CN114457117B

CN114457117B - 树突细胞肿瘤疫苗和其用途

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Publication number: CN114457117B
Application number: CN202210140959.XA
Authority: CN
Inventors: 徐洋
Original assignee: Shenzhen Jiayu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Jiayu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-01-11
Filing date: 2022-02-16
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2042-02-16
Also published as: CN114457117A

Abstract

本公开提供了一种树突细胞肿瘤疫苗，其包含用于激活树突细胞的嵌合抗原受体和肿瘤抗原。本公开还提供了制备所述树突细胞肿瘤疫苗的组合物和方法，以及使用所述树突细胞肿瘤疫苗治疗癌症的方法。

Description

树突细胞肿瘤疫苗和其用途

技术领域

本公开总体上涉及癌症疗法领域。具体地，本公开涉及树突细胞肿瘤疫苗、制备所述树突细胞肿瘤疫苗的组合物和方法，以及使用所述树突细胞肿瘤疫苗治疗癌症的方法。

背景技术

作为先天免疫与适应性免疫之间的关键环节，树突细胞(DC)在免疫系统中发挥着关键作用(R.M.Steinman,关于树突细胞的决定：过去、现在和未来(Decisions aboutdendritic cells:past,present,and future).《免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.)》30,1-22(2012)；和S.Puhr等人,树突细胞发育-历史、进展和开放性问题(Dendritic celldevelopment-History,advances,and open questions).《免疫学研讨文辑(Semin.Immunol.)》27,388-396(2015))。DC是用于激活T细胞依赖性免疫力的主要抗原呈递细胞(APC)，尤其是在触发肿瘤特异性免疫应答方面(M.Hansen等人,树突细胞在癌症中的作用(The role of dendritic cells in cancer).《免疫病理学研讨文辑(Semin.Immunopathol.)》39,307-316(2017))。近年来，树突细胞过继性细胞疗法取得了很大进展并且成为肿瘤免疫治疗的重要方法。

肿瘤疫苗是使用肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)以诱导身体通过主动免疫产生特异性抗肿瘤作用，刺激身体自身的免疫保护机制并达到治疗肿瘤或防止复发的效果。肿瘤疫苗根据其不同用途可以分为治疗性疫苗和预防性疫苗。根据成分和生产方法的不同，肿瘤疫苗可以分为蛋白肽疫苗、基因疫苗、病毒疫苗和树突细胞疫苗(DC疫苗)。

(西普鲁塞-T(Sipuleucel-T))树突细胞疫苗是世界上第一个也是唯一一个获得美国FDA批准的治疗性癌症疫苗。目前，临床试验中的大多数DC疫苗是由患者外周血中的单核细胞在体外诱导和分化而成的。所述单核细胞使用脉冲蛋白肽或基因转导而装载有TAA或TSA，并且然后被注射回患者体内，以刺激可以杀死肿瘤细胞的肿瘤特异性T细胞。

最近的研究发现，肿瘤浸润树突细胞(TIDC)在免疫抑制性肿瘤微环境或肿瘤免疫抑制性微环境(TIME)中通常表现出不成熟或功能失调的表型，从而抑制T细胞的浸润和激活(J.M.Tran Janco等人,癌症发病机制中的肿瘤浸润树突细胞(Tumor-infiltratingdendritic cells in cancer pathogenesis).《免疫学杂志(J.Immunol.)》194,2985-2991(2015))。结果，DC疫苗在TIME中刺激肿瘤特异性T细胞面临着障碍。因此，需要开发在TIME中具有增进的浸润和激活作用的新DC疫苗。

发明内容

在一方面，本公开提供了一种组合物，其包含一种或多种载体。在一些实施方式中，所述一种或多种载体包括：(a)编码能够激活树突细胞的嵌合抗原受体(CAR)的第一多核苷酸，其中所述CAR包括(1)细胞外抗原结合结构域，(2)跨膜结构域和(3)细胞内信号传导结构域，以及(b)编码肿瘤抗原的第二多核苷酸。

在一些实施方式中，所述CAR和/或所述肿瘤抗原当在所述树突细胞中表达时能够在免疫抑制性肿瘤微环境中激活所述树突细胞。在一些实施方式中，所述免疫抑制性肿瘤微环境包括肿瘤和/或肿瘤浸润免疫细胞，所述肿瘤和/或肿瘤浸润免疫细胞：1)表达免疫抑制性分子，和/或2)缺乏免疫刺激细胞因子。在一些实施方式中，所述免疫抑制性分子选自由以下组成的组：PD-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、A2AR、BTLA(CD272)、CTLA-4(CD152)、IDO1、IDO2、TDO、NOX2、VISTA、SIGLEC7(CD328)、PVR(CD155)和SIGLEC9(CD329)、PD-L1、PD-L2、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、PVR(CD155)、HLA I类、唾液酸糖蛋白、CD112、CD113、半乳凝素9、CD24和CD47。在一些实施方式中，所述免疫抑制性分子是CTLA-4和/或PD-L1。在一些实施方式中，所述免疫刺激细胞因子选自TNF-a、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和其组合。

在一些实施方式中，所述细胞内信号传导结构域包括选自由以下组成的组的树突细胞激活受体的细胞质结构域：RIG-1、NLRP10、DEC-205、BDCA-2、CD86、4-1BBL、OX40L、CD40、IFNAR、TLR4、TNFR(例如，TNFR2)、CD80、CD40L、CD367(DCIR)、CD207(Langerin)、CD371(DCAL-2、CLEC12a)、CD204、CD36、IFNγR、Dectin-1和FcγR或其组合。在一些实施方式中，所述细胞内信号传导结构域包括Dectin-1的细胞质结构域和FcγR的细胞质结构域。在一些实施方式中，Dectin-1的所述细胞质结构域包括SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列或其任何功能形式。在一些实施方式中，FcγR的所述细胞质结构域包括SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列或其任何功能形式。在一些实施方式中，所述细胞内信号传导结构域包括SEQID NO:3中所示的氨基酸序列或其任何功能形式。在一些实施方式中，所述细胞内信号传导结构域包括由SEQ ID NO:4中所示的核酸序列编码的氨基酸序列或其任何功能形式。

在一些实施方式中，所述细胞外抗原结合结构域包括单链可变片段(scFv)。在一些实施方式中，所述scFv对肿瘤表面标志物具有特异性。在一些实施方式中，所述肿瘤表面标志物选自由以下组成的组：EphA2、CD19、CD70、CD133、CD147、CD171、DLL3、EGFRvIII、间皮素、神经节苷脂GD2、FAP(成纤维细胞激活蛋白)、FBP(叶酸结合蛋白)、Lewis Y、密封蛋白18.2、IL13Ra2、HER2、MDC1、PMSA(前列腺膜特异性抗原)、ROR1、B7-H3、CAIX、CD133、CD171、CEA、GPC3、MUC1、NKG2D。

在一些实施方式中，所述CAR进一步包括信号肽。在一些实施方式中，所述信号肽包括CD8α的信号肽。在一些实施方式中，CD8α的所述信号肽包括SEQ ID NO:5中所示的序列或其任何功能形式。

在一些实施方式中，所述跨膜域包括CD8α的跨膜结构域。在一些实施方式中，CD8α的所述跨膜结构域包括SEQ ID NO:6中所示的序列或其任何功能形式。

在一些实施方式中，所述细胞外抗原结合结构域通过铰链区连接到所述跨膜结构域。在一些实施方式中，所述铰链区包括CD8α的铰链区。在一些实施方式中，CD8α的所述铰链区包括SEQ ID NO:7中所示的序列或其任何功能形式。

在一些实施方式中，所述肿瘤抗原是肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。在一些实施方式中，所述肿瘤抗原由突变的肿瘤基因或其片段编码。在一些实施方式中，所述肿瘤基因选自p53、ras、β-连环蛋白、BRCA1/2、CDK4、CML66、纤连蛋白、MART-2、TGF-βRII。在一些实施方式中，所述肿瘤抗原选自CEA、未成熟层粘连蛋白受体、TAG-72、HPVE6、HPV E7、BING-4、钙激活的氯离子通道2、细胞周期素-B1、9D7、Ep-Cam、EphA3、GPC3、Her2/neu、端粒酶、间皮素、SAP-2和存活。在一些实施方式中，所述肿瘤抗原选自p53R273H突变肽、KRAS G12V突变肽和KRAS G12C突变肽。在一些实施方式中，所述p53 R273H突变肽具有SEQ ID NO:29中所示的序列，所述KRAS G12V突变肽具有SEQ ID NO:31中所示的序列，并且所述KRAS G12C突变肽具有SEQ ID NO:30中所示的序列。

在一些实施方式中，所述肿瘤抗原连接到DC-LAMP分选信号。在一些实施方式中，所述DC-LAMP分选信号具有SEQ ID NO:32中所示的序列或其任何功能形式。

在一些实施方式中，所述一种或多种载体是DNA或RNA载体。

在一些实施方式中，所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸操作性地连接到用于表达所述CAR和/或所述肿瘤抗原的至少一个调控多核苷酸元件。

在一些实施方式中，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括在单个载体中。在一些实施方式中，所述第一多核苷酸通过IRES可操作地连接到所述第二多核苷酸。在一些实施方式中，所述IRES具有SEQ ID NO:36中所示的序列或其任何功能形式。

在一些实施方式中，所述载体是质粒载体、病毒载体、转座子、定点插入载体或自杀式表达载体。在一些实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或AAV载体。在一些实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。

在另一方面，本公开提供了一种经工程化的细胞，其包括本文所公开的一种或多种载体。在一些实施方式中，所述经工程化的细胞是树突细胞或其前体细胞或祖细胞。在一些实施方式中，所述树突细胞或其前体细胞或祖细胞源自外周血细胞、骨髓细胞或诱导性多能干细胞。

在又另一方面，本公开提供了一种产生经工程化的细胞的方法，所述方法包括在适合于表达CAR和肿瘤抗原的条件下向起始细胞引入本文所公开的一种或多种载体。在一些实施方式中，所述起始细胞是树突细胞或其前体细胞或祖细胞。在一些实施方式中，所述树突细胞或其前体细胞或祖细胞源自外周血细胞、骨髓细胞或诱导性多能干细胞。

在另一方面，本公开提供了一种细胞群体，其通过本文公开的产生经工程化的细胞的方法离体产生。在一些实施方式中，至少60％的所述细胞群体表达可检测水平的CAR多肽。

在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含(i)本文公开的一种或多种载体、或本文公开的经工程化的细胞的群体、或本文公开的细胞群体，和(ii)药学上可接受的介质。

在另一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的药物组合物。在一些实施方式中，所述受试者的肿瘤细胞带有突变基因。

在一些实施方式中，所述癌症是选自由以下组成的组的实体癌：肾上腺癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、食道癌、眼癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、细支气管肺泡细胞肺癌、间皮瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、口腔癌、卵巢癌、宫颈癌、阴茎癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌。

在一些实施方式中，所述癌症是选自由以下组成的组的血液系统恶性肿瘤：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、结外NK/T细胞淋巴瘤、HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、原发性纵膈大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、多发性骨髓瘤(MM)。

在一些实施方式中，所述用于治疗癌症的方法进一步包括向所述受试者施用经修饰的免疫细胞群体。在一些实施方式中，所述经修饰的免疫细胞在细胞表面表达合成受体(例如，CAR或TCR)。在一些实施方式中，所述免疫细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞或中性粒细胞。在一些实施方式中，所述免疫细胞是选自由以下组成的组的T细胞：CD4+T细胞、CD8+T细胞、细胞毒性T细胞、末端效应T细胞、记忆T细胞、原初T细胞、自然杀伤T细胞、γ-δT细胞、细胞因子诱导型杀伤(CIK)T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施方式中，所述免疫细胞是自体的或同种异体的。

在另一方面，本公开提供了一种在免疫抑制性微环境中诱导免疫细胞增殖、延长免疫细胞存活期和/或增加免疫刺激细胞因子从免疫细胞中表达和/或分泌的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使所述免疫抑制性微环境与本文公开的经工程化的细胞接触。在一些实施方式中，所述免疫细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞或中性粒细胞。在一些实施方式中，所述免疫细胞是选自由以下组成的组的T细胞：CD4+T细胞、CD8+T细胞、细胞毒性T细胞、末端效应T细胞、记忆T细胞、原初T细胞、自然杀伤T细胞、γ-δT细胞、细胞因子诱导型杀伤(CIK)T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施方式中，所述免疫细胞是自体的或同种异体的。

在一些实施方式中，所述免疫抑制性微环境是免疫抑制性肿瘤微环境。

附图说明

并入本文的附图构成本说明书的一部分。与此书面描述一起，附图进一步用于解释本公开的原理，并使相关领域的技术人员能够制备和使用本公开。

图1A-1J显示嵌合抗原受体(CARDF)在用慢病毒载体转导的细胞的表面的表达，所述慢病毒载体用于共表达CARDF和肿瘤抗原。图1A显示慢病毒载体的结构图。图1B显示在用慢病毒转导293FT细胞后，通过流式细胞术检测的CARDF在细胞表面的表达。图1C显示H460肿瘤细胞中的p53基因的测序结果。图1D显示SW480肿瘤细胞中的p53基因的测序结果。图1E显示SW837肿瘤细胞中的KRAS基因的测序。图1F显示SW480肿瘤细胞中的KRAS基因的测序结果。图1G显示EphA2在H460肿瘤细胞的表面的表达水平。图1H显示EphA2在SW480肿瘤细胞的表面的表达水平。图1I显示EphA2在SW837肿瘤细胞的表面的表达水平。图1J显示在过度表达p53R273H的H460肿瘤细胞(在下文中称为H460-p53R273Hov)中表达的p53R273H突变多肽的mRNA水平。

图2A-2D显示从人源化小鼠骨髓细胞分化的人DC以及在转导后CARDF-p53R273H在DC中的表达。图2A显示从人源化小鼠骨髓细胞分化的DC。图2B显示在DC中表达的p53R273H的mRNA水平。图2C显示从人源化小鼠骨髓细胞分化的DC和CARDF-p53R273H在DC中的表达。图2D显示在DC中表达的KRAS G12C和KRAS G12V的mRNA水平。

图3A-3G显示人源化小鼠(Hu-小鼠)肿瘤模型在用树突细胞肿瘤疫苗(在下文中称为CARDF-DC疫苗)处理后的肿瘤生长。图3A显示使用p53R273H疫苗的处理过程的示意图。图3B显示KRAS G12C疫苗和使用KRAS G12C疫苗的处理过程的示意图。图3C显示在使用p53R273H疫苗的不同处理组的处理期间H460肿瘤组织的生长曲线。图3D显示在使用p53R273H疫苗的不同处理组的处理期间H460-p53R273Hov(过度表达R273H)肿瘤组织的生长曲线。图3E显示在使用p53R273H疫苗的不同处理组的处理期间SW480肿瘤组织的生长曲线。图3F显示在使用KRAS疫苗的不同处理组的处理期间SW480肿瘤组织的生长曲线。图3G显示在使用KRAS疫苗的不同处理组的处理期间SW837肿瘤组织的生长曲线。

