JP2024502157A - 樹状細胞活性化キメラ抗原受容体及びその使用 - Google Patents

樹状細胞活性化キメラ抗原受容体及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2024502157A
JP2024502157A JP2023541498A JP2023541498A JP2024502157A JP 2024502157 A JP2024502157 A JP 2024502157A JP 2023541498 A JP2023541498 A JP 2023541498A JP 2023541498 A JP2023541498 A JP 2023541498A JP 2024502157 A JP2024502157 A JP 2024502157A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
cell
cancer
car
immune
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023541498A
Other languages
English (en)
Inventor
シュ、ヤン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Sansci Biotechnology Co Ltd
Shenzhen Frontiergate Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Guangdong Sansci Biotechnology Co Ltd
Shenzhen Frontiergate Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Sansci Biotechnology Co Ltd, Shenzhen Frontiergate Biotechnology Co Ltd filed Critical Guangdong Sansci Biotechnology Co Ltd
Publication of JP2024502157A publication Critical patent/JP2024502157A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464422—Ephrin Receptors [Eph]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464429—Molecules with a "CD" designation not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/7056—Lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/86—Lung
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
    • A61K2239/11—Antigen recognition domain
    • A61K2239/13—Antibody-based
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
    • A61K2239/17—Hinge-spacer domain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
    • A61K2239/21—Transmembrane domain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
    • A61K2239/22—Intracellular domain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1114—T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1121—Dendritic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

免疫抑制性腫瘍環境において、樹状細胞（ＤＣ）を活性化するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ＣＡＲを含む組成物、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ＣＡＲを含む操作細胞、及びＣＡＲを用いる方法もまた提供する。【選択図】図１Ａ

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２１年１月８日に出願された中国特許出願第２０２１１００２２２６８．５号に対する優先権を主張し、この中国特許出願の全開示は、引用することにより本明細書の一部をなす。
発明の分野
本開示は、一般的に、細胞療法の分野に関する。特に、本開示は、免疫抑制性腫瘍微小環境において、樹状細胞（ＤＣ）を活性化するための組成物及び方法に関する。
自然免疫系及び適応免疫系の間の重要なリンクとして、樹状細胞（ＤＣ）は、Ｔ細胞依存免疫（非特許文献１及び非特許文献２）を、特に腫瘍特異的免疫反応（非特許文献３）において活性化する、主な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。以前の研究によって、腫瘍浸潤樹状細胞（ＴＩＤＣ）は、通常、Ｔ細胞の浸潤及び活性化を抑制する免疫抑制性腫瘍微小環境又は腫瘍免疫抑制性微小環境（ＴＩＭＥ）において、未成熟又は機能不全表現型を示すことが明らかになってきている（非特許文献４）。
ＴＩＤＣの異常な振る舞いをレスキューするため、多くのシグナル伝達経路、例えば樹状細胞上のＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２のｓｉＲＮＡサイレンシングが同定されてきているが、その臨床適用において、大きな進展は達成されてきていない（非特許文献５、非特許文献６、及び非特許文献７）。
したがって、ＴＩＭＥにおいて樹状細胞（例えば腫瘍浸潤性樹状細胞）を活性化するための新規方法を開発する必要がある。
R. M. Steinman, Decisions about dendritic cells: past, present, and future. Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012) S. Puhr et al., Dendritic cell development-History, advances, and open questions. Semin. Immunol. 27, 388-396 (2015) M. Hansen et al., The role of dendritic cells in cancer. Semin. Immunopathol. 39, 307-316 (2017) J. M. Tran Janco et al., Tumor-infiltrating dendritic cells in cancer pathogenesis. J. Immunol. 194, 2985-2991 (2015) W. Hobo et al., siRNA silencing of PD-L1 and PD-L2 on dendritic cells augments expansion and function of minor istocompatibility antigen-specific CD8+ T cells. Blood 116, 4501-4511 (2010) A. Harari et al., Antitumour dendritic cell vaccination in a priming and boosting approach. Nat. Rev. Drug Discovery 19, 635-652 (2020) Y. Ma et al., Dendritic Cells in the Cancer Microenvironment. J. Cancer 4, 36-44 (2013)
一つの態様において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドであって、ＣＡＲが（１）細胞外抗原結合ドメイン、（２）膜貫通ドメイン及び（３）細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ＣＡＲが免疫抑制性腫瘍微小環境において、樹状細胞を活性化可能である、ポリヌクレオチドを提供する。
或る特定の実施の形態において、免疫抑制性腫瘍微小環境は、１）免疫阻害分子を発現し、及び／又は２）免疫刺激性サイトカインが不十分である、腫瘍及び／又は腫瘍浸潤性免疫細胞を含む。
或る特定の実施の形態において、免疫阻害分子は、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＨＬＡクラスＩ、シアロ糖タンパク質、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ガレクチン９、ＣＤ２４、並びにＣＤ４７からなる群から選択される。
或る特定の実施の形態において、免疫阻害分子はＣＴＬＡ－４及び／又はＰＤ－Ｌ１である。
或る特定の実施の形態において、免疫刺激性サイトカインは、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子及びそれらの組み合わせから選択される。
或る特定の実施の形態において、腫瘍は、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現する細胞を含む。
或る特定の実施の形態において、免疫抑制性腫瘍微小環境は、養子細胞療法の単独療法（例えばＣＡＲ－Ｔ単独療法）に対して劣った反応性を有する腫瘍を含む。
或る特定の実施の形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＲＩＧ－１、ＮＬＲＰ１０、ＤＥＣ－２０５、ＢＤＣＡ－２、ＣＤ８６、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＩＦＮＡＲ、ＴＬＲ４、ＴＮＦＲ（例えばＴＮＦＲ２）、ＣＤ８０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３６７（ＤＣＩＲ）、ＣＤ２０７（Ｌａｎｇｅｒｉｎ）、ＣＤ３７１（ＤＣＡＬ－２、ＣＬＥＣ１２ａ）、ＣＤ２０４、ＣＤ３６、ＩＦＮγＲ、デクチン－１及びＦｃγＲ、又はその組み合わせからなる群から選択される樹状細胞活性化受容体の細胞質ドメインを含む。
或る特定の実施の形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、デクチン－１の細胞質ドメイン及びＦｃγＲの細胞質ドメインを含む。
或る特定の実施の形態において、デクチン－１の細胞質ドメイン及びＦｃγＲの細胞質ドメインはタンデムに連結されている。
或る特定の実施の形態において、デクチン－１の細胞質ドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸配列、又はその任意の機能型を含む。
或る特定の実施の形態において、ＦｃγＲの細胞質ドメインは、配列番号２に示されるアミノ酸配列、又はその任意の機能型を含む。
或る特定の実施の形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３に示されるアミノ酸配列、又はその任意の機能型を含む。
或る特定の実施の形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、又はその任意の機能型を含む。
或る特定の実施の形態において、細胞外抗原結合ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。
或る特定の実施の形態において、ｓｃＦｖは、腫瘍表面マーカー（例えば固形腫瘍表面マーカー）に特異的である。
或る特定の実施の形態において、腫瘍表面マーカーは、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１９、ＣＤ７０、ＣＤ１３３、ＣＤ１４７、ＣＤ１７１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、メソテリン、ガングリオシドＧＤ２、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＦＢＰ（葉酸結合タンパク質）、ルイスＹ、クローディン１８．２、ＩＬ１３Ｒα２、ＨＥＲ２、ＭＤＣ１、ＰＭＳＡ（前立腺膜特異的抗原）、ＲＯＲ１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＡＩＸ、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＧＰＣ３、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される。
或る特定の実施の形態において、ＣＡＲはシグナルペプチドを更に含む。
或る特定の実施の形態において、シグナルペプチドはＣＤ８αのシグナルペプチドを含む。
或る特定の実施の形態において、ＣＤ８αのシグナルペプチドは、配列番号５に示される配列、又はその任意の機能型を含む。
或る特定の実施の形態において、膜貫通ドメインはＣＤ８αの膜貫通ドメインを含む。
或る特定の実施の形態において、ＣＤ８αの膜貫通ドメインは、配列番号６に示される配列、又はその任意の機能型を含む。
或る特定の実施の形態において、細胞外抗原結合ドメインは、ヒンジ領域によって、膜貫通ドメインに連結される。
或る特定の実施の形態において、ヒンジ領域はＣＤ８αのヒンジ領域を含む。
或る特定の実施の形態において、ＣＤ８αのヒンジ領域は、配列番号７に示される配列、又はその任意の機能型を含む。
或る特定の実施の形態において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡである。
別の態様において、本開示は、本明細書に提供されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを提供する。
別の態様において、本開示は、本明細書に提供されるポリヌクレオチドを含むベクターであって、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが、ＣＡＲの発現のための少なくとも１つの制御ポリヌクレオチド要素に機能的に連結される、ベクターを提供する。
或る特定の実施の形態において、ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾン、部位特異的挿入ベクター、又は自殺発現ベクターである。
或る特定の実施の形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである。
或る特定の実施の形態において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
別の態様において、本開示は、本明細書に提供されるポリペプチドを含む操作細胞を提供する。
或る特定の実施の形態において、操作細胞（engineered cell）は、樹状細胞又はその前駆体若しくは前駆細胞である。
或る特定の実施の形態において、樹状細胞又はその前駆体若しくは前駆細胞は、末梢血細胞、骨髄細胞、胚性幹細胞、又は人工多能性幹細胞に由来する。
別の態様において、本開示は、本明細書に提供される操作細胞を産生する方法であって、本明細書に提供されるベクターを、本明細書に提供されるポリヌクレオチドの発現に適した条件下で、出発細胞に導入することを含む、方法を提供する。
或る特定の実施の形態において、出発細胞は樹状細胞又はその前駆体若しくは前駆細胞である。
或る特定の実施の形態において、樹状細胞又はその前駆体若しくは前駆細胞は、末梢血細胞、骨髄細胞、胚性幹細胞、又は人工多能性幹細胞に由来する。
別の態様において、本開示は、本明細書に提供される方法によって、ｅｘ ｖｉｖｏで産生される細胞の集団を提供する。
或る特定の実施の形態において、細胞の集団の少なくとも７０％が、本明細書に提供されるポリペプチドを検出可能なレベルで発現する。
別の態様において、本開示は、（ｉ）本明細書に提供されるポリヌクレオチド、又は本明細書に提供されるポリペプチド、又は本明細書に提供されるベクター、又は本明細書に提供される操作細胞の集団、又は本明細書に提供される細胞の集団と、（ｉｉ）医薬的に許容され得る媒体とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様において、本開示は、治療の必要がある被験体において、癌を治療する際の養子細胞療法の有効性を改善する方法であって、本明細書に提供される医薬組成物を療法的有効量、投与することを含む、方法を提供する。
或る特定の実施の形態において、養子細胞療法は、改変免疫細胞の養子移入を含む。
或る特定の実施の形態において、医薬組成物は、改変免疫細胞の集団を更に含む。
或る特定の実施の形態において、上記方法は、改変免疫細胞の集団を含む医薬組成物を投与することを更に含む。
或る特定の実施の形態において、改変免疫細胞は、細胞表面上で合成受容体（例えばＣＡＲ又はＴＣＲ）の発現を有する。
或る特定の実施の形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ細胞、好酸球又は好中球である。
或る特定の実施の形態において、免疫細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ターミナルエフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδ Ｔ細胞、サイトカイン誘導型キラー（ＣＩＫ）Ｔ細胞、及び腫瘍浸潤性リンパ球からなる群から選択されるＴ細胞である。
或る特定の実施の形態において、免疫細胞は自己又は同種である。
或る特定の実施の形態において、癌は、副腎癌、骨癌、脳癌、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、眼癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、細気管支肺胞細胞肺癌、中皮腫、頭頸部癌、扁平上皮癌、黒色腫、口腔癌、卵巣癌、子宮頸癌、陰茎癌、前立腺癌、膵臓癌、皮膚癌、肉腫、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、膣癌からなる群から選択される固形癌である。
或る特定の実施の形態において、癌は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、ＨＨＶ８関連原発性滲出性リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球リッチＢ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫（ＭＭ）からなる群から選択される血液学的悪性疾患である。
別の態様において、本開示は、免疫抑制性微小環境において、免疫細胞の増殖を誘導し、免疫細胞の生存を延長させ、及び／又は免疫細胞からの免疫刺激性サイトカインの発現及び／又は分泌を増加させる方法であって、免疫抑制性微小環境を、本明細書に提供される操作細胞と接触させることを含む、方法を提供する。
或る特定の実施の形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ細胞、好酸球又は好中球である。
或る特定の実施の形態において、免疫細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ターミナルエフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδ Ｔ細胞、サイトカイン誘導型キラー（ＣＩＫ）Ｔ細胞、及び腫瘍浸潤性リンパ球からなる群から選択されるＴ細胞である。
或る特定の実施の形態において、免疫細胞は自己又は同種である。
或る特定の実施の形態において、免疫抑制性微小環境は、免疫抑制性腫瘍微小環境である。
或る特定の実施の形態において、免疫抑制性腫瘍微小環境は、免疫阻害分子を発現する、腫瘍及び／又は腫瘍浸潤性免疫細胞を含む。
或る特定の実施の形態において、免疫阻害分子は、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、シアロ糖タンパク質、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ガレクチン９、ＣＤ２４、並びにＣＤ４７からなる群から選択される。
或る特定の実施の形態において、免疫阻害分子はＣＴＬＡ－４及び／又はＰＤ－Ｌ１である。
或る特定の実施の形態において、腫瘍は、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現する細胞を含む。
或る特定の実施の形態において、免疫刺激性サイトカインは、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の１つ以上である。
別の態様において、本開示は、治療が必要な被験体において、疾患又は病的状態を治療する方法であって、本明細書に提供される医薬組成物を療法的有効量、投与することを含む、方法を提供する。
或る特定の実施の形態において、本明細書に提供される方法は、第二の作用物質を投与することを更に含む。
或る特定の実施の形態において、第二の療法は、改変免疫細胞の集団である。
或る特定の実施の形態において、第二の療法はＣＡＲ－Ｔ療法である。
或る特定の実施の形態において、疾患は癌を含む。
別の態様において、本開示は、樹状細胞を活性化可能なＣＡＲを選択する方法であって、
（ａ）免疫抑制性腫瘍微小環境を含む非ヒト動物を準備することと、
（ｂ）非ヒト動物に、候補ＣＡＲを発現する樹状細胞を投与することと、
（ｃ）参照樹状細胞と比較した際の、免疫抑制性腫瘍微小環境への浸潤の改善、生存率の改善、及び免疫細胞の活性化を誘導する際の機能の増進から選択される樹状細胞活性化に関するマーカーを検出することと、
（ｄ）樹状細胞を活性化可能なＣＡＲとして候補ＣＡＲを選択することと、
を含む、方法を提供する。
或る特定の実施の形態において、免疫抑制性腫瘍微小環境は臨床的に適切（clinically relevant）である。
或る特定の実施の形態において、非ヒト動物は、ヒト胎性脾臓及び自己ヒト造血幹細胞（例えばヒトＣＤ３４＋造血幹細胞）を含む。
或る特定の実施の形態において、免疫抑制性腫瘍微小環境は、免疫阻害分子を発現する腫瘍及び／又は腫瘍浸潤性免疫細胞を含む。
或る特定の実施の形態において、免疫阻害分子は、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＨＬＡクラスＩ、シアロ糖タンパク質、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ガレクチン９、ＣＤ２４、並びにＣＤ４７からなる群から選択される。
或る特定の実施の形態において、免疫阻害分子はＣＴＬＡ－４及び／又はＰＤ－Ｌ１である。
或る特定の実施の形態において、腫瘍は、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現する細胞を含む。
或る特定の実施の形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ細胞、好酸球又は好中球である。
或る特定の実施の形態において、免疫細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ターミナルエフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδ Ｔ細胞、サイトカイン誘導型キラー（ＣＩＫ）Ｔ細胞、及び腫瘍浸潤性リンパ球からなる群から選択されるＴ細胞である。
或る特定の実施の形態において、免疫細胞は自己又は同種である。
或る特定の実施の形態において、免疫細胞は、改変免疫細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）又は天然免疫細胞である。
或る特定の実施の形態において、改変免疫細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）は、候補ＣＡＲを発現する樹状細胞と組み合わせて投与される。
或る特定の実施の形態において、非ヒト動物は齧歯類、例えばラット又はマウスである。
本明細書に組み込まれる、付随する図面は、明細書の一部を形成する。この書面の明細書とともに、図面は、本開示の原理を説明し、関連する技術分野（複数の場合もある）の当業者が本開示を作製し、使用することを可能にするように更に働く。
図１は、ＣＡＲＤＦがＴＨＰ－１細胞由来のＤＣの活性を増進させたことを示す図である。図１Ａは、多様な抗ＣＤ１９ ＣＡＲ分子の模式図を示す。 図１Ｂは、ＴＨＰ－１細胞株表面上のＣＡＲＤＦ発現をフローサイトメトリーによって決定したことを示す。ＣＡＲＤＦは、プロテインＬへの結合によって検出された。 図１Ｃは、ＤＣへのＣＡＲＤＦ＋ ＴＨＰ－１細胞の分化効率のフローサイトメトリー分析を示す。 図１Ｄは、ＣＤ１９＋ Ｈ４６０腫瘍細胞と２日間共培養された後の対照ＤＣ及びＣＡＲＤＦ－ＤＣによる共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現を示す。 図１Ｅは、対照ＤＣ又はＣＡＲＤＦ－ＤＣと３日間共培養された後、ＣＦＳＥで標識されたＣＤ３＋初代Ｔ細胞の増殖を、フローサイトメトリーによって分析したことを示す。ＤＣは、図１Ｄに記載されるように、ＣＤ１９＋ Ｈ４６０腫瘍細胞によって２日間活性化された。右側のヒストグラムは、Ｔ細胞におけるＣＦＳＥの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示した。ｎ＝３。 図１Ｆは、Ｈ４６０細胞表面上のＣＤ１９の発現をフローサイトメトリーによって分析したことを示す。 図１Ｇは、ＣＡＲ－Ｔ細胞上の抗ＣＤ１９ ＣＡＲの発現を、プロテインＬ結合で分析したことを示す。ｎ＝３。 図１Ｈは、対照ＤＣ又はＣＡＲＤＦ－ＤＣの２４時間の存在下でのＣＤ１９＋ Ｈ４６０腫瘍細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的殺細胞能を示す。ｎ＝３。 図１Ｉ及び図１Ｊは、図１Ｈの共培養上清において、ＩＦＮ－γレベル（図１Ｉ）をＥＬＩＳＡによって評価し、ＬＤＨ（図１Ｊ）をＣｙｔｏＴｏｘ ９６（商標）アッセイによって分析したことを示す。ｎ＝３。データは、平均値±ＳＤとして提示される。統計：一元配置ＡＮＯＶＡ、チューキーの多重比較検定を含むブラウン・フォーサイス検定。ｎ．ｄ．、未検出。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓは非有意を示す。 図１Ｉ及び図１Ｊは、図１Ｈの共培養上清において、ＩＦＮ－γレベル（図１Ｉ）をＥＬＩＳＡによって評価し、ＬＤＨ（図１Ｊ）をＣｙｔｏＴｏｘ ９６（商標）アッセイによって分析したことを示す。ｎ＝３。データは、平均値±ＳＤとして提示される。統計：一元配置ＡＮＯＶＡ、チューキーの多重比較検定を含むブラウン・フォーサイス検定。ｎ．ｄ．、未検出。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓは非有意を示す。 図２は末梢単球由来のＣＡＲＤＦ－ＤＣが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ロバストなＴ細胞活性化活性を示すことを示す図である。図２Ａは、単球由来ＤＣ（Ｍｏ－ＤＣ）表面上のＣＡＲＤＦの発現を、フローサイトメトリーによって分析したことを示す。空ベクターレンチウイルスで形質導入された偽ＤＣを対照として用いた。 図２Ｂは、ＬＰＳ及びＴＮＦ－αによって刺激された後の、Ｍｏ－ＤＣ、偽ＤＣ、及びＣＡＲＤＦ－ＤＣにおける多様なＤＣ特異的マーカーの発現を示す。ｎ＝３。 図２Ｃは、偽ＤＣ又はＣＡＲＤＦ－ＤＣと３日間共培養された後、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ－ＣＦＳＥ希釈によって評価されるＣＤ３＋初代Ｔ細胞の増殖を分析したことを示す。ＤＣは、ＥＰＨＡ２＋ Ａ５４９に４８時間あらかじめ曝露されていた。右側のヒストグラムは、Ｔ細胞のＣＦＳＥのＭＦＩを示した。ｎ＝３。統計：一元配置ＡＮＯＶＡ、チューキーの多重比較検定を含むブラウン・フォーサイス検定。 図２Ｄは、Ａ５４９－ＣＰ上のＰＤ－Ｌ１発現をフローサイトメトリーによって分析し、ＣＴＬＡ４－ＩｇをＲＴ－ｑＰＣＲによって評価したことを示す。ｎ＝３。統計：独立両側スチューデントｔ検定。 図２Ｅは、Ａ５４９－ＣＰと共培養する前及び４８時間共培養した後の偽ＤＣ及びＣＡＲＤＦ－ＤＣにおける活性化マーカーの表面発現を示す。ｎ＝３。統計：独立両側スチューデントｔ検定。 図２Ｆは、Ａ５４９－ＣＰの存在下で４日間、偽ＤＣ又はＣＡＲＤＦ－ＤＣと共培養した後、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ－ＣＦＳＥ希釈によって評価されるＣＤ３＋初代Ｔ細胞の増殖を分析したことを示す。右側のヒストグラムは、全てのＴ細胞のＣＦＳＥのＭＦＩを示した。ｎ＝３。データは平均値±ＳＤとして示される。統計：独立両側スチューデントｔ検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 図３は、ＣＡＲＤＦ－ＤＣが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ａ５４９ＣＰ細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を活性化することを示す図である。図３Ａは、ＣＡＲ－Ｔ細胞上のＣＡＲ（ｓｃＦｖ：抗ＥｐｈＡ２）の発現を示す。 図３Ｂは、Ａ５４９及びＡ５４９ＣＰ上のＥｐｈＡ２の発現を、フローサイトメトリーによって分析したことを示す。 図３Ｃは、偽ＤＣ又はＣＡＲＤＦ－ＤＣの２４時間の存在下、Ａ５４９及びＡ５４９ＣＰ腫瘍細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解能を示す。