WO2016006700A1 - 樹状細胞免疫受容体活性化剤、樹状細胞免疫受容体活性化方法、破骨細胞形成抑制剤、破骨細胞形成抑制方法、樹状細胞分化・増殖阻害剤、樹状細胞分化・増殖阻害方法、サイトカイン産生抑制剤、サイトカイン産生抑制方法、治療方法及びスクリーニング方法 - Google Patents

樹状細胞免疫受容体活性化剤、樹状細胞免疫受容体活性化方法、破骨細胞形成抑制剤、破骨細胞形成抑制方法、樹状細胞分化・増殖阻害剤、樹状細胞分化・増殖阻害方法、サイトカイン産生抑制剤、サイトカイン産生抑制方法、治療方法及びスクリーニング方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2016006700A1
WO2016006700A1 PCT/JP2015/069960 JP2015069960W WO2016006700A1 WO 2016006700 A1 WO2016006700 A1 WO 2016006700A1 JP 2015069960 W JP2015069960 W JP 2015069960W WO 2016006700 A1 WO2016006700 A1 WO 2016006700A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dendritic cell
dcir
inhibitor
immune receptor
osteoclast formation
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/069960
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
洋一郎 岩倉
知則 海部
力朗 矢部
Original Assignee
学校法人東京理科大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 学校法人東京理科大学 filed Critical 学校法人東京理科大学
Priority to EP15818141.2A priority Critical patent/EP3167889B1/en
Priority to US15/323,748 priority patent/US10792300B2/en
Priority to JP2016532988A priority patent/JP6674685B2/ja
Publication of WO2016006700A1 publication Critical patent/WO2016006700A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/38—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence, e.g. gluco- or galactomannans, e.g. Konjac gum, Locust bean gum, Guar gum
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the present invention relates to dendritic cell immune receptor activator, dendritic cell immune receptor activation method, osteoclast formation inhibitor, osteoclast formation inhibitor, dendritic cell differentiation / proliferation inhibitor, dendritic cell
  • the present invention relates to a differentiation / proliferation inhibition method, a cytokine production inhibitor, a cytokine production inhibition method, a treatment method, and a screening method.
  • Dendritic cell receptor immunoreceptor (Dendric Cell Immunoreceptor, hereinafter also referred to as DCIR) is a membrane protein expressed in cells such as dendritic cells that are major antigen-presenting cells, osteoclasts that are bone-resorbing cells, It has a domain (CRD) that recognizes sugar chains in the extracellular region, and an immunosuppressive signaling motif (ITIM) in the cytoplasmic region.
  • the present inventors have succeeded in producing a mouse (Dcir ⁇ / ⁇ mouse) deficient in the DCIR gene first, and that the mouse spontaneously develops autoimmune diseases such as Sjögren's syndrome and attachment inflammation with age. Reported (for example, see Japanese Patent Application Laid-Open Nos.
  • DCIR is thought to play a role in negatively controlling osteoclast formation, dendritic cell differentiation / proliferation and production of inflammatory cytokines. Therefore, if a ligand that specifically acts on DCIR is discovered, it will be an effective means for suppressing or alleviating the symptoms of bone metabolic diseases and autoimmune diseases. In addition, since dendritic cells play a central role in the immune system, therapeutic effects can be expected even in diseases such as allergies. Based on the above findings, the present inventors have found that keratan sulfate-II (KS-II) transmits signals into osteoclasts via SHP-1 as an endogenous ligand that specifically binds to DCIR (for example, , See International Publication No. 2011/105424).
  • KS-II keratan sulfate-II
  • An object of the present invention is to provide a growth inhibitor, a dendritic cell differentiation / proliferation inhibition method, a cytokine production inhibitor, a cytokine production inhibition method, a treatment method, and a screening method.
  • a sugar chain having a structure represented by the following formula as a basic structure (however, sialic acid does not exist at two non-reducing ends of the following structure, and x and y each independently represents 3 or 4)
  • a dendritic cell immune receptor activator comprising a compound having an active ingredient as an active ingredient.
  • a method for activating a dendritic cell immune receptor comprising bringing the dendritic cell immune receptor activator according to ⁇ 1> above into contact with a dendritic cell immune receptor of a cell.
  • An osteoclast formation inhibitor comprising a compound having a sugar chain structure represented by the above formula as an active ingredient.
  • ⁇ 4> A method for inhibiting osteoclast formation, comprising bringing the osteoclast formation inhibitor according to ⁇ 3> above into contact with an osteoclast dendritic cell immune receptor.
  • a dendritic cell differentiation / proliferation inhibitor comprising, as an active ingredient, a compound having a sugar chain structure represented by the above formula.
  • a dendritic cell differentiation / proliferation inhibition method comprising contacting the dendritic cell differentiation / proliferation inhibitor according to ⁇ 5> above with a dendritic cell immunoreceptor of dendritic cells.
  • a cytokine production inhibitor comprising, as an active ingredient, a compound having a sugar chain structure represented by the above formula.
  • a method for suppressing cytokine production comprising bringing the cytokine production inhibitor according to ⁇ 7> above into contact with a dendritic cell immune receptor of dendritic cells.
  • a treatment method comprising administering the dendritic cell immune receptor activator according to ⁇ 1> to a patient having a bone metabolic disease, an autoimmune disease or an allergic disease.
  • Dendritic cell immunoreceptor by measuring the binding of a test substance to dendritic cell immune receptor in the presence of a compound having a sugar chain structure represented by the above formula or using said compound as a control
  • a screening method comprising screening an activator or a dendritic cell immune receptor antagonist.
  • a novel dendritic cell immunoreceptor activator, dendritic cell immunoreceptor activation method, osteoclast formation inhibitor, osteoclast formation inhibitor, dendritic cell differentiation / proliferation inhibitor Dendritic cell differentiation / proliferation inhibition method, cytokine production inhibitor, cytokine production inhibition method, treatment method and screening method are provided.
  • FIG. 5 shows the results of flow cytometry analysis of DCIR mRNA quantitative data during osteoclast formation and DCIR expression in osteoclasts of wild-type mice and Dcir ⁇ / ⁇ mice.
  • the solid line with the peak on the right represents the wild type
  • the solid line with the peak on the right represents the Dcir-/-type
  • the gray area represents the isotype control.
  • Data are representative of 2 or 3 independent tests, error bars represent mean ⁇ standard deviation (triple measurement), * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01. .
  • the data is the result of performing real-time PCR for a predetermined number of days, calculated by the 2- ddCt method, and relative to macrophage data on the second day of culture as 1.
  • Data are representative of 3 or more independent tests, error bars represent mean ⁇ standard deviation (triple measurement). It is a flow cytometry analysis result of DCIR expression on the cell surface of BMM on the 4th day of culture.
  • the blue solid line represents the wild type
  • the red solid line represents the Dcir ⁇ / ⁇ type
  • the gray area represents the isotype control.
  • Data are representative of 3 or more independent trials.
  • FIG. 6 is a diagram (magnification 10 times) showing the degree of osteoclast formation of wild type and Dcir ⁇ / ⁇ . Data are representative of 3 or more independent tests, error bars are mean ⁇ standard deviation (triple measurement), ** P ⁇ 0.01. It is quantitative data of osteoclast mRNA. Data are representative of 2 or 3 independent tests, error bars are mean ⁇ standard deviation (triple measurement), * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01.
  • Tnfsf11 (RANKL) after stimulation of non-enriched osteoblasts cultured in osteogenic medium with VD3 (10 ⁇ 8 M) and PGE2 (10 ⁇ 6 M) or AA (50 ⁇ g / ml) for 24 hours.
  • Tnfsflb (OPG) gene expression was quantified by real-time PCR.
  • Data are representative of 3 or more independent tests, error bars represent mean ⁇ standard deviation (triple measurement). It is a flow cytometry analysis result of the number of osteoclast precursors in 8-week-old wild type mice and Dcir ⁇ / ⁇ mice. Bone marrow cells gated as negative for CD3, B220 and Ter119 are plotted against CD11b and Ly6C.
  • FIG. 4 shows an increase in TRAP-positive mononuclear cells (MNC) in Dcir ⁇ / ⁇ mice immediately before osteoclast fusion (magnification 4 times).
  • MNC TRAP-positive mononuclear cells
  • Non-adherent BM collected from wild-type mice and Dcir-/-mice was cultured for 5 days in the presence of M-CSF with different concentrations and RANKL at 25 ng / ml, and images when TRAP staining was performed ( 4 times) and the results of counting the number of cells with 3 or more nuclei. Data are representative of two independent tests, error bars represent mean ⁇ standard deviation (triple measurement), ** P ⁇ 0.01.
  • Non-adherent BM collected from wild-type mice and Dcir-/-mice was cultured for 5 days in the presence of RANKL at different concentrations and 5 ng / ml M-CSF, and images obtained when TRAP staining was performed ( 4 times) and the results of counting the number of cells with 3 or more nuclei.
  • Data are representative of two independent tests, error bars represent mean ⁇ standard deviation (triple measurement), * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01.
  • FIG. 4 shows that BMM proliferates in response to M-CSF.
  • Data are representative of 3 independent tests, error bars represent mean ⁇ standard deviation (triple measurement), * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01.
  • FIG. 3 is a diagram showing images of TRAP-positive cells (4 ⁇ ) and the number of apoptotic cells, in which osteoclasts were induced from the same number of wild-type BMM and Dcir ⁇ / ⁇ BMM. The part marked with an asterisk in the image represents apoptotic cells.
  • Data are representative of two independent tests, error bars represent mean ⁇ standard deviation (triple measurement).
  • FIG. 5 shows that the same number of wild-type BMM and Dcir ⁇ / ⁇ BMM were induced in osteoclasts in the presence of 5 ng / ml M-SCF and RANKL at different concentrations.
  • FIG. 3 shows that Akt signals in response to M-CSF and RANKL in Bcir of Dcir ⁇ / ⁇ mice are enhanced. The lower number in each lane indicates the relative signal concentration of phosphorylated kinase. Data are representative of 3 or more independent trials. It is the bone structure analysis result of the tibia of an 8 week-old wild type mouse
  • FIG. 8 shows micro CT images and bone parameter measurement results of femur trabeculae of 8-week-old wild type mice and Dcir ⁇ / ⁇ mice. Data are representative of two or more independent tests, error bars represent mean ⁇ standard error (4-6 replicates), * P ⁇ 0.05. It is a figure which shows the mode of bone formation of the wild type mouse
  • Error bars represent mean value ⁇ standard error (4 to 6 measurements), and * P ⁇ 0.05 and ** P ⁇ 0.01. It is a flow cytometry analysis result of IFN- ⁇ positive T cells in peripheral blood. Data are representative of 3 independent trials. It is a flow cytometry analysis result of IFN- ⁇ positive T cells in lymph nodes. Data are representative of 3 independent trials. Error bars represent mean value ⁇ standard deviation (4-6 replicate measurements), * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01. Serum concentrations of IFN- ⁇ in 12-week-old wild-type mice and Dcir ⁇ / ⁇ mice (each 10 mice) were analyzed by ELISA. The P value of wild type and Dcir-/-type by unpaired two-sided t-test was 0.10.
  • Data are based on 3 independent trials.
  • the black circles in the figure represent the data for each wild type individual, and the white circles represent the data for each Dcir-/-type individual.
  • Data are representative of 3 independent trials.
  • the effect of external addition of IFN- ⁇ on osteoblast formation is shown.
  • the image of the alizarin red stained area was analyzed with ImageJ.
  • Data are representative of 3 or more independent tests, error bars represent mean ⁇ standard deviation (triple measurement), * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01. It shows a state of expression of osteogenesis-related genes after 14 days of culture in the presence of IFN- ⁇ .
  • Data are representative of 3 or more independent tests, error bars represent mean ⁇ standard deviation (triple measurement), * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01.
  • FIG. 3 shows that binding of DCIR-Fc to asialotransferrin is CRD-dependent, but binding to heparin is CRD-independent.
  • the results of DCIR-Fc and DCIR-Fc mutants (E197A-Fc, S199A-Fc, E197A / S199A-Fc) and the negative control Fc are shown. It is a result of a sugar chain microassay showing that DCIR-Fc binds to NA2.
  • Data are representative of 3 or more independent tests, error bars represent mean ⁇ standard deviation (triple measurement), * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01. It is a graph which shows that osteoclast formation is suppressed by NA2 addition.
  • Data are representative of 3 or more independent tests, error bars represent mean ⁇ standard deviation (triple measurement), * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01. It is a figure which shows the influence with respect to the signal through M-CSF and RANKL of NA2 when wild-type BMM is pre-treated with NA2 and stimulated with M-CSF or RANKL. It is a figure which shows that NA2 specifically controls the signal pathway by M-CSF and RANKL via DCIR.
  • Dcir ⁇ / ⁇ BMM was treated with NA2 (1 ⁇ g / ml) for 6 hours at 37 ° C. in serum free medium before stimulation with M-CSF and RANKL. Thereafter, stimulation with M-CSF (20 ng / ml) or RANKL (100 ng / ml) was given for the time indicated in the figure. Data are representative of 3 independent trials. It is a figure which shows the production amount of the inflammatory cytokine when the stimulation by LPS is given to the bone marrow-derived dendritic cells in the presence or absence of NA2.
  • a numerical range indicated by using “to” indicates a range including the numerical values described before and after “to” as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • “Dendritic cell immunoreceptor activation” means that the dendritic cell immunoreceptor activator of the present invention is brought into contact with the dendritic cell immune receptor activator of the present invention. Means that the activity of the dendritic cell immunoreceptor is increased as compared with the case where the dendritic cell immunoreceptor is not contacted.
  • “Inhibition of osteoclast formation” means that the osteoclast formation inhibitor of the present invention is brought into contact with the dendritic cell immune receptor, and the osteoclast formation inhibitor of the present invention is brought into contact with the dendritic cell immune receptor. It means that the formation of osteoclasts is suppressed as compared with the case where it is not allowed to occur. “Suppression of cytokine production” means that the cytokine production inhibitor of the present invention is brought into contact with the dendritic cell immune receptor, and the cytokine production inhibitor of the present invention is not brought into contact with the dendritic cell immune receptor. This means that production is suppressed.
  • “Inhibition of dendritic cell differentiation / proliferation” means that the dendritic cell differentiation / proliferation inhibitor of the present invention is dendritic by contacting the dendritic cell differentiation / proliferation inhibitor of the present invention with a dendritic cell immune receptor. This means that dendritic cell formation is inhibited more than when not in contact with cellular immune receptors.
  • treatment includes, in addition to eliminating symptoms of a disease to be treated, suppression of severity, reduction or alleviation of symptoms, and the like.
  • the dendritic cell immune receptor activator of the present invention is a sugar chain having a structure represented by the following formula as a basic structure (however, sialic acid does not exist at the two non-reducing ends of the following structure, and x and y represents a compound having 3 or 4 (hereinafter also referred to as a specific sugar chain-containing compound) as an active ingredient.
  • a compound having such a structure is a ligand that specifically acts on DCIR has not been reported so far.
  • the specific sugar chain-containing compound has a sugar chain having a structure represented by the above formula as a basic structure
  • the structure is not limited as long as the effect of the present invention is achieved. Therefore, it may have one branched chain at any site of the above basic structure or fucose may be added, and a compound having a sugar chain having such a structure is also included in the scope of the present invention. . Provided that no sialic acid is present at the two non-reducing ends of the structure. Examples of such sugar chain structures include the following.
  • the method for producing the specific sugar chain-containing compound is not particularly limited, and examples thereof include collection from a living body, production by a genetic engineering method, and production by an organic synthetic chemical method.
  • the structure or type is not limited as long as the effect of the present invention is achieved.
  • a compound having a structure that is the same as or similar to the above, or a compound that is not derived from a living body is preferable.
  • the biological compound include proteins (including peptides).
  • the specific sugar chain-containing compound is a protein
  • examples where the specific sugar chain-containing compound is a protein include those in which the reducing end of the sugar chain structure is bound to transferrin, acidic glycoprotein, fetuin, chicken-derived egg white protein, and the like.
  • the specific sugar chain-containing compound is a compound not derived from a living body, the reducing end of the sugar chain structure is bonded to polyacrylamide (PAA), paranitrophenylphenol (pNP), aminopyridine (PA), etc. Can be mentioned.
  • PAA polyacrylamide
  • pNP paranitrophenylphenol
  • PA aminopyridine
  • the specific sugar chain-containing compound may be subjected to various modifications depending on the application.
  • multimerization carriers such as micro beads and porcelain beads, proteins such as BSA and HSA, etc., including peptides
  • amino group modification biotinylation, myristoylation, palmitoylation, acetylation, maleimidation, etc.
  • Carboxy group modification (amidation, esterification, etc.)
  • thiol group modification farnesylation, geranylation, methylation, palmitoylation, etc.
  • hydroxyl group modification phosphorylation, sulfate, octanoylation, palmitoylation, palmitoleylation, Acetylation etc.
  • fluorescent labeling PEGylation, unnatural amino acid, D-amino acid, introduction of various spacers, etc.
  • the dendritic cell immune receptor activator of the present invention may contain components other than the specific sugar chain-containing compound depending on the use mode.
  • components other than the specific sugar chain-containing compound include a medium used for preparing a dendritic cell immune receptor activator and a pharmaceutical additive.
  • Additives for formulation include excipients, disintegrants, binders, lubricants, surfactants, buffers, solubilizers, stabilizers, tonicity agents, suspending agents, emulsifiers, buffers And solvents.
  • the form of the dendritic cell immune receptor activator of the present invention is not particularly limited, and can be selected according to the use.
  • forms suitable for oral administration such as tablets, granules, powders, capsules, suspensions, syrups, emulsions, limonades, ampoules for injection, freeze-dried powder for injection, dry powder for pulmonary administration Etc.
  • the dendritic cell immune receptor activation method of the present invention includes contacting the dendritic cell immune receptor activator of the present invention with a dendritic cell immune receptor of a cell.
  • the method for bringing the dendritic cell immunoreceptor activator into contact with cells is not particularly limited, and examples thereof include surgical treatment such as oral administration, intravenous administration, and indwelling.
  • the amount of the dendritic cell immunoreceptor activator to be contacted with the dendritic cell immunoreceptor is not particularly limited, and includes the state of activity of the dendritic cell immune receptor, the intended degree of activation, and a specific sugar chain-containing compound. It can be selected according to the type and amount of other components used.
  • DCIR dendritic cell immunoreceptor activation method of the present invention
  • the biological mechanism negatively controlled by DCIR when the biological mechanism negatively controlled by DCIR is excessive for some reason, DCIR is produced.
  • the biological mechanism is suppressed by activating it.
  • Biological mechanisms negatively controlled by DCIR include osteoclast formation, osteoclast proliferation response, cytokine production, dendritic cell proliferation response, dendritic cell function control, monocyte response, neutrophil function Control etc. are mentioned. Therefore, according to the dendritic cell immune receptor activation method of the present invention, osteoclast formation, dendritic cell differentiation / proliferation, cytokine production, and the like can be achieved.
  • the type of cells having DCIR activated by the dendritic cell immunoreceptor activation method of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention are obtained. Examples thereof include dendritic cells, osteoclasts, macrophages, monocytes, neutrophils and the like.
  • the osteoclast formation inhibitor of the present invention contains a specific sugar chain-containing compound as an active ingredient.
  • the specific sugar chain-containing compound contained as an active ingredient acts as a ligand that activates DCIR.
  • DCIR plays a role in negatively controlling osteoclast formation. Therefore, osteoclast formation can be suppressed by bringing the osteoclast formation inhibitor of the present invention into contact with DCIR to activate DCIR.
  • osteoclast formation inhibitor of the present invention and the specific sugar chain-containing compound contained as an active ingredient include the dendritic cell immune receptor activator of the present invention and the specific sugar chain-containing compound contained as an active ingredient. This can be the same as the above-described specific embodiment.
  • the osteoclast formation inhibitory method of the present invention includes contacting the osteoclast formation inhibitor of the present invention with an osteoclast dendritic cell immune receptor.
  • the method for bringing the osteoclast formation inhibitor into contact with the dendritic cell immune receptor is not particularly limited, and examples thereof include oral administration, intravenous administration, and surgical treatment such as indwelling.
  • the amount of osteoclast formation inhibitor to be brought into contact with the dendritic cell immune receptor is not particularly limited, and is used in combination with the state of osteoclast formation, the degree of intentional suppression of osteoclast formation, and a specific sugar chain-containing compound. Can be selected according to the type and amount of the components.
  • the balance between bone formation by osteoblasts and bone resorption by osteoclasts is some reason. If the bone resorption by osteoclasts is relatively dominant, the osteoclast formation is intentionally suppressed to restore balance and maintain bone homeostasis. .
  • the dendritic cell differentiation / proliferation inhibitor of the present invention contains a specific sugar chain-containing compound as an active ingredient.
  • the specific sugar chain-containing compound contained as an active ingredient acts as a ligand that activates DCIR.
  • DCIR plays a role in negatively controlling dendritic cell differentiation / proliferation. Therefore, the dendritic cell differentiation / proliferation can be inhibited by bringing the dendritic cell differentiation / proliferation inhibitor of the present invention into contact with DCIR to activate DCIR.
  • dendritic cell differentiation / proliferation inhibitor of the present invention and the specific sugar chain-containing compound contained as an active ingredient include the dendritic cell immune receptor activator of the present invention and the specific sugar contained as an active ingredient.
  • specific examples of the chain-containing compound can be the same as those described above.
  • the dendritic cell differentiation / proliferation inhibition method of the present invention includes contacting the dendritic cell differentiation / proliferation inhibitor of the present invention with a dendritic cell immunoreceptor of the dendritic cell.
  • the method for contacting the dendritic cell differentiation / proliferation inhibitor with the dendritic cell immune receptor is not particularly limited, and examples thereof include oral administration, intravenous administration, and surgical treatment such as indwelling.
  • the amount of the dendritic cell differentiation / proliferation inhibitor to be contacted with the dendritic cell immunoreceptor is not particularly limited, and the state of dendritic cell differentiation / proliferation and the degree of inhibition of the intended dendritic cell differentiation / proliferation It can be selected according to.
