibody has at least one selected from the group consisting of heavy chain CDRs 1-3, light chain CDRs 1-3, heavy chain FRs 1-4, and light chain FRs 1-4 of the sequence below. In one aspect, the anti-DCIR antibody has all of the heavy chain CDRs 1-3 of the sequence below. In one aspect, the anti-DCIR antibody has all of the light chain CDRs 1-3 of the sequence below. In one aspect, the anti-DCIR antibody has all of the heavy chain FR1-4 of the sequence below. In one aspect, the anti-DCIR antibody has all of the light chain FR1-4 of the sequence below. In one aspect, the anti-DCIR antibody has all of the heavy chain CDRs 1-3 and light chain CDRs 1-3 of the sequence below.
  • the anti-DCIR antibody has all of the heavy chain FR1-4 and light chain FR1-4 sequences below. In one aspect, the anti-DCIR antibody has all of the heavy chain CDRs 1-3, light chain CDRs 1-3, heavy chain framework (FR) 1-4, and light chain FRs 1-4 of the following sequence.
  • anti-DCIR antibody anti-DCIR antagonist antibody (5A3D8) BCR VDJ region sequence
  • 5A3D8 BCR VDJ region sequence The base sequences and corresponding amino acid sequences of each region of the anti-DCIR antibody (anti-DCIR antagonist antibody (5A3D8) BCR VDJ region sequence) in one embodiment are shown below.
  • Heavy chain FR1 (SEQ ID NO:81) gaggtccagctgcagcagtctggacctgagctggtaaagcctggggcttcagtgaagatgtcctgcaaggcttct Heavy chain CDR1 (SEQ ID NO:82) ggatacacattcactagctatgtt Heavy chain FR2 (SEQ ID NO:83) atgcactgggtgaagcagaagcctgggcagggccttgagtggattggatat Heavy chain CDR2 (SEQ ID NO:84) attaatccttacaatgatggtact Heavy chain FR3 (SEQ ID NO:85) aagtacaatgagaagttcaaaggcaaggccacactgacttcagacaaatcctccagcaca gcctacatggagctcagacctctga
  • Light chain FR1 gacattgtgatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagc gtcacctgcaaggccagt light chain CDR1 (SEQ ID NO: 89) cagaatgtgggtactaat Light chain FR2 (SEQ ID NO: 90) gtagcctggtatcaacagaaaccagggcaatctcctaaagcactgatttac Light chain CDR2 (SEQ ID NO:91) tcggcatcc Light chain FR3 (SEQ ID NO:92) taccggtacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcact ctcaccatcagcaatgtgcagtctgaagacttggcagagtatttctgt Light chain CDR3 (SEQ ID NO:88) ga
  • Heavy chain FR1 (SEQ ID NO:95) EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKAS Heavy chain CDR1 (SEQ ID NO:96) GYTFTSYV Heavy chain FR2 (SEQ ID NO:97) MHWVKQKPGQGLEWIGY Heavy chain CDR2 (SEQ ID NO:98) INPYNDGT Heavy chain FR3 (SEQ ID NO:99) KYNEKFKGKATLTSDKSSSSTAYMELSSLTSEDYAVYYC Heavy chain CDR3 (SEQ ID NO: 100) ARSYKRYDWYPR Heavy chain FR4 (SEQ ID NO: 101) WGA GT TV
  • Light chain FR1 (SEQ ID NO: 102) DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVVTCKAS light chain CDR1 (SEQ ID NO: 103) QNV GTN Light chain FR2 (SEQ ID NO: 104) VAWYQQKPGQSPKALIY Light chain CDR2 (SEQ ID NO: 105) SAS Light chain FR3 (SEQ ID NO: 106) YRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC Light chain CDR3 (SEQ ID NO: 107) QQYNSYPLT Light chain FR4 (SEQ ID NO: 108) FGGG TKLEIK
  • Heavy chain variable region (SEQ ID NO: 111) EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKAS GYTFTSYV MHWVKQKPGQGLEWIGY INPYNDGTKY NEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDYAVYYC ARSYKRYDWYPR WGAGTTV
  • the anti-DCIR antibody is not limited to the antibodies having the sequences of FIGS. 14A and 14B, and may be any antibody that exhibits binding activity to DCIR and has the ability to inhibit DCIR or inhibit the binding of NA2 and DCIR.
  • Various antibodies that exhibit binding activity to DCIR and have the ability to inhibit DCIR or inhibit the binding of NA2 and DCIR can be produced by those skilled in the art based on the methods described in the present disclosure and known antibody acquisition techniques.
  • an anti-DCIR antibody can be an antibody having a heavy chain variable region with 80% or greater, 85% or greater, 90% or greater, or 95% or greater amino acid sequence identity with SEQ ID NO:111.
  • the anti-DCIR antibody can be an antibody having a light chain variable region with 80% or greater, 85% or greater, 90% or greater, or 95% or greater amino acid sequence identity with SEQ ID NO:112.
  • the anti-DCIR antibody may be an antibody having a heavy chain variable region having heavy chain CDRs 1-3, light chain CDRs 1-3, or a combination thereof of the above sequences and having 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more amino acid sequence identity with SEQ ID NO: 111, and having a light chain variable region having 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more amino acid sequence identity with SEQ ID NO: 112.
  • the anti-DCIR antibody may be an antibody having heavy chain CDRs 1-3, light chain CDRs 1-3, or a combination thereof of the above sequences, and having a heavy chain variable region with 90% or more amino acid sequence identity with SEQ ID NO:111, and a light chain variable region with 90% or more amino acid sequence identity with SEQ ID NO:112.
  • the pharmaceutical composition of the present disclosure is used to treat or prevent at least one disease selected from the group consisting of inflammatory bowel disease and intestinal tumor.
  • Inflammatory diseases include Crohn's disease, ulcerative colitis, and the like.
  • Intestinal tumors include colon cancer, rectal cancer, small intestine cancer, and the like.
  • autoimmune diseases such as collagen-induced arthritis (CIA) and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)
  • CIA collagen-induced arthritis
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • inhibition of DCIR-NA2 binding or inhibition of DCIR is thought to exacerbate the disease.
  • inhibition of DCIR-NA2 binding or inhibition of DCIR suppresses inflammatory bowel disease and intestinal tumors in the large intestine. This is because innate immune lymphocyte 3 (ILC3) cells are abundant in the intestinal tract, which are absent in other organs.
  • ILC3 innate immune lymphocyte 3
  • Pharmaceutically acceptable carriers used in the pharmaceutical composition of the present disclosure include various commonly used organic or inorganic carrier substances, such as excipients, lubricants, binders, and disintegrants in solid preparations; Additives such as preservatives, antioxidants, coloring agents, sweeteners, adsorbents, and wetting agents can also be used as necessary.
  • the form of the pharmaceutical composition of the present disclosure is not particularly limited.
  • a pharmaceutical composition of the present disclosure may be formulated by mixing, dissolving, granulating, tabletting, emulsifying, encapsulating, freeze-drying, etc. the ingredients used in the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical compositions of the present disclosure may be formulated for oral administration, and more specifically into dosage forms such as tablets, pills, dragees, soft capsules, hard capsules, solutions, suspensions, emulsions, gels, syrups, slurries, and the like.
  • Pharmaceutical compositions of the present disclosure may also be formulated for parenteral administration, and more specifically, injectable solutions, suspensions, emulsions, creams, ointments, inhalants, suppositories, and the like.
  • the administration route of the pharmaceutical composition is not particularly limited.
  • administration routes include oral administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, eye drops, ear drops, nasal administration, inhalation administration, transdermal administration, transrectal administration, intrathecal administration, intravenous administration, surgical treatment such as indwelling, and the like.
  • the dose and dosing interval of the pharmaceutical composition are appropriately set according to conditions such as the route of administration; symptoms, body weight, physique, age, DCIR activity of the subject to be administered, etc.; types and amounts of ingredients used in combination.
  • the pharmaceutical composition of the present disclosure is administered to a subject with at least one disease selected from the group consisting of an inflammatory disease and an intestinal tumor at a dose and interval that provides a therapeutically or prophylactically effective amount of the DCIR-NA2 binding inhibitor or DCIR inhibitor.
  • Dosing intervals can be less than a day, once a day, or more than a day.
  • a method for treating or preventing at least one disease selected from the group consisting of inflammatory bowel disease or intestinal tumor comprising administering an effective amount of a DCIR-NA2 binding inhibitor or DCIR inhibitor to a subject.
  • use of a DCIR-NA2 binding inhibitor or DCIR inhibitor in the manufacture of a medicament for treating or preventing at least one disease selected from the group consisting of inflammatory bowel disease or intestinal tumor is provided.
  • a DCIR-NA2 binding inhibitor or DCIR inhibitor for use in treating or preventing at least one disease selected from the group consisting of inflammatory bowel disease or intestinal tumors. At least one disease selected from the group consisting of inflammatory bowel disease and intestinal tumor, the DCIR-NA2 binding inhibitor and the DCIR inhibitor, and their scope of application in these aspects are the same as those described above.
  • IBD Inflammatory bowel diseases
  • CD Crohn's disease
  • UC ulcerative colitis
  • CLR C-type lectin receptors
  • TLR Toll-like receptors
  • Dectin-1 a CLR that recognizes ⁇ -glucan, induces the intestinal antibacterial protein S100A8 by recognizing ⁇ -glucan in food, and suppresses the growth of Lactobacillus murinus (L. murinus), a Treg-inducing bacterium [5]. Therefore, blocking Dectin-1 may reduce L. murinus proliferation and increasing Treg cells can suppress the development of colitis [6].
  • MGL1 another CLR expressed in colonic squamous epithelial (cLP) macrophages, also ameliorate chemical colitis by binding to Streptococcus and Lactobacillus species and inducing IL-10 [7].
  • DCIR Dendritic cell immunoreceptor
  • Clec4a2 gene symbol Clec4a2
  • ITIM immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice spontaneously develop autoimmune sialadenitis and enthesitis [13, 14].
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice are highly susceptible to autoimmune diseases such as collagen-induced arthritis (CIA), experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) [13, 15].
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice have an expanded DC population and enhanced antigen-presenting capacity, which has been suggested to be responsible for the autoimmunity and hyperreactivity of Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice [50, 13].
  • DCs from bone marrow cells (BMCs) in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), also known as colony-stimulating factor 2 (CSF2), is promoted by hyperphosphorylation of signaling and transcriptional activator 5 (Stat5), suggesting that DCIR regulates GM-CSF signals by recruiting SHP-1 to the ITIM, thereby suppressing downstream phosphorylation of Stat5. has been suggested [13, 16].
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
  • CSF2 colony-stimulating factor 2
  • DSS-induced colitis is a disease model animal for human ulcerative colitis and Crohn's disease.
  • AOM-DSS-induced colorectal tumor is a model of colorectal cancer, in which protooncogenes such as K-ras gene and ⁇ -catenin gene are mutated to generate polyps in the colon, and DSS-induced inflammation promotes tumorigenesis.
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice were less susceptible to DSS-induced colitis than wild-type (WT) mice, had suppressed expression of inflammatory cytokines and chemokines, and did not involve resident microbes in these phenomena.
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice had suppressed AOM-DSS-induced colon tumor development and increased Csf2 expression in polyps compared to WT mice.
  • administration of an anti-double-chain asialo-N-glycan antibody (anti-NA2 antibody) suppressed the development of colitis and colon cancer.
  • mice Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice were generated using homologous recombination technology and backcrossed with BALB/cA (Japan SLC, Shizuoka, Japan) for 12 generations [1]. WT and Clec4a2 ⁇ / ⁇ male mice of similar age were used. These mice were bred under specific pathogen-free conditions in an environmentally controlled clean room at the Tokyo University of Science's Institute for Biomedical Sciences. All animal experiments were approved by the Institutional Animal Use Committee and were conducted in accordance with the ethical guidelines for animal experiments and the safety guidelines for genetic manipulation experiments.
  • DSS-induced colitis was induced by the following procedure. Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice and WT mice around 10 weeks of age were divided into separate groups or cohabiting groups (cohabiting groups cohabiting after weaning), and 4% DSS (36-50 kDa; MP Biomedicals, Illkirch, France) was administered in drinking water for 7 days, followed by normal water recovery for 5 days.
  • Diarrhea and bloody stool were scored once every two days as follows. [Diarrhea] 0: normal, 1: slightly loose stool, 2: loose stool, 3: slightly watery diarrhea, 4: watery diarrhea. [Hematochezia] 0: normal, 2: slight bleeding, 3: moderate bleeding, 4: heavy bleeding.
  • Weight loss was scored as follows. [Weight loss] 0: None, 1: 0% to 5% loss, 2: 5% to 10% loss, 3: 10% to 15% loss, 4: more than 15% loss.
  • the disease activity index was the average of these scores.
  • the disease activity index was (sum of diarrhea, bleeding, and weight loss scores)/3.
  • PBS and rmGM-CSF (Petrotech, USA) (1 ⁇ g) were administered intraperitoneally on days 0, 1, 2, and 3 during 4% DSS-induced colitis in Clec4a2 ⁇ / ⁇ and WT mice.
  • WT mice were intraperitoneally administered IgG2a isotype control (Bio X Cell, USA, clone: 2A3) and anti-GM-CSF (Bio X Cell, USA, clone: MP1-22E9) neutralizing antibody (100 ⁇ g/mouse) on days 0, 1, 2, 3, 4, 5, and 6.
  • Anti-NA2 antibody (clone: 633_1G3, 200 ⁇ g/mouse) and isotype antibody (IgM, clone: MM-3, 200 ⁇ g/mouse) were administered intraperitoneally to WT mice on days 1, 2, and 5. Mice were euthanized 12 days after the start of DSS administration and histopathological analysis was performed. Colon sections were washed with PBS, fixed in 10% neutral buffered formalin, and embedded in paraffin. After sectioning, tissue sections were stained with hematoxylin and eosin.
  • An anti-NA2 antibody was produced by immunizing galactosyltransferase-1 (GalT1)-deficient mice with NA2 according to the following procedure.
  • NA2 used for immunization is as follows.
  • Product name GT-11157 Company name: Glyco-engineering Laboratory Co., Ltd.
  • Structure NA2 sugar chain is bound to BSA form by maleimide bond, and 15 to 25 molecules of NA2 are bound to one BSA molecule.
  • cloning was performed again to establish a 633_1G3 clone.
  • the CDR region sequences of clones 633 and 633_1G3 were obtained (Fig. 10), and since 633 and 633_1G3 have the same sequences, they were recognized as monoclonal antibodies.
  • 633_1G3 hybridoma was transplanted into nude mice prestimulated with pristane, the mice were euthanized, and ascites was collected. Since 633_1G3 is an IgM antibody, the antibody was purified with Protein L-modified agarose beads CaptoL (Sigma Aldrich).
  • Anti-NA2 antibodies were identified by confirming their ability to inhibit the binding of DCIR-Fc to NA2 by the following procedure.
  • NA2-OVA GT-11204, Glyco Engineering Laboratory Co., Ltd.
  • OVA 10 ⁇ g/ml
  • Fc or DCIR-Fc 5 ⁇ g/ml
  • culture medium from anti-NA2 antibody-producing hybridomas were added.
  • Fc or DCIR-Fc associated with the plate was detected with Peroxidase-conjugated anti-human Fc (Jackson Immunoresearch) (Fig.
  • DCIR-Fc refers to mouse DCIR-Fc unless otherwise specified.
  • the binding of DCIR extracellular domain-human Fc fusion protein to NA2-OVA was significantly inhibited by an anti-NA2 antibody (633 clone, 633_1G3 was recloned from this clone and has the same BCR VDJ sequence).
  • the ability of the anti-NA2 antibody to bind to NA2 was confirmed by the following procedure. Using the 633_1G3 antibody, the binding ability to NA2 was confirmed by ELISA (Fig. 9B) and staining of the asialo-glycan-expressing LEC2 cell line (Fig. 9C).
  • the ELISA was performed according to the following procedure.
  • a 96-well plate was coated with OVA or NA2-OVA (10 ⁇ g/ml) and allowed to stand overnight at 4° C. to coat the plate with an antigen. After that, the plate was washed and blocked with 10% FC-containing PBS for 1 hour at room temperature. Subsequently, the plate was washed, isotype antibody (iso) (10 ⁇ g/ml (10)) or 633_1G3 antibody (0.1 ⁇ g/ml (0.1), 1 ⁇ g/ml (1) or 5 ⁇ g/ml (5)) was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • isotype antibody iso
  • 633_1G3 antibody 0.1 ⁇ g/ml (0.1)
  • the asialo-glycan-expressing LEC2 cell line was stained by the following procedure.
  • the binding of the anti-NA antibody (633_1G3) to CHO cells and their glycosylation enzyme mutant strains Lec1 (high-mannose sugar chain expression), Lec8 (agalacto sugar chain expression), and Lec2 (asialo sugar chain expression) was analyzed.
  • An isotype antibody (iso) or anti-NA antibody (633_1G3) was added to each cell (10 ⁇ g/ml), left on ice for 30 minutes, washed, PE/Cy7-conjugated anti-mouse IgM antibody (Biolegend) was added, and left on ice for 20 minutes. Cells were washed and analyzed by FACS CantoII.
  • RNA was purified, cDNA was prepared, and DNA sequence analysis of FR1 to FR4 was performed.
  • the amino acid sequence and analyzed DNA sequence of 633_1G3 are shown in FIG. In FIG. 10, the upper row shows the heavy chain (VH) sequence, and the lower row shows the light chain (VL) sequence.
  • AOM-DSS-induced tumors were induced by the following procedure.
  • WT mice were intraperitoneally administered anti-NA2 antibody (clone: 633_1G3, 200 ⁇ g/mouse) and isotype antibody (IgM, clone: MM-3, 200 ⁇ g/mouse).
  • RNA-seq Quantitative Real-Time RT-PCR and RNA Sequencing (RNA-seq) Methods Bacterial lawn cDNA is extracted from the feces of individually housed mice using the QIAmpDNA stool mini kit (QIAGEN, USA). Total mRNA was extracted from the colon of the colitis model or from 2-3 polyps and non-polyps using the GenElute mammalian RNA miniprep kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Equal amounts of RNA from each sample were pooled together prior to RNA-seq. The isolated RNA was reverse transcribed using a high capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems, Foster City, USA).
  • RNA expression of the indicated genes and expression of each bacterium were measured by real-time quantitative PCR using SYBR premix Ex Taq (Takara Bio Inc., Otsu, Japan) on the iCycler system (Bio-Rad, Hercules, USA). The relative value of each gene was calculated by the comparative Ct method and normalized by the Gapdh expression level, and the relative value of each bacterium was calculated by the comparative Ct method and normalized by the 16S expression level. Primer lists are shown in Tables 1A and 1B.
  • the single cell suspension was harvested by vortexing for 30 seconds and filtering through sterile gauze.
  • Epithelial cell adhesion molecule EpCAM
  • CD4, CD8, CD49b, CD19 microbeads BD, USA
  • EpCAM Epithelial cell adhesion molecule
  • CD19 microbeads CD19 microbeads
  • CD11b microbeads BD, USA
  • flow cytometry cells were washed twice with FACS Hank's buffer (HBSS with 2% FCS and 0.1% sodium azide) and then treated with 2.4G2 to block FcR binding.