图4A-4H显示人源化小鼠(Hu-小鼠)肿瘤模型在用树突细胞肿瘤疫苗处理后的流式细胞术分析结果。图4A显示p53R273H疫苗的不同处理组的脾脏中T细胞的比率。图4B显示不同处理组的脾脏中PD-1+T细胞的比率。显示p53R273H疫苗的不同处理组的脾脏中T细胞的比率。图4C显示KRAS疫苗的不同处理组的脾脏中T细胞的比率。图4D显示KRAS疫苗的不同处理组的脾脏中DC细胞的比率。图4E显示p53R273H疫苗的不同处理组的脾脏中的DC中的CD80表达的平均荧光强度。图4F显示p53R273H疫苗的不同处理组的外周血中B细胞的比率。图4G显示p53R273H疫苗的不同处理组的外周血中巨噬细胞的比率。图4H显示KRAS疫苗的不同处理组的外周血中B细胞的比率。

图5A-5E显示人源化小鼠(Hu-小鼠)肿瘤模型在用树突细胞肿瘤疫苗处理后的肿瘤mRNA分析结果。图5A显示p53R273H疫苗的不同处理组的sw480肿瘤组织中的TNF-α基因mRNA表达水平。图5B显示p53R273H疫苗的不同处理组的sw480肿瘤组织中的CARDF scFv基因mRNA表达水平。图5C显示KRAS疫苗的不同处理组的SW480肿瘤组织中的CD3基因mRNA表达水平。图5D显示KRAS疫苗的不同处理组的SW837肿瘤组织中的TNF-α基因mRNA表达水平。图5E显示引物序列。

具体实施方式

在更详细地描述本公开之前，应理解本公开不限于所描述的特定实施方式，并且因此当然可以变化。还应理解的是，本文使用的术语仅是为了描述特定实施方式的目的，而并不旨在是限制性的，因为本公开的范围将仅由所附权利要求书限定。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然与本文所描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。

本说明书中引用的所有出版物和专利通过引用的方式并入本文，就好像每个单独的出版物或专利都被具体地且单独地指示为通过引用的方式并入并且通过引用的方式并入本文以公开和描述引用出版物相关的方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对其在提交日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本公开因先前的公开而无权先于此类出版物。进一步地，所提供的公开日期可能与实际的公开日期不同，实际的公开日期可能需要单独确认。

如对于本领域技术人员将显而易见的是，在阅读本公开时，本文描述和说明的单独实施方式中的每一个均具有离散的组成部分和特征，所述组成部分和特征可以在不偏离本公开的范围或精神的情况下易于与任何其它若干实施方式的特征分离或组合。任何所列举的方法都可以按所列举的事件顺序或逻辑上可能的任何其它顺序进行。

定义

以下定义是为了帮助读者而提供。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其它科学或医学术语旨在具有本领域技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为了清楚和/或易于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包括此类定义不一定应被解释为表示与本领域通常理解的术语的定义相比具有实质性差异。

如本文所使用的，除非上下文清楚地另外指明，否则单数形式“一个”、“一种”以及“所述”包括复数指示物。

应该注意，在本公开中，如“包括(comprises)”、“包括(comprised)”、“包括(comprising)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”等术语具有美国专利法中赋予的含义；所述术语是包容性或开放性的并且不排除另外的、未列举的元素或方法步骤。如“基本上由…组成(consisting essentially of)”和“基本上由…组成(consistsessentially of)”等术语具有美国专利法中赋予的含义；所述术语允许包括不会对所要求保护的发明的基本和新颖特性产生实质性影响的另外的成分或步骤。术语“由…组成(consists of)”和“由…组成(consisting of)”具有美国专利法中赋予的含义；即这些术语是封闭式的。

在本申请中出现一系列列举的数值的所有情况下，应理解，任何列举的数值可以是数值范围的上限或下限。应进一步理解，本发明涵盖所有此类数值范围，即，具有数值上限和数值下限的组合的范围，其中上限和下限中的每一者的数值可以是本文中列举的任何数值。本文所提供的范围理解为包括范围内的所有值。例如，1-10理解为包括所有值1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，以及适当的分数值。类似地，由“至少”限定的范围理解为包括提供的下限值和所有更高的数字。

如本文所使用的，“约”理解为包括在平均值的三个标准差内或在具体技术中的标准公差范围内。在某些实施方式中，约理解为不超过0.5的变化。

如本文所使用的，术语“CAR”或“CARDF”可以与术语“嵌合抗原受体”互换使用，是指经工程化的受体或合成受体或编码其的多核苷酸。经工程化的受体或合成受体包括：细胞外结构域，所述细胞外结构域包括抗原结合结构域；跨膜结构域；和/或细胞内信号传导结构域；任选的信号肽，所述细胞外结构域、所述跨膜结构域和/或所述细胞内信号传导结构域、所述任选的信号肽彼此连接或可操作地彼此连接。最常见的CAR是例如衍生自与CD3-ζ跨膜和胞内结构域融合的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)。此类CAR会响应于scFv与其靶标的特异性结合而传递ζ信号。制备CAR的方法是公开的(参见例如Grupp等人,《新英格兰医学期刊(N Engl J Med.)》,368:1509-1518,2013；Park等人,《生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)》,29:550-557,2011；Haso等人,(2013)《血液(Blood)》,121,1165-1174；Han等人,《血液学与肿瘤学杂志(J.Hematol Oncol.)》6:47,2013；WO2012/079000；美国公开2012/0213783；和WO2013/059593，所述文献中的每一个文献以全文引用的方式并入本文)。

术语“嵌合抗原受体T细胞”与术语“CAR-T细胞”互换使用，是指通过生物学方法(例如，基因工程)工程化以在T细胞表面表达CAR的T细胞或其群体。CAR-T细胞可以是T辅助CD4+和/或T效应CD8+细胞。CAR-T可以鉴定表面抗原并启动免疫应答。

“抗原”是指引起免疫应答的分子。这种免疫应答可以是体液应答或细胞介导的应答或两者。技术人员将理解，任何大分子，包括实际上所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。很明显，本公开包括充当引发免疫应答的抗原的治疗性抗体。

“抗体”是指与抗原结合的免疫球蛋白(Ig)家族的多肽。例如，天然存在的IgG类型的“抗体”是包括通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的四聚体。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(在本文中缩写为CL)。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)(轻链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)，所述高变区散布有更保守的被称为框架区(FR)的区。本文公开的抗体的CDR边界可以通过Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani规则来定义或鉴定(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,273(4),927(1997)；Chothia,C.等人,《分子生物学杂志(JMol Biol.)》12月5日；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.,《分子生物学杂志》,196,901(1987)；Chothia,C.等人,《自然(Nature)》.12月21-28日；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等人,马里兰州贝斯赛达的国立卫生研究院(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md).(1991)；Marie-Paule Lefranc等人,《发育与比较免疫学(Developmental and Comparative Immunology)》,27:55-77(2003)；Marie-PauleLefranc等人,《免疫组研究(Immunome Research)》,1(3),(2005)；Marie-Paule Lefranc,《B细胞的分子生物学(Molecular Biology of B cells)》(第二版),第26章,481-514,(2015))。每个VH和VL包含按照以下顺序从氨基端到羧基端布置的三个CDR和四个FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

如本文所使用的，“抗原结合结构域”是指由包括一个或多个CDR的完整抗体的一部分形成的抗体片段，或可以与抗原结合但不包括完整天然抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合结构域的实例包括但不限于双抗体、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单链Fv-Fc抗体(scFv-Fc)、scFv二聚体(二价双抗体)、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。抗原结合结构域能够结合到亲本抗体结合的相同抗原。

“自体”细胞是指来源于同一受试者的任何细胞，所述细胞随后将被重新引入到所述受试者中。

“同种异体”细胞是指来源于相同物种的不同受试者的任何细胞。

在免疫细胞的上下文中使用的“效应细胞”是指可以被激活以响应刺激而执行效应功能的细胞。效应细胞可以包括但不限于NK细胞、细胞毒性T细胞和辅助T细胞。

“有效量”或“治疗有效量”是指如本文所述有效地实现期望生物学结果的细胞、组合物、调配物或材料的量。此类结果可以包括但不限于消除表达特定BCR的B细胞和由其产生的抗体。

多肽或多核苷酸上下文中的“同一性”或“序列同一性”的百分比是通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定的，其中多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分可能包括与参考序列(不包括添加或缺失)相比的添加或缺失(即空位)，以便对两个序列进行最佳比对。百分比通过以下计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以得到匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗口中的总位置数并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比。

术语“保守取代”，如在本文中针对氨基酸序列使用时，是指将氨基酸残基用不同的具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基替代。例如，可以在具有疏水侧链的氨基酸残基(例如，Met、Ala、Val、Leu和Ile)之间、具有中性亲水侧链的残基(例如，Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)之间、具有酸性侧链的残基(例如，Asp、Glu)之间、具有碱性侧链的氨基酸(例如，His、Lys和Arg)之间或具有芳香族侧链的残基(例如，Trp、Tyr和Phe)之间进行保守取代。如本领域中已知，保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著变化，并且因此可以保留蛋白质的生物活性。

如本文所使用的，术语“功能形式”是指亲本分子的不同形式(如变体、片段、融合体、衍生物和模拟物)，其尽管在氨基酸序列或化学结构中具有差异，但仍保留亲本分子的基本生物活性。如本文所使用的，“保留基本生物活性”的表述意指表现出亲本分子的生物活性的至少一部分(例如，不低于约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)或全部。亲本多肽的功能形式可以包括天然存在的变体形式和非天然存在的形式，如通过重组方法或化学合成获得的那些。功能形式可以含有非天然氨基酸残基。

如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸序列之间的功能关系。在编码如本公开的CAR的多肽链等融合蛋白的多核苷酸的上下文中，所述术语意指两个或更多个多核苷酸序列被连接成使得由这些片段编码的氨基酸序列保持在框内。在转录或翻译调控的上下文中，所述术语是指调控序列与编码序列的功能关系，例如，启动子相对于编码序列处于正确位置和朝向上，以便调节转录。

如本文所使用的，术语“多核苷酸”或“核酸”是指核苷酸链。所述术语还指合成的和/或非天然存在的核酸分子(例如，包括核苷酸类似物或经修饰的主链残基或键)。所述术语还指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。所述术语涵盖含有天然核苷酸类似物的核酸。所述术语还涵盖具有合成主链的核酸样结构。除非另外指出，否则特定多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地说，简并密码子取代可以通过生成序列来实现，在所述序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见Batzer等人,《核酸研究(Nucleic Acid Res.)》19:5081(1991)；Ohtsuka等人,《生物化学杂志》,260:2605-2608(1985)；以及Rossolini等人,《分子与细胞探测(Mol.Cell.Probes)》,8:91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。所述术语还适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。在某些实施方式中，多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

如本文所使用的，术语“单链可变片段”可与术语“scFv”互换使用，是指由直接相互连接或通过肽接头序列连接的轻链可变区和重链可变区组成的经工程化的抗体(HustonJS等人《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》,85:5879(1988))。

如本文所使用的，术语“TCR”可以与术语“T细胞受体”或术语“TCR复合物”互换使用，是指天然的(或内源性)TCR或经工程化的TCR。TCR是指T细胞表面的蛋白质复合物，所述蛋白质复合物负责将抗原片段识别为与MHC分子结合的肽。

如本文所使用的，术语“载体”是指可以将编码蛋白质的多核苷酸可操作地插入其中以便引起所述蛋白质的表达的媒剂。载体可以用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传元件在宿主细胞内得以表达。载体的实例包括质粒；噬菌粒；粘粒；人工染色体，如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)；噬菌体，如λ噬菌体或M13噬菌体；和动物病毒。用作载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如，SV40)。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选择元件和报告基因。另外，载体还可以含有复制起点。载体还可以包括协助其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包衣。载体可以是表达载体或克隆载体。本公开提供的载体(例如，表达载体)含有本文所提供的编码融合多肽的核酸序列、可操作地连接到所述核酸序列的至少一个启动子(例如，SV40、CMV、EF-1α)和至少一个选择标志物。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如，SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。

如本文所使用的，短语“宿主细胞”是指其中已引入有外源多核苷酸和/或载体的细胞。

术语“药学上可接受的”表示指定的载体、媒剂、稀释剂、赋形剂和/或盐通常与构成调配物的其它成分在化学和/或物理上相容，并且与其接受者在生理上相容。

如本文所使用的，术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”是指需要诊断、预后、改善、预防和/或治疗疾病或病症的人或非人动物，包括哺乳动物或灵长类动物。哺乳动物受试者包括人、家畜、农畜，以及动物园、体育或玩赏动物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、牛、熊等。

如本文所使用的，术语“治疗(treating或treatment)”病状包括预防或减轻病状、减缓病状的发作或发展速率、降低罹患病状的风险、预防或延迟与病状相关的症状的发展、减轻或结束与病状相关的症状、产生病状的完全或部分消退、治愈病状或其某种组合。

树突细胞(DC)肿瘤疫苗

在一方面，本公开提供了一种树突细胞(DC)肿瘤疫苗，其能够在免疫抑制性肿瘤微环境或肿瘤免疫抑制性微环境(TIME)中刺激肿瘤特异性T细胞。在一个实施方式中，DC肿瘤疫苗包含表达嵌合抗原受体(CAR或CARDF)的树突细胞或其前体细胞或祖细胞，所述嵌合抗原受体能够激活树突细胞(DC)和肿瘤抗原。

肿瘤免疫抑制性微环境

术语“免疫抑制性肿瘤微环境”和术语“肿瘤免疫抑制性微环境(TIME)”可以互换使用，并且是指具有与密集的细胞外基质一起能够抑制肿瘤免疫监视和免疫治疗的例如肿瘤细胞、肿瘤浸润免疫细胞、肿瘤相关成纤维细胞、内皮细胞以及各种趋化性和炎性细胞因子或免疫刺激细胞因子的微环境(F.R.Balkwill等人,肿瘤微环境一览(The tumormicroenvironment at a glance).《细胞科学杂志(J.Cell Sci.)》125,5591-5596(2012)；M.Binnewies等人,了解肿瘤免疫微环境(TIME)以进行有效治疗(Understanding thetumor immune microenvironment(TIME)for effective therapy).《自然医学(NatMed.)》24,541–550(2018)；M.A.-M.Alireza Labani-Motlagh等人,肿瘤微环境：妨碍和阻碍抗肿瘤免疫应答的环境(The Tumor Microenvironment:A Milieu Hindering andObstructing Antitumor Immune Responses).《免疫学前沿(Front.Immunol.)》11,940(2020)和L.Hui等人,肿瘤微环境：魔鬼的圣地(Tumor microenvironment:Sanctuary ofthe devil).《癌症通讯(Cancer Lett.)》368,7-13(2015))。

在一些实施方式中，免疫抑制性肿瘤微环境或TIME包括表达免疫抑制性分子的实体瘤和/或肿瘤浸润免疫细胞。免疫抑制性分子可以选自由以下组成的组：PD-1、TIM3、TIGIT、LAG3、A2AR、BTLA(CD272)、CTLA-4(CD152)、IDO1、IDO2、TDO、NOX2、VISTA、SIGLEC7(CD328)、PVR(CD155)和SIGLEC9(CD329)、PD-L1、PD-L2、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、PVR(CD155)、HLA I类、唾液酸糖蛋白、CD112、CD113、半乳凝素9、CD24和CD47。在某些实施方式中，免疫抑制性分子是CTLA-4和/或PD-L1。如本文所使用的，关于免疫抑制性分子，术语“表达”(expressing/express)是指以比参考水平高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的水平表达免疫抑制性分子。关于免疫抑制性分子的表达，术语“参考水平”是指由免疫缺陷动物模型(例如，NSG小鼠)中的野生型肿瘤细胞(例如，野生型A549细胞)形成的肿瘤中的免疫抑制性分子的表达水平。