  • the cytokine production inhibitor of the present invention contains a specific sugar chain-containing compound as an active ingredient.
  • the specific sugar chain-containing compound contained as an active ingredient acts as a ligand that activates DCIR.
  • DCIR plays a role in negatively controlling the production of certain cytokines. Therefore, cytokine production can be suppressed by bringing the cytokine production inhibitor of the present invention into contact with DCIR to activate DCIR.
  • Specific embodiments of the cytokine production inhibitor of the present invention and the specific sugar chain-containing compound contained as an active ingredient are specific examples of the dendritic cell immune receptor activator of the present invention and the specific sugar chain-containing compound contained as an active ingredient. It can be the same as that mentioned above as a specific aspect.
  • the method for inhibiting cytokine production of the present invention includes contacting the cytokine production inhibitor of the present invention with a dendritic cell immune receptor of dendritic cells.
  • the method for bringing the cytokine production inhibitor into contact with the dendritic cell immune receptor is not particularly limited, and examples thereof include surgical treatment such as oral administration, intravenous administration, and indwelling.
  • the amount of cytokine production inhibitor to be brought into contact with the dendritic cell immune receptor is not particularly limited, and the state of cytokine production, the degree of intended suppression of cytokine production, and the type and amount of other components used with the specific sugar chain-containing compound It can be selected according to etc.
  • the kind of cytokine whose production is suppressed by the method for suppressing cytokine production of the present invention is not particularly limited as long as the effect of the present invention is obtained.
  • Examples include IFN- ⁇ , IL-6, IL-12, IL-23, IL-1, IL-17, and IL-17F.
  • the treatment method of the present invention comprises administering the dendritic cell immune receptor activator of the present invention to a patient with bone metabolic disease, autoimmune disease or allergic disease.
  • the dendritic cell immune receptor activator of the present invention when brought into contact with DCIR, the specific sugar chain-containing compound contained as an active ingredient acts as a ligand for activating DCIR.
  • a biological mechanism that is negatively controlled by DCIR can be intentionally suppressed. Examples of such biological mechanisms include osteoclast formation and cytokine production. Therefore, the therapeutic method of the present invention is a method for treating various bone metabolic diseases associated with excessive bone resorption, and various autoimmune diseases or allergic diseases accompanied by excessive immune reaction or inflammation due to the production of inflammatory cytokines.
  • the specific sugar chain-containing compound acts in a DCIR-specific manner to suppress the functions of dendritic cells, osteoclasts, etc., it is possible to provide a therapeutic method that can limit the action point of medicinal effect and has few side effects.
  • Examples of the bone metabolic diseases include osteoarthritis, spondyloarthropathy, osteoporosis, Paget's disease, osteoarthritis, marble bone disease, and periodontal disease.
  • Examples of autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, Guillain-Barre syndrome, Goodpasture syndrome, type I diabetes, thyroiditis, ulcerative colitis, Sjogren's syndrome, and the like.
  • Examples of allergic diseases include bronchial asthma, atopic dermatitis, conjunctivitis, food allergy, anaphylaxis, contact dermatitis, allergic rhinitis, chronic glomerulonephritis and the like.
  • the method of administering the dendritic cell immunoreceptor activator of the present invention to a patient is not particularly limited, and examples thereof include surgical treatment such as oral administration, intravenous administration, and indwelling.
  • the amount of dendritic cell immunoreceptor activation administered to the patient is not particularly limited, and the type and condition of symptoms, the age and physique of the patient, the state of DCIR activity, the degree of intended DCIR activation, and the specific sugar chain content It can be selected according to the type and amount of other components used together with the compound.
  • the specific mode of the dendritic cell immunoreceptor activator administered to a patient in the treatment method of the present invention and the specific sugar chain-containing compound contained as an active ingredient is the dendritic cell immunoreceptor activator of the present invention.
  • the specific sugar chain-containing compound contained as an active ingredient can be the same as described above as a specific embodiment.
  • the screening method of the present invention measures the binding of a test substance to a dendritic cell immune receptor in the presence of a specific sugar chain-containing compound or using a specific sugar chain-containing compound as a control, and dendritic cell immune receptor activity. Screening for an agent or dendritic cell immune receptor antagonist.
  • the test substance is a DCIR activator or Whether it is a DCIR antagonist can be determined.
  • Measurement of binding to DCIR can be performed in vitro or in vivo. When screening in vivo, the binding may be compared using as an index the amount of osteoclast formation, the degree of dendritic cell differentiation / proliferation, the amount of cytokine production, and the like.
  • ⁇ Test Example 1 M-CSF-induced bone marrow formed at the mRNA and protein levels in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and nuclear factor ⁇ B ligand receptor activator (RANKL), factors involved in osteoclast differentiation DCIR was expressed in macrophage cells (BMM) and osteoclasts (FIGS. 1-3). Gene expression increased with osteoclast maturation. DCIR was detected by CD11b positive cells (OsteoMacs) but not by enriched osteoblasts (FIG. 4).
  • M-CSF macrophage colony-stimulating factor
  • RNKL nuclear factor ⁇ B ligand receptor activator
  • M-CSF is known to be involved in macrophage adhesion and osteoclast survival, but changes in Dcir-/-BMM adhesion activity and long-term cultured Dcir-/-osteoclast apoptosis was not seen (FIGS. 21-23). This means that DCIR-mediated signal negatively regulates proliferation induced by M-CSF.
  • IFN- ⁇ production was remarkable in peripheral blood, brachial lymph nodes, and axillary lymph nodes. It can be seen that IFN- ⁇ production is not significant in the mesenteric lymph nodes, and that the serum concentration of IFN- ⁇ in Dcir ⁇ / ⁇ mice tends to be higher than in wild type mice, and the cytokine environment of Dcir ⁇ / ⁇ mice It was shown that it was inclined toward the IFN- ⁇ environment (FIGS. 30 to 32). These results led to the hypothesis that IFN- ⁇ is a powerful stimulator of osteoblast formation.
  • IFN- ⁇ acts on osteoblasts was supported by the bone structure of Ifn- ⁇ and Dcir double-deficient mice and Ifn- ⁇ -deficient mice being equivalent to that of wild-type mice. . That is, it was suggested that IFN- ⁇ , which is considered to be an osteoclast inhibitor, does not act on osteoclasts in a steady state but may act on osteoblasts (FIG. 35). Overall, increased bone formation in Dcir-/-mice occurs due to systemic production of IFN- ⁇ , indicating that the net balance of IFN- ⁇ in vivo leans toward bone formation.
  • Example 1 Ligand binding is required for the receptor to initiate the signal cascade and exert its biological function. Since the in vitro culture system of osteoclast formation exists only in BMM, it was speculated that the ligand of DCIR is expressed in BMM or osteoclasts. Some macrophages and osteoclasts were positive for DCIR-Fc staining that occurred when fusion between the extracellular domain of DCIR and the Fc region of human IgG2 occurred, but the binding was a change in the amino acid of CRD Decreased by DCIR E197A / S199A-Fc, which is a DCIR-Fc variant that gives rise to.
  • DCIR-Fc binding was reduced by EDTA and trypsin. This indicates that DCIR interacts with glycoproteins in macrophages and osteoclasts in a CRD-dependent or Ca 2+ -dependent manner (FIG. 36).
  • NA2 is a functional DCIR ligand that suppresses osteoclast formation by negatively controlling the M-CSF signal cascade and the RANKL signal cascade.
  • NA2 is a ligand that specifically and functionally binds to DCIR.
  • Dendritic cells were prepared by induction of Flt3L differentiation as follows.
  • the bone marrow cells of the femur of wild type mice were removed, and the erythrocytes were placed in a hemolysis buffer (140 mM NH 4 Cl and 17 mM Tris-HCl, pH 7.2) and placed on ice for 10 minutes.
  • Cells were seeded in a medium containing 10% FBS, antibiotic mixture, essential amino acid, 2-mercaptoethanol in a well of 100 ng / ml human Flt3L recombinant to a million per well in a 24-well plate. .
  • the obtained dendritic cells were activated with an agonist reagent (LPS) in the presence or absence of 1 ⁇ g / ml NA2 for 24 hours.
  • LPS agonist reagent
  • the supernatant was collected and the amount of inflammatory cytokines (IL-6 and p40) was examined by ELISA.
  • IL-6 and p40 inflammatory cytokines
  • the two bars on the left represent the amount of inflammatory cytokine produced when LPS was not stimulated
  • the two bars on the right represent LPS-stimulated production
  • the black bar represents the production when stimulated in the presence of NA2. Indicates the amount.
  • mice All mice were bred at the University of Tokyo or Tokyo University of Science in accordance with the guidelines of the Zoological Society of Japan, and all experiments were approved by the University of Tokyo Institute of Medical Science or the Animal Science Committee of Tokyo University of Science. .
  • the base sequence of the mouse DCIR gene is Gene ID: Clec4a2, NCBI Accession No. This corresponds to the sequence of bases 273 to 1061 in NM001170332.
  • ⁇ -MEM ⁇ -minimum essential medium
  • penicillin 100 units / ml
  • streptomycin 100 ⁇ g / ml
  • 10% heat-inactivated fetal bovine serum were added to isolate BM cells.
  • Red blood cells were disrupted with lysis buffer (140 mM NH 4 Cl and 17 mM Tris-HCl, pH 7.2) on ice for 10 minutes and pre-incubated for 1 hour in 100 mm diameter dishes.
  • Non-adherent cells were collected and seeded with 50,000 cells per well in a 96-well plate in the presence of 20 ng / ml human M-CSF recombinant (R & D Systems) for 2 days Oita.
  • Cells grown by M-CSF were used as bone marrow-derived macrophages (BMM).
  • BMM was further cultured in the presence of 20 ng / ml M-CSF and 100 ng / ml soluble human RANKL recombinant (Oriental Yeast Co., Ltd.), and the medium was changed every 2 days. .
  • BMM was cultured for 6 days in the presence of 20 ng / ml M-CSF, and the medium was changed every 2 days.
  • BMM cultured in 100 mm dishes were dissociated with Cell Dissolution Solution Non-zymatic 1 ⁇ (Sigma-Aldrich) and the same number of BMM was reseeded to induce osteoclast formation.
  • Adherent cells were fixed with 10% formalin for 3 minutes and further fixed with fixation buffer (50% ethanol and 50% acetone) for 1 minute. The fixed cells were stained with naphthol AS-MX phosphate (Nacalai Tesque) and Fast Red (Nacalai Tesque) for 10-15 minutes at room temperature and washed with water for 3 minutes. The number of TRAP-positive cells having 3 or 10 cell nuclei as multinucleated osteoclasts was counted.
  • Mouse DCIR cDNA was amplified using sense: 5'-cgggaccccaccgggcttcagaaatacacttatg (SEQ ID NO: 1) and antisense: 5'-cggatattctataagtttttttttttca (SEQ ID NO: 2) as primers.
  • the product obtained by PCR was cloned into pMXs-IRES-Puro (provided by Professor Toshio Kitamura of the University of Tokyo) at the BamHI and EcoRI sites.
  • the pMXs vector was isolated from E. coli (DH5 ⁇ ).
  • the DCIR Y / F mutant was produced using KOD-Plus-Mutageness Kit (Toyobo Co., Ltd.). That is, forward primer for substituting phenylalanine for tyrosine in ITIM of DCIR: 5′-cactTttgcagaagtgagattcaagaatgaatc (SEQ ID NO: 3, capital letter T is adenosine) and reverse primer: 5′-atttgagagcccatggtgggggattggtgcincctggtcin ) Designed. Inverse PCR was performed using the pMXs vector as a template, and The methylated DNA of the E. coli cell line was digested with digestible DpnI.
  • the undigested PCR product was self-flyed at 16 degrees for 1 hour using T4 polynucleotide kinase and ligase.
  • the plat-E packaging cell line (provided by Professor Toshio Kitamura of the University of Tokyo) was cultured in 10% FBS ⁇ -MEM and split at a ratio of 1: 5 every other day.
  • Retroviral vectors were introduced into Plat-E cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). After 8 hours of incubation, the medium was changed and incubated for an additional 24 hours. Retroviral supernatant was collected and frozen at ⁇ 80 ° C. until use.
  • non-adherent bone marrow cells were cultured in 100 ⁇ l medium containing 20 ⁇ l retrovirus supernatant and the medium was changed every other day.
  • BMM was recovered using Cell Dissolution Solution Non-ezymatic 1 ⁇ (Sigma-Aldrich) and placed in each well of a 96-well plate in the presence of M-CSF with varying concentrations. After 2-3 hours, 1.0 ⁇ Ci [3H] thymidine (PerkinElmer) was added and incubated for an additional 48 hours at 37 ° C. Cells were passed through a glass fiber filter using a Skatron microplate washer supernatant collection system (Molecular Device). The introduction of [ 3 H] thymidine into DNA was confirmed by a MicroBeta microplate counter system (PerkinElmer).
  • FACS analysis Blood cell lysis of BM cells and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) was performed on ice using hemolysis buffer (140 mM NH 4 Cl and 17 mM Tris-HCl, pH 7.2). BMM and PBS were separated and washed with FACS buffer (PBS containing 2% FBS) to remove serum components. The Fc receptor of these cells was blocked with 2.4G2, an Fc receptor blocker, at 4 degrees for 10 minutes. The cells were then washed twice with FACS buffer and incubated with fluorescently labeled antibody for 30 minutes on ice.
  • hemolysis buffer 140 mM NH 4 Cl and 17 mM Tris-HCl, pH 7.2
  • FACS buffer PBS containing 2% FBS
  • APC- or PE-CD11b BioLegend
  • FITC-Ly6c BioLegend
  • APC-c-Fms BioLegend
  • biotin-RANK eBioscience
  • PE-Clec4a R & D Systems
  • FITC-CD3, Pacific Blue-CD4, APC-CD8, BV510-CD11b, and PE-IFN- ⁇ were used.
  • DCIR-Fc-protein DCIR-Fc-protein variant, or Fc-protein to form a protein complex consisting of Fc-protein for detection of DCIR ligand and anti-IgG antibody Of FITC-labeled anti-human IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) and a buffer containing calcium and magnesium (TBS containing 2 mM CaCl 2 , 2 mM MgCl 2 and 0.5% BSA) for 15 minutes at room temperature. Macrophages and osteoclasts were stained with the above protein complex for 1 hour at 4 ° C. and washed with Ca 2+ / Mg 2+ buffer.
  • TBS buffer containing calcium and magnesium
  • Flow cytometry was performed using FACSCanto II (Becton Dickinson) and analyzed using Flowjo software (Tree Star).
  • FACSCanto II Becton Dickinson
  • Flowjo software Te Star
  • the cells were first stained with 2.4G2, and then the surface antigen before fixation was stained with FITC-CD3.
  • immobilization / permeabilization buffer eBioscience
  • the immobilization / permeabilization buffer was decanted and washed twice with FACS buffer containing 0.1% saponin. These cells were stained with primary antibodies for surface antigens and intracellular molecules and diluted with 0.1% saponin buffer.
  • Quantification was performed using a CFX384 TM real-time system (Bio-Rad Laboratories, Inc.). The cycle number was 95 ° C for 1 minute in the first cycle, and the subsequent 44 cycles were 95 ° C for 3 seconds / 60 ° C for 30 seconds.
  • DCIR sense 5'-cctggtgattacttatgctgtgtgt-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • antisense 5'-gtcagaagagccttgtttccttc-3' (SEQ ID NO: 6)
  • GAPDH sense 5'-ttcaccaccgagga-3 (SEQ ID NO: 5)
  • Antisense 5′-ggcatggactgtgtgtcatga-3 ′ (SEQ ID NO: 8) was used.
  • the final primer concentration was 400 nM.
  • GAPDH was used as an internal housekeeping gene.
  • the target gene and housekeeping gene were simultaneously quantified in one plate using a water sample as a negative reference.
  • RNA quality and initial quantity between samples were normalized with GAPDH.
  • sense 5′-catttccccttactccccccgg-3 ′ (SEQ ID NO: 9)
  • antisense 5′-gcatgagtgtccagagacccc-3 ′ (SEQ ID NO: 9) 10) was used to amplify the 686 pb product, and the PCR reaction was performed for 30 cycles. 10 seconds at 98 ° C. Le, 30 seconds at 55 ° C., was used for one minute went. GAPDH as an internal standard at 72 ° C..
  • NP-40 solution 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , proteinase inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific) and phosphatase inhibitor cocktail (Roche)).
  • a lysate was obtained. Lysates were clarified by centrifuging on ice for 10 minutes and centrifuging at 15,000 rpm for 10 minutes. Equal volumes of lysate samples were separated on an SDS-polyacrylamide gel at 230 V for 30 minutes. The gel was electrically transferred onto the PVDF membrane at a constant current of 230 mA and a semi-dry system (Bio-Rad Laboratories, Inc.) in 25 minutes per membrane.
  • the PVDF membrane was blocked at room temperature for 1 hour in 5% BSA (Sigma-Aldrich) dissolved in TBS containing 5% Tween 20, and incubated with the primary antibody at 4 ° C overnight, followed by HRP-labeled secondary antibody. Probed with.
  • the PVDF membrane visualized the protein signal using ECL Prime Western Blotting Detection System (GE Healthcare).
  • cDNA having amino acid sequences 70 to 238 covering the extracellular domain (EC) of mouse DCIR was subcloned into the pFUSE-hIgG2-Fc2 vector (Invitrogen) at the Bgl II site.
  • the cDNA encoding EC was prepared using sense: 5′-ataagatctcaaaaagtactctcaactcttt-3 ′ (SEQ ID NO: 11) and antisense: 5′-ataagatcttaagttttttttttcatc-3 ′ (SEQ ID NO: 12) as primers.
  • a site-specific mutant of the CRD domain in which glutamic acid and serine were substituted with alanine was prepared using the KOD-Plus-Mutageness kit (Toyobo Co., Ltd.). The following were used as primers.
  • Plasmid vectors for obtaining DCIR-Fc (EC of mDCIR), DCIR-Fc mutant (inactive form of CRD domain), and Fc-protein (immunoglobulin constant region) were prepared. Subsequently, these plasmids were introduced into HEK293T cells using Lipofectamine LTX (Invitrogen), and the cells were incubated with Opti-MEM (Invitrogen) for 15 days. The medium was changed every 3 days. The Fc-chimeric protein was purified from the recovered supernatant by affinity chromatography using Protein A-Sepharose (GE Healthcare).
  • BMM cultured for 6 days was collected with Cell Dissolution Solution Non-zymatic 1 ⁇ (Sigma-Aldrich) and resuspended in TSA buffer (TBS containing 2 mM CaCl 2 , 2 mM MgCl 2 and 0.5% BSA). It was. The BMM was then treated with 0.5 ⁇ l neuraminidase (Roche) per 100,000 cells for 30 minutes at 37 ° C. Thereafter, the cells were washed with TSA buffer and FACS analysis was performed.
  • osteoclasts were induced from non-adherent BM cells in the presence of 1 ⁇ l neuraminidase (Roche). Neuraminidase was replenished when the medium was changed every other day.
  • Non-decalcified bone tissue is placed in methyl benzoate for 15 minutes to facilitate the penetration of glycol methacrylate (GMA) into the tissue, then immersed in GMA (4 ° C.) containing 5% methyl benzoate for 2 hours. Changed three times. The bone tissue was then embedded in GMA. A 3 ⁇ m-thick tibia fragment was prepared using a microtome (Sakura Finetech Japan Co., Ltd.), and fluorescence in the calcification front was detected.
  • GMA glycol methacrylate
  • calcified surface calcified surface / bone surface [MS] / [BS];%), bone calcification rate ([MAR]; ⁇ m / day), bone formation rate ( [BFR] / [Bs]; ⁇ m 3 / ⁇ m 2 / day) was examined with an image analyzer (System supply) at a magnification of 400 times.
  • Histomorphometric analysis of mouse tibia was performed at Kureha Analysis Center. Wild-type and Dcir ⁇ / ⁇ mouse bones were removed from 5-6 mice per group of 8 week old mice and fixed with 70% ethanol. In order to measure histomorphometric parameters of bone structure, femoral tissue fragments embedded in 3 ⁇ m thick GMA were stained with toluidine blue. The columnar bone parameter was defined as the area of secondary cancellous bone having a width of 1.05 mm in the distal direction from a point separated by 0.3 mm from the growth plate. The columnar bone at the metaphysis was observed with a HistometryRT CAMERA.
  • osteoclasts [Oc.N] / 100 mm
  • osteoclast surface area [Oc.S] / [BS];%) have one or more nuclei and form resorption pits on the columnar bone surface. Cells were counted as osteoclasts. Bone remodeling parameters including osteoblast count ([Ob.N] / 100 mm) and osteoblast surface area ([Ob.S] / [BS];%) were measured in cross sections stained with toluidine blue.
  • Tb.Sp 1 / Tb.N ⁇ Tb.Th.
  • Tb.Spac 1 / Tb.N
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • phorbol myristate acetate final concentration: 500 ng / ml
  • ionomycin final concentration: 50 ng / ml
  • brefeldin A final concentration: 10 ⁇ g / ml
  • Calvarial cells were prepared by continuous digestion and routine methods. That is, the calvaria was removed from a newborn mouse 1 to 2 days old and the adhesive mesenchymal tissue was removed. This calvaria was treated with a decomposition solution containing 0.1% collagenase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 0.1% dispase (Roche Diagnostics Inc.) for 10 minutes at 37 ° C. with stirring. A first digestion was performed. The solution containing debris was discarded, and the remaining calvaria was further digested with the same decomposition solution at 37 ° C. for 1 hour.
  • a decomposition solution containing 0.1% collagenase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 0.1% dispase (Roche Diagnostics Inc.) for 10 minutes at 37 ° C. with stirring. A first digestion was performed. The solution containing debris was discarded, and the remaining calvaria was further digested with the same decomposition solution at 37 ° C. for 1 hour.
  • the isolated cells were suspended in ⁇ -MEM (10% FCS, penicillin 100 units / ml, streptomycin 100 ⁇ g / ml) and seeded in a 12-well plate at a concentration of 200,000 per well. After culturing for 2 days, the cells were cultured in osteogenic medium (10% FBS, 50 ⁇ g / ml ascorbic acid (Sigma-Aldrich), 10 mM ⁇ -glycerophosphate (Calbiochem) and ⁇ -MEM supplemented with antibiotics) for 14 days or Incubated for 21 days. The medium was changed every 3 days.
  • Mouse osteoblasts were cultured and differentiated as described above. Primary calvarial cells were cultured in the presence of mouse IFN- ⁇ recombinant (PeproTech). IFN- ⁇ was added every time the osteogenic medium was changed.
  • Osteoblasts were prepared by culturing in 100 mm dishes for 5 days by the method described above. The osteoblasts were collected enzymatically and 20,000 cells per well were replated on Osteo Assay plates (Corning) in the presence of M-CSF and RANKL. After 3 days, cells were removed by ultrasonic disruption in 1M ammonia solution for 30 seconds. An image of the whole surface of the well coated with calcium phosphate was taken into a microscope (Keyence Corporation), and the area of the absorbed region was analyzed with ImageJ.
  • a 96-well plate was coated with 10 mg / ml fibronectin (Sigma-Aldrich) and placed at 4 ° C. overnight. The wells were washed twice with PBS, and 50,000 BMMs cultured for 2 days were inoculated with M-CSF (20 ng / ml) or without M-CSF and allowed to pass for 2 minutes, 5 minutes, or 10 minutes. The cells were then washed twice with DMEM, fixed with methanol for 2 minutes, and stained with 0.5% distilled water of crystal violet. After washing 5 times with distilled water, 100 ml of 1% SDS was added to each well to solubilize the dye, and the absorbance at 595 nm was measured.
  • Tnfsf11 (RANKL) Sense: 5′-cagcatcgctctgtttcctgta-3 ′ (SEQ ID NO: 33), Antisense: 5′-ctgcgtttcatggagtctca-3 ′ (SEQ ID NO: 34)
  • Tnfsf11b (OPG) Sense: 5'-ggcgtgtacctgaggatcg-3 '(SEQ ID NO: 35), Antisense: 5'-gagaagaacccattctgacattt-3' (SEQ ID NO: 36) mRNA quality and quantity were normalized using GAPDH.
  • the sugar chain-protein interaction was detected by an evanescent field fluorescence excitation detection system using a sugar chain microarray. That is, 3 spots of a sugar chain probe containing glycoprotein and glycoside-polyacrylamide (PAA) on a microarray grade epoxy activated glass slide (Schott) using a non-contact type microarray printing robot (MicroSys 4000, Genomic Solutions). Fixed one by one. The glass slide was incubated at 25 ° C.
  • PAA glycoprotein and glycoside-polyacrylamide
  • the prepared protein complex was applied to a glass slide at 100 ⁇ l per chamber and incubated at 20 ° C. for 3 hours.
  • the binding was detected with an evanescent field fluorescence excitation scanner (SC-Profiler, GP Bioscience) without going through a washing step.
  • SC-Profiler evanescent field fluorescence excitation scanner
  • the data is Array Pro analyzer Ver. Analysis was performed with 4.5 (Media Cybernetics).
  • the net intensity obtained by subtracting the raw intensity from the background intensity (net intensity) is shown as the average value ⁇ standard deviation of triplicate measurements.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Abstract