ｎ＝３。 図３Ｄは、（Ｃ）におけるようなＡ５４９ＣＰ条件由来のＣＡＲ－Ｔ細胞における、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＴＮＦ－α発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す。ｎ＝３。 図３Ｅは、図３Ｃにおける培養由来のＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ＋細胞のフローサイトメトリー分析を示す。 図３Ｆ及び図３Ｇは、図３Ｃにおける培養から収集された上清において、ＩＦＮ－γレベル（図３Ｆ）をＥＬＩＳＡによって評価し、ＬＤＨ（図３Ｇ）をＣｙｔｏＴｏｘ ９６（商標）アッセイによって分析したことを示す。ｎ＝３。データは平均値±ＳＤとして示される。ｎ＝３。統計：一元配置ＡＮＯＶＡ、チューキーの多重比較検定を含むブラウン・フォーサイス検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓは非有意を示す。 図３Ｆ及び図３Ｇは、図３Ｃにおける培養から収集された上清において、ＩＦＮ－γレベル（図３Ｆ）をＥＬＩＳＡによって評価し、ＬＤＨ（図３Ｇ）をＣｙｔｏＴｏｘ ９６（商標）アッセイによって分析したことを示す。ｎ＝３。データは平均値±ＳＤとして示される。ｎ＝３。統計：一元配置ＡＮＯＶＡ、チューキーの多重比較検定を含むブラウン・フォーサイス検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓは非有意を示す。 図４は、ＣＡＲＤＦ－ＤＣが、Ｃａｒ－Ｔ細胞を活性化して、ＴＩＭＥを含む固形肺腫瘍を除去することを示す図である。図４Ａは、ＣＡＲＤＦ－ＤＣ及びＣａｒ－Ｔ細胞で、ＮＳＧマウスで形成されたＡ５４９ＷＴ及びＡ５４９ＣＰ肺腫瘍を治療する実験設計を示す。 図４Ｂは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価される、Ａ５４９ＷＴ及びＡ５４９ＣＰ腫瘍における免疫抑制性遺伝子の発現を示す。データは平均値±ＳＤとして示される。ｎ＝３。統計：独立両側スチューデントｔ検定。 図４Ｃは、図４Ａに記載される治療の１７日後に回収した腫瘍の写真を示す。左：Ａ５４９ＷＴ腫瘍、右：Ａ５４９ＣＰ腫瘍。 図４Ｄは、図４Ｃに示される腫瘍の重量を示す。データは平均値±ＳＤとして示される。ｎ＝５。統計：一元配置ＡＮＯＶＡ、チューキーの多重比較検定を含むブラウン・フォーサイス検定。 図４Ｅは、ＲＴ－ｑＰＣＲによる、図４Ｃに示される回収されたＡ５４９ＣＰ腫瘍における遺伝子発現を示す。データは平均値±ＳＤとして示される。ｎ＝５。 図４Ｆは、脾臓中の総Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、樹状細胞、ＣＤ８０＋樹状細胞、ＣＤ８６＋樹状細胞の割合を、フローサイトメトリーによって分析したことを示す。データは平均値±ＳＤとして示される。ｎ＝５。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓは非有意を示す。 図５は、ＣＡＲＤＦ－ＤＣが、Ｈｕ－マウスにおいて形成された肺腫瘍のＣＡＲ－Ｔ細胞媒介性の退行を促進することを示す図である。図５Ａは、Ｈｕ－マウスにおいて形成されたＡ５４９肺腫瘍を治療する実験設計を示す。 図５Ｂは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価される、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療後のＮＳＧマウス及びＨｕ－マウス由来の肺腫瘍における遺伝子発現を示す。データは平均値±ＳＤとして示される。ｎ＝３。統計：独立両側スチューデントｔ検定。 図５Ｃは、多様な治療後の腫瘍体積を示す。データは平均値±ＳＤとして示される。統計：二元配置ＡＮＯＶＡ後、チューキーの多重比較検定。 図５Ｄ及び図５Ｆは、接種１６日後に回収された腫瘍の写真（図５Ｄ）及び腫瘍重量（図５Ｅ）を示す。治療経過を図５Ａに示す。データは平均値±ＳＤとして示される。統計：一元配置ＡＮＯＶＡ、チューキーの多重比較検定を含むブラウン・フォーサイス検定。正常Ｔ：ｎ＝４。ＣＡＲ－Ｔ：ｎ＝６。偽ＤＣ：ｎ＝６。ＣＡＲＤＦ－ＤＣ：ｎ＝６。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 図５Ｄ及び図５Ｆは、接種１６日後に回収された腫瘍の写真（図５Ｄ）及び腫瘍重量（図５Ｅ）を示す。治療経過を図５Ａに示す。データは平均値±ＳＤとして示される。統計：一元配置ＡＮＯＶＡ、チューキーの多重比較検定を含むブラウン・フォーサイス検定。正常Ｔ：ｎ＝４。ＣＡＲ－Ｔ：ｎ＝６。偽ＤＣ：ｎ＝６。ＣＡＲＤＦ－ＤＣ：ｎ＝６。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 図６は、ＣＡＲＤＦ－ＤＣが、Ｈｕ－マウスにおいて形成される肺腫瘍のＴＩＭＥを炎症促進状態に向けて逆転させることを示す図である。図６Ａは、脾臓ＣＤ３＋ Ｔ細胞中のＩＦＮ－γ＋ Ｔ細胞の割合を、フローサイトメトリーによって分析したことを示す。データは平均値±ＳＤとして示される。正常Ｔ、ｎ＝２。ＣＡＲ－Ｔ、偽ＤＣ、ＣＡＲＤＦ－ＤＣ、ｎ＝３。 図６Ｂは、脾臓中のＰＤ－１＋及びＴＩＭ－３＋ Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによって分析したことを示す。 図６Ｃは、脾臓由来の樹状細胞によって発現されるＣＤ８６及びＭＨＣ－ＩＩのＭＦＩを、フローサイトメトリーによって分析したことを示す。データは平均値±ＳＤとして示される。正常Ｔ、ｎ＝２。ＣＡＲ－Ｔ、偽ＤＣ、ＣＡＲＤＦ－ＤＣ、ｎ＝３。 図６Ｄは、播種性肺腫瘍におけるＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＣＤ８６及びＩＬ－１２Ｂの発現を、ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価したことを示す。図中に正規化を示した。データは平均値±ＳＤとして示される。正常Ｔ、ｎ＝２。ＣＡＲ－Ｔ、偽ＤＣ、ＣＡＲＤＦ－ＤＣ、ｎ＝３。 図６Ｅは、図６Ｂに示されるような脾臓ＣＤ３＋ Ｔ細胞におけるＰＤ－１＋ＴＩＭ－３＋ Ｔ細胞の割合を示す。データは平均値±ＳＤとして示される。正常Ｔ、ｎ＝２。ＣＡＲ－Ｔ、偽ＤＣ、ＣＡＲＤＦ－ＤＣ、ｎ＝３。 図６Ｆ及び図６Ｇは、播種性肺腫瘍におけるＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＴＧＦ－β（図６Ｆ）又はＣＤ２０６及びＣＤ１６３（図６Ｇ）の発現を、ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価したことを示す。図中に正規化を示した。データは平均値±ＳＤとして示される。正常Ｔ、ｎ＝２。ＣＡＲ－Ｔ、偽ＤＣ、ＣＡＲＤＦ－ＤＣ、ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 図６Ｆ及び図６Ｇは、播種性肺腫瘍におけるＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＴＧＦ－β（図６Ｆ）又はＣＤ２０６及びＣＤ１６３（図６Ｇ）の発現を、ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価したことを示す。図中に正規化を示した。データは平均値±ＳＤとして示される。正常Ｔ、ｎ＝２。ＣＡＲ－Ｔ、偽ＤＣ、ＣＡＲＤＦ－ＤＣ、ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 図７は、ＣＡＲＤＦ－ＤＣが別個の肺腫瘍のＴＩＭＥに抵抗して、ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化させ得ることを示す図である。図７Ａは、Ａ５４９及びＨ４６０腫瘍細胞株上のＰＤ－Ｌ１発現を、フローサイトメトリーによって分析したことを示す。 図７Ｂは、Ｈｕ－マウスにおいて形成されるＡ５４９腫瘍及びＨ４６０腫瘍における相対遺伝子発現を、ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価したことを示す。データは平均値±ＳＤとして示される。ｎ＝３。 図７Ｃは、Ｈ４６０肺腫瘍細胞上のＥｐｈＡ２発現をフローサイトメトリーによって検出したことを示す。 図７Ｄは、Ｈｕ－マウスにおいて形成されるＨ４６０腫瘍のＣＡＲ－Ｔ及びＤＣ併用療法の模式的設計を示す。 図７Ｅは、腫瘍を宿するＨｕ－マウスと同じ胎性組織で生成されるＨｕ－マウス由来ＤＣ及びＴ細胞の表面上のＣＡＲ（ｓｃＦｖ：抗ＥｐｈＡ２）発現を示す。 図７Ｆは、多様な治療後の腫瘍の増殖曲線を示す。データは平均値±ＳＤとして示される。ｎ＝６。統計：二元配置ＡＮＯＶＡ後、チューキーの多重比較検定。 図７Ｇは、腫瘍中に浸潤するＤＣ上のＣＤ８０及びＣＤ８６のＭＦＩを、フローサイトメトリーによって分析したことを示す。データは平均値±ＳＤとして示される。ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 図８Ａ及び図８Ｂは、ＴＨＰ－１細胞由来のＤＣを活性化させるＣＡＲのスクリーニングを示す図である。図８Ａは、ＴＨＰ－１細胞表面上のＣＡＲ（ｓｃＦｖ：抗ＣＤ１９及び第二世代Ｔ細胞活性化ドメイン、又はＴＬＲ４活性化ドメイン、又はＴＮＦＲ２活性化ドメイン）の発現を、プロテインＬへの結合によって決定したことを示す。 図８Ｂは、Ｈ４６０－ＣＤ１９腫瘍細胞と２日間共培養した後の、ＤＣ上の共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現を示す。 図９Ａ及び図９Ｂは、抗ＥｐｈＡ２ ＣＡＲ分子の模式図を示す図である。図９Ａは、ＤＣ用の抗ＥｐｈＡ２ ＣＡＲ構築物（ＣＡＲＤＦ）を含有するレンチウイルスベクターの図を示す。図９Ｂは、Ｔ細胞用の抗ＥｐｈＡ２ ＣＡＲ構築物（第二世代、Ｂ）を含有するレンチウイルスベクターの図を示す。 図１０Ａは、本開示に用いられる抗体を示す。 図１０Ｂは、本開示に用いられるＲＴ－ｑＰＣＲのプライマー配列を示す。 記載なし 記載なし
本開示をより詳細に記載する前に、本開示は記載される特定の実施形態に限定されず、こうしたものとして、当然のことながら多様であり得ることが理解されるものとする。本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのみのものであり、限定することは意図されず、これは本開示の範囲が、付随する特許請求の範囲によってのみ限定されるためであることも理解されるものとする。
別に定義しない限り、本明細書に用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料もまた、本開示の実施又は試験に用いられ得るが、好ましい方法及び材料をここに記載する。
本明細書に引用される全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物又は特許が具体的にかつ個々に引用することにより本明細書の一部をなすと示され、該刊行物が引用されるものと関連する方法及び／又は材料を開示し記載するために、引用することにより本明細書の一部をなすかのように、引用することにより本明細書の一部をなす。いかなる刊行物の引用も、出願日前のその開示に関してであり、本開示が以前の開示によりこうした刊行物に先行するよう権利を与えられないことを認めるものではない。さらに、提供される刊行物の日付は実際の刊行日と異なることがあり、独立に確認される必要があり得る。
本開示を読んだ際に、当業者には明らかであるように、本明細書に記載され、例示される個々の実施形態は各々、別個の構成要素及び特徴を有し、これらは、本開示の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴と容易に区別可能であり、又は組み合わせ可能である。列挙されるいかなる方法も、列挙される事象の順序で、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。
定義
読者を補助するため、以下の定義を提供する。別に定義されない限り、本明細書に用いられる、当該技術分野の全ての用語、表記法及び他の科学的又は医学的用語又は命名法は、当業者によって一般的に理解される意味を有すると意図される。いくつかの場合、一般的に理解される意味を持つ用語は、明確さのため及び／又は容易な参照のため、本明細書に定義され、本明細書におけるこうした定義の包含は、当該技術分野に一般的に理解されるような用語の定義を越える実質的な相違を示すとは必ずしも見なされないものとする。
本明細書において使用される場合、単数形「a」、「an」及び「the」には、文脈上明確に別に示さない限り、複数の参照物が含まれる。
本開示において、「含む（comprises）」、「含まれる（comprised）」、「含んでいる（comprising）」、「含有する（contains）」、「含有している（containing）」等の用語は、米国特許法に起因する意味を有し、これらは包含的、すなわちオープンエンド形式であり、更なる列挙されていない要素又は方法工程を排除しない。「本質的にからなっている（consisting essentially of）」及び「本質的にからなる（consists essentially of）」等の用語は、米国特許法に起因する意味を有し、これらは、請求される発明の基本的及び新規の特性に実質的に影響を及ぼさない更なる成分又は工程の包含を許容する。用語「からなる（consists of）」及び「からなっている（consisting of）」は、米国特許法に起因する意味を有し、すなわちこれらの用語はクローズドエンド形式である。
一連の列挙される数値がある、本出願中の全ての場合、いかなる列挙される数値も、数値範囲の上限又は下限であり得ることが理解されるものとする。本発明が、全てのこうした数値範囲、すなわち数値の上限及び数値の下限の組み合わせを有する範囲を含み、上限及び下限各々の数値が本明細書に列挙されるいかなる数値であってもよいことが更に理解されるものとする。本明細書に提供される範囲は、範囲内の全ての値を含むと理解される。例えば、１～１０は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０の値全て、並びに適切な場合、小数値を含むと理解される。同様に、「少なくとも」によって区切られた範囲は、提供されるような下限値及び全てのより高い数値を含むよう理解される。
本明細書において使用される場合、「約」は、平均の３標準偏差以内又は特定の技術範囲における許容標準範囲内を含むと理解される。或る特定の実施形態において、約は、０．５以下の変動と理解される。
本明細書において、用語「ＣＡＲ」は、用語「キメラ抗原受容体」と交換可能に使用可能であり、操作受容体若しくは合成受容体又はそれらをコードするポリヌクレオチドを指す。操作受容体又は合成受容体は、互いに連結された、又は互いに対して機能的に連結された、抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／又は細胞内シグナル伝達ドメイン、任意選択でシグナルペプチドを含む。最も一般的なＣＡＲは、例えば、ＣＤ３－ζ膜貫通及びエンドドメインに融合した、モノクローナル抗体由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。こうしたＣＡＲは、ｓｃＦｖのその標的への特異的結合に反応して、ζシグナルの伝達を生じる。ＣＡＲを調製する方法は、公的に入手可能である（例えば、各々その全体が引用することにより本明細書の一部をなす、Grupp et al., N Engl J Med., 368:1509-1518, 2013、Park et al., Trends Biotechnol., 29:550-557, 2011、Haso et al., (2013) Blood, 121, 1165-1174、Han et al., J. Hematol Oncol. 6:47, 2013、国際公開第２０１２／０７９０００号、米国特許出願公開第２０１２／０２１３７８３号、及び国際公開第２０１３／０５９５９３号を参照されたい）。
用語「キメラ抗原受容体Ｔ細胞」は、用語「ＣＡＲ－Ｔ細胞」と交換可能に用いられ、、Ｔ細胞表面上にＣＡＲを発現するよう生物学的方法（例えば遺伝子操作）を通じて操作されているＴ細胞又はその集団を指す。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＴヘルパーＣＤ４＋及び／又はＴエフェクターＣＤ８＋細胞であってもよい。ＣＡＲ－Ｔは、表面抗原を同定し、免疫反応を開始し得る。
「抗原」は、免疫反応を誘発する分子を指す。この免疫反応は、体液性、若しくは細胞媒介性反応のいずれでも、又は両方であってもよい。当業者は、実質的に全てのタンパク質又はペプチドを含む任意の巨大分子が、抗原として働き得ることを理解するであろう。本開示が抗原誘発免疫反応として作用する療法抗体を含むことが容易に明らかである。
「抗体」は、抗原と結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）ファミリーのポリペプチドを指す。例えばＩｇＧ型の天然存在「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む四量体である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＶＨと略される）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＶＬと略される）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（本明細書において、ＣＬと略される）で構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲ）と称される超可変性領域に更に細分することができ、これらの間に、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域が存在する。本明細書に開示の抗体に関するＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉの慣例によって定義又は同定され得る（Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997)、Chothia, C. et al., J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985)、Chothia, C. and Lesk, A.M., J.Mol.Biol., 196,901 (1987)、Chothia, C. et al., Nature. Dec 21-28;342(6252):877-83 (1989)、Kabat E.A. et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)、Marie-Paule Lefranc et al, Developmental and Comparative Immunology, 27: 55-77 (2003)、Marie-Paule Lefranc et al, Immunome Research, 1(3), (2005)、Marie-Paule Lefranc, Molecular Biology of B cells (second edition), chapter 26, 481-514, (2015)）。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序にアミノ末端からカルボキシ末端に配置される、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。
本明細書において使用される場合、「抗原結合ドメイン」は、１つ以上のＣＤＲを含むインタクトな（intact）抗体の部分から形成される抗体断片、又は抗原に結合可能であるが、インタクトな天然抗体構造を含まない任意の他の抗体断片を指す。抗原結合ドメインの例としては、限定なしに、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆｖ－Ｆｃ抗体（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ラクダ化（camelized）単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、及び二価ドメイン抗体が挙げられる。抗原結合ドメインは、親抗体が結合するものと同じ抗原に結合可能である。
「自己」細胞は、後に再導入される同じ被験体に由来する任意の細胞を指す。
「同種」細胞は、同じ種の異なる被験体由来の任意の細胞を指す。
免疫細胞の文脈において用いられる「エフェクター細胞」は、刺激に反応して活性化されてエフェクター機能を実行可能な細胞を指す。エフェクター細胞には、限定なしに、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞が含まれ得る。
「有効量」又は「療法的有効量」は、所望の生物学的結果を達成するために有効な、細胞、組成物、配合物又は本明細書に記載されるような任意の材料の量を指す。こうした結果には、限定なしに、特定のＢＣＲを発現するＢ細胞及びそこから産生される抗体の除去が含まれ得る。
ポリペプチド又はポリヌクレオチドの文脈における「同一性」又は「配列同一性」の百分率は、比較ウィンドウに渡って、２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適整列のため、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較した際、付加又は欠失（すなわちギャップ）を含んでもよい。百分率は、両方の配列中で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得ることと、マッチした位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数で割ることと、結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることとによって計算される。
用語「保存的置換」は、本明細書においてアミノ酸配列に関して使用される場合、アミノ酸残基を、類似の物理化学特性を持つ側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換することを指す。例えば、保存的置換は、疎水性側鎖を持つアミノ酸残基（例えばＭｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅ）間で、中性親水性側鎖を持つ残基（例えばＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎ）間で、酸性側鎖を持つ残基（例えばＡｓｐ、Ｇｌｕ）間で、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えばＨｉｓ、Ｌｙｓ、及びＡｒｇ）間で、又は芳香族側鎖を持つ残基（例えばＴｒｐ、Ｔｙｒ、及びＰｈｅ）間で、行われ得る。当該技術分野に知られるように、保存的置換は、通常、タンパク質コンホメーション構造の有意な変化を引き起こさず、したがって、タンパク質の生物学的活性を保持し得る。
用語「機能型」は、本明細書において使用される場合、アミノ酸配列又は化学構造に相違を有するにもかかわらず、親分子の実質的な生物学的活性を保持する、親分子の異なる型（例えば変異体、断片、融合体、誘導体及び模倣体）を指す。表現「実質的な生物学的活性を保持する」は、本明細書において使用される場合、親分子の生物学的活性の少なくとも一部（例えば約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％以上）又は全てを示すことを意味する。親ポリペプチドの機能型には、天然存在変異体型及び組換え法又は化学合成によって得られるもの等の非天然存在型の両方が含まれ得る。機能型は、非天然アミノ酸残基を含有してもよい。
本明細書において使用される場合、用語「機能的に連結される」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列間の機能的関係を指す。融合タンパク質、例えば本開示のＣＡＲのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドの文脈において、この用語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列が、これらのセグメントによってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、連結されることを意味する。転写又は翻訳制御の文脈において、この用語は、コード配列に対する制御配列の機能的関係、例えば転写を調節するような、コード配列に対して正しい位置及び配向でのプロモーターを指す。
本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、ヌクレオチド鎖を指す。これらはまた、合成及び／又は非天然存在核酸分子（例えばヌクレオチド類似体又は修飾主鎖残基若しくは連結を含む）も指す。この用語はまた、一本鎖又は二本鎖型いずれかのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドも指す。この用語は、天然ヌクレオチドの類似体を含有する核酸を含む。この用語はまた、合成主鎖を持つ核酸様構造も含む。別に示さない限り、特定のポリヌクレオチド配列はまた、暗に、保存的に修飾されたその変異体（例えば縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補性配列、並びに明らかに示される配列を含む。特に、１つ以上の選択される（又は全ての）コドンの第３位が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって、縮重コドン置換が達成されてもよい（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)、Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)、及びRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)を参照されたい）。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において交換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然存在アミノ酸の人工的化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然存在アミノ酸ポリマー及び非天然存在アミノ酸ポリマーにも当てはまる。或る特定の実施形態において、ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、又はその組み合わせが含まれる。
本明細書において使用される場合、用語「一本鎖可変断片」は、用語「ｓｃＦｖ」と交換可能に用いられ、互いに直接、又はペプチドリンカー配列を通じて連結された、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域からなる操作抗体を指す（Huston JS et al. Proc Natl Acad Sci USA, 85:5879(1988)）。
本明細書において使用される場合、用語「ＴＣＲ」は、用語「Ｔ細胞受容体」又は用語「ＴＣＲ複合体」と交換可能に使用可能であり、天然（又は内因性）ＴＣＲ又は操作ＴＣＲを指す。ＴＣＲは、ＭＨＣ分子に結合するペプチドとしての抗原の断片を認識する際に関与する、Ｔ細胞表面上のタンパク質複合体を指す。
用語「ベクター」は、本明細書において使用される場合、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、そのタンパク質の発現をもたらすように機能的に挿入され得るビヒクルを指す。ベクターを用いて、ベクターが所持する遺伝要素の発現を宿主細胞内でもたらすように、宿主細胞を形質転換、形質導入、又はトランスフェクトし得る。ベクターの例には、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、バクテリオファージ、例えばλファージ又はＭ１３ファージ、及び動物ウイルスが含まれる。ベクターとして用いられる動物ウイルスのカテゴリーには、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポバウイルス（例えばＳＶ４０）が含まれる。ベクターは、発現を制御するための多様な要素を含有してもよく、これには、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能要素、及びレポーター遺伝子が含まれる。さらに、ベクターは、複製起点を含有してもよい。ベクターにはまた、細胞内への進入を補助する物質が含まれてもよく、これには、限定されるわけではないが、ウイルス粒子、リポソーム、又はタンパク質コーティングが含まれる。ベクターは、発現ベクター又はクローニングベクターであってもよい。本開示は、融合ポリペプチドをコードする本明細書に提供される核酸配列、この核酸配列に機能的に連結された少なくとも１つのプロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）、及び少なくとも１つの選択マーカーを含有するベクター（例えば発現ベクター）を提供する。ベクターの例としては、限定されるわけではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えばＳＶ４０）、λファージ、及びＭ１３ファージ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．３、ｐＭＤ１８－Ｔ、ｐＯｐｔｉｖｅｃ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＩＲＥＳ、ｐＱＤ－Ｈｙｇ－ＧＳｅｕ、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ－Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ１０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２、ｐＣＭＶ－ＳＣＲＩＰＴ（商標）、ｐＣＤＭ８、ｐＣＤＮＡ１．１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ＰＣＲ ２．１、ｐＥＦ－１、ｐＦＢ、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１、ｐＣＤＥＦ３、ｐＳＶＳＰＯＲＴ、ｐＥＦ－Ｂｏｓ等が挙げられる。