“CTLA-4”是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4的简称并且也被称为CD152，并且更详细的描述可以在以下中找到：例如Kolar等人,(2009年1月1日)CTLA-4(CD152)控制小鼠体内的稳态和调节性T细胞的抑制能力(CTLA-4(CD152)controls homeostasis andsuppressive capacity of regulatory T cells in mice).《关节炎与风湿病(ArthritisRheum.)》60(1):123-32。“PD-L1”是程序性死亡配体1的简称并且也被称为分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)，并且更详细的描述可以在以下中找到：例如Dong H等人，B7-H1，一种B7家族的第三个成员，共刺激T细胞增殖和白介素-10分泌(B7-H1,a third memberof the B7 family,co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10secretion).《自然医学(Nature Medicine)》.5(12):1365–9,1999。

CTLA-4和PD-L1是通过抑制T细胞活性来维持外周耐受的关键免疫抑制性分子。CTLA-4以比CD28更高的亲和力与CD80和CD86结合，后者是激活T细胞的主要共刺激途径。PD-L1与在T细胞表面表达的PD-1结合并且抑制T细胞活性。PD-L1在维持T细胞无能和预防自身免疫方面起着核心作用(Walker LSK等人,内部的敌人：在外周避开自身反应性T细胞(The enemy within:keeping self-reactive T cells at bay in the periphery).《自然综述免疫学(Nat Rev Immunol.)》2002；2:11–19.；Fife BT等人,通过CTLA-4和PD-1途径控制外周T细胞耐受和自身免疫(Control of peripheral T-cell tolerance andautoimmunity via the CTLA-4and PD-1pathways).《免疫学评论(ImmunologicalReviews)》.2008；224:166-182.；和Keir ME等人,耐受和免疫中的PD-1和其配体(PD-1andIts Ligands in Tolerance and Immunity).《免疫学年度评论(Annual Review ofImmunology)》.2008；26:677-704.)。

在某些实施方式中，TIME内的肿瘤包括表达CTLA-4-免疫球蛋白融合蛋白(CTLA4-Ig)和/或PD-L1的细胞。CTLA4-Ig已被开发用于抑制T细胞介导的免疫应答(Walker LSK等人，内敌：在外周避开自身反应性T细胞(The enemy within:keeping self-reactive Tcells at bay in the periphery).《自然综述免疫学》2002；2:11-19.)。如本文所使用的，关于CTLA4-Ig，术语“表达”(expressing/express)是指以比参考水平高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的水平表达CTLA4-Ig。关于CTLA4-Ig的表达，术语“参考水平”是指野生型肿瘤细胞(例如，野生型A549细胞)中CTLA4-Ig的表达水平。如本文所使用的，关于PD-L1，术语“表达”(expressing/express)是指以比参考水平高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的水平表达PD-L1。关于PD-L1的表达，术语“参考水平”是指野生型肿瘤细胞(例如，野生型A549细胞)中PD-L1的表达水平。

在某些实施方式中，CTLA-4-Ig包括SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列、或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性同时保留SEQ ID NO:8的基本生物学活性的序列、或具有其1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代的序列、或其任何功能形式。在某些实施方式中，PD-L1包括SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列、或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性同时保留SEQ ID NO:9的基本生物学活性的序列、或具有其1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代的序列、或其任何功能形式。

在某些实施方式中，免疫抑制性肿瘤微环境包括对过继性细胞疗法的单一疗法(例如，CAR-T单一疗法)的应答性较差的肿瘤。如本文和整个说明书所使用的，术语“应答性较差”是指不存在应答性或应答性降低，这可以通过与已知没有治疗效果的对照治疗相比，疗法(例如，CAR-T疗法)的相当(例如，更佳的治疗效果低于20％、低于15％、低于10％、低于5％、低于4％、低于3％或低于2％)治疗效果来检测。

树突细胞激活性嵌合抗原受体

树突细胞是专业的抗原呈递细胞，其可以致敏原初T细胞并重新激活记忆应答。在癌症中，树突细胞可以通过交叉呈递肿瘤相关抗原(TAA)或新抗原以引起更强的抗肿瘤应答来激活T细胞(例如，细胞毒性CD8+T细胞)。DC的激活可以通过测量各种参数来测定，所述参数包括但不限于DC的激活状态和/或免疫细胞(例如，T细胞、巨噬细胞)的激活状态，所述激活状态可以通过以下来指示：DC激活性标志物(如CD80、CD86和MHC-II、CD83、CD54、CMRF-44、CMRF-56)的表达水平、免疫细胞(例如，T细胞)的存活期和/或细胞毒性、来自免疫细胞(例如，T细胞)的免疫刺激细胞因子(例如，TNF-a、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)的表达(和/或分泌)、来自免疫细胞(例如，T细胞)的免疫抑制性分子(例如，PD-1、TIM-3、TIGIT、LAG3、A2AR、BTLA(CD272)、CTLA-4(CD152)、IDO1、IDO2、TDO、KIR、NOX2、VISTA、SIGLEC7(CD328)、PVR(CD155)和SIGLEC9(CD329))的表达水平和/或抗炎性巨噬细胞(例如，M2巨噬细胞)的如CD206和CD163等标志物的表达水平。

在某些实施方式中，树突细胞的激活包括当与树突细胞的参考状态(例如，失活状态)相比，DC激活性标志物(如CD80、CD86和/或MHC-II、CD83、CD54、CMRF-44、CMRF-56)的表达水平增加、免疫细胞(例如，T细胞(如CD8+T细胞)、DC)的存活期增加、来自免疫细胞(例如，T细胞)的免疫刺激细胞因子(例如，TNF-a、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18和/或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)的表达(和/或分泌)增加、来自免疫细胞(例如，T细胞)的免疫抑制性分子(例如，PD-1、TIM-3、TIGIT、LAG3、A2AR、BTLA(CD272)、CTLA-4(CD152)、IDO1、IDO2、TDO、KIR、NOX2、VISTA、SIGLEC7(CD328)、PVR(CD155)和SIGLEC9(CD329))的表达降低和/或抗炎性巨噬细胞(例如，M2巨噬细胞)的标志物(如CD206和CD163)的表达水平降低。

在某些实施方式中，本文提供的DC激活性CAR包括：(1)细胞外抗原结合结构域，(2)跨膜结构域和(3)细胞内信号传导结构域。

(1)细胞外抗原结合结构域

在一些实施方式中，抗原结合结构域包括人抗体或人源化抗体或其抗体片段。术语“人抗体”是指整个分子来源于人类或由与人类形式的抗体或免疫球蛋白相同的氨基酸序列组成的抗体。术语“人源化抗体”是指含有来源于非人免疫球蛋白的序列(例如，CDR序列)的抗体。人抗体或人源化抗体或其片段可以通过各种方式制备，例如通过重组方法或通过用小鼠的所关注抗原进行免疫，所述小鼠经基因修饰以表达衍生自人重链和/或轻链编码基因的抗体。

在一些实施方式中，本文提供的CAR的细胞外抗原结合结构域包括单链可变片段(scFv)、Fv、Fab、(Fab)2、scFv、纳米抗体、配体/受体结构域或本领域已知的用作抗原结合结构域的任何替代性支架。在一些实施方式中，本文提供的CAR的细胞外抗原结合结构域是scFv。scFv可以对肿瘤表面标志物，例如实体瘤表面标志物，具有特异性。在某些实施方式中，肿瘤表面标志物选自由以下组成的组：EphA2、CD19、CD70、CD117、CD133、CD147、CD171、DLL3、EGFRvIII、VGFR2、间皮素、神经节苷脂GD2、FAP(成纤维细胞激活蛋白)、FBP(叶酸结合蛋白)、LMP1、Lewis Y、密封蛋白18.2、IL13Rα2、HER2、MDC1、PMSA(前列腺膜特异性抗原)、ROR1、ROR2、B7-H3、CAIX、CD133、CD171、CEA、GPC3、MUC1、MUC16、MAGE-A1、MAGE-A4、TROP2、EpCAM、NKG2D、被发现与关键正常组织相比更高度富集在肿瘤细胞表面的其它蛋白质和其组合。细胞外抗原结合结构域还可以对可以受益于将TIME朝促炎性状态转化的疾病的非肿瘤标志物(例如，传染病的标志物)具有特异性。

在一些实施方式中，scFv对EphA2具有特异性。在一些实施方式中，scFv包括可变重(VH)区和可变轻(VL)区。在一些实施方式中，VH包括：重链CDR1(HCDR1)，其具有SEQ IDNO:10中所示的序列、或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性同时保留其基本生物学活性的序列、或具有其1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代的序列、或其任何功能形式；CDR2，其具有SEQ ID NO:11中所示的序列、或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性同时保留其基本生物学活性的序列、或具有其1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代的序列、或其任何功能形式；和CDR3，其具有SEQ ID NO:12中所示的序列、或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性同时保留其基本生物学活性的序列、或具有其1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代的序列、或其任何功能形式。在一些实施方式中，VL区包括：轻链CDR1(LCDR1)，其具有SEQ ID NO:13中所示的序列、或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性同时保留其基本生物学活性的序列、或具有其1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代的序列、或其任何功能形式；CDR2，其具有SEQID NO:14中所示的序列、或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性同时保留其基本生物学活性的序列、或具有其1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代的序列、或其任何功能形式；和CDR3，其具有SEQ ID NO:15中所示的序列、或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性同时保留其基本生物学活性的序列、或具有其1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代的序列、或其任何功能形式。

在某些实施方式中，scFv包括：1)VH，所述VH包括：包括SEQ ID NO:10中所示的序列的HCDR1、包括SEQ ID NO:11中所示的序列的HCDR2、包括SEQ ID NO:12中所示的序列的HCDR3；以及2)VL，所述VL包括：包括SEQ ID NO:13中所示的序列的LCDR1、包括SEQ ID NO:14中所示的序列的LCDR2、包括SEQ ID NO:15中所示的序列的LCDR3。

在一些实施方式中，scFv包括VH和VL。在某些实施方式中，VH包括SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列、或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性同时保留其基本生物学活性的序列、或具有其1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代的序列、或其任何功能形式。在某些实施方式中，VL包括SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列、或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性同时保留其基本生物学活性的序列、或具有其1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代的序列、或其任何功能形式。在一些实施方式中，scFv包括：VH，所述VH包括SEQ ID NO:16中所示的序列；和VL，所述VL包括SEQ ID NO:17中所示的序列。

在一些实施方式中，scFv在其VL区与VH区之间包括至少0个、1个、2个、3个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个氨基酸残基的肽接头。接头序列可以包括任何天然存在的氨基酸。在某些实施方式中，肽接头包括包含SEQ ID NO:27(GGGGSGGGGSGGGGS)的氨基酸序列。

在一些实施方式中，scFv包括SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。

本领域的技术人员将理解，鉴于对如癌症、传染病或免疫性疾病等各种疾病的所鉴定的标志物的现有知识，可以根据所关注疾病来选择对任何疾病标志物具有特异性的适当的细胞外抗原结合结构域来构建本文提供的CAR。各种疾病标志物包括但不限于如上所述的标志物。

(2)跨膜结构域

本文所述的CAR的跨膜结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白，包括但不限于BAFFR、BLAME(SLAMF8)、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD11a(CD18、ITGAL、LFA-l)、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD19、CD22、CD27、CD28、CD29、CD33、CD37、CD40、CD45、CD49a、CD49d、CD49f、CD64、CD80、CD84、CD86、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、CD134、CD137(4-1BB)、CD150(IPO-3、SLAMF1、SLAM)、CD154、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(Ly9)、CD244(2B4、SLAMF4)、CD278(ICOS)、CEACAM1、CRT AM、GITR、HYEM(LIGHTR)、IA4、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Ra、ITGA1、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIR、LTBR、OX40、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、PAG/Cbp、PSGL1、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAMF7、T细胞受体的α、β或ζ链、TNFR2、VLA1和VLA-6。

在一个实施方式中，本文所述的CAR包括CD8α的跨膜结构域。在某些实施方式中，CD8α的跨膜结构域具有SEQ ID NO:6的序列、或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性同时保留其基本生物学活性的序列、或具有其1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代的序列、或其任何功能形式。

在某些实施方式中，本文所述的CAR的跨膜结构域是合成的，例如，包括占主导的疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在某些实施方式中，本文所述的CAR的跨膜结构域被修饰或设计成避免与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以便最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。

在一些实施方式中，本文所述的CAR进一步包括铰链区，所述铰链区在CAR的细胞外结构域与跨膜结构域之间形成连接。铰链结构域和/或跨膜结构域提供CAR的细胞外抗原结合结构域的细胞表面呈递。

铰链区可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白，包括但不限于BAFFR、BLAME(SLAMF8)、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD11a(CD18、ITGAL、LFA-l)、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD19、CD22、CD27、CD28、CD29、CD33、CD37、CD40、CD45、CD49a、CD49d、CD49f、CD64、CD80、CD84、CD86、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、CD134、CD137(4-1BB)、CD150(IPO-3、SLAMF1、SLAM)、CD154、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(Ly9)、CD244(2B4、SLAMF4)、CD278(ICOS)、CEACAM1、CRT AM、GITR、HYEM(LIGHTR)、IA4、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Ra、ITGA1、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIR、LTBR、OX40、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、PAG/Cbp、PSGL1、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAMF7、T细胞受体的α、β或ζ链、TNFR2、VLA1和VLA-6。

在一些实施方式中，铰链区包括CD8α的铰链区、人类免疫球蛋白(Ig)的铰链区或富含甘氨酸-丝氨酸的序列。

在一些实施方式中，CAR包括CD8α的铰链区。在某些实施方式中，铰链区具有SEQID NO:7的序列、或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性同时保留其基本生物学活性的序列、或具有其1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代的序列、或其任何功能形式。