　下記式で表される構造を基本構造とする糖鎖（ただし、下記構造の２つの非還元末端にシアル酸が存在せず、ｘ及びｙはそれぞれ独立に３又は４を表す。）を有する化合物を有効成分として含む、樹状細胞免疫受容体活性化剤、樹状細胞免疫受容体活性化方法、破骨細胞形成抑制剤、破骨細胞形成抑制方法、樹状細胞分化・増殖阻害剤、樹状細胞分化・増殖阻害方法、サイトカイン産生抑制剤、サイトカイン産生抑制方法、治療方法及びスクリーニング方法を提供する。

Description

樹状細胞免疫受容体活性化剤、樹状細胞免疫受容体活性化方法、破骨細胞形成抑制剤、破骨細胞形成抑制方法、樹状細胞分化・増殖阻害剤、樹状細胞分化・増殖阻害方法、サイトカイン産生抑制剤、サイトカイン産生抑制方法、治療方法及びスクリーニング方法
　本発明は、樹状細胞免疫受容体活性化剤、樹状細胞免疫受容体活性化方法、破骨細胞形成抑制剤、破骨細胞形成抑制方法、樹状細胞分化・増殖阻害剤、樹状細胞分化・増殖阻害方法、サイトカイン産生抑制剤、サイトカイン産生抑制方法、治療方法及びスクリーニング方法に関する。
　樹状細胞受容体免疫受容体（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下ＤＣＩＲとも称する）は、主要な抗原提示細胞である樹状細胞、骨吸収細胞である破骨細胞等の細胞に発現する膜タンパク質であり、細胞外領域に糖鎖を認識するドメイン（ＣＲＤ）を、細胞質内領域に免疫抑制性シグナル伝達モチーフ（ＩＴＩＭ）をもつ。本発明者らは先にＤＣＩＲの遺伝子を欠損したマウス（Ｄｃｉｒ－／－マウス）の作製に成功し、当該マウスが加齢に伴いシェーグレン症候群や付着部炎といった自己免疫疾患を自然発症することを報告した（例えば、特開２００８－２９３１９号公報及び特開２００９－１９０４４号公報参照）。また、Ｄｃｉｒ－／－マウスは自己免疫疾患モデルであるコラーゲン誘導関節炎において高い感受性を示すが、これは樹状細胞が過剰に増殖分化する為であることを報告した（例えば、Ｆｕｊｉｋａｄｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ.　Ｍｅｄ.，２００８参照）。
　以上のように、ＤＣＩＲは破骨細胞の形成、樹状細胞分化・増殖や炎症性サイトカインの産生を負に制御する役割を果たしていると考えられる。従って、ＤＣＩＲ特異的に作用するリガンドが発見されれば、骨代謝疾患や自己免疫疾患の症状の抑制や緩和の有効な手段となると考えられる。また、樹状細胞は免疫系の中枢を担うことから、アレルギーなどの疾患においても治療効果が期待できる。本発明者らは上記知見に基づき、ケラタン硫酸－ＩＩ（ＫＳ－ＩＩ）がＤＣＩＲ特異的に結合する内在性リガンドとして破骨細胞内へＳＨＰ－１を介してシグナル伝達することを見出した（例えば、国際公開第２０１１／１０５４２４号参照）。
　しかしながら、ＤＣＩＲ特異的に作用するリガンドに関しては未だ報告が少なく、その生体内における作用についても解明されていないことが多い。また、ＤＣＩＲに結合して機能的に作用するリガンドを数多く見出すことは、ＤＣＩＲによって制御されている生体機構の調節が有効となりうる疾病の治療方法の選択の幅を広げる上で有益である。
　本発明者らは上記状況に鑑み、新規な樹状細胞免疫受容体活性化剤、樹状細胞免疫受容体活性化方法、破骨細胞形成抑制剤、破骨細胞形成抑制方法、樹状細胞分化・増殖阻害剤、樹状細胞分化・増殖阻害方法、サイトカイン産生抑制剤、サイトカイン産生抑制方法、治療方法及びスクリーニング方法を提供することを目的とする。
　前記課題を達成するための具体的手段は以下のとおりである。
＜１＞下記式で表される構造を基本構造とする糖鎖（ただし、下記構造の２つの非還元末端にシアル酸が存在せず、ｘ及びｙはそれぞれ独立に３又は４を表す）を有する化合物を有効成分として含む、樹状細胞免疫受容体活性化剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 
＜２＞前記＜１＞に記載の樹状細胞免疫受容体活性化剤を細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む、樹状細胞免疫受容体活性化方法。
＜３＞上記式で表される糖鎖構造を有する化合物を有効成分として含む、破骨細胞形成抑制剤。
＜４＞前記＜３＞に記載の破骨細胞形成抑制剤を破骨細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む、破骨細胞形成抑制方法。
＜５＞上記式で表される糖鎖構造を有する化合物を有効成分として含む、樹状細胞分化・増殖阻害剤。
＜６＞前記＜５＞に記載の樹状細胞分化・増殖阻害剤を樹状細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む、樹状細胞分化・増殖阻害方法。
＜７＞上記式で表される糖鎖構造を有する化合物を有効成分として含む、サイトカイン産生抑制剤。
＜８＞前記＜７＞に記載のサイトカイン産生抑制剤を樹状細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む、サイトカイン産生抑制方法。
＜９＞前記＜１＞に記載の樹状細胞免疫受容体活性化剤を骨代謝疾患、自己免疫疾患又はアレルギー疾患の患者に投与することを含む、治療方法。
＜１０＞上記式で表される糖鎖構造を有する化合物の存在下、又は前記化合物を対照として、被検物質の樹状細胞免疫受容体への結合性を測定し、樹状細胞免疫受容体活性化剤又は樹状細胞免疫受容体拮抗剤をスクリーニングすることを含む、スクリーニング方法。
　本発明によれば、新規な樹状細胞免疫受容体活性化剤、樹状細胞免疫受容体活性化方法、破骨細胞形成抑制剤、破骨細胞形成抑制方法、樹状細胞分化・増殖阻害剤、樹状細胞分化・増殖阻害方法、サイトカイン産生抑制剤、サイトカイン産生抑制方法、治療方法及びスクリーニング方法が提供される。
破骨細胞形成過程におけるＤＣＩＲのｍＲＮＡの定量データと、野生型マウス及びＤｃｉｒ－／－マウスの破骨細胞におけるＤＣＩＲ発現のフローサイトメトリーによる解析結果である。ピークが右側に存在する実線は野生型、ピークが右側に存在する実線はＤｃｉｒ－／－型をそれぞれ表し、グレーの領域はアイソタイプコントロールを表す。データは２回又は３回の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 Ｍ－ＣＳＦの存在下で培養したＢＭＭにおけるＤＣＩＲ発現の状態を示す図である。データは所定の日数リアルタイムＰＣＲを行った結果を２－ｄｄＣｔ法で計算し、培養２日目のマクロファージのデータを１として相対化したものである。データは３回以上の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表す。 培養４日目のＢＭＭの細胞表面におけるＤＣＩＲ発現のフローサイトメトリー解析結果である。青色実線は野生型、赤色実線はＤｃｉｒ－／－型をそれぞれ表し、グレーの領域はアイソタイプコントロールを表す。データは３回以上の独立した試験を代表するものである。 ＣＤ１１ｂ陽性細胞を除去した濃縮（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）骨芽細胞とＣＤ１１ｂ陽性細胞（ＯｓｔｅｏＭａｃｓ）におけるコンベンショナルＰＣＲアッセイの結果、濃縮骨芽細胞ではＤＣＩＲの発現が見られなかったことを示す図である。データは３回の独立した試験を代表するものである。 野生型及びＤｃｉｒ－／－の破骨細胞形成の程度を示す図（倍率１０倍）である。データは３回以上の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）、＊＊Ｐ＜０．０１である。 破骨細胞のｍＲＮＡの定量データである。データは２又は３回の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 ＩＴＩＭを介した破骨細胞形成の阻害の状態を示すデータである。Ｄｃｉｒ－／－マウスの骨髄細胞（ＢＭ）をＤＣＩＲ－ｐＭＸ又はＤＣＩＲＹ７Ｆ－ｐＭＸでインフェクトしている。データは３の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 骨芽細胞と共培養した破骨細胞の形成の状態を示す図である。データは３回以上の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表し、＊＊Ｐ＜０．０１である。 ソートしていない初代骨芽細胞を骨形成培地で１４日培養後にアリザリンレッド染色及びフォン・コッサ染色を行った結果を示す図である。データは３回以上の独立した試験を代表するものである。 濃縮していない骨芽細胞を骨形成培地で培養する前と７日間培養後の遺伝子発現の定量データである。データは３回以上の独立した試験を代表するものである。エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表す。 ビタミンＤ３（ＶＤ３）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、アスコルビン酸（ＡＡ）が骨形成の活性化と分化に及ぼす影響を示す図である。データは、骨形成培地で培養した濃縮していない骨芽細胞をＶＤ３（１０－８Ｍ）とＰＧＥ２（１０－６Ｍ）又はＡＡ（５０μｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した後のＴｎｆｓｆ１１（ＲＡＮＫＬ）及びＴｎｆｓｆ１１ｂ（ＯＰＧ）の遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲで定量した。データは３回以上の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表す。 ８週齢の野生型マウス及びＤｃｉｒ－／－マウスにおける破骨細胞前駆体数のフローサイトメトリー解析結果である。ＣＤ３、Ｂ２２０及びＴｅｒ１１９に対し陰性としてゲートされた骨髄細胞をＣＤ１１ｂ及びＬｙ６Ｃに対してプロットしている。各プロットはマウス３個体の代表的データを示す。データは２回の独立した試験を代表するものである。 破骨細胞前駆体数をＣＤ１１ｂｌｏＬｙ６Ｃｈｉでキャラクタライズした頻度を示す図である。データは２回の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表す。 破骨細胞の融合直前のＤｃｉｒ－／－マウスのＴＲＡＰ陽性単核細胞（ＭＮＣ）が増加することを示す図である（倍率４倍）。データは３回以上の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）表し、＊＊Ｐ＜０．０１である。 同数の野生型ＢＭＭとＤｃｉｒ－／－ＢＭＭをＭ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの存在下で破骨細胞の形成を誘導し、ＴＲＡＰ染色とヘマトキシリン染色を行った結果をＦｕｓｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（核の数／ＴＲＡＰ陽性細胞の数）として示す図である。データは２回の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表し、＊Ｐ＜０．０５である。 Ｍ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの存在下で形成した同数の野生型破骨細胞とＤｃｉｒ－／－破骨細胞をＯｓｔｅｏ　Ａｓｓａｙプレートに再播種し、さらに５日間Ｍ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの存在下で５日間培養した後の画像（倍率４倍）及び破骨細胞により吸収された領域の面積のＩｍａｇｅＪによる解析結果である。データは２回の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表し、＊＊Ｐ＜０．０１である。 ＴＲＡＰ染色による破骨細胞形成の評価とアクチン細胞骨格形成をローダミン－ファロイジン染色により評価した結果である。データは２回の独立した試験を代表するものである。 野生型マウス及びＤｃｉｒ－／－マウスより採取した非接着性ＢＭを、濃度を変化させたＭ－ＣＳＦと２５ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬの存在下で５日間培養し、ＴＲＡＰ染色を行ったときの画像（４倍）及び３以上の核が存在する細胞の数を数えた結果を示す図である。データは２回の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表し、＊＊Ｐ＜０．０１である。 野生型マウス及びＤｃｉｒ－／－マウスより採取した非接着性ＢＭを、濃度を変化させたＲＡＮＫＬと５ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦの存在下で５日間培養し、ＴＲＡＰ染色を行ったときの画像（４倍）及び３以上の核が存在する細胞の数を数えた結果を示す図である。データは２回の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 Ｍ－ＣＳＦに応答してＢＭＭが増殖することを示す図である。データは３回の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 同数の野生型ＢＭＭ及びＤｃｉｒ－／－ＢＭＭをフィブロネクチンでコーティングしたプレートに播種し、Ｍ－ＣＳＦの存在下又は非存在下で２、５又は１０分間インキュベートした後、接着細胞をクリスタルバイオレット（０．５％）で染色し、５７０ｎｍにおける吸収度を測定した結果である。データは２回の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表す。 同数の野生型ＢＭＭ及びＤｃｉｒ－／－ＢＭＭについて７日間及び８日間は骨細胞形成を誘導し、８日目の最後の６時間はＭ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬを骨形成培地から除去したものをポジティブコントロールとして細胞質画分中のモノ又はオリゴヌクレオソームをＥＬＩＳＡにより検出した結果である。データは２回の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表す。 同数の野生型ＢＭＭ及びＤｃｉｒ－／－ＢＭＭから破骨細胞を誘導し、ＴＲＡＰ陽性細胞の画像（４倍）及びアポトーシス細胞の数を示す図である。画像中のアスタリスクで付している部分はアポトーシス細胞を表す。データは２回の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表す。 ５ｎｇ／ｍｌのＭ－ＳＣＦと濃度を変化させたＲＡＮＫＬの存在下で同数の野生型ＢＭＭ及びＤｃｉｒ－／－ＢＭＭが破骨細胞に誘導されたことを示す図である。データは３回の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 Ｄｃｉｒ－／－マウスのＢＭＭにおけるＭ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬに応答するＡｋｔシグナルが亢進することを示す。各レーンの下段の数値はリン酸化キナーゼの相対的シグナル濃度を示す。データは３回以上の独立した試験を代表するものである。 ８週齢の野生型マウス及びＤｃｉｒ－／－マウスの脛骨の骨構造解析結果である。エラーバーは平均値±標準誤差（４～６重測定）を表し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 ８週齢の野生型マウス及びＤｃｉｒ－／－マウスの大腿骨骨梁のマイクロＣＴ画像と骨パラメータの測定結果である。データは２回以上の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準誤差（４～６重測定）を表し、＊Ｐ＜０．０５である。 生体内における野生型マウス及びＤｃｉｒ－／－マウスの骨形成の様子をカルセイン二重ラベリングにより示す図である。データは２回の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準誤差（４～６重測定）を表す。 ９週齢の野生型マウス、Ｄｃｉｒ－／－マウス、Ｒａｇ２遺伝子及びＤｃｉｒ遺伝子の二重欠損マウスの大腿骨末端のＸ線マイクロＣＴ画像と骨パラメータの測定結果である。エラーバーは平均値±標準誤差（４～６重測定）を表し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 末梢血液中のＩＦＮ－γ陽性Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析結果である。データは３回の独立した試験を代表するものである。 リンパ節中のＩＦＮ－γ陽性Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析結果である。データは３回の独立した試験を代表するものである。エラーバーは平均値±標準偏差（４～６重測定）を表し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 １２週齢の野生型マウス及びＤｃｉｒ－／－マウス（それぞれ１０個体）のＩＦＮ－γの血清濃度をＥＬＩＳＡで解析した。対応のない両側ｔ検定による野生型とＤｃｉｒ－／－型のＰ値は０．１０であった。データは３回の独立した試験に基づくものである。図中の黒丸は野生型の各個体のデータ、白丸はＤｃｉｒ－／－型の各個体のデータをそれぞれ表す。データは３回の独立した試験を代表するものである。 骨芽細胞形成にＩＦＮ－γの外添が及ぼす影響を示す。アリザリンレッド染色領域はＩｍａｇｅＪで画像解析をした。データは３回以上の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 ＩＦＮ－γ存在下で１４日間培養後の骨形成関連遺伝子の発現の様子である。データは３回以上の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 野生型マウス、Ｄｃｉｒ－／－マウス、Ｉｆｎγ－／－Ｄｃｉｒ－／－マウス、Ｉｆｎγ－／－マウスの大腿骨末端のＸ線マイクロＣＴ画像と骨パラメータである。エラーバーは平均値±標準誤差（４～５重測定）を表し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．は非有意である。 ＢＭＭ（未処理、ＥＤＴＡ処理、トリプシン処理）におけるＤＣＩＲリガンド発現のフローサイトメトリー解析結果である。データは平均値±標準誤差（３回の独立した実験による）であり、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．は非有意である。 破骨細胞の分化がＣＲＤ依存的に阻害されることを示す図である。データは平均値±標準偏差（３重測定）であり、＊＊Ｐ＜０．０１である。 ＤＣＩＲ－Ｆｃがアシアロトランスフェリン及びヘパリンに結合することを示す糖鎖アレイアッセイ結果である。ＤＣＩＲ－Ｆｃ及びネガティブコントロールとしてＦｃタンパク質（ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分）を１０μｇ／ｍｌ、エポキシ活性化ガラススライドに複合糖質によりスポット（３点）し、結合の状態をエバネッセント場蛍光励起スキャナで検出した。 ＤＣＩＲ－Ｆｃのアシアロトランスフェリン及びヘパリンへの結合のＣａ２＋依存性を示す図である。図中に示すように濃度を変化させたＤＣＩＲ－Ｆｃとアシアロトランスフェリンとについて、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）の存在下又は非存在下での結合をエバネッセント場蛍光励起検出システムで検出した。 ＤＣＩＲ－Ｆｃのアシアロトランスフェリンへの結合はＣＲＤ依存的であるが、ヘパリンへの結合はＣＲＤ非依存的であることを示す図である。ＤＣＩＲ－Ｆｃ、ＤＣＩＲ－Ｆｃの変異体（Ｅ１９７Ａ－Ｆｃ、Ｓ１９９Ａ－Ｆｃ、Ｅ１９７Ａ／Ｓ１９９Ａ－Ｆｃ）の結果とネガティブコントロールであるＦｃの結果を示す。 ＤＣＩＲ－ＦｃがＮＡ２と結合することを示す糖鎖マイクロアッセイの結果である。 バックグラウンド強度からシグナル強度を差し引いた正味強度を示す図である。データは平均値±標準偏差（３重測定）である。 ＤＣＩＲ－ＦｃとＮＡ２との結合のＣａ２＋依存性及びＣＲＤ依存性を示す図である。 Ｃａ２＋依存性及びＣＲＤ依存性の正味強度を示す。データは平均値±標準偏差（３重測定）である。 ＤＣＩＲ－Ｆｃのノイラミニダーゼで処理したマクロファージへの結合を示すフローサイトメトリー解析結果である。データは３回以上の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表し、＊Ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．は非有意である。 ノイラミニダーゼの存在下での破骨細胞形成を示すグラフである。データは３回以上の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 ＮＡ２添加により破骨細胞形成が抑制されることを示すグラフである。データは３回以上の独立した試験を代表するものであり、エラーバーは平均値±標準偏差（３重測定）を表し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。 野生型ＢＭＭをＮＡ２で前処理し、Ｍ－ＣＳＦ又はＲＡＮＫＬで刺激したときのＮＡ２のＭ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬを介したシグナルに対する影響を示す図である。 ＮＡ２がＭ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬによるシグナル経路を特異的にＤＣＩＲを介して制御することを示す図である。Ｄｃｉｒ－／－ＢＭＭをＭ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬにより刺激する前に、血清フリー培地にて３７℃で６時間、ＮＡ２（１μｇ／ｍｌ）で処理した。その後、Ｍ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）又はＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）による刺激を図中に記載の時間与えた。データは３回の独立した試験を代表するものである。 ＮＡ２の存在下又は非存在下でＬＰＳによる刺激を骨髄由来樹状細胞に与えた場合の炎症性サイトカインの産生量を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について説明する。これらの説明及び実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