語句「宿主細胞」は、本明細書において使用される場合、外因性ポリヌクレオチド及び／又はベクターが導入されている細胞を指す。
用語「医薬的に許容され得る」は、示される担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤（複数の場合もある）及び／又は塩が、一般的に、配合物を構成する他の成分と、化学的及び／又は物理的に適合し、かつそのレシピエントに生理学的に適合することを示す。
用語「被験体」又は「個体」又は「動物」又は「患者」は、本明細書において使用される場合、疾患又は障害の診断、予後決定、軽減、防止及び／又は治療が必要な、ヒト又は哺乳動物若しくは霊長類を含む非ヒト動物を指す。哺乳動物被験体には、ヒト、家庭動物、農場動物、及び動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマ等が含まれる。
本明細書において使用される場合、病態を「治療する」又はその「治療」の用語には、病態の防止若しくは軽減、病態の発生若しくは展開速度の緩徐、病態の展開リスクの減少、病態と関連する症状の展開の防止若しくは遅延、病態と関連する症状の減少若しくは終結、病態の完全若しくは部分的退行の生成、病態の治癒、又はそのいくつかの組み合わせが含まれる。
樹状細胞（ＤＣ）活性化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本開示は、免疫抑制性腫瘍微小環境又は腫瘍免疫抑制性微小環境（ＴＩＭＥ）において、樹状細胞（ＤＣ）を活性化可能なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）を提供する。用語「免疫抑制性腫瘍微小環境」及び用語「ＴＩＭＥ」は交換可能に使用可能であり、高密度細胞外マトリックスとともに、腫瘍免疫監視及び免疫療法を抑制する可能性がある、例えば腫瘍細胞、腫瘍浸潤性免疫細胞、腫瘍関連線維芽細胞、内皮細胞、並びに多様な走化性及び炎症性又は免疫刺激性サイトカインを有する微小環境を指す（F. R. Balkwill et al., The tumor microenvironment at a glance. J. Cell Sci. 125, 5591-5596 (2012)、M. Binnewies et al., Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nat Med. 24, 541-550 (2018)、M. A.-M. Alireza Labani-Motlagh et al., The Tumor Microenvironment: A Milieu Hindering and Obstructing Antitumor Immune Responses. Front. Immunol. 11, 940 (2020)及びL. Hui et al., Tumor microenvironment: Sanctuary of the devil. Cancer Lett. 368, 7-13 (2015)）。
或る特定の実施形態において、免疫抑制性腫瘍微小環境又はＴＩＭＥは、免疫阻害分子を発現する固形腫瘍及び／又は腫瘍浸潤性免疫細胞を含む。免疫阻害分子は、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＨＬＡクラスＩ、シアロ糖タンパク質、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ガレクチン９、ＣＤ２４、並びにＣＤ４７からなる群から選択され得る。或る特定の実施形態において、免疫阻害分子はＣＴＬＡ－４及び／又はＰＤ－Ｌ１である。本明細書において使用される場合、免疫阻害分子に関する「発現している」又は「発現する」の用語は、免疫阻害分子を、参照レベルよりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも６０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１２０倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍又は少なくとも１０００倍高いレベルで発現することを指す。免疫阻害分子の発現に関する用語「参照レベル」は、免疫不全動物モデル（例えばＮＳＧマウス）において、野生型腫瘍細胞（例えば野生型Ａ５４９細胞）によって形成される腫瘍中の免疫阻害分子の発現レベルを指す。
「ＣＴＬＡ－４」は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated protein 4）を略したものであり、ＣＤ１５２としても知られ、より詳細な説明は、例えばKolar et al., (January 1, 2009) CTLA-4 (CD152) controls homeostasis and suppressive capacity of regulatory T cells in mice. Arthritis Rheum. 60 (1): 123-32に見出され得る。「ＰＤ－Ｌ１」はプログラム細胞死リガンド１（programmed death-ligand 1）を略したものであり、表面抗原分類２７４（ＣＤ２７４）又はＢ７ホモログ１（Ｂ７－Ｈ１）としても知られ、より詳細な説明は、例えばDong H et al., B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nature Medicine. 5 (12): 1365-9, 1999に見出され得る。
ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞活性を制限することにより、末梢性免疫寛容を維持する際に非常に重要な免疫阻害分子である。ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ８０及びＣＤ８６に、ＣＤ２８よりもより高いアフィニティで結合し、これらは、Ｔ細胞を活性化するための主な共刺激経路である。ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞表面上に発現されるＰＤ－１に結合し、Ｔ細胞活性を阻害する。ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞アネルギーを維持し、自己免疫を防止する際に中心的な役割を果たす（Walker LSK et al., The enemy within: keeping self-reactive T cells at bay in the periphery. Nat Rev Immunol. 2002; 2:11-19.、Fife BT et al., Control of peripheral T-cell tolerance and autoimmunity via the CTLA-4 and PD-1 pathways. Immunological Reviews. 2008; 224:166-182.、及びKeir ME et al., PD-1 and Its Ligands in Tolerance and Immunity. Annual Review of Immunology. 2008; 26:677-704.）。
或る特定の実施形態において、ＴＩＭＥ内の腫瘍は、ＣＴＬＡ－４－イムノグロブリン融合タンパク質（ＣＴＬＡ４－Ｉｇ）及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現する細胞を含む。ＣＴＬＡ４－Ｉｇは、Ｔ細胞媒介性免疫反応を阻害するために開発されてきている（Walker LSK et al., The enemy within: keeping self-reactive T cells at bay in the periphery. Nat Rev Immunol. 2002; 2:11-19.）。本明細書において使用される場合、ＣＴＬＡ４－Ｉｇに関する「発現している」又は「発現する」の用語は、ＣＴＬＡ４－Ｉｇを、参照レベルよりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも６０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１２０倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍又は少なくとも１０００倍高いレベルで発現することを指す。ＣＴＬＡ４－Ｉｇの発現に関する用語「参照レベル」は、野生型腫瘍細胞（例えば野生型Ａ５４９細胞）におけるＣＴＬＡ４－Ｉｇの発現レベルを指す。本明細書において使用される場合、ＰＤ－Ｌ１に関する「発現している」又は「発現する」の用語は、ＰＤ－Ｌ１を、参照レベルよりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも６０倍、少なくとも８０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１２０倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍又は少なくとも１０００倍高いレベルで発現することを指す。ＰＤ－Ｌ１の発現に関する用語「参照レベル」は、野生型腫瘍細胞（例えば野生型Ａ５４９細胞）におけるＰＤ－Ｌ１の発現レベルを指す。
或る特定の実施形態において、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇは、配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号８に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を含む。或る特定の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１は、配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号９に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を含む。
或る特定の実施形態において、免疫抑制性腫瘍微小環境は、養子細胞療法の単独療法（例えばＣＡＲ－Ｔ単独療法）に対して劣った反応性を有する腫瘍を含む。本明細書において使用される場合、かつ本明細書全体で、用語「劣った反応性」は、療法効果がないことが知られる対照治療と比較した際、療法（例えばＣＡＲ－Ｔ療法）の同程度の療法効果（例えば２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満又は２％未満のより優れた療法効果、好ましくは１０％未満のより優れた療法効果）によって検出され得る、反応性の非存在又は減少を指す。
樹状細胞は、ナイーブＴ細胞をプライミングし、メモリー反応を再活性化することが可能なプロフェッショナル抗原提示細胞である。癌において、樹状細胞は、Ｔ細胞（例えば細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞）を、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又はネオ抗原の交差提示を通じて活性化して、より強い抗腫瘍反応を誘発可能である。ＤＣの活性化は、限定なしに、ＤＣの活性化状態及び／又は免疫細胞（例えばＴ細胞、マクロファージ）の活性化状態を含む多様なパラメータを測定することによってアッセイ可能であり、これは、ＤＣ活性化マーカー（例えばＣＤ８０、ＣＤ８６及びＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ８３、ＣＤ５４、ＣＭＲＦ－４４、ＣＭＲＦ－５６、ＩＩＩ型ＩＮＦ、ＩＬ－１２、ＣＸＣＬ９／１０、ＩＲＦ８）の発現レベル、免疫細胞（例えばＴ細胞）の生存及び／又は細胞傷害性、免疫細胞（例えばＴ細胞）からの免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）の発現（及び／又は分泌）、免疫細胞（例えばＴ細胞）からの免疫阻害分子（例えば、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９））の発現レベル、及び／又は抗炎症マクロファージ（例えばＭ２マクロファージ）に関するマーカー、例えばＣＤ２０６及びＣＤ１６３の発現レベルによって示され得る。
或る特定の実施形態において、樹状細胞の活性化は、樹状細胞の参照状態（例えば不活性化状態）と比較した際の、ＤＣ活性化マーカー（例えばＣＤ８０、ＣＤ８６及び／又はＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ８３、ＣＤ５４、ＣＭＲＦ－４４、ＣＭＲＦ－５６、ＩＩＩ型ＩＮＦ、ＩＬ－１２、ＣＸＣＬ９／１０、ＩＲＦ８）の発現レベル増加、免疫細胞（例えばＴ細胞（例えばＣＤ８＋ Ｔ細胞）、ＤＣ）の生存増加、免疫細胞（例えばＴ細胞）からの免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及び／又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）の発現（及び／又は分泌）増加、免疫細胞（例えばＴ細胞）からの免疫阻害分子（例えば、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９））の発現減少、及び／又は抗炎症マクロファージ（例えばＭ２マクロファージ）に関するマーカー（例えばＣＤ２０６及びＣＤ１６３）の発現レベル減少を含む。
或る特定の実施形態において、本明細書に提供されるＤＣ活性化ＣＡＲは、（１）細胞外抗原結合ドメイン、（２）膜貫通ドメイン及び（３）細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
（１）細胞外抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒト若しくはヒト化抗体又はその抗体断片を含む。用語「ヒト抗体」は、分子全体がヒト起源であるか、又は抗体若しくは免疫グロブリンのヒト型に同一のアミノ酸配列からなる抗体を指す。用語「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリン由来の配列（例えばＣＤＲ配列）を含有する抗体を指す。ヒト若しくはヒト化抗体又はその断片は、多様な方法で、例えば組換え方法論を通じて、又はヒト重鎖及び／又は軽鎖コード遺伝子由来の抗体を発現するように遺伝子修飾されているマウスの関心対象の抗原での免疫を通じて、調製され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、ナノボディ、非共有若しくは共有結合リガンド／受容体ドメイン、又は抗原結合ドメインとして機能することが当該技術分野で知られる任意の別のスキャフォールドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。ｓｃＦｖは、腫瘍表面マーカー、例えば固形腫瘍表面マーカーに特異的であってもよい。或る特定の実施形態において、腫瘍表面マーカーは、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１９、ＣＤ７０、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１４７、ＣＤ１７１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＧＦＲ２、メソテリン、ガングリオシドＧＤ２、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＦＢＰ（葉酸結合タンパク質）、ＬＭＰ１、ルイスＹ、クローディン１８．２、ＩＬ１３Ｒα２、ＨＥＲ２、ＭＤＣ１、ＰＭＳＡ（前立腺膜特異的抗原）、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、Ｂ７－Ｈ３、ＣＡＩＸ、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＧＰＣ３、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＴＲＯＰ２、ＥｐＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄ、重要な正常組織より腫瘍細胞表面上でより高く濃縮されることが見出されている他のタンパク質、及びその組み合わせからなる群から選択される。細胞外抗原結合ドメインはまた、ＴＩＭＥを炎症促進状態に変換することから利益を得る可能性がある疾患に関する非腫瘍マーカー、例えば感染性疾患のマーカーに特異的であってもよい。
いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖはＥｐｈＡ２に特異的である。或る特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、そのＶＬ領域とＶＨ領域との間に、少なくとも０、１、２、３、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれより多いアミノ酸残基のペプチドリンカーを含む。リンカー配列は、任意の天然存在アミノ酸を含んでもよい。或る特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号５７（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を含むアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、可変重鎖（ＶＨ）領域及び可変軽鎖（ＶＬ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨは、配列番号１０に示される配列、又は配列番号１０の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号１０に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）と、配列番号１１に示される配列、又は配列番号１１の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号１１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を有するＣＤＲ２と、配列番号１２に示される配列、又は配列番号１２の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号１２に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を有するＣＤＲ３とを含む。いくつかの実施形態において、ＶＬ領域は、配列番号１３に示される配列、又は配列番号１３の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号１３に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）と、配列番号１４に示される配列、又は配列番号１４の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号１４に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を有するＣＤＲ２と、配列番号１５に示される配列、又は配列番号１５の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号１５に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を有するＣＤＲ３とを含む。
或る特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、１）配列番号１０に示される配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１１に示される配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１２に示される配列を含むＨＣＤＲ３を含むＶＨと、２）配列番号１３に示される配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１４に示される配列を含むＬＣＤＲ２、配列番号１５に示される配列を含むＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。
いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖはＶＨ及びＶＬを含む。或る特定の実施形態において、ＶＨは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１６の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号１６に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を含む。或る特定の実施形態において、ＶＬは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１７の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号１７に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号１６に示される配列を含むＶＨと、配列番号１７に示される配列を含むＶＬとを含む。
いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む。
本開示は、ＥｐｈＡ２特異的ｓｃＦｖを発現するＣＡＲ－ＤＣが、免疫抑制環境において、肺腫瘍体積を有意に減少させ得ることの検証に成功した。しかし、本明細書に提供されるＣＡＲ－ＤＣが、肺癌を治療するためにのみ使用され得ると理解してはならない。当業者は、関心対象の疾患に応じて、多様な疾患、例えば癌、感染性疾患、又は免疫疾患に関する同定されるマーカーの現在の知識を考慮して、任意の疾患マーカーに特異的な適切な細胞外抗原結合ドメインを選択して、本明細書に提供されるＣＡＲを構築してもよいことを認識するであろう。多様な疾患マーカーには、限定されるわけではないが、上述のものが含まれる。
（２）膜貫通ドメイン
本明細書に記載のＣＡＲの膜貫通ドメインは、限定されるわけではないが、ＢＡＦＦＲ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ（ＣＤ１８、ＩＴＧＡＬ、ＬＦＡ－ｌ）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＩＰＯ－３、ＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭ）、ＣＤ１５４、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１６２（ＳＥＬＰＬＧ）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ２２９（Ｌｙ９）、ＣＤ２４４（２Ｂ４、ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、ＧＩＴＲ、ＨＹＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＫＩＲ、ＬＴＢＲ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＳＧＬ１、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭＦ７、Ｔ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＴＮＦＲ２、ＶＬＡ１、及びＶＬＡ－６を含む任意の膜結合型又は膜貫通タンパク質に由来してもよい。
１つの実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＤ８αの膜貫通ドメインを含む。或る特定の実施形態において、ＣＤ８αの膜貫通ドメインは、配列番号６の配列、又は配列番号６の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号６に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を含む。
或る特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲの膜貫通ドメインは、合成であり、例えば主に疎水性の残基、例えばロイシン及びバリンを含む。或る特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲの膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするため、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避するように修飾されるか又は設計される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間に連結を形成する、ヒンジ領域を更に含む。ヒンジ及び／又は膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインの細胞表面提示を提供する。
ヒンジ領域は、限定されるわけではないが、ＢＡＦＦＲ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ（ＣＤ１８、ＩＴＧＡＬ、ＬＦＡ－ｌ）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＩＰＯ－３、ＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭ）、ＣＤ１５４、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１６２（ＳＥＬＰＬＧ）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ２２９（Ｌｙ９）、ＣＤ２４４（２Ｂ４、ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、ＧＩＴＲ、ＨＹＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＫＩＲ、ＬＴＢＲ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＳＧＬ１、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭＦ７、Ｔ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＴＮＦＲ２、ＶＬＡ１、及びＶＬＡ－６を含む任意の膜結合型又は膜貫通タンパク質に由来してもよい。
いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、ＣＤ８αのヒンジ領域、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）のヒンジ領域、又はグリシン－セリンリッチ配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８αのヒンジ領域を含む。或る特定の実施形態において、ヒンジ領域は、配列番号７の配列、又は配列番号７の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号７に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を含む。
（３）細胞内シグナル伝達ドメイン