  • cells were surface dyed with the following 250 times diluted fluorescent conjugate antibodies: anti -mouse CD11B (M1 / 70), CD45 (30 -F11), LY6C (HK1.4), LY6G (1A8), TCR - ⁇ (H57-597), CD3 (17A) 2), IL17A (TC11-18H10), FOXP3 (MF -14), IFN - ⁇ (XMG1.2), GM -CSF (MP1-22E99), CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7), CD206 (C068C2), NOS2 (W) 16030c), ROR ⁇ T (B2D), CD90.2 (30 -H12), GATA3 (PC61), GR1 (RB6-8C), etc.
  • mice exhibit resistance to DSS-induced colitis independent of changes in gut microbiota.
  • the expression of the DCIR gene in the inflammation site of colitis was first examined. To measure the expression of DCIR in the inflamed loci of DSS-induced colitis, mice were administered water containing 4% DSS for 7 days to induce colitis. After that, they were bred with normal drinking water until the 12th day, and then euthanized and analyzed. The expression of the Clec4a2 gene was enhanced in the large intestine of mice that developed colitis compared to that of healthy mice (Fig. 1A).
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ and WT mice were cohabited for 4 weeks after weaning. Thereafter, the mice were given drinking water containing 4% DSS ad libitum under cohabitation conditions. As a result, DSS-induced symptoms such as weight loss, diarrhea and bloody stools, shortening of the large intestine, and inflammatory cell infiltration were milder in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice than in WT mice (FIGS. 1E-G).
  • Figures 1H and 1I show the results of measuring the composition of representative strains of the intestinal flora by real-time PCR of the 16S rRNA sequence of nucleic acids extracted from mouse feces before and after 4 weeks of cohabitation.
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice and WT mice differed in the composition of the representative bacterial species of the intestinal flora before cohabitation, but after cohabitation, the composition became very similar.
  • Treg cells play an important role in maintaining the homeostasis of the intestinal immune system and suppress the development of DSS-induced colitis [6].
  • DSS-induced colitis we also examined Treg cell populations after DSS-induced colitis.
  • the percentages of CD4 + T cells, CD8 + T cells, and CD4 + Foxp3 + T cells among CD45 + cells in cLP were almost the same between WT and Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice (FIG. 2E).
  • Expression levels of Foxp3, Tgfb, and Tbx21 in the colon were also similar between Clec4a2 ⁇ / ⁇ and WT mice (FIG. 2F).
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice have decreased expression of inflammatory cytokines and chemokines such as Il17a and Cxcl2.
  • gene expression in the colon 12 days after induction of DSS-induced colitis was examined by RNA-seq analysis (Fig. 3A).
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice had significantly reduced expression of inflammatory cytokines such as Tnf, Il6, Il1b, Il1a, and Ifn-g compared to WT mice.
  • Il17f was not reduced.
  • Csf2 expression was enhanced in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice after DSS treatment, whereas it was significantly reduced in WT. Before DSS treatment, these gene expressions were similar between WT and Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice.
  • chemokines such as Cxcl2, Cxcl5, Cxcl9, Cxcl11, Cxcl15, Cxcr2, Ccl1, Ccr3 and their receptors was decreased in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice compared to WT mice. It was also found that the expression of transcription factors such as Stat5a and Stat5b is enhanced in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice.
  • RNA-seq data revealed that pathways related to inflammation and immune responses, such as NF- ⁇ B, TNF, and IL-17 signaling pathways, were reduced in the large intestine of Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice (FIG. 3B).
  • cLP of Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice had an increased proportion of GM-CSF + cells in ROR ⁇ t + ILC3 cells (FIG. 4E).
  • ILC3-derived GM-CSF production was dependent on the ability of macrophages to sense microbial signals and produce IL-1 ⁇ [45].
  • DCIR is a negative regulator of innate immune responses mediated by TLR8 and TLR9. In macrophages, DCIR activation suppresses TLR9-mediated IL-1 ⁇ production through phosphorylation of Erk1/2, JNK1/2, and p38 [46-47].
  • GM-CSF suppresses the development of DSS-induced colitis.
  • Recombinant mouse GM-CSF was administered to WT mice during administration of DSS, and the onset of colitis was examined.
  • administration of GM-CSF enhanced the expression of Stat5 in the large intestine, decreased the expression of Il17a, Cxcl2, Il6, and Il1b, and effectively suppressed the onset of DSS-induced colitis (FIGS. 5A-C).
  • expression of tight junction components such as Occludin, Claudin, and Zo1 increased after GM-CSF administration (Fig. 5C).
  • GM-CSF treatment enhanced the expression of Occludin, Claudin, and Zo1 in colon cells from Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice more efficiently than in cells from WT mice (FIG. 5D).
  • administration of anti-GM-CSF neutralizing antibody exacerbated symptoms of DSS-induced colitis in both WT and Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice (FIGS. 5E-G).
  • Il17a, Il6, and Il1b expression was increased and Stat5 expression was decreased, but Cxcl2 expression was unaffected compared to isotype control Ig (Fig. 5H).
  • administration of anti-GM-CSF antibody decreased the expression of Occludin, Claudin, and Zo1 (FIG. 5I).
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice were first cohabited with WT mice 4 weeks after weaning and tumors were induced under cohabitation conditions. Similar to the separately housed groups, Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice lost less weight and had significantly higher survival rates than WT mice (FIGS. 6E and 6F). In addition, Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice showed suppressed tumor development compared to WT mice even under cohabitation conditions, suggesting that suppression of tumor development in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice does not involve indigenous microorganisms (FIGS. 6G, 6H).
  • Anti-NA2 antibodies can suppress the development of colitis.
  • NA2 double-stranded asialo-N-glycan
  • the anti-NA2 antibody-administered group suppressed the onset of DSS-induced colitis compared to the isotype Ig-administered group.
  • the anti-NA2 antibody-treated group had less weight loss (Fig. 8A), less severe disease (Fig.
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice are resistant to DSS-induced colitis and AOM-DSS-induced tumor development contrasts sharply with the observation that the development of autoimmune diseases such as CIA and EAE is exacerbated in this mutant mouse [13, 15].
  • the accelerated development of autoimmune disease in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice is due to hyperproliferation and accelerated maturation of DCs in this mouse strain, resulting in hyperproliferation of antigen-presenting capacity [13].
  • suppression of colitis development and colon tumors in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice suggests that antigen presentation-independent innate immune responses are responsible for these phenotypes, rather than T cell-mediated autoimmunity that is dependent on DC antigen presentation. Supporting this notion, induction of DSS-induced colitis did not alter Th1, Th2, and Treg cell numbers in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice.
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice showed increased expression of Csf2 after DSS treatment compared to WT mice.
  • ILC3 cells are the major GM-CSF producing cells after DSS treatment [44,45]. Also, the proportion of GM-CSF + cells in ILC3 cells is increased in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice over WT mice after DSS treatment.
  • the production of GM-CSF by ILC3 was dependent on the production of IL-1 ⁇ by macrophages in sensing TLR-mediated microbial signals, and GM-CSF ⁇ / ⁇ altered effector function of mononuclear phagocytes, decreased Treg cell numbers and impaired oral tolerance [45].
  • Stat5-deficient mice are predisposed to experimental colitis [20, 49]. Consistent with the increased expression of GM-CSF in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice, Stat5 phosphorylation was increased in the large intestine of Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice. Furthermore, rmGM-CSF was shown to suppress the development of colitis and anti-GM-CSF to exacerbate colitis. This is consistent with previous observations that GM-CSF deficiency exacerbates the development of colitis and administration of GM-CSF ameliorates colitis in mice [19-21] and humans [22, 23].
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice were found to have increased expression of the junctional complex proteins Occludin, Zo1 and Claudin.
  • Stat5 signaling in enterocytes protects against tight junction barrier dysfunction and promotes wound healing of the intestinal mucosa [48].
  • Expression of these genes was enhanced by mrGM-CSF treatment and decreased by anti-GM-CSF treatment, suggesting that the GM-CSF/Stat5 signaling pathway induces these tight junction proteins. Since these proteins are important structural components of tight junctions, GM-CSF is thought to play an important role in strengthening the intestinal epithelial barrier function, in addition to promoting epithelial cell growth and survival [23].
  • IL-17A is an inflammatory cytokine and plays an important role in the development of autoimmune diseases such as EAE and CIA [26,27]. IL-17A induces inflammation by recruiting neutrophils by inducing the chemokine CXCL2 [28,29].
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice have decreased expression of Cxcl2, which was confirmed to be coordinated with decreased expression of Il17a.
  • Il17a expression is increased in IBD [30]
  • CXCL2 expression correlates with clinical activity in human UC [31]
  • excessive recruitment and accumulation of activated neutrophils is observed in association with intestinal mucosal injury in IBD patients [32].
  • Blocking its receptor, CXCR2 can also suppress DSS colitis in mice [33-35].
  • Il17a ⁇ / ⁇ mice also have exacerbated colitis development, in contrast to Il17f ⁇ / ⁇ mice, which are resistant to induced colitis [37-39].
  • IL-17A plays a rather protective role in the development of colitis. Consistent with this idea, IL-17A has been reported to play an important role in maintaining the barrier integrity of the intestinal epithelium by regulating the intracellular localization of the tight junction protein Occludin in colonic epithelial cells [40]. Therefore, decreased expression of IL-17A in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice appears not to be the primary reason, if any, for the suppression of colitis in these mice.
  • Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice As a result, in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice, the development of colon tumors induced by AOM-DSS was found to be suppressed in the same way as the development of colitis induced by DSS. Expression of Csf2 was greatly increased in both polyp and non-polyp regions in mutant mice compared to WT mice. Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice had reduced expression of Il17a, Il1b, Tnf, and Cxcl2, similar to DSS-induced colitis mice. Since inflammation promotes tumor development, enhanced inflammation in the gut of Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice may promote tumor development. In this regard, IL-17A is known to promote tumorigenesis by promoting angiogenesis [41].
  • IL-1 also promotes tumorigenesis [42].
  • Loss of CXCR2 dramatically suppresses tumorigenesis associated with chronic colonic inflammation and colitis by inhibiting MDSC infiltration into the colonic mucosa and tumors [34, 43]. Therefore, the suppression of AOM-DSS-induced tumor development in Clec4a2 ⁇ / ⁇ mice may be due to the production of inflammatory cytokines and decreased MDSC infiltration.
  • Anti-DCIR antibodies inhibit the binding of NA2 to DCIR and have potential applications in the treatment of inflammatory bowel disease and intestinal tumors. Accordingly, an anti-DCIR antibody was prepared and its binding property to DCIR and ability to inhibit NA2-DCIR binding were evaluated.
  • Anti-DCIR Antibody An anti-DCIR antibody was established by the following procedure. DCIR-expressing cell lines were mixed in immune adjuvant (Titer Max), DCIR-deficient mice were immunized twice, and mice were euthanized. Spleen cells were collected and fused with myeloma cells to prepare hybridoma cells, and a monoclonal library was prepared by limiting dilution. Subsequently, a DCIR-specific antibody was identified from DCIR-expressing cells and DCIR protein-binding activity. The established monoclonal antibody-producing hybridomas were conditioned in a serum-free medium, and finally the antibody was purified from the cell culture medium using Protein-L associated beads.
  • RNA was purified, cDNA was prepared, and DNA sequence analysis of FR1 to FR4 was performed.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of the anti-DCIR antagonist antibody produced are shown in FIGS. 14A and 14B.
  • the graph shows the mean and standard deviation of the number of osteoclasts in 4 replicate wells and tested by student's t-test. *; p ⁇ 0.05, iso VS anti-DCIR antibody. Data from one run experiment are shown (Fig. 15A, B).
  • the anti-DCIR antibody promoted osteoclast differentiation.
  • it promoted osteoclast differentiation, indicating that this antibody was an antagonistic rather than an agonistic antibody.
  • Dectin-1 is required for host defense against Pneumocystis carinii but not against Candida albicans. Nat Immunol. 8, 39-46(2007). 6. Ce Tang et al. Inhibition of Dectin-1 Signaling Ameliorates Colitis by Inducing Lactobacillus-Mediated Regulatory T Cell Expansion in the Intestine. Cell Host & Microbe 18, 183-197 (2015). 7. Saba K et al. A C ⁇ type lectin MGL1/CD301a plays an anti ⁇ inflammatory role in murine experimental colitis. Am J Pathol. 174, 144-152 (2009). 8. Huang, X. et al.
  • DCIR Dendritic Cell Immunoreceptor
  • DCIR is endocytosed into human dendritic cells and inhibits TLR8-mediated cytokine production.

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Abstract

炎症性腸疾患及び腸管腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を治療又は予防するための、樹状細胞免疫受容体－２本鎖アシアロＮ型糖鎖間の結合阻害剤、又は樹状細胞免疫受容体阻害剤と、薬学的に許容される担体と、を含有する医薬組成物。

Description

炎症性腸疾患及び腸管腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を治療又は予防するための医薬組成物
　本開示は、炎症性腸疾患及び腸管腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を治療又は予防するための医薬組成物に関する。
　クローン病（ＣＤ）や潰瘍性大腸炎（ＵＣ）等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、腸管の慢性炎症性疾患であり、最終的には大腸腫瘍の発生原因となる。腸内に発現するＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）やＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）等の自然免疫受容体は、病原体に対する宿主の防御だけでなく、常在微生物や食品成分を認識して活性酸素種（ＲＯＳ）、抗菌タンパク質（ＡＭＰ）、サイトカイン、ケモカイン等を誘導し、ＩＢＤの発症にも重要な役割を果たしていることが知られている。このように、腸の恒常性を保つためには、常在微生物叢と粘膜免疫系の絶妙なバランスが必要である。
　このような背景から、発明者らは以前、β－グルカンを認識するＣＬＲであるＤｅｃｔｉｎ－１が、食品中のβ－グルカンを認識することで腸内の抗菌タンパク質Ｓ１００Ａ８を誘導し、Ｔｒｅｇ誘導菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｕｒｉｎｕｓ（Ｌ．ｍｕｒｉｎｕｓ）の増殖を抑制することを明らかにした。したがって、Ｄｅｃｔｉｎ－１をブロックすることで、腸内のＬ．ｍｕｒｉｎｕｓの増殖を促進し、Ｔｒｅｇ細胞を増加させることで、大腸炎の発症を抑制することができる。また、大腸扁平上皮（ｃＬＰ）マクロファージに発現する別のＣＬＲであるＭＧＬ１は、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓやＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種と結合してＩＬ－１０を誘導することで、化学物質による大腸炎を改善する。
　樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ；遺伝子名Ｃｌｅｃ４ａ２）は、もう１つのＣＬＲファミリーのメンバーであり、樹状細胞（ＤＣ）、破骨細胞等の骨髄系由来の自然免疫細胞に主に発現している。ＤＣＩＲは、ヘミ免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ｈｅｍｉ－ＩＴＡＭ）を持つＤｅｃｔｉｎ－１とは異なり、細胞内領域に免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を持ち、プロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ－１をリクルートすることで複数のシグナル伝達経路を負に制御している。
　以前、発明者らは、高齢のＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスが自然に自己免疫性の唾液腺炎や付着部炎を発症することを報告した（非特許文献１～３参照）。
Fujikado N et al. Dcir deficiency causes development of autoimmune diseases in mice due to excess expansion of dendritic cells. Nat. Med. 14, 176-180 (2008). Maruhashi T. et al. DCIR Maintains Bone Homeostasis by Regulating IFN-g Production in T Cells. J. Immunol. 194, 5681-5691 (2015). Kaifu, T. et al., DCIR and its ligand asialo-biantennary N-glycan regulate DC function and osteoclastogenesis. J. Exp. Med., 218 (12), e20210435 (2021).
　Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスは、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）や実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）等の自己免疫疾患に感受性が高い。Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、ＤＣ集団が拡大し、ＤＣの抗原提示能力が亢進しており、この抗原提示能力の亢進が、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスの自己免疫性や抗原刺激に対する過剰反応の原因となっていることが示唆されている。また、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）による骨髄細胞（ＢＭＣ）のＤＣへの分化がＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスのＢＭＣで促進されており、細胞内シグナル伝達分子であるシグナル伝達兼転写活性化因子５（Ｓｔａｔ５）の過剰なリン酸化が見られた。ＤＣＩＲはＩＴＩＭに脱リン酸化酵素であるＳＨＰ－１をリクルートし下流のＳｔａｔ５のリン酸化を抑制することで、ＧＭ－ＣＳＦ下流のシグナルを制御していると考えられる。それだけではなく、ＤＣＩＲはＴＬＲ４、７、８、９などのシグナルを抑制することにより、マクロファージなどのミエロイド細胞からのＩＬ－１βやＩＬ－２３などの炎症性サイトカインの産生も抑制する。その結果、ＤＣＩＲ欠損マウスでは腸内細菌の持つＬＰＳやＤＮＡなどの成分により強くＩＬ－１βやＩＬ－２３の発現が誘導されるため、これらのサイトカインによってＧＭ－ＣＳＦの発現が非常に亢進することを見出した。このように、ＤＣＩＲは腸の炎症や抗腫瘍免疫にも関与していると考えられる。一方、腸の炎症や腫瘍の発生にＤＣＩＲがどのように関与しているかは、まだ解明されていない。
　上記背景のもと、腸の炎症や腫瘍におけるＤＣＩＲの役割を明らかにし、かかる疾患の治療又は予防につなげることが有用である。本開示は炎症性腸疾患及び腸管腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を治療又は予防するための新規の医薬組成物を提供することに関する。
　上記課題を解決するための手段は、以下の態様を含む。
＜１＞　炎症性腸疾患及び腸管腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を治療又は予防するための、樹状細胞免疫受容体－２本鎖アシアロＮ型糖鎖間の結合阻害剤、又は樹状細胞免疫受容体阻害剤と、薬学的に許容される担体と、を含有する医薬組成物。＜２＞　前記樹状細胞免疫受容体－２本鎖アシアロＮ型糖鎖間の結合阻害剤、又は前記樹状細胞免疫受容体阻害剤が、抗体である、＜１＞に記載の医薬組成物。
＜３＞　前記樹状細胞免疫受容体－２本鎖アシアロＮ型糖鎖間の結合阻害剤が抗２本鎖アシアロＮ型糖鎖抗体である、＜１＞又は＜２＞に記載の医薬組成物。
＜４＞　前記樹状細胞免疫受容体－２本鎖アシアロＮ型糖鎖間の結合阻害剤、又は前記樹状細胞免疫受容体阻害剤が、抗樹状細胞免疫受容体抗体である、＜１＞又は＜２＞に記載の医薬組成物。
＜５＞　前記抗体が、マウス抗体、キメラ型抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である、＜２＞に記載の医薬組成物。
＜６＞　前記抗体が、ヒト化抗体である、＜２＞に記載の医薬組成物。
＜７＞　前記抗体が、全長抗体、又は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びダイアボディーからなる群より選択される低分子化抗体である、＜２＞に記載の医薬組成物。
＜８＞　前記腸管腫瘍が、大腸がん、直腸がん、及び小腸がんからなる群より選択される少なくとも１つを含む、＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載の医薬組成物。
＜９＞　前記炎症性腸疾患が、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択される少なくとも１つを含む、＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の医薬組成物。
　本開示によれば、炎症性腸疾患及び腸管腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を治療又は予防するための新規の医薬組成物が提供される。
図１Ａ－１～図１Ｉは、Ｃｌｅｃ４ａ遺伝子の発現が炎症性腸炎の局所で亢進し、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスは、腸内常在微生物群とは無関係に、ＤＳＳ誘発大腸炎に対して抵抗性を示すことを表す図である。図１Ｂ～Ｄのデータは４回の独立した実験の代表であり、図１Ｅ～Ｇのデータは２回の独立した実験の代表である。図１Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆのデータは平均値±ＳＤで示した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。（図１Ａ－１）野生型(ＷＴ)マウスに４％デキストラン硫酸ナトリウム(ＤＳＳ)を含む飲料水を７日間与えた後、さらに５日間通常の飲料水を与えた。１２日目に大腸からトータルＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲによりＣｌｅｃ４ａ２の発現強度を測定した（ｎ＝５／群）。 ＮＣＢＩのＧＥＯデータベースにあるヒト大腸炎の遺伝子発現のデータ（ＧＳＥ１０６１６）で、健常人（ＨＣ、ｎ＝１１）と比較した、クローン病（大腸型（Ｃ－ＣＤ）；ｎ＝１５、直腸型（ＩＣ－ＣＤ）；ｎ＝１８）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ、ｎ＝１０）の患部でのヒトＤＣＩＲ遺伝子の発現を示した。 （図１Ｂ～図１Ｄ）ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスを別々のケージで飼育し、４％ＤＳＳを７日間投与した後、さらに５日間通常の水を投与した（ｎ＝８／群）。（図１Ｂ）毎日体重を測定し、２日に１回、重症度スコアを評価した。 ＤＳＳ投与開始後１２日目にマウスを安楽死させ、大腸の肉眼的病理を確認し、大腸の長さを測定した。 ＤＳＳ投与開始後１２日目に安楽死させたマウスの大腸組織を摘出し、遠位部の組織学的解析を行なった（Ｈ＆Ｅ染色、４０倍）。 （図１Ｅ～Ｉ）離乳後、ＷＴとＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスをまず４週間同居させた後、同じケージで４％ＤＳＳを７日間投与し、その後通常の水をさらに５日間投与した（ｎ＝５／群）。（図１Ｅ）毎日体重を測定し、２日に１回、重症度スコアを評価した。 ＤＳＳ投与開始後１２日目にマウスを安楽死させ、大腸の肉眼的病理を確認し、大腸の長さを測定した。 ＤＳＳ投与開始後１２日目にマウスを安楽死させ、大腸炎位部の組織学的解析を行なった（Ｈ＆Ｅ染色、４０倍）。 同居前のマウスの糞便から核酸を抽出し、１６ＳｒＲＮＡ配列のリアルタイムＰＣＲにより腸内細菌叢の代表菌種の構成を測定した（ｎ＝５／群）。 ４週間の同居後、マウスの糞便から核酸を抽出し、１６ＳｒＲＮＡ配列のリアルタイムＰＣＲにより腸内細菌叢の代表菌種の構成を測定した（ｎ＝５／群）。
図２Ａ～Ｆは、ＤＳＳ誘発大腸炎誘導後のＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸粘膜固有層（ｃＬＰ)では、単球と好中球の浸潤は減少するが、Ｔｒｅｇ細胞の浸潤は減少しないことを示す図である。図２Ａ～Ｄのデータは３回の独立した実験の代表であり、図２Ｅ、Ｆのデータは２回の独立した実験の代表である。データは平均値±ＳＤで示した。＊＊Ｐ＜０．０１。（図２Ａ）図１のように、ＷＴとＣｌｅｃ４ａ２－／マウスを別のケージで飼育し、ＤＳＳ無処理（ｎ＝５／群）で１２日目に安楽死させ、ｃＬＰのＣＤ４５＋細胞中のＬｙ６Ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋単球の割合をフローサイトメトリーで測定した。 図１のように、ＷＴとＣｌｅｃ４ａ２－／－を別々に飼育したマウスを、ＤＳＳ無処理（ｎ＝５／群）で１２日目に安楽死させ、ｃＬＰのＣＤ４５＋細胞中のＬｙ６Ｇ＋ＣＤ１１ｂ＋好中球の割合をフローサイトメトリーで測定した。 図１のように、ＷＴとＣｌｅｃ４ａ２－／－を別々に飼育したマウスを、ＤＳＳ処理（＝４／群）後の１２日目に安楽死させ、ｃＬＰのＣＤ４５＋細胞中のＬｙ６Ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋単球の割合をフローサイトメトリーで測定した。 図１のように、ＷＴとＣｌｅｃ４ａ２－／－を別々に飼育したマウスを、ＤＳＳ処理（＝４／群）後の１２日目に安楽死させ、ｃＬＰのＣＤ４５＋細胞中のＬｙ６Ｇ＋ＣＤ１１ｂ＋好中球の割合をフローサイトメトリーで測定した。 図１のように、ＷＴとＣｌｅｃ４ａ２－／－を別々に飼育したマウスを、ＤＳＳ処理（ｎ＝４／群）後１２日目に安楽死させ、ｃＬＰのＣＤ４５＋細胞中のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、並びにＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した。 ＤＳＳ投与開始（ｎ＝４／群）後１２日目にこれらのマウスから大腸を摘出し、Ｆｏｘｐ３、Ｔｇｆｂ、及びＴｂｘ２１遺伝子の発現レベルをリアルタイムＰＣＲで測定した。
図３Ａ～Ｌは、ＤＳＳ誘発大腸炎誘導後のＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、Ｉｌ１７ａ、Ｃｘｃｌ２等の炎症性サイトカイン及びケモカイン遺伝子の発現が低下することを示す図である。図３Ｃ～Ｈは３回の独立した実験の代表であり、図３Ｋ、Ｌは２回の独立した実験の代表である。図３Ｃ～Ｈ、Ｌのデータは平均値±ＳＤで示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。（図３Ａ）未処理又はＤＳＳ処理したＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸遺伝子発現をＲＮＡ－ｓｅｑで解析し、その発現レベルをヒートマップで示した。 図３Ａにおいて、ＤＳＳ処理後に発現が変化した転写産物におけるパスウェイ解析の結果を示した。各群でｎ＝５のマウスサンプルをプールして解析を行なった。（図３Ｃ～Ｊ）ＤＳＳ投与開始後１２日目に、別々に飼育したＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸からトータルＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲによって各遺伝子の発現を測定した。 ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスにおけるＤＳＳ処理後のＴｎｆａ遺伝子の発現量を示す（ｎ＝４）。 ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスにおけるＤＳＳ処理後のＩｌ１ｂの発現量を示す（ｎ＝４）。 ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスにおけるＤＳＳ処理後のＩｌ６の発現量を示す（ｎ＝４）。 ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスにおけるＤＳＳ処理後のＩｌ１７ａの発現量を示す（ｎ＝８）。 ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスにおけるＤＳＳ処理後のＩｌ１７ｆの発現量を示す（ｎ＝４）。 ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスにおけるＤＳＳ処理後のＣｘｃｌ２の発現量を示す（ｎ＝８）。 大腸におけるＣｘｃｌ２の発現量を、未処理のＷＴマウスとＣｌｅｃ４ａ２－／－マウス（ｎ＝５）で比較した。 大腸におけるＣｘｃｌ２の発現量を、未処理又はＤＳＳ処理のＷＴマウス（ｎ＝５）で比較した。 ＤＳＳ投与後１２日目にＷＴマウスとＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸からｃＬＰ細胞を分離し、ＰＭＡ＋イオノマイシンで刺激し、ＩＬ－１７及びＩＦＮ－γ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の割合をフローサイトメトリーで解析した（ｎ＝５／群）。 ＤＳＳ投与後１２日目にＷＴマウスとＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸からｃＬＰ細胞を分離し、ＰＭＡ＋イオノマイシンで刺激し、ＩＬ－１７及びＩＦＮ－γ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はγδＴ細胞の割合をフローサイトメトリーで解析した（ｎ＝５／群）。
図４Ａ～Ｊは、ＤＳＳ処理後のＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスではＧＭ－ＣＳＦ－Ｓｔａｔ５軸が活性化されることを示す図である。（図４Ａ）ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスをＤＳＳ処理した後、ＧＭ－ＣＳＦをコードするＣｓｆ２遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲで調べた。 ＷＴマウスをＤＳＳ未処理又は処理後、Ｃｓｆ２遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲで調べた。 ＤＳＳ未処理のＷＴ又はＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスにおいて、Ｃｓｆ２ｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲで調べた。 ＤＳＳ投与後１２日目に、ｃＬＰ　ＣＤ４５＋ＣＤ９０．２＋ＣＤ３－ＣＤ１９－ＣＤ１１ｂ－Ｇｒ１＋細胞におけるＧＡＴＡ３＋ＩＬＣ２細胞及びＲＯＲγｔ＋ＩＬＣ３細胞の割合をフローサイトメトリーにより解析した（ｎ＝５／群）。 ＤＳＳ投与後１２日目に、ｃＬＰ　ＣＤ４５＋ＣＤ９０．２＋ＣＤ３－ＣＤ１９－ＣＤ１１ｂ－Ｇｒ１＋細胞のＲＯＲγｔ＋ＩＬＣ３細胞におけるＧＭ－ＣＳＦ＋の割合をフローサイトメトリーにより解析した（ｎ＝５／群）。 ＤＳＳ未処理のマウスの大腸、又はＤＳＳ処理後７日目、１２日目のマウスの大腸からＭＡＣＳによりＣＤ１１ｂ＋細胞を単離した。５×１０５個の細胞をＴＬＲ８アゴニスト（Ｒ８４８、１００ｎｇ／ｍｌ）及びＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧ－ＯＤＮ、１００ｎｇ／ｍｌ）で４時間刺激し、Ｉｌ１ｂの発現量をリアルタイムＰＣＲで調べた（ｎ＝３／群）。 ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸から全タンパク質を抽出し、リン酸化Ｓｔａｔ５ａ（ｐＳｔａｔ５ａ）（９０ｋＤａ）及び全Ｓｔａｔ５ａの発現量をウェスタンブロット解析により測定した（ｎ＝３／群）。 図４ＧにおけるｐＳｔａｔ５ａ／Ｓｔａｔ５ａの比を示す。 ＤＳＳ処理後のｃＬＰのＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＭ２マクロファージ（ＣＤ２０６＋ＣＤ１１ｂ＋）及びＭ１マクロファージ（Ｎｏｓ２＋ＣＤ１１ｂ＋）の割合をフローサイトメトリーにより解析した（ＷＴ：ｎ＝３、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－：ｎ＝３）。 ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸の細胞（１×１０６個）をｒｍＧＭ－ＣＳＦ（０、１、又は１０ｎｇ／ｍｌ）で１時間処理した後、タンパク質を抽出し、ウェスタンブロット分析によりｐＳｔａｔ５ａ及び総Ｓｔａｔ５ａの発現量を測定した。
図５Ａ～Ｉは、ＧＭ－ＣＳＦはＤＳＳ誘発大腸炎の発症を抑制することを示す図である。データは平均値±ＳＤで示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（図５Ａ～Ｃ）ＷＴマウスに４％ＤＳＳを７日間投与し、その後５日間通常の水を投与した。ＤＳＳ投与中の６日目まで、ＰＢＳ又はｒｍＧＭ－ＣＳＦ（１ｍｇ／マウス）を毎日腹腔内投与した。（図５Ａ）体重は毎日測定した。 ＤＳＳ投与開始後１２日目にマウスを安楽死させ、大腸の肉眼的病理を確認し、大腸の長さを測定した（ｎ＝５／群）。 ＤＳＳ投与開始後１２日目にＰＢＳ又はｒｍＧＭ－ＣＳＦ投与マウスの大腸からトータルＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲによりＣｘｃｌ２、Ｔｎｆ、Ｉｌ１７ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ６、Ｓｔａｔ５ａ、Ｓｔａｔ５ｂ（ｎ＝５）、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ、Ｚｏ１、及びＣｌａｕｄｉｎ（ｎ＝４）の発現量を測定した。 ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸の細胞（５×１０５個）をｒｍＧＭ－ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で１２時間処理し、又は未処理で、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ、Ｚｏ１、及びＣｌａｕｄｉｎの発現量をリアルタイムＰＣＲで測定した（ｎ＝４／群）。 （図５Ｅ～Ｈ）ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスに４％ＤＳＳを７日間投与した後、通常の水を５日間投与した。アイソタイプ抗体又は抗ＧＭ－ＣＳＦ中和抗体（１００μｇ）（Ｂｉｏ　Ｘ　Ｃｅｌｌ社、米国、クローン：ＭＰ１－２２Ｅ９）をＤＳＳ投与の－１日目、１日目、３日目、５日目に腹腔内投与した。ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの体重及び生存率を毎日測定した（ｎ＝５／群）。図５Ｅは体重を示す。 生存率を示す。 ＤＳＳ投与開始後１２日目にマウスを安楽死させ、大腸の肉眼的病理を確認し、大腸の長さを調べた。 ＤＳＳ投与開始後１２日目に、アイソタイプＩｇＧ又は抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体を投与したＷＴマウスの大腸からトータルＲＮＡを抽出し、Ｉｌ１７ａ、Ｉｌ６、Ｔｎｆ、Ｉｌ１ｂ、Ｉｆｎｂ、Ｓｔａｔ５、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１０、及びＣｘｃｌ２の発現量（ｎ＝４／群）をリアルタイムＰＣＲで測定した。 ＤＳＳ投与開始後１２日目に、アイソタイプＩｇＧ又は抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体を投与したＷＴマウスの大腸からトータルＲＮＡを抽出し、Ｚｏｌ１、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ、及びＣｌａｕｄｉｎの発現量（ｎ＝４／群）をリアルタイムＰＣＲで測定した。
図６Ａは、ＡＯＭ－ＤＳＳマウスモデル実施による大腸腫瘍の発生は、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、常在菌に依存しない方法で抑制されることを示す図である。図６Ａ～Ｈは独立的に実施した４回の実験の代表である。図６Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈのデータは平均値±ＳＤで示した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。（図６Ａ～Ｈ）ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスを別々に飼育し、ＡＯＭ－ＤＳＳマウスモデルを実施した。（図６Ａ）体重は３日ごとに測定した。測定した体重を示す（ＷＴ：ｎ＝６、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－：ｎ＝８）。 生存率を示す（ＷＴ：ｎ＝６、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－：ｎ＝８）。 腸管の像を示す（ＷＴ：ｎ＝３、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－：ｎ＝５）。 結腸腫瘍の大きさ及び個数を示す（ＷＴ：ｎ＝３、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－：ｎ＝５）。 （図６Ｅ～Ｈ）ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスを４週間同居させた後、ＡＯＭ－ＤＳＳマウスモデルを実施した。（図６Ｅ）３日ごとに体重を測定した。測定された体重を示す（ＷＴ：ｎ＝５、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－：ｎ＝５）。 生存率を示す（ＷＴ：ｎ＝５、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－：ｎ＝５）。 結腸腫瘍の像を示す（ＷＴ：ｎ＝３、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－：ｎ＝５）。 結腸腫瘍の数を示す（ＷＴ：ｎ＝３、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－：ｎ＝５）。