(3)细胞内信号传导结构域

本文所述的CAR的细胞内信号传导结构域负责激活CAR所放置于的免疫细胞(例如，树突细胞)的多种正常效应功能中的至少一种正常效应功能。在免疫细胞的上下文中使用的术语“效应功能”是指所述细胞的特殊功能，例如，吞噬活性、细胞溶解活性或辅助活性。在某些实施方式中，本文所述的CAR的细胞内信号传导结构域能够在免疫抑制性肿瘤微环境中激活(包括成熟)树突细胞。DC的激活可以响应于各种刺激物而由许多如以下等细胞表面受体诱导：TLR4(A.Iwasaki等人,适应性免疫应答的Toll样受体控制(Toll-likereceptor control of the adaptive immune responses).《自然免疫学(Nat.Immunol.)》5,987-995(2004).)、TNFR(L.M.Sedger等人,从细胞死亡和炎症的介质到治疗巨头-过去、现在和未来(From mediators of cell death and inflammation to therapeuticgiants–past,present and future).《细胞因子与生长因子综述(Cytokine GrowthFactor Rev.)》25,453-472(2014).)、IFNγR(M.Z.Jianping Pan等人,干扰素-γ是树突细胞成熟的自分泌介质(Interferon-γis an autocrine mediator for dendritic cellmaturation).《免疫学快报(Immunol.Lett.)》94,141-151(2004).)、Dectin-1(T.S.HelenS.等人,Dectin-1在巨噬细胞和树突细胞中对CARD9的不同利用(Differentialutilization of CARD9 by Dectin-1in macrophages and dendritic cells).《免疫学杂志(J Immunol.)》182,1146–1154(2009))和FcγR(M.Guilliams等人,树突细胞和巨噬细胞中Fcγ受体的功能(The function of Fcγreceptors in dendritic cells andmacrophages).《自然综述免疫学(Nat.Rev.Immunol.)》14,94-108(2014).；T.H.Flinsenberg,Fc受体抗原靶向增强人类血液和淋巴组织BDCA-3树突细胞的交叉呈递(Fc receptor antigen targeting potentiates cross-presentation by human bloodand lymphoid tissue BDCA-3dendritic cells).《血液(Blood)》120,26(2012).)。这些DC激活受体在其细胞质结构域中具有基于酪氨酸的免疫受体激活基序(ITAM)，所述基于酪氨酸的免疫受体激活基序触发激活信号级联以激活DC。如本文所使用的，术语“细胞质结构域”是指蛋白质的位于细胞质内的全长结构域或其任何片段，例如，长度为全长结构域的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的片段。

本文所述的CAR的细胞内信号传导结构域可以包括选自由以下组成的组的树突细胞激活受体的细胞质结构域：RIG-1、NLRP10、DEC-205、BDCA-2、CD86、4-1BBL、OX40L、CD40、IFNAR、TLR4、TNFR(例如，TNFR2)、IFNγR、Dectin-1和FcγR或其组合。在某些实施方式中，本文所述的CAR的细胞内信号传导结构域包括Dectin-1的细胞质结构域和FcγR的细胞质结构域。

在某些实施方式中，Dectin-1的细胞质结构域和FcγR的细胞质结构域串联连接。在某些实施方式中，编码Dectin-1的细胞质结构域的多核苷酸位于编码FcγR的细胞质结构域的多核苷酸的上游。在某些实施方式中，编码Dectin-1的细胞质结构域的多核苷酸位于编码FcγR的细胞质结构域的多核苷酸的下游。

Dectin-1的细胞质结构域可以包括SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列、或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性同时保留其基本生物学活性的序列、或具有其1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代的序列、或其任何功能形式。

FcγR的细胞质结构域可以包括SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列、或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性同时保留其基本生物学活性的序列、或具有其1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代的序列、或其任何功能形式。

在某些实施方式中，本文所述的CAR的细胞内信号传导结构域包括SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列、或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性同时保留其基本生物学活性的序列、或具有其1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代的序列、或其任何功能形式。

在某些实施方式中，本文所述的CAR的细胞内信号传导结构域包括由SEQ ID NO:4中所示的核酸序列编码的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性同时保留其基本生物学活性的序列。

(4)共刺激信号传导结构域

在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域进一步包括共刺激信号传导结构域。

在一些实施方式中，共刺激信号传导结构域来源于共刺激分子的细胞内结构域。

共刺激分子的实施例包括B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、CD2、CD4、CD8α、CD8β、CD7、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD18、CD19、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD83、CD84、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、CD127、CD137(4-1BB)、CD150(SLAM、SLAMF1、IPO-3)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(Ly9)、CD244(SLAMF4、2B4)、CEACAM1、CRTAM、CDS、OX40、PD-l、ICOS、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-l、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、LAT、LFA-l、LIGHT、LTBR、NKG2C、NKG2D、NKp44、NKp30、NKp46、NKp80(KLRF1)、PAG/Cbp、PSGL1、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNFR2、TRANCE/RANKL、VLA1、VLA-6、其任何衍生物、变体或片段、具有相同功能能力的共刺激分子的任何合成序列，以及其任何组合。

在一些实施方式中，本文所述的CAR的共刺激信号传导结构域包括共刺激分子CD137(4-1BB)、CD28、OX40或ICOS的细胞内结构域。在一些实施方式中，本文所述的CAR的共刺激信号传导结构域具有SEQ ID NO:58的序列或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。

其它区

在一些实施方式中，所述CAR进一步包括信号肽。在一些实施方式中，所述信号肽包括CD8α的信号肽。在一些实施方式中，CD8α的信号肽包括SEQ ID NO:5的序列、或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性同时保留其基本生物学活性的序列、或具有其1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守性取代的序列、或其任何功能形式。

肿瘤抗原

肿瘤抗原是肿瘤细胞中产生的抗原性物质，即其在宿主体内触发免疫应答。体内的正常蛋白质由于自身耐受性而没有抗原性，所述自身耐受性即其中自身反应性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和产生自身抗体的B淋巴细胞在原代淋巴组织(BM)中被称为“中央”并且在次级淋巴组织(对于T细胞，主要是胸腺，并且对于B细胞，主要是脾脏/淋巴结)中被称为“外周”的过程。因此，任何未暴露于免疫系统的蛋白质都会触发免疫应答。这可以包括与免疫系统充分隔离的正常蛋白质、通常以极少量产生的蛋白质、通常仅在某些发育阶段产生的蛋白质或由于突变而改变结构的蛋白质。

肿瘤抗原可以基于其表达模式而大致分为两种类别：肿瘤特异性抗原(TSA)，所述肿瘤特异性抗原只存在于肿瘤细胞上并且不存在于任何其它细胞上；和肿瘤相关抗原(TAA)，所述肿瘤相关抗原存在于一些肿瘤细胞和一些正常细胞上。更确切地说，肿瘤抗原包括突变的致癌基因和肿瘤抑制基因的产物；其它突变基因的产物；过度表达或异常表达的细胞蛋白；由致癌病毒产生的肿瘤抗原；癌胚胎抗原；改变的细胞表面糖脂和糖蛋白；以及细胞类型特异性分化抗原。

肿瘤细胞中产生的由于突变而具有异常结构的任何蛋白质可以充当肿瘤抗原。此类异常蛋白是由于相关基因的突变而产生的。导致异常蛋白产生的原癌基因和肿瘤抑制因子的突变是产生肿瘤的原因，并且因此此类异常蛋白被称为肿瘤特异性抗原。肿瘤特异性抗原的实例包括ras和p53基因的异常产物。相比之下，与肿瘤形成无关的其它基因的突变可能导致异常蛋白的合成，所述异常蛋白是肿瘤相关抗原。因此，在一些实施方式中，本文所述的肿瘤抗原为由突变基因(即肿瘤基因)编码的肽或多肽或其片段。在一些实施方式中，所述肿瘤基因选自p53、ras、β-连环蛋白、BRCA1/2、CDK4、CML66、纤连蛋白、MART-2、TGF-βRII。

在人类肿瘤中，p53和RAS是最经常突变的基因。超过50％的侵袭性肿瘤具有p53突变。p53突变可以触发身体针对突变位点产生特异性细胞毒性T细胞，从而使其成为肿瘤疫苗的理想靶标。在p53的多种突变类型中，R175H、R248W、R273H是最常见的三个热点突变。在KRAS基因突变中，97％是第12或13个氨基酸的突变。最重要的是G12D、G12C、G12V和G13D。结构研究表明，这些基因突变大多干扰了KRAS水解GTP的能力。

肿瘤抗原的其它实例包括组织分化抗原、突变蛋白抗原、致癌病毒抗原、癌症-睾丸抗原和血管或基质特异性抗原。组织分化抗原是对某一类型的组织具有特异性的抗原。突变蛋白抗原可能对癌细胞更有特异性，因为正常细胞不应该含有这些蛋白质。正常细胞将在其MHC分子上显示正常蛋白抗原，而癌细胞将显示突变型式。一些病毒蛋白与形成癌症(肿瘤形成)相关，并且一些病毒抗原也是癌症抗原。癌症-睾丸抗原是主要在睾丸的生殖细胞中表达的抗原，但所述抗原也在胎儿卵巢和滋养层中表达。一些癌细胞异常地表达这些蛋白质，并且因此呈递这些抗原，从而引起对这些抗原具有特异性的T细胞进行攻击。这种类型的示例抗原是CTAG1B和MAGEA1。

通常以非常低的量产生但在肿瘤细胞中产量显著增加的蛋白质会触发免疫应答。此类蛋白质的实例是产生黑色素所需的酪氨酸酶。酪氨酸酶通常以极小的量产生，但其在黑素瘤细胞中的水平非常高。

癌胚胎抗原是肿瘤抗原的另一重要类别。实例是甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)。这些蛋白质通常产生于胚胎发育的早期阶段，并在免疫系统完全发育时消失。因此，不会针对这些抗原产生自身耐受性。

感染上肿瘤病毒(例如，EBV和HPV)的细胞也会产生异常蛋白。被这些病毒感染的细胞含有潜伏性病毒DNA，所述潜伏性病毒DNA会被转录，并且所得蛋白质会产生免疫应答。

因此，在一些实施方式中，本文所公开的DC疫苗中使用的肿瘤抗原选自CEA、未成熟层粘连蛋白受体、TAG-72、HPV E6、HPV E7、BING-4、钙激活的氯离子通道2、细胞周期素-B1、9D7、Ep-Cam、EphA3、GPC3、Her2/neu、端粒酶、间皮素、SAP-2和存活。

除蛋白质外，如细胞表面糖脂和糖蛋白等其它物质也可能在肿瘤细胞中具有异常结构，并且因此可能是免疫系统的靶标。

p53

肿瘤蛋白p53，又称p53、细胞肿瘤抗原p53、磷蛋白p53、肿瘤抑制因子p53、抗原NY-CO-13或转化相关蛋白53(TRP53)，是由各种生物体内的同源基因编码的蛋白质的任何同种型，如TP53(人类)和Trp53(小鼠)。这种同源物(最初被认为是，而且经常被说成是单一蛋白质)在多细胞生物中是至关重要的，它可以防止癌症形成并且因此起肿瘤抑制因子的功能。如此，p53由于其通过预防基因组突变来保持稳定性的作用而被描述为“基因组的守护者”。因此，TP53被分类为肿瘤抑制基因。

名称p53是在1979年给出的，用于描述表观分子质量；SDS-PAGE分析表明，它是53千道尔顿(kDa)蛋白质。然而，按氨基酸残基的质量之和计，全长p53蛋白(p53α)的实际质量仅为43.7kDa。此差异是由于所述蛋白质中大量的脯氨酸残基引起的，所述大量的脯氨酸残基使所述蛋白质在SDS-PAGE上的迁移减慢，从而使其看起来比实际重。除了全长蛋白外，人类TP53基因编码至少15种蛋白质同种型，其大小在3.5到43.7kDa的范围内。所有这些p53蛋白被称为p53同种型。TP53基因是人类癌症中最频繁的突变基因(＞50％)，这表明TP53基因在预防癌症形成方面起着关键作用。TP53基因编码的蛋白质与DNA结合并调控基因表达，以预防基因组的突变。

在人类中，TP53基因定位于17号染色体的短臂(17p13.1)上。所述基因跨度为20kb，其中具有非编码外显子1和10kb的非常长的第一内含子。编码序列含有五个区，所述五个区在脊椎动物中表现出高度的保守性，主要是在外显子2、5、6、7和8中，但在无脊椎动物中发现的序列只表现出与哺乳动物TP53的轻微相似性。已经在大多数可获得完整基因组数据的哺乳动物中鉴定了TP53直向同源物。

在人类中，常见的多态性涉及在密码子位置72处用精氨酸取代脯氨酸。许多研究探讨了这种变异与癌症易感性之间的基因联系；然而，结果一直存在争议。例如，2009年的一项荟萃分析未能显示与宫颈癌的联系。2011年的一项研究发现，TP53脯氨酸突变确实对男性患胰腺癌的风险具有深远影响。一项针对阿拉伯女性的研究发现，TP53密码子72处的脯氨酸纯合性与患乳腺癌的风险降低相关。一项研究表明，TP53密码子72多态性、MDM2SNP309和A2164G可能共同与非口咽癌易感性相关，并且MDM2 SNP309与TP53密码子72的组合可能加速女性非口咽癌的发展。2011年的一项研究发现，TP53密码子72多态性与肺癌的风险增加相关。

2011年的荟萃分析发现，TP53密码子72多态性与结肠直肠癌风险和子宫内膜癌风险两者并无明显的关联。2011年一项针对巴西出生群组的研究发现，非突变精氨酸TP53与没有家族癌症史的个体之间存在关联。另一项2011年的研究发现，p53纯合(Pro/Pro)基因型与肾细胞癌的风险显著增加相关。

KRAS

KRAS(Kirsten大鼠肉瘤病毒)或称K-Ras是RAS/MAPK途径中的蛋白质，所述蛋白质将信号从细胞外传递到细胞核。这些信号指示细胞生长和分裂(增殖)或成熟并承担特殊功能(分化)。K-Ras蛋白是GTP酶，所述GTP酶意指其将称为GTP的分子转化为另一种称为GDP的分子。以这种方式，K-Ras蛋白如由GTP和GDP分子打开和关闭的开关那样起作用。为了传输信号，它必须通过附着(结合)到GTP分子才能被打开。当K-Ras蛋白将GTP转化为GDP时，K-Ras蛋白被关闭(失活)。当所述蛋白质与GDP结合时，所述蛋白质不会向细胞核传递信号。所述蛋白质被称为KRAS，因为它首先被鉴定为Kirsten大鼠肉瘤病毒中的致癌基因。所述病毒致癌基因来源于细胞基因组。因此，细胞基因组中的KRAS基因被称为原癌基因。

KRAS的基因产物是以p21 GTP酶的形式被首次发现的。与ras亚家族的其它成员一样，KRAS蛋白是GTP酶并且是许多信号转导途径中的早期参与者。由于异戊二烯基团在其C端上的存在，KRAS通常连接到细胞膜。哺乳动物细胞中存在由使用替代外显子4(分别为外显子4A和4B)产生的KRAS基因的两种蛋白质产物：K-Ras4A和K-Ras4B；这些蛋白质在其C端区具有不同的结构，并使用不同的机制定位到包括质膜在内的细胞膜。

KRAS的单个氨基酸取代，特别是单个核苷酸取代，可能导致激活突变。产生的转化蛋白与各种恶性肿瘤有关，所述恶性肿瘤包括肺腺癌、粘液性腺瘤、胰腺导管癌和结肠直肠癌。已发现若干种系KRAS突变与努南综合征(Noonan syndrome)和心-面-皮肤综合征(cardio-facio-cutaneous syndrome)相关。体细胞KRAS突变在白血病、结肠直肠癌、胰腺癌和肺癌中的发生率很高。

MUC1

粘蛋白1，细胞表面相关(MUC1)，也称为多态性上皮粘蛋白(PEM)或上皮膜抗原或EMA，是一种由人类MUC1基因编码的粘蛋白。MUC1是一种糖蛋白，其细胞外结构域具有广泛的O-连接的糖基化。粘蛋白排列在肺、胃、肠、眼睛和若干其它器官的上皮细胞的顶表面。粘蛋白通过病原体与细胞外结构域中的寡糖结合，从而防止病原体到达细胞表面来保护身体免受感染。MUC1的过度表达通常与结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胰腺癌相关。JoyceTaylor-Papadimitriou在她关于乳腺和卵巢肿瘤的工作期间鉴定并表征了所述抗原。MUC1是粘蛋白家族的成员，并且编码膜结合的糖基化磷蛋白。MUC1的核心蛋白质量为120-225kDa，随着糖基化增加到250-500kDa。它超出细胞表面200-500nm。