本明細書に記載のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが置かれている免疫細胞（例えば樹状細胞）の正常エフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。免疫細胞の文脈で用いられる用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化機能、例えば食作用活性、細胞溶解活性又はヘルパー活性を指す。或る特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫抑制性腫瘍微小環境において樹状細胞を活性化する（成熟を含む）ことが可能である。ＤＣの活性化は、多様な刺激に反応して、多くの細胞表面受容体、例えばＴＬＲ４（A. Iwasaki et al., Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).）、ＴＮＦＲ（L. M. Sedger et al., From mediators of cell death and inflammation to therapeutic giants - past, present and future. Cytokine Growth Factor Rev. 25, 453-472 (2014).）、ＩＦＮγＲ（M. Z. Jianping Pan et al., Interferon-γ is an autocrine mediator for dendritic cell maturation. Immunol. Lett. 94, 141-151 (2004).）、デクチン－１（T. S. Helen S. et al., Differential utilization of CARD9 by Dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009)）及びＦｃγＲ（M. Guilliams et al., The function of Fcγ receptors in dendritic cells and macrophages. Nat. Rev. Immunol. 14, 94-108 (2014).、T. H. Flinsenberg, Fc receptor antigen targeting potentiates cross-presentation by human blood and lymphoid tissue BDCA-3 dendritic cells. Blood 120, 26 (2012).）によって誘導されてもよい。これらのＤＣ活性化受容体は、細胞質ドメイン中に１つ以上の免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有し、これは、活性化シグナルカスケードを誘発して、ＤＣを活性化する。本明細書において使用される場合、用語「細胞質ドメイン」は、細胞質内部にあるタンパク質の全長ドメイン、又はその任意の断片、例えば全長ドメインの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の長さを有する断片を指す。
本明細書に記載のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＲＩＧ－１、ＮＬＲＰ１０、ＤＥＣ－２０５、ＢＤＣＡ－２、ＣＤ８６、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＩＦＮＡＲ、ＴＬＲ４、ＴＮＦＲ（例えば、ＴＮＦＲ２）、ＩＦＮγＲ、デクチン－１、及びＦｃγＲ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される樹状細胞活性化受容体の細胞質ドメインを含んでもよい。或る特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、デクチン－１の細胞質ドメイン及びＦｃγＲの細胞質ドメインを含む。
或る特定の実施形態において、デクチン－１の細胞質ドメイン及びＦｃγＲの細胞質ドメインは、タンデムに連結される。或る特定の実施形態において、デクチン－１の細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチドは、ＦｃγＲの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチドの上流である。或る特定の実施形態において、デクチン－１の細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチドは、ＦｃγＲの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチドの下流である。
デクチン－１の細胞質ドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を含み得る。或る特定の実施形態において、デクチン－１の細胞質ドメインは、配列番号５８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５８の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号５８に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を含む。或る特定の実施形態において、デクチン－１の細胞質ドメインは、配列番号５８に示されるアミノ酸配列を含む。
ＦｃγＲの細胞質ドメインは、配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号２に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を含み得る。或る特定の実施形態において、ＦｃγＲの細胞質ドメインは、配列番号５９及び／又は配列番号６０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５９及び／又は配列番号６０の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号５９及び／又は配列番号６０に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を含み得る。或る特定の実施形態において、ＦｃγＲの細胞質ドメインは、配列番号５９及び／又は配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含み得る。
或る特定の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号３に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を含む。
或る特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、又は配列番号４の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号４に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。
（４）共刺激シグナル伝達ドメイン
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを更に含む。
いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインに由来する。
共刺激分子の例には、Ｂ７－Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６９、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭ、ＳＬＡＭＦ１、ＩＰＯ－３）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１６２（ＳＥＬＰＬＧ）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ１）、ＣＤ２２９（Ｌｙ９）、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４、２Ｂ４）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、ＣＤＳ、ＯＸ４０、ＰＤ－ｌ、ＩＣＯＳ、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ－ｌ、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＬＡＴ、ＬＦＡ－ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＳＧＬ１、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ－７６、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１、ＶＬＡ－６、その任意の誘導体、変異体又は断片、同じ機能能力を有する共刺激分子の任意の合成配列、及びその任意の組み合わせが含まれる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２８、ＯＸ４０又はＩＣＯＳの細胞内ドメインを含む。
他の領域
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＣＤ８αのシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αのシグナルペプチドは、配列番号５の配列、又は配列番号５の実質的な生物学的活性を保持しながら、配列番号５に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有する配列、又はこれに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ若しくは１０の保存的置換を有する配列、又はその任意の機能型を含む。
ヒト固形腫瘍は、免疫療法を回避するため、複雑で不均一なＴＩＭＥを発展させる。現在の免疫療法（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞療法）は、固形腫瘍には有効ではない。腫瘍浸潤性免疫抑制ＤＣは、ＴＩＭＥに有意に寄与する。上述のようなＤＣ活性化ＣＡＲは、ＴＩＭＥを破壊し、ＴＩＭＥを炎症状態に変換し、操作免疫細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）の細胞傷害性及び生存を増進し、操作免疫細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）の有効性を有意に促進して、ＴＩＭＥを伴う固形腫瘍を除去することができる。
ベクター
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるようなＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを、当該技術分野に知られる異なるタイプのベクター、例えばプラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス由来のウイルスベクター、コスミド、トランスポゾン、部位特異的挿入ベクター（例えばＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ、又は自殺発現ベクター内に挿入してもよい。いくつかの実施形態において、ベクターはＤＮＡ又はＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、ベクターは発現ＤＮＡベクター（例えばプラスミド、ウイルス）である。発現ＤＮＡベクターを一過性に細胞に導入すると、ＣＡＲのｍＲＮＡが宿主細胞において転写される。ＤＮＡベクター及びｍＲＮＡは細胞分裂とともに希釈されるため、ＣＡＲの発現は永続的ではないと考えられる。１つの実施形態において、ＣＡＲの一過性発現の形として、ＤＮＡベクターを細胞に導入してもよい。
いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルス由来であってもよい。有用なウイルスベクターは、一般的に、少なくとも１つの生物において機能性である複製起点、プロモーター、制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択可能マーカーを含有する。いくつかの実施形態において、ベクターはレンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、非増殖細胞ゲノム内に、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを長期間安定して組み込むために特に有用であり、宿主細胞、例えば宿主Ｔ細胞において、ＣＡＲの安定発現を生じる。いくつかの実施形態において、ベクターは、Addgeneのレンチ－Ｃａｓ９ベクターである。
いくつかの実施形態において、ベクターはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）である。ＲＮＡは細胞分裂とともに希釈されるため、ＲＮＡの発現は永続的ではないと考えられる。１つの実施形態において、一過性発現の形として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ ＣＡＲを細胞に導入してもよい。
いくつかの実施形態において、ベクターはトランスポゾンに基づく発現ベクターである。トランスポゾンは、ゲノム内での位置を変化させ得るＤＮＡ配列である。トランスポゾン系において、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドには、トランスポゾンの移動を媒介するトランスポザーゼによって認識可能な末端反復配列が隣接する。トランスポザーゼは、ＣＡＲと同じベクター上にコードされ、又は別個のベクター上にコードされて、タンパク質として同時送達されてもよい。トランスポゾン系の限定されない例としては、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｐｉｇｇｙｂａｃｋ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、及びＰｒｉｎｃｅ Ｃｈａｒｍｉｎｇが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＣＡＲの発現のためのベクター中の少なくとも１つの制御ポリヌクレオチド要素に機能性に連結される。典型的なベクターは、多様な制御ポリヌクレオチド要素、例えば挿入されるポリヌクレオチドの発現を制御する要素（例えば転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及びプロモーター）、宿主細胞におけるベクターの複製を制御する要素（例えば複製起点）、及びベクターの宿主ゲノム内への組込みを制御する要素（例えばトランスポゾンの末端反復配列）を含有する。ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをプロモーターに動作可能に連結し、この構築物をベクター内に取り込むことによって、ＣＡＲの発現を達成してもよい。構成的プロモーター（例えばＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、及びＭＭＴＶプロモーター）又は誘導性プロモーター（例えばメタロチオネイン（metallothionine）プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、及びプロゲステロンプロモーター）の両方が本開示のために意図される。いくつかの実施形態において、ベクターは発現ベクターであり、発現ベクターは、発現のために十分なシス作用要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系において供給されてもよい。
ＣＡＲの発現を評価するため、ベクターはまた、ベクターが導入される細胞の同定及び選択のため、選択可能マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子又はその両方を含んでもよい。有用な選択可能マーカーには、例えば、抗生物質耐性遺伝子、例えばネオ等が含まれる。有用なレポーターには、例えば、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子が含まれる。
安定性及び／又は翻訳効率を促進する能力を持つ化学構造もまた、ＲＮＡ中で用いられてもよい。トランスフェクションに使用するＲＮＡを生成する方法は、特別に設計されたプライマー、その後のポリＡ付加を伴うテンプレートのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を伴い、３’及び５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップ及び／又は内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現しようとする核酸、及び典型的には長さ５０塩基～２０００塩基のポリＡテールを含有する構築物を産生してもよい。こうして産生されたＲＮＡは、異なる種類の細胞を効率的にトランスフェクトし得る。
ＲＮＡは、異なる多くの方法のいずれを用いて標的細胞内に導入されてもよく、例えば利用可能な方法には、限定されるわけではないが、エレクトロポレーション又はＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（BioRad、コロラド州デンバー）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Eppendort、独国ハンブルグ）、リポフェクションを用いた陽イオン性リポソーム媒介性トランスフェクション、ポリマー被包、ペプチド媒介性トランスフェクション、又は微粒子銃粒子送達系、例えば「遺伝子銃（gene guns）」が含まれる。
当該技術分野に知られる任意の方法によって、例えば物理的、化学的又は生物学的手段によって、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞内に、ベクターを導入してもよい。宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入する物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃（particle bombardment）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等が含まれる。生物学的方法には、遺伝子を哺乳動物、例えばヒト細胞に挿入するためのウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターの使用が含まれる。化学的手段には、コロイド分散系、例えば巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、並びに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質に基づく系が含まれる。
細胞
１つの態様において、本開示は、本明細書に記載されるようなＣＡＲを含むか又は発現する操作細胞を提供する。いくつかの実施形態において、操作細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、又はＣＡＲポリヌクレオチドを含むベクターを含む。本明細書に提供される操作細胞は、１つ以上（例えば１つ、２つ、３つ、又はそれより多い）ＣＡＲを含むか又は発現してもよい。１つ以上のＣＡＲは同じであっても又は異なってもよい。或る特定の実施形態において、操作細胞は、樹状細胞又はその前駆体若しくは前駆細胞である。用語「樹状細胞又はその前駆体若しくは前駆細胞」は、本明細書において使用される場合、天然又は改変樹状細胞又はその前駆体若しくは前駆細胞を指す。
細胞供給源
本明細書に提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）は、任意の供給源から得られ得る。或る特定の実施形態において、本明細書に提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）は、被験体、例えばヒト被験体から単離される免疫細胞由来である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、関心対象の被験体、例えば特定の疾患若しくは病態を有すると推測される被験体、特定の疾患若しくは病態に対する素因を有すると推測される被験体、特定の疾患若しくは病態のための治療を受ける予定である、受けている、若しくは受けたことがある被験体、健康な志願者若しくは健康なドナーである被験体から、又は血液バンクから得られる。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、免疫療法、例えばＣＡＲ－Ｔ療法に対して劣った反応性を有する癌被験体から得られる。
細胞は、関心対象の被験体に対して自己又は同種であってもよい。同種ドナー細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合性でなくてもよく、したがって、同種細胞は、免疫原性を減少させるように処理されてもよい。
免疫細胞を、被験体中に存在する任意の位置から収集してもよく、これには限定されるわけではないが、血液、臍帯血、脾臓、胸腺、リンパ節、胸水、脾臓組織、腫瘍及び骨髄が含まれる。単離免疫細胞を直接用いてもよいし、又はこれらを或る程度の期間、例えば凍結によって保存してもよい。
いくつかの実施形態において、樹状細胞又はその前駆体若しくは前駆細胞を操作することによって、操作細胞を得る。樹状細胞又はその前駆体若しくは前駆細胞は、当業者に知られる任意のいくつかの技術、例えばアフェレーシスを用いて、被験体から収集された血液から得られてもよい。いくつかの実施形態において、樹状細胞又はその前駆体若しくは前駆細胞は、末梢血細胞（例えば末梢血単核細胞、例えば単球）、骨髄細胞、胚性幹細胞、又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する。
以前に記載された方法を用いて、樹状細胞の存在をチェックしてもよい。例えば、免疫化学、免疫表現型決定、フローサイトメトリー、Ｅｌｉｓｐｏｔｓアッセイ、古典的四量体染色、及び細胞内サイトカイン染色等の技術を用いて検出可能な、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ／ＨＬＡ分子、及び／又はＣＣＲ７分子の発現を測定することによって、樹状細胞を同定してもよい。
ＣＡＲ－ＤＣを産生する方法
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるようなＣＡＲを発現する操作細胞を作製する方法を提供する。当該技術分野に知られるＣＡＲ－Ｔ細胞を生成する多くの手段を、ＣＡＲ－ＤＣにも適用してもよい。ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成する方法は、例えば、Zhang et al., Engineering CAR-T cells, Biomarker Research (2017) 5:22に記載されている。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に提供されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、このポリヌクレオチドの発現に適した条件下で、出発細胞に導入することを含む。本明細書に提供される方法は、出発細胞（すなわち供給源由来の細胞）を得る工程と、この出発細胞を培養する工程（拡大することを含み、任意選択で成熟させることを含む）と、この細胞を遺伝子修飾する工程とから選択される１つ以上の工程を含んでもよい。出発細胞は、上述のような、樹状細胞又はその前駆体若しくは前駆細胞であってもよい。
ＤＣ又はその前駆体若しくは前駆細胞の遺伝子修飾は、実質的に均質なＤＣ集団を、本明細書に提供されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドで形質導入することによって達成され得る。或る特定の実施形態において、ＤＣ内に本明細書に提供されるポリヌクレオチドを導入するため、レトロウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター）を使用する。例えば、本明細書に提供されるポリヌクレオチドをレンチウイルスベクター内にクローニングしてもよく、内因性プロモーターから、レンチウイルス長末端反復配列から、又は関心対象の標的細胞型に特異的なプロモーターから、発現を駆動してもよい。ウイルスベクターを送達するための一般的な送達法には、限定されるわけではないが、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、及びマグネトフェクションが含まれる。現在開示されるＣＡＲの配置は、任意の内因性遺伝子の遺伝子座で行われてもよい。
ＤＣ又はその前駆体若しくは前駆細胞の遺伝子修飾のため、非ウイルスアプローチを使用してもよい。例えば、核酸をリポフェクション（Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990、Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987、Staubinger et al., Methods in Enzymology 101:512, 1983、Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989）、シアロオロソムコイドポリリジンコンジュゲーション（Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988、Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989）の存在下で投与することによって、又は外科的条件下でのマイクロインジェクションによって（Wolff et al., Science 247:1465, 1990）、核酸分子をＤＣ又はその前駆体若しくは前駆細胞内に導入してもよい。遺伝子導入のための他の非ウイルス手段には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、及びプロトプラスト融合を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションが含まれる。リポソームはまた、細胞内へのＤＮＡの送達に潜在的に有益であり得る。被験体の罹患組織内への正常遺伝子の移植はまた、培養可能な細胞タイプ（例えば自己又は異種初代細胞又はその子孫）内に正常核酸をｅｘ ｖｉｖｏで導入し、その後、細胞（又はその子孫）を標的化組織内に注入するか、又は全身性に注入することによって、達成され得る。組換え受容体もまた、トランスポザーゼ又は標的化ヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又はＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ）を用いて、導き出されるか又は得られ得る。
或る特定の実施形態において、本明細書に提供される操作細胞は、投与前に、本明細書に提供されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを、ＤＣ内にトランスフェクトすることによって調製される。或る特定の実施形態において、本明細書に提供される操作細胞は、ＤＣの前駆体又は前駆細胞を、例えばウイルスベクターを通じて、本明細書に提供されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトし、その後、トランスフェクトされた細胞をＤＣに分化させることによって作製され得る。本明細書に提供される操作細胞は、細胞表面上にてＣＡＲの発現の改善を示す。ＤＣの前駆体又は前駆細胞は、末梢血細胞（例えば末梢血単核細胞、例えば単球、例えばＴＨＰ－１細胞、末梢単球）、骨髄細胞に由来してもよい。ＤＣの前駆体又は前駆細胞はまた、胚性幹細胞、又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。
別の態様において、本開示はまた、上述のような方法によって、ｅｘ ｖｉｖｏで産生された細胞集団も提供する。或る特定の実施形態において、細胞集団の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％が、本明細書に提供されるＣＡＲポリペプチドを検出可能なレベルで発現する。或る特定の実施形態において、細胞集団の少なくとも８５％が、本明細書に提供されるＣＡＲポリペプチドを検出可能なレベルで発現する。
ＤＣ活性化ＣＡＲを選択する方法
別の態様において、本開示はまた、ＤＣを活性化可能なＣＡＲを選択する方法も提供する。本明細書に提供される方法は、免疫抑制性腫瘍微小環境を含む非ヒト動物を準備することを含む。或る特定の実施形態において、免疫抑制性腫瘍微小環境は、臨床的に適切である。本明細書において使用される場合、免疫抑制性腫瘍微小環境又はＴＩＭＥに関する用語「臨床的に適切」は、以下の特徴の１つ以上で特徴づけられる免疫抑制性腫瘍微小環境を指す。１）低酸素及び酸性、２）負の免疫制御細胞、例えば制御性Ｔ細胞、免疫抑制性ＤＣ細胞、腫瘍関連マクロファージ及び腫瘍関連線維芽細胞の濃縮、３）免疫抑制性分子、例えばＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＨＬＡクラスＩ、シアロ糖タンパク質、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ガレクチン９、ＣＤ２４、及びＣＤ４７の過剰発現、並びに４）腫瘍浸潤性免疫細胞（例えば免疫エフェクター細胞）の活性抑制可能。
或る特定の実施形態において、非ヒト動物（例えばマウス）モデルは、ヒト胎児胸腺及び自己ヒト造血幹細胞（例えば自己ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞、例えば自己ヒト胎性肝臓ＣＤ３４＋造血幹細胞）を含む。用語「自己」は、本明細書において使用される場合、ヒト造血幹細胞及びヒト胎性胸腺が同じ胎性供給源から生じていることを指し得る。或る特定の実施形態において、非ヒト動物（例えばマウス）モデルに、約１×１０５～約５×１０５自己ヒト造血幹細胞（例えば自己ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞、例えば自己ヒト胎性肝臓ＣＤ３４＋造血幹細胞）を注入する。或る特定の実施形態において、非ヒト動物（例えばマウス）モデルは、ヒトリンパ造血細胞、例えばＴ細胞（例えばＣＤ３＋ Ｔ細胞）、Ｂ細胞（例えばＣＤ１９＋ Ｂ細胞）及び任意選択で樹状細胞（ＤＣ）であって、ヒト胸腺環境内部で自己ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の存在下、正常ヒトＴ細胞成熟を可能にするものを含む、持続性ヒト免疫系を含む。或る特定の実施形態において、非ヒト動物は齧歯類、例えばラット又はマウスである。
