JP6674685B2 - 樹状細胞免疫受容体活性化剤、樹状細胞免疫受容体活性化方法、破骨細胞形成抑制剤、破骨細胞形成抑制方法、樹状細胞分化・増殖阻害剤、樹状細胞分化・増殖阻害方法、サイトカイン産生抑制剤、サイトカイン産生抑制方法、治療方法及びスクリーニング方法 - Google Patents
樹状細胞免疫受容体活性化剤、樹状細胞免疫受容体活性化方法、破骨細胞形成抑制剤、破骨細胞形成抑制方法、樹状細胞分化・増殖阻害剤、樹状細胞分化・増殖阻害方法、サイトカイン産生抑制剤、サイトカイン産生抑制方法、治療方法及びスクリーニング方法 Download PDFInfo
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Description
<1>下記式で表される構造を基本構造とする糖鎖(ただし、下記構造の2つの非還元末端にシアル酸が存在せず、x及びyはそれぞれ独立に3又は4を表す)を有する化合物を有効成分として含む、樹状細胞免疫受容体活性化剤。
<2>前記<1>に記載の樹状細胞免疫受容体活性化剤を細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む、樹状細胞免疫受容体活性化方法。
<3>上記式で表される糖鎖構造を有する化合物を有効成分として含む、破骨細胞形成抑制剤。
<4>前記<3>に記載の破骨細胞形成抑制剤を破骨細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む、破骨細胞形成抑制方法。
<5>上記式で表される糖鎖構造を有する化合物を有効成分として含む、樹状細胞分化・増殖阻害剤。
<6>前記<5>に記載の樹状細胞分化・増殖阻害剤を樹状細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む、樹状細胞分化・増殖阻害方法。
<7>上記式で表される糖鎖構造を有する化合物を有効成分として含む、サイトカイン産生抑制剤。
<8>前記<7>に記載のサイトカイン産生抑制剤を樹状細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む、サイトカイン産生抑制方法。
<9>前記<1>に記載の樹状細胞免疫受容体活性化剤を骨代謝疾患、自己免疫疾患又はアレルギー疾患の患者に投与することを含む、治療方法。
<10>上記式で表される糖鎖構造を有する化合物の存在下、又は前記化合物を対照として、被検物質の樹状細胞免疫受容体への結合性を測定し、樹状細胞免疫受容体活性化剤又は樹状細胞免疫受容体拮抗剤をスクリーニングすることを含む、スクリーニング方法。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
「樹状細胞免疫受容体活性化」とは、本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤を樹状細胞免疫受容体に接触させることで、本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤を樹状細胞免疫受容体に接触させない場合よりも樹状細胞免疫受容体の活性が高められた状態にすることを意味する。
「破骨細胞形成抑制」とは、本発明の破骨細胞形成抑制剤を樹状細胞免疫受容体に接触させることで、本発明の破骨細胞形成抑制剤を樹状細胞免疫受容体に接触させない場合よりも破骨細胞の形成が抑制された状態にすることを意味する。
「サイトカイン産生抑制」とは、本発明のサイトカイン産生抑制剤を樹状細胞免疫受容体に接触させることで、本発明のサイトカイン産生抑制剤を樹状細胞免疫受容体に接触させない場合よりもサイトカインの産生が抑制された状態にすることを意味する。
「樹状細胞分化・増殖阻害」とは、本発明の樹状細胞分化・増殖阻害剤を樹状細胞免疫受容体に接触させることで、本発明の樹状細胞分化・増殖阻害剤を樹状細胞免疫受容体に接触させない場合よりも樹状細胞の形成が阻害された状態にすることを意味する。
「治療」とは、治療対象である疾病の症状を消失させることのほか、重症化の抑制、症状の軽減又は緩和もこの用語に包摂される。
本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤は、下記式で表される構造を基本構造とする糖鎖(ただし、下記構造の2つの非還元末端にシアル酸が存在しせず、x及びyはそれぞれ独立に3又は4を表す)を有する化合物(以下、特定糖鎖含有化合物とも称する)を有効成分として含む。このような構造を有する化合物がDCIRに特異的に作用するリガンドであるという知見は、これまでに報告されていないものである。
特定糖鎖含有化合物が生体由来でない化合物である場合の例としては、上記糖鎖構造の還元末端がポリアクリルアミド(PAA)、パラニトロフェニルフェノール(pNP)、アミノピリジン(PA)等に結合したものを挙げることができる。
本発明の樹状細胞免疫受容体活性化方法は、本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤を細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む。樹状細胞免疫受容体活性化剤を細胞に接触させる方法は特に制限されず、経口投与、静脈内投与、留置等の外科的処置などを挙げることができる。樹状細胞免疫受容体に接触させる樹状細胞免疫受容体活性化剤の量は特に制限されず、樹状細胞免疫受容体の活性の状態、意図する活性化の度合、特定糖鎖含有化合物とともに使用する他の成分の種類や量等に応じて選択できる。