図７Ａ～Ｊはポリープと非ポリープ部位におけるＣｌｅｃ４ａ２及びサイトカインの発現とＭＤＳＣの存在比を示す。データは３回の独立した実験の代表であり、平均値±ＳＤで示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。別々に飼育したＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスにＡＯＭ－ＤＳＳ処理を行い、大腸を摘出し大腸のポリープ部及び非ポリープ部からトータルＲＮＡを抽出した。（図７Ａ）ＷＴマウス（ｎ＝８／群）の大腸のポリープ部及び非ポリープ部におけるＣｌｅｃ４ａ２の発現を上に、パブリックデータベース（ＧＳＥ２０８４２、ｎ＝６５）から得られた大腸癌患者の腫瘍部及び非腫瘍部におけるＣＬＥＣ４Ａの発現を下に示した。 ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸のポリープ（ｐ）と非ポリープ部分（ｎｐ）におけるＩｌ１７ａの発現をリアルタイムＰＣＲで測定した（ｎ＝８／群）。 ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸のポリープ（ｐ）と非ポリープ部分（ｎｐ）におけるＩｌ１７ｆの発現をリアルタイムＰＣＲで測定した（ｎ＝８／群）。 ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸のポリープ（ｐ）と非ポリープ部分（ｎｐ）におけるＣｘｃｌ２の発現をリアルタイムＰＣＲで測定した（ｎ＝８／群）。 ＷＴ又はＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸のポリープと非ポリープ部分におけるＲＮＡ－ｓｅｑで解析した遺伝子発現レベルをヒートマップで示した（ｎ＝５／群、各群で５サンプルを１つにプール）。 ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスにＡＯＭ－ＤＳＳ処理を行い、大腸ポリープ及び非ポリープ部位における単球性（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋）及び顆粒球性（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の存在比を測定し、グラフで示した（ＷＴ：ｎ＝３、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－：ｎ＝５）。 ＡＯＭ－ＤＳＳ処理後のＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの非ポリープ（ｎｐ）及びポリープ（ｐ）部位における単球性（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋）及び顆粒球性（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の存在比をフローサイトメトリーにより測定し、ドットブロットで示した（ＷＴ：ｎ＝３、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－：ｎ＝５）。 ＷＴ又はＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸の非ポリープ（ｎｐ）及びポリープ（ｐ）部位におけるＣｓｆ２遺伝子の発現強度をリアルタイムＰＣＲで測定した（ＷＴ：ｎ＝３、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－：ｎ＝４）。 ＷＴ又はＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸の非ポリープ（ｎｐ）及びポリープ（ｐ）部位におけるＳｔａｔ５ａ及びＳｔａｔ５ｂのｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲで測定した（ＷＴ：ｎ＝３、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－：ｎ＝４）。 ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの非ポリープ（Ｎｏｎ－ｐｏｌｙｐｓ）及びポリープ（Ｐｏｌｙｐｓ）部位からタンパク質を抽出し、ウェスタンブロット分析によりｐＳｔａｔ５ａ及び全Ｓｔａｔ５ａタンパク質（９０ｋＤａ）発現量を測定した。
図８Ａ～Ｆは、抗ＮＡ２抗体の投与により、大腸炎の発症が改善されることを示す図である。データは平均値±ＳＤで示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。（図８Ａ～Ｅ）ＷＴマウスに４％ＤＳＳを７日間投与した後、通常の水を４日間投与した。抗ＮＡ２抗体（ＩｇＭ、２００μｇ／マウス）及びアイソタイプ免疫グロブリン（ＩｇＭ、２００μｇ／マウス）は、ＤＳＳ投与中、３日毎（－１、２、５日目）にＷＴマウスに腹腔内投与した（ｎ＝５／群）。（図８Ａ）体重変化を示す。 疾患の重症度を示す。 ＤＳＳ投与開始後１１日目にマウスを安楽死させ、大腸の肉眼的病理を確認し大腸の長さを測定した。 ＤＳＳ処理開始後１１日目に、抗ＮＡ２抗体とアイソタイプ抗体を投与したマウスの大腸からトータルＲＮＡを調製し、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ１７ａ、Ｉｌ６、Ｃｓｆ２、Ｓｔａｔ５、及びＩｌ１ｂの発現量をリアルタイムＰＣＲで測定した（ｎ＝５／群）。 ＤＳＳ投与開始後１１日目に、ｃＬＰのＣＤ４５＋細胞中のＬｙ６Ｇ＋ＣＤ１１ｂ＋好中球の割合をフローサイトメトリーで測定した（ｎ＝５／群）。 ＷＴマウスにＡＯＭ－ＤＳＳと抗ＮＡ２抗体又はアイソタイプを投与した。サイズ別の大腸腫瘍の数を示した。
抗ＮＡ２抗体がＤＣＩＲ－ＮＡ２間の結合を阻害することを示すデータである。６＿２＿２、６＿３＿３等は異なる抗ＮＡ２モノクローナル抗体クローン名である。ＤＣＩＲ－Ｆｃのみを添加したウェルではＮＡ２－ＯＶＡへの結合が見られるが、抗ＮＡ２抗体を加えたウェルではこの結合が顕著に低下する。このことから、抗ＮＡ２抗体がＤＣＩＲ－ＮＡ２の結合を阻害することがわかる。実施例で大腸炎、及び腸管腫瘍治療に用いられた６３３＿１Ｇ３は６＿３＿３クローンから再度クローニングされたものであり、６３３＿１Ｇ３クローンと６＿３＿３クローンのＶＤＪシーケンスが一致することを確認している。 抗ＮＡ２抗体（６３３＿１Ｇ３）がＮＡ２へ結合することを示すＥＬＩＳＡの結果である。 抗ＮＡ２抗体（６３３＿１Ｇ３）が、Ｎ型糖鎖の中でアシアロ糖鎖発現細胞株に選択的に会合することを示す。野生型ＣＨＯ細胞（非還元末端にシアル酸を持つ糖鎖が多く発現している）、Ｌｅｃ１細胞（末端高マンノース）、Ｌｅｃ８（アガラクト糖鎖）に比べて、Ｌｅｃ２細胞（アシアロ糖鎖）に６３３＿１Ｇ３抗体は高い強度で結合した。
抗ＮＡ２抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列の一例を示す。 マウス及びヒトＤＣＩＲに対する抗ＤＣＩＲ抗体の結合性試験の模式図を示す。アイソタイプ又は抗ＤＣＩＲ抗体をプレートに添加し、４℃で一晩静置することでプレートに結合させる。１０％（ｗ／ｖ）ＦＣＳ含有ＰＢＳでブロッキングし、Ｆｃ、マウスＤＣＩＲ－Ｆｃ、又はヒトＤＣＩＲ－Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）を添加する。室温で１時間静置し、プレートを洗浄した後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）によりプレートに会合したＦｃ又はＤＣＩＲ－Ｆｃを検出する。検出されたＦｃ蛋白質は最初プレートコートした抗体により結合したものであるため、結果的に抗ＤＣＩＲ抗体のマウス及びヒトＤＣＩＲに対する結合活性を評価可能である。 マウス及びヒトＤＣＩＲに対する抗ＤＣＩＲ抗体の結合活性を示す。図１１の方法で、抗ＤＣＩＲ抗体がマウスＤＣＩＲ－Ｆｃ、及びヒトＤＣＩＲ－Ｆｃに結合活性を示した。 抗ＤＣＩＲ抗体の、ＮＡ２発現性細胞（Ｌｅｃ２）とＤＣＩＲの結合阻害活性を示す。Ｌｅｃ２細胞（アシアロ糖鎖）にＤＣＩＲ－Ｆｃ及びアイソタイプ又は抗ＤＣＩＲ抗体を添加しＤＣＩＲ－ＦｃのＬｅｃ２細胞への結合における影響を測定した。アイソタイプ抗体の添加によるＤＣＩＲ－ＦｃのＬｅｃ２細胞への結合は変化が見られなかったが、抗ＤＣＩＲ抗体を添加した場合抗体の濃度依存的にＤＣＩＲ－ＦｃのＬｅｃ２細胞への結合が低下することを認めた。よって抗ＤＣＩＲ抗体はＮＡ２発現性細胞（Ｌｅｃ２）とＤＣＩＲの結合阻害活性を持つことを示した。 抗ＤＣＩＲアンタゴニスト抗体の塩基配列の一例を示す。 抗ＤＣＩＲアンタゴニスト抗体のアミノ酸配列の一例を示す。 野生型又はＤＣＩＲ欠損マウスの骨髄細胞をＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）で２日間、続いてＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）で４日間培養した。アイソタイプ又はリコンビナント抗ＤＣＩＲアンタゴニスト抗体（５Ａ３Ｄ８＿ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）は１μｇ／ｍＬで培養開始及び培養液交換時に添加した。ＴＲＡＰ染色後ＴＲＡＰ陽性、細胞直軽１００～２００μｍ、そして２００μｍ以上の多核細胞を破骨細胞として計数した。図１５Ａは、野生型及びＤＣＩＲ欠損マウスにおける、アイソタイプ又は抗ＤＣＩＲ抗体を添加したときの破骨細胞のＴＲＡＰ染色後の顕微鏡図である。 図１５Ｂは、野生型及びＤＣＩＲ欠損マウスにおける、表示される各細胞直径（μｍ）を有する破骨細胞数を表す。グラフは４つのウェルの破骨細胞数の平均及び標準偏差で示し、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔで検定した。＊；ｐ＜０．０５、ｉｓｏ　ＶＳ　抗ＤＣＩＲ抗体。
　以下、本開示の実施形態を実施するための形態について詳細に説明する。但し、本開示の実施形態は以下の実施形態に限定されるものではない。以下の実施形態において、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合を除き、必須ではない。数値及びその範囲についても同様であり、本開示の実施形態を制限するものではない。
　本開示において「～」を用いて示された数値範囲には、「～」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
　本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
　本開示において各成分は該当する物質を複数種含んでいてもよい。組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合、各成分の含有率又は含有量は、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計の含有率又は含有量を意味する。
　本開示において要素が単数形で表記されている場合であっても、特に明示されているときを除き、技術的な矛盾が生じない限りは複数の存在を排除しない。
　本開示において疾患の「治療」には、疾患又は疾患に伴う症状を消失させること、改善すること等が含まれる。また、疾患の「予防」には、疾患又は疾患に伴う症状の発現を防ぐこと、疾患又は疾患に伴う症状の発現を遅延させること、疾患又は疾患に伴う症状を未然に軽減させること等が含まれる。
＜医薬組成物＞
　本研究で発明者らは炎症性腸疾患及び腸管腫瘍の発症及び進展が樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）の作用により促進されることを見出した。そこで、これらの疾患を治療又は予防するための、樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）－２本鎖アシアロＮ型糖鎖（ＮＡ２）間の結合阻害剤（以下、ＤＣＩＲ－ＮＡ２結合阻害剤ともいう）又はＤＣＩＲ阻害剤と、薬学的に許容される担体と、を含有する医薬組成物を提唱する。
　ＤＣＩＲ（遺伝子記号：Ｃｌｅｃ４ａ２）は、細胞質ドメインにＩＴＩＭを含むミエロイド系Ｃ型レクチン受容体の一種である。ＤＣＩＲは２本鎖アシアロＮ型糖鎖（ＮＡ２）を認識し、樹状細胞の分化及び活性化を抑制することを発明者らの研究グループは以前に報告した（海部ら、Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．、２１８（１２）、e２０２１０４３５、２０２１）。発明者らは、ＤＣＩＲシグナルをブロックすると、ＧＭ－ＣＳＦ－Ｓｔａｔ５シグナル経路が強化されることで、炎症性腸疾患及び腸管腫瘍などの疾患が改善されることを見出した。
　発明者らは、マウスのデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎及びアゾキシメタン（ＡＯＭ）誘発大腸腫瘍の発症におけるＤＣＩＲの役割を調べた。ＤＳＳ誘発大腸炎は、ヒトの潰瘍性大腸炎やクローン病の動物疾患モデルである。ＡＯＭ－ＤＳＳ誘発腫瘍は、大腸がんのモデルであり、Ｋ－ｒａｓ遺伝子、β－Ｃａｔｅｎｉｎ遺伝子等のプロトオンコジーンに変異を誘発することで大腸にポリープを発生させ、ＤＳＳによる炎症によって腫瘍化を促進する。その結果、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスは、野生型（ＷＴ）マウスに比べて、ＤＳＳ誘発大腸炎に抵抗性であることがわかった。さらに、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、大腸がんのモデルであるＡＯＭ－ＤＳＳ誘発性腸管腫瘍の発生が抑制された。Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスの表現型は、ＷＴマウスとの同居条件下でも軽度であったことから、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスの表現型は腸内常在微生物とは無関係であると考えられた。Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸では、ＧＭ－ＣＳＦの発現とその下流のＳｔａｔ５のリン酸化が亢進し、Ｉｌ１７ａとＣｘｃｌ２の発現が抑制され、好中球と骨髄由来サプレッサー細胞の浸潤が抑制された。また、マウスにリコンビナントＧＭ－ＣＳＦを投与すると、Ｉｌ１７ａの発現が効率的に抑制され、ＤＳＳ誘発大腸炎が改善された。一方、抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体を投与すると症状が著しく悪化した。さらに、ＤＣＩＲのリガンドであるＮＡ２に対する抗ＮＡ２抗体は、ＤＣＩＲに対するＮＡ２の作用を阻害することによって、大腸炎や大腸腫瘍の発生を抑制した。これらの観察結果は、ＤＣＩＲの作用は大腸炎や大腸腫瘍等の疾患を増悪化させること、及びこれらのＤＣＩＲによるこれらの疾患の増悪化を治療又は予防するためにＤＣＩＲ－ＮＡ２結合阻害剤が有用であることを示唆している。さらには、ＤＣＩＲを不活性化するＤＣＩＲ阻害剤が、これらの疾患の治療又は予防に有用であることが示唆される。
　本発明者らは、ＤＣＩＲ－ＮＡ２軸が、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９等の自然免疫受容体により誘導される免疫応答を腸内で制御する役割を担うことを見出した。生理的条件下では、ＤＣＩＲはＤＣの過剰な分化と活性化を制御し、自己免疫を防いでいる。しかし、腸内では、ＤＣＩＲのシグナルが自然免疫シグナルを制御し、ＧＭ－ＣＳＦの誘導を抑制するため、腸が炎症や腫瘍の発生に対して脆弱になっている。したがって、ＤＣＩＲの活性化を阻害することで、自然免疫機構を介して腸の炎症や腫瘍の発生を抑制することができる。
　ＤＣＩＲ－ＮＡ２結合阻害剤は、ＤＣＩＲとＮＡ２との結合を阻害（結合を低減することを含む）する物質である。ＤＣＩＲ阻害剤は、ＤＣＩＲを不活性化する物質である。一態様において、ＤＣＩＲ－ＮＡ２結合阻害剤又はＤＣＩＲ阻害剤は、抗体であってもよい。一態様において、ＤＣＩＲ－ＮＡ２結合阻害剤は、抗ＮＡ２抗体であってもよい。一態様において、ＤＣＩＲ－ＮＡ２結合阻害剤又はＤＣＩＲ阻害剤は、抗ＤＣＩＲ抗体であってもよい。
　ＤＣＩＲ－ＮＡ２結合阻害剤について、ＤＣＩＲとＮＡ２との結合が阻害されることは、後述の抗ＮＡ２抗体及び抗ＤＣＩＲ抗体の項で詳述される方法に準じた方法により確認できる。
　ＤＣＩＲ阻害剤について、ＤＣＩＲが不活性化されることは、抗ＤＣＩＲ抗体の項で詳述される方法に準じた方法により確認できる。
　以下、本開示の医薬組成物に含まれてもよい抗ＮＡ２抗体及び抗ＤＣＩＲ抗体について詳述する。
－抗ＮＡ２抗体－
　抗ＮＡ抗体はＮＡ２に特異的に結合する抗体である。抗ＮＡ２抗体は、ＤＣＩＲ－２本鎖アシアロＮ型糖鎖間の結合を阻害する抗体であればよい。ＮＡ２は、ＤＣＩＲのリガンドである２本鎖アシアロＮ型糖鎖である。ＮＡ２としては、下記式で表される構造（ただし、下記式（Ａ）の構造の２つの非還元末端にシアル酸が存在せず、ｘ及びｙはそれぞれ独立に３又は４を表す）を基本構造とする糖鎖が挙げられる。
　抗ＮＡ２抗体が特異的に結合するＮＡ２は、上記式で表される構造を基本構造とする糖鎖を有するものであり、上記の基本構造の任意の部位に１つの分岐鎖を有していたり、フコースが付加されていたりしてもよい。ただし、上記構造の２つの非還元末端にはシアル酸は存在しない。このような糖鎖構造の例としては、以下の糖鎖が挙げられる。
　上記式で表されるＮＡ２はいずれもＤＣＩＲのリガンドであり、これらのＮＡ２に結合する抗体はＤＣＩＲとこれらのＮＡ２の結合を阻害すると考えられる。
　抗ＮＡ２抗体は、ＮＡ２に修飾されたタンパク質（ペプチドを含む）又はＮＡに修飾された他の高分子化合物を認識する抗体であってもよい。ＮＡ２に修飾されたタンパク質としては、ＮＡ２に修飾された、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、トランスフェリン等が挙げられる。ＮＡ２に修飾された高分子化合物としては、ＮＡに修飾された、ポリアリルアミン（ＰＡＡ）等が挙げられる。これらのタンパク質又は他の高分子化合物にＮＡ２の糖鎖構造の還元末端が結合したものを用いることができる。
　ＮＡ２は、生体からの採取、遺伝子工学的方法による作製、有機合成化学的方法による作製等により入手することができる。また、ＮＡ２は市販で入手可能な材料から作製することもできる。（例えば、ＰＡＡ修飾誘導体の場合、会社名：ＧｌｙｃｏＴｅｃｈ　Ｃｏ．、商品名：Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ　Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒ（構造：（ＳＡ２－６Ｇ－ＧＮ－Ｍ）２－３，６－Ｍ－ＧＮ－ＧＮβ－ＰＡＡ－ｂｉｏｔｉｎ、ここで、ＳＡ＝Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｇ＝Ｇａｌ、ＧＮ＝ＧｌｃＮＡｃ、Ｍ＝Ｍａｎ、ｓｐ＝－ＮＨＣＯＣＨ２ＮＨ－）をノイラミニダーゼで処理することによりＮＡ２を得ることができる。したがって、ＮＡ２は、（Ｇ－ＧＮ－Ｍ）２－３，６－Ｍ－ＧＮ－ＧＮβ－で表される糖鎖構造を有するものでもよい。
　ＮＡ２は、生体由来であっても、非生体由来であってもよい。ＮＡ２が生体由来である場合、ＮＡ２は生体の糖タンパク質（糖ペプチドを含む）に由来するものであってもよい。糖タンパク質としては、上述した例が挙げられる。ＮＡ２の詳細は、例えば、国際公開第２０１６／００６７００号を参照することができる。
　一態様において、抗ＮＡ２抗体は、下記配列の重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３、重鎖ＦＲ１～４、及び軽鎖ＦＲ１～４からなる群より選択される少なくとも１つを有する。
　一態様において、抗ＮＡ２抗体は、下記配列の重鎖ＣＤＲ１～３をすべて有する。
　一態様において、抗ＮＡ２抗体は、下記配列の軽鎖ＣＤＲ１～３をすべて有する。
　一態様において、抗ＮＡ２抗体は、下記配列の重鎖ＦＲ１～４をすべて有する。
　一態様において、抗ＮＡ２抗体は、下記配列の軽鎖ＦＲ１～４をすべて有する。
　一態様において、抗ＮＡ２抗体は、下記配列の重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３をすべて有する。
　一態様において、抗ＮＡ２抗体は、下記配列の重鎖ＦＲ１～４及び軽鎖ＦＲ１～４をすべて有する。
　一態様において、抗ＮＡ２抗体は、下記配列の重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３、重鎖フレームワーク（ＦＲ）１～４、及び軽鎖ＦＲ１～４をすべて有する。
　以下に一態様における抗ＮＡ２抗体の各領域の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示す。
　重鎖ＦＲ１（配列番号５１）
gaggtgaagcttctcgagtctggaggtggcctggtgcagcctggaggatccctgaaactctcctgtgcagcctca
　重鎖ＣＤＲ１（配列番号５２）
ggattcgattttagtagatactgg
　重鎖ＦＲ２（配列番号５３）
atgagttgggtccggcaggctccagggaaagggctagaatggattggagaa
　重鎖ＣＤＲ２（配列番号５４）
attaatccagatagcagtacgata
　重鎖ＦＲ３（配列番号５５）
aactatacgccatctctaaaggataaattcatcatctccagagacaacgccaaaaatacgctgtacctgcaaatgagcaaagtgagatctgaggacacagccctttattactgt
　重鎖ＣＤＲ３（配列番号５６）
gcaagacctgatgggacgatttattactacggttgctggtacttcgatgtc
　重鎖ＦＲ４（配列番号５７）
tggggcgcagggaccacggtc
　軽鎖ＦＲ１（配列番号５８）
gatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtctgggagatcaagcctccatctcttgcagatctagt
　軽鎖ＣＤＲ１（配列番号５９）
cagagtcttgcacacagtaatggaaacacctat
　軽鎖ＦＲ２（配列番号６０）
ttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctac
　軽鎖ＣＤＲ２
aaaatttcc
　軽鎖ＦＲ３（配列番号６１）
aaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgc
　軽鎖ＣＤＲ３（配列番号６２）
tctcaaagtacacatgttccgtggacg
　軽鎖ＦＲ４（配列番号６３）
ttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
　重鎖ＦＲ１（配列番号６４）
ＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳ
　重鎖ＣＤＲ１（配列番号６５）
ＧＦＤＦＳＲＹＷ
　重鎖ＦＲ２（配列番号６６）
ＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥ
　重鎖ＣＤＲ２（配列番号６７）
ＩＮＰＤＳＳＴＩ
　重鎖ＦＲ３（配列番号６８）
ＮＹＴＰＳＬＫＤＫＦＩＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＫＶＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣ
　重鎖ＣＤＲ３（配列番号６９）
ＡＲＰＤＧＴＩＹＹＹＧＣＷＹＦＤＶ
　重鎖ＦＲ４（配列番号７０）
ＷＧＡＧＴＴＶ
　軽鎖ＦＲ１（配列番号７１）
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳ
　軽鎖ＣＤＲ１（配列番号７２）
ＱＳＬＡＨＳＮＧＮＴＹ　　　
　軽鎖ＦＲ２（配列番号７３）
ＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹ　　　
　軽鎖ＣＤＲ２
ＫＩＳ　　　
　軽鎖ＦＲ３（配列番号７４）
ＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣ　　　
　軽鎖ＣＤＲ３（配列番号７５）
ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ
　軽鎖ＦＲ４（配列番号７６）
ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