或る特定の実施形態において、非ヒト動物は、免疫抑制性微小環境、例えば免疫抑制性腫瘍微小環境を含む。或る特定の実施形態において、免疫抑制性腫瘍微小環境は、免疫阻害分子を発現する腫瘍及び／又は腫瘍浸潤性免疫細胞を含む。免疫阻害分子は、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＨＬＡクラスＩ、シアロ糖タンパク質、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ガレクチン９、ＣＤ２４、並びにＣＤ４７からなる群から選択され得る。或る特定の実施形態において、免疫阻害分子は、ＣＴＬＡ－４及び／又はＰＤ－Ｌ１である。或る特定の実施形態において、腫瘍は、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現する細胞を含む。
本明細書に提供される方法は、更に、候補ＣＡＲを発現している樹状細胞を、上述の非ヒト動物に投与することと、参照ＤＣと比較した際、例えば免疫抑制性腫瘍微小環境への浸潤改善、生存率改善、及び／又は免疫細胞（例えばＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ細胞、好酸球又は好中球）の活性化誘導における機能増進を含む、樹状細胞活性化に関するマーカーを検出することと、ＤＣを活性化可能なＣＡＲとして候補ＣＡＲを選択することとを含む。或る特定の実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ターミナルエフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδ Ｔ細胞、サイトカイン誘導型キラー（ＣＩＫ）Ｔ細胞、及び腫瘍浸潤性リンパ球からなる群から選択されるＴ細胞である。或る特定の実施形態において、免疫細胞は自己又は同種である。或る特定の実施形態において、免疫細胞は改変免疫細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）又はナイーブ免疫細胞である。或る特定の実施形態において、改変免疫細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）は、候補ＣＡＲを発現する樹状細胞と組み合わせて投与される。
臨床的に適切なＴＩＭＥを伴う非ヒト動物に関与するＤＣ活性化ＣＡＲを選択する方法は、より臨床的に適切なＤＣ活性化ＣＡＲ又はＣＡＲ－ＤＣを提供する。言い換えると、本明細書に提供される方法によって選択されるＤＣ活性化ＣＡＲ又はＣＡＲ－ＤＣは、動物モデルにおいてＤＣを活性化可能であるだけでなく、慣用的な動物モデルと比較した際、ヒト患者においては腫瘍微小環境の複雑性及び不均一性が増加しているため、慣用的な動物モデルによってはこれまでほとんど達成不能であった臨床設定下でも、ＤＣを活性化すると予期され得る。
医薬組成物
別の態様において、本開示はまた、本明細書に提供されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと医薬的に許容され得る媒体とを含む医薬組成物も提供する。別の態様において、本開示はまた、本明細書に提供されるＣＡＲポリペプチドと医薬的に許容され得る媒体とを含む医薬組成物も提供する。別の態様において、本開示はまた、本明細書に提供されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを送達するベクターと医薬的に許容され得る媒体とを含む医薬組成物も提供する。別の態様において、本開示はまた、本明細書に提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）集団と医薬的に許容され得る媒体とを含む医薬組成物も提供する。本明細書において使用される場合、用語「医薬組成物」は、医薬使用のために配合された組成物を指す。
用語「医薬的に許容され得る」は、指定される担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤（複数の場合もある）、及び／又は塩が、一般的に、配合物を構成する他の成分と、化学的及び／又は物理的に適合し、かつそのレシピエントに生理学的に適合することを示す。
「医薬的に許容され得る媒体」は、生物学的に許容可能であり、被験体に対して非毒性である、活性成分以外の医薬配合物中の成分を指す。本明細書に開示される医薬組成物中で使用される医薬的に許容され得る媒体には、例えば、医薬的に許容され得る液体、ゲル、若しくは固形担体、水性若しくは非水性ビヒクル、抗微生物剤、緩衝剤、酸化防止剤、等張剤、懸濁／分散剤、封鎖若しくはキレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、若しくは非毒性補助物質、又はその多様な組み合わせが含まれ得る。
本開示の医薬組成物は、当該技術分野に知られる多様な技術を用いて調製され得る。例えば、Remington, The Science And Practice of Pharmacy (21st ed. 2005)を参照されたい。簡潔には、操作細胞又はその集団を、使用又は保存前に、適切な媒体と混合する。適切な医薬的に許容され得る媒体は、一般的に、１）医薬組成物の被験体への投与、２）医薬組成物の送達可能な調製物へのプロセシング、及び／又は３）投与前の医薬組成物の保存を補助する、不活性物質を含む。或る特定の実施形態において、医薬的に許容され得る媒体は、配合物の型、コンシステンシー、粘性、ｐＨ、薬物動態、及び／又は溶解性を安定化させるか、最適化するか、又は改変し得る作用物質を含む。こうした作用物質には、限定なしに、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、希釈剤、被包剤、及び皮膚浸透増進剤、例えば生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、アルギニン、スクロース、水、グリセロール、エタノール、ソルビトール、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及びその組み合わせが含まれる。
例示的な医薬的に許容され得る媒体には、糖（例えばラクトース、グルコース及びスクロース）、デンプン（例えばコーンスターチ及びジャガイモデンプン）、セルロース及びその誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース及び酢酸セルロース）、粉末化トラガカント、麦芽、ゼラチン、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルク）、賦形剤（例えばココアバター及び座薬ワックス）、油（例えばピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油、グリコール（例えばプロピレングリコール）、ポリオール（例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、エステル（例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル）、寒天、緩衝剤（例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム）、アルギン酸、発熱物質不含水、等張性生理食塩水、リンゲル溶液、エチルアルコール、ｐＨ緩衝溶液、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ無水物、充填剤（bulking agents）（例えばポリペプチド及びアミノ酸）、血清アルコール（例えばエタノール）、（無菌）リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液及び医薬配合物中で用いられる他の非毒性適合物質が含まれる。
抗原に対する免疫反応を誘導及び／又は増進するため、及び／又は新生物、病原体感染、又は感染性疾患を治療及び／又は防止するため、本明細書に提供される医薬組成物を、被験体に全身性に又は直接投与してもよい。或る特定の実施形態において、本明細書に提供される医薬組成物は、関心対象の腫瘍又は臓器内に直接注射される。他の実施形態において、本明細書に提供される医薬組成物は、例えば循環系（例えば腫瘍血管系）内への投与によって、関心対象の臓器に間接的に投与される。
本明細書に提供される医薬組成物は、少なくとも約１×１０５、約２×１０５、約３×１０５、約４×１０５又は約５×１０５の操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）集団を含み得る。当業者は、多様な既知の方法、例えば蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、集団中の本明細書に提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）の割合を容易に決定可能である。集団中の、本明細書に提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）の割合（「純度」とも称される）の適切な範囲は、約５０％～約５５％、約５５％～約６０％、約６０％～約６５％、約６５％～約７０％、約７０％～約７５％、約７５％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、又は約９５％～約１００％であってもよい。
或る特定の実施形態において、レシピエントには、少なくとも１×１０３細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０３細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０４細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０４細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０７細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０７細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも２×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも３×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも４×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０８細胞／ｋｇ体重、又は少なくとも６×１０８細胞／ｋｇ体重が投与される。当業者は、本明細書に提供される医薬組成物の投薬量は、レシピエントの多様な要因、例えばサイズ、年齢、性別、体重、及び状態に基づいて決定され得ることを理解する。投薬量は、本開示及び当該技術分野における知識から、当業者によって容易に決定され得る。当業者は、組成物中の、本開示の方法で投与されるべき本明細書に提供される操作細胞の数、並びに任意選択の添加剤、ビヒクル、媒体及び／又は担体の量を容易に決定可能である。典型的には、添加剤は、あるとすれば、リン酸緩衝生理食塩水中、０．００１％～５０％（重量）溶液の量で存在し、活性成分（例えば本明細書に提供される改変／組換え細胞）は、マイクログラムからミリグラムの桁、例えば約０．０００１～約５重量％、好ましくは約０．０００１重量％～約１重量％、更により好ましくは約０．０００１重量％～約０．０５重量％又は約０．００１重量％～約２０重量％、好ましくは約０．０１重量％～約１０重量％、更により好ましくは約０．０５重量％～約５重量％で存在する。或る特定の投薬量の毒性を、例えば適切な動物モデル（例えばマウス）において、致死用量（ＬＤ）及びＬＤ５０を決定することによって、決定することが好ましい。適切な反応を誘発する、組成物（複数の場合もある）投与のタイミングを決定することもまた好ましい。こうした決定は、当業者の知識及び本開示によるものであり、過度の実験を必要としない。
本明細書に提供される医薬組成物は、例えば注射（例えば全身注射、局所注射、静脈内注射、リンパ内注射）又はカテーテルによって投与され得る。或る特定の実施形態において、本明細書に提供される医薬組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、髄内、又は腹腔内に投与され得る。１つの実施形態において、本開示の細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。投与は自己又は異種であってもよい。例えば、１つの被験体由来の出発細胞を改変することによって、操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）を得て、同じ被験体又は異なる被験体に投与してもよい。本明細書に提供される医薬組成物は、投与のための単位投薬注射可能型（例えば溶液、懸濁物、エマルジョン）で配合されてもよい。本明細書に提供される医薬組成物の投与は、単一事象として、又は治療の時間経過に渡って、例えば毎日、毎週、２週に一度、若しくは毎月、行われてもよい。本明細書に提供される医薬組成物は、別の作用物質、例えば化学療法剤、別の型の免疫療法（例えばＣＡＲ－Ｔ療法）、又は放射線療法と組み合わせて（例えばこれらの前に、後に、又はこれらと同時に）投与されてもよい。同時投与は、各々が、本明細書に提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）、及び別の作用物質、例えば化学療法剤、別の型の免疫療法（例えばＣＡＲ－Ｔ療法）、又は放射線療法を含有する別個の組成物の投与を通じて行われてもよい。同時投与は、本明細書に提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）、及び別の作用物質、例えば化学療法剤、別の型の免疫療法（例えばＣＡＲ－Ｔ療法）、又は放射線療法を含有する１つの組成物の投与を通じて行われてもよい。
キット
別の態様において、本開示はまた、本明細書に提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）を含むキットも提供する。別の態様において、本開示はまた、本明細書に提供されるＣＡＲ－ＤＣを生成する際に使用される、本明細書に提供されるポリペプチド、本明細書に提供されるポリヌクレオチド又は発現ベクターを含むキットも提供する。
いくつかの実施形態において、本開示のキットは、キットの使用のための書面の使用説明書を含む。或る特定の実施形態において、使用説明書には、臨床研究、使用上の注意、警告、及び／又は参考文献の少なくとも１つが含まれる。使用説明書は、容器（存在する場合）上に直接印刷されていてもよいし、又は容器中に、若しくは容器に適用されるラベルとして容器とともに、若しくは別個のシート、パンフレット、カード若しくはフォルダーとして、提供されてもよい。適切な容器には、例えば、ボトル、シリンジ、バイアル、及び試験管が含まれる。容器は、多様な材料、例えばプラスチック又はガラスから形成されてもよい。或る特定の実施形態において、容器は、本明細書に提供される医薬組成物を保持し、無菌アクセスポートを有する。
或る特定の実施形態において、キットは、上述のような医薬的に許容され得る媒体を含む第二の容器を更に含む。或る特定の実施形態において、キットは、商業的に望ましいか又はユーザーフレンドリーな他の物質、例えば他の希釈剤、緩衝剤、針、フィルター、シリンジ、及び使用の説明書を含む添付文書を更に含む。
使用法
本開示はまた、本明細書に提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）の多様な使用も提供する。
一般的使用
１つの態様において、本開示は、患者において疾患又は病的状態を治療する方法であって、患者に本明細書に提供される操作細胞を療法的有効量、投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、疾患又は病的状態を治療する方法は、被験体から単離された細胞（例えば末梢血細胞、骨髄細胞、胚性幹細胞）から単離されたか若しくはこうした細胞に由来する、又はｉＰＳＣに由来する、ＤＣを準備することと、ＤＣを操作して本明細書に提供されるようなＣＡＲを発現させることと、操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）を被験体に戻して注入することとを含む。いくつかの実施形態において、疾患又は病的状態を治療する方法は、ＤＣの前駆体又は前駆細胞（例えば末梢血細胞、骨髄細胞、胚性幹細胞、又はｉＰＳＣ）を準備することと、この前駆体又は前駆細胞を分化させ、操作して、本明細書に提供されるようなＣＡＲを発現させることと、分化し操作された細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）を被験体に戻して注入することとを含む。いくつかの実施形態において、疾患又は病的状態を治療する方法は、ＤＣの前駆体又は前駆細胞（例えば末梢血細胞、骨髄細胞、胚性幹細胞、又はｉＰＳＣ）を準備することと、この前駆体又は前駆細胞を操作して、本明細書に提供されるようなＣＡＲを発現させることと、操作された前駆体又は前駆細胞を、本明細書に提供されるようなＣＡＲを発現するＤＣに分化させることと、本明細書に提供されるようなＣＡＲを発現するＤＣ（例えばＣＡＲ－ＤＣ）を被験体に戻して注入することとを含む。
いくつかの実施形態において、疾患は癌である。
いくつかの実施形態において、癌は、副腎癌、骨癌、脳癌、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、眼癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、細気管支肺胞細胞肺癌、中皮腫、頭頸部癌、扁平上皮癌、黒色腫、口腔癌、卵巣癌、子宮頸癌、陰茎癌、前立腺癌、膵臓癌、皮膚癌、肉腫、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、膣癌からなる群から選択される固形癌である。いくつかの実施形態において、癌は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、ＨＨＶ８関連原発性滲出性リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球リッチＢ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫（ＭＭ）からなる群から選択される、血液学的悪性疾患である。
いくつかの実施形態において、癌を有する被験体は、癌療法（例えば免疫療法）に対する反応性が劣っている。
用語「免疫療法」は、本明細書において使用される場合、癌等の疾患に対して戦うように免疫系を刺激するか、又は一般的な方式で免疫系をブーストする療法タイプを指す。免疫療法には、直接又は間接的に抗腫瘍効果を媒介し、必ずしもインタクトな宿主免疫系に依存しない、確立された腫瘍免疫反応性を持つ作用物質（例えばエフェクター細胞）を送達することによる受動免疫療法（例えば抗体療法又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法）が含まれる。免疫療法には更に、治療が、免疫反応修飾剤の投与を伴い、疾患細胞に対して反応するように内因性宿主免疫系をｉｎ ｖｉｖｏ刺激することに頼る、能動免疫療法が含まれ得る。
免疫療法の例としては、限定なしに、チェックポイント調節剤、養子細胞移入、サイトカイン、腫瘍溶解性ウイルス及び療法ワクチンが挙げられる。
チェックポイント調節剤は、癌細胞が免疫系の攻撃を回避する能力に干渉し、免疫系が腫瘍に対してより強く反応するよう援助し得る。免疫チェックポイント分子は、共刺激シグナルを媒介して、免疫反応を増大し得るか、又は共阻害シグナルを媒介して、免疫反応を抑制し得る。チェックポイント調節剤の例としては、限定なしに、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦ β、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ１２２、ＩＣＡＭ－１、ＩＤＯ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＳＩＧＬＥＣ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、ＬＦＡ－１、１ＣＯＳ、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＣＤ３、ＣＤ１６及びＣＤ８３の調節剤が挙げられる。或る特定の実施形態において、免疫チェックポイント調節剤は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸阻害剤を含む。
養子細胞移入は、Ｔ細胞が癌と戦う天然の能力をブーストするよう試みる治療である。この治療において、患者からＴ細胞を採取し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大し、活性化する。或る特定の実施形態において、Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＡＲ－Ｔ細胞へと改変する。癌に対して最も活性であるＴ細胞又はＣＡＲ－Ｔ細胞を、大容量で、２週間～８週間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する。この期間中、患者は体の免疫を減少させる化学療法及び放射線療法等の治療を受ける。これらの治療後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養したＴ細胞又はＣＡＲ－Ｔ細胞を患者に戻す。或る特定の実施形態において、免疫療法はＣＡＲ－Ｔ療法である。
ＴＩＭＥの破壊
１つの態様において、本開示は、本明細書で提供されるＣＡＲ－ＤＣ又はその集団を用いて、ＴＩＭＥを破壊する（例えばＴＩＭＥを炎症状態に変換する）方法を提供する。
別の態様において、本開示はまた、免疫抑制性微小環境において、免疫細胞増殖を誘導し、免疫細胞の生存を延長させ、及び／又は免疫細胞からの免疫刺激性サイトカインの発現及び／又は分泌を増加させる方法も提供する。免疫刺激性サイトカインは、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の１つ以上であってもよい。方法は、免疫抑制性微小環境を、本明細書に提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）と接触させることを含む。免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ細胞、好酸球又は好中球であってもよい。或る特定の実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ターミナルエフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδ Ｔ細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）Ｔ細胞、及び腫瘍浸潤性リンパ球からなる群から選択されるＴ細胞である。或る特定の実施形態において、免疫細胞は、非改変免疫細胞である。或る特定の実施形態において、免疫細胞は改変免疫細胞である。非改変又は改変免疫細胞は、自己又は同種であってもよい。或る特定の実施形態において、改変免疫細胞はＣＡＲ－Ｔ細胞である。或る特定の実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、本明細書に提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）と同じ供給源（例えば被験体の末梢血）に由来する。
或る特定の実施形態において、免疫抑制性微小環境は、免疫抑制性腫瘍微小環境である。免疫抑制性腫瘍微小環境は、「樹状細胞（ＤＣ）－活性化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」と題されるセクションに記載されている。或る特定の実施形態において、免疫抑制性腫瘍微小環境は、例えばＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、シアロ糖タンパク質、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ガレクチン９、ＣＤ２４、及びＣＤ４７からなる群から選択される免疫阻害分子を発現する、腫瘍及び／又は腫瘍浸潤性免疫細胞を含む。或る特定の実施形態において、免疫阻害分子は、ＣＴＬＡ－４及び／又はＰＤ－Ｌ１である。或る特定の実施形態において、腫瘍は、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現する細胞を含む。
養子細胞療法（例えばＣＡＲ－Ｔ療法）の有効性改善
別の態様において、本開示は、治療が必要な被験体において、癌を治療する際の養子細胞療法の有効性を改善する方法を提供する。方法は、本明細書に提供される医薬組成物を療法的有効量、投与することを含む。或る特定の実施形態において、本明細書に提供される方法は、改変免疫細胞集団を含む医薬組成物を投与することを更に含む。
養子細胞療法は、改変免疫細胞、例えば細胞表面上に合成受容体（例えばＣＡＲ又はＴＣＲ）を発現する免疫細胞の養子移入を含む。改変免疫細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ細胞、好酸球又は好中球であってもよい。或る特定の実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ターミナルエフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδ Ｔ細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）Ｔ細胞、及び腫瘍浸潤性リンパ球からなる群から選択されるＴ細胞である。改変免疫細胞は、自己又は同種であってもよい。或る特定の実施形態において、改変免疫細胞はＣＡＲ－Ｔ細胞である。或る特定の実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、本明細書に提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）と同じ供給源（例えば被験体の末梢血）に由来する。
いくつかの実施形態において、癌は、上述のような固形腫瘍、又は血液学的悪性疾患である。
いくつかの実施形態において、癌を有する被験体は、上述のような癌療法（例えば免疫療法）に対して反応性が劣っている。
併用療法
別の態様において、本開示は、本明細書に提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）と第二の作用物質とを用いた併用療法を提供する。
或る特定の実施形態において、第二の作用物質は、上述のような改変免疫細胞、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞の集団である。或る特定の実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、本明細書に提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）と同じ供給源（例えば被験体の末梢血）に由来する。或る特定の実施形態において、併用療法において提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）及びＣＡＲ－Ｔ細胞の比は、約１：１～１：１０の範囲である。
或る特定の実施形態において、本明細書に提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）及びＣＡＲ－Ｔ細胞は、同じ医薬組成物中にある。或る特定の実施形態において、本明細書に提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）及びＣＡＲ－Ｔ細胞は、２つの別個の医薬組成物中にある。或る特定の実施形態において、本明細書に提供される操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与前、投与と同時又は投与後に、治療の必要がある被験体に投与される。
或る特定の実施形態において、第二の作用物質は、免疫抑制経路を阻害する作用物質であり、これには、限定されるわけではないが、ＴＧＦ－β、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、アデノシン、ＶＥＧＦ、インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ２（ＩＤＯ２）、トリプトファン２－３－ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）、乳酸塩、低酸素、アルギナーゼ、及びプロスタグランジンＥ２の阻害剤が含まれる。第二の作用物質はまた、Ｔ細胞チェックポイント阻害剤であってもよく、これには、限定されるわけではないが、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えばイピリムマブ）、抗ＰＤ１抗体（例えばニボルマブ、ペムブロリズマブ、セミプリマブ）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えばアテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ）、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、及び抗ＫＩＲ抗体が含まれる。
或る特定の実施形態において、第二の作用物質はＴ細胞アゴニストであり、これには限定されるわけではないが、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ－４０、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、及びＨＶＥＭを刺激する抗体が含まれる。或る特定の実施形態において、第二の作用物質は療法性腫瘍溶解性ウイルスであり、これには、限定されるわけではないが、ラブドウイルス、レトロウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、レオウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びポックスウイルスが含まれる。