本発明の破骨細胞形成抑制剤は、特定糖鎖含有化合物を有効成分として含む。有効成分として含まれる特定糖鎖含有化合物は、DCIRを活性化させるリガンドとして作用する。DCIRは破骨細胞の形成を負に制御する役割を果たしている。従って、本発明の破骨細胞形成抑制剤をDCIRに接触させてDCIRを活性化させることで、破骨細胞の形成を抑制することができる。
本発明の破骨細胞形成抑制方法は、本発明の破骨細胞形成抑制剤を破骨細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む。破骨細胞形成抑制剤を樹状細胞免疫受容体に接触させる方法は特に制限されず、経口投与、静脈内投与、留置等の外科的処置などを挙げることができる。樹状細胞免疫受容体に接触させる破骨細胞形成抑制剤の量は特に制限されず、破骨細胞形成の状態、意図する破骨細胞形成の抑制の度合、特定糖鎖含有化合物とともに使用する他の成分の種類や量等に応じて選択できる。
本発明の樹状細胞分化・増殖阻害剤は、特定糖鎖含有化合物を有効成分として含む。有効成分として含まれる特定糖鎖含有化合物は、DCIRを活性化させるリガンドとして作用する。DCIRは樹状細胞分化・増殖を負に制御する役割を果たしている。従って、本発明の樹状細胞分化・増殖阻害剤をDCIRに接触させてDCIRを活性化させることで、樹状細胞の分化・増殖を阻害することができる。
本発明の樹状細胞の分化・増殖阻害方法は、本発明の樹状細胞の分化・増殖阻害剤を樹状細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む。樹状細胞の分化・増殖阻害剤を樹状細胞免疫受容体に接触させる方法は特に制限されず、経口投与、静脈内投与、留置等の外科的処置などを挙げることができる。樹状細胞免疫受容体に接触させる樹状細胞の分化・増殖阻害剤の量は特に制限されず、樹状細胞の分化・増殖の状態や、意図する樹状細胞の分化・増殖の阻害の程度に応じて選択できる。
本発明のサイトカイン産生抑制剤は、特定糖鎖含有化合物を有効成分として含む。有効成分として含まれる特定糖鎖含有化合物は、DCIRを活性化させるリガンドとして作用する。DCIRはある種のサイトカインの産生を負に制御する役割を果たしている。従って、本発明のサイトカイン産生抑制剤をDCIRに接触させてDCIRを活性化させることで、サイトカインの産生を抑制することができる。
本発明のサイトカイン産生抑制方法は、本発明のサイトカイン産生抑制剤を樹状細胞の樹状細胞免疫受容体に接触させることを含む。サイトカイン産生抑制剤を樹状細胞免疫受容体に接触させる方法は特に制限されず、経口投与、静脈内投与、留置等の外科的処置などを挙げることができる。樹状細胞免疫受容体に接触させるサイトカイン産生抑制剤の量は特に制限されず、サイトカイン産生の状態、意図するサイトカイン産生の抑制の度合、特定糖鎖含有化合物とともに使用する他の成分の種類や量等に応じて選択できる。
本発明の治療方法は、本発明の樹状細胞免疫受容体活性化剤を骨代謝疾患、自己免疫疾患又はアレルギー疾患の患者に投与することを含む。
本発明のスクリーニング方法は、特定糖鎖含有化合物の存在下又は特定糖鎖含有化合物を対照として、被検物質の樹状細胞免疫受容体への結合性を測定し、樹状細胞免疫受容体活性化剤又は樹状細胞免疫受容体拮抗剤をスクリーニングすることを含む。
破骨細胞の分化に関係する因子であるマクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)と核因子κBリガンドの受容体活性化因子(RANKL)の存在下でmRNA及びタンパク質レベルで形成したM−CSF誘発骨髄マクロファージ細胞(BMM)と破骨細胞にDCIRを発現させた(図1〜3)。遺伝子の発現は破骨細胞の成熟に伴って増加した。DCIRはCD11b陽性細胞(OsteoMacs)によって検出されたが、エンリッチされた骨芽細胞には検出されなかった(図4)。
骨髄中の破骨細胞前駆体数の頻度を確認するため、骨髄中の造血細胞を調べた。フローサイトメトリー解析の結果、Dcir−/−マウスの破骨細胞前駆体数の頻度(CD11bloLy6Chi)は野生型のそれと同程度であった(図12、13)。このことから、DCIRが破骨細胞の分化に関係していることがわかった。
Dcir−/−マウスの骨の構造について、脛骨遠位骨幹端部の組織形態計測的な評価を行った。その結果、破骨細胞及び骨芽細胞の双方のパラメータが増加していた(図26)。マイクロCT撮影によると、8週齢のDcir−/−マウスの大腿骨に軽度の大理石骨病が発症しており(図27)、骨体積及び骨梁数が増加していた(図27)。さらに、動的組織形態計測による解析結果は骨梁表面における単位あたりの骨石灰化速度及び骨形成速度の上昇を示していた(図28)。これらの結果は、DCIRの欠損が、骨芽細胞による骨の形成が破骨細胞による骨の破壊よりも優勢であり、破骨細胞と骨芽細胞のバランスにより制御される骨代謝が骨形成に傾いていることを示唆している。