　本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
　「樹状細胞免疫受容体活性化」とは、本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤を樹状細胞免疫受容体に接触させることで、本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤を樹状細胞免疫受容体に接触させない場合よりも樹状細胞免疫受容体の活性が高められた状態にすることを意味する。
　「破骨細胞形成抑制」とは、本発明の破骨細胞形成抑制剤を樹状細胞免疫受容体に接触させることで、本発明の破骨細胞形成抑制剤を樹状細胞免疫受容体に接触させない場合よりも破骨細胞の形成が抑制された状態にすることを意味する。
　「サイトカイン産生抑制」とは、本発明のサイトカイン産生抑制剤を樹状細胞免疫受容体に接触させることで、本発明のサイトカイン産生抑制剤を樹状細胞免疫受容体に接触させない場合よりもサイトカインの産生が抑制された状態にすることを意味する。
　「樹状細胞分化・増殖阻害」とは、本発明の樹状細胞分化・増殖阻害剤を樹状細胞免疫受容体に接触させることで、本発明の樹状細胞分化・増殖阻害剤を樹状細胞免疫受容体に接触させない場合よりも樹状細胞の形成が阻害された状態にすることを意味する。
　「治療」とは、治療対象である疾病の症状を消失させることのほか、重症化の抑制、症状の軽減又は緩和もこの用語に包摂される。
＜樹状細胞免疫受容体活性化剤＞
　本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤は、下記式で表される構造を基本構造とする糖鎖（ただし、下記構造の２つの非還元末端にシアル酸が存在しせず、ｘ及びｙはそれぞれ独立に３又は４を表す）を有する化合物（以下、特定糖鎖含有化合物とも称する）を有効成分として含む。このような構造を有する化合物がＤＣＩＲに特異的に作用するリガンドであるという知見は、これまでに報告されていないものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 
　特定糖鎖含有化合物は、上記式で表される構造を基本構造とする糖鎖を有するものであれば本発明の効果が達成される限りその構造に制限はない。従って、上記の基本構造の任意の部位に１つの分岐鎖を有していたり、フコースが付加されていたりしてもよく、そのような構造の糖鎖を有する化合物も本発明の範囲に含まれる。ただし、上記構造の２つの非還元末端にシアル酸が存在しないことを条件とする。このような糖鎖構造の例としては、以下のようなものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 
　特定糖鎖含有化合物の作製方法は特に制限されず、生体からの採取、遺伝子工学的方法による作製、有機合成化学的方法による作製等を挙げることができる。
　特定糖鎖含有化合物は、上記式で表される構造を基本構造とする糖鎖を有するものであれば、本発明の効果が達成される限りその構造又は種類に制限はなく、生体由来の化合物と同一又は類似の構造を有する化合物であっても、生体由来でない化合物であってもよい。生体との適合性の観点からは、生体由来の化合物と同一又は類似の構造を有する化合物であることが好ましい。生体由来の化合物としては、タンパク質（ペプチドを含む）を挙げることができる。
　特定糖鎖含有化合物がタンパク質である場合の例としては、上記糖鎖構造の還元末端がトランスフェリン、酸性糖タンパク質、フェツイン、ニワトリ由来卵白タンパク質等に結合したものを挙げることができる。
　特定糖鎖含有化合物が生体由来でない化合物である場合の例としては、上記糖鎖構造の還元末端がポリアクリルアミド（ＰＡＡ）、パラニトロフェニルフェノール（ｐＮＰ）、アミノピリジン（ＰＡ）等に結合したものを挙げることができる。
　特定糖鎖含有化合物は、用途に応じて種々の改変を施してもよい。例えば、多量体化（マイクロビーズ、磁器ビーズ等の担体などやＢＳＡ、ＨＳＡ等のタンパク質など。ペプチドを含む）、アミノ基修飾（ビオチン化、ミリストイル化、パルミトイル化、アセチル化、マレイミド化等）、カルボキシ基修飾（アミド化、エステル化等）、チオール基修飾（ファルネシル化、ゲラニル化、メチル化、パルミトイル化等）、水酸基修飾（リン酸化、硫酸化、オクタノイル化、パルミトイル化、パルミトレオイル化、アセチル化等）、蛍光標識、ＰＥＧ化、非天然アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、各種スペーサー等の導入などの改変を施してもよい。
　本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤は、使用態様に応じて特定糖鎖含有化合物以外の成分を含んでいてもよい。特定糖鎖含有化合物以外の成分としては、樹状細胞免疫受容体活性化剤の調製に用いられる媒質及び製剤用添加物を挙げることができる。製剤用添加物としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、緩衝剤、溶剤等を挙げることができる。
　本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤の形態は特に制限されず、用途に応じて選択できる。例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ、乳剤、リモナーデ剤等の経口投与に適した形態、注射用アンプル剤、注射用凍結乾燥粉末剤、経肺投与用乾燥粉末剤などが挙げられる。
＜樹状細胞免疫受容体活性化方法＞
　本発明の樹状細胞免疫受容体活性化方法は、本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤を細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む。樹状細胞免疫受容体活性化剤を細胞に接触させる方法は特に制限されず、経口投与、静脈内投与、留置等の外科的処置などを挙げることができる。樹状細胞免疫受容体に接触させる樹状細胞免疫受容体活性化剤の量は特に制限されず、樹状細胞免疫受容体の活性の状態、意図する活性化の度合、特定糖鎖含有化合物とともに使用する他の成分の種類や量等に応じて選択できる。
　本発明の樹状細胞免疫受容体活性化方法によりＤＣＩＲを活性化させることで期待できる作用としては、ＤＣＩＲによって負に制御される生体機構が何らかの理由で過剰となっているときに、ＤＣＩＲを作為的に活性化させることでかかる生体機構を抑制することが挙げられる。ＤＣＩＲによって負に制御される生体機構としては、破骨細胞の形成、破骨細胞増殖応答、サイトカインの産生、樹状細胞の増殖応答、樹状細胞の機能制御、単球応答、好中球機能制御等が挙げられる。従って、本発明の樹状細胞免疫受容体活性化方法によれば、破骨細胞形成の抑制、樹状細胞分化・増殖の抑制、サイトカイン産生の抑制等を達成することができる。
　本発明の樹状細胞免疫受容体活性化方法により活性化されるＤＣＩＲを有する細胞の種類は、本発明の効果が得られる限り特に制限されない。例えば樹状細胞、破骨細胞、マクロファージ、単球、好中球等が挙げられる。
＜破骨細胞形成抑制剤＞
　本発明の破骨細胞形成抑制剤は、特定糖鎖含有化合物を有効成分として含む。有効成分として含まれる特定糖鎖含有化合物は、ＤＣＩＲを活性化させるリガンドとして作用する。ＤＣＩＲは破骨細胞の形成を負に制御する役割を果たしている。従って、本発明の破骨細胞形成抑制剤をＤＣＩＲに接触させてＤＣＩＲを活性化させることで、破骨細胞の形成を抑制することができる。
　本発明の破骨細胞形成抑制剤及び有効成分として含まれる特定糖鎖含有化合物の具体的な態様は、本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤及び有効成分として含まれる特定糖鎖含有化合物の具体的な態様として上述したものと同様とすることができる。
＜破骨細胞形成抑制方法＞
　本発明の破骨細胞形成抑制方法は、本発明の破骨細胞形成抑制剤を破骨細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む。破骨細胞形成抑制剤を樹状細胞免疫受容体に接触させる方法は特に制限されず、経口投与、静脈内投与、留置等の外科的処置などを挙げることができる。樹状細胞免疫受容体に接触させる破骨細胞形成抑制剤の量は特に制限されず、破骨細胞形成の状態、意図する破骨細胞形成の抑制の度合、特定糖鎖含有化合物とともに使用する他の成分の種類や量等に応じて選択できる。
　本発明の破骨細胞形成抑制方法により破骨細胞の形成を抑制することで期待できる作用としては、骨芽細胞による骨の形成と、破骨細胞による骨の吸収との間のバランスが何らかの理由により崩れて破骨細胞による骨の吸収が相対的に優位になっている場合において、破骨細胞の形成を意図的に抑制してバランスを回復し、骨の恒常性を維持することが挙げられる。
＜樹状細胞分化・増殖阻害剤＞
　本発明の樹状細胞分化・増殖阻害剤は、特定糖鎖含有化合物を有効成分として含む。有効成分として含まれる特定糖鎖含有化合物は、ＤＣＩＲを活性化させるリガンドとして作用する。ＤＣＩＲは樹状細胞分化・増殖を負に制御する役割を果たしている。従って、本発明の樹状細胞分化・増殖阻害剤をＤＣＩＲに接触させてＤＣＩＲを活性化させることで、樹状細胞の分化・増殖を阻害することができる。
　本発明の樹状細胞の分化・増殖阻害剤及び有効成分として含まれる特定糖鎖含有化合物の具体的な態様は、本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤及び有効成分として含まれる特定糖鎖含有化合物の具体的な態様として上述したものと同様とすることができる。
＜樹状細胞分化・増殖阻害方法＞
　本発明の樹状細胞の分化・増殖阻害方法は、本発明の樹状細胞の分化・増殖阻害剤を樹状細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む。樹状細胞の分化・増殖阻害剤を樹状細胞免疫受容体に接触させる方法は特に制限されず、経口投与、静脈内投与、留置等の外科的処置などを挙げることができる。樹状細胞免疫受容体に接触させる樹状細胞の分化・増殖阻害剤の量は特に制限されず、樹状細胞の分化・増殖の状態や、意図する樹状細胞の分化・増殖の阻害の程度に応じて選択できる。
＜サイトカイン産生抑制剤＞
　本発明のサイトカイン産生抑制剤は、特定糖鎖含有化合物を有効成分として含む。有効成分として含まれる特定糖鎖含有化合物は、ＤＣＩＲを活性化させるリガンドとして作用する。ＤＣＩＲはある種のサイトカインの産生を負に制御する役割を果たしている。従って、本発明のサイトカイン産生抑制剤をＤＣＩＲに接触させてＤＣＩＲを活性化させることで、サイトカインの産生を抑制することができる。
　本発明のサイトカイン産生抑制剤及び有効成分として含まれる特定糖鎖含有化合物の具体的な態様は、本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤及び有効成分として含まれる特定糖鎖含有化合物の具体的な態様として上述したものと同様とすることができる。
＜サイトカイン産生抑制方法＞
　本発明のサイトカイン産生抑制方法は、本発明のサイトカイン産生抑制剤を樹状細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む。サイトカイン産生抑制剤を樹状細胞免疫受容体に接触させる方法は特に制限されず、経口投与、静脈内投与、留置等の外科的処置などを挙げることができる。樹状細胞免疫受容体に接触させるサイトカイン産生抑制剤の量は特に制限されず、サイトカイン産生の状態、意図するサイトカイン産生の抑制の度合、特定糖鎖含有化合物とともに使用する他の成分の種類や量等に応じて選択できる。
　本発明のサイトカイン産生抑制方法によりサイトカインの産生を抑制することで期待できる作用としては、ＤＣＩＲによって負に制御されるある種のサイトカインの産生が何らかの理由により増加したことにより過剰な免疫反応や炎症等が生じている場合において、サイトカインの産生を意図的に抑制し、過剰な免疫反応や炎症を軽減することが挙げられる。
　本発明のサイトカイン産生抑制方法によって産生が抑制されるサイトカインの種類は、本発明の効果が得られる限り特に制限されない。例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－１、ＩＬ－１７、ＩＬ－１７Ｆ等が挙げられる。
＜治療方法＞
　本発明の治療方法は、本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤を骨代謝疾患、自己免疫疾患又はアレルギー疾患の患者に投与することを含む。
　上述のように、本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤をＤＣＩＲに接触させると、有効成分として含まれる特定糖鎖含有化合物がＤＣＩＲを活性化させるリガンドとして作用する。その結果、ＤＣＩＲによって負に制御される生体機構を意図的に抑制することができる。このような生体機構としては破骨細胞の形成、サイトカインの産生等が挙げられる。従って、本発明の治療方法は、過剰な骨吸収が関係している各種の骨代謝疾患、及び炎症性サイトカインの産生による過剰な免疫反応や炎症を伴う各種の自己免疫疾患又はアレルギー疾患の治療方法として有効である。さらに、特定糖鎖含有化合物はＤＣＩＲ特異的に作用して樹状細胞、破骨細胞等の機能を抑制するため、薬効の作用点が限局でき、副作用の少ない治療方法を提供することができる。
　上記の骨代謝疾患としては骨関節炎、脊椎関節症、骨粗しょう症、骨パジェット病、変形性骨炎、大理石骨病、歯周病等を挙げることができる。自己免疫疾患としては関節リウマチ、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、グッドパスチャー症候群、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群等を挙げることができる。アレルギー疾患としては気管支喘息、アトピー性皮膚炎、結膜炎、食物アレルギー、アナフィラキシー、接触皮膚炎、アレルギー性鼻炎、慢性糸球体腎炎等を挙げることができる。
　本発明の治療方法において、本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤を患者に投与する方法は特に制限されず、経口投与、静脈内投与、留置等の外科的処置などを挙げることができる。患者に投与する樹状細胞免疫受容体活性化の量は特に制限されず、症状の種類や状態、患者の年齢や体格、ＤＣＩＲの活性の状態、意図するＤＣＩＲ活性化の度合、特定糖鎖含有化合物とともに使用する他の成分の種類や量等に応じて選択できる。
　本発明の治療方法において患者に投与される樹状細胞免疫受容体活性化剤及び有効成分として含まれる特定糖鎖含有化合物の具体的な態様は、本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤及び有効成分として含まれる特定糖鎖含有化合物の具体的な態様として上述したものと同様とすることができる。
＜スクリーニング方法＞
　本発明のスクリーニング方法は、特定糖鎖含有化合物の存在下又は特定糖鎖含有化合物を対照として、被検物質の樹状細胞免疫受容体への結合性を測定し、樹状細胞免疫受容体活性化剤又は樹状細胞免疫受容体拮抗剤をスクリーニングすることを含む。
　具体的には、被検物質とＤＣＩＲへの結合性を測定し、特定糖鎖含有化合物のＤＣＩＲへの結合性の測定結果を比較することで、被検物質がＤＣＩＲ活性化剤であるか又はＤＣＩＲ拮抗剤であるかを判定することができる。ＤＣＩＲへの結合性の測定は、インビトロでも、インビボでも行うことができる。インビボでスクリーニングを行う場合は、破骨細胞の形成量、樹状細胞分化・増殖の程度、サイトカインの産生量等を指標として結合性を比較することで行ってもよい。
　以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
＜試験例１＞
　破骨細胞の分化に関係する因子であるマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）と核因子κＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）の存在下でｍＲＮＡ及びタンパク質レベルで形成したＭ－ＣＳＦ誘発骨髄マクロファージ細胞（ＢＭＭ）と破骨細胞にＤＣＩＲを発現させた（図１～３）。遺伝子の発現は破骨細胞の成熟に伴って増加した。ＤＣＩＲはＣＤ１１ｂ陽性細胞（ＯｓｔｅｏＭａｃｓ）によって検出されたが、エンリッチされた骨芽細胞には検出されなかった（図４）。
　破骨細胞形成におけるＤＣＩＲの役割を調べるため、Ｄｃｉｒ遺伝子欠損型（Ｄｃｉｒ－／－）ＢＭＭと野生型ＢＭＭにおける破骨細胞形成の様子を、Ｍ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの存在下で比較した。破骨細胞のマーカーである酒石酸耐性酸フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）陽性細胞の数（核が１０個以上）を比較したところ、Ｄｃｉｒ－／－ＢＭＭにおいて破骨細胞の形成が顕著に誘導されていた（図５）。破骨細胞の遺伝子の発現はＤｃｉｒ－／－破骨細胞において顕著に増加したが、ＩＴＩＭを有する受容体は変化しなかった（図６）。著明な破骨細胞の分化はＤＣＩＲのレトロウイルス発現により有効に減少したが、抑制シグナル伝達能を欠くＤＣＩＲ変異体（ＤＣＩＲＹ７Ｆ）では減少が見られず、このことからＩＴＩＭを介したシグナルがＤＣＩＲによる破骨細胞形成の抑制に必要であることがわかった（図７）。また、Ｄｃｉｒ－／－由来の非接着性骨髄細胞と骨芽細胞との共培養系において破骨細胞形成が促進したことからＤＣＩＲが破骨細胞の形成を非冗長的に負に制御することがわかった（図８）。一方、野生型マウスとＤｃｉｒ－／－マウスとの間に骨芽細胞の分化に関する差異は認められなかった（図９～１１）。
　以上の結果から、ＤＣＩＲを介したシグナルは破骨細胞の形成を負に制御すること、及びＤＣＩＲの欠損は破骨細胞の形成を促進することがわかった。
＜試験例２＞
　骨髄中の破骨細胞前駆体数の頻度を確認するため、骨髄中の造血細胞を調べた。フローサイトメトリー解析の結果、Ｄｃｉｒ－／－マウスの破骨細胞前駆体数の頻度（ＣＤ１１ｂｌｏＬｙ６Ｃｈｉ）は野生型のそれと同程度であった（図１２、１３）。このことから、ＤＣＩＲが破骨細胞の分化に関係していることがわかった。
　ＤＣＩＲ欠損による破骨細胞形成亢進は、破骨細胞前駆体（ＭＮＣｓ）が増加することが一因となっていると思われる。この仮説を検証するため、多核化した破骨細胞が現れる前のＴＲＡＰ陽性の野生型ＭＮＣ及びＤｃｉｒ－／－ＭＮＣの数を数えたところ、野生型ＭＮＣに比べて著しく多いＴＲＡＰ陽性のＤｃｉｒ－／－ＭＮＣが確認された（図１４）。さらに、ＤＣＩＲの欠損が破骨細胞の特徴のひとつである、ＭＮＣの細胞－細胞融合に影響するかを調べた。同数のＢＭＭを再播種してＲＡＮＫＬによる分化を誘導したところ、極めて多数の核がＤｃｉｒ－／－ＭＮＣのＴＲＡＰ陽性細胞中に認められた（図１５）また、破骨細胞形分化因子であるＲＡＮＫＬに対する応答性亢進も破骨細胞形成増加の一因であると考えられる。ＲＡＮＫＬ刺激により特異的に誘導される遺伝子（Ｎｆａｔｃ１、Ａｃｐ、ｃＳｒｃ、Ｃａｌｃｒ、ＣｔｓＫ）の発現を定量したところ、Ｄｃｉｒ－／－破骨細胞で発現が亢進していた（図６）。
　さらに、ＤＣＩＲの欠損が吸収領域の大きさとピット数の増加につながっており、破骨細胞の顕著な形成と一致する傾向がみられた（図１６）。対照的に、ＤＣＩＲの欠損は破骨細胞による吸収に必須の構造であるアクチン環の形成には影響しなかった（図１７）。これらの結果から、ＤＣＩＲが破骨細胞形成の負の制御因子として重要であることが確認できた。
　Ｍ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬを用いた破骨細胞形成のインビトロアッセイでは、破骨細胞の分化の促進がこれらの因子に対する高い感受性によるものであることが報告されている。このことを検証するため、一方の因子の濃度を徐々に増加させ、もう一方の因子の濃度を一定にして培養を行った。その結果、すべての培養系において、通常の培養系よりもコンスタントサイトカインの濃度が低かった。Ｍ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬに対し、ＴＲＡＰ陽性多核化Ｄｃｉｒ－／－細胞の数が上昇する傾向が見られたが、野生型細胞でそのような上昇は見られなかった（図１８、１９）。このことは、ＤＣＩＲの欠損がＢＭＭのＭ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬに対する反応性を過剰なものにしている可能性を示唆している。Ｍ－ＣＳＦに対するこのような過剰な反応と合致して、Ｄｃｉｒ－／－ＢＭＭのＭ－ＣＳＦ応答性の増殖が増加した（図２０）。
　Ｍ－ＣＳＦはマクロファージの接着及び破骨細胞の生存に関係していることが知られているが、Ｄｃｉｒ－／－ＢＭＭの接着活性と長期間培養したＤｃｉｒ－／－破骨細胞のアポトーシスに変化は見られなかった（図２１～２３）。このことは、ＤＣＩＲを介したシグナルがＭ－ＣＳＦにより誘発される増殖を負に制御していることを意味している。
　さらに、培養の初期に破骨細胞を同数のＢＭＭから成長させると、Ｄｃｉｒ－／－ＢＭＭの多核化した破骨細胞への分化はＲＡＮＫＬが低濃度であっても明らかに見られた（図２４）。従って、Ｄｃｉｒ－／－ＢＭＭにおける破骨細胞形成の増大は、Ｍ－ＣＳＦ応答性の増殖の増加とＲＡＮＫＬ応答性の分化の誘発とによって引き起こされることがわかった。ＤＣＩＲの欠損を介した破骨細胞形成の増大の分子的機序について調べるため、Ｍ－ＣＳＦのチロシンキナーゼ受容体であるｃ－Ｆｍｓと、ＲＡＮＫＬの受容体であるＲＡＮＫの下流にあるシグナル成分のリン酸化のレベルを解析した。その結果、Ｍ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬはＤｃｉｒ－／－ＢＭＭにおけるＡｋｔのリン酸化をより誘発したが、ＥＲＫ、ｐ３８及びＩκＢαの活性は同等であった（図２５）。このことは、Ｍ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬによるＡｋｔシグナル経路の活性化が破骨細胞の形成を促進することを示している。
　以上の結果から、ＢＭＭのＭ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬに対する応答性はＤＣＩＲが欠損すると増大することがわかった。