或る特定の実施形態において、第二の作用物質は、免疫刺激剤、例えばｔｏｌｌ様受容体アゴニストであり、これには、限定されるわけではないが、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９アゴニストが含まれる。或る特定の実施形態において、第二の作用物質は、インターフェロン遺伝子刺激剤（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト、例えば環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）である。
或る特定の実施形態において、限定されるわけではないが、樹状細胞又はＴ細胞増殖及び持続性を増進させ、限定されるわけではないが、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５又はその類似体を含む、サイトカインでの処理、又はＣＡＲ－ＤＣ内部からのこうしたサイトカインの発現を含む、任意の数の適切な治療方式と組み合わせて、例えばこうした治療の前、こうした治療と同時、又はこうした治療後に、治療が必要な被験体に、本明細書に提供されるＣＡＲ－ＤＣ又はＣＡＲ－ＤＣ集団を投与する。
いくつかの実施形態において、治療法は、操作細胞の投与と関連する副作用を減少させるか又は軽減する作用物質を投与することを更に含む。例示的な副作用としては、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、及び血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）とも称される）が挙げられる。或る特定の実施形態において、副作用を治療するために投与する作用物質は、可溶性因子、例えばＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＩＬ－２及びＩＬ－６を中和する作用物質を含む。例示的な作用物質としては、限定なしに、ＴＮＦ－αの阻害剤（例えばエタネルセプト）及びＩＬ－６の阻害剤（例えばトシリズマブ）が挙げられる。
本開示は、特定の実施形態（このうちいくつかは好ましい実施形態である）に関連して特に示され記載されてきたが、当業者には、本明細書に開示されるような本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、型及び詳細に多様な変化を行ってもよいことが理解されるはずである。
実施例１
ＤＣを特異的に活性化するＣＡＲの生成
Ｔ細胞及びＤＣを活性化する際に関与する経路が別個であるため、本発明者らは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の典型的なＣＡＲ分子は、ＤＣを活性化することができないと推測した（図１Ａ、図８Ａ及び図８Ｂ）。したがって、本発明者らは、ＴＬＲ４、ＴＮＦＲ２、デクチン－１及びＦｃγＲ等のＤＣ活性化経路を取り込む新規ＣＡＲを評価した。本発明者らはまず、サイトカインカクテルで機能性ＤＣに分化可能であるヒト単球性白血病細胞株であるＴＨＰ－１細胞由来のＤＣ（C. Berges et al., A cell line model for the differentiation of human dendritic cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333, 896-907 (2005)）において、抗ヒトＣＤ１９ ｓｃＦｖ並びにＴＬＲ４、ＴＮＦＲ２、デクチン－１、及びＦｃγＲの細胞内活性化ドメインからなるＣＡＲ構造を試験した。ＴＬＲ４又はＴＮＦＲ２テールを持つＣＡＲはＤＣを効率的に活性化することができず、ＴＬＲ４又はＴＮＦＲテールのみによって与えられる刺激シグナルは、ＤＣ活性化には十分でないことが示された（図８Ａ及び図８Ｂ）。ＴＨＰ－１細胞における、デクチン１及びＦｃＲγの細胞質テールのタンデム融合を含む抗ヒトＣＤ１９ ｓｃＦｖからなるＣＡＲの発現は、ＣＡＲＤＦ－ＤＣと示される、ＤＣへの分化に影響を及ぼさなかった（図１Ｂ及び図１Ｃ）。ＣＡＲＤＦ－ＤＣ及び対照ＴＨＰ－１由来ＤＣをＨ４６０－ＣＤ１９に曝露すると（図１Ｆ）、ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、対照ＤＣと比較して、より高いレベルの共刺激分子（ＣＤ８０及びＣＤ８６）を発現した（図１Ｄ）。さらに、ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、対照ＤＣよりも、同種Ｔ細胞のよりロバストな増殖を誘導可能であった（図１Ｅ）。ＣＡＲＤＦ－ＤＣが、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を活性化可能であるかどうかを調べるため、第二世代抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＣＡＲＤＦ－ＤＣ又は対照ＤＣの存在下で、Ｈ４６０－ＣＤ１９腫瘍細胞と培養した（図１Ａ及び図１Ｇ）。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、対照ＤＣよりもＣＡＲＤＦ－ＤＣの存在下で、ＣＤ１９＋ Ｈ４６０腫瘍細胞に対するより高い細胞傷害性を与えた（図１Ｈ）。さらに、ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、対照ＤＣと比較した際、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるより高い発現レベルのＩＦＮ－γ、及び腫瘍細胞による乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を誘導した（図１Ｉ及び図１Ｊ）。これらのデータは、ＣＡＲＤＦがＤＣの活性を増進させて、ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化し得ることを示す。
実施例２
ＣＡＲＤＦは、正常末梢単球由来のＤＣを活性化し得る
ＴＨＰ－１細胞由来のＤＣにおけるＣＡＲＤＦの知見を確認するため、本発明者らは、臨床適用のためのＤＣの一般的な供給源である末梢単球由来の正常ＤＣ（Ｍｏ－ＤＣ）に対するＣＡＲＤＦ発現の影響を調べた（J. Constantino et al., Antitumor dendritic cell-based vaccines: lessons from 20 years of clinical trials and future perspectives. Transl. Res. 168, 74-95 (2016)）。健康なドナーのＰＢＭＣから精製した単球を、ＣＡＲＤＦを発現するレンチウイルスで形質導入し、ＤＣに分化するよう誘導した（図２Ａ）。ＣＡＲＤＦの発現は、Ｍｏ－ＤＣの分化及び成熟に影響を及ぼさず、ＤＣマーカーであるＣＤ１１Ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＡＢＣ、及びＨＬＡ－ＤＲは対照ＤＣと匹敵する表面発現レベルであった（図２Ｂ）。非操作固形腫瘍に特異的でない抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＡＲを用いる代わりに、本発明者らは、固形腫瘍の多くのタイプによって高発現されるＥｐｈＡ２に関する抗体ｓｃＦｖを用いた（図９Ａ）（J. Wykosky et al., The EphA2 receptor and ephrinA1 ligand in solid tumors: function and therapeutic targeting. Mol. Cancer Res. 6, 1795-1806 (2008)、J. M. Brannan et al., EphA2 in the early pathogenesis and progression of non-small cell lung cancer. Cancer Prev. Res. 2, 1039-1049 (2009)、V. M. Youngblood et al., The Ephrin-A1/EPHA2 Signaling Axis Regulates Glutamine Metabolism in HER2-Positive Breast Cancer. Cancer Res. 76, 1825-1836 (2016)、M. Tandon et al., Emerging strategies for EphA2 receptor targeting for cancer therapeutics. Expert Opin Ther Targets. 15, 31-51 (2011)）。抗ＥｐｈＡ２ ＣＡＲＤＦ－ＤＣがＣＤ３＋ Ｔ細胞の拡大を増進し得るかどうかを評価するため、本発明者らは、ＣＦＳＦ標識Ｔ細胞を、ＥｐｈＡ２を発現するヒト肺癌Ａ５４９細胞に４８時間あらかじめ曝露されているＣＡＲＤＦ Ｍｏ－ＤＣ又は対照Ｍｏ－ＤＣと培養した。ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、対照Ｍｏ－ＤＣよりもよりロバストにＴ細胞増殖を誘導可能であった（図２Ｃ）。要約すると、本発明者らの知見は、ＣＡＲＤＦが、腫瘍抗原の刺激に反応して、Ｍｏ－ＤＣを活性化可能であることを示す。
エフェクターＴ細胞を抑制し、腫瘍増殖を促進するため、以前の知見は、ＴＩＭＥ内の免疫抑制性ＴＩＤＣが固形腫瘍表面上のＰＤ－Ｌ１及びＣＴＬＡ４の発現によって誘導され得ることを示している（非特許文献４、C. Fu et al., Dendritic Cells and CD8 T Cell Immunity in Tumor Microenvironment. Front Immunol. 9, 3059 (2018)、C. Pfirschke et al., Tumor Microenvironment: No Effector T Cells without Dendritic Cells. Cancer cell 31, 614-615 (2017)、R. A. Belderbos et al., Enhancing Dendritic Cell Therapy in Solid Tumors with Immunomodulating Conventional Treatment. Mol. Ther. Oncolytics 13, 67-81 (2019)）。ＣＴＬＡ４－Ｉｇ及びＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞に反応したＭｏ－ＤＣの活性化状態を評価するため、本発明者らは、以前に記載されるように、ＨＰＲＴ遺伝子座内に発現カセットをノックインすることによって、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ及びＰＤ－Ｌ１を過剰発現するヒト肺癌細胞Ａ５４９（Ａ５４９－ＣＰ）を構築した（Rong Z et al., An Effective Approach to Prevent Immune Rejection of Human ESC-Derived Allografts. Cell Stem Cell 14, 121-130 (2014)）。対照Ａ５４９細胞と比較して、ＣＰの発現は、Ａ５４９－ＣＰ腫瘍細胞においてはるかに高かった（図２Ｄ）。ＣＡＲＤＦ－ＤＣ又は対照Ｍｏ－ＤＣをＡ５４９－ＣＰ細胞と４８時間共培養した際、ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、対照Ｍｏ－ＤＣよりもはるかにより高いレベルのＣＤ８０、ＨＬＡ－ＡＢＣ及びＨＬＡ－ＤＲを発現した（図２Ｅ）。ＣＡＲＤＦ－ＤＣ及び対照Ｍｏ－ＤＣをＡ５４９－ＣＰに４８時間あらかじめ曝露した際、ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、対照Ｍｏ－ＤＣよりもよりロバストにＴ細胞を活性化可能であった（図２Ｆ）。したがって、ＣＡＲＤＦは、腫瘍細胞誘導性免疫抑制に抵抗するようにＤＣを活性化して、Ｔ細胞を有効に活性化し得る。
実施例３
ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を活性化する
本発明者らのＣＡＲＤＦ－ＤＣが、腫瘍細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を増加させるかどうかを調べるため、本発明者らは、Ｍｏ－ＤＣと同じドナー由来のＴ細胞を用いて、抗ＥｐｈＡ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生した。ＣＡＲ－Ｔ細胞表面上のＣＡＲ、並びにＡ５４９及びＡ５４９－ＣＰ腫瘍細胞表面上のＥｐｈＡ２の発現を確認した（図３Ａ及び図３Ｂ、図９Ｂ）。対照Ｍｏ－ＤＣ又はＣＡＲＤＦ－ＤＣによって活性化されるＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害活性を調べるため、Ａ５４９及びＡ５４９－ＣＰ細胞をＣＡＲ－Ｔ細胞及びＤＣと共培養した。対照Ｍｏ－ＤＣと比較した際、ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、Ａ５４９細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害活性を有意に増加させた（図３Ｃ）。Ａ５４９－ＣＰ細胞に向かうＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解活性は、Ａ５４９細胞のものと比較した際、減少しており、ＣＰの発現がＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解活性を抑制したことが示された。対照的に、腫瘍細胞におけるＣＰの発現による、ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解活性の阻害は、ＣＡＲＤＦ－ＤＣによって逆転された（図３Ｃ）。この知見と一致して、対照Ｍｏ－ＤＣと比較した際、ＣＡＲＤＦ－ＤＣ及びＣＡＲ－Ｔ細胞の共培養は、ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＩＬ－２、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの発現を増加させ（図３Ｄ）、ＩＦＮ－γ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の割合並びに上清中のＩＦＮ－γ及びＬＤＨのレベルを増加させた（図３Ｅ～図３Ｇ）。したがって、ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、ＣＰ媒介性免疫抑制に抵抗して、ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解活性を活性化し得る。
実施例４
ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、ｉｎ ｖｉｖｏで、ＴＩＭＥに抵抗し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を活性化する
ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＡＲ－Ｔ細胞に対するＣＡＲＤＦ－ＤＣの影響を調べるため、本発明者らは、それぞれ、Ａ５４９－ＷＴ及びＡ５４９－ＣＰ腫瘍細胞を、免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ－２γ－／－（ＮＳＧ）マウスに皮下注射した。腫瘍が触診可能なサイズに到達したら、１×１０７のＣＡＲ－Ｔ細胞及び５×１０６の対照Ｍｏ－ＤＣ又はＣＡＲＤＦ－ＤＣを、それぞれ、静脈内注入した（図４Ａ）。Ａ５４９腫瘍とは対照的に、Ａ５４９－ＣＰ腫瘍は、臨床的に適切なＴＩＭＥを発展させた（図４Ｂ）。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＴＩＭＥを伴う固形腫瘍において、迅速に疲弊するという以前の知見（J. L.-M. Chen et al., NR4A transcription factors limit CAR T cell function in solid tumours. Nature 567, 530-534 (2019)、J. Li et al., Chimeric antigen receptor T cell (CAR-T) immunotherapy for solid tumors: lessons learned and strategies for moving forward. J Hematol Oncol. 11, 22 (2018)）と一致して、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ａ５４９－ＷＴ腫瘍を有効に除去したが、Ａ５４９－ＣＰ腫瘍を除去しなかった（図４Ｃ）。ＣＡＲＤＦ－ＤＣと組み合わされたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療のみと比較して、Ａ５４９－ＣＰ腫瘍負荷を効率的に減少させた（図４Ｃ及び図４Ｄ）。さらに、ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、ｉｎ ｖｉｖｏで、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を含むＴ細胞の生存を有意に延長させ、ＤＣ自体の生存及び活性化を促進した（図４Ｅ及び図４Ｆ）。さらに、本発明者らはまた、ＣＡＲＤＦ－ＤＣ治療群の腫瘍において、ＣＤ１１Ｃ及びＣＤ８０のより高い発現レベルを検出し（図４Ｅ）、ＣＡＲＤＦ－ＤＣが、対照Ｍｏ－ＤＣよりも、ＣＰ過剰発現腫瘍においてよりよく浸潤するか又はより長く生存し得ることが示唆された。要約すると、これらのデータは、ＣＡＲＤＦ－ＤＣがＴＩＭＥに抵抗して、ＣＡＲ－Ｔ細胞の生存及び活性を促進し、固形腫瘍を抑制することを示唆する。
実施例５
ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、ＴＩＭＥを逆転させて、ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化し、Ｈｕ－マウスにおいて固形腫瘍を除去する
免疫系と腫瘍との間の相互作用は、ＴＩＭＥの形成において重要な役割を果たす（M. Binnewies et al., Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nat Med. 24, 541-550 (2018)）。したがって、本発明者らは、以前に記載されるような、免疫系ヒト化マウスにおいて、ヒト固形腫瘍が臨床的に適切なＴＩＭＥを発展させるＨｕＳモデルを使用して（Q. Li, et al., Developing Covalent Protein Drugs via Proximity-Enabled Reactive Therapeutics. Cell 182, 85-97.e16 (2020)）、固形腫瘍のＴＩＭＥを逆転させる際のＣＡＲＤＦ－ＤＣの活性を更に評価した（図５Ａ）。ＣＡＲＤＦ－ＤＣ及びＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＨｕＳモデルを確立するため、ヒト肺腫瘍を接種するためにも用いた同じドナーの組織で確立されたＨｕ－マウスの骨髄細胞及びＴ細胞由来であった。したがって、ＨｕＳマウスにおけるＣＡＲＤＦ－ＤＣ、ＣＡＲ－Ｔ細胞及び免疫系は、全て同じドナー由来であった。予期されるように、対照Ｍｏ－ＤＣを伴う又は伴わないＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＨｕＳマウスにおいて形成される臨床的に適切なＴＩＭＥを発展させたヒト肺腫瘍を抑制することができなかった（図５Ｂ～図５Ｅ）。対照的に、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＡＲＤＦ－ＤＣと組み合わせると、Ｈｕ－マウスの同じバッチにおいて形成されるヒト肺腫瘍の成長が効率的に抑制された（図５Ｃ～図５Ｅ）。したがって、ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、臨床的に適切なＴＩＭＥに抵抗して、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を活性化可能であった。
ＣＡＲＤＦ－ＤＣが、Ｔ細胞を活性化するため、固形腫瘍のＴＩＭＥを炎症促進状態に向かって変換可能であるという仮説を試験するため、本発明者らは、末梢及び腫瘍において、Ｔ細胞の活性化状態を調べた。ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、脾臓においてＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の割合を増加させ（図６Ａ）、脾臓Ｔ細胞における阻害性表面受容体ＰＤ－１及びＴＩＭ－３の発現を減少させた（図６Ｂ及び図６Ｅ）。さらに、ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、脾臓ＤＣにおいて、ＤＣ活性化マーカーＣＤ８６及びＭＨＣ－ＩＩの発現を増加させた（図６Ｃ）。したがって、ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、全身免疫系を活性化するようであった。ＣＡＲＤＦ－ＤＣが固形腫瘍のＴＩＭＥを炎症促進状態に向けて変換可能であるという知見の裏付けとして、ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＣＤ８６、ＩＬ－１２Ｂの腫瘍内発現を増加させ（図６Ｄ）、免疫チェックポイント分子ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＴＧＦ－β（図６Ｆ）及びＭ２マクロファージマーカーＣＤ２０６、ＣＤ１６３（図６Ｇ）の発現を減少させた。これらのデータは、ＣＡＲＤＦ－ＤＣが、ＴＩＭＥを炎症促進状態に向けて逆転させ、固形腫瘍に対する免疫を活性化し得ることを示す。
実施例６
ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、異なるＴＩＭＥにおいて、均一なＴ細胞活性化活性を有する
固形腫瘍は、ＴＩＭＥの背景において不均一性である（V. Thorsson et al., The Immune Landscape of Cancer. Immunity 48, 812-830 e814 (2018)）。ＣＡＲＤＦ－ＤＣが、異なる固形腫瘍のＴＩＭＥを炎症促進状態に向けて逆転し得るという仮説を試験するため、本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１をより高いレベルで発現し、同様にＨｕ－マウスにおいて臨床的に適切なＴＩＭＥを形成する別のヒト肺癌細胞株Ｈ４６０を使用した（図７Ａ及び図７Ｂ）。この腫瘍細胞は、ＥｐｈＡ２を発現することが確認された（図７Ｃ）。Ｈｕ－マウスにおいて、Ａ５４９によって形成される肺腫瘍における知見と一致して、ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を効率的にレスキューし、ＨｕＳ－マウスにおいてＨ４６０細胞によって形成される固形腫瘍を抑制した（図７Ｄ～図７Ｆ）。ＣＡＲＤＦ－ＤＣは、対照ＤＣよりも、Ｈ４６０腫瘍により効率的に浸潤するか又は距離長く生存可能であった（図７Ｇ）。したがって、これらのデータは、ＣＡＲＤＦ－ＤＣの、固形腫瘍の不均一なＴＩＭＥにおいて免疫抑制を逆転させる、均一なＴ細胞活性化能を明らかにした。
実施例７
考察
血液悪性疾患を治療するＣＡＲ－Ｔ細胞療法の傑出した有効性にもかかわらず、固形腫瘍の免疫療法は、免疫抑制性微小環境（ＴＩＭＥ）が存在するため、困難なままである。したがって、固形腫瘍の免疫療法の有効性を改善するため、ＴＩＭＥを破壊する戦略を発展させることが非常に重要である。免疫抑制性ＴＩＤＣが、細胞傷害性Ｔ細胞機能を抑制し、免疫抑制性制御Ｔ細胞を促進することによって、ＴＩＭＥ確立に重要な役割を果たすことは十分に確立されている（非特許文献４）。この目的を達成するため、本発明者らは、ＤＣが腫瘍細胞を特異的に標的化し、ＴＩＭＥと遭遇した後も活性化されたままであることを可能にする、ＣＡＲ－ＤＣ戦略を発展させた。この背景において、本発明者らは、Ｔ細胞の標準ＣＡＲが、ＤＣがＴＩＭＥと遭遇した後、ＤＣを活性化することができないことを示す。ＤＣを特異的に活性化するため、本発明者らは、多様なＤＣ活性化ドメインで構成される細胞内ドメインを持つＤＣ活性化ＣＡＲ分子を設計した。多様な組み合わせのＤＣ活性化ドメインを持つＣＡＲを試験した後、本発明者らは、デクチン１及びＦｃＲγの細胞質テールのタンデム連結が、ＴＩＭＥと遭遇した後のＤＣを有効に活性化し得ることを発見した。
腫瘍免疫療法研究に関する重要なボトルネックの１つは、免疫療法の有効性を評価する臨床的に適切なｉｎ ｖｉｖｏモデルがないことである（P. S. Hegde et al., Top 10 Challenges in Cancer Immunotherapy. Immunity 52, 17-35 (2020)）。例えば、免疫不全マウスにおいて確立された固形腫瘍は、ＴＩＭＥを発展させることができず、このモデルにおいて、ＣＡＲ－Ｔ細胞による固形腫瘍の効率的な除去を可能にする。このボトルネックを解決するため、本発明者らは、臨床的に適切なＴＩＭＥを伴うヒト固形腫瘍を生じる２つのヒト化マウスモデルを開発した。第一に、免疫不全マウスにおけるＣＴＬＡ４－Ｉｇ／ＰＤ－Ｌ１過剰発現ヒト腫瘍細胞による固形腫瘍の形成は、免疫抑制性微小環境を発展させた。第二に、固形腫瘍のＴＩＭＥの不均一性を反復するため、免疫系ヒト化マウスにおけるヒト腫瘍細胞による固形腫瘍の形成は、臨床的に適切なＴＩＭＥを発展させた。これらのモデルを用いて、本発明者らは、ヒトＣＡＲ－ＤＣが、ＣＡＲ－Ｔ細胞を促進して、臨床的に適切なＴＩＭＥを宿する固形腫瘍を抑制することを立証する。この背景において、これは、ＣＡＲ－ＤＣが、ＴＩＭＥを炎症促進状態に逆転させて、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を活性化して、固形腫瘍を抑制可能であることを示す最初の報告である。
固形腫瘍の不均一性を考慮すると、ＣＡＲ－ＤＣが、多様なタイプのヒト固形腫瘍のＴＩＭＥを逆転させ得るかどうかを調べることが重要であろう。さらに、この戦略の１つの潜在的な限界は、複数回の化学療法又は放射線療法後、癌患者に、十分で健康なＤＣが残っていない可能性があることである。この問題は、患者の人工多能性幹細胞から機能性ＤＣを得る、近年の進歩によって軽減され得る（D. Todorova et al., hESC-derived immune suppressive dendritic cells induce immune tolerance of parental hESC-derived allografts. EBioMedicine 62, 103120 (2020)、S. Senju et al., Generation of dendritic cells and macrophages from human induced pluripotent stem cells aiming at cell therapy. Gene Ther. 18, 874-883 (2011)、S. Sontag et al., Modelling IRF8 Deficient Human Hematopoiesis and Dendritic Cell Development with Engineered iPS Cells. Stem cells 35, 898-908 (2017)）。ＣＡＲ－ＤＣが、免疫抑制性ＴＩＭＥを炎症促進状態に逆転させる能力に基づいて、ＣＡＲ－ＤＣと他の免疫療法との組み合わせを試験して、悪性固形腫瘍を治療することに関心が持たれるであろう。例えば、ＣＡＲ－ＤＣは、固形腫瘍のごく一部にしか有効でない、ナチュラルキラー細胞及び免疫チェックポイント阻害剤、例えば抗ＰＤ１抗体の抗腫瘍活性を促進し得る（T. Walzer et al., Natural-killer cells and dendritic cells: "l'union fait la force". Blood 106, 2252-2258 (2005)、E. Mamessier et al., Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J. Clin. Invest. 121, 3609-3622 (2011)、K. Foley et al., Current progress in immunotherapy for pancreatic cancer. Cancer lett. 381, 244-251 (2016)、J. S. O'Donnell et al., Resistance to PD1/PDL1 checkpoint inhibition. Cancer Treat. Rev. 52, 71-81 (2017)67-70）。本明細書で用いられる臨床的に適切なＴＩＭＥを伴う新規ヒト化固形腫瘍モデルは、これらの併用免疫療法の有効性を評価するための理想的なプラットフォームを提供するであろう。要約すると、ＣＡＲ－ＤＣアプローチは、悪性固形腫瘍の免疫療法の転帰を決定づけるＴＩＭＥを克服する、有望で潜在的に普遍的な戦略に相当する。
実施例８
材料及び方法
研究設計
示される結果は、標準偏差を伴う平均値である。独立実験反復の数を、図の凡例に示す。腫瘍増殖のｉｎ ｖｉｖｏ実験に関しては、治療、並びに測定、例えば腫瘍重量及び体積測定、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイ、フローサイトメトリー分析、又はＥＬＩＳＡ測定前に、動物を盲検的に治療群に分けた。一次データをデータファイルＳ１に含める。