受容体がシグナルカスケードを開始してその生物学的機能を発揮するためには、リガンドの結合が必要である。破骨細胞形成のインビトロ培養系はBMMのみ存在するため、DCIRのリガンドはBMM又は破骨細胞に発現すると推測した。DCIRの細胞外ドメインとヒトIgG2のFc領域との融合が生じたときに生じるDCIR−Fc染色に対してマクロファージと破骨細胞の一部は陽性であったが、その結合はCRDのアミノ酸の変化を生じさせるDCIR−Fc変異体であるDCIR E197A/S199A−Fcにより減少した。
以下のようにして、Flt3Lの分化誘導により樹状細胞を作製した。野生型マウスの大腿骨の骨髄細胞を摘出し、赤血球を溶血バッファー(140mM NH4Cl及び17mM Tris−HCl、pH7.2)に入れ、氷上で10分間おいた。細胞を10%FBS、抗生物質混合物、必須アミノ酸、2−メルカプトエタノールを含む培地にて、100ng/mlのヒトFlt3L組み変え体の存在下、24ウェルプレートにウェルあたり100万個となるよう播種した。4日後、100ng/mlのヒトFlt3L組変え体(Milteny社)を各ウェルに添加してさらに4日間培養した。その後、細胞を回収し、96ウェルプレートにウェルあたり50万個の細胞を播種した。
(マウスの作製及び入手先)
Dcir−/−マウス及びIfnγ−/−マウスは既報に従い作製し、C57BL/6と12世代戻し交配した。Rag2−/−マウスは公益財団法人実験動物中央研究所より提供を受けた。Ifn−γ−/−Dcir−/−マウスの作製のため、当研究室でDcir−/−マウスをIfnγ−/−マウスと交配した。実験で使用したマウスはすべて8〜12週齢のオスである。対照として用いた週齢及び性別が同じであるC57BL/6Jマウスは日本エスエルシー株式会社より購入した。すべてのマウスは公益財団法人日本動物学会のガイドラインに従って東京大学又は東京理科大学内で飼育し、すべての実験は東京大学医科学研究所又は東京理科大学の動物実験委員会の承認を得て行った。なお、マウスDCIRの遺伝子の塩基配列はGene ID:Clec4a2、NCBIのアクセッションNo.NM001170332のうち273番目〜1061番目の塩基の配列に相当する。
各群の統計的差異はtwo−tailed unpaired students’ t−test (*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、NSは非有意)により判断し、P<0.05で統計的に有意な差があると判断した。
M−CSF依存性骨髄由来マクロファージを作製するため、α−minimal essential medium(α−MEM)(商品名Gibco、Life Technologies)で大腿骨の骨髄腔を洗い流し、ペニシリン(100単位/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)及び10%熱非動化ウシ胎児血清を補充してBM細胞を単離した。赤血球を溶血バッファー(140mM NH4Cl及び17mM Tris−HCl、pH7.2)を用いて氷上で10分間かけて破壊し、100mm径ディッシュで1時間プレインキュベートした。非接着性細胞(造血細胞)を回収し、20ng/mlのヒトM−CSF組み換え体(R&D Systems社)の存在下で96ウェルプレートに1ウェルあたり50,000個の細胞を播種し、2日間おいた。M−CSFにより増殖した細胞を骨髄由来マクロファージ(BMM)とした。破骨細胞を作製するため、BMMをさらに20ng/mlのM−CSFと100ng/mlの可溶性ヒトRANKL組み換え体(オリエンタル酵母工業株式会社)の存在下で培養し、培地を2日おきに交換した。成熟したマクロファージを得るため、BMMを20ng/mlのM−CSFの存在下で6日間培養し、培地を2日おきに交換した。一部の実験では、100mmディッシュで培養したBMMをCell Dissociation Solution Non−ezymatic 1×(Sigma−Aldrich社)で解離し、同数のBMMを再播種して破骨細胞の形成を誘発した。
接着細胞を10%ホルマリンで3分間固定し、固定バッファー(50%エタノール及び50%アセトン)で1分間さらに固定した。固定した細胞をナフトールAS−MXリン酸塩(ナカライテスク株式会社)及びファストレッド(ナカライテスク株式会社)で10〜15分間室温で染色し、3分間水洗した。細胞核が3以上又は10以上存在するTRAP陽性細胞を多核化した破骨細胞とし、その数を数えた。