所述蛋白质通过跨膜结构域锚定到许多上皮细胞的顶表面。跨膜结构域之外是SEA结构域，所述SEA结构域含有用于释放大细胞外结构域的切割位点。粘蛋白的释放由脱落酶执行。细胞外结构域包括20个氨基酸可变数目串联重复序列(VNTR)结构域，其中重复序列的数目在不同个体中在20到120的范围内。这些重复序列富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸残基，从而允许重度o-糖基化。

已经报道了编码此基因的不同同种型的多个可替代地剪接的转录物变体，但仅确定了一些转录物变体的全长性质。

MUC1在内质网中被切割成两部分，胞质尾区包括跨膜结构域和细胞外结构域。这些结构域以非共价方式紧密缔合。这种紧密的非共价缔合不会被利用尿素、低pH、高盐或煮沸进行的处理所破坏。用十二烷基硫酸钠处理会触发亚基的离解。MUC1的胞质尾区长72个氨基酸并且含有若干个磷酸化位点。所述蛋白质通过与病原体结合而发挥保护作用，并在细胞信号传导能力中发挥作用。

这种蛋白质的过度表达、异常的细胞内定位和糖基化的变化与癌相关。例如，CanAg肿瘤抗原是MUC1的新型糖型。在细胞核中，蛋白质MUC1调节转录因子复合物的活性，所述转录因子复合物在肿瘤诱导的宿主免疫变化中具有记录的作用。

PSMA

前列腺特异性膜抗原(PSMA)、谷氨酸羧肽酶II(GCPII)(也称为N-乙酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酸肽酶I(NAALAD酶I)或NAAG肽酶)是在人中由FOLH1(叶酸水解酶1)基因编码的酶。人PSMA含有750个氨基酸并且重量为大约84kDa。PSMA是存在于膜中的锌金属酶。大部分酶存在于细胞外空间。PSMA是II类膜糖蛋白。根据向右的反应方案，其催化N-乙酰天冬氨酰谷氨酸(NAAG)水解成谷氨酸和N-乙酰天冬氨酸(NAA)。

神经科学家在他们的研究中主要使用术语NAALAD酶，而那些研究叶酸代谢的科学家使用叶酸水解酶，并且那些研究前列腺癌或肿瘤学的科学家使用PSMA，所有这些术语都是指同一蛋白质。

PSMA主要在身体的四种组织中表达，所述四种组织包括前列腺上皮、肾脏近端小管、小肠的空肠刷状缘和神经系统的神经节。

实际上，编码表达PSMA的基因的cDNA的初始克隆是用来自前列腺肿瘤细胞系LNCaP的RNA完成的。PSMA与转铁蛋白受体具有同源性并经历内吞作用，但尚未鉴定用于诱导内化的配体。发现PSMA与小肠中负责从聚γ谷氨酸叶酸中去除γ连接的谷氨酸的膜蛋白相同。这使得能够释放叶酸，然后可以将所述叶酸输送到体内以用作维生素。这导致PSMA的克隆基因组命名为叶酸水解酶的FOLH1。

PSMA的细胞外部分的三个结构域——蛋白酶、顶端和C端结构域——在底物识别中协作。蛋白酶结构域是一个中心的七链混合β-折叠。β-折叠侧接10个α-螺旋。顶端结构域定位于蛋白酶结构域的中心β-折叠的第一链与第二链之间。顶端结构域形成促进底物结合的口袋。C端结构域是上-下-上-下四螺旋束。

中心口袋的深度为大约2纳米，并且从细胞外空间通向活性位点。此活性位点含有两个锌离子。在抑制期间，每个锌离子充当2-PMPA或磷酸盐中的氧的配体。PSMA中还存在一个配位的远离活性位点的钙离子。有人提出钙将蛋白酶和顶端结构域保持在一起。另外，人PSMA具有十个潜在的糖基化位点，并且这些位点中的许多位点(包括一些远离催化结构域的位点)影响PSMA水解NAAG的能力。

FOLH1基因具有多个潜在的起始位点和剪接形式，从而导致基于亲本组织的膜蛋白结构、定位和羧肽酶活性存在差异。

人PSMA在前列腺中高度表达，表达水平大约是大多数其它组织中的一百倍。在一些前列腺癌中，PSMA是上调程度第二的基因产物，比非癌性前列腺细胞中的水平高8到12倍。由于这种高表达，PSMA被开发为用于一些癌症的治疗和成像的潜在生物标志物。在人前列腺癌中，表达程度较高的肿瘤与较快的进展时间和更大百分比的复发患者相关。使用具有降低的PSMA水平的前列腺癌和乳腺癌细胞系的体外研究显示细胞的增殖、迁移、侵袭、粘附和存活期显著降低。

PSMA是若干种用于前列腺癌的核医学显像剂的靶标。卡罗单抗喷地肽(Capromabpentide)(以PROSTASCINT出售)与铟-111结合以通过γ相机进行检测。用于成像和治疗的第二代抗体和低分子量配体正在开发中。PSMA也可以在实验上用于靶向治疗。镥-177是与PSMA结合以治疗前列腺肿瘤的β发射体。除了人类前列腺和前列腺癌外，PSMA在肿瘤新血管系统中高度表达，但在包括肾、乳腺和结肠在内的所有类型的实体瘤的对应正常血管系统中不表达。

S100P

S100钙结合蛋白P(S100P)是在人体中由S100P基因编码的蛋白质。由此基因编码的蛋白质是含有2个EF-手钙结合基序的S100蛋白质家族的成员。S100蛋白定位于许多各种不同细胞的细胞质和/或细胞核中，并参与如细胞周期进程和分化等许多细胞过程的调节。S100基因包括作为簇定位于染色体1q21上的至少13个成员；然而，此基因定位于4p16处。此蛋白质除了结合Ca²⁺外，还结合Zn²⁺和Mg²⁺。此蛋白质可能在前列腺癌的病因中起作用。已经证明S100P与EZR和RAGE相互作用。S100P与RAGE之间的相互作用被色甘酸和喷他脒破坏。

载体

在另一方面，本公开提供了一种或多种载体，其包括编码如本文所述的CAR的第一多核苷酸和编码如本文所述的肿瘤抗原的第二多核苷酸。可以将编码CAR和/或肿瘤抗原的多核苷酸插入到本领域已知的不同类型的载体中，所述载体例如质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、来源于动物病毒的病毒载体、粘粒、转座子、定点插入载体(例如，CRISPR、锌指核酸酶、TALEN)、体外转录的RNA或自杀式表达载体。在一些实施方式中，载体是DNA或RNA。

在一些实施方式中，载体是表达DNA载体(例如，质粒、病毒)。当表达DNA载体瞬时引入细胞中时，CAR的mRNA将在宿主细胞中转录。由于DNA载体和mRNA会随着细胞分裂而被稀释，所以CAR的表达不会是永久性的。在一个实施方式中，DNA载体可以以CAR的瞬时表达的形式引入到细胞中。

在一些实施方式中，载体是病毒载体。病毒载体可以来源于例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒和慢病毒。有用的病毒载体一般含有在至少一种生物体内起作用的复制起点、启动子、限制性核酸内切酶位点和一个或多个可选择标志物。在一些实施方式中，载体是慢病毒载体。慢病毒载体对于将编码CAR的多核苷酸长期、稳定地整合到非增殖细胞的基因组中以使得CAR在宿主细胞(例如，宿主T细胞)中稳定表达特别有用。在一些实施方式中，载体是来自Addgene的lenti-Cas9载体。

在一些实施方式中，载体是RNA(例如，mRNA)。由于RNA会随着细胞分裂而被稀释，所以RNA的表达不会是永久性的。在一个实施方式中，可以将体外转录的RNA CAR以瞬时表达的形式引入细胞。

在一些实施方式中，载体是基于转座子的表达载体。转座子是可以改变其在基因组内位置的DNA序列。在转座子系统中，编码CAR的多核苷酸侧接末端重复序列，所述末端重复序列可由介导转座子移动的转座酶识别。转座酶可以作为蛋白质共递送，在与CAR相同的载体上编码，或者在单独的载体上编码。转座子系统的非限制性实例包括SleepingBeauty、Piggyback、Frog Prince和Prince Charming。

在一些实施方式中，多核苷酸可操作地连接到载体中的用于表达CAR的至少一个调控多核苷酸元件。典型的载体含有各种调控多核苷酸元件，例如调控插入的多核苷酸表达的元件(例如，转录和翻译终止子、起始序列和启动子)、调控载体在宿主细胞中复制的元件(例如，复制起点)以及调控载体整合到宿主基因组中的元件(例如，转座子的末端重复序列)。CAR的表达可以通过将编码CAR的多核苷酸可操作地连接到启动子并将构建体掺入到载体中来实现。组成型启动子(如CMV启动子、SV40启动子和MMTV启动子)或诱导型启动子(如金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子和孕酮启动子)都可考虑用于本公开。在一些实施方式中，载体是表达载体，表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；其它用于表达的元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中供应。

为了评估CAR的表达，载体还可以包括可选择标志物基因或报告基因或两者，以用于鉴定和选择载体所引入的细胞。有用的可选标志物包括例如抗生素抗性基因，如neo等。有用的报告基因包括例如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因。

具有促进稳定性和/或翻译效率能力的化学结构也可以用于RNA中。用于产生用于转染的RNA的方法可以涉及用专门设计的引物对模板进行体外转录(IVT)，然后添加polyA，以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸和通常长度为50-2000个碱基的polyA尾区的构建体。这样产生的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。

可以使用多种不同方法中的任何一种方法将RNA引入到靶细胞中，例如，可用的方法包括但不限于电穿孔或基因脉冲仪II(Gene Pulser II)(科罗拉多州丹佛的伯乐公司(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(德国汉堡的艾本德公司(Eppendorf,HamburgGermany))、使用脂质转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包封、肽介导的转染或如“基因枪”等生物弹道颗粒递送系统(biolistic particle delivery system)。

载体可以通过本领域已知的任何方法，例如通过物理、化学或生物手段引入到宿主细胞，例如哺乳动物细胞中。用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、微注射、电穿孔等。生物方法包括使用病毒载体，特别是逆转录病毒载体，将基因插入到哺乳动物，例如人类细胞中。化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒，以及基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。

产生DC肿瘤疫苗的方法

在另一方面，本公开提供了一种制备如本文所述的DC肿瘤疫苗的方法。也可以应用本领域已知的许多产生CAR-T细胞的手段来产生DC肿瘤疫苗。用于产生CAR-T细胞的方法已在例如Zhang等人,工程化CAR-T细胞(Engineering CAR-T cells),《生物标志物研究(Biomarker Research)》(2017)5:22中描述。在一些实施方式中，所述方法包括在适合于表达CAR和肿瘤抗原的条件下向起始细胞引入包括编码CAR的第一多核苷酸和编码肿瘤抗原的第二多核苷酸的载体。本文所提供的方法可以包括选自以下的多个步骤之一：获得起始细胞(即来自来源的细胞)；培养(包括扩增，任选地包括成熟)起始细胞；以及对细胞进行基因修饰。如上所述，起始细胞可以是树突细胞或其前体细胞或祖细胞。

细胞来源

本文提供的DC肿瘤疫苗可以从任何来源获得。在某些实施方式中，本文提供的DC肿瘤疫苗来源于从受试者，例如人类受试者，分离的免疫细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是从所关注受试者或血库获得，所述所关注受试者如疑似患有特定疾病或病状的受试者、疑似具有特定疾病或病状倾向的受试者、将接受、正在接受或已经接受特定疾病或病状治疗的受试者、作为健康志愿者或健康捐赠者的受试者。在一些实施方式中，免疫细胞从对如CAR-T疗法等免疫疗法的应答性较差的癌症受试者获得。

细胞对于所关注受试者可以是自体的或同种异体的。同种异体供体细胞可能与人类白细胞抗原(HLA)不相容，因此可以处理同种异体细胞以降低免疫原性。

免疫细胞可以从它们存在于受试者中的任何位置收集，所述位置包括但不限于血液、脐带血、脾脏、胸腺、淋巴结、胸腔积液、脾组织、肿瘤和骨髓。分离的免疫细胞可以直接使用，或者其可以如通过冷冻而储存一定时间段。

在一些实施方式中，经工程化的细胞通过对树突细胞或其前体细胞或祖细胞进行工程化来获得。树突细胞或其前体细胞或祖细胞可以使用技术人员已知的任何数量技术(如单采术)获自从受试者收集的血液。在一些实施方式中，树突细胞或其前体细胞或祖细胞源自外周血细胞(例如，外周血单核细胞，如单核细胞)、骨髓细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)。

可以使用先前描述的方法检查树突细胞的存在。例如，可以通过测量CD11c、CD80、CD86、MHC/HLA分子和/或CCR7分子的表达来鉴定树突细胞，所述分子可以使用如免疫化学、免疫分型、流式细胞术、Elispot测定、典型的四聚体染色和细胞内细胞因子染色等技术进行检测。

基因修饰

对DC或其前体细胞或祖细胞进行基因修饰可以通过用本文提供的载体转导基本上同源的DC群体来完成。在一些实施方式中，采用逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体)来将多核苷酸引入到DC中。例如，可以将本文提供的多核苷酸克隆到慢病毒载体中，并且可以从其内源启动子、从慢病毒长末端重复序列或从对所关注靶细胞类型具有特异性的启动子驱动表达。用于递送病毒载体的常见递送方法包括但不限于电穿孔、微注射、基因枪和磁转染。可以将当前公开的CAR和肿瘤抗原放置在任何内源性基因座处。

还可以采用非病毒方法来对DC或其前体细胞或祖细胞进行基因修饰。例如，可以通过以下来将核酸分子引入到DC或其前体细胞或祖细胞中：在存在脂质转染的情况下施用核酸(Ono等人,《神经科学快报(Neuroscience Letters)》17:259,1990；Feigner等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》84:7413,1987；Staubinger等人,《酶学方法(Methods in Enzymology)》101:512,1983；Brigham等人,《美国医学科学杂志(Am.J.Med.Sci.)》298:278,1989)；唾液酸血清类粘蛋白聚赖氨酸(sialoorosomucoidpolylysine)缀合(Wu等人,《生物化学杂志(Journal of BiologicalChemistry)》263:14621,1988；Wu等人,《生物化学杂志》264:16985,1989)；或在手术条件下的微注射(Wolff等人,《科学(Science)》247:1465,1990)。其它用于基因转移的非病毒手段包括使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合进行体外转染。脂质体对于将DNA递送到细胞中而言也可能具有潜在的益处。将正常基因移植到受试者的受影响组织中也可以通过将正常核酸离体转移到可培养的细胞类型(例如，自体或异源原代细胞或其子代)中、之后将细胞(或其后代)注射到靶向组织中或全身性注射来完成。重组受体也可以使用转座酶或靶向核酸酶(例如，锌指核酸酶、大范围核酸酶或TALE核酸酶、CRISPR)衍生或获得。