＜試験例３＞
　Ｄｃｉｒ－／－マウスの骨の構造について、脛骨遠位骨幹端部の組織形態計測的な評価を行った。その結果、破骨細胞及び骨芽細胞の双方のパラメータが増加していた（図２６）。マイクロＣＴ撮影によると、８週齢のＤｃｉｒ－／－マウスの大腿骨に軽度の大理石骨病が発症しており（図２７）、骨体積及び骨梁数が増加していた（図２７）。さらに、動的組織形態計測による解析結果は骨梁表面における単位あたりの骨石灰化速度及び骨形成速度の上昇を示していた（図２８）。これらの結果は、ＤＣＩＲの欠損が、骨芽細胞による骨の形成が破骨細胞による骨の破壊よりも優勢であり、破骨細胞と骨芽細胞のバランスにより制御される骨代謝が骨形成に傾いていることを示唆している。
　Ｄｃｉｒ－／－マウスの骨体積の増加は、ＤＣＩＲの欠損が破骨細胞の形成を促進するが骨芽細胞の形成には影響しないというインビトロでの知見と相反するように思われる。Ｔ細胞サブセットは破骨細胞形成の制御に関係し、ＤＣＩＲの欠損は樹状細胞の機能不全により自己免疫性の症状を引き起こすため、Ｄｃｉｒ－／－マウスのＴ細胞の性質に着目したところ、骨体積の増加がＲａｇ２とＤｃｉｒの二重欠損型マウスでは相殺されており（図２９）、Ｔ細胞が骨の恒常性に関与している可能性が大きいことがわかった。
　次に、定常状態のＤｃｉｒ－／－マウスのＴ細胞のサイトカイン産生能について調べたところ、末梢血液と上腕リンパ節、腋窩｛えきか｝リンパ節ではＩＦＮ－γの産生が顕著であるが、腸間膜リンパ節ではＩＦＮ－γの産生が顕著でないこと、Ｄｃｉｒ－／－マウスのＩＦＮ－γの血清濃度は野生型マウスよりも高い傾向にあることがわかり、Ｄｃｉｒ－／－マウスのサイトカイン環境がＩＦＮ－γ環境側に傾いていることが示された（図３０～３２）。これらの結果より、ＩＦＮ－γが骨芽細胞形成の強力な刺激因子であるという仮説に至った。ＩＦＮ－γの外的な付加は、骨芽細胞の石灰化の指標であるアリザリンレッド染色の度合、及び骨形成遺伝子の発現を用量依存的に増強した（図３３、３４）。ＩＦＮ－γが骨芽細胞に作用するという仮説は、Ｉｆｎ－γとＤｃｉｒの二重欠損型マウス及びＩｆｎ－γ欠損型マウスの骨構造が野生型マウスのそれと同等であったことから裏付けられた。すなわち、破骨細胞の抑制因子と考えられているＩＦＮ－γは定常状態では破骨細胞には作用せず骨芽細胞に作用する可能性が示唆された（図３５）。総じて、Ｄｃｉｒ－／－マウスの骨形成の増加がＩＦＮ－γの全身的な産生に起因して生じ、生体内でのＩＦＮ－γの正味バランスが骨形成側に傾くことを示している。
　以上の結果から、ＤＣＩＲが欠損したマウスでは骨量が増加すること、及びその骨量増加はＤｃｉｒ－／－マウスのサイトカイン環境がＩＦＮ－γに傾いていることに起因していることがわかった。
＜実施例１＞
　受容体がシグナルカスケードを開始してその生物学的機能を発揮するためには、リガンドの結合が必要である。破骨細胞形成のインビトロ培養系はＢＭＭのみ存在するため、ＤＣＩＲのリガンドはＢＭＭ又は破骨細胞に発現すると推測した。ＤＣＩＲの細胞外ドメインとヒトＩｇＧ２のＦｃ領域との融合が生じたときに生じるＤＣＩＲ－Ｆｃ染色に対してマクロファージと破骨細胞の一部は陽性であったが、その結合はＣＲＤのアミノ酸の変化を生じさせるＤＣＩＲ－Ｆｃ変異体であるＤＣＩＲ　Ｅ１９７Ａ／Ｓ１９９Ａ－Ｆｃにより減少した。
　さらに、ＤＣＩＲ－Ｆｃ結合はＥＤＴＡ及びトリプシンによって減少した。このことは、ＤＣＩＲがマクロファージ及び破骨細胞中の糖タンパク質にＣＲＤ依存的又はＣａ２＋依存的に相互作用することを示している（図３６）。
　破骨細胞形成過程におけるＤＣＩＲリガンドの機能を調べるため、破骨細胞をＤＣＩＲ－Ｆｃの存在下で形成した。ＴＲＡＰ染色によると、多核化した細胞が野生型ＢＭＭで顕著に誘導されるが（図３７）、ＤＣＩＲ－Ｆｃ添加により破骨細胞形成が増加すること、ＤＣＩＲ－Ｆｃ変異体であるＤＣＩＲ　Ｅ１９７Ａ／Ｓ１９９Ａ－Ｆｃの存在下では破骨細胞形成は変化しないことがわかった（図３７）。この結果は、ＢＭＭに発現するＤＣＩＲがリガンドを認識し破骨細胞形成を抑制していること、その抑制作用はＣＲＤ依存的であることを示している。ＤＣＩＲ－Ｆｃ又はＤＣＩＲ－Ｆｃ変異体の存在は、Ｄｃｉｒ－／－ＢＭＭにおける破骨細胞の形成には影響しなかったことからＤＣＩＲ特異的に作用していることが分かった（図３７）。
　ＤＣＩＲ－Ｆｃ添加による破骨細胞形成抑制の結果は、機能的な内在性リガンドの存在を示唆するものである。そこで、弱い相互作用を高い感受性で検出することの出来るエバネッセント場蛍光励起検出システムにより糖鎖マイクロアレイ解析を実施したところ、ＤＣＩＲリガンド候補を検出した。糖鎖マイクロアレイにより、ＤＣＩＲ－Ｆｃがアシアロ－トランスフェリンとヘパリンにＣａ２＋依存的に結合することがわかった（図３８、３９）。ＤＣＩＲ－Ｆｃ変異体はアシアロ－トランスフェリンに結合しないが、ヘパリンには結合することがわかった（図４０）。破骨細胞形成の抑制はＣＲＤに依存するため（図３７）、アシアロ－トランスフェリンのＤＣＩＲリガンドの単離を試みた。トランスフェリンでは二本鎖のＮ型糖鎖が主であるため、アシアロ二本鎖Ｎ型糖鎖（ＮＡ２）がＤＣＩＲリガンドであると推測した。ＤＣＩＲ－ＦｃはＮＡ２に強く結合すること（図４１、４２）、そのためにはＣａ２＋及びＣＲＤの存在が必要であることがわかった（図４３、４４）。
　興味深いことに、ＢＭＭをノイラミニダーゼで処理すると、ＤＣＩＲ－Ｆｃの結合が強まった（図４５）。破骨細胞の形成が野生型ＢＭＭでは顕著に抑制されるのに対し、ノイラミニダーゼで処理したＤｃｉｒ－／－ＢＭＭではそのような傾向は見られなかった（図４６）。ＮＡ２は野生型ＢＭＭの破骨細胞形成を顕著に抑制したが、Ｄｃｉｒ－／－ＢＭＭではそのような傾向は見られなかった（図４７）。さらに、ＮＡ２による処理はＭ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬに対して応答性の野生型ＢＭＭにおけるＡｋｔリン酸化の減少を生じさせた（図４８）。Ｄｃｉｒ－／－ＢＭＭのリン酸化プロファイルの傾向と合致して、ＮＡ２による処理はＭ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの刺激下でのＭＡＰＫｓ及びＩκＢαに何らの影響も及ぼさなかった（図４９）。これらの結果は、ＮＡ２がＭ－ＣＳＦシグナルカスケード及びＲＡＮＫＬシグナルカスケードを負に制御することにより破骨細胞の形成を抑制する機能性ＤＣＩＲリガンドであることを示している。
　以上の結果から、ＮＡ２はＤＣＩＲに対して特異的かつ機能的に結合するリガンドであることがわかった。
＜実施例２＞
　以下のようにして、Ｆｌｔ３Ｌの分化誘導により樹状細胞を作製した。野生型マウスの大腿骨の骨髄細胞を摘出し、赤血球を溶血バッファー（１４０ｍＭ　ＮＨ４Ｃｌ及び１７ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．２）に入れ、氷上で１０分間おいた。細胞を１０％ＦＢＳ、抗生物質混合物、必須アミノ酸、２－メルカプトエタノールを含む培地にて、１００ｎｇ／ｍｌのヒトＦｌｔ３Ｌ組み変え体の存在下、２４ウェルプレートにウェルあたり１００万個となるよう播種した。４日後、１００ｎｇ／ｍｌのヒトＦｌｔ３Ｌ組変え体（Ｍｉｌｔｅｎｙ社）を各ウェルに添加してさらに４日間培養した。その後、細胞を回収し、９６ウェルプレートにウェルあたり５０万個の細胞を播種した。
　得られた樹状細胞は、アゴニスト試薬（ＬＰＳ）とともに１μｇ／ｍｌのＮＡ２の存在下又は非存在下で２４時間活性化させた。上清を回収し、炎症性サイトカイン（ＩＬ－６及びｐ４０）の量をＥＬＩＳＡで調べた。その結果、樹状細胞をＮＡ２の存在下でＬＰＳにより刺激したときの炎症性サイトカインの産生量は、ＮＡ２の非存在下でＬＰＳにより刺激したときの炎症性サイトカインの産生量よりも減少する傾向がみられた（図５０）。図中の左側の２本の棒がＬＰＳによる刺激なし、右側の２本の棒がＬＰＳで刺激した場合の炎症性サイトカインの産生量をそれぞれ表し、黒棒がＮＡ２存在下で刺激した場合の産生量を示す。
　以上の結果から、ＮＡ２がＤＣＩＲに結合することで炎症性サイトカインの産生が抑制されることがわかった。
＜材料及び方法＞
（マウスの作製及び入手先）
　Ｄｃｉｒ－／－マウス及びＩｆｎγ－／－マウスは既報に従い作製し、Ｃ５７ＢＬ／６と１２世代戻し交配した。Ｒａｇ２－／－マウスは公益財団法人実験動物中央研究所より提供を受けた。Ｉｆｎ－γ－／－Ｄｃｉｒ－／－マウスの作製のため、当研究室でＤｃｉｒ－／－マウスをＩｆｎγ－／－マウスと交配した。実験で使用したマウスはすべて８～１２週齢のオスである。対照として用いた週齢及び性別が同じであるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは日本エスエルシー株式会社より購入した。すべてのマウスは公益財団法人日本動物学会のガイドラインに従って東京大学又は東京理科大学内で飼育し、すべての実験は東京大学医科学研究所又は東京理科大学の動物実験委員会の承認を得て行った。なお、マウスＤＣＩＲの遺伝子の塩基配列はＧｅｎｅ　ＩＤ：Ｃｌｅｃ４ａ２、ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．ＮＭ００１１７０３３２のうち２７３番目～１０６１番目の塩基の配列に相当する。
（統計的手法）
　各群の統計的差異はｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ　ｕｎｐａｉｒｅｄ　ｓｔｕｄｅｎｔｓ’　ｔ－ｔｅｓｔ　（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＮＳは非有意）により判断し、Ｐ＜０．０５で統計的に有意な差があると判断した。
（骨髄由来マクロファージ及び破骨細胞の培養）
　Ｍ－ＣＳＦ依存性骨髄由来マクロファージを作製するため、α－ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ（α－ＭＥＭ）（商品名Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で大腿骨の骨髄腔を洗い流し、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及び１０％熱非動化ウシ胎児血清を補充してＢＭ細胞を単離した。赤血球を溶血バッファー（１４０ｍＭ　ＮＨ４Ｃｌ及び１７ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．２）を用いて氷上で１０分間かけて破壊し、１００ｍｍ径ディッシュで１時間プレインキュベートした。非接着性細胞（造血細胞）を回収し、２０ｎｇ／ｍｌのヒトＭ－ＣＳＦ組み換え体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）の存在下で９６ウェルプレートに１ウェルあたり５０，０００個の細胞を播種し、２日間おいた。Ｍ－ＣＳＦにより増殖した細胞を骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）とした。破骨細胞を作製するため、ＢＭＭをさらに２０ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦと１００ｎｇ／ｍｌの可溶性ヒトＲＡＮＫＬ組み換え体（オリエンタル酵母工業株式会社）の存在下で培養し、培地を２日おきに交換した。成熟したマクロファージを得るため、ＢＭＭを２０ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦの存在下で６日間培養し、培地を２日おきに交換した。一部の実験では、１００ｍｍディッシュで培養したＢＭＭをＣｅｌｌ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｎｏｎ－ｅｚｙｍａｔｉｃ　１×（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で解離し、同数のＢＭＭを再播種して破骨細胞の形成を誘発した。
（破骨細胞形成のＴＲＡＰ染色による測定）
　接着細胞を１０％ホルマリンで３分間固定し、固定バッファー（５０％エタノール及び５０％アセトン）で１分間さらに固定した。固定した細胞をナフトールＡＳ－ＭＸリン酸塩（ナカライテスク株式会社）及びファストレッド（ナカライテスク株式会社）で１０～１５分間室温で染色し、３分間水洗した。細胞核が３以上又は１０以上存在するＴＲＡＰ陽性細胞を多核化した破骨細胞とし、その数を数えた。
（骨髄細胞のレトロウイルストランスフェクション）
　マウスＤＣＩＲのｃＤＮＡを、プライマーとしてセンス：５’－ｃｇｇｇａｔｃｃｃａｃｃａｔｇｇｃｔｔｃａｇａａａｔｃａｃｔｔａｔｇ（配列番号１）及びアンチセンス：５’－ｃｇｇａａｔｔｃｔｃａｔａａｇｔｔｔａｔｔｔｔｃｔｔｃａ（配列番号２）を用いて増幅した。ＰＣＲで得られた産物を、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩサイトでｐＭＸｓ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（東京大学の北村俊雄教授より提供を受けた）にクローニングした。ｐＭＸｓベクターを大腸菌（ＤＨ５α）から単離した。ＤＣＩＲ　Ｙ／Ｆ変異体を、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡株式会社）を用いて作製した。すなわち、ＤＣＩＲのＩＴＩＭにおけるチロシンをフェニルアラニンに置換するためのフォワードプライマー：５’－ｃａｃｔＴｔｔｇｃａｇａａｇｔｇａａｇｔｔｃａａｇａａｔｇａａｔｃ（配列番号３、大文字のＴはアデノシン）及びリバースプライマー：５’－ａｔｔｔｃｔｇａａｇｃｃａｔｇｇｔｇｇｇａｔｃｃｔｔｇｇｔｔａａｃ（配列番号４、大文字のＴはアデノシン）を設計した。ｐＭＸｓベクターをテンプレートとした逆ＰＣＲを行い、典型的なＥ．ｃｏｌｉセルラインのメチル化したＤＮＡを消化可能なＤｐｎＩで消化した。消化していないＰＣＲ産物を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びリガーゼを用いて１６度で１時間セルフライゲートした。ｐｌａｔ－Ｅパッケージングセルライン（東京大学の北村俊雄教授より提供を受けた）を１０％ＦＢＳ　α－ＭＥＭで培養し、１日おきに１対５の割合で分割した。レトロウイルスベクターをＰｌａｔ－Ｅ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて導入した。８時間インキュベートした後、培地を交換し、さらに２４時間インキュベートした。レトロウイルス上清を回収し、使用するまで－８０℃で冷凍した。ＤＣＩＲのＢＭとＤＣＩＲ変異体のＢＭをレトロウイルスによって形質導入するため、非接着性骨髄細胞をレトロウイルス上清２０μｌを含む培地１００μｌで培養し、培地を１日おきに交換した。
（トリチウムチミジン取り込みアッセイ）
　ＢＭＭをＣｅｌｌ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｎｏｎ－ｅｚｙｍａｔｉｃ　１×（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて回収し、濃度を変化させたＭ－ＣＳＦの存在下で９６ウェルプレートの各ウェルに３００，０００個ずつ入れた。２～３時間後、１．０μＣｉの［３Ｈ］チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を添加し、さらに４８時間３７℃でインキュベートした。細胞はＳｋａｔｒｏｎマイクロプレートウォッッシャー上清回収システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅ社）を用いてガラスファイバーフィルターを通した。［３Ｈ］チミジンのＤＮＡへの導入は、ＭｉｃｒｏＢｅｔａマイクロプレートカウンターシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）によって確認した。
（ＦＡＣＳ分析）
　ＢＭ細胞と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の血液細胞溶解を溶血バッファー（１４０ｍＭ　ＮＨ４Ｃｌ及び１７ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．２）を用いて氷上で行った。ＢＭＭとＰＢＳを分離し、ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で洗浄し、血清成分を除去した。これらの細胞のＦｃ受容体はＦｃ受容体ブロッカーである２．４Ｇ２で、４度で１０分間ブロックした。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２度洗浄し、蛍光標識した抗体とともに３０分間氷上でインキュベートした。抗体としては、ＡＰＣ－又はＰＥ－ＣＤ１１ｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、ＦＩＴＣ－Ｌｙ６ｃ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、ＡＰＣ－ｃ－Ｆｍｓ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、ｂｉｏｔｉｎ－ＲＡＮＫ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及びＰＥ－Ｃｌｅｃ４ａ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。細胞内分子の染色にはＦＩＴＣ－ＣＤ３、Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅ－ＣＤ４、ＡＰＣ－ＣＤ８、ＢＶ５１０－ＣＤ１１ｂ、ＰＥ－ＩＦＮ－γ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を使用した。ＤＣＩＲリガンド検出用のＦｃ－タンパク質と抗ＩｇＧ抗体とからなるタンパク質複合体を形成するため、１０μｇ／ｍｌのＤＣＩＲ－Ｆｃ－タンパク質、ＤＣＩＲ－Ｆｃ－タンパク質変異体、又はＦｃ－タンパク質を、５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）とともにカルシウム及びマグネシウムを含有するバッファー（２ｍＭ　ＣａＣｌ２、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び０．５％ＢＳＡを含むＴＢＳ）で、１５分間室温でインキュベートした。マクロファージと破骨細胞を上記のタンパク質複合体で１時間、４℃で染色し、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋バッファーで洗浄した。フローサイトメトリーをＦＡＣＳＣａｎｔｏ　ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて実施し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ　Ｓｔａｒ社）を用いて分析した。細胞内染色のため、細胞をまず２．４Ｇ２で染色し、次いで固定前の表面抗原をＦＩＴＣ－ＣＤ３で染色した。ＦＡＣＳバッファーで洗浄後、固定／透過化バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を添加し、４℃で６０分おいた。遠心分離後、固定／透過化バッファーをデカンテーションし、０．１％サポニン含有ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。これらの細胞は表面抗原及び細胞内分子を一次抗体で染色し、０．１％サポニンバッファーで希釈した。
（定量ＲＴ－ＰＣＲ及びコンベンショナルＰＣＲ）
　全ＲＮＡはＢＭＭ及び破骨細胞からＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて抽出した。全ＲＮＡの定量はＮａｎｏＤｒｏｐを用いて行った。１μｇの全ＲＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写し、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。定量ＰＣＲを全ＲＮＡに相当する５ｎｇ、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ（タカラバイオ株式会社）、フォワード及びリバースプライマー（Ｏｐｅｒｏｎ社）を含めた全反応容量を１０μｌとし、２又は３サンプルとして行った。定量はＣＦＸ３８４ＴＭリアルタイムシステム（バイオ・ラッド　ラボラトリーズ株式会社）を用いて行った。サイクル数は１サイクル目を９５℃で１分、続く４４サイクルを９５℃で３秒／６０度で３０秒とした。プライマーとしてはＤＣＩＲのセンス：５’－ｃｃｔｇｇｔｇａｔｔｃｔａｔｇｃｔｇｔｇｇｔ－３’（配列番号５）、アンチセンス：５’－ｇｔｃａｇａａｇａｇａｇｃｃｔｔｇｔｔｃｃｔｔｃ－３’（配列番号６）、ＧＡＰＤＨのセンス：５’－ｔｔｃａｃｃａｃｃａｔｇｇａｇａａｇｇｃ－３’（配列番号７）、アンチセンス：５’－ｇｇｃａｔｇｇａｃｔｇｔｇｇｔｃａｔｇａ－３’（配列番号８）を用いた。プライマーの最終濃度は４００ｎＭであった。ＧＡＰＤＨはインターナルハウスキーピング遺伝子として用いた。目的の遺伝子とハウスキーピング遺伝子を、水サンプルをネガティブリファレンスとして１プレートで同時に定量した。サンプル間のＲＮＡの品質と初期量の違いはＧＡＰＤＨで正規化した。目的の遺伝子の相対的発現は、２－ｄＣｔ（ｄＣｔ＝目的遺伝子の平均Ｃｔ値－ハウスキーピング遺伝子の平均Ｃｔ値）として計算した。目的の遺伝子の２日目に対する３日目及び４日目のｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅは２－ｄｄＣｔ（ｄｄＣｔ＝３日目及び４日目の各サンプルにおける（目的遺伝子の平均Ｃｔ値－ハウスキーピング遺伝子の平均Ｃｔ値）－２日目の（目的遺伝子の平均Ｃｔ値－ハウスキーピング遺伝子の平均Ｃｔ値）として計算した。標準偏差は既報に従い、数学的手法で計算した。ＲＴ－ＰＣＲをＥｘ－ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて反応容量２０μｌとして行った。ＤＣＩＲを増幅するためのプライマーとして、センス：５’－ｃａｔｔｔｃｃｃｔｔａｔｃｔｃｇｃｃｃｔｇｇ－３’（配列番号９）、アンチセンス：５’－ｇｃａｔｇａｇｔｇｔｃｃａａｇａｔｃｃ－３’（配列番号１０）を使用し、６８６ｐｂの産物を増幅した。ＰＣＲ反応は３０サイクルを９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分間行った。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。