マウスDCIRのcDNAを、プライマーとしてセンス:5’−cgggatcccaccatggcttcagaaatcacttatg(配列番号1)及びアンチセンス:5’−cggaattctcataagtttattttcttca(配列番号2)を用いて増幅した。PCRで得られた産物を、BamHI及びEcoRIサイトでpMXs−IRES−Puro(東京大学の北村俊雄教授より提供を受けた)にクローニングした。pMXsベクターを大腸菌(DH5α)から単離した。DCIR Y/F変異体を、KOD−Plus−Mutagenesis Kit(東洋紡株式会社)を用いて作製した。すなわち、DCIRのITIMにおけるチロシンをフェニルアラニンに置換するためのフォワードプライマー:5’−cactTttgcagaagtgaagttcaagaatgaatc(配列番号3、大文字のTはアデノシン)及びリバースプライマー:5’−atttctgaagccatggtgggatccttggttaac(配列番号4、大文字のTはアデノシン)を設計した。pMXsベクターをテンプレートとした逆PCRを行い、典型的なE.coliセルラインのメチル化したDNAを消化可能なDpnIで消化した。消化していないPCR産物を、T4ポリヌクレオチドキナーゼ及びリガーゼを用いて16度で1時間セルフライゲートした。plat−Eパッケージングセルライン(東京大学の北村俊雄教授より提供を受けた)を10%FBS α−MEMで培養し、1日おきに1対5の割合で分割した。レトロウイルスベクターをPlat−E細胞にLipofectamine 2000(Invitrogen社)を用いて導入した。8時間インキュベートした後、培地を交換し、さらに24時間インキュベートした。レトロウイルス上清を回収し、使用するまで−80℃で冷凍した。DCIRのBMとDCIR変異体のBMをレトロウイルスによって形質導入するため、非接着性骨髄細胞をレトロウイルス上清20μlを含む培地100μlで培養し、培地を1日おきに交換した。
BMMをCell Dissociation Solution Non−ezymatic 1×(Sigma−Aldrich社)を用いて回収し、濃度を変化させたM−CSFの存在下で96ウェルプレートの各ウェルに300,000個ずつ入れた。2〜3時間後、1.0μCiの[3H]チミジン(PerkinElmer社)を添加し、さらに48時間37℃でインキュベートした。細胞はSkatronマイクロプレートウォッッシャー上清回収システム(Molecular Device社)を用いてガラスファイバーフィルターを通した。[3H]チミジンのDNAへの導入は、MicroBetaマイクロプレートカウンターシステム(PerkinElmer社)によって確認した。
BM細胞と末梢血単核細胞(PBMC)の血液細胞溶解を溶血バッファー(140mM NH4Cl及び17mM Tris−HCl、pH7.2)を用いて氷上で行った。BMMとPBSを分離し、FACSバッファー(2%FBSを含むPBS)で洗浄し、血清成分を除去した。これらの細胞のFc受容体はFc受容体ブロッカーである2.4G2で、4度で10分間ブロックした。その後、細胞をFACSバッファーで2度洗浄し、蛍光標識した抗体とともに30分間氷上でインキュベートした。抗体としては、APC−又はPE−CD11b(BioLegend社)、FITC−Ly6c(BioLegend社)、APC−c−Fms(BioLegend社)、biotin−RANK(eBioscience社)及びPE−Clec4a(R&D Systems社)を使用した。細胞内分子の染色にはFITC−CD3、Pacific Blue−CD4、APC−CD8、BV510−CD11b、PE−IFN−γ(BioLegend社)を使用した。DCIRリガンド検出用のFc−タンパク質と抗IgG抗体とからなるタンパク質複合体を形成するため、10μg/mlのDCIR−Fc−タンパク質、DCIR−Fc−タンパク質変異体、又はFc−タンパク質を、5μg/mlのFITC標識抗ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories社)とともにカルシウム及びマグネシウムを含有するバッファー(2mM CaCl2、2mM MgCl2及び0.5%BSAを含むTBS)で、15分間室温でインキュベートした。マクロファージと破骨細胞を上記のタンパク質複合体で1時間、4℃で染色し、Ca2+/Mg2+バッファーで洗浄した。フローサイトメトリーをFACSCanto II(Becton Dickinson社)を用いて実施し、Flowjoソフトウェア(Tree Star社)を用いて分析した。細胞内染色のため、細胞をまず2.4G2で染色し、次いで固定前の表面抗原をFITC−CD3で染色した。FACSバッファーで洗浄後、固定/透過化バッファー(eBioscience社)を添加し、4℃で60分おいた。遠心分離後、固定/透過化バッファーをデカンテーションし、0.1%サポニン含有FACSバッファーで2回洗浄した。これらの細胞は表面抗原及び細胞内分子を一次抗体で染色し、0.1%サポニンバッファーで希釈した。
全RNAはBMM及び破骨細胞からGenEluteTM Mammalian Total RNA Miniprepキット(Sigma−Aldrich社)を用いて抽出した。全RNAの定量はNanoDropを用いて行った。1μgの全RNAをSuperscript II Reverse Transcriptase(Invitrogen社)を用いて逆転写し、1本鎖cDNAを合成した。定量PCRを全RNAに相当する5ng、SYBR Green I(タカラバイオ株式会社)、フォワード及びリバースプライマー(Operon社)を含めた全反応容量を10μlとし、2又は3サンプルとして行った。定量はCFX384TMリアルタイムシステム(バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社)を用いて行った。