　抗ＮＡ２抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のＤＮＡ配列（それぞれ配列番号７７、配列番号７８）及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号７９、配列番号８０）の一例を図１０に示す。
　重鎖可変領域（配列番号７７）
gaggtgaagcttctcgagtctggaggtggcctggtgcagcctggaggatccctgaaactctcctgtgcagcctcaggattcgattttagtagatactggatgagttgggtccggcaggctccagggaaagggctagaatggattggagaaattaatccagatagcagtacgataaactatacgccatctctaaaggataaattcatcatctccagagacaacgccaaaaatacgctgtacctgcaaatgagcaaagtgagatctgaggacacagccctttattactgtgcaagacctgatgggacgatttattactacggttgctggtacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtc
　軽鎖可変領域（配列番号７８）
gatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtctgggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagtcttgcacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaaatttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
　重鎖可変領域（配列番号７９）
ＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＤＦＳＲＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤＫＦＩＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＫＶＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＰＤＧＴＩＹＹＹＧＣＷＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶ
　軽鎖可変領域（配列番号８０）
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＡＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＩＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ　　　
　なお、抗ＮＡ２抗体は図１０の配列を持つ抗体に限定されるものではなく、ＮＡ２に対する結合活性を示し、ＮＡ２とＤＣＩＲの結合を阻害する能力を有するいずれの抗体であってもよい。ＮＡ２に対する結合活性を示し、ＮＡ２とＤＣＩＲの結合を阻害する能力を有する各種抗体は、本開示に記載の方法、及び公知の抗体取得技術に基づき、当業者が作製可能である。なお、ヒトはマウスのＮＡ２と同様の糖鎖を有するＮＡ２を有することが知られており、マウス抗ＮＡ２抗体はヒトでも同様に有効である。
　例えば、抗ＮＡ２抗体は、配列番号７９と８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を有する抗体であってもよい。抗ＮＡ２抗体は、配列番号８０と８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を有する抗体であってもよい。また、抗ＮＡ２抗体は、上記配列の重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３、又はこれらの組み合わせを有し、かつ配列番号７９と８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を有し、かつ配列番号８０と８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を有する抗体であってもよい。抗ＮＡ２抗体は、上記配列の重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３、又はこれらの組み合わせを有し、かつ配列番号７９と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を有し、かつ配列番号８０と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を有する抗体であってもよい。
　本開示において、アミノ酸配列の「同一性」とは、比較する２つのアミノ酸配列を、アミノ酸残基の一致数が最大となるように、必要に応じて一方又は双方に適宜ギャップを挿入してアラインメントしたときの、全アミノ酸残基数における一致アミノ酸残基数の割合をいう。アラインメントは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗ等の周知のアラインメントツールを用いて行うことができる。例えば、アラインメントは、ＢＬＡＳＴのデフォルトパラメータで評価することができる。
　抗ＮＡ２抗体の結合活性は以下の手順で確認できる。オボアルブミン（ＯＶＡ）又はＮＡ２－ＯＶＡ（１０μｇ／ｍｌ）を９６ウェルプレートにコートし、４℃で一晩静置し抗原をプレートコートする。その後プレートを洗浄し、１０％（ｗ／ｖ）ＦＣＳ含有ＰＢＳで常温１時間ブロッキングを行う。つづいてプレートを洗浄し、アイソタイプ抗体、又は抗ＮＡ２抗体を添加し室温で１時間静置する。プレート洗浄後、標識抗体を用いてアイソタイプ抗体を検出する。具体的には、抗ＮＡ２抗体の結合活性は実施例に記載の方法により確認できる。
　抗ＮＡ２抗体がＮＡ２とＤＣＩＲの結合を阻害する能力を有することは、以下の手順で確認できる。
　９６ウェルプレートの底にＮＡ２－ＯＶＡ又はＯＶＡ（１０μｇ／ｍｌ）を添加し、４℃で一晩静置することでプレートに結合させる。１０％（ｗ／ｖ）ＦＣＳ含有ＰＢＳでブロッキングし、Ｆｃ又はＤＣＩＲ－Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）、及び抗ＮＡ２抗体を添加する。室温で１時間静置し、プレートを洗浄した後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）によりプレートに会合したＦｃ又はＤＣＩＲ－Ｆｃを検出する。具体的には、抗ＮＡ２抗体がＮＡ２とＤＣＩＲの結合を阻害する能力を有することは実施例に記載の方法により確認できる（図９Ａ）。
　抗ＮＡ２抗体は、任意の適当な方法により製造することができる。例えば、抗ＮＡ２抗体は、インビボ、培養細胞、インビトロ翻訳反応、組換えＤＮＡ発現系等により製造することができる。または、抗ＮＡ２抗体は、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをヌードマウスに免疫し、腹水から精製することで作製できる。
　抗ＮＡ２抗体のアイソタイプは、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥであってもよいが、ＩｇＭが最も好ましい。
　抗ＮＡ２抗体は、全長抗体であってもよく、ＮＡ２に特異的に結合する抗体断片等の低分子化抗体であってもよい。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディー等が挙げられる。これらの抗体断片を得る方法としては、これらの抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。
　また、抗ＮＡ２抗体は、抗体の修飾物であってもよい。抗体の修飾物としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野において既知の方法を使用できる。
　抗ＮＡ２抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよく、抗原決定基に特異的に結合する能力を保持している抗体等の抗体の誘導体であってもよい。
　ポリクローナル抗体は、ＮＡ２誘導体を免疫したＧａｌＴ欠損マウスから抗体を含有する抗血清を単離し、ＮＡ２糖鎖ＥＬＩＳＡアッセイ、アシアロ糖鎖発現細胞の染色など、周知の方法を用いて、所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングすることにより得ることができる。
　モノクローナル抗体及びハイブリドーマを製造する手法としては周知の方法から本抗体作製のため考案した方法を採用できる。例えば、１０分子以上のＮＡ２をＢＳＡに結合させたＮＡ２－ＢＳＡ誘導体を免疫原として用いて、Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ糖鎖転移酵素の欠損により体内にアシアロ糖鎖を含まないマウス（ＧａｌＴ１欠損マウス）に、ＮＡ２－ＢＳＡ複合体（ＧＴ－１１１１５７，　糖鎖工学研究所製）を皮下注射することにより免疫することができる。また、野生型動物に免疫してもよい。免疫に際してアジュバント（Ｔｉｔｅｒ　ｍａｘ　ｇｏｌｄ；　ＴｉｔｅｒＭａｘ　ＵＳＡ，　Ｉｎｃ．製）を用いてもよい。そのようなアジュバントとしては当該技術分野において既知のアジュバントを使用できる。
　モノクローナル抗体は、免疫した動物から脾臓細胞を切除し、ミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製することにより得ることができる。ＮＡ２糖鎖をＯＶＡに結合したものを９６穴プレートに結合させたものを用いたＥＬＩＳＡアッセイ、アシアロ糖鎖発現細胞株（Ｌｅｃ２細胞）への結合を染色で検出する等の周知の方法を用いて、目的とするＮＡ２糖鎖を認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、適切な条件下で培養し、分泌された抗体を回収し、イオン交換カラム、アフィニティークロマトグラフィー、ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ会合ビーズ等の周知の方法を用いて精製することができる。また、免疫不全マウスにハイブリドーマを移植し、分泌された抗体を含有する腹水を回収し、同様に精製することも可能である。また、取得したＢＣＲ　ＶＤＪ領域の配列に基づき、培養細胞での抗体産生や、ゼノマウス株を用いたヒト型モノクローナル抗体の製造（Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２３１：１１－２３，１９９９；Ｗｅｌｌｓ，Ｅｅｋ，Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ　２０００　Ａｕｇ；７（８）：Ｒ１８５－６を参照）、免疫を行わないファージディスプレイに基づいたモノクローナル抗体の作製も可能である。
　抗ＮＡ２抗体としては、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、トリ抗体等を用いてもよく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等）を用いてもよい。抗ＮＡ２抗体としては、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体が好ましく、ヒト化抗体がより好ましい。
　キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
　ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、ヒト化抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１－８５６．）。
　ヒト抗体も、既知の方法を用いて製造することができる。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏで所望の抗原又は所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト型抗体を取得することができる。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト型抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかであるので(例えば、図１０参照)、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト型抗体を取得することができる。ＤＮＡ配列に基づき抗体を作製する方法は周知である。
－抗ＤＣＩＲ抗体－
　抗ＤＣＩＲ抗体はＤＣＩＲに特異的に結合する抗体である。ＤＣＩＲは、ＣＬＲファミリーのメンバーの１つであり、細胞外には糖鎖認識ドメイン、細胞内には免疫抑制チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を有する膜タンパク質である。抗ＤＣＩＲ抗体は、ＤＣＩＲとＮＡ２の間の結合を阻害する抗体であってもよく、ＤＣＩＲの作用を減弱させる又は不活性化する阻害抗体であってもよい。一例として、抗ＤＣＩＲアンタゴニスト抗体が好ましい。抗ＤＣＩＲアンタゴニスト抗体は、ＮＡ２と競合する競合的アンタゴニスト抗体であってもよく、非競合的アンタゴニスト抗体であってもよい。
　抗ＤＣＩＲ抗体の結合活性は以下の手順で確認できる。
　ＤＣＩＲ発現細胞株への結合活性を、次のように測定する。ＤＣＩＲ発現細胞株又は空細胞（ＨＥＫ２９３細胞）にアイソタイプ又は抗ＤＣＩＲ抗体（１０μｇ／ｍｌ）を添加し、懸濁し、氷上で３０分静置する。細胞を洗浄し、蛍光物質標識抗マウスＩｇＭ抗体を加え（０．５μｇ／ｍｌ）氷上で３０分静置する。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーにより抗体の細胞への結合を測定する。または、ＤＣＩＲタンパク質への結合活性を、次のように測定する。アイソタイプ抗体、又は抗ＤＣＩＲ抗体（５μｇ／ｍｌ）を９６ウェルプレートにコートし、４℃で一晩静置しプレートコートする。その後プレートを洗浄し、１０％（ｗ／ｖ）ＦＣＳ含有ＰＢＳで常温１時間ブロッキングを行う。つづいてプレートを洗浄し、Ｆｃ又はＤＣＩＲ－Ｆｃタンパク質（５μｇ／ｍｌ）を添加し室温で１時間静置する。プレート洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ抗体を用いて、コートした抗体に結合したＤＣＩＲ－Ｆｃタンパク質を検出する。
　ＤＣＩＲ－ＮＡ２結合阻害剤である抗ＤＣＩＲ抗体がＮＡ２とＤＣＩＲの結合を阻害する能力を有することは、以下の手順で確認できる。
　アシアロ糖鎖（主にＮＡ２）を発現するＬｅｃ２細胞に、ＤＣＩＲ－Ｆｃ及び抗ＤＣＩＲ抗体又はアイソタイプ抗体（１０μｇ／ｍｌ）を添加し、懸濁し、氷上で３０分静置する。細胞を洗浄し、蛍光標識抗ヒトＦｃ抗体を用いて、ＤＣＩＲ－Ｆｃタンパク質のＬｅｃ２細胞への結合を検出する。
　ＤＣＩＲ阻害剤である抗ＤＣＩＲ抗体がＤＣＩＲを不活性化することは、以下の手順で確認できる。野生型マウスの骨髄細胞にＭ－ＣＳＦ、ｓＲＡＮＫＬを添加して１週間ほど培養し、ＴＲＡＰ染色を行いＴＲＡＰ陽性の多核細胞を計数することで破骨細胞の分化度を評価可能である（５０）。この分化誘導系に、抗ＤＣＩＲ抗体を添加し、破骨細胞の分化度を測定し、アイソタイプ抗体を加えた場合と比較することにより、破骨細胞の分化に対する影響を評価する。ＤＣＩＲの作動により破骨細胞の分化が抑制されることが見出されているため、破骨細胞分化が抗ＤＣＩＲ抗体によって促進していた場合は、ＤＣＩＲが不活化され分化抑制が解除されたものと考えられる。ＤＣＩＲ欠損マウスの骨髄細胞を用いた同様の実験を並行して行い、抗ＤＣＩＲ抗体が非特異的に破骨細胞形成を阻害しないことを確認する。
　抗ＤＣＩＲ抗体は、任意の適当な方法により作製することができ、例えば、抗ＤＣＩＲ抗体は、培養細胞により製造することができる。より具体的には、例えば、抗ＤＣＩＲ抗体は、以下の方法により作製することができる。
　以下の手順で抗体を樹立する。ＤＣＩＲ発現性細胞株（ＨＥＫ２９３細胞にＤＣＩＲ発現ベクターを導入し、ＤＣＩＲを細胞表面で発現させたもの）を免疫アジュバント（Ｔｉｔｅｒ　Ｍａｘ）に混合し、ＤＣＩＲ欠損マウスに２回免疫し、ＤＣＩＲに対する抗体価の上昇が認められた時点で、マウスを安楽死させる。脾臓細胞を採取し、定法に従いミエローマ細胞と融合させハイブリドーマ細胞を作製し、限界希釈によるモノクローナルライブラリーを作製する。つづいてＤＣＩＲ発現細胞及びＤＣＩＲタンパク質への結合活性からＤＣＩＲ特異的抗体を同定する。樹立したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、無血清培地に馴化させ、最終的には細胞培養液からＰｒｏｔｅｉｎ－Ｌ会合ビーズにより抗体を精製する。ヒトへの投与を目的として、ヒト化させてもよい。
　抗ＤＣＩＲ抗体における抗体の形態（アイソタイプ、全長抗体又は低分子化抗体、抗体の修飾物、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、抗体の起源、並びにこれらの作製方法）は、抗ＮＡ２抗体に特有の事項を除き、抗ＮＡ２抗体の項において記載した事項が適用できる。
　一態様において、抗ＤＣＩＲ抗体は、下記配列の重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３、重鎖ＦＲ１～４、及び軽鎖ＦＲ１～４からなる群より選択される少なくとも１つを有する。
　一態様において、抗ＤＣＩＲ抗体は、下記配列の重鎖ＣＤＲ１～３をすべて有する。
　一態様において、抗ＤＣＩＲ抗体は、下記配列の軽鎖ＣＤＲ１～３をすべて有する。
　一態様において、抗ＤＣＩＲ抗体は、下記配列の重鎖ＦＲ１～４をすべて有する。
　一態様において、抗ＤＣＩＲ抗体は、下記配列の軽鎖ＦＲ１～４をすべて有する。
　一態様において、抗ＤＣＩＲ抗体は、下記配列の重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３をすべて有する。
　一態様において、抗ＤＣＩＲ抗体は、下記配列の重鎖ＦＲ１～４及び軽鎖ＦＲ１～４をすべて有する。
　一態様において、抗ＤＣＩＲ抗体は、下記配列の重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３、重鎖フレームワーク（ＦＲ）１～４、及び軽鎖ＦＲ１～４をすべて有する。
　以下に一態様における抗ＤＣＩＲ抗体（抗ＤＣＩＲアンタゴニスト抗体（５Ａ３Ｄ８）　ＢＣＲ　ＶＤＪ領域配列）の各領域の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示す。
　重鎖ＦＲ１（配列番号８１）
gaggtccagctgcagcagtctggacctgagctggtaaagcctggggcttcagtgaagatgtcctgcaaggcttct
　重鎖ＣＤＲ１（配列番号８２）
ggatacacattcactagctatgtt
　重鎖ＦＲ２（配列番号８３）
atgcactgggtgaagcagaagcctgggcagggccttgagtggattggatat
　重鎖ＣＤＲ２（配列番号８４）
attaatccttacaatgatggtact
　重鎖ＦＲ３（配列番号８５）
aagtacaatgagaagttcaaaggcaaggccacactgacttcagacaaatcctccagcaca
gcctacatggagctcagcagcctgacctctgaggactatgcggtctattactgt
　重鎖ＣＤＲ３（配列番号８６）
gcaagatcctacaagaggtacgactggtacccaaga
　重鎖ＦＲ４（配列番号８７）
tggggcgcagggaccacggtc
　軽鎖ＦＲ１（配列番号８８）
gacattgtgatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagc
gtcacctgcaaggccagt
　軽鎖ＣＤＲ１（配列番号８９）
cagaatgtgggtactaat
　軽鎖ＦＲ２（配列番号９０）
gtagcctggtatcaacagaaaccagggcaatctcctaaagcactgatttac
　軽鎖ＣＤＲ２（配列番号９１）
tcggcatcc
　軽鎖ＦＲ３（配列番号９２）
taccggtacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcact
ctcaccatcagcaatgtgcagtctgaagacttggcagagtatttctgt
　軽鎖ＣＤＲ３（配列番号９３）
cagcaatataacagctatccgctcacg
　軽鎖ＦＲ４（配列番号９４）
ttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
　重鎖ＦＲ１（配列番号９５）
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳ
　重鎖ＣＤＲ１（配列番号９６）
ＧＹＴＦＴＳＹＶ
　重鎖ＦＲ２（配列番号９７）
ＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹ
　重鎖ＣＤＲ２（配列番号９８）
ＩＮＰＹＮＤＧＴ
　重鎖ＦＲ３（配列番号９９）
ＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＹＡＶＹＹＣ
　重鎖ＣＤＲ３（配列番号１００）
ＡＲＳＹＫＲＹＤＷＹＰＲ
　重鎖ＦＲ４　（配列番号１０１）
ＷＧＡＧＴＴＶ
　軽鎖ＦＲ１（配列番号１０２）
ＤＩＶＭＴＱＳＱＫＦＭＳＴＳＶＧＤＲＶＳＶＴＣＫＡＳ
　軽鎖ＣＤＲ１（配列番号１０３）
ＱＮＶＧＴＮ
　軽鎖ＦＲ２（配列番号１０４）
ＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＡＬＩＹ
　軽鎖ＣＤＲ２（配列番号１０５）
ＳＡＳ
　軽鎖ＦＲ３（配列番号１０６）
ＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＶＱＳＥＤＬＡＥＹＦＣ
　軽鎖ＣＤＲ３（配列番号１０７）
ＱＱＹＮＳＹＰＬＴ
　軽鎖ＦＲ４（配列番号１０８）
ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
　抗ＤＣＩＲアンタゴニスト抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のＤＮＡ配列（それぞれ配列番号１０９、配列番号１１０）及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１１１、配列番号１１２）の一例を図１４Ａ及び図１４Ｂに示す。
　重鎖可変領域（配列番号１０９）
gaggtccagctgcagcagtctggacctgagctggtaaagcctggggcttcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggatacacattcactagctatgttatgcactgggtgaagcagaagcctgggcagggccttgagtggattggatatattaatccttacaatgatggtactaagtacaatgagaagttcaaaggcaaggccacactgacttcagacaaatcctccagcacagcctacatggagctcagcagcctgacctctgaggactatgcggtctattactgtgcaagatcctacaagaggtacgactggtacccaagatggggcgcagggaccacggtc