在某些实施方式中，本文提供的DC肿瘤疫苗通过在施用前将包括编码本文提供的CAR和肿瘤抗原的多核苷酸的载体转染到DC中来制备。在某些实施方式中，本文提供的DC肿瘤疫苗可以通过用例如病毒载体转染DC的前体细胞或祖细胞，然后将经转染的细胞分化成DC来制备。本文提供的DC肿瘤疫苗表现出CAR在细胞表面的表达和肿瘤抗原的表达得到改善。DC的前体细胞或祖细胞可以源自外周血细胞(例如，外周血单核细胞，如单核细胞，例如THP-1细胞、外周单核细胞)、骨髓细胞。DC的前体细胞或祖细胞也可以是诱导性多能干细胞(iPSC)。

在另一方面，本公开提供了一种通过上述方法离体产生的细胞群体。在某些实施方式中，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的细胞群体表达可检测水平的本文提供的CAR多肽和肿瘤抗原。在某些实施方式中，至少85％的细胞群体表达可检测水平的本文提供的CAR多肽和肿瘤抗原。

药物组合物

在另一方面，本公开还提供了一种包含本文提供的DC肿瘤疫苗的群体和药学上可接受的介质的药物组合物。如本文所使用的，术语“药物组合物”是指为药物使用而调配的组合物。

“药学上可接受的介质”是指药物调配物中除了活性成分以外的对受试者在生物上可接受且无毒的成分。用于本文公开的药物组合物的药学上可接受的介质可以包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性或非水性媒剂、抗微生物剂、缓冲剂、抗氧化剂、等渗剂、悬浮剂/分配剂、多价螯合剂或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、或其各种组合。

本公开的药物组合物可以使用本领域已知的各种技术来制备，参见例如《雷明顿：药学科学与实践(Remington,The Science and Practice of Pharmacy)》(第21版2005)。简而言之，在使用或储存前，将DC肿瘤疫苗或其群体与合适的介质混合。合适的药学上可接受的介质通常包括有助于以下方面的惰性物质：1)向受试者施用药物组合物，2)将药物组合物加工成可递送制剂，和/或3)在施用前储存药物组合物。在某些实施方式中，药学上可接受的介质包括可以稳定、优化或改变调配物的形式、稠度、粘度、pH、药代动力学和/或溶解度的药剂。此类药剂包括但不限于缓冲剂、润湿剂、乳化剂、稀释剂、包封剂和皮肤渗透增强剂，例如盐水、缓冲盐水、葡萄糖、精氨酸、蔗糖、水、甘油、乙醇、山梨醇、葡聚糖、羧甲基纤维素钠和其组合。

示例性药学上可接受的介质包括糖(例如，乳糖、葡萄糖和蔗糖)、淀粉(例如，玉米淀粉和马铃薯淀粉)、纤维素和其衍生物(例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素)、粉末状黄蓍胶、麦芽、明胶、润滑剂(例如，硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石粉)、赋形剂(例如，可可脂和栓剂蜡)、油(例如，花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、乙二醇(例如，丙二醇)、多元醇(例如，甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG))、酯(例如，油酸乙酯和月桂酸乙酯)、琼脂、缓冲剂(例如，氢氧化镁和氢氧化铝)、藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇、pH缓冲溶液、聚酯、聚碳酸酯、聚酸酐、填充剂(例如，多肽和氨基酸、血清醇(例如，乙醇)、(无菌)磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和其它用于药物调配物的无毒相容性物质。

本文提供的药物组合物可以全身或直接施用于受试者，以诱导和/或增强对抗原的免疫应答，和/或治疗和/或预防肿瘤、病原体感染或传染病。在某些实施方式中，本文提供的药物组合物被直接注射到所关注的肿瘤或器官中。在其它实施方式中，本文提供的药物组合物例如通过施用于循环系统(例如，肿瘤脉管系统)而被间接地施用于所关注器官。

本文提供的药物组合物可以至少包含约1×10⁵、约2×10⁵、约3×10⁵、约4×10⁵或约5×10⁵DC肿瘤疫苗(即经工程化的细胞)的群体。本领域技术人员可以使用各种众所周知的方法(例如，荧光激活细胞分选(FACS))容易地测定本文提供的DC肿瘤疫苗在群体中的百分比。本文提供的DC肿瘤疫苗在群体中的百分比(也称为“纯度”)的合适范围可以是约50％到约55％、约55％到约60％和约65％到约70％、约70％到约75％、约75％到约80％、约80％到约85％、约85％到约90％、约90％到约95％、或约95％到约100％。

在某些实施方式中，向接受者施用至少1×10³个细胞/kg体重、至少5×10³个细胞/kg体重、至少1×10⁴个细胞/kg体重、至少5×10⁴个细胞/kg体重、至少1×10⁵个细胞/kg体重、至少5×10⁵个细胞/kg体重、至少1×10⁶个细胞/kg体重、至少5×10⁶个细胞/kg体重、至少1×10⁷个细胞/kg体重、至少5×10⁷个细胞/kg体重、至少1×10⁸个细胞/kg体重、至少2×10⁸个细胞/kg体重、至少3×10⁸个细胞/kg体重、至少4×10⁸个细胞/kg体重、至少5×10⁸个细胞/kg体重或至少6×10⁸个细胞/kg体重。本领域技术人员将理解，本文提供的药物组合物的剂量可以基于接受者的各种因素，如体型、年龄、性别、体重和病状来确定。本领域技术人员从本公开和本领域知识中可以容易地确定剂量。本领域技术人员可以很容易地确定本文提供的DC肿瘤疫苗的数量，以及组合物中和待在本公开的方法中施用的任选添加剂、媒剂、介质和/或载体的量。通常，添加剂(如果存在的话)以0.001％到50％(重量)的量存在于磷酸盐缓冲盐水溶液中，并且活性成分(例如，本文提供的经修饰/重组细胞)以微克到毫克的量级存在，如约0.0001到约5wt％，优选地约0.0001到约1wt％，仍更优选地约0.0001到约0.05wt％或约0.001到约20wt％，优选地约0.01到约10wt％，并且仍更优选地约0.05到约5wt％。将优选的是如通过在合适的动物模型(例如，小鼠)中确定致死剂量(LD)和LD50来确定某一剂量的毒性。还将优选的是确定施用组合物的定时，所述定时引起合适的应答。此类确定不需要根据本领域技术人员的知识和本公开进行过度实验。

本文提供的药物组合物可以通过例如注射(例如，全身注射、局部注射、静脉内注射、淋巴内注射)或导管施用。在某些实施方式中，本文提供的药物组合物可以通过皮下、皮内、瘤内、髓内或腹膜内施用。在一个实施方式中，本公开的细胞组合物优选地通过静脉内注射施用。施用可以是自体的或异源的。例如，DC肿瘤疫苗可以通过对来自一个受试者的起始细胞进行修饰来获得，并且施用于同一受试者或不同受试者。本文提供的药物组合物可以被调配成可注射的单位剂型(例如，溶液、悬浮液、乳剂)以供施用。本文提供的药物组合物的施用可以作为单个事件发生，或者可以在治疗的时间过程中发生，如每天、每周、每两周或每月。本文提供的药物组合物可以与如化学治疗剂等另一种药剂、另一种形式的免疫疗法(例如，CAR-T疗法)或放射疗法组合施用(例如，在其之前、之后或同时施用)。同时施用可以通过施用单独的组合物发生，所述单独的组合物各自含有本文提供的DC肿瘤疫苗和如化学治疗剂等另一种药剂、另一种形式的免疫疗法(例如，CAR-T疗法)或放射疗法。同时施用可以通过施用一种组合物发生，所述一种组合物含有本文提供的DC肿瘤疫苗和如化学治疗剂等另一种药剂、另一种形式的免疫疗法(例如，CAR-T疗法)或放射疗法。

使用方法

本公开还提供了本文提供的DC肿瘤疫苗的各种用途。

一般用途

在一方面，本公开提供了一种用于治疗患者的癌症的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的本文提供的DC肿瘤疫苗。在一些实施方式中，用于治疗疾病或病理学病状的方法包括：提供从受试者分离的DC、或衍生自从受试者分离的细胞(例如，外周血细胞、骨髓细胞)的DC、或衍生自iPSC的DC；对DC进行工程化以表达本文提供的CAR和肿瘤抗原，以产生DC肿瘤疫苗；以及将DC肿瘤疫苗输回受试者体内。在一些实施方式中，用于治疗癌症的方法包括：提供DC的前体细胞或祖细胞(例如，外周血细胞、骨髓细胞或iPSC)；对前体细胞或祖细胞进行工程化以表达本文提供的CAR和肿瘤抗原；将经工程化的前体细胞或祖细胞分化为表达本文提供的CAR和肿瘤抗原的DC；以及将表达本文提供的CAR和肿瘤抗原的DC(例如，DC肿瘤疫苗)输回受试者体内。

在一些实施方式中，所述癌症是选自由以下组成的组的实体癌：肾上腺癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、食道癌、眼癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、细支气管肺泡细胞肺癌、间皮瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、口腔癌、卵巢癌、宫颈癌、阴茎癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌。在一些实施方式中，所述癌症是选自由以下组成的组的血液系统恶性肿瘤：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、结外NK/T细胞淋巴瘤、HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、原发性纵膈大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤(MM)。

在一些实施方式中，患有癌症的受试者对癌症疗法(例如，免疫疗法)的应答性较差。

如本文所使用的，术语“免疫疗法”是指刺激免疫系统对抗如癌症等疾病或以一般方式增强免疫系统的疗法类型。免疫疗法包括被动免疫疗法，其通过递送具有已建立的肿瘤免疫反应性的药剂(如效应细胞)来进行，可以直接或间接介导抗肿瘤作用并且不一定依赖于完整的宿主免疫系统(如抗体疗法或CAR-T细胞疗法)。免疫疗法可以进一步包括主动免疫疗法，其中治疗依赖于通过施用免疫应答调节剂来体内刺激内源性宿主免疫系统对病变细胞作出反应。

免疫疗法的实例包括但不限于检查点调节剂、过继性细胞转移、细胞因子、溶瘤病毒和治疗性疫苗。

检查点调节剂可以干扰癌细胞避免免疫系统攻击的能力，并帮助免疫系统对肿瘤做出更强烈的应答。免疫检查点分子可以介导共刺激信号以增强免疫应答，或者可以介导共抑制信号以抑制免疫应答。检查点调节剂的实例包括但不限于PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、A2AR、CD160、2B4、TGFβ、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD47、CD122、ICAM-1、IDO、NKG2C、SLAMF7、SIGLEC7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、1COS、4-1BB、GITR、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、CD3、CD16和CD83。在某些实施方式中，免疫检查点调节剂包括PD-1/PD-L1轴抑制剂。

过继性细胞转移，这是一种试图增强T细胞对抗癌症的天然能力的治疗。在这种治疗中，T细胞取自患者，并在体外扩增和激活。在某些实施方式中，T细胞在体外被修饰为CAR-T细胞。在体外大批量培养抗癌最活跃的T细胞或CAR-T细胞2到8周。在此时间段期间，患者将接受如化学疗法和放射疗法等治疗，以降低身体的免疫力。在这些治疗后，体外培养的T细胞或CAR-T细胞将被回给予患者。在某些实施方式中，免疫疗法是CAR-T疗法。

TIME的破坏

在一方面，本公开提供了一种使用本文提供的DC肿瘤疫苗破坏TIME(例如，将TIME转化为炎性状态)的方法。

在另一方面，本公开还提供了一种在免疫抑制性微环境中诱导免疫细胞增殖、延长免疫细胞存活期和/或增加免疫刺激细胞因子从免疫细胞中表达和/或分泌的方法。免疫刺激细胞因子可以是以下中的一个或多个：TNF-a、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。所述方法包括使免疫抑制性微环境与本文提供的DC肿瘤疫苗接触。免疫细胞可以是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞或中性粒细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是选自由以下组成的组的T细胞：CD4+T细胞、CD8+T细胞、细胞毒性T细胞、末端效应T细胞、记忆T细胞、原初T细胞、自然杀伤T细胞、γ-δT细胞、细胞因子诱导型杀伤(CIK)T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞。在某些实施方式中，免疫细胞是未经修饰的免疫细胞。在某些实施方式中，免疫细胞是经修饰的免疫细胞。未经修饰或经修饰的免疫细胞可以是自体的或同种异体的。在某些实施方式中，经修饰的免疫细胞是CAR-T细胞。在某些实施方式中，CAR-T细胞源自与本文提供的DC肿瘤疫苗相同的来源(例如，受试者的外周血)。

在某些实施方式中，免疫抑制性微环境是免疫抑制性肿瘤微环境。免疫抑制性肿瘤微环境已在上文中描述。在某些实施方式中，免疫抑制性肿瘤微环境包括表达免疫抑制性分子的肿瘤和/或肿瘤浸润免疫细胞，所述免疫抑制性分子例如选自由以下组成的组：PD-1、TIM3、TIGIT、LAG3、A2AR、BTLA(CD272)、CTLA-4(CD152)、IDO1、IDO2、TDO、NOX2、VISTA、SIGLEC7(CD328)、PVR(CD155)和SIGLEC9(CD329)、PD-L1、PD-L2、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、PVR(CD155)、唾液酸糖蛋白、CD112、CD113、半乳凝素9、CD24和CD47。在某些实施方式中，免疫抑制性分子是CTLA-4和/或PD-L1。在某些实施方式中，肿瘤包括表达CTLA4-Ig和/或PD-L1的细胞。

组合疗法

在另一方面，本公开提供了一种使用本文提供的DC肿瘤疫苗和第二药剂的组合疗法。

在某些实施方式中，第二药剂是如CAR-T细胞等上述经修饰的免疫细胞群体。在某些实施方式中，CAR-T细胞源自与本文提供的DC肿瘤疫苗相同的来源(例如，受试者的外周血)。在某些实施方式中，组合疗法中提供的DC肿瘤疫苗和CAR-T细胞的比率在约1:1到1:10的范围内。

在某些实施方式中，本文提供的DC肿瘤疫苗和CAR-T细胞在同一药物组合物中。在某些实施方式中，本文提供的DC肿瘤疫苗和CAR-T细胞在两种单独的药物组合物中。在某些实施方式中，在施用CAR-T细胞之前、同时或之后，将本文提供的DC肿瘤疫苗施用于有需要的受试者。

在某些实施方式中，第二药剂是抑制免疫抑制途径的药剂，包括但不限于TGF-β、白介素10(IL-10)、腺苷、VEGF、吲哚胺2,3加双氧酶1(IDO1)、吲哚胺2,3-加双氧酶2(IDO2)、色氨酸2-3-加双氧酶(TDO)、乳酸盐、缺氧、精氨酸酶和前列腺素E2的抑制剂。第二药剂也可以是T细胞检查点抑制剂，包括但不限于抗CTLA4抗体(例如，伊匹单抗(Ipilimumab))、抗PD1抗体(例如，纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、西米普利单抗(Cemiplimab))、抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、德瓦鲁单抗(Durvalumab))、抗PD-L2抗体、抗BTLA抗体、抗LAG3抗体、抗TIM3抗体、抗VISTA抗体、抗TIGIT抗体和抗KIR抗体。