（生化学分析）
　Ｍ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬを介したシグナルのウェスタンブロッティングのため、ＢＭＭを５ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦとともに１２ウェルプレートに各ウェル２５０，０００個ずつ再播種した。２４時間培養後、刺激前にＢＭＭをＭ－ＣＳＦを添加しない血清フリー培地にて６時間おいた。次いで、２０ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦ又は１００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬを添加して所定の時間、細胞を活性化した。細胞は１％ＮＰ－４０溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、プロテナーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社））に溶解して細胞溶解物を得た。溶解物を氷上に１０分おき、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して清澄化した。等量の溶解物サンプルをＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルで２３０Ｖにて３０分間分離した。ゲルはＰＶＤＦ膜上に定電流２３０ｍＡとし、膜あたり２５分でセミドライシステム（バイオ・ラッド　ラボラトリーズ株式会社）により電気的に転写した。ＰＶＤＦ膜は５％のＴｗｅｅｎ　２０を含むＴＢＳに５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を溶かした中で１時間室温でブロックし、一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした後、ＨＲＰ標識二次抗体でプローブした。ＰＶＤＦ膜はＥＣＬ　Ｐｒｉｍｅ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてタンパク質シグナルを可視化した。
（Ｆｃ結合ＤＣＩＲタンパク質の作製）
　マウスＤＣＩＲの細胞外ドメイン（ＥＣ）をカバーするアミノ酸配列７０～２３８番目のｃＤＮＡを、ｐＦＵＳＥ－ｈＩｇＧ２－Ｆｃ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＢｇｌ　ＩＩサイトにてサブクローニングした。ＥＣをコードするｃＤＮＡは、プライマーとしてセンス：５’－ａｔａａｇａｔｃｔｃａａａａｇｔａｃｔｃｔｃａａｃｔｔｃｔｔ－３’（配列番号１１）、アンチセンス：５’－ａｔａａｇａｔｃｔｔａａｇｔｔｔａｔｔｔｔｃｔｔｃａｔｃ－３’（配列番号１２）を用いて作製した。グルタミン酸とセリンがアラニンに置換されたＣＲＤドメインの部位特異的変異体を、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（東洋紡株式会社）を用いて作製した。プライマーとしては、以下のものを使用した。
・Ｅ１９７Ａ　センス：５’－ＡＡＴＧＧＴＧＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＡ－３’（配列番号１３）、アンチセンス：５’－ＴＧＴＡＡＧＡＣＣＧＴＧＴＴＡＣＣＡＣＧＡＧＧＧＴＣＡ－３’（配列番号１４）
・Ｓ１９９Ａ　センス：５’－ＧＡＧＣＣＣＧＣＴＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴ－３’（配列番号１５） 、アンチセンス：５’－ＡＣＣＧＴＧＴＴＡＣＣＡＣＴＣＧＧＧＣＧＡＴＣＡＣＣＧ－３’（配列番号１６）
・Ｅ１９７Ａ／Ｓ１９９Ａ　センス：５’－ＧＧＴＧＣＴＣＣＣＧＣＴＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴ－３’（配列番号１７） 、アンチセンス：５’－ＴＡＧＴＧＴＡＡＧＡＣＣＧＴＧＴＴＡＣＣＡＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＣＡ－３’（配列番号１８）
　ＤＣＩＲ－Ｆｃ（ｍＤＣＩＲのＥＣ）、ＤＣＩＲ－Ｆｃ変異体（ＣＲＤドメインの不活性型）、Ｆｃ－ｐｒｏｔｅｉｎ（免疫グロブリンの定常部）を得るためのプラスミドベクターをそれぞれ作製した。次いで、これらのプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で１５日間インキュベートした。培地は３日おきに交換した。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、Ｆｃ－キメラタンパク質を回収した上清から精製した。
（ＤＣＩＲリガンドの機能解析）
　野生型ＢＭＭ及びＤｃｉｒ－／－ＢＭＭの破骨細胞への分化を、Ｍ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの存在下で誘導した。ＧｌｙｃｏＴｅｃｈ社より購入したアシアロ二本鎖Ｎ型糖鎖（ＮＡ２）を非接着性ＢＭ細胞の培養初期に加え、培地を交換するごとに継続的に添加した。破骨細胞の数をＴＲＡＰ染色により数えた。ＮＡ２の生物活性を評価するため、Ｍ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）又はＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）による刺激を付与する前に、ＢＭＭをＮＡ２の存在下又は非存在下で６時間処理した。細胞溶解物をウェスタンブロット法により解析し、シグナル化合物のリン酸化のレベルを調べた。
（ノイラミニダーゼによる処理）
　６日間培養したＢＭＭをＣｅｌｌ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｎｏｎ－ｅｚｙｍａｔｉｃ　１×（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）にて回収し、ＴＳＡバッファー（２ｍＭ　ＣａＣｌ２、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び０．５％ＢＳＡを含むＴＢＳ）に再度懸濁させた。次いで、１０万細胞あたり０．５μｌのノイラミニダーゼ（Ｒｏｃｈｅ社）でＢＭＭを３７℃で３０分間処理した。その後、細胞をＴＳＡバッファーで洗浄し、ＦＡＣＳ分析を行った。シアル酸の脱離が破骨細胞形成に与える影響を調べるため、１μｌのノイラミニダーゼ（Ｒｏｃｈｅ社）の存在下で非接着性ＢＭ細胞から破骨細胞を誘導した。ノイラミニダーゼは培地を１日おきに交換する際に補充した。
（カルセインラベリング）
　骨形成の様子を調べるための動的組織形態計測学的解析は株式会社クレハ分析センターにて行った。野生型マウス及びＤｃｉｒ－／－マウスの８週齢における体重を測定し、１６ｍｇ／ｋｇ（体重）のカルセイン（ナカライテスク株式会社）を２日おきに２回マウスの腹腔内に投与した。２度目の投与から２日後に脛骨を摘出して軟組織及び筋肉を取り除き、７０％エタノールで１週間、毎日エタノールを交換して固定した。石灰化した部分が緑の線として染色された。脱灰していない骨組織はグリコールメタクリレート（ＧＭＡ）の組織への浸入を促すためメチルベンゾエート中に１５分間おき、次いで５％のメチルベンゾエートを含むＧＭＡ（４℃）に浸漬し、２時間の間に３回交換した。次いで、骨組織をＧＭＡに埋め込んだ。３μｍ厚の脛骨断片をミクロトーム（サクラファインテックジャパン株式会社）を用いて作製し、石灰化前線における蛍光を検出した。動的組織形態計測学的解析のため、石灰化表面（石灰化表面／骨表面［ＭＳ］／［ＢＳ］；％）、骨石灰化速度（［ＭＡＲ］；μｍ／ｄａｙ）、骨形成速度（［ＢＦＲ］／［Ｂｓ］；μｍ３／μｍ２／ｄａｙ）を画像解析装置（Ｓｙｓｔｅｍ　ｓｕｐｐｌｙ社）で倍率４００倍として調べた。
（組織形態計測学的分析）
　マウス脛骨の組織形態計測学的分析は株式会社クレハ分析センターにて行った。野生型マウス及びＤｃｉｒ－／－マウスの骨を、８週齢のマウス１群あたり５～６個体から取り出し、７０％エタノールで固定した。骨構造の組織形態計測パラメータを測定するため、３μｍ厚のＧＭＡに埋め込んだ大腿骨組織断片をトルイジンブルーで染色した。柱状骨パラメータは、成長板から０．３ｍｍはなれた地点から末端方向に幅１．０５ｍｍの二次海綿骨の面積とした。骨幹端における柱状骨をＨｉｓｔｏｍｅｔｒｙＲＴ　ＣＡＭＥＲＡで観察した。破骨細胞数（［Ｏｃ．Ｎ］／１００ｍｍ）と破骨細胞表面積（［Ｏｃ．Ｓ］／［ＢＳ］；％）は、１以上の核を有し、柱状骨表面で吸収窩を形成している細胞を破骨細胞として計測した。骨芽細胞数（［Ｏｂ．Ｎ］／１００ｍｍ）及び骨芽細胞表面積（［Ｏｂ．Ｓ］／［ＢＳ］；％）を含む骨リモデリングのパラメータは、トルイジンブルーで染色した断面において測定した。
（マイクロＣＴ解析）
　野生型マウスとＤｃｉｒ－／－マウスの骨の構造特性について、高解像度マイクロＣＴシステムで調べた。大腿骨骨幹端の末端における長さ１．８１４ｍｍの海綿骨断面をマイクロＣＴシステム（Ｓｃａｎ　Ｘｍａｔｅ－Ｌ０９０、コムスキャンテクノ株式会社）でスキャンした。３Ｄ画像解析をＴＲＩ／３Ｄ　ＢＯＮソフトウェア（ラトックシステム株式会社）を用いて行った。骨梁のミネラル濃度は骨密度（骨体積［ＢＶ］／骨組織体積［ＴＶ］）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ．＝２×ＢＶ／骨表面積［ＢＳ］）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ＝（ＢＶ／ＴＶ）／Ｔｂ．Ｔｈ．）、骨梁間隔（Ｔｂ．Ｓｐ＝１／Ｔｂ．Ｎ・Ｔｂ．Ｔｈ．）及び骨梁中心距離（Ｔｂ．Ｓｐａｃ＝１／Ｔｂ．Ｎ）により評価した。骨梁数は、骨梁細胞の数とした。
（末梢血中のＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞の測定）
　ヘパリンを含む２１ゲージ針付注射器（持田製薬株式会社）を用いて麻酔下のマウスより心臓穿刺により全血を採取した。血液は１０倍量の溶血バッファーと混合し、氷上に１０分間おいた。次いで１５００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、単核細胞を回収した。以上の処理を３回繰り返した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をホルボールミリスタートアセタート（最終濃度：５００ｎｇ／ｍｌ）で５時間刺激し、さらにイオノマイシン（最終濃度：５０ｎｇ／ｍｌ）とブレフェルジンＡ（最終濃度：１０μｇ／ｍｌ）でインキュベーションの全期間にわたって刺激した。ＰＢＭＣによりＩＦＮ－γが産生されていることが細胞内分子染色とフローサイトメトリー解析より検出された。
（初代頭蓋冠細胞の培養）
　頭蓋冠細胞を連続消化及び定法により作製した。すなわち、頭蓋冠を生後１～２日のマウス新生児より摘出し、接着性間葉組織を除去した。この頭蓋冠を０．１％コラゲナーゼ（和光純薬工業株式会社）と０．１％ディスパーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を含む分解液で１０分間、３７℃で撹拌しながら処理して１回目の消化を行った。デブリを含む溶液を捨て、残った頭蓋冠を上記と同じ分解液で３７℃で１時間、さらに消化した。連続消化後、単離した細胞はα－ＭＥＭ（１０％ＦＣＳ、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）に懸濁させ、１２ウェルプレートにウェルあたり２０万個となる濃度で播種した。２日間培養後、細胞を骨形成培地（１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、１０ｍＭ　β－グリセロリン酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）及び抗生物質を添加したα－ＭＥＭ）で１４日間又は２１日間インキュベートした。培地は３日おきに交換した。
（ＩＦＮ－γの骨芽細胞形成に及ぼす影響の評価）
　マウス骨芽細胞の培養及び分化は上述の方法で行った。初代頭蓋冠細胞を、マウスＩＦＮ－γ組み換え体（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）の存在下で培養した。ＩＦＮ－γは骨形成培地を交換する度に添加した。
（磁気細胞分離）
　頭蓋冠細胞は上記の方法でマウス新生児より採取し、赤血球細胞を溶血バッファーで１０分間、３７℃で溶解させた。残存する細胞は、１０００万個の全細胞あたり９０μｌのａｕｔｏＭＡＣＳ　Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）に再懸濁し、１０００万個の全細胞あたり１０μｌのＣＤ１１ｂ　ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）で１５分間、４℃でインキュベートした。細胞はＭＡＣＳバッファーで洗浄し、１０８　個の細胞あたり５００μｌのａｕｔｏＭＡＣＳ　Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、７５ナイロンメッシュ（７５×７５μｍ　メッシュ）を通して細胞の凝集塊を除去した。ＣＤ１１ｂに対し陽性の画分と陰性の画分とをａｕｔｏ　ＭＡＣＳ　Ｐｒｏ　ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙ　Ｂｉｏｔｅｃ社）で分離し、それぞれの細胞をＯｓｔｅｏＭａｃｓ又は初代骨芽細胞として使用した。
（石灰化結節形成アッセイ）
　骨芽細胞の石灰化の形成は、フォン・コッサ法及びアリザリンレッドＳによる染色で確認した。フォン・コッサ法による染色は、培養した骨芽細胞を１０％ホルマリンで１０分間室温で固定し、洗浄後、固定した細胞を５％硝酸銀溶液中で３０分間明るい日光に曝露し、次いで５％チオ硫酸ナトリウムで洗浄することで行った。石灰化した結節は暗褐色又は黒色の斑点として可視化された。アリザリンレッドＳによる染色は、培養した骨芽細胞を１０％ホルマリンで１０分間室温で固定し、１％アリザリンレッドＳ（ｐＨ４．２）で１０分間室温で染色し、蒸留水で余分な染料を除去することで行った。石灰化した結節は暗赤色の斑点として可視化された。染色した細胞の画像はＧＴ－Ｘ７７０イメージスキャナ（セイコーエプソン株式会社）で撮影した。
（初代頭蓋冠細胞と骨髄細胞の共培養）
　初代頭蓋冠細胞は酵素的に採取し、１２ウェルプレートにウェルあたり２０万個としてビタミンＤ３（１０－８Ｍ）とプロスタグランジンＥ２（１０－６Ｍ）を含むα－ＭＥＭとともに播種し、２４時間おいた。１０倍の数の非接着性骨髄細胞を、初代骨芽細胞とともに７日間共培養した。培地は３日おきに交換した。
（ピット形成）
　骨芽細胞は既述の方法で５日間１００ｍｍディッシュにて培養して作製した。この骨芽細胞を酵素的に採取し、Ｍ－ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの存在下、Ｏｓｔｅｏ　Ａｓｓａｙ　プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）にウェルあたり２万個の細胞を再播種した。３日後、１Ｍアンモニア溶液中で３０秒間の超音波破壊により細胞を除去した。リン酸カルシウムでコーティングされたウェルの表面全体の画像を顕微鏡（株式会社キーエンス）に取り込み、吸収された領域の面積をＩｍａｇｅＪで解析した。
（接着活性の評価）
　９６ウェルプレートを１０ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）でコーティングし、４℃で一晩おいた。ウェルをＰＢＳで２度洗浄し、２日培養したＢＭＭをＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）とともに、又はＭ－ＣＳＦなしで５万個播種し、２分間、５分間又は１０分間経過させた。次いで、細胞をＤＭＥＭで２度洗浄し、メタノールで２分間固定し、クリスタルバイオレットの０．５％蒸留水溶液で染色した。蒸留水で５回洗浄後、１００ｍｌの１％ＳＤＳを各ウェルに添加して色素を可溶化し、５９５ｎｍでの吸収度を測定した。
（アポトーシスの評価）
　２日間培養したＢＭＭを、Ｍ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに４８ウェルプレートでウェルあたり１万個をインキュベートした。培地は２日おきに交換した。培養開始から７日後及び８日後に培地を除去し、細胞死検出キット（Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ＥＬＩＳＡ、Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）の細胞溶解バッファーを用いて３０分間、室温で細胞溶解液を作製した。ポジティブコントロールとして、培養８日目のウェルから最後の６時間ですべてのサイトカインを除去したものを準備した。２０μｌの上清を用いてＥＬＩＳＡによりアポトーシスの程度を解析した。
（定量ＲＴ－ＰＣＲのプライマーセット）
　破骨細胞の転写産物の検出には以下のプライマーを使用した。
・Ａｃｐ（ＴＲＡＰ）　センス：５’－ｃａｇｃａｇｃｃｃａａａａｔｇｃｃｔ－３’（配列番号１９）、アンチセンス：５’－ｔｔｔｔｇａｇｃｃａｇｇａｃａｇｃｔｇａ－３’（配列番号２０）
・ＮＦＡＴｃ１　センス：５’－ｇｃｃａａｇｔａｃｃａｇｃｔｔｔｃｃａｇ－３’（配列番号２１）、アンチセンス：５’－　ａｇｇｇｔｃｇａｇｇｔｇａｃａｃｔａｇｇ－３’（配列番号２２）
・Ｃａｌｃｒ（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ　Ｒ）　センス：５’－ｇｃｃｔｃｃｃｃａｔｔｔａｃａｔｃｔｇｃ－３’（配列番号２３）、アンチセンス：５’－ｃｔｃｃｔｃｇｃｃｔｔｃｇｔｔｇｔｔｇ－３’ 配列番号２４）
・Ｎｆａｔｃ１　センス：５’－ｇｃｃａａｇｔａｃｃａｇｇｔｔｔｃｃａｇ－３’（配列番号２５）、アンチセンス：５’－ａｇｇｇｔｃｇａｇｇｔｇａｃａｃｔａｇｇ－３’（配列番号２６）
・ｃＳｒｃ　センス：５’－ｇａａｃｃｃｇａｇａｇｇｇａｃｃｔｔｃ－３’（配列番号２７）、アンチセンス：５’－ｇａｇｇｃａｇｔａｇｇｃａｃｃｔｔｔｔｇｔ－３’（配列番号２８）
・Ｐｉｒｂ　センス：５’－ａｇｃｃａｇａａａａｃａａｇｇｃｔｇａａ－３’（配列番号２９）、アンチセンス：５’－ｇｇｃｔｇｇｇｔｇｔｃｃａｇｔａｇｔｇｔ－３’（配列番号３０）
・Ｓｉｒｐａ　センス：５’－ｇｔａｇｇｔｇｃｇａｃｔｇｇｇａｔｇｔｔ－３’（配列番号３１）、アンチセンス：５’－ａｇｔｇａｇｇｃｃａａｃｔｃａｇｃｃｔａ－３’ （配列番号３２）
　骨芽細胞の転写産物の検出には以下のプライマーを使用した。
・Ｔｎｆｓｆ１１（ＲＡＮＫＬ）　センス：５’－ｃａｇｃａｔｃｇｃｔｃｔｇｔｔｃｃｔｇｔａ－３’（配列番号３３）、アンチセンス：５’－ｃｔｇｃｇｔｔｔｔｃａｔｇｇａｇｔｃｔｃａ－３’（配列番号３４）
・Ｔｎｆｓｆ１１ｂ（ＯＰＧ）　センス：５’－ｇｇｇｃｇｔｔａｃｃｔｇｇａｇａｔｃｇ－３’（配列番号３５）、アンチセンス：５’－ｇａｇａａｇａａｃｃｃａｔｃｔｇｇａｃａｔｔｔ－３’（配列番号３６）
　ｍＲＮＡの品質及び量はＧＡＰＤＨを用いて正規化した。
（糖鎖アレイアッセイ）
　糖鎖－タンパク質間の相互作用は、糖鎖マイクロアレイを用いたエバネッセント場蛍光励起検出システムにより検出した。すなわち、糖タンパク質やグリコシド－ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）を含む糖鎖プローブを非接触型マイクロアレイ印刷ロボット（ＭｉｃｒｏＳｙｓ　４０００、Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）を用いてマイクロアレイグレードエポキシ活性化ガラススライド（Ｓｃｈｏｔｔ社）上に３スポットずつ固定した。このガラススライドを２５℃で３時間インキュベートし、反応バッファー（０．８％　ＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、１　ｍＭ　ＭｎＣｌ２及び１ｍＭ　ＣａＣｌ２を含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４））で固定化した物質を除去し、次いでＴＢＳ（０．８％　ＮａＣｌ及び１％　ＢＳＡを含む２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４））で２０℃、１時間ブロッキングを行った。ＤＣＩＲ－Ｆｃ、ＤＣＩＲ－Ｆｃ変異体、又はＦｃと、Ｃｙ３－標識抗ヒトＦｃ抗体とのタンパク質複合体を反応バッファー中で、室温、遮光条件下で２０分間で作製した。
　作製したタンパク質複合体をガラススライドにチャンバあたり１００μｌ付与し、２０℃で３時間インキュベートした。洗浄工程を経ずに、結合をエバネッセント場蛍光励起スキャナ（ＳＣ－Ｐｒｏｆｉｌｅｒ、ＧＰ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で検出した。データはＡｒｒａｙ　Ｐｒｏ　ａｎａｌｙｚｅｒ　Ｖｅｒ．４．５（Ｍｅｄｉａ　Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社）で解析した。バックグラウンド強度（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）から生の強度（ｒａｗ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を差し引いた正味強度（ｎｅｔ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を３重測定の平均値±標準偏差として示す。
（血清の回収）
　全血は麻酔したマウスから心臓穿刺で採取した。採取した血液を４℃で一晩おいて凝固させ、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清を分離した。得られた血清は－８０℃で保存した。ＩＦＮ－γの量は、ＩＦＮ－γ用ＥＬＩＳＡキット（ＭＡＢＴＥＣＨ社）で検出した。
　日本国特許出願第２０１４－１４３４９１号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