サイクル数は1サイクル目を95℃で1分、続く44サイクルを95℃で3秒/60度で30秒とした。プライマーとしてはDCIRのセンス:5’−cctggtgattctatgctgtggt−3’(配列番号5)、アンチセンス:5’−gtcagaagagagccttgttccttc−3’(配列番号6)、GAPDHのセンス:5’−ttcaccaccatggagaaggc−3’(配列番号7)、アンチセンス:5’−ggcatggactgtggtcatga−3’(配列番号8)を用いた。プライマーの最終濃度は400nMであった。GAPDHはインターナルハウスキーピング遺伝子として用いた。目的の遺伝子とハウスキーピング遺伝子を、水サンプルをネガティブリファレンスとして1プレートで同時に定量した。サンプル間のRNAの品質と初期量の違いはGAPDHで正規化した。目的の遺伝子の相対的発現は、2−dCt(dCt=目的遺伝子の平均Ct値−ハウスキーピング遺伝子の平均Ct値)として計算した。目的の遺伝子の2日目に対する3日目及び4日目のfold changeは2−ddCt(ddCt=3日目及び4日目の各サンプルにおける(目的遺伝子の平均Ct値−ハウスキーピング遺伝子の平均Ct値)−2日目の(目的遺伝子の平均Ct値−ハウスキーピング遺伝子の平均Ct値)として計算した。標準偏差は既報に従い、数学的手法で計算した。RT−PCRをEx−taq(タカラバイオ株式会社)を用いて反応容量20μlとして行った。DCIRを増幅するためのプライマーとして、センス:5’−catttcccttatctcgccctgg−3’(配列番号9)、アンチセンス:5’−gcatgagtgtccaagatcc−3’(配列番号10)を使用し、686pbの産物を増幅した。PCR反応は30サイクルを98℃で10秒、55℃で30秒、72℃で1分間行った。内部標準としてGAPDHを使用した。
M−CSF及びRANKLを介したシグナルのウェスタンブロッティングのため、BMMを5ng/mlのM−CSFとともに12ウェルプレートに各ウェル250,000個ずつ再播種した。24時間培養後、刺激前にBMMをM−CSFを添加しない血清フリー培地にて6時間おいた。次いで、20ng/mlのM−CSF又は100ng/mlのRANKLを添加して所定の時間、細胞を活性化した。細胞は1%NP−40溶液(10mM Tris−HCl、pH7.5、100mM NaCl、5mM MgCl2、プロテナーゼ阻害剤カクテル(Thermo Fischer Scientific社)及びホスファターゼ阻害剤カクテル(Roche社))に溶解して細胞溶解物を得た。溶解物を氷上に10分おき、15,000rpmで10分間遠心分離して清澄化した。等量の溶解物サンプルをSDS−ポリアクリルアミドゲルで230Vにて30分間分離した。ゲルはPVDF膜上に定電流230mAとし、膜あたり25分でセミドライシステム(バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社)により電気的に転写した。PVDF膜は5%のTween 20を含むTBSに5%BSA(Sigma−Aldrich社)を溶かした中で1時間室温でブロックし、一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした後、HRP標識二次抗体でプローブした。PVDF膜はECL Prime Western Blotting Detection System(GE Healthcare社)を用いてタンパク質シグナルを可視化した。
マウスDCIRの細胞外ドメイン(EC)をカバーするアミノ酸配列70〜238番目のcDNAを、pFUSE−hIgG2−Fc2ベクター(Invitrogen社)にBgl IIサイトにてサブクローニングした。ECをコードするcDNAは、プライマーとしてセンス:5’−ataagatctcaaaagtactctcaacttctt−3’(配列番号11)、アンチセンス:5’−ataagatcttaagtttattttcttcatc−3’(配列番号12)を用いて作製した。グルタミン酸とセリンがアラニンに置換されたCRDドメインの部位特異的変異体を、KOD−Plus−Mutagenesisキット(東洋紡株式会社)を用いて作製した。プライマーとしては、以下のものを使用した。
・E197A センス:5’−AATGGTGCTCCCAGCAGTGGCAATGAA−3’(配列番号13)、アンチセンス:5’−TGTAAGACCGTGTTACCACGAGGGTCA−3’(配列番号14)
・S199A センス:5’−GAGCCCGCTAGTGGCAATGAAAAATGT−3’(配列番号15) 、アンチセンス:5’−ACCGTGTTACCACTCGGGCGATCACCG−3’(配列番号16)
・E197A/S199A センス:5’−GGTGCTCCCGCTAGTGGCAATGAAAAATGTGCT−3’(配列番号17) 、アンチセンス:5’−TAGTGTAAGACCGTGTTACCACGAGGGCGATCA−3’(配列番号18)