動物研究
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ－２γ－／－（ＮＳＧ）マウスを、Nanjing Model biology Companyより購入した。この研究で使用されるＮＳＧマウス及びＨｕ－マウスを、病原体不含隔離動物施設中で維持した。全ての動物研究は、施設動物飼育及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって認可された。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含有するレンチウイルスベクターの構築
第二世代ＣＡＲ抗ＣＤ１９及び抗ＥｐｈＡ２の構造は、ＣＤ８リーダー配列及びｓｃＦｖ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ細胞内ドメインで構成される。ＤＣ ＣＡＲを生成するため、ＴＬＲ４（ＮＭ＿１３８５５４．５）、ＴＮＦＲ２（ＮＭ＿００１０６６．３）並びにデクチン１（ＮＭ＿１９７９４７）、ＦｃＲγ（ＮＭ＿００４１０６）の細胞質内配列を増幅して、第二世代ＣＡＲ内の４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ細胞内ドメインの領域を置換した。全ての配列を最適化し、IGene company（広州）によって合成した。次いで、Ｃａｓ９領域を置換することによって、発現カセットをレンチ－Ｃａｓ９ベクター（Addgene）内にクローニングした。
初代細胞及び細胞株培養
ＰＢＭＣ（LDEBIOカタログ番号１５０１）から単離した単球より、ＤＣを生成した。簡潔には、単球を、抗ＣＤ１４マイクロビーズ（Miltenyi Biotechカタログ番号１３０－０５０－２０１）及びａｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏ分離装置によって単離した。次いで、単球を、１０％ＦＢＳ（Gibco）、１００単位／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Corning）中、ＧＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、PeproTechカタログ番号３００－０３）及びＩＬ－４（１００ｎｇ／ｍｌ、PeproTechカタログ番号２００－０４）と５日間～６日間培養して、未成熟ＤＣを生成した。サイトカインを２日～３日ごとに補充した。ＤＣの成熟をＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ、PeproTechカタログ番号３００－０１Ａ）及びＬＰＳ（３μｇ／ｍｌ、Sigma-Aldrichカタログ番号Ｌ４３９１）で２４時間行った。
初代Ｔ細胞を、末梢血単核細胞から抗ＣＤ３マイクロビーズ（Miltenyi Biotechカタログ番号１３０－０５０－１０１）によって単離し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Thermo Fisher Scientific）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、２－メルカプトエタノール（２５μＭ、Gibco）及び１００Ｕ／ｍｌヒトＩＬ－２（PeproTechカタログ番号ＡＦ－２００－０２－５００）を補ったＲＰＭＩ１６４０中で維持した。
Ａ５４９（カタログ番号ＡＴＣＣ（商標）ＣＣＬ－１８５（商標））及びＨ４６０（カタログ番号ＡＴＣＣ（商標）ＨＴＢ－１７７（商標））をATCC（バージニア州マナッサス）より購入した。本発明者らが以前に記載した（６０）ように、Ａ５４９－ＣＰ構築を行った。レンチウイルスを用いて、Ｈ４６０表面上にヒトＣＤ１９を過剰発現させることによって、Ｈ４６０－ＣＤ１９を構築した。ＴＨＰ－１細胞株（カタログ番号ＡＴＣＣ（商標）ＴＩＢ－２０２（商標））は、慢性骨髄性白血病患者から樹立された白血病細胞株である。上記細胞を全て、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、及び２５μＭ ２－メルカプトエタノールを補ったＲＰＭＩ１６４０中で培養した。２９３ＦＴ細胞（Thermo scientificカタログ番号Ｒ７０００７）を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補ったダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Thermo Fisher Scientific）中で培養した。細胞が完全集密に到達した際、適切な比率で、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Thermo Fisher Scientific）を用いて、上記細胞株を継代した。全ての細胞を、５％ＣＯ２を含む暗所加湿３７℃インキュベーター中でインキュベートした。
Ｍｏ－ＤＣの形質導入
ヒト単球を、形質導入前に、２４ウェル超低付着組織培養プレートに、１ウェル当たり２～５×１０５細胞／４００μＬ分化培地（１００ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ及び１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４を補充したＲＰＭＩ１６４０完全培地）の密度で移した。レンチウイルス量をｑＰＣＲレンチウイルス力価決定（力価）キット（ABMカタログ番号ＬＶ９００－ｉＣ）によって計算した。力価決定されたレンチウイルスストックを３７℃で融解することによって、ＭＯＩ １００を用いて、形質導入を行った。異なる培地中、適切な体積のウイルス濃縮物と、６μｇ／ｍｌ硫酸プロタミン（Sigma-Aldrichカタログ番号１５７８６１２－２）を混合して、１ウェル当たり５００μｌの総体積を達成した。３７℃で１２時間のインキュベーション後、更に５００μｌの分化培地を各ウェルに添加した。形質導入２４時間後、培地の大部分を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、分化培地中で更に培養した。５日目に、Ｍｏ－ＤＣを将来の共培養実験のために収集するか、又はＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ、PeproTech）及びＬＰＳ（３μｇ／ｍｌ、Sigma-Aldrich）によって２４時間～４８時間直接成熟させた。
ｉＰＳＣの形質導入
本開示の操作細胞（例えばＣＡＲ－ＤＣ）はまた、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に本明細書に提供されるウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター）をトランスフェクトして、安定なＣＡＲ発現細胞株（例えばＣＡＲＤＦ－ｈｉＰＳＣ）を調製することによって調製してもよい。ｈｉＰＳＣは、不死性に増殖して、多様な組織細胞に分化する能力を有し、疾患の細胞療法において大きな潜在能力を有する。本開示において好ましくは、ＯＰ９間質細胞栄養法（Nat Protoc. 2011 March; 6(3): 296-313. doi: 10.1038/nprot. 2010.184）が用いられて、ｈｉＰＳＣのＤＣへの分化が誘導される。本開示において、ｈｉＰＳＣ由来の分化細胞の最初の数は、好ましくは１×１０６～１．５×１０６であり、最初の培地は、好ましくは、２０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＭＥＭ－αの完全培地である。ＤＣ細胞分化の全プロセスは、好ましくは、約３１日～３８日を要する。本開示のＣＡＲＤＦ－ｈｉＰＳＣを大規模に分化に誘導して、均一なＣＡＲＤＦ－ＤＣを産生し得る。ｈｉＰＳＣ由来のＣＡＲＤＦ－ＤＣは、上述のように、ＴＩＭＥを破壊し、ＴＩＭＥを炎症状態に変換し、ＤＣを免疫抑制性腫瘍微小環境において活性化することを可能にする等の機能を有すると予期される。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
初代ＣＤ３＋ Ｔ細胞をＰＢＭＣから単離し、製造者の指示に従って、ヒトＴ細胞活性化キットで活性化した。簡潔には、１２ウェルプレートを３μｇ／ｍＬ ＰＢＳ希釈抗ＣＤ３抗体（BDカタログ番号５５５３２９、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３９５７３６）で４℃にて一晩コーティングし、翌日、プレートをＰＢＳで２回洗浄し、次いで、Ｔ細胞を融解し、Ｔ細胞培地中、１μｇ／ｍＬ抗ＣＤ２８抗体（BDカタログ番号５５５７２５、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３９６０６８）とともにプレート内に移した。活性化は２日間続き、３日目、活性化Ｔ細胞を採取し、示すＴ－ＣＡＲ構築物を発現するレンチウイルスに感染させた。簡潔には、形質導入前に、Ｔ細胞を１ウェル当たり５×１０５細胞／４００μＬ Ｔ細胞培地の密度で２４ウェル組織培養プレートに移した。力価決定されたウイルスストックを３７℃で融解することによって、ＭＯＩ １０を用いて、形質導入を行った。適切な体積のウイルス濃縮物を１０μｇ／ｍｌポリブレン（Sigma-Aldrichカタログ番号ＴＲ－１００３－Ｇ）と培地中で混合して、１ウェル当たり５００μｌの総体積を達成した。３７℃で１２時間のインキュベーション後、更に５００μｌの培地を各ウェルに添加した。形質導入２４時間後、細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、Ｔ細胞培地中に再懸濁し、増殖のため、培養を続けた。殺細胞アッセイ日（活性化のほぼ１０日後）、細胞を収集し、フローサイトメトリーによって分析し、血球計数器を用いて、細胞カウントを得た。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞増殖アッセイ
初代ＣＤ３＋ Ｔ細胞を、製造者の指示に従って、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ－ＣＦＳＥ（Life Technologiesカタログ番号６５－０８５０－８４）で染色した。実験において、ＤＣを癌標的（Ｈ４６０－ＣＤ１９細胞、Ａ５４９細胞又はＡ５４９－ＣＰ細胞）と、１：１比、４８ウェルプレート中で、４８時間プレインキュベートし、次いで、初代Ｔ細胞（ＤＣ：Ｔ細胞＝１：５）を共培養に添加した。他の実験において、ＤＣ及びＴ細胞を同時に癌標的とインキュベートした（第０日）。特に示さない限り、標的：ＤＣ：Ｔ細胞＝１：１：５の比を各細胞共培養条件で行った。生存ＣＤ３＋ Ｔ細胞をゲート処理することによって、フローサイトメトリーを用いて増殖を分析した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＣ及び腫瘍細胞共培養アッセイ
１×１０６のＨ４６０－ＣＤ１９細胞、Ａ５４９細胞又はＡ５４９－ＣＰ細胞を、ＴＨＰ－１又は単球由来の１×１０６の偽ＤＣ又はＣＡＲ－ＤＣと、６ウェルプレート中、共培養し、共培養の４８時間後、細胞を０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡで３７℃にて５分間処理し、ＰＢＳで洗浄し、次いで細胞を直接、蛍光色素コンジュゲート化抗体ＣＤ１１Ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＨＬＡ－ＤＲで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ殺細胞アッセイ
ＣＤ１９標的
およそ１×１０４のＨ４６０細胞及び１×１０４のＨ４６０－ＣＤ１９細胞（標的細胞）を、４８ウェルプレートの各ウェル中、２００μｌ ＲＰＭＩ１６４０完全培地中でプレーティングし、１００μｌ ＲＰＭＩ１６４０培地中の２×１０４のＷＴ－ＤＣ又はＣＡＲＤＦ－ＤＣ（刺激細胞）を対応するウェルに添加し、１００μｌ ＲＰＭＩ１６４０培地中の１０５のＣＡＲ－Ｔ細胞（エフェクター細胞）を対応するウェルに添加した。続けて、足りないウェルには、４００μｌまで培地を補った。２４時間インキュベートした後、残った細胞をフローサイトメトリーのために収集し、培養上清を続くアッセイのために収集した。各ウェルに関して、特異的細胞溶解パーセントを以下のように計算した。特異的溶解％＝（％ＣＤ１９（腫瘍細胞のみ）－％ＣＤ１９（殺細胞群））／ＣＤ１９％（腫瘍細胞のみ）×１００％。
ＥｐｈＡ２標的
およそ２×１０４のＡ５４９細胞又は２×１０４のＡ５４９－ＣＰ細胞（標的細胞）を、４８ウェルプレートの各ウェル中、２００μｌ ＲＰＭＩ１６４０完全培地中でプレーティングし、１００μｌ ＲＰＭＩ１６４０培地中の２×１０４の偽ＤＣ又はＣＡＲ－ＤＣ（刺激細胞）を対応するウェルに添加し、１００μｌ ＲＰＭＩ１６４０培地中の１×１０５のＣＡＲ－Ｔ細胞（エフェクター細胞）を対応するウェルに添加した。続けて、足りないウェルには、４００μｌまで培地を補った。１２時間、２４時間、インキュベートした後、残った細胞をフローサイトメトリーのために収集し、培養上清を続くアッセイのために収集した。
ＩＦＮ－γ染色
Ａ５４９－ＣＰ腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ殺細胞アッセイ後、残った細胞を収集し、製造者の指示に従って、細胞内染色キット（BD Biosciences）を用いて染色した。簡潔には、２００μｌ固定／透過処理緩衝液で、氷上で２０分間、細胞を固定及び透過処理し、次いで１×洗浄緩衝液で２回洗浄した。細胞をＩＦＮ－γ－ＢＶ６５０、ＣＤ３－Ｖ４５０、ＣＤ８－ＰＥで、洗浄緩衝液中、４℃で３０分間染色し、次いで、１×洗浄緩衝液で２回洗浄した後、フローサイトメトリー分析した。
ＩＦＮ－γ及びＬＤＨアッセイ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ殺細胞アッセイからの培養上清を収集し、製造者の指示に従って、ＥＬＩＳＡキット（Invitrogenカタログ番号８８－７３１６－７６）によってサイトカインＩＦＮ－γレベルに関して試験し、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promegaカタログ番号Ｇ１７８０）によってＬＤＨレベルに関して試験した。上清を、予備実験に従って、１：５０又は１：１００に希釈した。
ＮＳＧマウス研究における腫瘍異種移植モデル
１００μｌのＰＢＳ中の１．５×１０６細胞を、６週齢ＮＳＧマウスの両脇腹内に皮下注射することによって、Ａ５４９ＷＴ腫瘍モデル及びＡ５４９－ＣＰ腫瘍モデルを生成した。実験において、Ｔ細胞及びＤＣを、５００μｌのＰＢＳ中、５×１０６のＤＣ及び１×１０７のＣＡＲ－Ｔ細胞の静脈内注射によって、腫瘍曝露５日後及び１４日後に注入した。ノギス測定によって腫瘍体積を決定し、以下の式を用いて計算した。体積（ｍｍ３）＝１／２×Ｄ×ｄ２、式中、Ｄはより長く、ｄはより短い腫瘍軸である。マウスを安楽死させ、全ての腫瘍を収集し、重量測定し、写真撮影した。加えて、マウス脾臓及び血液を収集し、分離し、単一細胞にプロセシングし、示す蛍光色素コンジュゲート化抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
Ｈｕ－マウス研究における腫瘍異種移植モデル
Ｈｕ－マウス生成の詳細な説明は、例えば、Rong Z et al., An Effective Approach to Prevent Immune Rejection of Human ESC-Derived Allografts. Cell Stem Cell 14, 121-130 (2014)に見られ得る。Ｈｕ－マウス由来ＤＣの生成は、公表されたプロトコルに従って、骨髄細胞から分化させた。簡潔には、Ｈｕ－マウスの大腿骨及び脛骨を、滅菌したハサミで取り除き、７０％アルコールに３分間浸し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、無菌シリンジ（２６ゲージ針）を用いて、骨髄細胞をフラッシングした。骨髄細胞を再懸濁し、７０μｍナイロンメッシュを通過させ、次いで赤血球をＬｙｓｅ緩衝液（BD Bioscience）で溶解した。残った細胞をＰＢＳで２回洗浄し、計数し、２０ｎｇ／ｍｌヒトＧＭ－ＣＳＦ及び５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－４を補充した完全ＲＰＭＩ－１６４０培地で、１×１０６細胞／ｍｌに調整した。３ｍｌの細胞懸濁物を６ウェルプレートの各ウェル内に移した。プレートを穏やかに回旋させ、培地の半分を吸引し、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４を含有する新鮮な培地を添加することによって、培地を２日ごとに交換した。培養９日後、細胞を収集し、洗浄し、抗ヒトＣＤ１１Ｃ抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＡＲＤＦ形質導入のため、形質導入前に、未成熟ＢＭ－ＤＣを、１ウェル当たり５０×１０５～１０×１０５細胞／ｍｌ分化培地（２０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ及び５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４を補充したＲＰＭＩ１６４０完全培地）の密度で、６ウェル組織培養プレートに移した。力価決定されたレンチウイルスストックを３７℃で融解することによって、ＭＯＩ １００を用いて、形質導入を行った。分化培地中、ウイルス濃縮物を６μｇ／ｍｌ硫酸プロタミンと混合した。３７℃で１２時間のインキュベーション後、更に１ｍｌの分化培地を各ウェルに添加した。形質導入２４時間後、培地の大部分を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、使用するまで分化培地中で更に培養した。
Ｈｕ－マウス由来のＴ細胞の生成を、脾臓細胞から単離した。簡潔には、Ｈｕ－マウスの脾臓を滅菌ピンセットで取り除き、氷冷ＰＢＳ中に３分間浸し、次いで、シリンジの底を用いて、７０μｍナイロンメッシュ表面上ですりつぶした。単一細胞を、メッシュを通じてフラッシングし、ＰＢＳで洗浄した。次いで、赤血球を溶解した。抗ヒトＣＤ３磁気マイクロビーズによって、Ｔ細胞を分離し、次いで、１００Ｕ／ｍｌヒトＩＬ－２を補ったＲＰＭＩ１６４０完全培地中に維持した。ＣＡＲ－Ｔ細胞を上述のように調製した。
Ｍａｔｒｉｇｅｌを補ったＰＢＳ １００μｌ中の１．５×１０６のＡ５４９細胞を、Ｈｕ－マウスの両脇腹内に皮下接種した。８日後、腫瘍担持Ｈｕ－マウスを、４つのコホートにランダムに分配した。実験において、４００μｌのＰＢＳ中の３×１０６のＤＣ及び１×１０７のＣＡＲ－Ｔ細胞の尾静脈内注射を通じて、ＤＣ及びＴ細胞を注入した。Ｍａｔｒｉｇｅｌを補ったＰＢＳ １００μｌ中の２×１０６のＨ４６０細胞を、Ｈｕ－マウスの両脇腹内に皮下接種した。１３日後、腫瘍担持Ｈｕ－マウスを、４つのコホートにランダムに分配した。実験において、４００μｌのＰＢＳ中の３×１０６のＤＣ及び１×１０７のＣＡＲ－Ｔ細胞の尾静脈内注射を通じて、ＤＣ及びＴ細胞を注入した。ノギス測定によって腫瘍体積を決定し、以下の式を用いて計算した。体積（ｍｍ３）＝１／２×Ｄ×ｄ２、式中、Ｄはより長く、ｄはより短い腫瘍軸である。マウスを安楽死させた際、腫瘍、脾臓、骨髄及び血液を分析のために収集した。
腫瘍組織消化及び染色
１匹のＨｕ－マウスに移植した、採取した対の腫瘍を混合し、パッチに切断し、組織消化酵素溶液（２０μＭ ＨＥＰＥＳ（GIBCO）を含む培地１９９（GIBCO）中、ＤＮアーゼＩ（STEM CELLカタログ番号０７９００）１００クニッツ単位、リベラーゼＴＭ ＴＭ（Sigmaカタログ番号ＬＩＢＴＭ－ＲＯ）８ウンシュ単位（８Ｕ／ｍＬ）及びリベラーゼＴＭ ＴＨ（Sigmaカタログ番号ＬＩＢＴＨ－ＲＯ）（８Ｕ／ｍＬ））を用いて解離させた。３７℃、１５０ｒｐｍで１．５時間振盪した後、１０％ＦＢＳを含有する５ｍＬ ＲＰＭＩ－１６４０を添加することによって、消化を停止した。続いて、４０μｍ細胞ストレーナー（Corning）を通じて懸濁物を濾過し、得た細胞をフローサイトメトリー分析のため、抗体染色に供した。
フローサイトメトリー分析
全てのフローサイトメトリー分析を、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（BD Biosciences）によって行った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tree Star、オハイオ州アシュランド）を用いて、フローデータを分析した。適切なサンプルゲート処理が詳細なデータ図に提供されている。蛍光色素コンジュゲート化抗体ＡＰＣ－ＣＤ４５、ＰＥ－ＣＤ１１Ｃ、ＦＩＴＣ－ＣＤ８０、ＢＶ６０５－ＣＤ８６、ＰＥ－ｃｙ７－ＣＤ８３、ＡＰＣ－ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＢＶ５１０－ＨＬＡ－ＤＲ、Ｖ４５０－ＣＤ３、ＰＥ－ｃｙ７－ＣＤ３、ＢＶ４２１－ＴＩＭ－３、ＰＥ－ＰＤ－１、ＰＥ－ＣＤ８、ＢＶ６５０－ＩＦＮγ、ＢＶ４２１－ＩＦＮγ、ＦＩＴＣ－ＰＤＬ１、Ｐｅｒｃｐ－ｃｙ５．５－ＣＤ１９、ＰＥ－ｃｙ５－ストレプトアビジン、ＡＰＣ－ストレプトアビジンをBD Sciencesから購入し、ＦＩＴＣ－ＴＩＭ－３をMiltenyi Biotechから購入し、ビオチン－プロテインＬをGenScriptから購入し、ＰＥ－ＥｐｈＡ２をBioLegendから購入した。樹状細胞染色アッセイのため、製造者の指示に従って、ＦｃＲブロッキング試薬（Miltenyi Biotech）を用いた。表面マーカー染色のため、細胞を遠沈し、製造者の指示に従って、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）中、希釈した抗体で、４℃で３０分間染色し、次いでＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリーによって直ちに分析した。プロテインＬ染色は、製造者の指示に従って、二次抗体染色を必要とした。抗体の詳細に関しては図１０Ａを参照されたい。
統計分析
Ｐｒｉｓｍ７（GraphPad Software）によって必要とされるように、ウェルチ補正を伴う独立両側ｔ検定、チューキーの多重比較検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ、二元配置ＡＮＯＶＡ後のチューキーの多重比較検定を含む、適切な統計比較を用いて統計分析を行った。データを平均±ＳＤとして示した。Ｐ≦０．０５を統計的に有意と見なした。
実施例９
補足材料
材料及び方法：
ＴＨＰ－１細胞形質導入及びＤＣへの分化
ＴＨＰ－１細胞を、形質導入前に、１ウェル当たり５×１０５細胞／４００μＬ ＲＰＭＩ１６４０完全培地の密度で２４ウェル組織培養プレートに移した。力価決定されたレンチウイルスストックを３７℃で融解することによって、ＭＯＩ １０を用いて、形質導入を行った。ＲＰＭＩ１６４０完全培地中、適切な体積のウイルス濃縮物を６μｇ／ｍｌ硫酸プロタミンと混合して、１ウェル当たり５００μｌの総体積を達成した。３７℃で１２時間のインキュベーション後、更に５００μｌの培地を各ウェルに添加した。形質導入２４時間後、培養培地の大部分を吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、更に培養した。３日目に、細胞を収集し、フローサイトメトリーによって、形質導入効率を分析した。
ＴＨＰ－１又はＣＡＲ＋ ＴＨＰ－１細胞を採取し、２×１０５細胞／ｍｌの密度でＲＰＭＩ１６４０完全培地中に再懸濁し、次いで、それぞれ３ｍｌの細胞懸濁物を６ウェルプレートの１つのウェルに移した。組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）及び組換えヒトＩＬ－４（１００ｎｇ／ｍｌ）を培養培地に含めて、ＤＣ分化を刺激した。２日又は３日ごとに、培養培地を新鮮なサイトカイン補充培地に交換した。サイトカイン存在下でのＤＣ分化は、更なる実験前に、少なくとも７日間～１０日間続いた。
レンチウイルス産生
レンチウイルスパッケージングのためのプラスミドＤＮＡを、製造者の指示に従って、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ ＥＦキット（Takara Bioカタログ番号７４０４２０．５０）で精製した。僅かに修飾を加えて、Addgeneのレンチウイルス産生プロトコルに従って、ＰＥＩパッケージング法を行った。簡潔には、２９３ＦＴパッケージング細胞を１５ｃｍディッシュに１：３の希釈比でプレーティングし、翌日、集密度が９０％に到達した際、トランスフェクションの１時間前に培地を交換し、２つのパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２（Addgeneカタログ番号１２２６０）及びｐＭＤ２．Ｇ（Addgeneカタログ番号１２２５９）を標的プラスミドとともに、１ｍｇ／ｍｌ ＰＥＩを含むＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Gibco）中、１：３～１：４のＤＮＡ：ＰＥＩ比で希釈した。室温で２０分間のインキュベーション後、プラスミド混合物を細胞に穏やかに添加し、トランスフェクション８時間後、培地を完全ＤＭＥＭ培地で置き換えた。製造者の指示に従って、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Takara Bioカタログ番号６３１２３２）を用いて、レンチウイルス粒子をトランスフェクションの４８時間～７２時間後に採取した。簡潔には、収集した培地を１５００ｇで１５分間遠心分離し、上清を１／３体積のＬｅｎｔｉ－Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒと４℃で一晩インキュベートした。３０００ｒｐｍ、４℃で４５分間遠心分離した後、ウイルスペレットを０．６ｍｌ～０．８ｍｌの冷ＰＢＳに再懸濁し、アリコートし、－８０℃で保存した。
定量的ＰＣＲ分析
先に記載されるように、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（TaKaRa）を用いて、細胞又は腫瘍組織から総ＲＮＡを抽出した。製造者の指示に従って、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ試薬キット（TaKaRaカタログ番号ＲＲ０４７Ａ）を用いて、１μｇ総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。製造者の指示に従って、ＴＢ Ｇｒｅｅｎ試薬（TaKaRaカタログ番号ＲＲ８２０Ａ）とともにＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems）及びＲｏｃｈｅシステム（Lifescience）を用いて、リアルタイムＰＣＲ分析を行った。プライマー配列を図１０Ｂに示す。
表１ 本開示で言及される配列

Claims (78)

  1. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドであって、前記ＣＡＲが（１）細胞外抗原結合ドメイン、（２）膜貫通ドメイン及び（３）細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記ＣＡＲが免疫抑制性腫瘍微小環境において、樹状細胞を活性化可能である、ポリヌクレオチド。
  2. 前記免疫抑制性腫瘍微小環境が、１）免疫阻害分子を発現し、及び／又は２）免疫刺激性サイトカインが不十分である、腫瘍及び／又は腫瘍浸潤性免疫細胞を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 前記免疫阻害分子が、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＨＬＡクラスＩ、シアロ糖タンパク質、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ガレクチン９、ＣＤ２４、並びにＣＤ４７からなる群から選択される、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記免疫阻害分子がＣＴＬＡ－４及び／又はＰＤ－Ｌ１である、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
  5. 前記免疫刺激性サイトカインが、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子及びそれらの組み合わせから選択される、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記腫瘍が、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現する細胞を含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記免疫抑制性腫瘍微小環境が、養子細胞療法の単独療法（例えばＣＡＲ－Ｔ単独療法）に対して劣った反応性を有する腫瘍を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  8. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＲＩＧ－１、ＮＬＲＰ１０、ＤＥＣ－２０５、ＢＤＣＡ－２、ＣＤ８６、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＩＦＮＡＲ、ＴＬＲ４、ＴＮＦＲ（例えばＴＮＦＲ２）、ＣＤ８０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３６７（ＤＣＩＲ）、ＣＤ２０７（Ｌａｎｇｅｒｉｎ）、ＣＤ３７１（ＤＣＡＬ－２、ＣＬＥＣ１２ａ）、ＣＤ２０４、ＣＤ３６、ＩＦＮγＲ、デクチン－１及びＦｃγＲ、又はその組み合わせからなる群から選択される樹状細胞活性化受容体の細胞質ドメインを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  9. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、デクチン－１の細胞質ドメイン及びＦｃγＲの細胞質ドメインを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  10. デクチン－１の前記細胞質ドメイン及びＦｃγＲの前記細胞質ドメインがタンデムに連結されている、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
  11. デクチン－１の前記細胞質ドメインが、配列番号１に示されるアミノ酸配列、又はその任意の機能型を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
  12. ＦｃγＲの前記細胞質ドメインが、配列番号２に示されるアミノ酸配列、又はその任意の機能型を含む、請求項１０又は１１に記載のポリヌクレオチド。
  13. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号３に示されるアミノ酸配列、又はその任意の機能型を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  14. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号４に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、又はその任意の機能型を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  15. 前記細胞外抗原結合ドメインが、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  16. 前記ｓｃＦｖが、腫瘍表面マーカー（例えば固形腫瘍表面マーカー）に特異的である、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
  17. 前記腫瘍表面マーカーが、ＥｐｈＡ２、ＣＤ１９、ＣＤ７０、ＣＤ１３３、ＣＤ１４７、ＣＤ１７１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、メソテリン、ガングリオシドＧＤ２、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＦＢＰ（葉酸結合タンパク質）、ルイスＹ、クローディン１８．２、ＩＬ１３Ｒα２、ＨＥＲ２、ＭＤＣ１、ＰＭＳＡ（前立腺膜特異的抗原）、ＲＯＲ１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＡＩＸ、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＧＰＣ３、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄからなる群から選択される、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
  18. 前記ＣＡＲがシグナルペプチドを更に含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  19. 前記シグナルペプチドがＣＤ８αのシグナルペプチドを含む、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
  20. ＣＤ８αの前記シグナルペプチドが、配列番号５に示される配列、又はその任意の機能型を含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
  21. 前記膜貫通ドメインがＣＤ８αの膜貫通ドメインを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  22. ＣＤ８αの前記膜貫通ドメインが、配列番号６に示される配列、又はその任意の機能型を含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
  23. 前記細胞外抗原結合ドメインが、ヒンジ領域によって、膜貫通ドメインに連結される、請求項１～２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  24. 前記ヒンジ領域がＣＤ８αのヒンジ領域を含む、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
  25. ＣＤ８αの前記ヒンジ領域が、配列番号７に示される配列、又はその任意の機能型を含む、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
  26. ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  27. 請求項１～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
  28. 前記ＣＡＲをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記ＣＡＲの発現のための少なくとも１つの制御ポリヌクレオチド要素に動作可能に連結される、請求項１～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  29. 前記ベクターが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾン、部位特異的挿入ベクター、又は自殺発現ベクターである、請求項２８に記載のベクター。
  30. 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである、請求項２９に記載のベクター。
  31. 前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項３０に記載のベクター。
  32. 請求項２７に記載のポリペプチドを含む操作細胞。
  33. 前記操作細胞が、樹状細胞又はその前駆体若しくは前駆細胞である、請求項３２に記載の操作細胞。
  34. 前記樹状細胞又はその前駆体若しくは前駆細胞が、末梢血細胞、骨髄細胞、胚性幹細胞、又は人工多能性幹細胞に由来する、請求項３２又は３３に記載の操作細胞。
  35. 請求項３２～３４のいずれか一項に記載の操作細胞を産生する方法であって、請求項２８～３１のいずれか一項に記載のベクターを、請求項１～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの発現に適した条件下で、出発細胞に導入することを含む、方法。
  36. 前記出発細胞が樹状細胞又はその前駆体若しくは前駆細胞である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記樹状細胞又はその前駆体若しくは前駆細胞が、末梢血細胞、骨髄細胞、胚性幹細胞、又は人工多能性幹細胞に由来する、請求項３６に記載の方法。
  38. 請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法によって、ｅｘ ｖｉｖｏで産生される細胞の集団。
  39. 細胞の前記集団の少なくとも７０％が、請求項２７に記載のポリペプチドを検出可能なレベルで発現する、請求項３８に記載の細胞の集団。
  40. （ｉ）請求項１～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項２７に記載のポリペプチド、又は請求項２８～３１のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項３２～３４のいずれか一項に記載の操作細胞の集団、又は請求項３８若しくは３９に記載の細胞の集団と、（ｉｉ）医薬的に許容され得る媒体とを含む医薬組成物。
  41. 治療の必要がある被験体において、癌を治療する際の養子細胞療法の有効性を改善する方法であって、請求項４０に記載の医薬組成物を療法的有効量、投与することを含む、方法。
  42. 前記養子細胞療法が、改変免疫細胞の養子移入を含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記医薬組成物が、改変免疫細胞の集団を更に含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
  44. 前記方法が、改変免疫細胞の集団を含む医薬組成物を投与することを更に含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
  45. 前記改変免疫細胞が、細胞表面上で合成受容体（例えばＣＡＲ又はＴＣＲ）の発現を有する、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ細胞、好酸球又は好中球である、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記免疫細胞が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ターミナルエフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδ Ｔ細胞、サイトカイン誘導型キラー（ＣＩＫ）Ｔ細胞、及び腫瘍浸潤性リンパ球からなる群から選択されるＴ細胞である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記免疫細胞が自己又は同種である、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記癌が、副腎癌、骨癌、脳癌、乳癌、結腸直腸癌、食道癌、眼癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、細気管支肺胞細胞肺癌、中皮腫、頭頸部癌、扁平上皮癌、黒色腫、口腔癌、卵巣癌、子宮頸癌、陰茎癌、前立腺癌、膵臓癌、皮膚癌、肉腫、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、膣癌からなる群から選択される固形癌である、請求項４１～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記癌が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、ＨＨＶ８関連原発性滲出性リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球リッチＢ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫（ＭＭ）からなる群から選択される血液学的悪性疾患である、請求項４１～４８のいずれか一項に記載の方法。
  51. 免疫抑制性微小環境において、免疫細胞の増殖を誘導し、免疫細胞の生存を延長させ、及び／又は免疫細胞からの免疫刺激性サイトカインの発現及び／又は分泌を増加させる方法であって、前記免疫抑制性微小環境を、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の操作細胞と接触させることを含む、方法。
  52. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ細胞、好酸球又は好中球である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記免疫細胞が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ターミナルエフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδ Ｔ細胞、サイトカイン誘導型キラー（ＣＩＫ）Ｔ細胞、及び腫瘍浸潤性リンパ球からなる群から選択されるＴ細胞である、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記免疫細胞が自己又は同種である、請求項５１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記免疫抑制性微小環境が、免疫抑制性腫瘍微小環境である、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記免疫抑制性腫瘍微小環境が、免疫阻害分子を発現する腫瘍及び／又は腫瘍浸潤性免疫細胞を含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記免疫阻害分子が、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、シアロ糖タンパク質、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ガレクチン９、ＣＤ２４、並びにＣＤ４７からなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記免疫阻害分子がＣＴＬＡ－４及び／又はＰＤ－Ｌ１である、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記腫瘍が、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現する細胞を含む、請求項５６に記載の方法。
  60. 前記免疫刺激性サイトカインが、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の１つ以上である、請求項５１～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 治療が必要な被験体において、疾患又は病的状態を治療する方法であって、請求項４０に記載の医薬組成物を療法的有効量、投与することを含む、方法。
  62. 第二の作用物質を投与することを更に含む、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記第二の療法が、改変免疫細胞の集団である、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記第二の療法がＣＡＲ－Ｔ療法である、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記疾患が癌を含む、請求項６１に記載の方法。
  66. 樹状細胞を活性化可能なＣＡＲを選択する方法であって、
    （ａ）免疫抑制性腫瘍微小環境を含む非ヒト動物を準備することと、
    （ｂ）前記非ヒト動物に、候補ＣＡＲを発現する樹状細胞を投与することと、
    （ｃ）参照樹状細胞と比較した際の、前記免疫抑制性腫瘍微小環境への浸潤の改善、生存率の改善、及び免疫細胞の活性化を誘導する際の機能の増進から選択される樹状細胞活性化に関するマーカーを検出することと、
    （ｄ）樹状細胞を活性化可能なＣＡＲとして前記候補ＣＡＲを選択することと、
    を含む、方法。
  67. 前記免疫抑制性腫瘍微小環境が臨床的に適切（clinically relevant）である、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記非ヒト動物が、ヒト胎性脾臓及び自己ヒト造血幹細胞（例えばヒトＣＤ３４＋造血幹細胞）を含む、請求項６６又は６７に記載の方法。
  69. 前記免疫抑制性腫瘍微小環境が、免疫阻害分子を発現する腫瘍及び／又は腫瘍浸潤性免疫細胞を含む、請求項６６に記載の方法。
  70. 前記免疫阻害分子が、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、Ａ２ＡＲ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＮＯＸ２、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）及びＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＨＬＡクラスＩ、シアロ糖タンパク質、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ガレクチン９、ＣＤ２４、並びにＣＤ４７からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記免疫阻害分子がＣＴＬＡ－４及び／又はＰＤ－Ｌ１である、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記腫瘍が、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現する細胞を含む、請求項６９に記載の方法。
  73. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ細胞、好酸球又は好中球である、請求項６６～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記免疫細胞が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ターミナルエフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδ Ｔ細胞、サイトカイン誘導型キラー（ＣＩＫ）Ｔ細胞、及び腫瘍浸潤性リンパ球からなる群から選択されるＴ細胞である、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記免疫細胞が自己又は同種である、請求項６６～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記免疫細胞が、改変免疫細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）又は天然免疫細胞である、請求項６６～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記改変免疫細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）が、前記候補ＣＡＲを発現する前記樹状細胞と組み合わせて投与される、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記非ヒト動物が齧歯類、例えばラット又はマウスである、請求項６６又は７７に記載の方法。
JP2023541498A 2021-01-08 2021-12-24 樹状細胞活性化キメラ抗原受容体及びその使用 Pending JP2024502157A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110022268.5A CN112830974B (zh) 2021-01-08 2021-01-08 一种嵌合抗原受体、载体、人树突状细胞、细胞系、实体肿瘤治疗药物及制备方法和应用
CN202110022268.5 2021-01-08
PCT/CN2021/141311 WO2022148255A1 (en) 2021-01-08 2021-12-24 Dendritic cell activating chimeric antigen receptors and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024502157A true JP2024502157A (ja) 2024-01-17

Family

ID=75928631

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023541498A Pending JP2024502157A (ja) 2021-01-08 2021-12-24 樹状細胞活性化キメラ抗原受容体及びその使用

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20240041926A1 (ja)
EP (1) EP4240775A1 (ja)
JP (1) JP2024502157A (ja)
KR (1) KR20230129979A (ja)
CN (2) CN112830974B (ja)
AU (1) AU2021416980A1 (ja)
CA (1) CA3207627A1 (ja)
WO (1) WO2022148255A1 (ja)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112830974B (zh) * 2021-01-08 2022-07-26 深圳市珈钰生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体、载体、人树突状细胞、细胞系、实体肿瘤治疗药物及制备方法和应用
CN114457117B (zh) * 2022-01-11 2023-06-02 深圳市珈钰生物科技有限公司 树突细胞肿瘤疫苗和其用途
TW202340474A (zh) * 2022-01-11 2023-10-16 大陸商深圳市珈鈺生物科技有限公司 樹突細胞腫瘤疫苗和其用途
CN115197911B (zh) * 2022-09-01 2023-09-12 山西医科大学 一种婴儿树突状细胞的制备及其应用
CN115957335B (zh) * 2023-01-03 2024-05-28 华中科技大学同济医学院附属协和医院 基于嵌合抗原受体修饰的单核细胞外囊泡类似物、制备方法及应用
CN116679065B (zh) * 2023-07-31 2023-11-14 北京大学人民医院 检测试剂的应用、多发性骨髓瘤治疗预后预测方法及产品
CN117338914B (zh) * 2023-10-27 2024-09-06 中山市珈钰生物医药有限公司 一种同种异体树突细胞肿瘤疫苗及其制备方法和应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013074916A1 (en) * 2011-11-18 2013-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Car+ t cells genetically modified to eliminate expression of t- cell receptor and/or hla
MX2018001182A (es) * 2015-07-28 2018-04-20 Univ Pennsylvania Monocitos/macrofagos modificados que expresan receptores de antigeno quimerico y sus usos.
CN107286246B (zh) * 2016-12-28 2019-12-17 时力生物科技（北京）有限公司 治疗脑胶质瘤的嵌合抗原受体修饰的树突状细胞及其制备方法
CN108276493B (zh) * 2016-12-30 2023-11-14 南京传奇生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
CN107573419A (zh) * 2017-01-24 2018-01-12 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种增强t细胞抗肿瘤活性的核酸分子
WO2019152781A1 (en) * 2018-02-02 2019-08-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified monocytes/macrophages/dendritic cells expressing chimeric antigen receptors and uses in diseases and disorders associated with protein aggregates
JP2022525781A (ja) * 2019-03-20 2022-05-19 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 免疫細胞療法における両親媒性物質の使用およびそのための組成物
WO2020200303A1 (zh) * 2019-04-04 2020-10-08 上海医药集团股份有限公司 一种包含肿瘤抗原识别受体的免疫细胞及其应用
CA3137397A1 (en) * 2019-04-19 2020-10-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Chimeric receptor that recognizes engineered site in antibody
CN111533808B (zh) * 2020-03-10 2021-02-09 南京医科大学 一种可自分泌TLR4 scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用
CN111411085A (zh) * 2020-04-10 2020-07-14 格源致善(上海)生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用
CN112830974B (zh) * 2021-01-08 2022-07-26 深圳市珈钰生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体、载体、人树突状细胞、细胞系、实体肿瘤治疗药物及制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230129979A (ko) 2023-09-11
CN112830974B (zh) 2022-07-26
US20240041926A1 (en) 2024-02-08
CA3207627A1 (en) 2022-07-14
CN112830974A (zh) 2021-05-25
WO2022148255A1 (en) 2022-07-14
EP4240775A1 (en) 2023-09-13
AU2021416980A1 (en) 2023-06-29
AU2021416980A9 (en) 2024-10-10
CN115135674A (zh) 2022-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210246423A1 (en) Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
KR102618231B1 (ko) 변형된 만능성 줄기 세포, 및 제조 및 사용 방법
WO2022148255A1 (en) Dendritic cell activating chimeric antigen receptors and uses thereof
KR102357004B1 (ko) 입양 세포 면역요법의 효능을 강화하기 위한 조성물 및 방법
CN114761037A (zh) 结合bcma和cd19的嵌合抗原受体及其用途
JP2022050420A (ja) キメラ抗原受容体発現細胞の製造法
CN111566124A (zh) 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
JP2019536452A (ja) 融合タンパク質を用いたｔｃｒの再プログラミングのための組成物及び方法
EP3967329A1 (en) Engineered immune cell targeting bcma and use thereof
US20210038659A1 (en) Combination therapy using a chimeric antigen receptor
CN110404061B (zh) 改进的t细胞治疗方法
KR20230084470A (ko) 면역 세포 기능의 향상
US20220289813A1 (en) Chimeric antigen receptors for treating myeloid malignancies
CN114457117B (zh) 树突细胞肿瘤疫苗和其用途
US20230226181A1 (en) GENETIC ENGINEERING OF gamma delta T CELLS FOR IMMUNOTHERAPY
KR20220004076A (ko) 리툭시맙-내성 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
US12097259B2 (en) Dendritic cell tumor vaccine and uses thereof
US20240350631A1 (en) Anti-ror1 chimeric antigen receptors (cars), cells expressing the cars and related methods
US20230338422A1 (en) Engineering gamma delta t cells with interleukin-36 for immunotherapy
WO2024073583A1 (en) Anti-ror1 chimeric antigen receptors (cars), car-nk cells and related methods
AU2023220999A1 (en) Boosting chimeric antigen receptor cells in the blood
JP2022531814A (ja) 改変細胞の増幅およびその応用

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230925

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230906

RD01 Notification of change of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426

Effective date: 20230727

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20231225