Claims (10)

  1. 　下記式で表される構造を基本構造とする糖鎖（ただし、下記構造の２つの非還元末端にシアル酸が存在せず、ｘ及びｙはそれぞれ独立に３又は４を表す。）を有する化合物を有効成分として含む、樹状細胞免疫受容体活性化剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  2. 　請求項１に記載の樹状細胞免疫受容体活性化剤を細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む、樹状細胞免疫受容体活性化方法。
  3. 　下記式で表される構造を基本構造とする糖鎖（ただし、下記構造の２つの非還元末端にシアル酸が存在せず、ｘ及びｙはそれぞれ独立に３又は４を表す。）を有する化合物を有効成分として含む、破骨細胞形成抑制剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  4. 　請求項３に記載の破骨細胞形成抑制剤を破骨細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む、破骨細胞形成抑制方法。
  5. 　下記式で表される構造を基本構造とする糖鎖（ただし、下記構造の２つの非還元末端にシアル酸が存在せず、ｘ及びｙはそれぞれ独立に３又は４を表す。）を有する化合物を有効成分として含む、樹状細胞分化・増殖阻害剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  6. 　請求項５に記載の樹状細胞分化・増殖阻害剤を樹状細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む、樹状細胞分化・増殖阻害方法。
  7. 　下記式で表される構造を基本構造とする糖鎖（ただし、下記構造の２つの非還元末端にシアル酸が存在せず、ｘ及びｙはそれぞれ独立に３又は４を表す。）を有する化合物を有効成分として含む、サイトカイン産生抑制剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  8. 　請求項７に記載のサイトカイン産生抑制剤を樹状細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む、サイトカイン産生抑制方法。
  9. 　請求項１に記載の樹状細胞免疫受容体活性化剤を骨代謝疾患、自己免疫疾患又はアレルギー疾患の患者に投与することを含む、治療方法。
  10. 　下記式で表される構造を基本構造とする糖鎖（ただし、下記構造の２つの非還元末端にシアル酸が存在せず、ｘ及びｙはそれぞれ独立に３又は４を表す。）を有する化合物の存在下、又は前記化合物を対照として、被検物質の樹状細胞免疫受容体への結合性を測定し、樹状細胞免疫受容体活性化剤又は樹状細胞免疫受容体拮抗剤をスクリーニングすることを含む、スクリーニング方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
PCT/JP2015/069960 2014-07-11 2015-07-10 樹状細胞免疫受容体活性化剤、樹状細胞免疫受容体活性化方法、破骨細胞形成抑制剤、破骨細胞形成抑制方法、樹状細胞分化・増殖阻害剤、樹状細胞分化・増殖阻害方法、サイトカイン産生抑制剤、サイトカイン産生抑制方法、治療方法及びスクリーニング方法 WO2016006700A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15818141.2A EP3167889B1 (en) 2014-07-11 2015-07-10 Dendritic cell immune receptor activators for use in therapy
US15/323,748 US10792300B2 (en) 2014-07-11 2015-07-10 Dendritic cell immune receptor activator, method for activating dendritic cell immune receptor, osteoclast formation inhibitor, method for inhibiting osteoclast formation, dendritic cell differentiation/proliferation inhibitor, method for inhibiting dendritic cell differentiation/proliferation, cytokine production inhibitor, method for inhibiting cytokine production, therapeutic method and screening method
JP2016532988A JP6674685B2 (ja) 2014-07-11 2015-07-10 樹状細胞免疫受容体活性化剤、樹状細胞免疫受容体活性化方法、破骨細胞形成抑制剤、破骨細胞形成抑制方法、樹状細胞分化・増殖阻害剤、樹状細胞分化・増殖阻害方法、サイトカイン産生抑制剤、サイトカイン産生抑制方法、治療方法及びスクリーニング方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014143491 2014-07-11
JP2014-143491 2014-07-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016006700A1 true WO2016006700A1 (ja) 2016-01-14