野生型BMM及びDcir−/−BMMの破骨細胞への分化を、M−CSF及びRANKLの存在下で誘導した。GlycoTech社より購入したアシアロ二本鎖N型糖鎖(NA2)を非接着性BM細胞の培養初期に加え、培地を交換するごとに継続的に添加した。破骨細胞の数をTRAP染色により数えた。NA2の生物活性を評価するため、M−CSF(20ng/ml)又はRANKL(100ng/ml)による刺激を付与する前に、BMMをNA2の存在下又は非存在下で6時間処理した。細胞溶解物をウェスタンブロット法により解析し、シグナル化合物のリン酸化のレベルを調べた。
6日間培養したBMMをCell Dissociation Solution Non−ezymatic 1×(Sigma−Aldrich社)にて回収し、TSAバッファー(2mM CaCl2、2mM MgCl2及び0.5%BSAを含むTBS)に再度懸濁させた。次いで、10万細胞あたり0.5μlのノイラミニダーゼ(Roche社)でBMMを37℃で30分間処理した。その後、細胞をTSAバッファーで洗浄し、FACS分析を行った。シアル酸の脱離が破骨細胞形成に与える影響を調べるため、1μlのノイラミニダーゼ(Roche社)の存在下で非接着性BM細胞から破骨細胞を誘導した。ノイラミニダーゼは培地を1日おきに交換する際に補充した。
骨形成の様子を調べるための動的組織形態計測学的解析は株式会社クレハ分析センターにて行った。野生型マウス及びDcir−/−マウスの8週齢における体重を測定し、16mg/kg(体重)のカルセイン(ナカライテスク株式会社)を2日おきに2回マウスの腹腔内に投与した。2度目の投与から2日後に脛骨を摘出して軟組織及び筋肉を取り除き、70%エタノールで1週間、毎日エタノールを交換して固定した。石灰化した部分が緑の線として染色された。脱灰していない骨組織はグリコールメタクリレート(GMA)の組織への浸入を促すためメチルベンゾエート中に15分間おき、次いで5%のメチルベンゾエートを含むGMA(4℃)に浸漬し、2時間の間に3回交換した。次いで、骨組織をGMAに埋め込んだ。3μm厚の脛骨断片をミクロトーム(サクラファインテックジャパン株式会社)を用いて作製し、石灰化前線における蛍光を検出した。動的組織形態計測学的解析のため、石灰化表面(石灰化表面/骨表面[MS]/[BS];%)、骨石灰化速度([MAR];μm/day)、骨形成速度([BFR]/[Bs];μm3/μm2/day)を画像解析装置(System supply社)で倍率400倍として調べた。
マウス脛骨の組織形態計測学的分析は株式会社クレハ分析センターにて行った。野生型マウス及びDcir−/−マウスの骨を、8週齢のマウス1群あたり5〜6個体から取り出し、70%エタノールで固定した。骨構造の組織形態計測パラメータを測定するため、3μm厚のGMAに埋め込んだ大腿骨組織断片をトルイジンブルーで染色した。柱状骨パラメータは、成長板から0.3mmはなれた地点から末端方向に幅1.05mmの二次海綿骨の面積とした。骨幹端における柱状骨をHistometryRT CAMERAで観察した。破骨細胞数([Oc.N]/100mm)と破骨細胞表面積([Oc.S]/[BS];%)は、1以上の核を有し、柱状骨表面で吸収窩を形成している細胞を破骨細胞として計測した。骨芽細胞数([Ob.N]/100mm)及び骨芽細胞表面積([Ob.S]/[BS];%)を含む骨リモデリングのパラメータは、トルイジンブルーで染色した断面において測定した。
野生型マウスとDcir−/−マウスの骨の構造特性について、高解像度マイクロCTシステムで調べた。大腿骨骨幹端の末端における長さ1.814mmの海綿骨断面をマイクロCTシステム(Scan Xmate−L090、コムスキャンテクノ株式会社)でスキャンした。3D画像解析をTRI/3D BONソフトウェア(ラトックシステム株式会社)を用いて行った。骨梁のミネラル濃度は骨密度(骨体積[BV]/骨組織体積[TV])、骨梁幅(Tb.Th.=2×BV/骨表面積[BS])、骨梁数(Tb.N=(BV/TV)/Tb.Th.)、骨梁間隔(Tb.Sp=1/Tb.N・Tb.Th.)及び骨梁中心距離(Tb.Spac=1/Tb.N)により評価した。骨梁数は、骨梁細胞の数とした。
ヘパリンを含む21ゲージ針付注射器(持田製薬株式会社)を用いて麻酔下のマウスより心臓穿刺により全血を採取した。血液は10倍量の溶血バッファーと混合し、氷上に10分間おいた。次いで1500rpmで5分間、4℃で遠心分離し、単核細胞を回収した。以上の処理を3回繰り返した。末梢血単核球(PBMC)をホルボールミリスタートアセタート(最終濃度:500ng/ml)で5時間刺激し、さらにイオノマイシン(最終濃度:50ng/ml)とブレフェルジンA(最終濃度:10μg/ml)でインキュベーションの全期間にわたって刺激した。PBMCによりIFN−γが産生されていることが細胞内分子染色とフローサイトメトリー解析より検出された。
頭蓋冠細胞を連続消化及び定法により作製した。すなわち、頭蓋冠を生後1〜2日のマウス新生児より摘出し、接着性間葉組織を除去した。この頭蓋冠を0.1%コラゲナーゼ(和光純薬工業株式会社)と0.1%ディスパーゼ(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)を含む分解液で10分間、37℃で撹拌しながら処理して1回目の消化を行った。デブリを含む溶液を捨て、残った頭蓋冠を上記と同じ分解液で37℃で1時間、さらに消化した。連続消化後、単離した細胞はα−MEM(10%FCS、ペニシリン100単位/ml、ストレプトマイシン100μg/ml)に懸濁させ、12ウェルプレートにウェルあたり20万個となる濃度で播種した。2日間培養後、細胞を骨形成培地(10%FBS、50μg/mlアスコルビン酸(Sigma−Aldrich社)、10mM β−グリセロリン酸(Calbiochem社)及び抗生物質を添加したα−MEM)で14日間又は21日間インキュベートした。培地は3日おきに交換した。
マウス骨芽細胞の培養及び分化は上述の方法で行った。初代頭蓋冠細胞を、マウスIFN−γ組み換え体(PeproTech社)の存在下で培養した。IFN−γは骨形成培地を交換する度に添加した。
頭蓋冠細胞は上記の方法でマウス新生児より採取し、赤血球細胞を溶血バッファーで10分間、37℃で溶解させた。残存する細胞は、1000万個の全細胞あたり90μlのautoMACS Running Buffer(Miltenyi Biotec社)に再懸濁し、1000万個の全細胞あたり10μlのCD11b MicroBeads(Miltenyi Biotec社)で15分間、4℃でインキュベートした。細胞はMACSバッファーで洗浄し、108 個の細胞あたり500μlのautoMACS Running Bufferに再懸濁し、75ナイロンメッシュ(75×75μm メッシュ)を通して細胞の凝集塊を除去した。CD11bに対し陽性の画分と陰性の画分とをauto MACS Pro separator(Milteny Biotec社)で分離し、それぞれの細胞をOsteoMacs又は初代骨芽細胞として使用した。
骨芽細胞の石灰化の形成は、フォン・コッサ法及びアリザリンレッドSによる染色で確認した。フォン・コッサ法による染色は、培養した骨芽細胞を10%ホルマリンで10分間室温で固定し、洗浄後、固定した細胞を5%硝酸銀溶液中で30分間明るい日光に曝露し、次いで5%チオ硫酸ナトリウムで洗浄することで行った。石灰化した結節は暗褐色又は黒色の斑点として可視化された。アリザリンレッドSによる染色は、培養した骨芽細胞を10%ホルマリンで10分間室温で固定し、1%アリザリンレッドS(pH4.2)で10分間室温で染色し、蒸留水で余分な染料を除去することで行った。石灰化した結節は暗赤色の斑点として可視化された。染色した細胞の画像はGT−X770イメージスキャナ(セイコーエプソン株式会社)で撮影した。
初代頭蓋冠細胞は酵素的に採取し、12ウェルプレートにウェルあたり20万個としてビタミンD3(10−8M)とプロスタグランジンE2(10−6M)を含むα−MEMとともに播種し、24時間おいた。10倍の数の非接着性骨髄細胞を、初代骨芽細胞とともに7日間共培養した。培地は3日おきに交換した。
骨芽細胞は既述の方法で5日間100mmディッシュにて培養して作製した。この骨芽細胞を酵素的に採取し、M−CSF及びRANKLの存在下、Osteo Assay プレート(Corning社)にウェルあたり2万個の細胞を再播種した。3日後、1Mアンモニア溶液中で30秒間の超音波破壊により細胞を除去した。リン酸カルシウムでコーティングされたウェルの表面全体の画像を顕微鏡(株式会社キーエンス)に取り込み、吸収された領域の面積をImageJで解析した。
96ウェルプレートを10mg/mlのフィブロネクチン(Sigma−Aldrich社)でコーティングし、4℃で一晩おいた。ウェルをPBSで2度洗浄し、2日培養したBMMをM−CSF(20ng/ml)とともに、又はM−CSFなしで5万個播種し、2分間、5分間又は10分間経過させた。次いで、細胞をDMEMで2度洗浄し、メタノールで2分間固定し、クリスタルバイオレットの0.5%蒸留水溶液で染色した。蒸留水で5回洗浄後、100mlの1%SDSを各ウェルに添加して色素を可溶化し、595nmでの吸収度を測定した。
2日間培養したBMMを、M−CSF(20ng/ml)、RANKL(100ng/ml)とともに48ウェルプレートでウェルあたり1万個をインキュベートした。培地は2日おきに交換した。培養開始から7日後及び8日後に培地を除去し、細胞死検出キット(Cell Death Detection ELISA、Roche Molecular Biochemicals社)の細胞溶解バッファーを用いて30分間、室温で細胞溶解液を作製した。ポジティブコントロールとして、培養8日目のウェルから最後の6時間ですべてのサイトカインを除去したものを準備した。20μlの上清を用いてELISAによりアポトーシスの程度を解析した。
破骨細胞の転写産物の検出には以下のプライマーを使用した。
・Acp(TRAP) センス:5’−cagcagcccaaaatgcct−3’(配列番号19)、アンチセンス:5’−ttttgagccaggacagctga−3’(配列番号20)
・NFATc1 センス:5’−gccaagtaccagctttccag−3’(配列番号21)、アンチセンス:5’− agggtcgaggtgacactagg−3’(配列番号22)
・Calcr(Calcitonin R) センス:5’−gcctccccatttacatctgc−3’(配列番号23)、アンチセンス:5’−ctcctcgccttcgttgttg−3’ 配列番号24)
・Nfatc1 センス:5’−gccaagtaccaggtttccag−3’(配列番号25)、アンチセンス:5’−agggtcgaggtgacactagg−3’(配列番号26)
・cSrc センス:5’−gaacccgagagggaccttc−3’(配列番号27)、アンチセンス:5’−gaggcagtaggcaccttttgt−3’(配列番号28)
・Pirb センス:5’−agccagaaaacaaggctgaa−3’(配列番号29)、アンチセンス:5’−ggctgggtgtccagtagtgt−3’(配列番号30)
・Sirpa センス:5’−gtaggtgcgactgggatgtt−3’(配列番号31)、アンチセンス:5’−agtgaggccaactcagccta−3’ (配列番号32)
・Tnfsf11(RANKL) センス:5’−cagcatcgctctgttcctgta−3’(配列番号33)、アンチセンス:5’−ctgcgttttcatggagtctca−3’(配列番号34)
・Tnfsf11b(OPG) センス:5’−gggcgttacctggagatcg−3’(配列番号35)、アンチセンス:5’−gagaagaacccatctggacattt−3’(配列番号36)
mRNAの品質及び量はGAPDHを用いて正規化した。
糖鎖−タンパク質間の相互作用は、糖鎖マイクロアレイを用いたエバネッセント場蛍光励起検出システムにより検出した。すなわち、糖タンパク質やグリコシド−ポリアクリルアミド(PAA)を含む糖鎖プローブを非接触型マイクロアレイ印刷ロボット(MicroSys 4000、Genomic Solutions社)を用いてマイクロアレイグレードエポキシ活性化ガラススライド(Schott社)上に3スポットずつ固定した。このガラススライドを25℃で3時間インキュベートし、反応バッファー(0.8% NaCl、1%(v/v)Triton−X、1 mM MnCl2及び1mM CaCl2を含む25mM Tris−HCl(pH7.4))で固定化した物質を除去し、次いでTBS(0.8% NaCl及び1% BSAを含む25mM Tris−HCl(pH7.4))で20℃、1時間ブロッキングを行った。DCIR−Fc、DCIR−Fc変異体、又はFcと、Cy3−標識抗ヒトFc抗体とのタンパク質複合体を反応バッファー中で、室温、遮光条件下で20分間で作製した。
全血は麻酔したマウスから心臓穿刺で採取した。採取した血液を4℃で一晩おいて凝固させ、3000rpmで10分間遠心分離して血清を分離した。得られた血清は−80℃で保存した。IFN−γの量は、IFN−γ用ELISAキット(MABTECH社)で検出した。
Claims (6)
- 下記式で表される構造を基本構造とするN型糖鎖(ただし、下記構造の2つの非還元末端にシアル酸が存在せず、x及びyはそれぞれ独立に3又は4を表す。)を有する化合物を有効成分として含む、骨代謝疾患、アレルギー疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、ギラン・バレー症候群又はグッドパスチャー症候群の治療に用いるための樹状細胞免疫受容体活性化剤。
- 下記式で表される構造を基本構造とするN型糖鎖(ただし、下記構造の2つの非還元末端にシアル酸が存在せず、x及びyはそれぞれ独立に3又は4を表す。)を有する化合物を有効成分として含む、破骨細胞形成抑制剤。
- 下記式で表される構造を基本構造とするN型糖鎖(ただし、下記構造の2つの非還元末端にシアル酸が存在せず、x及びyはそれぞれ独立に3又は4を表す。)を有する化合物を有効成分として含む、骨代謝疾患、アレルギー疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、ギラン・バレー症候群又はグッドパスチャー症候群の治療に用いるための樹状細胞分化・増殖阻害剤。
- 下記式で表される構造を基本構造とするN型糖鎖(ただし、下記構造の2つの非還元末端にシアル酸が存在せず、x及びyはそれぞれ独立に3又は4を表す。)を有する化合物を有効成分として含み、樹状細胞の樹状細胞免疫受容体を活性化することでサイトカインの産生を抑制する、骨代謝疾患、アレルギー疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、ギラン・バレー症候群又はグッドパスチャー症候群の治療に用いるためのサイトカイン産生抑制剤。
- 下記式で表される構造を基本構造とする糖鎖(ただし、下記構造の2つの非還元末端にシアル酸が存在せず、x及びyはそれぞれ独立に3又は4を表す。)を有する化合物の存在下、又は前記化合物を対照として、被検物質の樹状細胞免疫受容体への結合性を測定し、樹状細胞免疫受容体活性化剤又は樹状細胞免疫受容体拮抗剤をスクリーニングすることを含む、スクリーニング方法。
- 下記式で表される構造を基本構造とするN型糖鎖(ただし、下記構造の2つの非還元末端にシアル酸が存在せず、x及びyはそれぞれ独立に3又は4を表す。)を有する化合物を有効成分として含む、骨代謝疾患、アレルギー疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、ギラン・バレー症候群又はグッドパスチャー症候群の治療に用いるための医薬組成物。
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