　軽鎖可変領域（配列番号１１０）
gacattgtgatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccagggcaatctcctaaagcactgatttactcggcatcctaccggtacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcaatgtgcagtctgaagacttggcagagtatttctgtcagcaatataacagctatccgctcacg,ttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
　重鎖可変領域（配列番号１１１）
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳ　ＧＹＴＦＴＳＹＶ　ＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹ　ＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹ　ＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＹＡＶＹＹＣ　ＡＲＳＹＫＲＹＤＷＹＰＲ　ＷＧＡＧＴＴＶ
　軽鎖可変領域（配列番号１１２）
ＤＩＶＭＴＱＳＱＫＦＭＳＴＳＶＧＤＲＶＳＶＴＣＫＡＳ　ＱＮＶＧＴＮ　ＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＡＬＩＹ　ＳＡＳ　ＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＶＱＳＥＤＬＡＥＹＦＣ　ＱＱＹＮＳＹＰＬＴ　ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
　なお、抗ＤＣＩＲ抗体は図１４Ａ及び図１４Ｂの配列を持つ抗体に限定されるものではなく、ＤＣＩＲに対する結合活性を示し、ＤＣＩＲを阻害するか、ＮＡ２とＤＣＩＲの結合を阻害する能力を有するいずれの抗体であってもよい。ＤＣＩＲに対する結合活性を示し、ＤＣＩＲを阻害するか、ＮＡ２とＤＣＩＲの結合を阻害する能力を有する各種抗体は、本開示に記載の方法、及び公知の抗体取得技術に基づき、当業者が作製可能である。
　例えば、抗ＤＣＩＲ抗体は、配列番号１１１と８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を有する抗体であってもよい。抗ＤＣＩＲ抗体は、配列番号１１２と８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を有する抗体であってもよい。また、抗ＤＣＩＲ抗体は、上記配列の重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３、又はこれらの組み合わせを有し、かつ配列番号１１１と８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を有し、かつ配列番号１１２と８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を有する抗体であってもよい。抗ＤＣＩＲ抗体は、上記配列の重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３、又はこれらの組み合わせを有し、かつ配列番号１１１と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域を有し、かつ配列番号１１２と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を有する抗体であってもよい。
　本開示の医薬組成物は、炎症性腸疾患及び腸管腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を治療又は予防するために用いられる。炎症性疾患としては、クローン病、潰瘍性大腸炎等が挙げられる。腸管腫瘍としては、大腸がん、直腸がん、小腸がん等が挙げられる。コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）や実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）等の自己免疫疾患においては、ＤＣＩＲ－ＮＡ２間の結合阻害又はＤＣＩＲの阻害は疾患を増悪化されると考えられるが、本発明で、大腸においては、ＤＣＩＲ－ＮＡ２間の結合阻害又はＤＣＩＲの阻害は炎症性腸疾患及び腸管腫瘍を抑制することを示した。これは他の臓器にはない、自然免疫リンパ球３（ＩＬＣ３）細胞が腸管には豊富に存在するためである。
　本開示の医薬組成物に用いられる、薬学的に許容される担体としては、一般に使用される各種有機あるいは無機担体物質が挙げられ、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を用いることもできる。
　本開示の医薬組成物の形態は特に制限されない。本開示の医薬組成物は、医薬組成物に用いられる各成分の混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化してもよい。
　例えば、本開示の医薬組成物は経口投与用に製剤化されてもよく、より具体的には、錠剤、丸薬、糖衣剤、軟カプセル、硬カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、シロップ、スラリー等の剤形に製剤化してもよい。
　また、本開示の医薬組成物は非経口投与用に製剤化されてもよく、より具体的には、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、座剤等の剤形に製剤化してもよい。
　医薬組成物の投与経路は特に制限されない。投与経路としては、例えば、経口投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、点眼、点耳、経鼻投与、吸入投与、経皮投与、経直腸投与、髄腔内投与、静脈内投与、留置等の外科的処置等が挙げられる。
　医薬組成物の投与量及び投与間隔は、投与経路；投与される対象の症状、体重、体格、年齢、ＤＣＩＲの活性の状態等；併用する成分の種類、量等の条件に応じて適宜設定される。一態様において、本開示の医薬組成物は、炎症性疾患及び腸管腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を有する対象に、ＤＣＩＲ－ＮＡ２結合阻害剤又はＤＣＩＲ阻害剤が治療上又は予防上有効量となる用量及び間隔で投与される。投与間隔は、１日より短くてもよく、１日１回でもよく、１日より長くてもよい。
　本開示の一態様によれば、対象に有効量のＤＣＩＲ－ＮＡ２結合阻害剤又はＤＣＩＲ阻害剤を投与することを含む、炎症性腸疾患又は腸管腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を治療又は予防するための方法が提供される。
　本開示のさらなる一態様によれば、炎症性腸疾患又は腸管腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を治療又は予防するための医薬の製造における、ＤＣＩＲ－ＮＡ２結合阻害剤又はＤＣＩＲ阻害剤の使用が提供される。
　本開示のさらなる一態様によれば、炎症性腸疾患又は腸管腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つの疾患の治療又は予防における使用のためのＤＣＩＲ－ＮＡ２結合阻害剤又はＤＣＩＲ阻害剤が提供される。
　これらの態様における，炎症性腸疾患及び腸管腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つの疾患、ＤＣＩＲ－ＮＡ２結合阻害剤及びＤＣＩＲ阻害剤、並びにこれらの適用範囲は、上述の事項と同じである。
　次に本開示の実施形態を実施例により具体的に説明するが、本開示の実施形態はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
１．緒論
　クローン病（ＣＤ）や潰瘍性大腸炎（ＵＣ）等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、腸管の慢性炎症性疾患であり、最終的には大腸腫瘍の発生原因となる［１、２］。腸内に発現するＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）やＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）等の自然免疫受容体は、病原体に対する宿主の防御だけでなく、常在微生物や食品成分を認識して活性酸素種（ＲＯＳ）、抗菌タンパク質（ＡＭＰ）、サイトカイン、ケモカイン等を誘導し、ＩＢＤの発症にも重要な役割を果たしていることが示唆されている［３、４］。このように、腸の恒常性を保つためには、常在微生物叢と粘膜免疫系の絶妙なバランスが必要である［４］。
　このような背景から、発明者らは以前、β－グルカンを認識するＣＬＲであるＤｅｃｔｉｎ－１が、食品中のβ－グルカンを認識することで腸内の抗菌タンパク質Ｓ１００Ａ８を誘導し、Ｔｒｅｇ誘導菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｕｒｉｎｕｓ（Ｌ．ｍｕｒｉｎｕｓ）の増殖を抑制することを明らかにした［５］。したがって、Ｄｅｃｔｉｎ－１をブロックすることで、腸内のＬ．ｍｕｒｉｎｕｓの増殖を促進し、Ｔｒｅｇ細胞を増加させることで、大腸炎の発症を抑制することができる［６］。また、大腸扁平上皮（ｃＬＰ）マクロファージに発現する別のＣＬＲであるＭＧＬ１は、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓやＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種と結合してＩＬ－１０を誘導することで、化学物質による大腸炎を改善する［７］。
　樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ；遺伝子記号Ｃｌｅｃ４ａ２）は、別のＣＬＲファミリーのメンバーであり、樹状細胞（ＤＣ）、破骨細胞等の骨髄系由来の細胞に主に発現している。ＤＣＩＲは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を持つＤｅｃｔｉｎ－１とは異なり、細胞質領域に免疫受容体チロシンベースの抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を持ち、プロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ－１をリクルートすることで複数のシグナル伝達経路を負に制御している［７－１２］。
　以前、発明者らは、高齢のＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスが自然に自己免疫性の唾液腺炎や腱付着部炎を発症することを報告した［１３、１４］。Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスは、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）等の自己免疫疾患に非常に感受性が高い［１３、１５］。Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、ＤＣ集団が拡大し、ＤＣの抗原提示能力が亢進しており、この抗原提示能力の亢進が、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスの自己免疫性や抗原刺激に対する過剰反応の原因となっていることが示唆されている［５０、１３］。また、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）として知られる顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）によるＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの骨髄細胞（ＢＭＣ）からのＤＣの分化は、シグナル伝達兼転写活性化因子５（Ｓｔａｔ５）の過剰なリン酸化によって促進されることから、ＤＣＩＲは、ＳＨＰ－１をＩＴＩＭにリクルートすることにより、下流のＳｔａｔ５のリン酸化を抑制することでＧＭ－ＣＳＦシグナルを制御していることが示唆されている［１３、１６］。このように、ＤＣＩＲは腸の炎症や抗腫瘍免疫にも関与していると考えられる。しかし、腸の炎症や腫瘍の発生にＤＣＩＲがどのように関与しているかは、まだ解明されていない。
　本研究では、マウスのデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎及びアゾキシメタン（ＡＯＭ）誘発大腸腫瘍の発症におけるＤＣＩＲの役割を調べた。ＤＳＳ誘発大腸炎は、ヒトの潰瘍性大腸炎やクローン病の疾患モデル動物である。ＡＯＭ－ＤＳＳ誘発大腸腫瘍は、大腸がんのモデルであり、Ｋ－ｒａｓ遺伝子、β－Ｃａｔｅｎｉｎ遺伝子等のプロトオンコジーンに変異を誘発することで大腸にポリープを発生させ、ＤＳＳによる炎症によって腫瘍化を促進する。その結果、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスは野生型（ＷＴ）マウスに比べてＤＳＳ誘発大腸炎にかかりにくく、炎症性サイトカイン及びケモカインの発現が抑制されること、並びにこれらの現象には常在微生物が関与していないことがわかった。また、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、ＷＴマウスに比べてＡＯＭ－ＤＳＳ誘発大腸腫瘍の発生が抑制され、ポリープにおけるＣｓｆ２の発現が増加していた。さらに、抗２本鎖アシアロＮ型糖鎖抗体（抗ＮＡ２抗体）を投与すると、大腸炎及び大腸がんの発症が抑制された。これらの結果から、ＤＣＩＲリガンドであるＮＡ２が、ＤＣＩＲの作用により増悪化する疾患の治療及び予防の標的として応用できると考えられた。
２．材料と方法
２．１　マウス
　Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスは、相同組換え技術を用いて作製し、ＢＡＬＢ／ｃＡ（日本エスエルシー株式会社、日本、静岡）と１２世代にわたって戻し交配した［１］。年齢の近いＷＴとＣｌｅｃ４ａ２－／－の雄マウスを使用した。これらのマウスは、東京理科大学生命医科学研究所の環境制御されたクリーンルームにおいて、特定の病原体を含まない条件で飼育された。すべての動物実験は、機関内の動物使用委員会によって承認され、動物実験に関する倫理指針及び遺伝子操作実験に関する安全指針に従って行われた。
２．２　ＤＳＳ誘発大腸炎、ＡＯＭ－ＤＳＳ誘発腫瘍
　ＤＳＳ誘発大腸炎の誘発は以下の手順で行った。１０週齢前後のＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスとＷＴマウスを分離群又は同居群（同居群は離乳後から同居）とし、４％ＤＳＳ（３６～５０ｋＤａ；ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、フランス、イルキルシュ）を飲料水に入れて７日間投与した後、通常の水を用いて５日間回復させた。
　下痢及び血便は２日に１回、以下のようにスコア化した。
［下痢］０：正常、１：やや緩い便、２：緩い便、３：やや水様性の下痢、４：水様性の下痢。
［血便］０：正常、２：わずかな出血、３：中程度の出血、４：大量の出血。
　体重減少は以下のようにスコア化した。
［体重減少］０：なし、１：０％超５％以下の減少、２：５％超１０％以下の減少、３：１０％超１５％以下の減少、４：１５％超の減少。
　疾患活動指数はこれらのスコアの平均値とした。疾患活動指数は、（下痢、出血、及び体重減少のスコアの合計）／３とした。
　Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウス及びＷＴマウスにおける４％ＤＳＳ誘発大腸炎の間、ＰＢＳ及びｒｍＧＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｔｒｏｔｅｃｈ社、米国）（１μｇ）を０、１、２、及び３日目に腹腔内投与した。
　ＷＴマウスでは０、１、２、３、４、５、及び６日目に、ＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（Ｂｉｏ　Ｘ　Ｃｅｌｌ社、米国、クローン：２Ａ３）及び抗ＧＭ－ＣＳＦ（Ｂｉｏ　Ｘ　Ｃｅｌｌ社、米国、クローン：ＭＰ１－２２Ｅ９）中和抗体（１００μｇ／マウス）を腹腔内投与した。
　抗ＮＡ２抗体（クローン：６３３＿１Ｇ３、２００μｇ／マウス）及びアイソタイプ抗体（ＩｇＭ、クローン：ＭＭ－３、２００μｇ／マウス）をＷＴマウスに１、２、及び５日目に腹腔内投与した。
　ＤＳＳ投与開始後１２日目にマウスを安楽死させ、病理組織学的分析を行った。大腸の切片をＰＢＳで洗浄した後、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。切片にした後、組織切片をヘマトキシリンとエオジンで染色した。
　抗ＮＡ２抗体は以下の手順でガラクトシル転移酵素－１（ＧａｌＴ１）欠損マウスにＮＡ２を免疫することにより作製した。免疫に使用したＮＡ２は以下の通りである。
　商品名：ＧＴ－１１１５７
　会社名：株式会社糖鎖工学研究所
　構造：ＢＳＡ体にマレイミド結合によりＮＡ２糖鎖が結合しており、ＢＳＡ１分子あたり１５～２５分子のＮＡ２が結合されている。
　免疫は以下の手順で行った。ＮＡ２－ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）をアジュバントのＴｉｔｅｒ　Ｍａｘ　Ｇｏｌｄ（登録商標、ＴｉｔｅｒＭａｘ社）と１：１で混合し、ＧａｌＴ１欠損マウス１匹あたり４００μＬを皮下接種し、４週後２００μＬをブースト接種した。それから２週間後、マウスを安楽死させ、脾臓細胞をミエローマ（ＮＳ－１）細胞と融合させハイブリドーマを作製した。限界希釈によりハイブリドーマのモノクローナルライブラリーを作製し、下記方法によりＮＡ２特異的抗体産生クローン（６３３）を同定した。さらにシングルクローンを確立するため、再度クローニングし６３３＿１Ｇ３クローンを確立した。クローン６３３及び６３３＿１Ｇ３のＣＤＲ領域配列を獲得しており（図１０）、６３３及び６３３＿１Ｇ３は同じ配列を持つことからモノクローナル抗体として認めた。
　６３３＿１Ｇ３ハイブリドーマをプリスタンで前刺激したヌードマウスに移植し、マウスを安楽死させ腹水を回収した。６３３＿１Ｇ３がＩｇＭ抗体であるため、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ　修飾アガローズビーズであるＣａｐｔｏＬ（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社）により抗体を精製した。
　抗ＮＡ２抗体の同定は、以下の手順でＤＣＩＲ－ＦｃのＮＡ２への結合阻害能を確認して行った。９６ウェルプレートの底にＮＡ２－ＯＶＡ（株式会社糖鎖工学研究所、ＧＴ－１１２０４）又はＯＶＡ（１０μｇ／ｍｌ）を添加し、４℃で一晩静置することでプレートに結合させた。１０％ＦＣＳ含有ＰＢＳでブロッキングし、Ｆｃ又はＤＣＩＲ－Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）、及び抗ＮＡ２抗体産生ハイブリドーマからの培養液を添加した。室温で１時間静置し、プレートを洗浄した後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）によりプレートに会合したＦｃ又はＤＣＩＲ－Ｆｃを検出した（図９Ａ）。グラフはトリプリケートの平均＋－標準偏差で示した。なお実施例１においてＤＣＩＲ－Ｆｃは特段の指定がない限りマウスＤＣＩＲ－Ｆｃを指す。
　ＤＣＩＲの細胞外領域－ヒトＦｃ融合タンパク質のＮＡ２－ＯＶＡへの結合を、抗ＮＡ２抗体（６３３クローン、６３３＿１Ｇ３はこのクローンから再度クローニングされたものであり、同一のＢＣＲ　ＶＤＪ配列を持つ）が著しく阻害した。
　抗ＮＡ２抗体のＮＡ２に対する結合能は以下の手順で確認した。６３３＿１Ｇ３抗体を用いて、ＮＡ２に対する結合能をＥＬＩＳＡ（図９Ｂ）、及びアシアロ糖鎖発現ＬＥＣ２細胞株の染色（図９Ｃ）で確認した。
　ＥＬＩＳＡは以下の手順で行った。ＯＶＡ又はＮＡ２－ＯＶＡ（１０μｇ／ｍｌ）を９６ウェルプレートにコートし、４℃で一晩静置し抗原をプレートコートした。その後プレートを洗浄し、１０％ＦＣ含有ＰＢＳで常温１時間ブロッキングを行なった。つづいてプレートを洗浄し、アイソタイプ抗体（ｉｓｏ）（１０μｇ／ｍｌ（１０））、又は６３３＿１Ｇ３抗体（０．１μｇ／ｍｌ（０．１）、１μｇ／ｍｌ（１）又は５μｇ／ｍｌ（５））を添加し室温で１時間静置した。プレート洗浄後Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）によりＩｇＭ抗体を検出した。グラフはトリプリケートで実施したウェル間平均で示した。本結果は独立に行われた２回以上の実験の代表である。
　アシアロ糖鎖発現ＬＥＣ２細胞株の染色は、以下の手順で行った。ＣＨＯ細胞及びその糖鎖修飾酵素の変異株Ｌｅｃ１（高マンノース型糖鎖発現）、Ｌｅｃ８（アガラクト糖鎖発現）、Ｌｅｃ２（アシアロ糖鎖発現）に対する抗ＮＡ抗体（６３３＿１Ｇ３）の結合を解析した。各細胞にアイソタイプ抗体（ｉｓｏ）、あるいは抗ＮＡ抗体（６３３＿１Ｇ３）を添加し（１０μｇ／ｍｌ）、氷上で３０分静置し、洗浄後ＰＥ／Ｃｙ７－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＭ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を添加し、さらに氷上で２０分静置した。細胞を洗浄しＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩで解析した。
　６３３＿１Ｇ３クローンハイブリドーマ細胞から、ＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡを調製して、ＦＲ１からＦＲ４のＤＮＡシーケンス解析を行った。６３３＿１Ｇ３のアミノ酸配列及び解析されたＤＮＡ配列を図１０に示す。図１０において、上段は重鎖（ＶＨ）の配列、下段は軽鎖（ＶＬ）の配列をそれぞれ示す。
　ＡＯＭ－ＤＳＳ誘発腫瘍の誘発は以下の手順で行った。４週齢で離乳させた後に同居又は分離させた７～８週齢の雌マウスに、体重に応じてＡＯＭ（１ｍｇ／ｍｌ）を注射し（１０ｍｇ／ｋｇ）、１週間後に２％ＤＳＳで１週間処理した後、通常の水で処理した。上記のＤＳＳと水の処理を３サイクル行った後、水で８週間処理した。体重は３日ごとに測定した。ＷＴマウスに抗ＮＡ２抗体（クローン：６３３＿１Ｇ３、２００μｇ／マウス）及びアイソタイプ抗体（ＩｇＭ、クローン：ＭＭ－３、２００μｇ／マウス）を腹腔内投与した。
２．３　ウェスタンブロット解析
　ＤＳＳ及び通常の水の投与後１２日目に、マウス大腸からＮＰ４０溶解バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を用いて全タンパク質を抽出し、リン酸化阻害剤（Ｒｏｃｈｅ社、スイス）で処理した。ポリープ（各群２～３個）と非ポリープ（ポリープ周辺の組織）の全タンパク質を前記と同様に抽出した。１０６個の大腸細胞をｒｍＧＭ－ＣＳＦ（０、１、１０ｎｇ／ｍｌ）で１時間処理し、刺激後にタンパク質を採取した。ブロッティングには、ウサギ抗マウスＳｔａｔ５（Ｄ２Ｏ６Ｙ）抗体、ウサギ抗マウスリン酸化Ｓｔａｔ５（Ｔｒｙ６９４）抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、及び抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、米国）を使用した。
２．４　定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ及びＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）法
　別々に飼育したマウスの糞便からＱＩＡｍｐＤＮＡ　ｓｔｏｏｌ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、米国）を用いて菌叢のｃＤＮＡを抽出する。ＧｅｎＥｌｕｔｅ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ＲＮＡ　ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国セントルイス）を用いて、大腸炎モデルの大腸、又は２～３個のポリープと非ポリープからトータルｍＲＮＡを抽出した。各サンプルの同量のＲＮＡを１つにプールしてから、ＲＮＡ－ｓｅｑを行った。分離したＲＮＡは、ハイキャパシティｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国フォスターシティ）を用いて逆転写を行った。表示された遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現及び各細菌の発現は、ｉＣｙｃｌｅｒシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国ハーキュリーズ）上でＳＹＢＲ　ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社、日本、大津）を用いたリアルタイム定量ＰＣＲにより測定した。各遺伝子の相対値は比較Ｃｔ法で算出し、Ｇａｐｄｈの発現量で正規化し、各細菌の相対値は比較Ｃｔ法で算出し、１６Ｓの発現量で正規化した。表１Ａ及び表１Ｂにプライマーリストを示す。
２．５　結腸又は腫瘍細胞の準備
　マウス大腸又は２～３個の腫瘍（２～３ｍｍ）をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、２ｍｍのスライスに切り出した後、３ｍＭ　エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で、３７℃で３０分間振とうした。その後、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、４００Ｕ／ｍｌ　コラゲナーゼ（Ｃ２１３９；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、及び５Ｕ／ｍｌ　ＤＮａｓｅ　１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加したＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールスバッド）にスライスを懸濁し、３７℃で１２０分間振盪した。最終インキュベーション後、３０秒間ボルテックスを行い、滅菌したガーゼでろ過して単一細胞懸濁液を採取した。上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ１９マイクロビーズ（ＢＤ社、米国）を２０分間インキュベートした後、ＭＡＣＳ（登録商標）バッファーで２回洗浄し、陰性細胞を選別するＭＡＣＳ（登録商標）処理を行った。ＣＤ１１ｂマイクロビーズ（ＢＤ社、米国）を２０分間インキュベートした後、ＭＡＣＳ（登録商標）バッファーで２回洗浄し、陽性細胞を選別するＭＡＣＳ（登録商標）処理を行った。フローサイトメトリーでは、細胞をＦＡＣＳハンクス緩衝液（２％ＦＣＳと０．１％アジ化ナトリウムを含むＨＢＳＳ）で２回洗浄した後、２．４Ｇ２で処理してＦｃＲの結合をブロックした。その後、以下の２５０倍希釈の蛍光コンジュゲート抗体で細胞を表面染色した：抗マウスＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＣＤ４５（３０－Ｆ１１）、Ｌｙ６Ｃ（ＨＫ１．４）、Ｌｙ６Ｇ（１Ａ８）、ＴＣＲ－β（Ｈ５７－５９７）、ＣＤ３（１７Ａ２）、ＩＬ１７Ａ（ＴＣ１１－１８Ｈ１０）、Ｆｏｘｐ３（ＭＦ－１４）、ＩＦＮ－γ（ＸＭＧ１．２）、ＧＭ－ＣＳＦ（ＭＰ１－２２Ｅ９）、ＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８（５３－６．７）、ＣＤ２０６（Ｃ０６８Ｃ２）、Ｎｏｓ２（Ｗ１６０３０Ｃ）、ＲＯＲγｔ（Ｂ２Ｄ）、ＣＤ９０．２（３０－Ｈ１２）、ＧＡＴＡ３（ＰＣ６１）、Ｇｒ１（ＲＢ６－８Ｃ）等。すべての抗体はＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。死滅細胞を区別するために、適用する前にすべてのサンプルに７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）を添加した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ　ＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で細胞を採取し、ＦｌｏｗＪｏ１０．０ソフトウェア（Ｔｒｅｅ　Ｓｔａｒ社、米国オレゴン州アッシュランド）を用いてデータを解析した。
２．６　統計解析
　パラメトリックデータの差はスチューデントのｔ検定で評価した。統計はＰＲＩＳＭ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて計算し、Ｐ値＜０．０５を統計的に有意とした。
３．結果
３．１　Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスは、腸内細菌叢の変化に非依存的にＤＳＳ誘発大腸炎に抵抗性を示す。
　大腸炎の発症におけるＤＣＩＲの役割を解明する目的で、まず大腸炎の炎症局所におけるＤＣＩＲ遺伝子の発現を検討した。ＤＳＳ誘発大腸炎の炎症局所におけるＤＣＩＲの発現を測定するため、マウスに４％のＤＳＳを含む水を７日間投与して大腸炎を誘発した。その後、１２日目まで通常の飲料水を与えて飼育した後、安楽死させて解析を行った。大腸炎を発症したマウスの大腸では、健康マウスの大腸に比べてＣｌｅｃ４ａ２遺伝子の発現が亢進していた（図１Ａ）。またＮＣＢＩのパブリックＧＥＯデータベースからヒトＤＣＩＲ遺伝子の発現を調べたところ、健康人に比べクローン病及び潰瘍性大腸炎の大腸にてＤＣＩＲ遺伝子の発現亢進が見られた（図１Ａ－２）。Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスの体重減少と大腸炎の重症度スコアは、ＤＳＳ投与時と回復期の両方において、ＷＴマウスよりも軽度であった（図１Ｂ）。Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、炎症によって誘発される大腸の短縮がＷＴマウスに比べて弱まった（図１Ｃ）。Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸における炎症性細胞の浸潤は、ＷＴマウスに比べて軽度であったが、大腸上皮細胞の損傷については、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスとＷＴマウスの間に有意な差は見られなかった（図１Ｄ）。
　次に、このＤＣＩＲの機能に対する常在微生物の影響の可能性を調べるために、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスとＷＴマウスを離乳後４週間同居させた。その後、同居条件でマウスに４％のＤＳＳを含有する飲料水を自由飲水させた。その結果、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、体重減少、下痢や血便、大腸の短縮、炎症性細胞の浸潤等、ＤＳＳによって引き起こされる症状が、ＷＴマウスに比べて軽度であった（図１Ｅ～Ｇ）。また、同居前及び４週間の同居後のマウスの糞便から核酸を抽出し、１６ＳｒＲＮＡ配列のリアルタイムＰＣＲにより腸内細菌叢の代表菌種の構成を測定した結果を図１Ｈ及び図１Ｉにそれぞれ示す。これらの結果、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスとＷＴマウスとの間で腸内細菌叢の代表菌種の構成は、同居させる前は差が認められたが、同居後は構成がよく似てくる事がわかった。これらの結果から、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスは、常在微生物群に依存しない方法で、ＤＳＳ誘発大腸炎に抵抗性であることが示された。
３．２　ＤＳＳ投与後のＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の浸潤は減少しないが、炎症細胞の浸潤は減少している。
　Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスにおける大腸炎の改善メカニズムを知るために、大腸粘膜固有層（ｃＬＰ）における浸潤細胞の割合を測定した。ＤＳＳ処理前には、Ｌｙ６Ｃ＋単球、Ｌｙ６Ｇ＋好中球等の炎症細胞の割合は、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスとＷＴマウスの間で同程度であった（図２Ａ、Ｂ）。しかし、４％ＤＳＳ処理後、これらの細胞の割合は、ＷＴマウスでは有意に増加したが、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは増加しなかった（図２Ｃ、Ｄ）。このことから、これらの炎症細胞の増加が炎症の原因となっていると考えられた。
　Ｔｒｅｇ細胞は、腸管免疫系の恒常性維持に重要な役割を果たし、ＤＳＳ誘発大腸炎の発症を抑制することから［６］、ＤＳＳ誘発大腸炎後のＴｒｅｇ細胞集団についても調べた。その結果、ＤＳＳ投与後１２日目の時点で、ｃＬＰのＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の割合は、ＷＴマウスとＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの間でほぼ同じであった（図２Ｅ）。大腸におけるＦｏｘｐ３、Ｔｇｆｂ、及びＴｂｘ２１の発現レベルもＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスとＷＴマウスの間で同様であった（図２Ｆ）。これらの結果から、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、ＤＳＳ誘発大腸炎を誘導しても、ｃＬＰのＴｒｅｇ細胞、並びにＴｈ１及びＴｈ２細胞の存在比は、ＤＣＩＲの欠乏によって影響を受けないことが示唆された。
３．３　Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、Ｉｌ１７ａ、Ｃｘｃｌ２等の炎症性サイトカインやケモカインの発現が減少している。
　次に、ＤＳＳ誘発大腸炎誘導後１２日目の大腸での遺伝子発現をＲＮＡ－ｓｅｑ解析で調べた（図３Ａ）。Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、ＷＴマウスと比較して、Ｔｎｆ、Ｉｌ６、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ１ａ、Ｉｆｎ－ｇ等の炎症性サイトカインの発現が、非常に減少していた。Ｉｌ１７ｆは減少しなかった。ＤＳＳ処理後のＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、Ｃｓｆ２の発現が増強されたのに対し、ＷＴでは大幅に減少した。ＤＳＳ処理前には、これらの遺伝子発現はＷＴマウスとＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの間で同様であった。また、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ５、Ｃｘｃｌ９、Ｃｘｃｌ１１、Ｃｘｃｌ１５、Ｃｘｃｒ２、Ｃｃｌ１、Ｃｃｒ３等のケモカイン及びその受容体の発現は、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスではＷＴマウスに比べて減少していた。また、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、Ｓｔａｔ５ａ、Ｓｔａｔ５ｂ等の転写因子の発現が亢進していることもわかった。
　ＲＮＡ－ｓｅｑデータのパスウェイ解析を行ったところ、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸では、ＮＦ－κＢ、ＴＮＦ、ＩＬ－１７シグナル経路等、炎症や免疫反応に関連する経路が低下していることが明らかになった（図３Ｂ）。
　その後、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより、サイトカイン及びケモカインの発現を確認した。その結果、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、Ｔｎｆ、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ６、及びＩｌ１７ａの発現が、ＷＴマウスに比べて低下していることが確認された（図３Ｃ～Ｆ）。図３Ｃ～Ｊを組み合わせた。Ｉｌ１７ｆの発現は、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは低下しなかった（図３Ｇ）。また、ケモカインの１つであるＣｘｃｌ２の発現も、ＤＳＳ処理を行わないＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスとＷＴマウスでは同程度であったが、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは大きく減少した（図３Ｈ～Ｊ）。そして次に、これらのサイトカインを発現している細胞を解析した。ＩＬ－１７Ａを発現する細胞をｃＬＰ　ＣＤ４＋Ｔ細胞で解析したところ、ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ－１７ＡはＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスで減少していたが、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＬ－１７Ａは減少していなかった（図３Ｋ及び３Ｌ）。ＩＦＮ－γ産生ｃＬＰ－Ｔ細胞の割合もＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは減少していた（図３Ｋ及び３Ｌ）。
３．４　ＤＣＩＲは、ＴＬＲによるＩｌ１ｂの発現を抑制することによって、ＩＬＣ３におけるＧＭ－ＣＳＦの発現を抑制する。
　ＧＭ－ＣＳＦをコードするＣｓｆ２の発現が、大腸炎を誘発したＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスでＷＴマウスに比べて増加していることがわかった（図３Ａ及び４Ａ）。この遺伝子の発現は、ＤＳＳ処理後にのみ増強された（図４Ｂ及び４Ｃ）。ＧＭ－ＣＳＦは主にＤＳＳ処理後の大腸のＩＬＣ３によって産生される［４４、４５］。ＧＡＴＡ＋ＩＬＣ２細胞とＲＯＲγｔ＋ＩＬＣ３細胞の割合は、ＷＴマウスとＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの間のｃＬＰでは変化しなかった（図４Ｄ）。ＷＴマウスと比較して、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスのｃＬＰでは、ＲＯＲγｔ＋ＩＬＣ３細胞におけるＧＭ－ＣＳＦ＋細胞の割合が増加していた（図４Ｅ）。ＩＬＣ３由来のＧＭ－ＣＳＦ産生は、微生物のシグナルを感知してＩＬ－１βを産生するマクロファージの能力に依存していた［４５］。ＤＣＩＲは、ＴＬＲ８とＴＬＲ９を介した自然免疫応答の負の制御因子である．マクロファージでは、ＤＣＩＲが活性化されると、Ｅｒｋ１／２、ＪＮＫ１／２、及びｐ３８のリン酸化を介する、ＴＬＲ９を介したＩＬ－１βの産生が抑制される［４６－４７］。ＷＴマウスと比較して、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸ＣＤ１１ｂ＋細胞では、Ｒ８４８及びＣｐＧ－ＯＤＮ刺激後にＩｌ１ｂの相対発現が増加していることがわかった（図４Ｆ）。大腸全体ではＩｌ１ｂの相対的な発現は減少していたが、ＤＳＳ投与７日後及び１２日後のＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸のＣＤ１１ｂ＋細胞ではＩｌ１ｂの発現が増加していることがわかった（図４Ｆ）。これらのデータは、ＤＣＩＲが微生物を介したＴＬＲシグナル伝達経路を介してＩＬＣ３細胞によるＧＭ－ＣＳＦの産生を制御していることを示唆している。さらに、発明者らの以前の報告では、ＧＭ－ＣＳＦシグナルが骨髄細胞においてＳｔａｔ５のリン酸化を介して伝達されることが示された［１３］。Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスにおけるＧＭ－ＣＳＦの発現増加と同様に、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸ではＳｔａｔ５のリン酸化が亢進していた（図４Ｇ及び４Ｈ）。また、大腸の細胞を組換えマウスＧＭ－ＣＳＦで処理すると、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでＳｔａｔ５のリン酸化が亢進した（図４Ｊ）。また、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスのｃＬＰでは、ＷＴマウスと比較して、Ｍ２マクロファージが増加し、Ｍ１マクロファージが減少していることがわかった（図４Ｉ）。
３．５　ＧＭ－ＣＳＦは、ＤＳＳ誘発大腸炎の発症を抑制する。
　次に、ＤＳＳ誘発大腸炎の発症におけるＧＭ－ＣＳＦの役割を調べた。ＷＴマウスにＤＳＳ投与中にリコンビナントマウスＧＭ－ＣＳＦを投与し、大腸炎の発症を調べた。その結果、ＧＭ－ＣＳＦの投与により、大腸におけるＳｔａｔ５の発現が亢進し、Ｉｌ１７ａ、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ６、及びＩｌ１ｂの発現が低下するとともに、ＤＳＳ誘発大腸炎の発症が効果的に抑制されることがわかった（図５Ａ～Ｃ）。また、ＧＭ－ＣＳＦ投与後には、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ、及びＺｏ１等のタイトジャンクション成分の発現が増加した（図５Ｃ）。さらに、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウス由来の大腸細胞では、ＧＭ－ＣＳＦ投与により、ＷＴマウス由来の細胞と比較して、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ、及びＺｏ１の発現がより効率的に増強された（図５Ｄ）。一方、抗ＧＭ－ＣＳＦ中和抗体を投与すると、ＷＴマウスとＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスの両方でＤＳＳ誘発大腸炎の症状が悪化した（図５Ｅ～Ｇ）。抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体を投与した大腸では、アイソタイプコントロールＩｇと比較して、Ｉｌ１７ａ、Ｉｌ６、及びＩｌ１ｂの発現が増加し、Ｓｔａｔ５の発現は減少したが、Ｃｘｃｌ２の発現には影響がなかった（図５Ｈ）。また、抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体を投与すると、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ、及びＺｏ１の発現が減少した（図５Ｉ）。これらの結果は、ＧＭ－ＣＳＦが大腸炎発症の制御に重要な役割を果たしていることを示唆している。
３．６　ＡＯＭ－ＤＳＳによる大腸腫瘍の発生は、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは常在菌に依存しない方法で抑制される。
　ＤＣＩＲは大腸炎の発症に重要な役割を果たしていることから、次にＣｌｅｃ４ａ２の欠損が大腸の腫瘍形成に及ぼす影響を調べた。ＷＴ及びＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスにＡＯＭを投与し、７日後、これらのマウスに２％ＤＳＳ含有水を１週間、通常水を２週間投与した。ＤＳＳ－通常水投与を３サイクル行った後、マウスをさらに６週間通常水で飼育した。その結果、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスではＷＴマウスに比べて体重減少が穏やかであったが、生存率には有意な差がなかった（図６Ａ及び６Ｂ）。大腸における腫瘍の発生は、ＷＴマウスと比較してＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは有意に減少した（図６Ｃ及び６Ｄ）。
　腸内細菌叢の影響を調べるために、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスを離乳後４週間目にまずＷＴマウスと同居させ、同居条件下で腫瘍を誘発した。別々に飼育した群と同様に、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスはＷＴマウスよりも体重減少が穏やかで、生存率も有意に高かった（図６Ｅ及び６Ｆ）。また、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、同居条件下でもＷＴマウスに比べて腫瘍の発生が抑制されたことから、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスの腫瘍発生の抑制には、常在微生物が関与していないことが示唆された（図６Ｇ、６Ｈ）。
３．７　Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、ＭＤＳＣの浸潤及び炎症性サイトカインの発現が減少し、ポリープにおけるＣｘｃｌ２の発現が減少する。
　次に、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲとＲＮＡ－ｓｅｑ解析を用いて、ポリープとポリープ周辺組織における遺伝子発現を解析した。その結果、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスのポリープ及び非ポリープ組織では、ＷＴマウスと比較してＩｌ１７ａの発現が劇的に減少していることがわかった（図７Ｂ及び７Ｅ）。また、Ｉｌ１７ｆの発現も減少していたが、その程度はＩｌ１７ａよりも小さかった。これらの発現レベルはｑＰＣＲでも確認された（図７Ｃ及び７Ｅ）。Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスのポリープ及び非ポリープ組織では、Ｃｘｃｌ２を含むケモカインのｍＲＮＡレベルが低下していた（図７Ｅ）。また、Ｃｘｃｌ２の発現低下はＲＴ－ＰＣＲでも確認された（図７Ｄ）。この観察結果と一致して、ＣＸＣＲ２を発現する単球性（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋）及び顆粒球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）ＭＤＳＣのポリープへの浸潤が、ＡＯＭ－ＤＳＳ処理後にＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスではＷＴマウスに比べて減少していることがわかった（図７Ｆ及び７Ｇ）。ＤＣＩＲ（Ｃｌｅｃ４ａ２）のポリープでの発現は、周辺正常組織に比べ、有意に亢進していた。また、同じことはヒト大腸癌でも観察された。ヒトの炎症性腸疾患でもマウスと同じように発現が亢進していた。これらの結果は、ヒトでもマウスと同様にＤＣＩＲが大腸炎や腸管腫瘍の発生に関与していることを強く示唆する。また、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスのポリープ及び非ポリープ組織では、Ｇｚｍｂの発現がＷＴマウスと比較して減少していることがわかった（図７Ｅ）。これらの結果から、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、炎症を誘発するのに重要なＩｌ１７ａやＣｘｃｌ２を含む様々なサイトカインやケモカインの発現が低下しており、ＭＤＳＣのポリープへのリクルートの低下と関連していることがわかった。
３．８　Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、ＧＭ－ＣＳＦ－Ｓｔａｔ５軸が活性化され、大腸がんの発生を抑制することがわかった。
　また、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスのポリープと非ポリープの組織では、Ｃｓｆ２の発現がＷＴマウスの１０００倍になっていることがわかった（図７Ｈ）。また、ＧＭ－ＣＳＦのシグナル分子であるＳｔａｔ５の発現も、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは大幅に増加していた（図７Ｉ）。次に、この分子の活性化状態を解析した。その結果、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスのポリープと非ポリープの組織でＳｔａｔ５のリン酸化が増加していることがわかり（図７Ｊ）、大腸腫瘍の誘発後、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスの腸内でＧＭ－ＣＳＦ－Ｓｔａｔ５軸が活性化されていることが示唆された。
３．９　抗ＮＡ２抗体は大腸炎の発症を抑えることができる。
　我々は、２本鎖アシアロＮ型糖鎖（ＮＡ２）がＤＣＩＲのリガンドであることを示し（海部ら）、ガラクトシル転移酵素－１欠損マウスにＮＡ２を免疫してＮＡ２に対する抗体を作製した［５０］。そして、抗ＮＡ２抗体がＤＳＳ誘発大腸炎の発症に及ぼす影響を調べた。その結果、抗ＮＡ２抗体投与群では、アイソタイプＩｇ投与群と比較して、ＤＳＳ誘発大腸炎の発症が抑制されることがわかった。抗ＮＡ２抗体投与群では、体重減少が少なく（図８Ａ）、疾患の重症度が低く（図８Ｂ）、結腸の長さが長く（図８Ｃ）なった。また、抗ＮＡ２抗体投与により、大腸におけるＣｘｃｌ２、Ｉｌ１７ａ、Ｉｌ６の発現が抑制され、Ｃｓｆ２の発現が増強された（図８Ｄ）。ｃＬＰへのＬｙ６Ｇ＋好中球の浸潤は、４％ＤＳＳ処理後、抗ＮＡ２抗体処理群がアイソタイプＩｇ処理群に比べて有意に減少した（図８Ｅ）。ＡＯＭ－ＤＳＳで誘発された大腸のポリープの発生は、抗ＮＡ２抗体処理群ではＩｇ処理群に比べて有意に減少した（図８Ｆ）。これらの観察結果は、ＮＡ２－ＤＣＩＲ相互作用を阻害する抗体が、ＤＳＳ誘発大腸炎及び大腸腫瘍の発生を抑制できることを示している。
４．考察
　本研究において、発明者らは、ＤＣＩＲの欠損がＤＳＳ誘発大腸炎及びＡＯＭ－ＤＳＳ誘発大腸腫瘍の発症を抑制することを明らかにした。Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、ＷＴマウスと比較して、ＤＳＳを経口投与した後、体重減少が少なく、大腸炎の重症度が軽度であり、大腸における炎症性細胞の浸潤が抑制されていた。また、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、ＡＯＭ－ＤＳＳ投与後の大腸腫瘍の発生が少なかった。さらに、ＤＣＩＲリガンドであるＮＡ２に対する抗体は、ＡＯＭ－ＤＳＳによる大腸炎と腫瘍の発生を改善することができた。これらの結果は、ＤＣＩＲシグナルを阻害することで、大腸炎や大腸腫瘍の発生を防ぐことができることを示唆している。
　マウスやヒトの大腸炎の発症には、常在する微生物が重要な役割を果たしていることが示唆されている［１７、１８］。しかし、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスとＷＴマウスを同居させても、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸炎に対する感受性には影響がなかったことから、腸内細菌叢はこの表現型には関与していないことが示唆された。また、ＡＯＭ－ＤＳＳ処理後の腫瘍発生も同居によって影響を受けなかったことから、ＤＣＩＲ欠損による腫瘍発生への影響もまた、微生物叢によって媒介されるものではないことが示された。
　Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスがＤＳＳ誘発大腸炎及びＡＯＭ－ＤＳＳ誘発腫瘍の発生に抵抗性であるという知見は、ＣＩＡやＥＡＥ等の自己免疫疾患の発症がこの変異マウスで悪化するという観察結果と明確な対比をなすものである［１３、１５］。Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスで自己免疫疾患の発症が促進されるのは、このマウス系統ではＤＣの過剰な増殖と成熟の促進により、抗原提示能力が過剰に亢進しているためである［１３］。したがって、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスで大腸炎の発症や大腸腫瘍が抑制されることは、ＤＣの抗原提示に依存するＴ細胞介在性の自己免疫がこれらの表現型に関与しているのではなく、抗原提示に依存しない自然免疫応答が関与していることを示唆している。この考えを裏付けるように、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、ＤＳＳ誘発大腸炎を誘導しても、Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｒｅｇ細胞の数は変化しなかった。
　Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、ＤＳＳ処理後にＣｓｆ２の発現がＷＴマウスよりも増加していることがわかった。ＩＬＣ３細胞は、ＤＳＳ処理後の主要なＧＭ－ＣＳＦ産生細胞である［４４、４５］。また、ＩＬＣ３細胞におけるＧＭ－ＣＳＦ＋細胞の割合は、ＤＳＳ処理後のＷＴマウスよりもＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスで増加している。ＩＬＣ３によるＧＭ－ＣＳＦの産生は、ＴＬＲを介した微生物のシグナルを感知する際にマクロファージがＩＬ－１βを産生することに依存しており、ＧＭ－ＣＳＦ－／－は単核食細胞のエフェクター機能を変化させ、Ｔｒｅｇ細胞数を減少させ、経口耐性を損なっていた［４５］。我々のデータは、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９のアゴニストによる刺激又はＤＳＳ誘発大腸炎後、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスのＣＤ１１ｂ＋細胞でＩｌ１ｂの発現が増加することを示した。これは、ＤＣＩＲがマクロファージにおけるＥｒｋ１／２、ＪＮＫ１／２、及びｐ３８のリン酸化を抑制することで、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９を介したＩＬ－１βの産生を抑制するという過去の報告と一致している［４６－４７］。ＧＭ－ＣＳＦのシグナルは、Ｓｔａｔ５のリン酸化を介して骨髄細胞に伝達される［１３］。ＧＭ－ＣＳＦ－Ｓｔａｔ５シグナルは、腸の損傷に対する腸のホメオスタシス反応に不可欠であり、腸上皮細胞のＳｔａｔ５をノックアウトすると、ＮＦ－κＢシグナルが増加し、タイトジャンクションの透過性が増加する［４８］。Ｓｔａｔ５欠損マウスは、実験的大腸炎に罹患しやすくなる［２０、４９］。Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスにおけるＧＭ－ＣＳＦの発現増加と一致して、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスの大腸ではＳｔａｔ５のリン酸化が亢進していた。さらに、ｒｍＧＭ－ＣＳＦは大腸炎の発症を抑制し、抗ＧＭ－ＣＳＦは大腸炎を悪化させることが示された。これは、ＧＭ－ＣＳＦの欠乏が大腸炎の発症を悪化させ、ＧＭ－ＣＳＦの投与がマウス［１９～２１］やヒト［２２、２３］の大腸炎を改善するというこれまでの観察結果と一致する。以上のことから、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスにおける大腸炎の抑制には、大腸でのＧＭ－ＣＳＦの過剰産生が関与していると結論づけられ、ＧＭ－ＣＳＦ／Ｓｔａｔ５シグナルの大腸炎における保護機能が示唆された。
　興味深いことに、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、ジャンクション複合タンパク質であるＯｃｃｌｕｄｉｎ、Ｚｏ１、及びＣｌａｕｄｉｎの発現が増加していることがわかった。腸球のＳｔａｔ５シグナルは、タイトジャンクションバリア機能不全から保護し、腸管粘膜の創傷治癒を促進する［４８］。これらの遺伝子の発現は、ｍｒＧＭ－ＣＳＦ処理により増強され、抗ＧＭ－ＣＳＦ処理により減少したことから、ＧＭ－ＣＳＦ／Ｓｔａｔ５シグナル伝達経路がこれらのタイトジャンクションタンパク質を誘導していることが示唆された。これらのタンパク質はタイトジャンクションの重要な構造成分であることから、ＧＭ－ＣＳＦは、上皮細胞の成長促進や生存に加えて、腸の上皮バリア機能の強化にも重要な役割を果たしていると考えられる［２３］。
　一方、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、Ｔｎｆ、Ｉｌ１、Ｉｌ６等の炎症性サイトカイン遺伝子の発現が抑制されていたことから、大腸炎の改善はこれらの炎症性サイトカインの発現が抑制されることに起因すると考えられた。また、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ６、Ｔｎｆ、及びＣｘｃｌ２の発現は、ｒｍＧＭ－ＣＳＦ処理で抑制され、抗ＧＭ－ＣＳＦ処理で増強されることが示され、これらの炎症性サイトカインの発現がＧＭ－ＣＳＦによって制御されていることが示された。発明者らの結果と一致するように、ＧＭ－ＣＳＦ処理は、Ｔｎｆ、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ等の炎症性サイトカインの発現をダウンレギュレートすることが報告されている［２１］。さらに、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、Ｉｌ１７ａの発現も有意に抑制されていることがわかった。これは、Ｉｌ１７ａエンハンサーへの結合をＳｔａｔ３と競合させることでＩｌ１７ａの発現を抑制するＳｔａｔ５が、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスで過剰に活性化されているためである［２４、２５］。
　大腸炎の発症におけるＩＬ－１７Ａの役割については議論の余地がある。ＩＬ－１７Ａは、炎症性サイトカインであり、ＥＡＥやＣＩＡ等の自己免疫疾患の発症に重要な役割を果たしている［２６、２７］。ＩＬ－１７Ａは、ケモカインであるＣＸＣＬ２を誘導することにより、好中球をリクルートして炎症を引き起こす［２８、２９］。
　Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、Ｃｘｃｌ２の発現が低下しており、Ｉｌ１７ａの発現低下と協調していることが確認された。ＩＢＤではＩｌ１７ａの発現が増加し［３０］、ＣＸＣＬ２の発現はヒトＵＣの臨床活動と相関しており［３１］、ＩＢＤ患者の腸の粘膜傷害に関連して、活性化された好中球の過剰なリクルートと蓄積が観察される［３２］。また、その受容体であるＣＸＣＲ２をブロックすることで、マウスのＤＳＳ大腸炎を抑制することができる［３３－３５］。これらの観察結果は、ＩＬ－１７Ａの発現低下が、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスにおける好中球のリクルートを抑制することで、大腸炎の軽減に寄与していることを示唆していると考えられる。しかし、抗ＩＬ－１７Ａ中和抗体による治療は効果がなく、むしろＩＢＤ患者の病状を悪化させることが報告されている［３６］。また、実験的な大腸炎モデルにおいても、Ｉｌ１７ａ－／－マウスでは大腸炎の発症が悪化し、誘発された大腸炎に抵抗性を示すＩｌ１７ｆ－／－マウスとは対照的である［３７－３９］。これらの観察結果は、ＩＬ－１７Ａが大腸炎の発症にむしろ保護的な役割を果たしていることを示唆している。この考えと一致するように、ＩＬ－１７Ａは、大腸上皮細胞におけるタイトジャンクションタンパク質Ｏｃｃｌｕｄｉｎの細胞内局在を制御することによって、腸上皮のバリア統合性の維持に重要な役割を果たしていることが報告されている［４０］。したがって、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスにおけるＩＬ－１７Ａの発現低下は、これらのマウスにおける大腸炎の抑制に関与していたとしても、主要な理由ではないと考えられる。
　その結果、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、ＡＯＭ－ＤＳＳで誘発される大腸腫瘍の発生が、ＤＳＳで誘発される大腸炎の発生と同様に抑制されることがわかった。Ｃｓｆ２の発現は、ＷＴマウスと比較して、変異マウスではポリープと非ポリープの両方の領域で大きく増加していた。Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでは、ＤＳＳによる大腸炎発症マウスと同様に、Ｉｌ１７ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｔｎｆ、及びＣｘｃｌ２の発現が低下していた。炎症は腫瘍の発生を促進することから、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスの腸内で炎症が増強されると、腫瘍の発生が促進される可能性がある。この観点から、ＩＬ－１７Ａは血管新生を促進することで腫瘍形成を促進することが知られている［４１］。また、ＩＬ－１も腫瘍形成を促進する［４２］。ＣＸＣＲ２の欠損は、ＭＤＳＣの大腸粘膜や腫瘍への浸潤を抑制することで、大腸の慢性炎症や大腸炎に伴う腫瘍形成を劇的に抑制する［３４、４３］。したがって、Ｃｌｅｃ４ａ２－／－マウスでＡＯＭ－ＤＳＳによる腫瘍の発生が抑制される理由は、炎症性サイトカインの産生とＭＤＳＣの浸潤の減少にあると考えられる。
　我々は、抗ＮＡ２抗体を用いてＤＣＩＲとそのリガンドであるＮＡ２の相互作用を阻害することで、ＤＳＳ誘発大腸炎やＡＯＭ－ＤＳＳ誘発腫瘍の発生を抑制できることを示した。抗ＮＡ２処理後、Ｃｓｆ２の発現は増加し、Ｉｌ１７ａ、Ｉｌ６、Ｉｌ１ｂ、及びＣｘｃｌ２の発現は減少したが、これはＣｌｅｃ４ａ２－／－マウスでの観察結果と一致していた。これらの結果から、ＮＡ２－ＤＣＩＲ軸は、ＴＬＲ８やＴＬＲ９等の自然免疫受容体によって誘導される免疫応答を腸内で制御するのに重要な役割を果たしていることがわかった。生理的条件下では、ＤＣＩＲはＤＣの過剰な分化と活性化を制御し、自己免疫を防いでいる。しかし、腸内では、ＤＣＩＲのシグナルが自然免疫シグナルを制御し、ＧＭ－ＣＳＦの誘導を抑制するため、腸が炎症や腫瘍の発生に対して脆弱になっている。したがって、ＤＣＩＲの活性化を阻害することで、自然免疫機構を介して腸の炎症や腫瘍の発生を抑制することができる。なお、ヒトとマウスではＮＡ２の構造は同じであることから、上記知見をヒトに応用できると考えられる。これらの知見は、大腸炎や大腸腫瘍を治療するための新たな治療法を開発する手がかりになると考えられる。
＜実施例２＞
１．緒論
　抗ＤＣＩＲ抗体はＮＡ２とＤＣＩＲの結合を阻害し、炎症性腸疾患及び腸管腫瘍の治療に応用できる可能性がある。そこで、抗ＤＣＩＲ抗体を作製し、ＤＣＩＲに対する結合性及びＮＡ２－ＤＣＩＲ結合阻害能を評価した。
２．材料と方法
２．１　抗ＤＣＩＲ抗体の作製
　以下の手順で抗ＤＣＩＲ抗体を樹立した。ＤＣＩＲ発現性細胞株を免疫アジュバント（Ｔｉｔｅｒ　Ｍａｘ）に混合し、ＤＣＩＲ欠損マウスに２回免疫し、マウスを安楽死させた。脾臓細胞を採取し、ミエローマ細胞と融合させハイブリドーマ細胞を作製し、限界希釈によるモノクローナルライブラリーを作製した。つづいてＤＣＩＲ発現細胞及びＤＣＩＲタンパク質への結合活性からＤＣＩＲ特異的抗体を同定した。樹立したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、無血清培地に馴化させ、最終的には細胞培養液からＰｒｏｔｅｉｎ－Ｌ会合ビーズにより抗体を精製した。
　モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞から、ＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡを調製して、ＦＲ１からＦＲ４のＤＮＡシーケンス解析を行った。作製した抗ＤＣＩＲアンタゴニスト抗体の塩基配列及びアミノ酸配列を図１４Ａ及び図１４Ｂに示す。
２．２　マウス及びヒトＤＣＩＲに対する抗ＤＣＩＲ抗体の結合性
　９６ウェルプレートの底に抗ＤＣＩＲ抗体又はアイソタイプ抗体（１０μｇ／ｍｌ）を添加し、４℃で一晩静置することでプレートに結合させた。１０％（ｗ／ｖ）ＦＣＳ含有ＰＢＳでブロッキングし、Ｆｃ又はマウスＤＣＩＲ－Ｆｃ、又はヒトＤＣＩＲ－Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）を添加した。室温で１時間静置し、プレートを洗浄した後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）によりプレートに会合したＦｃマウスＤＣＩＲ－Ｆｃ、又はヒトＤＣＩＲ－Ｆｃを検出した（図１１）。
２．３　抗ＤＣＩＲ抗体の、ＮＡ２発現性細胞（Ｌｅｃ２）とＤＣＩＲの結合阻害
　ＮＡ２を発現するＬｅｃ２細胞に、ＤＣＩＲ－Ｆｃ及びアイソタイプ抗体（５μｇ／ｍｌ）、又は抗ＤＣＩＲ抗体（０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）を添加し、懸濁し、氷上で３０分静置した。細胞を洗浄し、蛍光標識抗ヒトＦｃ抗体を用いて、ＤＣＩＲ－Ｆｃタンパク質のＬｅｃ２細胞への結合を検出した。
３．結果と考察
　作製した抗ＤＣＩＲ抗体は、マウス及びヒトＤＣＩＲに対する結合活性を示した（図１２）。また、作製した抗ＤＣＩＲ抗体は、ＮＡ２発現性細胞（Ｌｅｃ２）とＤＣＩＲの結合を阻害する能力を有することが確認された（図１３）。本抗体は、ヒトＤＣＩＲ抗体への結合を示し、ＤＣＩＲとＮＡ２の結合を阻害することから、新医薬へ有効に応用できる可能性が示唆される。
＜実施例３＞
抗ＤＣＩＲ抗体のアンタゴニスト活性の確認
　野生型又はＤＣＩＲ欠損マウスの骨髄細胞をＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）で２日間、続いてＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）で４日間培養した。アイソタイプ又はリコンビナント抗ＤＣＩＲアンタゴニスト抗体（５Ａ３Ｄ８＿ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）は１μｇ／ｍＬで培養開始及び培養液交換時に添加した。ＴＲＡＰ染色後ＴＲＡＰ陽性、細胞直軽１００～２００μｍ、そして２００μｍ以上の多核細胞を破骨細胞として計数した。グラフは４つのリプリケートウェルの破骨細胞数の平均及び標準偏差で示し、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔで検定した。＊；ｐ＜０．０５、ｉｓｏ　ＶＳ　抗ＤＣＩＲ抗体。１回実施した実験のデータを示す（図１５Ａ、Ｂ）。
　この結果、抗ＤＣＩＲ抗体は破骨細胞の分化を促進した。抗ＤＣＩＲアゴニスト抗体とは逆に破骨細胞分化を促進することから、この抗体はアゴニストではなく、アンタゴニスト抗体であることが示された。
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　日本国特許出願第願２０２２－００８１２９号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。

Claims (9)

  1. 　炎症性腸疾患及び腸管腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を治療又は予防するための、樹状細胞免疫受容体－２本鎖アシアロＮ型糖鎖間の結合阻害剤、又は樹状細胞免疫受容体阻害剤と、薬学的に許容される担体と、を含有する医薬組成物。
  2. 　前記樹状細胞免疫受容体－２本鎖アシアロＮ型糖鎖間の結合阻害剤、又は前記樹状細胞免疫受容体阻害剤が、抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　前記樹状細胞免疫受容体－２本鎖アシアロＮ型糖鎖間の結合阻害剤が抗２本鎖アシアロＮ型糖鎖抗体である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. 　前記樹状細胞免疫受容体－２本鎖アシアロＮ型糖鎖間の結合阻害剤、又は前記樹状細胞免疫受容体阻害剤が、抗樹状細胞免疫受容体抗体である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  5. 　前記抗体が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である、請求項２に記載の医薬組成物。
  6. 　前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項２に記載の医薬組成物。
  7. 　前記抗体が、全長抗体、又は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びダイアボディーからなる群より選択される低分子化抗体である、請求項２に記載の医薬組成物。
  8. 　前記腸管腫瘍が、大腸がん、直腸がん、及び小腸がんからなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  9. 　前記炎症性腸疾患が、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
     
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