在某些实施方式中，第二药剂是T细胞激动剂，包括但不限于刺激CD28、ICOS、OX-40、CD27、4-1BB、CD137、GITR和HVEM的抗体。在某些实施方式中，第二药剂是治疗性溶瘤病毒，包括但不限于弹状病毒、逆转录病毒、副粘病毒、小核糖核酸病毒、呼吸道肠道病毒、细小病毒、腺病毒、疱疹病毒和痘病毒。

在某些实施方式中，第二药剂是免疫刺激剂，如toll样受体激动剂，包括但不限于TLR3、TLR4、TLR7和TLR9激动剂。在某些实施方式中，第二药剂是干扰素基因刺激因子(STING)激动剂，如环状GMP-AMP合成酶(cGAS)。

在某些实施方式中，将本文提供的DC肿瘤疫苗与任何数量的相关治疗方式结合(例如，在所述相关治疗方式之前、同时或之后)施用于有需要的受试者，所述相关治疗方式包括但不限于用细胞因子或来自DC肿瘤疫苗内的细胞因子的表达来进行治疗，所述细胞因子增强树突细胞或T细胞增殖和持久性并且包括但不限于Flt3L、IL-2、IL-7和IL-15或其类似物。

在一些实施方式中，治疗方法进一步包括施用减少或改善与施用DC肿瘤疫苗相关的副作用的药剂。示例性副作用包括细胞因子释放综合征(CRS)和嗜血细胞淋巴组织细胞增多症(HLH，也称为巨噬细胞激活综合征(MAS))。在某些实施方式中，为治疗副作用而施用的药剂包括中和IFN-γ、IFN-α、IL-2和IL-6等可溶性因子的药剂。示例性药剂包括但不限于TNF-α的抑制剂(例如，依他西普(entanercept))和IL-6的抑制剂(例如，托珠单抗(tocilizumab))。

实施例

虽然已经参照具体实施方式(其中一些是优选实施方式)具体地示出和描述了本公开，但本领域技术人员应理解，可以在其中进行形式和细节上的各种改变而不背离如本文所公开的本公开的精神和范围。

实施例1

此实施例说明了表达CAR和肿瘤基因突变肽两者的慢病毒载体的构建以及所述载体在293FT细胞中的表达：

慢病毒载体的构建

所有序列都是由Guangzhou Aiji优化和合成的。将CAR基因(SEQ ID NO:28)和p53R273H疫苗基因(SEQ ID NO:33)、KRAS G12C疫苗基因(SEQ ID NO:34)或KRAS G12V疫苗基因(SEQ ID NO:35)克隆到lenti-Cas9(Addgene)载体中以替代Cas9。载体的结构图如图1A所示。

慢病毒的制备

所有用于包装慢病毒的质粒DNA都使用NucleoBond Xtra Midi EF试剂盒(宝生物工程株式会社(Takara Bio))进行提取和纯化。慢病毒根据Addgene网站上描述的常用方法产生并使用聚乙烯亚胺(PEI)(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))进行包装。在包装病毒的前一天，将293FT细胞(ATCC)以1:3的比率传代并分配到15cm的陪替氏培养皿中。第二天，当细胞融合度达到90％时，将病毒包装。在转染前1小时将培养基更换成新鲜培养基。将两个包装质粒pSPAX2(Addgene，目录号12260)和pMD2.G(Addgene，目录号12259)、靶慢病毒载体和1mg/ml PEI以1:3～1:4的DNA:PEI比率在Opti-MEM(购自Gibco)中稀释。在室温下温育20分钟后，将质粒混合物轻轻滴入细胞培养基中，并且在转染后8小时将所述培养基用DMEM完全培养基(Gibco)替换。在转染后48～72小时收集慢病毒颗粒。使用Lenti-X病毒浓缩物(宝生物工程株式会社)浓缩含有病毒的培养基的上清液。将收集的含有病毒颗粒的培养基以1500g离心15分钟，将1/3体积的Lenti-X病毒浓缩物添加到分离的上清液中，混合均匀并且然后在4℃下放置过夜。第二天，将混合物在4℃、3000rpm下离心45分钟。将离心管底部处的病毒颗粒重新悬浮在0.6～0.8ml的预冷PBS缓冲液中，并以等分的形式储存在-80℃的冰箱中，以供后续使用。

用慢病毒感染的293FT细胞的结果如图1B中所示。如图1B所示，在慢病毒感染后，如通过蛋白质-L检测到的，93％的293FT细胞在细胞表面表达CAR，表明表达CAR和肿瘤基因突变肽两者的所构建的慢病毒载体在包装到慢病毒中后可以有效地转导细胞并在细胞表面表达CAR结构。

如图1C和图1D所示，H460具有野生型p53基因，而SW480细胞具有突变的p53基因，所述突变的p53基因含有G＞A突变，从而导致在p53蛋白中产生R273H突变。因此，SW480是含有p53R273H突变的肿瘤细胞系。

如图1E和图1F所示，SW837细胞中编码KRAS的第12个氨基酸残基的核苷酸具有突变GGT＞TGT，这使得编码的氨基酸突变为G12C。SW480细胞中编码KRAS的第12个氨基酸残基的核苷酸具有突变GGT＞GTT，这使得编码的氨基酸突变为G12V。因此，SW480是具有KRASG12V突变的肿瘤细胞系，并且SW837是具有KRAS G12C突变的肿瘤细胞系。

如图1G-1I所示，H460、SW480和SW837细胞在细胞表面表达高水平的EphA2。

如图1J所示，构建的H460-p53R273Hov细胞高水平地表达p53R273H突变多肽。

实施例2

此实施例说明由人源化小鼠骨髓细胞制备DC。

用无菌剪刀取出人源化小鼠的股骨和胫骨，将所述股骨和胫骨在70％酒精中浸泡3分钟并用冰冷PBS冲洗两次。然后用无菌注射器(26号针头)抽吸PBS。通过从骨髓腔的一个端部进行冲洗，将骨髓细胞冲出。使用1ml移液管尖端通过反复吹吸分散骨髓细胞，并且然后将所述骨髓细胞通过70μm尼龙网过滤。将过滤后的细胞收集并离心。然后用裂解缓冲液(BD生物科学(BD Biosciences))溶解红血球。将剩余的细胞用PBS洗涤两次并计数。将细胞以1×10⁶/ml培养在分化培养基(具有20ng/ml重组人GM-CSF和5ng/ml重组人IL-4的RPMI-1640完全培养基)中，所述分化培养基每两天补充有新鲜分化培养基。

在分化的第8天，以100的MOI用慢病毒感染未成熟的DC。将具有适当滴度的经浓缩的慢病毒储备溶液在37℃下缓慢解冻。将适量的病毒储备溶液与6ug/ml的硫酸鱼精蛋白混合并添加到分化培养基中。在37℃下温育12小时后，将1ml的分化培养基添加到每个孔中。在转导24小时后，收集细胞进行离心，小心地丢弃含病毒的培养基，将细胞用PBS洗涤两次并在新鲜分化培养基中进一步培养，直到在第10天使用。

如图2A和下表1所示，可以将Hu-小鼠骨髓细胞以超过90％的效率诱导成人类DC。在转导后，CARDF-DC和p53R273H疫苗的表面的CARDF表达效率分别为82.1％和75％。

表1.分化成DC的效率

模拟-DC	CARDF-DC	p53R273H疫苗
			34.6+58.5＝93.1	82.1+13.5＝95.6	75+17.4＝92.4

如图2B所示，CARDF-DC和p53R273H疫苗的qPCR分析显示，p53R273H疫苗中p53R273H的mRNA表达水平明显提高。

如图2C和下表2所示，可以将Hu-小鼠骨髓细胞以超过80％的效率诱导成人类DC。在转导后，CARDF-DC、KRAS G12C疫苗和KRAS G12V疫苗的表面的CARDF表达效率分别为46％、68.2％和69.4％。

表2.分化成DC的效率

CARDF-DC	KRAS G12C疫苗	KRAS G12V疫苗
			46+35.4＝81.4	68.2+11.9＝80.1	69.4+10.9＝80.3

如图2D所示，CARDF-DC、KRAS G12C疫苗和KRAS G12V疫苗的qPCR分析显示，KRASG12C疫苗和KRAS G12V疫苗中突变肽的mRNA表达水平明显提高。

上述数据表明，人源化小鼠骨髓细胞可以有效地分化为人类DC，CARDF可以通过慢病毒转导在DC表面高水平表达，并且p53R273H也可以在DC细胞中高水平表达。

实施例3

此实施例说明来源于人源化小鼠骨髓细胞的DC肿瘤疫苗在治疗Hu-小鼠异种移植模型中的肿瘤的用途。

将2×10⁶个H460细胞、2×10⁶个H460-p53R273Hov细胞和2×10⁶个SW480细胞用100μL PBS重新悬浮并且皮下注射到Hu-小鼠背部两侧中，以制备异种移植Hu-小鼠肿瘤模型。将携带肿瘤的Hu-小鼠随机分为三组，即：

(1)模拟-DC处理组

(2)CARDF-DC处理组

(3)p53R273H疫苗处理组

处理过程如图3A中所示。

将2×10⁶个SW480细胞和2×10⁶个SW837细胞重新悬浮于100μL PBS中并且皮下注射到Hu-小鼠的背部中，以制备异种移植Hu-小鼠动物肿瘤模型。将携带肿瘤的Hu-小鼠随机分为三组，即：

(1)CARDF-DC处理组

(2)KRAS G12C疫苗处理组

(3)KRAS G12V疫苗处理组

处理过程如图3B中所示。

将细胞疗法通过尾静脉注射到小鼠体内，并将细胞重新悬浮于400μL PBS中。图3A中处理期间的第一次注射的剂量为6×10⁶DC/小鼠，并且第二次注射的剂量为2×10⁶DC/小鼠。图3B的处理期间的注射剂量为5×10⁶DC/小鼠。在细胞疗法期间，每隔一天用游标卡尺测量肿瘤的大小并进行统计。当使小鼠安乐死时，将所有肿瘤收集、称重并拍照。另外，收集小鼠脾脏、血液和骨髓，将其分离并处理成单个细胞，用荧光标记的流式细胞术抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。通过qPCR分析从肿瘤组织中提取的RNA。结果如图3-图5中所示。引物序列如图5E中所示。

如图3C所示，在不同处理后，由H460形成的肿瘤组织的肿瘤组织生长没有明显差异。

如图3D和表3所示，在用p53R273H疫苗处理后，由H460-p53R273Hov形成的肿瘤组织的生长受到抑制。在第15天，CARDF-DC处理组中的H460-p53R273Hov肿瘤组织的平均肿瘤体积为1286.64mm³，并且p53R273H疫苗处理组中的平均肿瘤体积为591.789mm³。

表3.在第15天每个组中H460-p53R273Hov肿瘤组织的平均体积(mm³)

CARDF-DC	p53R273H疫苗
		1286.64	591.789

如图3E和表4所示，在用p53R273H疫苗处理后，由SW480形成的肿瘤组织的生长受到抑制。在第15天，CARDF-DC处理组中的SW480肿瘤组织的平均肿瘤体积为1055.52mm³，并且p53R273H疫苗处理组中的平均肿瘤体积为342.587mm³。

表4.在第15天每个组中SW480肿瘤组织的平均体积(mm³)

模拟-DC	CARDF-DC	p53R273H疫苗
			957.522	1055.52	342.587

如图3F和表5所示，在用KRAS G12V疫苗处理后，由SW480形成的肿瘤组织的生长受到抑制。在第15天，CARDF-DC处理组中的SW480肿瘤组织的平均肿瘤体积为723.254mm³，KRAS G12C处理组中的SW480肿瘤组织的平均肿瘤体积为542.616mm³，并且KRAS G12V疫苗处理组中的平均肿瘤体积为312.747mm³。

表5.在第15天每个组中SW480肿瘤组织的平均体积(mm³)

CARDF-DC	KRAS G12C疫苗	KRAS G12V疫苗
			723.254	542.616	312.747

如图3G和表6所示，在用KRAS G12C疫苗处理后，由SW837形成的肿瘤组织的生长受到抑制。在第8天，CARDF-DC处理组中的SW837肿瘤组织的平均肿瘤体积为167.727mm³，KRASG12C处理组中的SW837肿瘤组织的平均肿瘤体积为41.3374mm³，并且KRAS G12V疫苗处理组中的平均肿瘤体积为122.71mm³。

表5.在第8天每个组中SW837肿瘤组织的平均体积(mm³)

CARDF-DC	KRAS G12C疫苗	KRAS G12V疫苗
			167.727	41.3374	122.71

如图4A和表7所示，p53R273H疫苗处理组中的T细胞的比例(12.163％)高于CARDF-DC处理组(4.786％)和模拟-DC处理组(6.024％)，这表明DC疫苗刺激了T细胞在体内增殖。

表7.每个组中T细胞的平均百分比(％)

模拟-DC	CARDF-DC	p53R273H疫苗
			6.024	4.786	12.163

如图4B和表8所示，p53R273H疫苗处理组中的PD-1+T细胞的比例(18.7％)低于模拟-DC处理组中的比例(31.6％)，这表明DC疫苗逆转了肿瘤微环境状态中的T细胞耗竭。

表8.每个组中PD-1+T细胞的平均百分比(％)

模拟-DC	CARDF-DC	p53R273H疫苗
			31.6	28.3	18.7

如图4C和表9所示，KRAS G12C疫苗处理组中的T细胞的比例(27.3％)和KRAS G12V疫苗处理组中的T细胞的比例(17.825％)高于CARDF-DC处理组(12.3％)，这表明DC疫苗刺激了T细胞在体内增殖。

表9.每个组中T细胞的平均百分比(％)

CARDF-DC	KRAS G12C疫苗	KRAS G12V疫苗
			12.3	27.3	17.825

如图4D和表10所示，KRAS G12C疫苗处理组中的DC细胞的比例(3.2425％)和KRASG12V疫苗处理组中的DC细胞的比例(2.7％)与CARDF-DC处理组(1.665％)相比有所增加，这表明DC疫苗在体内的存活时间得到延长。

表10.每个组中DC细胞的平均百分比(％)

CARDF-DC	KRAS G12C疫苗	KRAS G12V疫苗
			1.665	3.2425	2.7

如图4E和表11所示，与模拟-DC处理组相比，CARDF-DC处理组和p53R273H疫苗处理组的DC细胞中的CD80表达的平均荧光强度明显增加，这表明CARDF的存在使DC在接触肿瘤靶标后被有效激活。

表11.每个组的DC中的CD80表达的平均荧光强度

模拟-DC	CARDF-DC	p53R273H疫苗
			1177	1459	1387

如图4F-4H和表12-14所示，不同处理组的外周血中的B细胞和巨噬细胞的比例无明显差异，这表明DC疫苗处理后无免疫细胞毒性反应。

表12.每个组中B细胞的平均百分比(％)

模拟-DC	CARDF-DC	p53R273H疫苗
			6.2	4.23	5.4

表13.每个组中巨噬细胞的平均百分比(％)

模拟-DC	CARDF-DC	p53R273H疫苗
			3.74	1.82	2.89

表14.每个组中B细胞的平均百分比(％)

CARDF-DC	KRAS G12C疫苗	KRAS G12V疫苗
			3.74	1.82	2.89

如图5A和表15所示，与模拟-DC处理组相比，CARDF-DC处理组和p53R273H疫苗处理组中SW480肿瘤组织中的TNF-α基因的表达水平明显增加，这表明CARDF的存在促进了DC的激活，从而增强促炎性基因在肿瘤中的表达。

表15.每个组中TNF-αmRNA的平均相对表达水平

模拟-DC	CARDF-DC	p53R273H疫苗
			1.21	8.20	8.09

如图5B和表16所示，与模拟-DC和CARDF-DC处理组相比，p53R273H疫苗处理组中的SW480肿瘤组织中的CARDF scFv基因表达明显增加，这表明DC疫苗在肿瘤组织中的浸润增加。

表16.每个组中CARDF scFv mRNA的平均相对表达水平

模拟-DC	CARDF-DC	p53R273H疫苗
			1.01	1.35	3.36

如图5C和表17所示，与CARDF-DC处理组和KRAS G12C疫苗处理组相比，KRAS G12V疫苗处理组中的SW480肿瘤组织中的CD3基因的表达明显增加，这表明在用KRAS G12V疫苗处理后，T细胞在SW480肿瘤组织中的浸润增加。

表17.每个组中CD3 mRNA的平均相对表达水平

CARDF-DC	KRAS G12C疫苗	KRAS G12V疫苗
			1.01	2.12	6.05

如图5D和表18所示，与CARDF-DC处理组和KRAS G12V疫苗处理组相比，KRAS G12C疫苗处理组中的SW837肿瘤组织中的TNF-α的基因表达明显增加，这表明在用KRAS G12C疫苗处理后，T细胞在SW837肿瘤组织中的浸润增加。

表18.每个组中TNF-αmRNA的平均相对表达水平

上述数据表明，DC疫苗刺激了Hu-小鼠的效应T细胞应答，有效地抑制了表达突变基因的肿瘤组织的生长，并且无免疫细胞毒性副作用。

表19本公开中提及的序列

/>

/>

/>

序列表

<110> 深圳珈钰生物科技有限公司（Shenzhen FrontierGate Biotechnology Co., LTD）

<120> 树突细胞肿瘤疫苗和其用途

<130> 082971-8002WO01

<160> 36

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成

<400> 1

Arg Trp Pro Pro Ser Ala Ala Cys Ser Gly Lys Glu Ser Val Val Ala

1 5 10 15

Ile Arg Thr Asn Ser Gln Ser Asp Phe His Leu Gln Thr Tyr Gly Asp

20 25 30

Glu Asp Leu Asn Glu Leu Asp Pro His Tyr Glu Met

35 40

<210> 2

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 2

Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys

1 5 10 15

Ser Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr

20 25 30

Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln

35 40

<210> 3

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 3

Arg Trp Pro Pro Ser Ala Ala Cys Ser Gly Lys Glu Ser Val Val Ala

1 5 10 15

Ile Arg Thr Asn Ser Gln Ser Asp Phe His Leu Gln Thr Tyr Gly Asp

20 25 30

Glu Asp Leu Asn Glu Leu Asp Pro His Tyr Glu Met Arg Leu Lys Ile

35 40 45

Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val

50 55 60

Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys

65 70 75 80

His Glu Lys Pro Pro Gln

85

<210> 4

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 4

cgctggcctc cttctgcagc ttgttcggga aaagagtcag ttgttgctat aaggaccaat 60

agccaatctg acttccactt acaaacttat ggagatgaag atttgaatga attagatcct 120

cattatgaaa tgcgactgaa gatccaagtg cgaaaggcag ctataaccag ctatgagaaa 180

tcagatggtg tttacacggg cctgagcacc aggaaccagg agacttacga gactctgaag 240

catgagaaac caccacag 258

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 5

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 6

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 7

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 7

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 8

<211> 383

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 8

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro

20 25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu

35 40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg

50 55 60

Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met

65 70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser

85 90 95

Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp

100 105 110

Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr

115 120 125

Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu

130 135 140

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

145 150 155 160

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val

165 170 175

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

180 185 190

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

195 200 205

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

210 215 220

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

225 230 235 240

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

245 250 255

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

260 265 270

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

275 280 285

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

290 295 300

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

305 310 315 320

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

325 330 335

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

340 345 350

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

355 360 365

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375 380

<210> 9

<211> 290

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 9

Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu

1 5 10 15

Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

20 25 30

Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu

35 40 45

Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

50 55 60

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

85 90 95

Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

100 105 110

Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val

115 120 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val

130 135 140

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

165 170 175

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn

180 185 190

Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr

195 200 205

Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu

210 215 220

Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His

225 230 235 240

Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr

245 250 255

Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys

260 265 270

Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu

275 280 285

Glu Thr

290

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 10

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 11

Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 12

Glu Ala Ile Phe Thr His

1 5

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 13

Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr His Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 14

Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 15

Leu Lys Tyr Asn Val Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 16

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 16

Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Ile Phe Thr His Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 17

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

His Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Lys Tyr Asn Val Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 18

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 18

Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Ile Phe Thr His Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

130 135 140

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn

145 150 155 160

Asn Tyr His Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu

165 170 175

Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe

180 185 190

Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile

195 200 205

Glu Ser Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Lys Tyr Asn Val Phe

210 215 220

Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 19

cagagcctcg cctttgccga tc 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 20

catccatggt gagctggcgg cg 22

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 21

ggggcaagat ggtaatgaag 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 22

ccaggatact gagggcatgt 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 23

gctgcacttt ggagtgatcg 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 24

tcactcgggg ttcgagaaga 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 25

ataccatgtc ttgggtgcga 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 26

aatcggccct tcacactgtc 20

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 27

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 28

<211> 1242

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 28

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgcaggtgc agctgttgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga 120

ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt agcagctata ccatgtcttg ggtgcgacag 180

gcccctggac aagcgcttga gtggatggga accattagta gtcgtggtac ttacacctac 240

tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaacgccaa gaactcactg 300

tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggctg tgtattactg tgcgagagaa 360

gctatcttta ctcactgggg ccgtggcacc ctggtcaccg tctcctcagg tggtggtggt 420

tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt tctgacatcc agttgaccca gtctccatcc 480

tccctgtctg catctgtagg agacagagtc accatcactt gcaaggcgag tcaggacatt 540

aataactatc acagctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggct cctcatctat 600

cgtgcaaaca gattggtaga tggggtccca gacaggttca gtggcagcgg gtatggaaca 660

gattttaccc tcacaattaa taacatagaa tctgaggatg ctgcatatta cttctgtctg 720

aaatataatg tgtttccgta cacgttcggc caagggacca aggtggagat caaaaccacg 780

acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg 840

cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc 900

gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca 960

ctggttatca ccctttactg ccgctggcct ccttctgcag cttgttcggg aaaagagtca 1020

gttgttgcta taaggaccaa tagccaatct gacttccact tacaaactta tggagatgaa 1080

gatttgaatg aattagatcc tcattatgaa atgcgactga agatccaagt gcgaaaggca 1140

gctataacca gctatgagaa atcagatggt gtttacacgg gcctgagcac caggaaccag 1200

gagacttacg agactctgaa gcatgagaaa ccaccacagt aa 1242

<210> 29

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 29

Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val His

1 5 10 15

Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn

20 25 30

<210> 30

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 30

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln

20

<210> 31

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 31

Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Gln

20

<210> 32

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 32

Gly Tyr Gln Arg Ile

1 5

<210> 33

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 33

atgggctacc agaggatcga agactccagt ggtaatctac tgggacggaa cagctttgag 60

gtgcatgttt gtgcctgtcc tgggagagac cggcgcacag aggaagagaa t 111

<210> 34

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 34

atgggctacc agaggatcac tgaatataaa cttgtggtag ttggagcttg tggcgtaggc 60

aagagtgcct tgacgataca g 81

<210> 35

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 35

atgggctacc agaggatcac tgaatataaa cttgtggtag ttggagctgt tggcgtaggc 60

aagagtgcct tgacgataca g 81

<210> 36

<211> 574

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<223> 合成

<400> 36

cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60

tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120

gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180

aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240

aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300

ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360

cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420

ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 480

cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540

ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataa 574

Claims

1.用于制备树突细胞肿瘤疫苗的载体，其包括：

（a）编码能够激活树突细胞的嵌合抗原受体（CAR）的第一多核苷酸，其中所述CAR包括（1）CD8α的信号肽，（2）单链可变片段（scFv），（3）CD8a铰链区，（4）CD8α的跨膜结构域和（5）细胞内信号传导结构域，以及

（b）编码肿瘤抗原的第二多核苷酸，其中所述肿瘤抗原是肿瘤相关抗原（TAA）或肿瘤特异性抗原（TSA），其中所述第二多核苷酸是突变的肿瘤基因或其片段，其中所述肿瘤基因选自p53和ras，其中所述CAR和所述肿瘤抗原在树突细胞中表达时能够在免疫抑制性肿瘤微环境中激活所述树突细胞；

其中所述细胞内信号传导结构域包括Dectin-1的细胞质结构域和FcγR的细胞质结构域，其中所述Dectin-1的细胞质结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，其中所述FcγR的细胞质结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；且

其中所述肿瘤抗原连接到氨基酸序列如SEQ ID NO: 32所示的DC-LAMP分选信号。

2.根据权利要求1所述的载体，其中所述细胞内信号传导结构域为SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列。

3.根据前述权利要求中任一项所述的载体，其中所述细胞内信号传导结构域为由SEQID NO: 4中所示的核酸序列编码的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-2中任一项所述的载体，其中所述scFv对肿瘤表面标志物具有特异性。

5.根据权利要求4所述的载体，其中所述肿瘤表面标志物选自由以下组成的组：EphA2、CD19、CD70、CD133、CD147、CD171、DLL3、EGFRvIII、间皮素、神经节苷脂GD2、FAP（成纤维细胞激活蛋白）、FBP（叶酸结合蛋白）、Lewis Y、密封蛋白18.2（Claudin 18.2）、IL13Ra2、HER2、MDC1、PMSA（前列腺膜特异性抗原）、ROR1、B7-H3、CAIX、CEA、GPC3、MUC1、NKG2D。

6.根据权利要求1-2中任一项所述的载体，其中CD8α的所述信号肽为SEQ ID NO: 5中所示的序列。

7.根据权利要求1-2中任一项所述的载体，其中CD8α的所述跨膜结构域为SEQ ID NO:6中所示的序列。

8.根据权利要求1-2中任一项所述的载体，其中CD8α的所述铰链区为SEQ ID NO: 7中所示的序列。

9.根据权利要求1-2中任一项所述的载体，其中所述肿瘤抗原选自p53 R273H突变肽、KRAS G12V突变肽和KRAS G12C突变肽。

10.根据权利要求9所述的载体，其中所述p53 R273H突变肽的序列如SEQ ID NO: 29中所示，所述KRAS G12V突变肽的序列如SEQ ID NO: 31中所示，并且所述KRAS G12C突变肽的序列如SEQ ID NO: 30中所示。

11.根据权利要求1-2、5和10中任一项所述的载体，其是DNA或RNA。

12.根据权利要求11所述的载体，其中所述第一多核苷酸和/或所述第二多核苷酸操作性地连接到用于表达所述CAR和/或所述肿瘤抗原的至少一个调控多核苷酸元件。

13.根据权利要求11所述的载体，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括在单个载体中。

14.根据权利要求11所述的载体，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包括在多个载体中。

15.根据权利要求13所述的载体，其中所述第一多核苷酸通过序列如SEQ ID NO: 36所示的IRES可操作地连接到所述第二多核苷酸。

16.根据权利要求11所述的载体，其中所述载体是质粒载体、病毒载体、转座子、定点插入载体或自杀式表达载体。

17.根据权利要求16所述的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或AAV载体。

18.根据权利要求17所述的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。

19.一种经工程化的细胞，其包括根据前述权利要求中任一项所述的载体。

20.根据权利要求19所述的经工程化的细胞，其中所述经工程化的细胞是树突细胞或其前体细胞或祖细胞。

21.根据权利要求20所述的经工程化的细胞，其中所述树突细胞或其前体细胞或祖细胞源自外周血细胞、骨髓细胞或诱导性多能干细胞。

22.一种产生经工程化的细胞的方法，所述方法包括在适合于表达CAR和肿瘤抗原的条件下向起始细胞引入根据权利要求1到18中任一项所述的载体。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述起始细胞是树突细胞或其前体细胞或祖细胞。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述树突细胞或其前体细胞或祖细胞源自外周血细胞、骨髓细胞或诱导性多能干细胞。

25.一种细胞群体，其通过根据权利要求22到24中任一项所述的方法离体产生。

26.根据权利要求25所述的细胞群体，其中至少60%的所述细胞群体表达可检测水平的根据权利要求1-18中任一项所述的载体编码的CAR和肿瘤抗原。

27.一种药物组合物，其包含（i）根据权利要求1到18中任一项所述的载体、或根据权利要求19到21中任一项所述的经工程化的细胞的群体、或根据权利要求25或26所述的细胞群体，和（ii）药学上可接受的介质。

28.根据权利要求27所述的药物组合物在制备用于治疗有需要的受试者的癌症的药物中的用途，其中所述受试者的肿瘤细胞带有突变基因，其中所述突变基因为突变的肿瘤基因或其片段，其中所述肿瘤基因选自p53和ras。

29.根据权利要求28所述的用途，其中所述癌症是选自由以下组成的组的实体癌：乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌和卵巢癌。

30.根据权利要求28所述的用途，其中所述药物还包括经修饰的免疫细胞群体。

31.根据权利要求30所述的用途，其中所述经修饰的免疫细胞在细胞表面表达合成受体。

32.根据权利要求31所述的用途，其中所述合成受体为CAR或TCR。

33.根据权利要求30所述的用途，其中所述免疫细胞是T细胞、自然杀伤（NK）细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞或中性粒细胞。

34.根据权利要求30-33中任一项所述的用途，其中所述免疫细胞是选自由以下组成的组的T细胞：CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、细胞毒性T细胞、末端效应T细胞、记忆T细胞、原初T细胞、自然杀伤T细胞、γ-δ T细胞、细胞因子诱导型杀伤（CIK）T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞。

35.根据权利要求30-33中任一项所述的用途，其中所述免疫细胞是自体的或同种异体的。

36.根据权利要求19到21中任一项所述的经工程化的细胞在制备用于在免疫抑制性微环境中诱导T细胞增殖的药物中的用途。

37.根据权利要求36所述的用途，其中所述免疫抑制性微环境是免疫抑制性肿瘤微环境。

38.根据权利要求36所述的用途，其中所述免疫抑制性肿瘤微环境包括表达免疫抑制性分子的肿瘤和/或肿瘤浸润免疫细胞。

39.根据权利要求38所述的用途，其中所述免疫抑制性分子选自由以下组成的组：PD-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、A2AR、BTLA（CD272）、CTLA-4（CD152）、IDO1、IDO2、TDO、NOX2、VISTA、SIGLEC7（CD328）、PVR（CD155）、SIGLEC9（CD329）、PD-L1、PD-L2、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、唾液酸糖蛋白、CD112、CD113、半乳凝素9、CD24和CD47。

40.根据权利要求39所述的用途，其中所述免疫抑制性分子是CTLA-4和/或PD-L1。