Family

ID=55064326

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/069960 WO2016006700A1 (ja) 2014-07-11 2015-07-10 樹状細胞免疫受容体活性化剤、樹状細胞免疫受容体活性化方法、破骨細胞形成抑制剤、破骨細胞形成抑制方法、樹状細胞分化・増殖阻害剤、樹状細胞分化・増殖阻害方法、サイトカイン産生抑制剤、サイトカイン産生抑制方法、治療方法及びスクリーニング方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10792300B2 (ja)
EP (1) EP3167889B1 (ja)
JP (1) JP6674685B2 (ja)
WO (1) WO2016006700A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018207949A1 (ja) 2017-05-12 2018-11-15 学校法人東京理科大学 糖鎖修飾酵素を含む医薬組成物及び医薬組成物を用いた樹状細胞免疫受容体関連疾患の治療方法
WO2023140385A1 (ja) * 2022-01-21 2023-07-27 学校法人東京理科大学 炎症性腸疾患及び腸管腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を治療又は予防するための医薬組成物

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996002255A1 (fr) * 1994-07-15 1996-02-01 Taiyo Kagaku Co., Ltd. Composition medicamenteuse contenant un derive d'acide sialique
JP2000139463A (ja) * 1998-11-06 2000-05-23 Amersham Pharmacia Biotech Kk 遺伝子工学的手法による改変により構築した新規糖鎖認識特異性をもつレクチンおよびその製造手法
JP2007508328A (ja) * 2003-10-16 2007-04-05 ステファン ジョン ラルフ 免疫調節性組成物およびその使用方法
WO2008001498A1 (fr) * 2006-06-28 2008-01-03 Genodive Pharma Inc. Modèle animal d'une maladie associée à l'inactivation génique d'immunorécepteurs de cellules dendritiques
WO2011105424A1 (ja) * 2010-02-23 2011-09-01 国立大学法人東京大学 樹状細胞免疫受容体刺激剤

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6274148B1 (en) * 1990-11-08 2001-08-14 Chiron Corporation Hepatitis C virus asialoglycoproteins
JP4429386B2 (ja) 1994-12-01 2010-03-10 生化学工業株式会社 ケラタン硫酸オリゴ糖画分及びそれを含む薬剤
WO1997048712A1 (fr) * 1996-06-17 1997-12-24 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Derives asialotrisaccharide moranoline et medicaments

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996002255A1 (fr) * 1994-07-15 1996-02-01 Taiyo Kagaku Co., Ltd. Composition medicamenteuse contenant un derive d'acide sialique
JP2000139463A (ja) * 1998-11-06 2000-05-23 Amersham Pharmacia Biotech Kk 遺伝子工学的手法による改変により構築した新規糖鎖認識特異性をもつレクチンおよびその製造手法
JP2007508328A (ja) * 2003-10-16 2007-04-05 ステファン ジョン ラルフ 免疫調節性組成物およびその使用方法
WO2008001498A1 (fr) * 2006-06-28 2008-01-03 Genodive Pharma Inc. Modèle animal d'une maladie associée à l'inactivation génique d'immunorécepteurs de cellules dendritiques
WO2011105424A1 (ja) * 2010-02-23 2011-09-01 国立大学法人東京大学 樹状細胞免疫受容体刺激剤

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RIBOLDI E. ET AL.: "Human C-type Lectin Domain Family 4, Member C (CLEC4C/BDCA-2/ CD 303) Is a Receptor for Asialo-galactosyl-oligosaccharides", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 286, no. 41, 2011, pages 35329 - 35333, XP055250296, ISSN: 0021-9258 *
RIKIO YABE ET AL.: "DC-SIGN Kanren Lectin no Teiryoteki Sogo Sayo Kaiseki: Agalacto N-gata Tosa eno Shinki Tokuisei no Hakken", JOURNAL OF JAPANESE BIOCHEMICAL SOCIETY, 2009, pages ROMBUNN0. 4P-10 8, XP008183687 *
See also references of EP3167889A4 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018207949A1 (ja) 2017-05-12 2018-11-15 学校法人東京理科大学 糖鎖修飾酵素を含む医薬組成物及び医薬組成物を用いた樹状細胞免疫受容体関連疾患の治療方法
JPWO2018207949A1 (ja) * 2017-05-12 2020-03-12 学校法人東京理科大学 糖鎖修飾酵素を含む医薬組成物及び医薬組成物を用いた樹状細胞免疫受容体関連疾患の治療方法
US11324809B2 (en) 2017-05-12 2022-05-10 Tokyo University Of Science Foundation Method of preventing aggravation of a disease involving a biological mechanism controlled by a dendritic cell immunoreceptor
JP7103581B2 (ja) 2017-05-12 2022-07-20 学校法人東京理科大学 糖鎖修飾酵素を含む医薬組成物及び医薬組成物を用いた樹状細胞免疫受容体関連疾患の治療方法
WO2023140385A1 (ja) * 2022-01-21 2023-07-27 学校法人東京理科大学 炎症性腸疾患及び腸管腫瘍からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を治療又は予防するための医薬組成物

Also Published As

Publication number Publication date
EP3167889B1 (en) 2020-12-16
JP6674685B2 (ja) 2020-04-01
EP3167889A4 (en) 2017-07-05
EP3167889A1 (en) 2017-05-17
US10792300B2 (en) 2020-10-06
JPWO2016006700A1 (ja) 2017-06-08
US20170143754A1 (en) 2017-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cimbro et al. IL-7 induces expression and activation of integrin α4β7 promoting naive T-cell homing to the intestinal mucosa
Yang et al. Sestrin2 suppresses classically activated macrophages-mediated inflammatory response in myocardial infarction through inhibition of mTORC1 signaling
Ozawa et al. Thymic stromal lymphopoietin secretion of synovial fibroblasts is positively and negatively regulated by Toll-like receptors/nuclear factor-κB pathway and interferon-γ/dexamethasone
Shen et al. TRAF3 promotes ROS production and pyroptosis by targeting ULK1 ubiquitination in macrophages
Berla Thangam et al. Airway smooth muscle cells enhance C3a‐induced mast cell degranulation following cell‐cell contact
Ueda et al. Fyn promotes Th17 differentiation by regulating the kinetics of RORγt and Foxp3 expression
Fang et al. Transcription factor E2F1 suppresses dendritic cell maturation
Yuan et al. Mycobacterium tuberculosis mannose-capped lipoarabinomannan induces IL-10-producing B cells and hinders CD4+ Th1 immunity
Labonte et al. Expression of scavenger receptor‐AI promotes alternative activation of murine macrophages to limit hepatic inflammation and fibrosis
Schroeder et al. Activation of human basophils by A549 lung epithelial cells reveals a novel IgE-dependent response independent of allergen
Feng et al. The therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells in the acute lung injury induced by sulfur mustard
Huynh et al. ITAM-coupled receptors inhibit IFNAR signaling and alter macrophage responses to TLR4 and Listeria monocytogenes
McDonald et al. Nogo receptor is involved in the adhesion of dendritic cells to myelin
Park et al. Interleukin-9 inhibits lung metastasis of melanoma through stimulating anti-tumor M1 macrophages
Tare et al. KU812 cells provide a novel in vitro model of the human IL-33/ST2L axis: functional responses and identification of signaling pathways
Chu et al. STAT6 pathway is critical for the induction and function of regulatory T cells induced by mucosal B cells
JP6674685B2 (ja) 樹状細胞免疫受容体活性化剤、樹状細胞免疫受容体活性化方法、破骨細胞形成抑制剤、破骨細胞形成抑制方法、樹状細胞分化・増殖阻害剤、樹状細胞分化・増殖阻害方法、サイトカイン産生抑制剤、サイトカイン産生抑制方法、治療方法及びスクリーニング方法
Sanseverino et al. STAT3-silenced human dendritic cells have an enhanced ability to prime IFNγ production by both αβ and γδ T lymphocytes
Miralda et al. Siglec-9 is an inhibitory receptor on human mast cells in vitro
Zheng et al. Co-culture with synovial tissue in patients with rheumatoid arthritis suppress cell proliferation by regulating MAPK pathway in osteoblasts
Ortner et al. The adaptor protein Bam32 in human dendritic cells participates in the regulation of MHC class I-induced CD8+ T cell activation
Liu et al. Adhesion of monocytes to periodontal fibroblasts requires activation of NOD1/2-and TLR4-mediated LFA-1 and VLA-4
Matsumiya et al. High frequency of Bob1lo T follicular helper cells in florid reactive follicular hyperplasia
US11846629B2 (en) MonoMac-1 cells expressing CD16 and CD163
Liu et al. Bcl-3 regulates the function of Th17 cells through raptor mediated glycolysis metabolism

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15818141

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016532988

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15323748

Country of ref document: US

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2015818141

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2015818141

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE