TW202023580A - 使用靶特異性融合蛋白進行ｔｃｒ再程式化之組合物及方法 - Google Patents

使用靶特異性融合蛋白進行ｔｃｒ再程式化之組合物及方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202023580A
TW202023580A TW108126642A TW108126642A TW202023580A TW 202023580 A TW202023580 A TW 202023580A TW 108126642 A TW108126642 A TW 108126642A TW 108126642 A TW108126642 A TW 108126642A TW 202023580 A TW202023580 A TW 202023580A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
tcr
domain
patent application
scope
tfp
Prior art date
Application number
TW108126642A
Other languages
English (en)
Inventor
派崔克 亞歷山大 拜奧雷
羅伯特 赫夫梅斯特
丹尼爾 蓋茲
凡尼雅 艾希米諾娃
丁健
Original Assignee
美商Ｔｃｒ２療法股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商Ｔｃｒ２療法股份有限公司 filed Critical 美商Ｔｃｒ２療法股份有限公司
Publication of TW202023580A publication Critical patent/TW202023580A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/00117—Mucins, e.g. MUC-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464466—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A61K39/464468—Mesothelin [MSLN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464469—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/46447—Mucins, e.g. MUC-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/59—Reproductive system, e.g. uterus, ovaries, cervix or testes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本文中提供T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)、經工程化以表現一或多種MUC16或IL13Rα2或MSLN TFP之T細胞及其用於治療疾病，包括癌症之使用方法。

Description

使用靶特異性融合蛋白進行TCR再程式化之組合物及方法
大部分晚期實體腫瘤患者用標準療法不可治癒。另外，傳統治療方案通常具有嚴重副作用。已進行眾多嘗試以使患者之免疫系統參與排斥癌細胞，此方法統稱為癌症免疫療法。然而，若干障礙使得相當難以達成臨床有效性。儘管已鑑定出數百種所謂的腫瘤抗原，但此等抗原通常來源於自身且因而可能使癌症免疫療法針對健康組織，或具有不良免疫原性。此外，癌細胞使用多種機制使其自身對癌症免疫療法之免疫攻擊不可見或不利於其起始及傳播。
最近開發了使用經嵌合抗原受體(CAR)修飾之自體T細胞療法，該療法依賴於使經遺傳工程化之T細胞重定向至癌細胞上之適合細胞表面分子，從而有望利用免疫系統之能力來治療B細胞惡性病(參見例如Sadelain等人，Cancer Discovery 3：388-398(2013))。利用CD-19特異性CAR-T細胞(稱為CTL019)之臨床結果已顯示罹患慢性淋巴細胞性白血病(CLL)以及兒童期急性淋巴母細胞性白血病(ALL)之患者的完全緩解(參見例如Kalos等人，Sci Transl Med 3：95ra73(2011)；Porter等人，NEJM 365：725-733(2011)；Grupp等人，NEJM 368：1509-1518(2013))。替代方法為使用針對腫瘤相關肽抗原選擇之T細胞受體(TCR)α及β鏈用於對自體T細胞進行遺傳工程化。此等TCR鏈將形成完整TCR複合物且給T細胞提供TCR以達成第二確定性特異性。在滑膜癌患者中，用表現NY-ESO-1特異性TCR α及β鏈之工程化自體T細胞獲得了令人鼓舞之結果。
除了表現CAR或第二TCR之經遺傳修飾之T細胞在活體外/離體識別並破壞相應靶細胞之能力以外，利用工程化T細胞之成功患者療法亦需要T細胞能夠強活化、擴增、持續一定時間且在疾病復發之情況下能夠有『記憶』反應。CAR-T細胞之高且可控之臨床效力目前僅限於BCMA及CD-19陽性B細胞惡性病以及表現HLA-A2之表現NY-ESO-1-肽之滑膜肉瘤患者。顯然需要改良經遺傳工程化之T細胞以更廣泛地對各種人類惡性病起作用。
本文中提供T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)、經工程化以表現一或多種TFP之T細胞及其用於治療疾病之使用方法。
根據一態樣，本文中提供一種醫藥組合物，其包含(I)來自人類個體之T細胞，其中該T細胞包含編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之重組核酸分子，該T細胞受體融合蛋白包含(a)TCR次單元，其包含(i)TCR細胞外結構域之至少一部分，(ii)TCR跨膜結構域，及(iii)TCR細胞內結構域，其包含來自細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及(b)抗原結合結構域，其包含抗MUC16結合結構域、抗IL13Rα2結合結構域或抗間皮素(MSLN)結合結構域；及(II)醫藥學上可接受之載劑；其中該TCR次單元及該抗原結合結構域可操作地連接；其中該TFP當表現於該T細胞中時與TCR在功能上相互作用。
在一些實施例中，該T細胞與不含該TFP之T細胞相比對表現與該抗原結合結構域特異性相互作用之抗原的細胞展現增加之細胞毒性。
在一些實施例中，該TCR次單元之TCR細胞外結構域、TCR跨膜結構域及TCR細胞內結構域來源於TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRγ鏈、TCRδ鏈、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
在一些實施例中，該TCR次單元之TCR細胞外結構域、TCR跨膜 結構域及TCR細胞內結構域來源於TCR複合物之單一次單元，其中該單一次單元為TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRγ鏈、TCRδ鏈、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
根據一態樣，本文中提供一種醫藥組合物，其包含(I)來自人類個體之T細胞，其中該T細胞包含編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之重組核酸分子，該T細胞受體融合蛋白包含(a)TCR次單元，其包含(i)TCR細胞外結構域之至少一部分，(ii)TCR跨膜結構域，及(iii)TCR細胞內結構域，其包含來自細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及(b)scFv或單結構域抗體，其包含抗MUC16結合結構域、抗IL13Rα2結合結構域或抗間皮素(MSLN)結合結構域；及(II)醫藥學上可接受之載劑；其中該TCR次單元及該抗MUC16或該IL13Rα2或該抗MSLN結合結構域可操作地連接；其中該TCR次單元之細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域僅來源於除TCRα鏈或TCRβ鏈以外之TCR次單元；其中該TFP當表現於該T細胞中時與TCR在功能上相互作用；且其中該T細胞與不含該TFP之T細胞相比對表現與該抗MUC16或抗IL13Rα2結合結構域特異性相互作用之抗原的細胞展現增加之細胞毒性。
在一些實施例中，編碼抗MUC16或抗IL13Rα2或抗MSLN結合結構域之序列係藉由編碼連接子之序列連接至編碼TCR細胞外結構域之序列。在一些實施例中，該連接子包含(G4S)n，其中G為甘胺酸，S為絲胺酸，且n為整數1至4(SEQ ID NO：107)。
在一些實施例中，該抗MUC16結合結構域包含(a)重鏈(HC)CDR1序列GRTVSSLF(SEQ ID NO：16)、GRAVSSLF(SEQ ID NO：21)或GDSLDGYV(SEQ ID NO：31)，(b)HC CDR2序列ISRYSLYT(SEQ ID NO：17)或ISGDGSMR(SEQ ID NO：32)，及(c)HC CDR3序列ASKLEYTSNDYDS(SEQ ID NO：18)或AADPPTWDY(SEQ ID NO：33)。在一些實施例中，該抗MUC16結合結構域包 含與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：40具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列一致性之序列。
在一些實施例中，該抗IL13Rα2結合結構域包含(a)重鏈(HC)CDR1序列GFTSDYYI(SEQ ID NO：52)或GFASDDYI(SEQ ID NO：67)，(b)HC CDR 2序列ISSKYANT(SEQ ID NO：53)或ISSRYANT(SEQ ID NO：68)，及(c)HC C DR3序列AADTRRYTCPDIATMHRNFDS(SEQ ID NO：54)或AMDSRRVTCPEISTMHRNFDS(SEQ ID NO：69)。在一些實施例中，該抗IL13Rα2結合結構域包含與SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：76具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列一致性之序列。在一些實施例中，使用BLAST算法以字組大小6、BLOSUM62矩陣、存在罰分11及延伸罰分1確定序列一致性。
在一些實施例中，該抗MSLN結合結構域包含與SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：98具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列一致性之序列。在一些實施例中，該醫藥組合物實質上不含血清。在一些實施例中，該scFv或單結構域抗體為scFv。在一些實施例中，該scFv或單結構域抗體為單結構域抗體。在一些實施例中，該單結構域抗體為VH結構域。在一些實施例中，所編碼之抗TAA結合結構域包含抗TAA結合結構域，且其中該等T細胞之細胞毒性活性比包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核酸的CD8+或CD4+ T細胞更高或更高效，該嵌合抗原受體包含(a)抗TAA結合結構域，其可操作地連接至(b)CD28細胞外結構域之至少一部分，(c)CD28跨膜結構域，(d)CD28細胞內結構域之至少一部分及(e)CD3ζ細胞內結構域。在一些實施例中，該編碼TFP分子當表現於該T細胞中時與內源TCR複合物、至少一種 內源TCR多肽或其組合在功能上相互作用。在一些實施例中，該T細胞為初代T細胞。在一些實施例中，該T細胞為人類CD4+ T細胞。在一些實施例中，該T細胞為人類CD8+ T細胞。在一些實施例中，該T細胞進一步包含編碼第一多肽之核酸，該第一多肽包含選自由PD-1及BTLA組成之群的抑制性分子之至少一部分，其中該抑制性分子之至少一部分與包含細胞內信號傳導結構域之正信號的第二多肽締合。在一些實施例中，該第二多肽包含來自選自由以下組成之群的蛋白質的共刺激結構域及一級信號傳導結構域：CD28、CD27、ICOS、CD3ζ、41-BB、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160及B7-H3。在一些實施例中，在表現與該抗TAA結合結構域特異性相互作用之抗原的細胞存在下，由該T細胞產生之IL-2或IFNγ與不含該TFP之T細胞相比有所增加。在一些實施例中，該細胞為人類CD8+或CD4+ T細胞群體，其中該群體之個別T細胞包含至少兩種TFP分子，或該群體之至少兩種T細胞共同包含至少兩種TFP分子；其中該至少兩種TFP分子包含抗TAA結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域；且其中該至少兩種TFP分子中之至少一種與內源TCR複合物、至少一種內源TCR多肽或其組合在功能上相互作用。在一些實施例中，該TCR次單元僅來源於CD3ε。在一些實施例中，該TCR次單元僅來源於CD3γ。在一些實施例中，該TCR次單元僅來源於CD3δ。
根據一態樣，本文中提供一種在哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性之方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之經編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之重組核酸分子轉導之T細胞群體，該T細胞受體融合蛋白包含(a)TCR次單元，其包含(i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及(ii)TCR細胞內結構域，其包含來自TCR細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及(b)抗體結構域，其包含 抗原結合結構域抗TAA結合結構域；其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中，且其中在治療後釋放之細胞介素之水準相較於經包含相同抗體結構域之CAR-T細胞治療之哺乳動物之細胞介素水準更低。在一些實施例中，該TCR細胞內信號傳導結構域來源於CD3ε或CD3γ。在一些實施例中，該TCR次單元進一步包含TCR跨膜結構域。在一些實施例中，TCR細胞外結構域、TCR跨膜結構域及TCR細胞內結構域來源於TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRδ鏈、TCRγ鏈、CD3ε、CD3γ或CD3δ。在一些實施例中，TCR細胞外結構域、TCR跨膜結構域及TCR細胞內結構域來源於TCR複合物之單一次單元，其中該單一次單元為TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRδ鏈、TCRγ鏈、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
在一些實施例中，該抗體結構域為與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：40中所示之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列一致性之抗MUC16 VHH結構域。在一些實施例中，該抗體結構域為與SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：76中所示之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列一致性之抗IL13Rα2 VHH結構域。在一些實施例中，使用BLAST算法以字組大小6、BLOSUM62矩陣、存在罰分11及延伸罰分1確定序列一致性。在一些實施例中，該細胞為自體T細胞。在一些實施例中，該細胞為同種異體T細胞。在一些實施例中，該哺乳動物為人類。
根據一態樣，本文中提供一種治療患有與腫瘤相關抗原(TAA)(例如MUC16、IL13Rα2或MSLN)之表現相關之疾病的哺乳動物的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量之經編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之重組核酸 分子轉導之T細胞群體，該T細胞受體融合蛋白包含(a)TCR次單元，其包含(i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及(ii)TCR細胞內結構域，其包含來自CD3ε或CD3γ細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及(b)抗體結構域，其包含抗原結合結構域抗TAA結合結構域；其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中，且其中在治療後釋放之細胞介素之水準相較於經包含相同抗體結構域之CAR-T細胞治療之哺乳動物之細胞介素水準更低。
在一些實施例中，該抗體結構域為與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：40中所示之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列一致性之VHH結構域。在一些實施例中，該抗體結構域為與SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：76中所示之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列一致性之VHH結構域。在一些實施例中，使用BLAST算法以字組大小6、BLOSUM62矩陣、存在罰分11及延伸罰分1確定序列一致性。在一些實施例中，該細胞為自體T細胞。在一些實施例中，該細胞為同種異體T細胞。在一些實施例中，與TAA表現相關之疾病係選自由以下組成之群：增殖性疾病、癌症、惡性病及與TAA(例如MUC16、IL13Rα2或MSLN)之表現相關之非癌症相關適應症。在一些實施例中，該疾病為選自由以下組成之群的癌症：神經膠質母細胞瘤、間皮瘤、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、結腸癌、子宮頸癌、腦癌、肝癌、胰臟癌、甲狀腺癌、膀胱癌、輸尿管癌、腎癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、胸腺癌、膽管型肝癌、胃癌及其任何組合。在一些實施例中，該疾病為選自由以下組成之群的癌症：神經膠質母細胞瘤、 間皮瘤、乳頭狀漿液性卵巢腺癌、透明細胞卵巢癌、混合型密勒氏卵巢癌(mixed Mullerian ovarian carcinoma)、子宮內膜樣黏液性卵巢癌、胰臟腺癌、導管型胰臟腺癌、子宮漿液性癌、肺腺癌、肝外膽管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳房腺癌、與MUC16表現相關之疾病、與IL13Rα2表現相關之疾病、與MSLN表現相關之疾病及其任何組合。在一些實施例中，表現TFP分子之細胞係與使表現TFP分子之細胞之效力增加的劑組合投與。在一些實施例中，對於指定細胞介素，在治療後釋放之該指定細胞介素之量與用包含該相同抗體結構域之CAR-T細胞治療之哺乳動物的該指定細胞介素之量相比低至少10%。在一些實施例中，該指定細胞介素包含一或多種選自由以下組成之群的細胞介素：IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6、IL-13、IL-5、IL-10、sCD137、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β及其任何組合。在一些實施例中，該哺乳動物中之腫瘤生長受到抑制，使得在治療至少8天之後，該腫瘤之大小為用不表現該TFP之T細胞治療之哺乳動物中之腫瘤大小的至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%或至多60%，其中該用表現TFP之T細胞治療之哺乳動物及該用不表現該TFP之T細胞治療之哺乳動物在該治療之前具有相同的腫瘤大小。在一些實施例中，該哺乳動物中之腫瘤生長受到完全抑制。在一些實施例中，該哺乳動物中之腫瘤生長受到完全抑制持續至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天、至少100天或更久。在一些實施例中，經TFP轉導之T細胞群體與包含相同抗體結構域之CAR-T細胞相比殺死類似量之腫瘤細胞。在一些實施例中，經TFP轉導之T細胞群體與包含相同抗體結構域之CAR-T細胞相比具有不同的基因表現譜。在一些實施例中，經TFP轉導之T細胞中的基因表現水準不同於包含相同抗體結構域之CAR-T細胞中的基因表現水準。在一些實施例中，該基因在抗原呈遞、TCR信號傳導、 體內平衡、代謝、趨化介素信號傳導、細胞介素信號傳導、類鐸(toll like)受體信號傳導、MMP及黏附分子信號傳導或TNFR相關信號傳導中具有功能。
根據一態樣，本文中提供一種重組核酸分子，其編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該T細胞受體融合蛋白包含(a)TCR次單元，其包含(i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及(ii)TCR細胞內結構域，其包含來自CD3ε細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及(b)抗體結構域，其包含抗TAA結合結構域；其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，且其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中。
根據一態樣，本文中提供一種重組核酸分子，其編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該T細胞受體融合蛋白包含(a)TCR次單元，其包含(i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及(ii)TCR細胞內結構域，其包含來自CD3γ細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及(b)抗體結構域，其包含抗TAA結合結構域；其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，且其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中。
根據一態樣，本文中提供一種重組核酸分子，其編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該T細胞受體融合蛋白包含(a)TCR次單元，其包含(i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及(ii)TCR細胞內結構域，其包含來自CD3δ細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及(b)抗體結構域，其包含抗TAA結合結構域；其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，且其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中。
根據一態樣，本文中提供一種重組核酸分子，其編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該T細胞受體融合蛋白包含(a)TCR次單元，其包含(i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及(ii)TCR細胞內結構域，其包含來自TCRα細胞 內信號傳導結構域之刺激結構域；及(b)抗體結構域，其包含抗TAA結合結構域；其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，且其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中。
根據一態樣，本文中提供一種重組核酸分子，其編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該T細胞受體融合蛋白包含(a)TCR次單元，其包含(i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及(ii)TCR細胞內結構域，其包含來自TCRβ細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及(b)抗體結構域，其包含抗TAA結合結構域；其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，且其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中。
在一些實施例中，該抗體結構域為人類或人類化抗體結構域。在一些實施例中，該編碼抗原結合結構域係藉由連接子序列連接至該TCR細胞外結構域。在一些實施例中，該編碼連接子序列包含(G4S)n，其中n=1至4(SEQ ID NO：107)。在一些實施例中，該TCR次單元進一步包含TCR細胞外結構域。在一些實施例中，該TCR次單元包含TCR跨膜結構域。在一些實施例中，該TCR次單元包含TCR細胞內結構域。在一些實施例中，該TCR次單元包含(i)TCR細胞外結構域，(ii)TCR跨膜結構域，及(iii)TCR細胞內結構域，其中(i)、(ii)及(iii)中至少兩個來自相同TCR次單元。在一些實施例中，該TCR次單元包含TCR細胞內結構域，該TCR細胞內結構域包含選自CD3ε、CD3γ或CD3δ之細胞內信號傳導結構域的刺激結構域，或具有至少一個針對其之修飾的胺基酸序列。在一些實施例中，該TCR次單元包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含選自4-1BB功能信號傳導結構域及/或CD3ζ功能信號傳導結構域之刺激結構域，或具有至少一個針對其之修飾的胺基酸序列。在一些實施例中，該抗體結構域包含抗體片段。在一些實施例中，該抗體結構域包含scFv或VH結構域。
在一些實施例中，該重組核酸分子編碼(a)重鏈(HC)CDR1序列GRTVSSLF(SEQ ID NO：16)、GRAVSSLF(SEQ ID NO：21)或GDSLDGYV(SEQ ID NO：31)，(b)HC CDR2序列ISRYSLYT(SEQ ID NO：17)或ISGDGSMR(SEQ ID NO：32)，及(c)HC CDR3序列ASKLEYTSNDYDS(SEQ ID NO：18)或AADPPTWDY(SEQ ID NO：33)。在一些實施例中，該重組核酸分子編碼(a)重鏈(HC)CDR1序列GFTSDYYI(SEQ ID NO：52)或GFASDDYI(SEQ ID NO：67)，(b)HC CDR2序列ISSKYANT(SEQ ID NO：53)或ISSRYANT(SEQ ID NO：68)，及(c)HC CDR3序列AADTRRYTCPDIATMHRNFDS(SEQ ID NO：54)或AMDSRRVTCPEISTMHRNFDS(SEQ ID NO：69)。在一些實施例中，該分離之核酸分子編碼與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：40中所示之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列一致性之重鏈可變結構域。在一些實施例中，該抗體結構域為與SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：76中所示之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列一致性之VHH結構域。在一些實施例中，使用BLAST算法以字組大小6、BLOSUM62矩陣、存在罰分11及延伸罰分1確定序列一致性。在一些實施例中，該TFP包括TCR次單元之細胞外結構域，該細胞外結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的細胞外結構域或其一部分：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。在一些實施例中，該編碼TFP包括跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的跨膜結構域：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、其功能片段，及其 具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。在一些實施例中，該編碼TFP包括跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的跨膜結構域：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR ζ鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。
在一些實施例中，該重組核酸分子進一步包含編碼共刺激結構域之序列。在一些實施例中，該共刺激結構域為獲自選自由以下組成之群的蛋白質的功能信號傳導結構域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)，及其具有至少一個但不超過20個針對其之修飾的胺基酸序列。在一些實施例中，該至少一個但不超過20個針對其之修飾包含介導細胞信號傳導之胺基酸修飾或響應於配位體結合至該TFP而磷酸化之胺基酸修飾。在一些實施例中，該分離之核酸分子為mRNA。在一些實施例中，該TFP包括TCR次單元之基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)，其包含選自由以下組成之群的蛋白質的ITAM或其一部分：CD3ζ TCR次單元、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、TCR ζ鏈、Fcε受體1鏈、Fcε受體2鏈、Fcγ受體1鏈、Fcγ受體2a鏈、Fcγ受體2b1鏈、Fcγ受體2b2鏈、Fcγ受體3a鏈、Fcγ受體3b鏈、Fcβ受體1鏈、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個針對其之修飾的胺基酸序列。在一些實施例中，該ITAM置換CD3γ、CD3δ或CD3ε之ITAM。在一些實施例中，該ITAM係選自由以下組成之群：CD3ζ TCR次單元、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元，且置換選自由以下組成之群的 不同ITAM：CD3ζ TCR次單元、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元。在一些實施例中，該核酸包含核苷酸類似物。在一些實施例中，該核苷酸類似物係選自由以下組成之群：經2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-胺基丙基、2’-去氧、T-去氧-2’-氟、2’-O-胺基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基胺基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基胺基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙醯胺基(2’-O-NMA)修飾之鎖核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-無水己糖醇核酸(HNA)、嗎啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸及2’-氟N3-P5’-亞磷醯胺。在一些實施例中，該重組核酸分子進一步包含前導序列。
根據一態樣，本文中提供一種由本文中描述之重組核酸分子編碼之重組多肽分子。
根據一態樣，本文中提供一種重組TFP分子，其包含抗TAA結合結構域(例如MUC16、IL13Ra2或MSLN結合結構域)、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域。
根據一態樣，本文中提供一種重組TFP分子，其包含抗TAA結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，其中該TFP分子能夠與內源TCR複合物及/或至少一種內源TCR多肽在功能上相互作用。
根據一態樣，本文中提供一種重組TFP分子，其包含抗TAA結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，其中該TFP分子能夠功能整合至內源TCR複合物中。
在一些實施例中，該重組TFP分子包含含有抗MUC16、抗IL13Rα2或抗MSLN結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域之抗體或抗體片段。
在一些實施例中，該抗TAA結合結構域為scFv、VHH或VH結構域。
在一些實施例中，該抗TAA結合結構域包含與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：40之胺基酸序列具有95-100%一致性之重鏈、其功能片段或其具有至少一個但不超過30個修飾之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗TAA結合結構域包含與SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：76之胺基酸序列具有95-100%一致性之重鏈、其功能片段或其具有至少一個但不超過30個修飾之胺基酸序列。
在一些實施例中，使用BLAST算法以字組大小6、BLOSUM62矩陣、存在罰分11及延伸罰分1確定序列一致性。
在一些實施例中，該重組TFP分子包含TCR細胞外結構域，該TCR細胞外結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的細胞外結構域或其一部分：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗TAA結合結構域係藉由連接子序列連接至該TCR細胞外結構域。在一些實施例中，該連接子區包含(G4S)n，其中n=1至4(SEQ ID NO：107)。
根據一態樣，本文中提供一種核酸，其包含編碼TFP之序列。
在一些實施例中，該核酸係選自由以下組成之群：DNA及RNA。在一些實施例中，該核酸為mRNA。在一些實施例中，該核酸包含核苷酸類似物。在一些實施例中，該核苷酸類似物係選自由以下組成之群：經2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-胺基丙基、2’-去氧、T-去氧-2’-氟、2’-O-胺基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基胺基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基胺基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙醯 胺基(2’-O-NMA)修飾之鎖核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-無水己糖醇核酸(HNA)、嗎啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸及2’-氟N3-P5’-亞磷醯胺。在一些實施例中，該核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，該核酸為活體外轉錄之核酸。在一些實施例中，該核酸進一步包含編碼聚(A)尾之序列。在一些實施例中，該核酸進一步包含3'UTR序列。
根據一態樣，本文中提供一種載體，其包含編碼TFP之核酸分子。
在一些實施例中，該載體係選自由以下組成之群：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體、勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma viral，RSV)載體或反轉錄病毒載體。在一些實施例中，該載體進一步包含啟動子。在一些實施例中，該載體為活體外轉錄之載體。在一些實施例中，該載體中之核酸序列進一步包含聚(A)尾。在一些實施例中，該載體中之核酸序列進一步包含3'UTR。
在一些實施例中，本文中提供一種細胞，其包含本文中描述之重組核酸分子。在一些實施例中，本文中提供一種多肽分子。在一些實施例中，本文中提供一種TFP分子。在一些實施例中，本文中提供一種核酸。在一些實施例中，本文中提供一種載體。在一些實施例中，該細胞為人類T細胞。在一些實施例中，該T細胞為CD8+或CD4+ T細胞或CD4+CD8+ T細胞。在一些實施例中，該T細胞為γδ T細胞。在一些實施例中，該細胞進一步包含編碼抑制性分子之核酸，該抑制性分子包含第一多肽，該第一多肽包含抑制性分子之至少一部分，該抑制性分子之至少一部分與包含細胞內信號傳導結構域之正信號的第二多肽締合。在一些實施例中，該抑制性分子包含第一多肽及第二多肽，該第一多肽包含PD1之至少一部分，該第二多肽包含共刺激結構域及一級信號傳導結構域。
根據一態樣，本文中提供一種人類CD8+或CD4+ T細胞，其包含至 少兩種TFP分子，該等TFP分子包含抗TAA結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，其中該TFP分子能夠與人類CD8+或CD4+ T細胞中、處及/或表面上之內源TCR複合物及/或至少一種內源TCR多肽在功能上相互作用。
根據一態樣，本文中提供一種蛋白質複合物，其包含：(a)TFP分子，其包含抗TAA結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域；及(b)至少一種內源TCR次單元或內源TCR複合物。
在一些實施例中，該TCR包含選自由以下組成之群的蛋白質的細胞外結構域或其一部分：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元。在一些實施例中，該抗TAA結合結構域係藉由連接子序列連接至該TCR細胞外結構域。在一些實施例中，該連接子區包含(G4S)n，其中n=1至4(SEQ ID NO：107)。
根據一態樣，本文中提供一種蛋白質複合物，其包含(a)由本文中揭示之重組核酸分子中之任一者編碼的TFP，及(b)至少一種內源TCR次單元或內源TCR複合物。
根據一態樣，本文中提供一種蛋白質複合物，其包含：(a)TFP分子，其包含抗TAA結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域；及(b)至少一種內源TCR次單元或內源TCR複合物。
在一些實施例中，該TCR包含選自由以下組成之群的蛋白質的細胞外結構域或其一部分：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元。在一些實施例中，該抗TAA結合結構域係藉由連接子序列連接至該TCR細胞外結構域。在一些實施例中，該連接子區包含(G4S)n，其中n=1至4(SEQ ID NO：107)。
根據一態樣，本文中提供一種人類CD8+或CD4+ T細胞，其包含每種蛋白質複合物至少兩種不同的TFP蛋白質。
根據一態樣，本文中提供一種人類CD8+或CD4+ T細胞，其包含至少兩種不同的由本文中描述之分離之核酸分子編碼之TFP分子。
根據一態樣，本文中提供一種人類CD8+或CD4+ T細胞群體，其中該群體之T細胞個別或共同包含至少兩種TFP分子，該等TFP分子包含抗TAA結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，其中該TFP分子能夠與該人類CD8+或CD4+ T細胞中、處及/或表面上之內源TCR複合物及/或至少一種內源TCR多肽在功能上相互作用。
根據一態樣，本文中提供一種人類CD8+或CD4+ T細胞群體，其中該群體之T細胞個別或共同包含至少兩種由本文中描述之重組核酸分子編碼之TFP分子。
根據一態樣，本文中提供一種製造細胞之方法，其包括用本文中描述之重組核酸分子、本文中描述之核酸或本文中描述之載體對T細胞進行轉導。
根據一態樣，本文中提供一種產生RNA工程化細胞群體之方法，其包括將活體外轉錄之RNA或合成RNA引入細胞中，其中該RNA包含編碼本文中描述之TFP分子的核酸。
根據一態樣，本文中提供一種在哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性之方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之本文中描述之重組核酸分子、本文中描述之多肽分子、表現本文中描述之多肽分子的細胞、本文中描述之TFP分子、本文中描述之核酸、本文中描述之載體或本文中描述之細胞。在一些實施例中，該細胞為自體T細胞。在一些實施例中，該細胞為同種異體T細胞。在一些實施例中，該哺乳動物為人類。
根據一態樣，本文中提供一種治療患有與MUC16、IL13Rα2或MSLN表現相關之疾病的哺乳動物的方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之分離之核酸分子、本文中描述之多肽分子、表現該多肽分子之細胞、本文中描述之TFP分子、本文中描述之核酸、載體或細胞。在一些實施例中，該與MUC16、IL13Rα2或MSLN表現相關之疾病係選自由以下組成之群：增殖性疾病、癌症、惡性病、骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群、白血病前期、與MUC16、IL13Rα2或MSLN表現相關之非癌症相關適應症。在一些實施例中，該疾病為胰臟癌、卵巢癌、乳癌或其任何組合。在一些實施例中，表現TFP分子之細胞係與使表現TFP分子之細胞之效力增加的劑組合投與。在一些實施例中，與投與有效量之表現抗TAA嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的哺乳動物相比，該哺乳動物中釋放更少細胞介素。在一些實施例中，表現TFP分子之細胞係與改善與投與表現TFP分子之細胞相關之一或多種副作用的劑組合投與。在一些實施例中，表現TFP分子之細胞係與治療與TAA(例如MUC16、IL13Rα2或MSLN)相關之疾病的劑組合投與。在一些實施例中，該多肽分子、表現該多肽分子之細胞、該重組TFP、該核酸、該載體、該複合物或該細胞係用作藥物。
根據一態樣，本文中提供編碼TFP之重組核酸分子、TFP之多肽分子、表現TFP之多肽分子的細胞、重組TFP、編碼TFP之核酸、包含編碼TFP之核酸的載體、蛋白質複合物或細胞係用作藥物。根據一態樣，本文中提供一種治療患有與MUC16、IL13Rα2或MSLN表現相關之疾病的哺乳動物的方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之該重組核酸分子、該多肽分子、表現該多肽分子之細胞、該重組TFP分子、該核酸、該載體或該細胞，其中與投與有效量之表現抗TAA嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的哺乳動物相比，該哺乳動物中釋放更少細胞介素。
根據一態樣，本文中提供一種醫藥組合物，其包含(I)來自人類個體之T細胞，其中該T細胞包含編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之重組核酸分子，該T細胞受體融合蛋白包含(a)TCR次單元，其包含(i)TCR細胞外結構域之至少一部分，(ii)TCR跨膜結構域，及(iii)TCR細胞內結構域，其包含來自細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及(b)抗原結合結構域，其包含抗IL13Rα2結合結構域；及(II)醫藥學上可接受之載劑；其中該TCR次單元及該抗IL13Rα2結合結構域可操作地連接；其中該TFP當表現於該T細胞中時與TCR在功能上相互作用。在一些實施例中，該TCR次單元之該TCR細胞外結構域、該TCR跨膜結構域及該TCR細胞內結構域來源於TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRγ鏈、TCRδ鏈、CD3ε、CD3δ或CD3γ。在一些實施例中，該TCR次單元之該TCR細胞外結構域、該TCR跨膜結構域及該TCR細胞內結構域來源於TCR複合物之單一次單元，其中該單一次單元為TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRγ鏈、TCRδ鏈、CD3ε、CD3γ或CD3δ。在一些實施例中，該T細胞與不含該TFP之T細胞相比對表現與該抗IL13Rα2結合結構域特異性相互作用之抗原的細胞展現增加之細胞毒性。
根據一態樣，本文中提供一種在哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性之方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之經編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之重組核酸分子轉導之T細胞群體，該T細胞受體融合蛋白包含TCR次單元，其包含TCR細胞外結構域之至少一部分，及TCR細胞內結構域，其包含來自細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及人類或人類化抗體結構域，其包含抗原結合結構域抗間皮素結合結構域；其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中，且其中該T細胞群體優先殺死與具有較低間皮素表現之腫瘤細胞隔開的具有較高間皮素表現之腫瘤細胞。
在一些實施例中，TCR次單元進一步包含TCR跨膜結構域。在一些實施例中，該TCR細胞外結構域、該TCR跨膜結構域及該TCR細胞內結構域來源於TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRγ鏈、TCRδ鏈、CD3ε、CD3γ或CD3δ。在一些實施例中，該TCR次單元之該TCR細胞外結構域、該TCR跨膜結構域及該TCR細胞內結構域來源於TCR複合物之單一次單元，其中該單一次單元為TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRγ鏈、TCRδ鏈、CD3ε、CD3γ或CD3δ。在一些實施例中，該TCR細胞內信號傳導結構域來源於CD3ε或CD3γ。
本專利或申請案檔案含有至少一個以彩色製作之圖式。需要時且在支付必需費用後，事務所將提供含彩色圖式之此專利或專利申請公開案副本。所附申請專利範圍中詳細闡述本發明之新穎特徵。藉由參考闡述利用本發明原理之說明性實施例的以下詳細描述及附圖，將獲得對本發明之特徵及優勢之更好理解，其中：
圖1描繪實例IL13Rα2純系序列。圖1揭示之序列依照出現順序分別為SEQ ID NOs：51、61、128、56、129-135、66、76、136、71及137-143。
圖2係說明進行Pall Forte Bio Dip & Read AHC抗原決定基分區分析之方式的圖。使AHC生物感測器尖端經由Fc結構域偶聯至4H11 scFv-Fc抗體(4H11)，隨後經由其Fv結構域結合至抗原肽(「Ag」，例如MUC16、IL13Ra2、MSLN)。隨後以100nM添加各sdAb(Ab2)以評定與4H11 scFv-Fc抗體對結合至抗原之競爭。
圖3A描繪來自測試抗IL13Rα2奈米抗體之活體外活性的腫瘤細胞溶解分析的資料。
圖3B描繪顯示TFP T細胞誘導IFNγ及IL-2產生之能力的實驗資料。
圖3C描繪來自測試抗IL13Rα2奈米抗體之活體外活性的腫瘤細胞溶解分析的實驗資料。
圖3D描繪顯示TFP T細胞誘導IFNγ及IL-2產生之能力的實驗資料。
圖3E描繪來自測試抗IL13Rα2奈米抗體之活體外活性的腫瘤細胞溶解分析的實驗資料。
圖3F描繪顯示TFP T細胞誘導IFNγ及IL-2產生之能力的實驗資料。
圖4描繪來自測試IL13Rα2-TFP T細胞之效力的IL13Rα2 U251 GBM模型的實驗資料。該圖顯示在將5×106個U251細胞經皮下注射至NSG小鼠中，繼而在4天後經靜脈內投與1×107個IL13Rα2-TFP T細胞之後藉由卡尺量測之平均腫瘤體積。
圖5A至圖5C顯示親本(美洲駝)及人類化抗MUC16單鏈抗體(VHH)之結合親和力之滴定及量測。圖5A係說明使用NTA生物感測器(經鎳塗覆之表面)篩檢實例5中產生之VHH結合物的實驗程序的圖。使His標籤化MUC16 sdAb(3.25μg/ml)與生物感測器結合，且以0、1.56、6.25、25、50、100或200nM之濃度添加MUC16肽。緩衝液：1×Octet；1×含0.02% Tween® 20之Corning® Cellgro® PBS(目錄號21-040-CM)，30℃。感測器：Pall Forte Bio Dip & Read(目錄號18-5102)。圖5B(純系R3Mu4親本及人類化變異體)及圖5C(純系R3Mu29親本及人類化變異體)顯示sdAb與MUC16標靶之結合動力學(亦參見表1)。使用此等曲線得到各蛋白質之結合親和力常數且評定人類化對抗原結合之效應。
圖6A至圖6C顯示抗MUC16 sdAb與用作陽性對照之MUC-16特異性scFv-Fc工具結合物4H11相比之抗原決定基分區。圖6A係說明如圖2中針對IL13Rα2結合物所示進行Pall Forte Bio Dip & Read AHC抗原決定基分區分析之方式的圖。使AHC生物感測器尖端經由Fc結構域偶聯至4H11 scFv-Fc抗體 (4H11)，隨後經由其Fv結構域結合至MUC16抗原肽(Ag)。隨後以100nM添加各sdAb(Ab2)以評定與4H11 scFv-Fc抗體對結合至MUC16抗原之競爭。如圖6B中所示，MUC16 sdAb-親本(美洲駝)R3Mu4及親本(美洲駝)R3Mu29顯示在4H11工具結合物已與MUC16肽結合之後與該MUC16肽結合，證明與4H11 scFv-Fc工具結合物相比，親本sdAb識別並分區至MUC16肽之不同的抗原決定基。陰性對照在無抗原(MUC16肽)之情況下顯示無結合，從而排除任何非特異性結合之機會。圖6C描繪MUC16胞外結構域序列情況下之相關抗體之抗原決定基(SEQ ID NO：96)。
圖7顯示表現包含TCR次單元及包含抗MUC16結合結構域之抗體結構域之T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之T細胞對表現MUC16胞外結構域(「MUC16ecto」)之細胞的劑量依賴性溶解的圖。T細胞特異性殺死經轉導以便以劑量依賴性方式過度表現C末端細胞締合MUC16形式之SKOV3-MUC16Cterm卵巢癌細胞，而親本SKOV3 MUC16陰性細胞倖免於T細胞介導之殺死。同樣，表現MUC16-TFP之T細胞消除過度表現細胞締合MUC16形式之OVCAR3-MUC16-Cterm細胞。表現低水準MUC16之親本OVCAR3細胞僅在最高TFP-T細胞與靶細胞比率下被殺死。同樣，TFP-T細胞僅在靶細胞上存在MUC16時釋放細胞介素，從而支持單結構域抗體之特異性。
圖8描繪顯示MUC16-TFP在使用表現高水準及低水準MUC16之卵巢細胞株的細胞分析中的效力的實例實驗資料。在此等研究中，觀測到MUC16-TFP具有優先殺死能力，視腫瘤細胞表面上之MUC16水準而定。更確切言之，觀測到MUC16-TFP以劑量依賴性方式殺死表現高MUC16之腫瘤細胞，而在此等分析中所使用之劑量水準下未觀測到表現低MUC16之細胞的MUC16-TFP殺死。
圖9A至圖9B描繪基於流式細胞術之MUC16ecto拷貝數定量的結果。將經4H11-PE抗體染色之腫瘤細胞與Quantibrite珠粒一起在Fortessa® X-20上運作。計算細胞以及珠粒之幾何中值螢光強度(gMFI)(圖9A)。珠粒儲備含有4個群體，該等群體製造為每個珠粒具有不同數目之PE分子(高、中、低、陰性)。基於每個珠粒之指定PE分子拷貝相對於各組珠粒之量測MFI來產生標準曲線。隨後基於珠粒產生之標準曲線來估計腫瘤細胞上MUC16ecto之拷貝數。OVCAR3、OVCAR3-MUC16ecto、SKOV3及SKOV3-MUC16ecto細胞上之MUC16ecto拷貝分別測定為726、3616、39及2351(圖9B)。
圖10A至圖10D顯示一系列顯示MUC16 TFP-T細胞之MUC16ecto特異性腫瘤細胞溶解的圖。表現MUC16 TFP之T細胞特異性殺死過度表現細胞締合MUC16形式之SKOV3-MUC16ecto細胞(圖10A)，而表現MUC16 TFP之T細胞並未殺死親本SKOV3細胞(圖10B)。同樣，表現MUC16-TFP之T細胞消除過度表現細胞締合MUC16形式之OVCAR3-MUC16ecto細胞(圖10C)。僅部分殺死表現低水準MUC16ecto之親本OVCAR3細胞(圖10D)。
圖11A至圖11H顯示一系列顯示MUC16 TFP-T細胞之MUC16ecto特異性細胞介素產生的圖。表現MUC16 TFP之T細胞當與SKOV3-MUC16ecto細胞(分別為圖11A及圖11E)或OVCAR3-MUC16ecto細胞(分別為圖11C及圖11G)共培養時分泌IFN-γ及IL-2，但與SKOV3細胞(分別為圖11B及圖11F)或OVCAR3細胞(分別為圖11D及圖11H)共培養時則不然。
圖12描繪表現MUC16-TFP之T細胞的MUC16ecto特異性增殖。藉由以流式細胞術分析監測T細胞追蹤信號之稀釋(CellTraceTM之信號強度降低)來確定MUC16-TFP T細胞之MUC16ecto特異性增殖。用CellTraceTM遠紅光增殖套組(目錄號C34564ThermoFisher)標記表現MUC16-TFP之T細胞，隨後與 SKOV3或SKOV3-MUC16ecto細胞以1：1比率共培養3天。亦用單獨培養基或用1μg/mL板結合抗CD3抗體(純系OKT-3，目錄號14-0037-82，Invitrogen)將經CellTrace遠紅光增殖套組標記之表現MUC16-TFP之T細胞刺激3天。表現MUC16-TFP之T細胞顯示MUC16ecto特異性增殖，由當與SKOV3-MUC16ecto細胞共培養時存在CellTrace信號減少但與SKOV3細胞共培養時則不然來證明(圖12)。
圖13A至圖13C描繪一系列顯示MUC16-TFP T細胞之活體內活性的圖。在人類卵巢癌細胞株SKOV3-MUC16ecto細胞及OVCAR3-MUC16ecto細胞之NSG小鼠異種移植模型中評估表現MUC16-TFP之T細胞。在SKOV3-MUC16ecto細胞之腹膜內模型中，MUC16 TFP1顯示腫瘤負荷與第0天(T細胞注射當天)之基線水準相比顯著減少(圖13A)。一致地，在SKOV3-MUC16ecto細胞之皮下模型中，MUC16 TFP1當與NT T細胞相比時顯著延遲腫瘤生長(圖13B)。在OVCAR3-MUC16ecto細胞之腹膜內模型中，MUC16 TFP1及MUC16 TFP2均完全清除了小鼠中之腫瘤(圖13C)。
圖14A至圖14B為顯示MSLN-TFP T細胞在攜帶MSTO-MSLN高或MSTO-MSLN低腫瘤之NSG小鼠中對高MSLN腫瘤(MSTO-MSLN高，表面MSLN之11006個拷貝)及低MSLN腫瘤(MSTO-MSLN低，表面MSLN之198個拷貝)之差異性殺死能力。將攜帶腫瘤之小鼠經靜脈內注射未經轉導之T細胞(NT，1×107個總T細胞)或MSLN-TFP T細胞(1×107個總T細胞)。與經NTT細胞處理之小鼠相比，MSLN-TFP T細胞顯著控制高MSLN腫瘤之生長(圖14A)。另一方面，在經MSLN-TFP T細胞處理之具有低MSLN腫瘤之小鼠中觀測到有限的抗腫瘤反應(圖14B)。
交叉引用
本申請案主張2018年7月26日申請之美國臨時專利申請案第62/703,824號、2018年8月30日申請之美國臨時專利申請案第62/725,066號、2018年7月26日申請之美國臨時專利申請案第62/703,834號、2018年9月5日申請之美國臨時專利申請案第62/727,469號及2018年9月5日申請之美國臨時專利申請案第62/727,459號之權益，各案係以引用之方式整體併入本文中。
以引用之方式併入
本說明書中所提及之所有出版物、專利及專利申請案均以引用之方式併入本文中，其併入程度如同明確地且個別地指示各個別出版物、專利或專利申請案係以引用之方式併入一般。本申請案包含序列表，其係以ASCII格式經由電子送件，並以引用之方式整體併入本文中。該ASCII檔案於2019年8月23日產生，檔名為48538-718 601 SL.txt，檔案大小131,781位元。
本文中描述TCR次單元(包括CD3ε、CD3γ及CD3δ)以及具有對細胞表面抗原具特異性之結合結構域的TCRα及TCRβ鏈之新穎融合蛋白，該等新穎融合蛋白有可能克服現有方法之侷限性。
本文中描述比CAR更高效地殺死靶細胞但釋放相當或更低水準之促炎性細胞介素的新穎融合蛋白。此等融合蛋白及其使用方法代表T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)相對於CAR之優勢，因為此等細胞介素之升高水準與過繼性CAR-T療法之劑量限制性毒性相關。
在一個態樣中，本文中描述編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之分離之核酸分子，該T細胞受體融合蛋白包含TCR次單元及包含抗腫瘤相關抗原(TAA)結合結構域(例如，IL13Ra2、MUC16或MSLN結合域)之抗體結構域。 在一些實施例中，該抗體結構域為人類或人類化抗體結構域。在一些實施例中，該TCR次單元進一步包含TCR細胞外結構域。在其他實施例中，該TCR次單元包含TCR跨膜結構域。在其他實施例中，該TCR次單元包含TCR細胞內結構域。在其他實施例中，該TCR次單元包含(i)TCR細胞外結構域，(ii)TCR跨膜結構域，及(iii)TCR細胞內結構域，其中(i)、(ii)及(iii)中至少兩個來自相同TCR次單元。在其他實施例中，該TCR次單元包含TCR細胞內結構域，該TCR細胞內結構域包含選自CD3ε、CD3γ或CD3δ之細胞內信號傳導結構域的刺激結構域或具有至少一、二或三個針對其之修飾的胺基酸序列。在其他實施例中，該TCR次單元包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含選自4-1BB功能信號傳導結構域及/或CD3ζ功能信號傳導結構域之刺激結構域，或具有至少一、二或三個針對其之修飾的胺基酸序列。
在一些實施例中，分離之核酸分子包含(i)本文中提供之任何抗TAA輕鏈結合結構域胺基酸序列之輕鏈(LC)CDR1、LC CDR2及LC CDR3，及/或(ii)本文中提供之任何抗TAA重鏈結合結構域胺基酸序列之重鏈(HC)CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
在一些實施例中，分離之核酸分子包含本文中提供之任何抗TAA重鏈抗體或單結構域抗體之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。舉例而言，重鏈抗體或單結構域抗體可見於駱駝科(Camelidae)動物中。偶蹄目(Artiodactyla)駱駝亞目(Tylopoda)駱駝科(駱駝：單峰之單峰駝(Camelus dromedary)及雙峰之雙峰駝(Camelus bactrianus)；美洲駝：大羊駝(Lama glama)、南美駝馬(Lama guanicoe)、瘦駝(Lama vicugna)；羊駝(alpaca)：羊駝(Vicugna pacos))在其血清中除經典抗體以外亦具有一種特殊類型之抗體。此等稱為重鏈抗體(HCAb)之抗體的獨特之處在於不存在整個輕鏈及第一重鏈恆定區(CH1)。在鬚鯊、鉸口鯊及兔銀鮫中亦發 現類似於駱駝僅重鏈抗體(cAb)之抗體。
在一些實施例中，輕鏈可變區包含具有對本文中提供之輕鏈可變區胺基酸序列之至少一、二或三個修飾但不超過30、20或10個修飾之胺基酸序列或與本文中提供之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列。在其他實施例中，重鏈可變區包含具有對本文中提供之重鏈可變區胺基酸序列之至少一、二或三個修飾但不超過30、20或10個修飾之胺基酸序列或與本文中提供之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列。
在一些實施例中，該TFP包括TCR次單元之細胞外結構域，該細胞外結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的細胞外結構域或其一部分：T細胞受體之α或β鏈、CD3δ、CD3ε或CD3γ或其功能片段，或具有至少一、二或三個但不超過20、10或5個針對其之修飾的胺基酸序列。在其他實施例中，該編碼TFP包括跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的跨膜結構域：TCR之α、β鏈或TCR次單元CD3ε、CD3γ及CD3δ或其功能片段，或具有至少一、二或三個修飾但不超過20、10或5個針對其之修飾的胺基酸序列。
在一些實施例中，該編碼TFP包括跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的跨膜結構域：TCR之α、β或ζ鏈，或CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD45、CD2、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154及其功能片段。在一些實施例中，該編碼TFP包括包含具有至少一、二或三個針對其之修飾但不超過20、10或5個針對其之修飾的胺基酸序列的蛋白質的跨膜結構域，其中該蛋白質選自由以下組成之群：TCR之α、β或ζ鏈，或CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD45、CD2、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、 CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154及其功能片段。
在一些實施例中，該編碼抗TAA結合結構域係藉由連接子序列連接至該TCR細胞外結構域。在一些情況下，該編碼連接子序列包含(G4S)n，其中n=1至4(SEQ ID NO：107)。在一些情況下，該編碼連接子序列包含長連接子(LL)序列。在一些情況下，該編碼長連接子序列包含(G4S)n，其中n=2至4(SEQ ID NO：108)。在一些情況下，該編碼連接子序列包含短連接子(SL)序列。在一些情況下，該編碼短連接子序列包含(G4S)n，其中n=1至3(SEQ ID NO：109)。
在一些實施例中，該分離之核酸分子進一步包含編碼共刺激結構域之序列。在一些情況下，該共刺激結構域為獲自選自由以下組成之群的蛋白質的功能信號傳導結構域：DAP10、DAP12、CD30、LIGHT、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)，或具有至少一、二或三個針對其之修飾但不超過20、10或5個針對其之修飾的胺基酸序列。
在一些實施例中，該經分離之核酸分子進一步包含前導序列。
本文中亦提供由先前描述之核酸分子中之任一者編碼的經分離之多肽分子。
在另一態樣中，本文中亦提供包含抗TAA結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域之經分離之T細胞受體融合蛋白(TFP)分子。在一些實施例中，該經分離之TFP分子包含含有人類或人類化抗TAA結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域之抗體或抗體片段。在一些實施例中，該抗TAA結合結構域為人類或人類化結合結構域。在一些實施例中，該抗TAA結合結構域未經人類化。在一些實施例中，該抗TAA結合結構域包含駱駝抗體或其抗體片段。
在一些實施例中，該抗體結構域包含抗體片段。在一些實施例中，該抗體結構域包含scFv、單結構域抗體(sdAb)或VH結構域。
在一些實施例中，該人類或人類化抗體結構域包含抗體片段。在一些實施例中，該人類或人類化抗體結構域包含scFv、單結構域抗體(sdAb)或VH結構域。
在一些實施例中，該抗TAA結合結構域為scFv、單結構域抗體(sdAb)、VHH或VH結構域。在一些實施例中，該抗TAA結合結構域包含本文中提供之胺基酸序列之輕鏈及重鏈，或其功能片段，或具有對本文中提供之輕鏈可變區之胺基酸序列之至少一、二或三個修飾但不超過30、20或10個修飾之胺基酸序列或與本文中提供之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列。
在一些實施例中，該經分離之TFP分子包含TCR細胞外結構域，該TCR細胞外結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的細胞外結構域或其一部分：T細胞受體之α或β鏈、CD3δ、CD3ε或CD3γ，或具有至少一、二或三個針對其之修飾但不超過20、10或5個針對其之修飾的胺基酸序列。
在一些實施例中，該抗TAA結合結構域係藉由連接子序列連接至該TCR細胞外結構域。在一些情況下，該連接子區包含(G4S)n，其中n=1至4(SEQ ID NO：107)。在一些情況下，該連接子序列包含長連接子(LL)序列。在一些情況下，該長連接子序列包含(G4S)n，其中n=2至4(SEQ ID NO：108)。在一些情況下，該連接子序列包含短連接子(SL)序列。在一些情況下，該短連接子序列包含(G4S)n，其中n=1至3(SEQ ID NO：109)。
在一些實施例中，該經分離之TFP分子進一步包含編碼共刺激結構域之序列。在其他實施例中，該經分離之TFP分子進一步包含編碼細胞內信號傳導結構域之序列。在其他實施例中，該經分離之TFP分子進一步包含前導序 列。
本文中亦提供包含編碼先前描述之TFP分子中之任一者的核酸分子的載體。在一些實施例中，該載體係選自由以下組成之群：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體或反轉錄病毒載體。在一些實施例中，該載體進一步包含啟動子。在一些實施例中，該載體為活體外轉錄之載體。在一些實施例中，該載體中之核酸序列進一步包含聚(A)尾。在一些實施例中，該載體中之核酸序列進一步包含3'UTR。
本文中亦提供包含所描述之載體中之任一者的細胞。在一些實施例中，該細胞為人類T細胞。在一些實施例中，該細胞為CD8+或CD4+ T細胞。在其他實施例中，該細胞進一步包含編碼抑制性分子之核酸，該抑制性分子包含第一多肽，該第一多肽包含抑制性分子之至少一部分，該抑制性分子之至少一部分與包含細胞內信號傳導結構域之正信號的第二多肽締合。在一些情況下，該抑制性分子包含第一多肽及第二多肽，該第一多肽包含PD1之至少一部分，該第二多肽包含共刺激結構域及一級信號傳導結構域。
在另一態樣中，本文中提供經分離之TFP分子，其包含抗TAA結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，其中該TFP分子能夠與內源TCR複合物及/或至少一個內源TCR多肽在功能上相互作用。在一些實施例中，該抗TAA結合結構域為人類或人類化抗TAA結合結構域。
在另一態樣中，本文中提供經分離之TFP分子，其包含抗TAA結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，其中該TFP分子能夠功能整合至內源TCR複合物中。
在另一態樣中，本文中提供人類CD8+或CD4+ T細胞，其包含至少兩種TFP分子，該等TFP分子包含人類或人類化抗TAA結合結構域、TCR細 胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，其中該TFP分子能夠與人類CD8+或CD4+ T細胞中、處及/或表面上之內源TCR複合物及/或至少一個內源TCR多肽在功能上相互作用。
在另一態樣中，本文中提供蛋白質複合物，其包含i)TFP分子，該TFP分子包含人類或人類化抗TAA結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域；及ii)至少一種內源TCR複合物。
在一些實施例中，該TCR包含選自由以下組成之群的蛋白質的細胞外結構域或其一部分：該T細胞受體之α或β鏈、CD3δ、CD3ε或CD3γ。在一些實施例中，該抗TAA結合結構域係藉由連接子序列連接至該TCR細胞外結構域。在一些情況下，該連接子區包含(G4S)n，其中n=1至4(SEQ ID NO：107)。在一些情況下，該連接子序列包含長連接子(LL)序列。在一些情況下，該長連接子序列包含(G4S)n，其中n=2至4(SEQ ID NO：108)。在一些情況下，該連接子序列包含短連接子(SL)序列。在一些情況下，該短連接子序列包含(G4S)n，其中n=1至3(SEQ ID NO：109)。
本文中亦提供人類CD8+或CD4+ T細胞，其包含每所描述蛋白質複合物中之任一者至少兩種不同的TFP蛋白。
在另一態樣中，本文中提供一種人類CD8+或CD4+ T細胞群體，其中該群體之T細胞個別或共同包含至少兩種TFP分子，該等TFP分子包含人類或人類化抗TAA結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，其中該TFP分子能夠與該人類CD8+或CD4+ T細胞中、處及/或表面上之內源TCR複合物及/或至少一種內源TCR多肽在功能上相互作用。
在另一態樣中，本文中提供一種人類CD8+或CD4+ T細胞群體，其中該群體之T細胞個別或共同包含至少兩種由本文中提供之經分離之核酸分子 編碼的TFP分子。
在另一態樣中，本文中提供製造細胞之方法，其包括用所描述之載體中之任一者對T細胞進行轉導。
在另一態樣中，本文中提供產生RNA工程化細胞群體之方法，其包括將活體外轉錄之RNA或合成RNA引入細胞中，其中該RNA包含編碼所描述之TFP分子中之任一者的核酸。
在另一態樣中，本文中提供在哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性之方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之表現所描述之TFP分子中之任一者的細胞。在一些實施例中，該細胞為自體T細胞。在一些實施例中，該細胞為同種異體T細胞。在一些實施例中，該哺乳動物為人類。
在另一態樣中，本文中提供治療患有與腫瘤相關抗原(TAA)(例如MUC16、IL13Rα2或MSLN)表現相關之疾病的哺乳動物的方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之包含所描述之TFP分子中之任一者的細胞。在一些實施例中，與TAA(例如MUC16、IL13Rα2、MSLN)表現相關之疾病係選自增殖性疾病，諸如癌症或惡性病或癌前病狀，諸如胰臟癌、卵巢癌、胃癌、間皮瘤、肺癌或子宮內膜癌，或為與TAA(例如MUC16、IL13Rα2、MSLN)表現相關之非癌症相關適應症。
在一些實施例中，表現所描述之TFP分子中之任一者的細胞係與改善與投與表現TFP分子之細胞相關之一或多種副作用的劑組合投與。在一些實施例中，表現所描述之TFP分子中之任一者的細胞係與治療與TAA(例如MUC16、IL13Rα2、MSLN)相關之疾病的劑組合投與。
本文中亦提供所描述之經分離之核酸分子中之任一者、所描述之經分離之多肽分子中之任一者、所描述之經分離之TFP中之任一者、所描述之蛋 白質複合物中之任一者、所描述之載體中之任一者或所描述之細胞中之任一者以供用作藥物。
定義
除非另外定義，否則本文中使用之所有技術及科學術語均具有與熟習本發明所屬領域技術者通常所理解之含義相同的含義。
術語「一(a及an)」係指該冠詞之一個或多於一個(亦即，至少一個)語法受詞。舉例而言，「一要素」意謂一個要素或多於一個要素。
如本文中所使用，「約」可意謂加或減少於1%或1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%或超過30%，視情況而定且對熟習此項技術者為已知或可知的。
如本說明書中所使用，「個體(subject或subjects或individuals)」可包括但不限於哺乳動物，諸如人類或非人類哺乳動物，例如馴養動物、農用動物或野生動物，以及鳥類及水生動物。「患者」為罹患疾病、病症或病狀或有發展疾病、病症或病狀之風險或換言之需要本文中提供之組合物及方法的個體。
如本文中所使用，「治療(treating或treatment)」係指成功治療或改善疾病或病狀之任何標誌。治療可包括例如減輕、延遲或緩解疾病或病狀之一或多種症狀之嚴重程度，或其可包括降低患者經歷之疾病、缺陷、病症或不利病狀之症狀及其類似情形之頻率。如本文中所使用，「治療或預防」在本文中有時用於指在某種程度上治療或改善疾病或病狀之方法，且涵蓋指向該目的之一系列結果，包括但不限於完全預防病狀。
如本文中所使用，「預防」係指預防患者之疾病或病狀，例如腫瘤形成。舉例而言，若有發展腫瘤或其他形式癌症之風險的個體用本發明之方法 加以治療且稍後不發展腫瘤或其他形式癌症，則至少在一段時間內在該個體中預防該疾病。
如本文中所使用，「治療有效量」為足以提供有益效應或以其他方式減少投與組合物之個體之不利非有益事件的組合物或其活性組分的量。「治療有效劑量」在本文中意謂產生一或多種投與所要或理想(例如有益)效應之劑量，此種投與在給定時段內發生一或多次。確切劑量將視治療目的而定，且將由熟習此項技術者使用已知技術來確定(參見例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；及Pickar,Dosage Calculations(1999))。
如本文中所使用，「T細胞受體(TCR)融合蛋白」或「TFP」包括來源於包含TCR之各種多肽的重組多肽，其一般能夠i)結合至靶細胞上之表面抗原以及ii)典型地當共同位於T細胞中或表面上時與完整TCR複合物之其他多肽組分相互作用。「TFP T細胞」為已根據本文中揭示之方法進行轉導且表現TFP，例如併入至天然TCR中之T細胞。在一些實施例中，T細胞為CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或CD4+/CD8+ T細胞。在一些實施例中，TFP T細胞為NK細胞。在一些實施例中，
如本文中所使用，術語「MUC16」，亦稱為黏蛋白16或CA125(癌症抗原125、癌瘤抗原125或糖抗原125(carbohydrate antigen 125))，係指人類中由MUC16基因編碼之蛋白質。MUC16為黏蛋白家族糖蛋白之成員，且已得以用作在患有特定類型癌症或其他良性病狀之一些患者的血液中可能升高的腫瘤標記物或生物標記物。MUC16用作卵巢癌偵測之生物標記物，且已發現其在其他癌症(包括子宮內膜癌、輸卵管癌、肺癌、乳癌及胃腸癌)中升高。MUC16亦已顯示抑制天然殺手細胞在對癌細胞之免疫反應中的活性(參見例如Patankar等 人，Gynecologic Oncology 99(3)；704-13)。
如本文中所使用，術語「IL13Rα2」，亦稱為分化簇213A2(CD213A2)，係指人類中由IL13Rα2基因編碼之膜結合蛋白。IL13Rα2為介白素13受體複合物之次單元且為IL13蛋白之受體。已發現IL13Rα2過度表現於多種癌症中，包括胰臟癌、卵巢癌、黑色素瘤及惡性神經膠質瘤。
如本文中所使用，術語「MSLN」或「間皮素」係指40kDa細胞表面糖基磷脂醯肌醇(GPI)連接之糖蛋白。人類間皮素蛋白合成為69kD前驅物，隨後進行蛋白水解加工。間皮素30kD胺基末端經分泌且稱為巨核細胞增強因子(Yamaguchi等人，J.Biol.Chem.269：805 808,1994)。40kD羧基末端仍作為成熟間皮素與膜結合(Chang等人，Natl.Acad.Sci.USA 93：136 140,1996；Scholler等人，Cancer Lett 247(2007),130-136)。例示性核酸及胺基酸間皮素序列亦可根據在NCBI登錄號NM_005823或NCBI登錄號NM_013404下發現之MSLN基因轉錄物來確定。因此，在本文中揭示之結合物構築體的特徵在於與參考抗體交叉競爭間皮素或其抗原決定基時，間皮素為Scholler等人，Cancer Lett 247(2007),130-136中所報導之間皮素。
人類及鼠類胺基酸及核酸序列可見於公共資料庫，諸如GenBank、UniProt及Swiss-Prot。舉例而言，人類MUC16之胺基酸序列可見於UniProt/Swiss-Prot登錄號Q8WXI7下。編碼人類MUC16之核苷酸序列可見於登錄號NM_024690下。編碼人類MUC16轉錄物變異體X1之核苷酸序列可見於登錄號XM_017027486下。編碼人類MUC16轉錄物變異體X2之核苷酸序列可見於登錄號XM_017027487下。編碼人類MUC16轉錄物變異體X3之核苷酸序列可見於登錄號XM_017027488下。編碼人類MUC16轉錄物變異體X4之核苷酸序列可見於登錄號XM_017027489下。編碼人類MUC16轉錄物變異體X5之 核苷酸序列可見於登錄號XM_017027490下。編碼人類MUC16轉錄物變異體X6之核苷酸序列可見於登錄號XM_017027491下。編碼人類MUC16轉錄物變異體X7之核苷酸序列可見於登錄號XM_017027492下。編碼人類MUC16轉錄物變異體X8之核苷酸序列可見於登錄號XM_017027493下。編碼人類MUC16轉錄物變異體X9之核苷酸序列可見於登錄號XM_017027494下。編碼人類MUC16轉錄物變異體X10之核苷酸序列可見於登錄號XM_017027495下。編碼人類MUC16轉錄物變異體X11之核苷酸序列可見於登錄號XM_017027499下。編碼人類MUC16轉錄物變異體X12之核苷酸序列可見於登錄號XM_017027500下。編碼人類MUC16轉錄物變異體X13之核苷酸序列可見於登錄號XM_017027501下。在一個實例中，TFP之抗原結合部分識別並結合如神經膠質瘤細胞、神經膠質瘤引發細胞、正常或惡性間皮瘤細胞、卵巢癌細胞、胰臟腺癌細胞或鱗狀細胞癌細胞上所表現之MUC16蛋白之細胞外結構域內的抗原決定基。
人類IL13Rα2之胺基酸序列可見於UniProt/Swiss-Prot登錄號Q14627下。編碼人類IL13Rα2之核苷酸序列可見於登錄號NM_000640下。編碼人類IL13Rα2前驅物之核苷酸序列可見於登錄號NP_000631下。在一個實例中，TFP之抗原結合部分識別並結合如神經膠質瘤細胞、神經膠質瘤引發細胞、正常或惡性間皮瘤細胞、卵巢癌細胞、胰臟腺癌細胞或鱗狀細胞癌細胞上所表現之IL13Rα2蛋白之細胞外結構域內的抗原決定基。
如本文中所使用之術語「抗體」係指來源於免疫球蛋白分子之蛋白質或多肽序列，其特異性結合至抗原。抗體可為多株或單株來源之完整免疫球蛋白或其片段，且可來源於天然或重組來源。
術語「抗體片段」或「抗體結合結構域」係指抗體之至少一部分或 其重組變異體，其含有抗原結合結構域，亦即，完整抗體中足以賦予抗體片段識別並特異性結合諸如抗原及其確定性抗原決定基之標靶的抗原決定可變區。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab)2及Fv片段、單鏈(sc)Fv(「scFv」)抗體片段、線性抗體、單結構域抗體(縮寫為「sdAb」)(VL或VH)、駱駝VHH結構域及由抗體片段形成之多特異性抗體。
術語「scFv」係指包含至少一個包含輕鏈可變區之抗體片段及至少一個包含重鏈可變區之抗體片段的融合蛋白，其中該輕鏈及重鏈可變區經由短可撓性多肽連接子鄰接，且能夠表現為單一多肽鏈，並且其中該scFv保留其所來源之完整抗體之特異性。
關於抗體之「重鏈可變區」或「VH」(或在單結構域抗體，例如奈米抗體之情況下之「VHH」)係指含有插入在稱為構架區之側翼延伸段之間的三個CDR的重鏈片段，此等構架區一般比CDR更高度保守且形成支撐CDR之支架。
除非說明，否則如本文中所使用，scFv可按任一順序具有VL及VH可變區，例如，就多肽N末端及C末端而言，scFv可包含VL-連接子-VH或可包含VH-連接子-VL。
本發明TFP組合物之包含抗體或其抗體片段之部分可呈多種形式存在，其中抗原結合結構域表現為鄰接多肽鏈之一部分，包括例如單結構域抗體片段(sdAb)或重鏈抗體HCAb、來源於鼠類、人類化或人類抗體之單鏈抗體(scFv)(Harlow等人，1999,Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.；Harlow等人，1989,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.；Houston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird等人，1988,Science 242：423-426)。在一個態樣中，本發明之TFP組合物之抗原結合結構域包含抗體片段。在另一態樣中，該TFP包含含有 scFv或sdAb之抗體片段。
術語「抗體重鏈」係指抗體分子中以天然存在之構型存在之兩種類型多肽鏈中之較大者，且通常決定抗體所屬之類別。
術語「抗體輕鏈」係指抗體分子中以天然存在之構型存在之兩種類型多肽鏈中之較小者。卡帕(「κ」)及蘭布達(「λ」)輕鏈係指兩種主要抗體輕鏈同型。
術語「重組抗體」係指使用重組DNA技術產生之抗體，諸如由細菌噬菌體或酵母表現系統表現之抗體。該術語亦應解釋為意謂已藉由合成編碼抗體之DNA分子且該DNA分子表現抗體蛋白質或規定抗體之胺基酸序列而產生之抗體，其中已使用此項技術中可利用且眾所周知的重組DNA或胺基酸序列技術獲得該DNA或胺基酸序列。
術語「抗原」或「Ag」係指能夠被抗體特異性結合或以其他方式激起免疫反應之分子。此免疫反應可涉及抗體產生或特定免疫勝任細胞之活化或二者。
熟習此項技術者應理解，任何巨分子，包括幾乎所有蛋白質或肽，均可用作抗原。此外，抗原可來源於重組或基因體DNA。熟習此項技術者應理解，包含編碼引發免疫反應之蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA均因此編碼「抗原」，如該術語用於本文中。此外，熟習此項技術者應理解，抗原不必僅由基因之全長核苷酸序列編碼。顯而易見，本發明包括但不限於使用多於一種基因之部分核苷酸序列且此等核苷酸序列以各種組合排列以編碼引發所要免疫反應之多肽。此外，熟習此項技術者應理解抗原完全不必由「基因」編碼。顯而易見，抗原可合成產生或可來源於生物樣品，或可能為除多肽以外之巨分子。此種生物樣品可包括但不限於含其他生物學組分之組織樣品、 腫瘤樣品、細胞或體液。
術語「抗腫瘤效應」係指可藉由各種結果體現之生物學效應，包括但不限於例如腫瘤體積減小、腫瘤細胞數目減少、轉移數目減少、預期壽命增加、腫瘤細胞增殖減少、腫瘤細胞存活時間減少或與癌性病狀相關之各種生理學症狀之改善。「抗腫瘤作用」亦可直接由本發明之肽、聚核苷酸、細胞及抗體預防腫瘤發生之能力來體現。
術語「自體」係指來源於與稍後將重新引入至其中之個體相同的個體之任何材料。
術語「同種異體」係指來源於與引入材料之個體屬於相同物種的不同動物或不同患者的任何材料。當一或多個基因座處之基因不一致時，稱兩個或更多個個體相對於彼此為同種異體。在一些態樣中，來自相同物種之個體的同種異體材料可在遺傳上足夠不同以發生抗原性相互作用。
術語「異種」係指來源於不同物種之動物的移植物。
術語「癌症」係指以異常細胞之快速且不受控制之生長為特徵的疾病。癌細胞可局部擴散或經由血流及淋巴系統擴散至身體其他部分。本文中描述各種癌症之實例，且包括但不限於乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、肺癌及其類似癌症。
片語與MUC16、IL13Rα2或MSLN「表現相關之疾病」包括但不限於與MUC16、IL13Rα2或MSLN表現相關之疾病或與表現MUC16、IL13Rα2或MSLN之細胞相關的病狀，包括例如增殖性疾病，諸如癌症或惡性病或癌前病狀。在一個態樣中，癌症為神經膠質母細胞瘤。在一個態樣中，癌症為間皮瘤。在一個態樣中，癌症為胰臟癌。在一個態樣中，癌症為卵巢癌。在一個態樣中，癌症為腦癌。在一個態樣中，癌症為胃癌。在一個態樣中，癌症為肺癌。 在一個態樣中，癌症為子宮內膜癌。與MUC16、IL13Rα2或MSLN表現相關之非癌症相關適應症包括但不限於例如自體免疫疾病(例如狼瘡、類風濕性關節炎、結腸炎)、炎性病症(過敏反應及哮喘)及移植。
術語「保守序列修飾」係指不顯著影響或改變含有胺基酸序列之抗體或抗體片段之結合特徵的胺基酸修飾。此種保守修飾包括胺基酸取代、添加或缺失。可藉由此項技術中已知的標準技術將修飾引入至本發明之抗體或抗體片段中，諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發。保守胺基酸取代為胺基酸殘基置換為具有類似側鏈之胺基酸殘基的取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β-分支側鏈之胺基酸(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳族側鏈之胺基酸(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因而，本發明之TFP內之一或多個胺基酸殘基可置換為來自相同側鏈家族之其他胺基酸殘基且可使用本文中描述之功能分析法測試經改變之TFP。
術語「刺激」係指由刺激結構域或刺激分子(例如TCR/CD3複合物)與其同源配位體結合從而介導信號轉導事件，諸如但不限於經由TCR/CD3複合物之信號轉導而誘導的一級反應。刺激可介導某些分子之表現改變及/或細胞骨架結構之重組及其類似事件。
術語「刺激分子」或「刺激結構域」係指對於T細胞信號傳導途徑之至少一些態樣提供以刺激方式調控TCR複合物之一級活化的一級細胞質信號 傳導序列的由T細胞表現的分子或其一部分。在一個態樣中，一級信號由例如TCR/CD3複合物與負載有肽之MHC分子結合而引發，且其介導T細胞反應，包括但不限於增殖、活化、分化及其類似反應。以刺激方式作用之一級細胞質信號傳導序列(亦稱為「一級信號傳導結構域」)可含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或「ITAM」之信號傳導基元。含有在本發明中具有特定用途之一級細胞質信號傳導序列的ITAM的實例包括但不限於來源於TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(亦稱為「ICOS」)及CD66d。
術語「抗原呈遞細胞」或「APC」係指呈現與其表面上之主要組織相容性複合體(MHC)複合之外來抗原的免疫系統細胞，諸如輔助細胞(例如，B細胞、樹突狀細胞及其類似物)。T細胞可使用其T細胞受體(TCR)識別此等複合物。APC處理抗原並將其呈遞至T細胞。
如本文中所使用之術語「細胞內信號傳導結構域」係指分子之細胞內部分。細胞內信號傳導結構域產生促進含TFP之細胞(例如表現TFP之T細胞)之免疫效應功能的信號。免疫效應功能(例如在表現TFP之T細胞中)之實例包括細胞溶解活性及T輔助細胞活性，包括細胞介素之分泌。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域可包含一級細胞內信號傳導結構域。例示性一級細胞內信號傳導結構域包括來源於負責一級刺激或抗原依賴性模擬之分子的一級細胞內信號傳導結構域。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域可包含共刺激細胞內結構域。例示性共刺激細胞內信號傳導結構域包括來源於負責共刺激信號或非抗原依賴性模擬之分子的共刺激細胞內信號傳導結構域。
一級細胞內信號傳導結構域可包含ITAM(「基於免疫受體酪胺酸之活化基元」)。含有一級細胞質信號傳導序列之ITAM之實例包括但不限於來源 於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、DAP10及DAP12之ITAM。
術語「共刺激分子」係指T細胞上與共刺激配位體特異性結合，從而介導T細胞之共刺激反應(諸如但不限於增殖)的同源結合搭配物。共刺激分子為除可能為有效免疫反應所需要之抗原受體或其配位體以外的細胞表面分子。共刺激分子包括但不限於MHC 1類分子、BTLA及鐸配位體受體，以及DAP10、DAP12、CD30、LIGHT、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)及4-1BB(CD137)。共刺激細胞內信號傳導結構域可為共刺激分子之細胞內部分。共刺激分子可在以下蛋白質家族中表示：TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴球活化分子(SLAM蛋白)及活化NK細胞受體。此種分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴球功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3及與CD83特異性結合之配位體及其類似物。細胞內信號傳導結構域可包含其所來源之分子的整個細胞內部分或整個天然細胞內信號傳導結構域，或其功能片段。術語「4-1BB」係指TNFR超家族之成員，其具有作為GenBank登錄號AAA62478.2提供之胺基酸序列或來自非人類物種(例如小鼠、囓齒動物、猴、猿及其類似物)之等效殘基；且「4-1BB共刺激結構域」定義為GenBank登錄號AAA62478.2之胺基酸殘基214-255，或來自非人類物種(例如小鼠、囓齒動物、猴、猿及其類似物)之等效殘基。
術語「編碼」係指用於在生物過程中充當模板以合成具有確定核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA及mRNA)或確定胺基酸序列之其他聚合物及巨分子的呈聚核苷酸(諸如基因、cDNA或mRNA)形式之特定核苷酸序列的固有性質， 以及由此產生之生物學性質。因而，若對應於該基因之mRNA之轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則基因、cDNA或RNA編碼蛋白質。核苷酸序列與mRNA序列一致且通常提供於序列表中之編碼鏈及用作基因或cDNA之轉錄模板的非編碼鏈可稱為編碼蛋白質或者該基因或cDNA之其他產物。
除非另外規定，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括彼此為簡併形式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。片語編碼蛋白質或RNA之核苷酸序列亦可包括內含子，其程度為編碼蛋白質之核苷酸序列可在某種型式中含有一或多個內含子。
術語「有效量」或「治療有效量」在本文中可互換使用，且係指對達成特定生物學或治療結果有效的如本文中所描述之化合物、調配物、材料或組合物之量。
術語「內源」係指來自或在生物體、細胞、組織或系統內部產生之任何材料。
術語「外源」係指自生物體、細胞、組織或系統引入或在其外部產生之任何材料。
術語「表現」係指由啟動子驅動特定核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。
術語「轉移載體」係指包含分離之核酸且可用於將分離之核酸遞送至細胞內部的物質組合物。許多載體在此項技術中為已知的，包括但不限於線性聚核苷酸、與離子化合物或兩性化合物締合之聚核苷酸、質體及病毒。因而，術語「轉移載體」包括自主複製之質體或病毒。該術語亦應理解為進一步包括促進核酸轉移至細胞中之非質體非病毒化合物，諸如聚離胺酸化合物、脂質體及其類似物。病毒轉移載體之實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體及其類似物。
術語「表現載體」係指包含重組聚核苷酸之載體，其包含可操作地連接至欲表現之核苷酸序列的表現控制序列。表現載體包含足夠順式作用元件用於表現；用於表現之其他元件可由宿主細胞或在活體外表現系統中提供。表現載體包括此項技術中已知的所有表現載體，包括併入重組聚核苷酸之黏質體、質體(例如裸露或包含在脂質體中)及病毒(例如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
術語「慢病毒」係指反轉錄病毒家族之一個屬。慢病毒在反轉錄病毒中為獨特的，因為能夠感染非分裂細胞；其可將大量遺傳資訊遞送至宿主細胞之DNA中，因此其為基因遞送載體之最有效方法之一。HIV、SIV及FIV均為慢病毒之實例。
術語「慢病毒載體」係指來源於慢病毒基因體之至少一部分的載體，尤其包括如Milone等人，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)中所提供之自滅活慢病毒載體。臨床上可使用之慢病毒載體之其他實例包括但不限於例如來自Oxford BioMedica之LENTIVECTORTM基因遞送技術、來自Lentigen之LENTIMAXTM載體系統及其類似物。非臨床類型之慢病毒載體亦可利用且對熟習此項技術者為已知的。
術語「同源」或「一致性」係指兩種聚合物分子之間，例如兩種核酸分子(諸如兩種DNA分子或兩種RNA分子)之間或兩種多肽分子之間的次單元序列一致性。當該兩種分子二者中之次單元位置被相同單體次單元佔據時，例如，若兩種DNA分子中之每一者中的一個位置被腺嘌呤佔據，則其在該位置為同源或一致的。兩個序列之間的同源性隨匹配或同源位置之數目直接變化；例如，若兩個序列中之半數位置(例如，長度為十個次單元之聚合物中的五個位置)為同源的，則該兩個序列為50%同源；若90%位置(例如，10個中之9個)為匹 配或同源的，則該兩個序列為90%同源。
非人類(例如鼠類)抗體之「人類化」形式為嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的片段(諸如抗體之Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其他抗原結合子序列)。對於大多數情況，人類化抗體及其抗體片段為人類免疫球蛋白(接受體抗體或抗體片段)，其中來自受體之互補決定區(CDR)的殘基置換為具有所要特異性、親和力及容量之來自非人類物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠或兔)之CDR的殘基。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基置換為相應非人類殘基。此外，人類化抗體/抗體片段可包含既未見於受體抗體中亦未見於輸入CDR或構架序列中之殘基。此等修飾可進一步改善及最佳化抗體或抗體片段效能。一般而言，人類化抗體或其抗體片段將包含實質上所有至少一個且典型地兩個可變結構域，其中所有或實質上所有CDR區均對應於非人類免疫球蛋白之CDR區，且所有或大部分FR區為人類免疫球蛋白序列之FR區。人類化抗體或抗體片段亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)，典型地為人類免疫球蛋白恆定區之至少一部分。關於其他細節，參見Jones等人，Nature,321：522-525,1986；Reichmann等人，Nature,332：323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596,1992。
術語「人類」或「完全人類」係指免疫球蛋白，諸如抗體或抗體片段，其中整個分子係人類起源或由與抗體或免疫球蛋白之人類形式一致的胺基酸序列組成。
術語「分離」意謂自天然狀態改變或移除。舉例而言，天然存在於活動物中之核酸或肽未經「分離」，而與其天然狀態之共存材料部分或完全分離之相同核酸或肽經「分離」。經分離之核酸或蛋白質可呈實質上經純化形式存在，或可存在於非天然環境，諸如宿主細胞中。
在本發明之上下文中，使用以下對常見核酸鹼基之縮寫。「A」係指腺苷，「C」係指胞嘧啶，「G」係指鳥苷，「T」係指胸苷，且「U」係指尿苷。
術語「可操作地連接」或「轉錄控制」係指調控序列與異源核酸序列之間引起後者表現的功能連接。舉例而言，當第一核酸序列與第二核酸序列處於功能關係時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接至編碼序列。可操作地連接之DNA序列可彼此鄰接，且例如在有必要接合兩個蛋白質編碼區時處於相同閱讀框中。
術語「非經腸」投與免疫原性組合物包括例如經皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌肉內(i.m.)或胸骨內注射、腫瘤內或輸注技術。
術語「核酸」或「聚核苷酸」係指呈單鏈或雙鏈形式之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非明確限制，否則該術語涵蓋含有具有與參考核酸類似之結合性質且以類似於天然存在之核苷酸的方式代謝的已知天然核苷酸類似物的核酸。除非另外指示，否則特定核酸序列亦隱含其經保守修飾之變異體(例如，簡併密碼子取代)、等位基因、異種同源物、SNP及互補序列以及明確指示之序列。特定言之，簡併密碼子取代可藉由產生一或多個所選(或所有)密碼子之第三位經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代之序列來達成(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。
術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用且係指由藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基組成的化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，並且對可構成蛋白質或肽序列之胺基酸之最大數目不加限制。多肽包括包含兩個或更多個藉由肽鍵彼此接合之胺基酸的任何肽或蛋白質。如本文中所使用， 該術語係指例如此項技術中通常亦稱為肽、寡肽及寡聚物之短鏈及此項技術中一般稱為蛋白質之較長鏈，其有許多種類型。「多肽」尤其包括例如生物學活性片段、實質上同源多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽變異體、經修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重組肽或其組合。
術語「啟動子」係指由細胞之轉錄機構或引入之合成機構識別之DNA序列，其可引發聚核苷酸序列之特異性轉錄。
術語「啟動子/調控序列」係指可用於表現可操作地連接至啟動子/調控序列之基因產物的核酸序列。在一些情況下，此序列可為核心啟動子序列，且在其他情況下，此序列亦可包括增強子序列及表現基因產物所需之其他調控元件。啟動子/調控序列可為例如以組織特異性方式表現基因產物之啟動子/調控序列。
術語「組成性」啟動子係指當與編碼或指定基因產物之聚核苷酸可操作地連接時導致在細胞之大部分或所有生理條件下在細胞中產生基因產物的核苷酸序列。
術語「誘導性」啟動子係指當與編碼或指定基因產物之聚核苷酸可操作地連接時導致僅當細胞中存在對應於該啟動子之誘導子時在細胞中產生基因產物的核苷酸序列。
術語「組織特異性」啟動子係指當與由基因編碼或指定之聚核苷酸可操作地連接時導致實質上僅在細胞為對應於該啟動子之組織類型之細胞時在細胞中產生基因產物的核苷酸序列。
術語「連接子」及「可撓性多肽連接子」在用於scFv之上下文中時係指由單獨或組合用於將可變重鏈區及可變輕鏈區連接在一起之胺基酸(諸如甘胺酸及/或絲胺酸殘基)組成的肽連接子。在一個實施例中，可撓性多肽連接子為 Gly/Ser連接子且包含胺基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n為等於或大於1之正整數(SEQ ID NO：110)。舉例而言，n=1，n=2，n=3，n=4，n=5，n=6，n=7，n=8，n=9，以及n=10。在一個實施例中，可撓性多肽連接子包括但不限於(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：111)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：112)。在另一實施例中，連接子包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO：113)之多個重複。本發明之範疇內亦包括WO2012/138475(以引用之方式併入本文中)中所描述之連接子。在一些情況下，該連接子序列包含長連接子(LL)序列。在一些情況下，該長連接子序列包含(G4S)n，其中n=2至4(SEQ ID NO：108)。在一些情況下，該連接子序列包含短連接子(SL)序列。在一些情況下，該短連接子序列包含(G4S)n，其中n=1至3(SEQ ID NO：109)。
如本文中所使用，5'帽(亦稱為RNA帽、RNA 7-甲基鳥苷帽或RNA m7G帽)為已在轉錄開始之後不久添加至真核生物信使RNA之「前」或5'端的經修飾鳥嘌呤核苷酸。5'帽由連接至第一轉錄核苷酸之末端基團組成。其存在對於被核糖體識別及免受RNA酶影響至關重要。帽添加與轉錄偶聯且與轉錄共同發生，使得每一者影響另一者。在轉錄開始之後不久，所合成之mRNA之5'端被與RNA聚合酶相關之帽合成複合物結合。此酶複合物催化mRNA加帽可能需要之化學反應。合成作為多步驟生物化學反應進行。可修飾加帽部分以調節mRNA之功能，諸如其穩定性或轉譯效率。
如本文中所使用，「活體外轉錄RNA」係指活體外合成之RNA，較佳為mRNA。一般而言，活體外轉錄RNA由活體外轉錄載體產生。活體外轉錄載體包含用於產生活體外轉錄RNA之模板。
如本文中所使用，「聚(A)」為藉由聚腺苷酸化連接至mRNA之一系列腺苷。在用於瞬時表現之構築體之較佳實施例中，聚A在50與5000之間， 較佳大於64，更佳大於100，最佳大於300或400(SEQ ID NO：114)。聚(A)序列可經化學或酶修飾以調節mRNA功能，諸如定位、穩定性或轉譯效率。
如本文中所使用，「聚腺苷酸化」係指聚腺苷酸部分或其經修飾變異體共價連接至信使RNA分子。在真核生物中，大部分信使RNA(mRNA)分子在3'末端聚腺苷酸化。3'聚(A)尾為藉由酶聚腺苷酸聚合酶之作用添加至前mRNA之長腺嘌呤核苷酸序列(通常數百個)。在高等真核生物中，將聚(A)尾添加至含有特定序列，亦即聚腺苷酸化信號之轉錄物上。聚(A)尾及與其結合之蛋白質有助於保護mRNA免受外切核酸酶降解。聚腺苷酸化對於轉錄終止、mRNA自細胞核輸出及轉譯亦非常重要。聚腺苷酸化在DNA轉錄成RNA之後立即發生在細胞核中，但另外稍後亦可在細胞質中發生。在轉錄已終止之後，藉由與RNA聚合酶相關之內切核酸酶複合物之作用切割mRNA鏈。切割位點通常以切割位點附近存在鹼基序列AAUAAA為特徵。在已切割mRNA之後，腺苷殘基得以添加至切割位點之游離3'端。
如本文中所使用，「瞬時」係指非整合轉殖基因表現持續數小時、數天或數週之時段，其中該表現時段小於該基因在整合至基因體中或包含在宿主細胞中之穩定質體複製子內時的表現時段。
術語「信號轉導途徑」係指在信號自細胞之一個部分傳輸至細胞之另一部分中起作用的多種信號轉導分子之間的生物化學關係。片語「細胞表面受體」包括能夠接收信號且越過細胞膜傳輸信號之分子及分子複合物。
術語「個體」意欲包括可引發免疫反應之活生物體(例如哺乳動物、人類)。
術語「實質上經純化」之細胞係指基本上不含其他細胞類型之細胞。實質上經純化之細胞亦係指已與在其天然存在狀態下通常與其相關之其他細胞 類型分離的細胞。在一些情況下，實質上經純化之細胞群體係指同源細胞群體。在其他情況下，此術語僅係指已與在其天然狀態下通常與其相關之細胞分離的細胞。在一些態樣中，該等細胞係在活體外培養。在其他態樣中，該等細胞並非在活體外培養。
如本文中所使用之術語「治療」意謂治療。治療效果係藉由減輕、抑制、緩解或根除疾病狀態來獲得。
如本文中所使用之術語「預防」意謂對疾病或疾病狀態之預防或保護性治療。
在本發明之上下文中，「腫瘤抗原」或「過度增殖性病症抗原」或「與過度增殖性病症相關之抗原」係指對於特定過度增殖性病症常見之抗原。在某些態樣中，本發明之過度增殖性病症抗原來源於癌症，包括但不限於原發性或轉移性黑色素瘤、神經膠質母細胞瘤、間皮瘤、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、結腸癌、子宮頸癌、腦癌、肝癌、胰臟癌、腎癌、子宮內膜癌及胃癌。
在一些情況下，該疾病為選自由以下組成之群的癌症：間皮瘤、神經膠質母細胞瘤、乳頭狀漿液性卵巢腺癌、透明細胞卵巢癌、混合型密勒氏卵巢癌、子宮內膜樣黏液性卵巢癌、惡性胸膜疾病、胰臟腺癌、導管型胰臟腺癌、子宮漿液性癌、肺腺癌、肝外膽管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳房腺癌、與MUC16、IL13Rα2或MSLN表現相關之疾病及其任何組合。
術語「轉染」或「轉型」或「轉導」係指將外源核酸轉移或引入至宿主細胞中之方法。「轉染」或「轉型」或「轉導」細胞為已用外源核酸轉染、轉型或轉導之細胞。細胞包括原代受試細胞及其後代。
術語「特異性結合」係指抗體、抗體片段或特定配位體識別並結合 樣品中存在之同源結合搭配物(例如MUC16、IL13Rα2或MSLN)但未必且實質上不識別或結合樣品中之其他分子。
範圍：貫穿本發明，本發明之各個態樣可呈範圍形式提供。應理解，呈範圍形式之描述僅出於便利及簡要目的，而不應被視為對本發明範疇之不靈活限制。因此，對範圍之描述應理解為已明確揭示所有可能之子範圍以及該範圍內之個別數值。舉例而言，對諸如1至6之範圍之描述應理解為已明確揭示子範圍，諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及該範圍內之個別數字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。作為另一實例，諸如95-99%一致性之範圍包括具有95%、96%、97%、98%或99%一致性者，且包括諸如96-99%、96-98%、96-97%、97-99%、97-98%及98-99%一致性之子範圍。無論範圍之寬度如何，此均適用。
發明描述
本文中提供使用T細胞受體(TCR)融合蛋白治療諸如癌症之疾病的物質組合物及使用方法。如本文中所使用，「T細胞受體(TCR)融合蛋白」或「TFP」包括來源於包含TCR之各種多肽的重組多肽，其一般能夠i)結合至靶細胞上之表面抗原以及ii)典型地當共同位於T細胞中或表面上時與完整TCR複合物之其他多肽組分相互作用。如本文中所提供，TFP與嵌合抗原受體相比提供實質性益處。術語「嵌合抗原受體」或「CAR」係指包含呈scFv形式之細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域及包含來源於如以下所定義之刺激分子之功能信號傳導結構域之細胞質信號傳導結構域(本文中亦稱為「細胞內信號傳導結構域」)的重組多肽。一般而言，CAR之中心細胞內信號傳導結構域來源於通常發現與TCR複合物締合之CD3ζ鏈。CD3ζ信號傳導結構域可與來源於至少一個共刺激分子，諸如4-1BB(亦即，CD137)、CD27及/或CD28之一或多個功能信號傳導結 構域融合。
MUC16
MUC16為支氣管、輸卵管及子宮黏膜中由人類眼表面上皮細胞表現之腫瘤相關抗原多肽。所提出之MUC16之一種功能可為在黏膜表面提供針對粒子及傳染物之保護性潤滑屏障。高度多晶型MUC16由三個結構域，亦即，富含Ser/Thr之N末端結構域、介於十一與60個以上部分保守串聯重複(各自具有平均156個胺基酸)之間之重複結構域以及含有跨膜序列及短胞質尾部之C末端非重複結構域構成。MUC16可為高度O糖基化及N糖基化。與相應正常人類卵巢、乳房及胰臟組織相比，由MUC16基因表現之編碼MUC16多肽之mRNA分別可顯著地、可再現地且可偵測地過度表現於某些類型之人類癌性卵巢、乳房及胰臟腫瘤中。定量分析MUC16表現之多種無關不同類型之癌性人類卵巢組織樣品顯示癌性樣品中之MUC16表現水準可為可變的，其中眾多癌性樣品顯示MUC16表現係所分析之正常卵巢組織樣品組之平均MUC16表現水準的至少6倍(至高達約580倍)。特定言之，與正常卵巢組織相比，對多種卵巢癌類型、子宮內膜樣腺癌、漿液性嚢腺癌(包括乳頭狀及透明細胞腺癌)可觀察到可偵測且可再現之MUC16過度表現。由於MUC16多肽在某些人類腫瘤中過度表現，故MUC16多肽及編碼該多肽之核酸成為用於在各種哺乳動物組織樣品間進行定量及定性比較之標靶。MUC16多肽之表現譜及編碼該多肽之核酸可用於對哺乳動物中某些類型之癌性腫瘤進行診斷及治療性治療。
CA125(癌瘤抗原125(O772P、CA-O772P、CA-125)為由MUC16基因編碼之細胞外脫落蛋白及通常用於監測卵巢癌患者之血清標記物。CA125為一種密勒氏管分化抗原，其過度表現於上皮卵巢癌細胞中且分泌至血液中，但其表現可能不完全侷限於卵巢癌。血清CA125水準可在約80%上皮卵巢癌(EOC) 患者中但在不足1%健康女性中升高。CA125為與結合β-半乳糖苷之細胞表面凝集素相關之腫瘤細胞之細胞表面上存在之巨大黏蛋白樣糖蛋白，其可為牽涉細胞黏附、細胞凋亡、細胞增殖及腫瘤進展調控之細胞外基質組分。CA125之高血清濃度在漿液性卵巢腺癌中可為典型的，而其在黏液性卵巢癌中不升高。可能不推薦CA125用於卵巢癌篩檢，乃因正常水準可能不排除腫瘤。然而，CA125偵測可為在患有經組織學證實之惡性病的患者中監測臨床病程及疾病狀態之標準工具。眾多研究已證實CA125水準在監測EOC患者之進展方面及作為癌症血清標記物之適用性。CA125水準升高典型地可先於臨床偵測約3個月。在化學療法期間，血清CA125水準變化可與疾病病程相關。在新藥物試驗中，可使用CA125作為臨床反應之替代標記物。另一方面，CA125由於其在許多良性病狀中升高而不適用於EOC初步診斷。CA125特異性抗體MAb-B43.13(奧戈伏單抗(oregovomab)，OvaRex MAb-B43.13)作為免疫治療劑用於卵巢癌患者之臨床試驗中。
MUC16(CA-125)可藉由若干不同的機制在促進腫瘤發生及腫瘤增殖中起作用。MUC16有助於腫瘤生長之一種方式可為藉由抑制天然殺手細胞之反應，從而保護癌細胞免受免疫反應影響。MUC16可保護腫瘤細胞免受免疫系統影響之進一步證據可為發現MUC16之高度糖基化串聯重複結構域可結合至半乳糖凝集素-1(一種免疫抑制蛋白)。MUC16可參與使腫瘤細胞能夠轉移之細胞間相互作用。此可由顯示MUC16可選擇性地結合至通常由腹膜(腹腔內層)間皮細胞表現之糖蛋白間皮素的證據來支持。MUC16與間皮素相互作用可提供腫瘤細胞侵襲腹膜之第一步。亦發現間皮素表現於若干類型之癌症中，包括間皮瘤、卵巢癌及鱗狀細胞癌。由於間皮素亦由腫瘤細胞表現，故MUC16與間皮相互作用可能有助於其他腫瘤細胞聚集至轉移位置，因而增加轉移之大小。證據 表明，MUC16之細胞質尾之表現可使腫瘤細胞能夠生長，促進細胞移動性且可促進侵襲。此看似由於MUC16之C末端結構域能夠促進信號傳導，由此減少E-鈣黏蛋白之表現且增加N-鈣黏蛋白及波形蛋白之表現，此可為與上皮-間質轉化一致之表現模式。MUC16亦可在降低癌細胞對藥物治療之敏感性方面起作用。舉例而言，MUC16之過度表現可保護細胞免受基因毒性藥物(諸如順鉑(cisplatin))之影響。
IL13Rα2
介白素-13為正常生理條件下以及癌症中在免疫反應期間之免疫微環境調控劑。IL-13結合至兩種不同的受體IL13Rα1及IL13Rα2。在大部分細胞中，IL-13以低親和力結合至受體IL13Rα1單體且結合IL4Ra以形成異二聚體複合物，從而引起信號轉導因子與轉錄活化因子(STAT)6之下游途徑活化。IL-13在一些正常細胞(諸如睪丸細胞)中結合至IL13Rα2受體，但其在癌細胞中亦以高親和力結合IL13Rα2受體。
位於Xq13.1-q28中之IL13Rα2基因之RNA轉錄物編碼380個胺基酸之蛋白質，其包括26個胺基酸之信號傳導序列及17個胺基酸之短細胞外結構域。在神經膠質母細胞瘤細胞中，IL13Rα2表現至多30,000個針對IL-13蛋白之結合位點。
所提出之IL13Rα2之一種功能為作為導致IL-13發生鉗合從而遠離IL13Rα1之誘餌受體。由於IL13Rα2以較高親和力結合可利用之IL-13且與IL13Rα1相比提供更多結合位點，因此在細胞中促進IL-13之鉗合。在正常細胞中，IL-13與IL13Rα1結合活化STAT6，使其易位至細胞核，在其中對含有N6-生長停滯特異性啟動子之基因(諸如15-脂氧合酶-1)發揮轉錄控制。此可藉由增加凋亡蛋白酶-3活性而引起細胞凋亡。IL-13鉗合因而可為腫瘤細胞之細胞凋亡 逃逸機制。所提出之IL13Rα2之另一功能為藉由物理阻斷STST6與受體對接來阻斷IL13Rα2對IL13Rα1之作用。缺乏STAT6對接阻礙下游細胞凋亡活化。IL13Rα2亦誘導神經膠質瘤細胞中STAT3及B細胞淋巴瘤2上調。
IL13Rα2表現於神經膠質瘤引發細胞上且表現於在約58%成人及約83%兒科腦腫瘤中。在卵巢癌及胰臟癌中，其經由細胞外信號調控激酶/活化蛋白1之途徑促進侵襲及轉移。免疫細胞(諸如骨髓來源之抑制性細胞)中之IL13Rα2表現亦經由上調轉型生長因子β促進腫瘤免疫逃逸及進展。IL13Rα2表現增加可在神經膠質瘤及其他腫瘤模型中促進腫瘤進展。IL13Rα2表現增加神經膠質瘤惡性等級，且因而可提供患者存活時間之預後指標。IL13Rα2多肽之表現譜及編碼該多肽之核酸可用於對哺乳動物中某些類型之癌性腫瘤進行診斷及治療性治療。
T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)
本發明涵蓋編碼TFP之重組DNA構築體，其中該TFP包含特異性結合至MUC16、IL13Rα2或MSLN，例如人類MUC16、IL13Rα2或MSLN之抗體片段，其中該抗體片段之序列與編碼TCR次單元或其一部分之核酸序列鄰接且處於相同閱讀框中。本文中提供之TFP能夠與一或多種內源(或替代地，一或多種外源，或內源與外源之組合)TCR次單元締合，以形成功能TCR複合物。
在一個態樣中，本發明之TFP包含靶特異性結合元件，又稱為抗原結合結構域。部分之選擇視定義靶細胞表面之靶抗原的類型及數目而定。舉例而言，可選擇抗原結合結構域以識別充當與特定疾病狀態相關之靶細胞上之細胞表面標記物的靶抗原。因而，可充當本發明TFP中之抗原結合結構域的靶抗原的細胞表面標記物的實例包括與病毒、細菌及寄生蟲感染、自體免疫疾病及癌性疾病(例如，惡性疾病)相關之細胞表面標記物。
在一個態樣中，可藉由將抗原結合結構域工程化至特異性結合所要抗原之TFP中的方式使TFP介導之T細胞反應針對相關抗原。
在一個態樣中，包含抗原結合結構域之TFP部分包含靶向MUC16、IL13Rα2或MSLN之抗原結合結構域。在一個態樣中，抗原結合結構域靶向人類MUC16、IL13Rα2或MSLN。
抗原結合結構域可為結合至抗原(包括但不限於單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類抗體、人類化抗體及其功能片段，包括但不限於限於單結構域抗體，諸如駱駝來源之奈米抗體之重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)及可變結構域(VHH))，以及結合至此項技術中已知的用於充當抗原結合結構域之替代支架(諸如重組纖連蛋白結構域、抗載運蛋白(anticalin)、DARPIN及其類似物)之任何結構域。同樣，特異性識別並結合靶抗原之天然或合成配位體可用作TFP之抗原結合結構域。在一些情況下，抗原結合結構域來源於最終將使用TFP之相同物種係有益的。舉例而言，為了在人類中使用，TFP之抗原結合結構域包含抗體或抗體片段之抗原結合結構域之人類或人類化殘基可能係有益的。
因而，在一個態樣中，抗原結合結構域包含人類化或人類抗體或抗體片段，或駱駝抗體或抗體片段，或鼠類抗體或抗體片段。在一個實施例中，人類化或人類抗TAA結合結構域包含本文中所描述之人類化或人類抗TAA結合結構域之一或多個(例如，所有三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及/或本文中所描述之人類化或人類抗TAA結合結構域之一或多個(例如，所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如包含一或多個(例如所有三個)LC CDR及一或多個(例如所有三個)HC CDR之人類 化或人類抗TAA結合結構域。在一個實施例中，人類化或人類抗TAA結合結構域包含本文中所描述之人類化或人類抗TAA結合結構域之一或多個(例如，所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如人類化或人類抗TAA結合結構域具有兩個可變重鏈區，各自包含本文中所描述之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中，人類化或人類抗TAA結合結構域包含本文中所描述之人類化或人類輕鏈可變區及/或本文中所描述之人類化或人類重鏈可變區。在一個實施例中，人類化或人類抗TAA結合結構域包含本文中所描述之人類化重鏈可變區，例如本文中所描述之至少兩個人類化或人類重鏈可變區。在一個實施例中，抗TAA結合結構域為包含本文中所提供胺基酸序列之輕鏈及重鏈之scFv。在一個實施例中，抗TAA結合結構域(例如，scFv)包含：輕鏈可變區，其包含具有對本文中提供之輕鏈可變區之胺基酸序列之至少一、二或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列或與本文中提供之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包含具有對本文中提供之重鏈可變區之胺基酸序列之至少一、二或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)之胺基酸序列或與本文中提供之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列。在一個實施例中，人類化或人類抗TAA結合結構域為scFv，且包含本文中所描述之胺基酸序列之輕鏈可變區經由連接子(例如本文中所描述之連接子)連接至包含本文中所描述之胺基酸序列之重鏈可變區。在一個實施例中，人類化抗TAA結合結構域包括(Gly4-Ser)n連接子，其中n為1、2、3、4、5或6，較佳為3或4(SEQ ID NO：115)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可例如呈以下取向中之任一種：輕鏈可變區-連接子-重鏈可變區或重鏈可變區-連接子-輕鏈可變區。在一些情況下，該連接子序列包含長連接子(LL)序列。在一些情況下，該長 連接子序列包含(G4S)n，其中n=2至4(SEQ ID NO：108)。在一些情況下，該連接子序列包含短連接子(SL)序列。在一些情況下，該短連接子序列包含(G4S)n，其中n=1至3(SEQ ID NO：109)。
在一些態樣中，非人類抗體經人類化，其中抗體之特定序列或區域經修飾以增加與人類中天然產生之抗體或其片段的相似性。在一個態樣中，抗原結合結構域經人類化。
可使用此項技術中已知的多種技術產生人類化抗體，該等技術包括但不限於CDR移植(參見例如歐洲專利第239,400號；國際公開案第WO 91/09967號；及美國專利第5,225,539號、第5,530,101號及第5,585,089號，各案以引用之方式整體併入本文中)、面飾或表面重整(參見例如歐洲專利第EP 592,106號及第EP 519,596號；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5)：489-498；Studnicka等人，1994,Protein Engineering,7(6)：805-814；及Roguska等人，1994,PNAS,91：969-973，各案以引用之方式整體併入本文中)、鏈改組(參見例如美國專利第5,565,332號，其以引用之方式整體併入本文中)以及例如美國專利申請公開案第US2005/0042664號、美國專利申請公開案第US2005/0048617號、美國專利第6,407,213號、美國專利第5,766,886號、國際公開案第WO 9317105號、Tan等人，J.Immunol.,169：1119-25(2002)、Caldas等人，Protein Eng.,13(5)：353-60(2000)、Morea等人，Methods,20(3)：267-79(2000)、Baca等人，J.Biol.Chem.,272(16)：10678-84(1997)、Roguska等人，Protein Eng.,9(10)：895-904(1996)、Couto等人，Cancer Res.,55(23增刊)：5973s-5977s(1995)、Couto等人，Cancer Res.,55(8)：1717-22(1995)、Sandhu J S,Gene,150(2)：409-10(1994)及Pedersen等人，J.Mol.Biol.,235(3)：959-73(1994)中揭示之技術，各文獻係以引用之方式整體併入本文中。通常，構架區中之構架殘基將經來自CDR供體抗體之相應殘基取代以 改變(例如改良)抗原結合。此等構架取代係藉由此項技術中眾所周知的方法來鑑定，例如，藉由模擬CDR與構架殘基之相互作用以鑑定對抗原結合重要之構架殘基，及序列比較以鑑定特定位置處之異常構架殘基(參見例如Queen等人，美國專利第5,585,089號；及Riechmann等人，1988,Nature,332：323，其係以引用之方式整體併入本文中)。
人類化抗體或抗體片段內仍具有一或多個來自非人類來源之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，其典型地取自「輸入」可變結構域。如本文中所提供，人類化抗體或抗體片段包含來自非人類免疫球蛋白分子之一或多個CDR及構架區，其中構成構架之胺基酸殘基完全或主要來源於人類生殖系。用於使抗體或抗體片段人類化之多種技術在此項技術中為眾所周知的，且基本上可遵循Winter及同事之方法(Jones等人，Nature,321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536(1988))，藉由用囓齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列(亦即，CDR移植)(EP 239,400；PCT公開案第WO 91/09967號；及美國專利第4,816,567號、第6,331,415號、第5,225,539號、第5,530,101號、第5,585,089號、第6,548,640號，其內容以引用之方式整體併入本文中)來進行。在此種人類化抗體及抗體片段中，實質上少於完整之人類可變結構域已取代為來自非人類物種之相應序列。人類化抗體通常為一些CDR殘基及可能一些構架(FR)殘基取代為來自囓齒動物抗體中類似位點之殘基的人類抗體。抗體及抗體片段之人類化亦可藉由面飾或表面重整(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5)：489-498；Studnicka等人，Protein Engineering,7(6)：805-814(1994)；及Roguska等人，PNAS,91：969-973(1994))或鏈改組(美國專利第5,565,332號)來達成，該等文獻之內容係以引用之方式整體併入本文中。
用於製造人類化抗體之人類可變結構域(輕鏈及重鏈二者)之選擇旨在降低抗原性。根據所謂的「最佳擬合」方法，針對已知人類可變結構域序列之整個庫篩檢囓齒動物抗體之可變結構域之序列。隨後接受最接近囓齒動物序列之人類序列作為人類化抗體之人類構架(FR)(Sims等人，J.Immunol.,151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.,196：901(1987)，其內容以引用之方式整體併入本文中)。另一方法使用來源於特定輕鏈或重鏈子組之所有人類抗體之一致序列的特定構架。相同構架可用於若干不同的人類化抗體(參見例如Nicholson等人，Mol.Immun.34(16-17)：1157-1165(1997)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993)，其內容以引用之方式整體併入本文中)。在一些實施例中，重鏈可變區之構架區(例如，所有四個構架區)均來源於VH4-4-59生殖系序列。在一個實施例中，構架區可包含例如來自相應鼠類序列之胺基酸之一、二、三、四或五個修飾，例如取代。在一個實施例中，輕鏈可變區之構架區(例如，所有四個構架區)均來源於VK3-1.25生殖系序列。在一個實施例中，構架區可包含例如來自相應鼠類序列之胺基酸之一、二、三、四或五個修飾，例如取代。
在一些態樣中，包含抗體片段之本發明TFP組合物之部分經人類化且保留對靶抗原之高親和力及其他有利生物學性質。根據本發明之一個態樣，藉由使用親本序列及人類化序列之三維模型分析親本序列及各種設想人類化產物之製程來製備人類化抗體及抗體片段。三維免疫球蛋白模型為常用的且為熟習此項技術者所熟知。可利用說明並呈現所選候選免疫球蛋白序列之大概三維構型結構的電腦程式。檢查此等呈現允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列發揮功能中之可能作用，例如分析影響候選免疫球蛋白結合靶抗原之能力的殘基。以此方式，可自接受體及輸入序列中選擇FR殘基並組合，從而達成所要抗體或 抗體片段特徵，諸如增加之對靶抗原之親和力。一般而言，CDR殘基直接且最實質性地參與影響抗原結合。
人類化抗體或抗體片段可保留與原始抗體類似之抗原特異性，例如在本發明中，結合人類腫瘤相關抗原(諸如MUC16、IL13Rα2或MSLN)之能力。在一些實施例中，人類化抗體或抗體片段可對人類MUC16、IL13Rα2或MSLN具有改良之結合親和力及/或特異性。
在一個態樣中，抗TAA結合結構域(亦即，MUC16、IL13Rα2或MSLN結合結構域)以抗體或抗體片段之特定功能特徵或性質為特徵。舉例而言，在一個態樣中，包含抗原結合結構域之本發明TFP組合物之部分特異性結合人類MUC16、IL13Rα2或MSLN。在一個態樣中，本發明係關於一種包含抗體或抗體片段之抗原結合結構域，其中該抗體結合結構域特異性結合至MUC16、IL13Rα2或MSLN蛋白或其片段，其中該抗體或抗體片段包含包括本文中提供之胺基酸序列的可變輕鏈及/或可變重鏈。在某些態樣中，scFv與前導序列鄰接且處於相同閱讀框中。
在一個態樣中，抗TAA結合結構域為片段，例如單鏈可變片段(scFv)。在一個態樣中，抗TAA結合結構域為Fv、Fab、(Fab')2或雙功能(例如雙特異性)雜合抗體(例如Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一個態樣中，本文中揭示之抗體及其片段以野生型或增強之親和力結合MUC16、IL13Rα2或MSN蛋白。
本文中亦提供用於獲得對靶抗原(例如MUC16、IL13Rα2、MLSN，或本文中其他部分針對融合部分結合結構域之標靶描述之任何靶抗原)具特異性之抗體抗原結合結構域的方法，該方法包括藉由在本文中所示之VH結構域之胺基酸序列中添加、缺失、取代或插入一或多個胺基酸的方式提供呈該VH結構域 之胺基酸序列變異體形式的VH結構域，視情況將由此提供之VH結構域與一或多個VL結構域組合，以及測試VH結構域或一或多個VH/VL組合以鑑定對相關靶抗原(例如MUC16、IL13Rα2、MSLN)具特異性且視情況具有一或多種所要性質之特異性結合成員或抗體抗原結合結構域。
在一些情況下，可根據此項技術中已知的方法製備VH結構域及scFv(參見例如Bird等人，(1988)Science 242：423-426；及Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。scFv分子可藉由使用可撓性多肽連接子將VH及VL區連接在一起來產生。scFv分子包含具有最佳化長度及/或胺基酸組成之連接子(例如Ser-Gly連接子)。連接子長度可極大地影響scFv可變區如何摺疊及相互作用。實際上，若採用短多肽連接子(例如，在5至10個胺基酸之間)，則防止鏈內摺疊。亦可能需要鏈間摺疊以使兩個可變區在一起，從而形成功能抗原決定基結合位點。在一些情況下，該連接子序列包含長連接子(LL)序列。在一些情況下，該長連接子序列包含(G4S)n，其中n=2至4(SEQ ID NO：108)。在一些情況下，該連接子序列包含短連接子(SL)序列。在一些情況下，該短連接子序列包含(G4S)n，其中n=1至3(SEQ ID NO：109)。關於連接子取向及大小之實例，參見例如Hollinger等人，1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448；美國專利第7,695,936號、美國專利申請公開案第20050100543號及第20050175606號，以及PCT公開案第WO2006/020258號及第WO2007/024715號，該等文獻均以引用之方式併入本文中。
scFv在其VL區與VH區之間可包含約10、11、12、13、14、15或超過15個殘基之連接子。連接子序列可包含任何天然存在之胺基酸。在一些實施例中，連接子序列包含胺基酸甘胺酸及絲胺酸。在另一實施例中，連接子序列包含多組甘胺酸及絲胺酸重複，諸如(Gly4Ser)n，其中n為等於或大於1之正整 數(SEQ ID NO：116)。在一個實施例中，該連接子可為(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：111)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：112)。連接子長度之變化可保留或增強活性，從而在活性研究中產生優越效力。在一些情況下，該連接子序列包含長連接子(LL)序列。在一些情況下，該長連接子序列包含(G4S)n，其中n=2至4(SEQ ID NO：108)。在一些情況下，該連接子序列包含短連接子(SL)序列。在一些情況下，該短連接子序列包含(G4S)n，其中n=1至3(SEQ ID NO：109)。
穩定性及突變
可參考習知對照scFv分子或全長抗體之生物物理學性質(例如熱穩定性)來評估抗TAA結合結構域(例如scFv分子，例如可溶性scFv)之穩定性。在一個實施例中，人類化或人類scFv之熱穩定性比所描述之分析中之親本scFv高約0.1、約0.25、約0.5、約0.75、約1、約1.25、約1.5、約1.75、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10攝氏度、約11攝氏度、約12攝氏度、約13攝氏度、約14攝氏度或約15攝氏度。
抗TAA結合結構域(例如scFv)之改良熱穩定性隨後賦予整個TAA-TFP構築體，從而改良抗TAA TFP構築體之治療性質。與習知抗體相比，抗TAA結合結構域(例如scFv)之熱穩定性可提高至少約2℃或3℃。在一個實施例中，抗TAA結合結構域(例如scFv)之熱穩定性與習知抗體相比提高1℃。在另一實施例中，抗TAA結合結構域(例如scFv)之熱穩定性與習知抗體相比提高2℃。在另一實施例中，scFv之熱穩定性與習知抗體相比提高4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃或15℃。舉例而言，可在本文中揭示之scFv分子與scFv VH及VL所來源之抗體之scFv分子或Fab片段之間進行比較。可使用此項技術中已知的方法量測熱穩定性。舉例而言，在一個實施例中， 可量測TM。量測TM之方法及測定蛋白質穩定性之其他方法描述如下。
scFv中之突變(藉由可溶性scFv之人類化或突變誘發而產生)改變scFv之穩定性並改良scFv及抗TAA TFP構築體之總體穩定性。使用諸如TM、溫度變性及溫度聚集之量測結果來比較人類化scFv相對於鼠類scFv之穩定性。在一個實施例中，抗TAA結合結構域(例如scFv)包含至少一個由人類化過程產生之突變，使得突變scFv賦予抗TAA TFP構築體改良之穩定性。在另一實施例中，抗TAA結合結構域(例如scFv)包含由人類化過程產生之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個突變，使得突變scFv賦予抗TAA-TFP構築體改良之穩定性。
在一個態樣中，TFP之抗原結合結構域包含與本文中所描述之抗原結合結構域胺基酸序列同源的胺基酸序列，且抗原結合結構域保留本文中所描述之抗TAA抗體片段之所要功能性質。在一個特定態樣中，本發明之TFP組合物包含抗體片段。在另一態樣中，該抗體片段包含scFv。
在各個態樣中，藉由修飾一或兩個可變區(例如，VH及/或VL)內(例如一或多個CDR區內及/或一或多個構架區內)之一或多個胺基酸對TFP之抗原結合結構域進行工程化。在一個特定態樣中，本發明之TFP組合物包含抗體片段。在另一態樣中，該抗體片段包含scFv。
熟習此項技術者應理解，可進一步修飾本發明之抗體或抗體片段，使得其在胺基酸序列(例如，來自野生型)方面而非在所要活性方面不同。舉例而言，可對蛋白質進行額外核苷酸取代，從而引起「非必需」胺基酸殘基處之胺基酸取代。舉例而言，可將分子中之非必需胺基酸殘基置換為來自相同側鏈家族之另一胺基酸殘基。在另一實施例中，可將胺基酸串置換為在側鏈家族成員之順序及/或組成上不同的在結構上類似之串，例如可進行保守取代，其中將胺 基酸殘基置換為具有類似側鏈之胺基酸殘基。
此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。
在兩個或更多個核酸或多肽序列之情形下，一致性百分比係指兩個或更多個相同序列。當如使用以下序列比較算法之一或藉由手動比對及目視檢查所量測，在比較窗口或指定區域內比較並比對最大一致性時，若兩個序列中有指定百分比之胺基酸殘基或核苷酸為相同的(例如，在指定區域內或當未指定時在整個序列內具有60%一致性，視情況70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)，則兩個序列「實質上一致」。視情況，一致性存在於長度為至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)之區域上，或更佳存在於長度為100至500或1000或更多個核苷酸(或20、50、200或更多個胺基酸)之區域上。
對於序列比較，通常一個序列充當與測試序列相比較之參考序列。當使用序列比較算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦，必要時指定子序列座標，並指定序列算法程式參數。可使用預設程式參數，或可指定替代參數。序列比較算法隨後基於程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。用於比較之序列比對方法在此項技術中為眾所周知的。藉由例如以下方式進行用於比較之最佳序列比對：藉由Smith及Waterman,(1970)Adv.Appl. Math.2：482c之局部同源性算法、藉由Needleman及Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48：443之同源性比對算法、藉由Pearson及Lipman,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444之相似性檢索法、藉由電腦實施此等算法(Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)或藉由手動比對及目視檢查(參見例如Brent等人，(2003)Current Protocols in Molecular Biology)。適用於確定序列一致性百分比及序列相似性之算法之兩個實例為分別描述於以下文獻中之BLAST及BLAST 2.0算法：Altschul等人，(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402；及Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。用於進行BLAST分析之軟體可公開獲自國家生物技術資訊中心。使用核苷酸BLAST確定核苷酸序列一致性之算法參數可使用具有1、-2之匹配/錯配評分之評分參數，且其中空位罰分(gap cost)為線性的。可將BLAST算法中之引發比對之序列長度或字組大小設定為28以便進行序列比對。使用蛋白質BLAST確定肽序列一致性之算法參數可使用具有BLOSUM62矩陣之評分參數來指定用於比對殘基對之評分，並確定總體比對評分，其中空位罰分之存在罰分可為11且延伸罰分為1。補償序列之胺基酸組成之矩陣調節方法可為條件組成評分矩陣調節。可將BLAST算法中之引發比對之序列長度或字組大小設定為6以便進行序列比對。
在一個態樣中，本發明設想產生功能等效分子之起始抗體或片段(例如scFv)胺基酸序列之修飾。舉例而言，可修飾TFP中所包含之抗TAA結合結構域(例如scFv)之VH或VL，以保留抗TAA結合結構域(例如scFv)之起始VH或VL構架區之至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性。本發明設想修 飾整個TFP構築體，例如修飾TFP構築體之各個結構域之一或多個胺基酸序列，以產生功能等效分子。可修飾TFP構築體以保留起始TFP構築體之至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。
細胞外結構域
細胞外結構域可來源於天然來源或重組來源。在來源為天然來源之情況下，結構域可來源於任何蛋白質，但尤其來源於膜結合或跨膜蛋白。在一個態樣中，細胞外結構域能夠與跨膜結構域締合。特定用於本發明中之細胞外結構域可至少包括例如T細胞受體之α、β、γ、δ或ζ鏈或CD3ε、CD3γ或CD3δ之細胞外區域，或在替代實施例中，細胞外結構域可至少包括CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154之細胞外結構域。在一些情況下，該TCR細胞外結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的細胞外結構域或其一部分：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈、TCR δ鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。
跨膜結構域
一般而言，TFP序列含有細胞外結構域及由單一基因體序列編碼之跨膜結構域。在替代實施例中，TFP可設計為包含與TFP之細胞外結構域異源的跨膜結構域。跨膜結構域可包括與跨膜區相鄰之一或多個額外胺基酸，例如，與跨膜蛋白所來源之蛋白質的細胞外區域相關之一或多個胺基酸(例如，該細胞外區域之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個胺基酸)及/ 或與跨膜蛋白所來源之蛋白質的細胞內區域相關之一或多個額外胺基酸(例如，該細胞內區域之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個胺基酸)。在一些情況下，跨膜結構域可包括細胞外區域之至少30、35、40、45、50、55、60或更多個胺基酸。在一些情況下，跨膜結構域可包括細胞內區域之至少30、35、40、45、50、55、60或更多個胺基酸。在一個態樣中，跨膜結構域為與所使用之TFP之其他結構域之一相關的跨膜結構域。在一些情況下，可藉由胺基酸取代來選擇或修飾跨膜結構域，以避免該等結構域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜結構域結合，例如，以減少與受體複合物之其他成員之相互作用。在一個態樣中，跨膜結構域能夠與TFP T細胞表面上之另一TFP同源二聚。在不同的態樣中，可修飾或取代跨膜結構域之胺基酸序列，以便使與相同TFP中存在之天然結合搭配物之結合結構域的相互作用減至最少。
跨膜結構域可來源於天然來源或重組來源。在來源為天然來源之情況下，該結構域可來源於任何膜結合或跨膜蛋白。在一個態樣中，只要TFP已結合至標靶，跨膜結構域便能夠對細胞內結構域進行信號傳導。在一些情況下，該TCR次單元包含跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的跨膜結構域：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈、TCR δ鏈、TCRζ鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。在一些情況下，跨膜結構域可經由鉸鏈(例如來自人類蛋白質之鉸鏈)連接至TFP之細胞外區域，例如TFP之抗原結合結構域。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈可為人類免疫球蛋白(Ig)鉸鏈，例如IgG4鉸鏈或CD8a鉸鏈。
連接子
視情況，長度在2個胺基酸與10個胺基酸之間的短寡肽或多肽連接子可在TFP之跨膜結構域與細胞質區之間形成鍵聯。甘胺酸-絲胺酸二連體提供尤其適合之連接子。舉例而言，在一個態樣中，該連接子包含胺基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：99)。在一些實施例中，該連接子由核苷酸序列GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO：100)編碼。其他例示性連接子示於表4中。
細胞質結構域
若TFP含有CD3 γ、δ或ε多肽，則TFP之細胞質結構域可包括細胞內信號傳導結構域；TCRα及TCRβ次單元一般缺乏信號傳導結構域。細胞內信號傳導結構域一般負責活化已引入TFP之免疫細胞之至少一種正常效應功能。術語「效應功能」係指特化細胞功能。舉例而言，T細胞之效應功能可為細胞溶解活性或輔助活性，包括細胞介素分泌。因而，術語「細胞內信號傳導結構域」係指轉導效應功能信號並指導細胞執行特化功能之蛋白質部分。儘管通常可採用整個細胞內信號傳導結構域，但在許多情況下不必使用整個鏈。就使用細胞內信號傳導結構域之截短部分而言，可使用此種截短部分替代完整鏈，只要其轉導效應功能信號即可。術語細胞內信號傳導結構域因而意欲包括細胞內信號傳導結構域中足以轉導效應功能信號之任何截短部分。
用於本發明之TFP中之細胞內信號傳導結構域之實例包括T細胞受體(TCR)及協同作用以在抗原受體嚙合後引發信號轉導之共同受體的細胞質序列，以及此等序列之任何衍生物或變異體及具有相同功能能力之任何重組序列。
已知由TCR產生之信號單獨可能不足以完全活化原初T細胞且可能需要二級及/或共刺激信號。因而，可稱原初T細胞活化由如下兩個不同類別之 細胞質信號傳導序列介導：藉由TCR引發抗原依賴性一級活化的細胞質信號傳導序列(一級細胞內信號傳導結構域)及以非抗原依賴性方式起作用以提供二級或共刺激信號之細胞質信號傳導序列(二級細胞質結構域，例如共刺激結構域)。
一級信號傳導結構域可以刺激方式或以抑制方式調控TCR複合物之一級活化。以刺激方式起作用之一級細胞內信號傳導結構域可含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)的信號傳導基元。
含有在本發明中具有特定用途之一級細胞內信號傳導結構域之ITAM的實例包括CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d之ITAM。在一個實施例中，本發明之TFP包含細胞內信號傳導結構域，例如CD3ε之一級信號傳導結構域。在一個實施例中，一級信號傳導結構域包含經修飾之ITAM結構域，例如與天然ITAM結構域相比具有改變(例如，增高或降低)之活性的突變ITAM結構域。在一個實施例中，一級信號傳導結構域包含含有經修飾之ITAM之一級細胞內信號傳導結構域，例如含有經最佳化及/或經截短ITAM之一級細胞內信號傳導結構域。在一實施例中，一級信號傳導結構域包含一、二、三、四或更多個ITAM基元。
TFP之細胞內信號傳導結構域可包含CD3ζ信號傳導結構域本身，或其可與適用於本發明之TFP之情形下的任何其他所要細胞內信號傳導結構域組合。舉例而言，TFP之細胞內信號傳導結構域可包含CD3ε鏈部分及共刺激信號傳導結構域。共刺激信號傳導結構域係指包含共刺激分子之細胞內結構域的TFP部分。共刺激分子為淋巴球對抗原之有效反應可能需要之除抗原受體或其配位體以外之細胞表面分子。該等分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、DAP10、DAP12、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及與CD83特異性結合之配位 體及其類似物。舉例而言，已證明CD27共刺激可增強活體外人類TFP-T細胞擴增、效應功能及存活，並增強活體內人類T細胞耐久性及抗腫瘤活性(Song等人，Blood.2012；119(3)：696-706)。
本發明之TFP之細胞質部分內之細胞內信號傳導序列可按隨機或規定順序彼此連接。視情況，例如長度在2個胺基酸與10個胺基酸之間(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸)的短寡肽或多肽連接子可在細胞內信號傳導序列之間形成鍵聯。
在一個實施例中，可使用甘胺酸-絲胺酸二連體作為適合之連接子。在一個實施例中，可使用單一胺基酸(例如丙胺酸、甘胺酸)作為適合之連接子。
在一個態樣中，本文中所描述之表現TFP之細胞可進一步包含第二TFP，例如包括例如針對相同標靶(例如MUC16、IL13Rα2、MSLN)或不同標靶(例如CD123)之不同抗原結合結構域的第二TFP。在一個實施例中，當表現TFP之細胞包含兩個或更多個不同的TFP時，該等不同的TFP之抗原結合結構域可使得該等抗原結合結構域不與彼此相互作用。舉例而言，表現第一TFP及第二TFP之細胞可具有第一TFP之抗原結合結構域，例如呈片段(例如scFv)形式，其不與第二TFP之抗原結合結構域締合，例如，第二TFP之抗原結合結構域為VHH。在一個實施例中，該抗原結合結構域為SD1(SEQ ID NO：15)、SD2(SEQ ID NO：20)、SD3(SEQ ID NO：25)、SD4(SEQ ID NO：30)、SD5(SEQ ID NO：35)或SD6(SEQ ID NO：40)。在一個實施例中，該抗原結合結構域為LSD1(SEQ ID NO：51)、H1-LSD1(SEQ ID NO：56)、H2-LSD1(SEQ ID NO：61)、LSD2(SEQ ID NO：66)、H1-LSD1(SEQ ID NO：71)或H2-LSD2(SEQ ID NO：76)。在一個實施例中，該抗原結合結構域為抗MSLN VHH1(SEQ ID NO：96)或抗MSLN VHH2(SEQ ID NO：97)。
在另一態樣中，本文中所描述之表現TFP之細胞可進一步表現另一劑，例如增強表現TFP之細胞之活性的劑。舉例而言，在一個實施例中，該劑可為抑制抑制性分子之劑。在一些實施例中，抑制性分子(例如PD1)可降低表現TFP之細胞建立免疫效應子反應之能力。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFRβ。在一個實施例中，抑制抑制性分子之劑包含第一多肽，例如抑制性分子，其與向細胞提供正信號之第二多肽(例如本文中所描述之細胞內信號傳導結構域)締合。在一個實施例中，該劑包含例如抑制性分子(諸如PD1、LAG3、CTLA4、CD160、BTLA、LAIR1、TIM3、2B4及TIGIT或此等中任一者之片段(例如，此等中任一者之細胞外結構域之至少一部分))之第一多肽及呈本文中所描述之細胞內信號傳導結構域(例如，包含共刺激結構域(例如4-1BB、CD27或CD28，例如，如本文中所描述)及/或一級信號傳導結構域(例如本文中所描述之CD3ζ信號傳導結構域))形式之第二多肽。在一個實施例中，該劑包含PD1或其片段(例如，PD1之細胞外結構域之至少一部分)之第一多肽及本文中所描述之細胞內信號傳導結構域(例如，本文中所描述之CD28信號傳導結構域及/或本文中所描述之CD3ζ信號傳導結構域)之第二多肽。PD1為CD28受體家族之抑制成員，該受體家族亦包括CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA。PD1可表現於活化B細胞、T細胞及骨髓細胞上(Agata等人，1996 Int.Immunol 8：765-75)。PD1之兩個配位體(即程式性死亡-配位體1(PD-L1)及程式性死亡-配位體2(PD-L2))已顯示在與PD1結合後下調T細胞活化(Freeman等人，2000 J Exp Med 192：1027-34；Latchman等人，2001 Nat Immunol 2：261-8；Carter等人，2002 Eur J Immunol 32：634-43)。PD-L1可富含於人類癌症中(Dong等人，2003 J Mol Med 81：281-7；Blank等人，2005 Cancer Immunol.Immunother 54：307-314；Konishi等人，2004 Clin Cancer Res 10：5094)。可藉由抑制PD1與PD-L1之局部相互作用來逆轉免疫抑制。
在一個實施例中，該劑包含抑制性分子之細胞外結構域(ECD)，例如程式性死亡1(PD1)可融合至跨膜結構域及視情況細胞內信號傳導結構域(諸如41BB及CD3ζ)(本文中亦稱為PD1 TFP)。在一個實施例中，PD1 TFP當與本文中描述之抗TAA TFP組合使用時改良T細胞之耐久性。在一個實施例中，該TFP為包含PD1之細胞外結構域的PD1 TFP。替代地，提供含有特異性結合至PD-L1或PD-L2之抗體或抗體片段(諸如scFv)的TFP。
在另一態樣中，本發明提供表現TFP之T細胞群體，例如TFP-T細胞。在一些實施例中，表現TFP之T細胞群體包含表現不同TFP之細胞的混合物。舉例而言，在一個實施例中，TFP-T細胞群體可包括表現具有本文中所描述之抗TAA結合結構域之TFP的第一細胞，及表現具有不同的抗TAA結合結構域(例如本文中所描述之不同於該第一細胞所表現之TFP中之抗TAA結合結構域的抗TAA結合結構域)之TFP的第二細胞。作為另一實例，表現TFP之細胞群體可包括表現包括抗TAA結合結構域(例如，如本文中所描述)之TFP的第一細胞及表現包括針對除第一細胞之抗TAA TFP以外之靶標(例如，對MUC16、IL13Rα2或MSLN具特異性)(例如另一腫瘤相關抗原)的抗原結合結構域的TFP的第二細胞。
在另一態樣中，本發明提供細胞群體，其中該群體中之至少一種細胞表現具有本文中所描述之抗TAA結構域之TFP，且第二細胞表現另一劑，例如增強表現TFP之細胞之活性的劑。舉例而言，在一個實施例中，該劑可為抑制抑制性分子之劑。在一些實施例中，抑制性分子例如可降低表現TFP之細胞建立免疫效應子反應之能力。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFRβ。 在一個實施例中，抑制抑制性分子之劑包含第一多肽，例如抑制性分子，其與向細胞提供正信號之第二多肽(例如本文中所描述之細胞內信號傳導結構域)締合。
本文中揭示用於產生編碼TFP之活體外轉錄RNA之方法。本發明亦包括編碼可直接轉染至細胞中之RNA構築體之TFP。用於產生供轉染使用之mRNA的方法可包括用特別設計之引子對模板進行活體外轉錄(IVT)，繼而進行聚A添加，以產生含有3'及5'未轉譯序列(「UTR」)、5'帽及/或內部核糖體進入位點(IRES)、欲表現之核酸及聚A尾之構築體，其長度典型地為50-2000個鹼基(SEQ ID NO：117)。如此產生之RNA可有效地轉染不同種類的細胞。在一個態樣中，模板包括TFP之序列。
在一個態樣中，抗TAA TFP由信使RNA(mRNA)編碼。在一個態樣中，將編碼抗TAA TFP之mRNA引入至T細胞中以產生TFP-T細胞。在一個態樣中，可將活體外轉錄之RNA TFP作為瞬時轉染形式引入至細胞中。使用聚合酶鏈反應(PCR)產生之模板藉由活體外轉錄產生RNA。來自任何來源之相關DNA可使用適當引子及RNA聚合酶藉由PCR直接轉化為供活體外mRNA合成用之模板。DNA之來源可為例如基因體DNA、質體DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他適當DNA來源。用於活體外轉錄之所要模板為本發明之TFP。在一個實施例中，用於PCR之DNA含有開放閱讀框。DNA可來自生物體基因體之天然存在DNA序列。在一個實施例中，核酸可包括一些或所有5'及/或3'未轉譯區(UTR)。核酸可包括外顯子及內含子。在一個實施例中，用於PCR之DNA為人類核酸序列。在另一實施例中，用於PCR之DNA為包含5'及3'UTR之人類核酸序列。DNA可替代地為通常不表現於天然存在生物體中之人工DNA序列。例示性人工DNA序列為含有連接在一起以形成編碼融合蛋白 之開放閱讀框之基因部分的序列。連接在一起之DNA部分可來自單一生物體或來自多於一種生物體。
使用PCR來產生供活體外轉錄用於轉染之mRNA用的模板。用於進行PCR之方法在此項技術中為眾所周知的。用於PCR之引子設計為具有與欲用作PCR模板之DNA區域實質上互補的區域。如本文中所使用，「實質上互補」係指引子序列中之大部分或所有鹼基互補或者一或多個鹼基非互補或錯配的核苷酸序列。實質上互補之序列能夠在用於PCR之退火條件下退火或與預期DNA標靶雜交。引子可設計為與DNA模板之任何部分實質上互補。舉例而言，引子可經設計以擴增在細胞中正常轉錄之核酸部分(開放閱讀框)，包括5'及3' UTR。引子亦可經設計以擴增編碼特定相關結構域之核酸部分。在一個實施例中，引子經設計以擴增人類cDNA之編碼區，包括所有或部分5'及3' UTR。可用於PCR之引子可藉由此項技術中眾所周知的合成方法來產生。「正向引子」為在欲擴增之DNA序列上游之含有與DNA模板上之核苷酸實質上互補的核苷酸區域的引子。「上游」在本文中用於指欲擴增之DNA序列相對於編碼鏈之位置5。「反向引子」為在欲擴增之DNA序列下游之含有與雙鏈DNA模板實質上互補之核苷酸區域的引子。「下游」在本文中用於指欲擴增之DNA序列相對於編碼鏈之位置3'。
可用於PCR之任何DNA聚合酶均可用於本文中揭示之方法中。試劑及聚合酶可自眾多來源商購獲得。
亦可使用能夠促進穩定性及/或轉譯效率之化學結構。RNA較佳具有5'及3' UTR。在一個實施例中，5' UTR之長度在1個核苷酸與3,000個核苷酸之間。欲添加至編碼區之5'及3' UTR序列之長度可藉由不同的方法加以改變，包括但不限於設計與UTR之不同區域退火之PCR用引子。使用此方法，熟習此項 技術者可改變5'及3' UTR長度，由此可用於在轉染經轉錄RNA後達成最佳轉譯效率。
5'及3' UTR可為相關核酸之天然存在內源5'及3' UTR。替代地，可藉由將UTR序列併入至正向及反向引子中或藉由模板之任何其他修飾來添加對相關核酸為非內源之UTR序列。使用對相關核酸為非內源之UTR序列可用於改變RNA之穩定性及/或轉譯效率。舉例而言，已知3' UTR序列中之富AU元件可降低mRNA之穩定性。因此，可基於此項技術中眾所周知的UTR性質選擇或設計3' UTR以增加轉錄RNA之穩定性。
在一個實施例中，5' UTR可含有內源核酸之Kozak序列。替代地，當如以上所描述藉由PCR添加對相關核酸為非內源之5' UTR時，可藉由添加5' UTR序列重新設計一致Kozak序列。Kozak序列可增加一些RNA轉錄物之轉譯效率，但看似不需要所有RNA均能夠高效轉譯。在其他實施例中，5' UTR可為RNA基因體在細胞中穩定之RNA病毒之5' UTR。在其他實施例中，各種核苷酸類似物可用於3'或5' UTR中以阻礙mRNA之外切核酸酶降解。
為了能夠自DNA模板合成RNA而無需基因選殖，轉錄啟動子應連接至欲轉錄之序列上游的DNA模板。當充當RNA聚合酶啟動子之序列添加至正向引子之5'端時，RNA聚合酶啟動子併入欲轉錄之開放閱讀框上游之PCR產物中。在一個較佳實施例中，啟動子為T7聚合酶啟動子，如本文中其他部分所描述。其他可用啟動子包括但不限於T3及SP6 RNA聚合酶啟動子。T7、T3及SP6啟動子之一致核苷酸序列在此項技術中為已知的。
在一較佳實施例中，mRNA具有5'端帽及3'聚(A)尾，從而確定細胞中mRNA之核糖體結合、轉譯起始及穩定性。在環狀DNA模板(例如質體DNA)上，RNA聚合酶產生不適於在真核生物細胞中表現之長多連體產物。在3' UTR 端線性化之質體DNA之轉錄產生正常大小之mRNA，其即使在轉錄後經聚腺苷酸化在真核生物轉染中亦無效。
在線性DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可使轉錄物3'端延伸超出模板之最後一個鹼基(Schenborn及Mierendorf,Nuc Acids Res.,13：6223-36(1985)；Nacheva及Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270：1485-65(2003)。
將聚A/T延伸段整合至DNA模板中之習知方法為分子選殖。然而，整合至質體DNA中之聚A/T序列可導致質體不穩定，此即獲自細菌細胞之質體DNA模板往往被缺失及其他畸變高度污染之原因。此使得選殖程序不僅費力又耗時，而且往往不可靠。此即允許不進行選殖之情況下用聚A/T 3'延伸段構築DNA模板之方法非常理想之原因。
轉錄DNA模板之聚A/T區段可在PCR期間藉由使用含有聚T尾，諸如100 T尾(SEQ ID NO：118)(大小可為50-5000個T(SEQ ID NO：119))之反向引子，或在PCR之後藉由任何其他方法(包括但不限於DNA連接或活體外重組)來產生。聚(A)尾亦為RNA提供穩定性並減少其降解。一般而言，聚(A)尾之長度與轉錄RNA之穩定性正相關。在一個實施例中，聚(A)尾在100個腺苷與5000個腺苷之間(SEQ ID NO：120)。
可在活體外轉錄後在使用聚(A)聚合酶(諸如大腸桿菌聚A聚合酶(E-PAP))之情況下進一步延長RNA之聚(A)尾。在一個實施例中，將聚(A)尾之長度自100個核苷酸增至300至400個核苷酸(SEQ ID NO：121)導致RNA之轉譯效率增加約兩倍。另外，將不同的化學基團連接至3'端可增加mRNA穩定性。此種連接可含有經修飾/人工核苷酸、適配體及其他化合物。舉例而言，可使用聚(A)聚合酶將ATP類似物併入聚(A)尾中。ATP類似物可進一步增加RNA之穩定性。
5'帽亦為RNA分子提供穩定性。在較佳實施例中，藉由本文中揭示之方法產生之RNA包括5'帽。使用此項技術中已知的及本文中描述的技術提供5'帽(Cougot等人，Trends in Biochem.Sci.,29：436-444(2001)；Stepinski等人，RNA,7：1468-95(2001)；Elango等人，Biochim.Biophys.Res.Commun.,330：958-966(2005))。
藉由本文中揭示之方法產生之RNA亦可含有內部核糖體進入位點(IRES)序列。IRES序列可為任何病毒、染色體或人工設計序列，其引發非帽依賴性核糖體與mRNA結合且促進轉譯起始。可包括適用於細胞電穿孔之任何溶質，其可含有促進細胞滲透性及生存力之因子，諸如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑及表面活性劑。
可使用許多不同方法中之任一種將RNA引入至靶細胞中，例如可商購方法，包括但不限於電穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems，Cologne，Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments，Boston，Mass.)或Gene Pulser II(BioRad，Denver，Colo.)、Multiporator(Eppendort，Hamburg Germany)、使用脂質轉染之陽離子脂質體介導轉染、聚合物包封、肽介導轉染或生物彈粒子遞送系統，諸如「基因槍」(參見例如Nishikawa等人，Hum Gene Ther.,12(8)：861-70(2001)。
編碼TFP之核酸構築體
本發明亦提供編碼一或多種本文中所描述之TFP構築體之核酸分子。在一個態樣中，核酸分子提供為信使RNA轉錄物。在一個態樣中，核酸分子提供為DNA構築體。
編碼所要分子之核酸序列可使用此項技術中已知的重組方法(諸如藉由對來自表現該基因之細胞的庫進行篩檢、藉由自已知包括基因之載體獲得 該基因或藉由使用標準技術自含有該基因之細胞及組織直接分離)而獲得。替代地，可合成產生而非選殖相關基因。
在一些實施例中，本文中揭示包含本文中揭示之重組核酸的載體。在一些情況下，該載體係選自由以下組成之群：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體(AAV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)載體或反轉錄病毒載體。在一些情況下，該載體為AAV6載體。在一些情況下，該載體進一步包含啟動子。在一些情況下，該載體為活體外轉錄之載體。在一些實施例中，該載體為環形RNA載體(例如，如同在審理中之臨時專利申請案第62/836,977號中所揭示)。
本發明亦提供插入本發明之DNA之載體。來源於反轉錄病毒(諸如慢病毒)之載體為達成長期基因轉移之適合工具，乃因其允許轉殖基因之長期穩定整合及其在子細胞中之繁殖。慢病毒載體相對於來源於致癌反轉錄病毒(諸如鼠類白血病病毒)之載體具有附加優勢，乃因其可轉導非增殖細胞，諸如肝細胞。其亦具有低免疫原性之附加優點。在一些實施例中，本文中揭示包含本文中揭示之重組核酸的載體。
在另一實施例中，包含編碼本發明之所要TFP之核酸的載體為腺病毒載體(A5/35)。在另一實施例中，可使用諸如睡美人、crisper、CAS9及鋅指核酸酶之轉位子來實現編碼TFP之核酸之表現(參見June等人，2009 Nature Reviews Immunol.9.10：704-716，以引入之方式併入本文中)。
本發明之表現構築體亦可使用標準基因遞送方案用於核酸免疫及基因療法。基因遞送方法在此項技術中為已知的(參見例如美國專利第5,399,346號、第5,580,859號、第5,589,466號，以引用之方式整體併入本文中)。在另一實施例中，本發明提供基因療法載體。
可將核酸選殖至許多類型之載體中。舉例而言，可將核酸選殖至包括但不限於質體、噬菌體質體、噬菌體衍生物、動物病毒及黏質體之載體中。特定相關載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體及定序載體。
此外，表現載體可呈病毒載體形式提供至細胞。病毒載體技術在此項技術中為眾所周知的，且描述於例如Sambrook等人，2012,Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY)，以及其他病毒學及分子生物學手冊中。可用作載體之病毒包括但不限於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及慢病毒。一般而言，適合之載體含有在至少一種生物體中具功能性之複製起點、啟動子序列、便利限制性內切核酸酶位點及一或多個選擇標記物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。
已開發許多基於病毒之系統用於基因轉移至哺乳動物細胞中。舉例而言，反轉錄病毒為基因遞送系統提供便利平台。可使用此項技術中已知的技術將所選基因插入載體中並包裝在反轉錄病毒粒子中。隨後可分離重組病毒並在活體內或離體遞送至個體之細胞。許多反轉錄病毒系統在此項技術中為已知的。在一些實施例中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體在此項技術中為已知的。在一個實施例中，使用慢病毒載體。
其他啟動子元件(例如增強子)調控轉錄起始之頻率。典型地，此等位於起始位點上游30-110bp之區域中，但許多啟動子已顯示亦含有處於起始位點下游之功能元件。啟動子元件之間的間隔通常為可撓性的，因此啟動子功能在元件相對於彼此逆轉或移動時得以保留。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間的間隔可增至50bp，隨後活性開始下降。視啟動子而定，看似個別元件可協同或獨立地發揮功能以活化轉錄。
能夠在哺乳動物T細胞中表現TFP轉殖基因之啟動子之實例為EF1a 啟動子。天然EF1a啟動子驅動負責將胺醯基tRNA酶促遞送至核糖體之延長因子-1複合物之α次單元之表現。EF1a啟動子已廣泛用於哺乳動物表現質體中且已顯示在驅動選殖至慢病毒載體中之轉殖基因之TFP表現方面有效(參見例如Milone等人，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009))。啟動子之另一實例為即時早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列為能夠驅動與其可操作地連接的任何聚核苷酸序列之高水準表現的強組成性啟動子序列。然而，亦可使用其他組成性啟動子序列，包括但不限於猿猴病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)長末端重複(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽白血病病毒啟動子、埃-巴二氏病毒即時早期啟動子(Epstein-Barrvirus immediate early promoter)、勞氏肉瘤病毒啟動子，以及人類基因啟動子，諸如但不限於肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、延長因子-1a啟動子、血紅素啟動子及肌酸激酶啟動子。此外，本發明不應限制於使用組成性啟動子。亦設想誘導性啟動子為本發明之一部分。使用誘導性啟動子提供能夠在需要表現時開啟可操作地連接之聚核苷酸序列之表現或在不需要表現時關閉表現的分子開關。誘導性啟動子之實例包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子及四環素調控啟動子。
為了評定TFP多肽或其部分之表現，欲引入細胞中之表現載體亦可含有選擇標記基因或報告基因或二者，以有助於自試圖藉由病毒載體轉染或感染之細胞群體鑑定及選擇表現細胞。在其他態樣中，選擇標記物可攜帶於單獨DNA片段上且用於共轉染程序。選擇標記物及報告基因二者皆可側接有適當調控序列以能夠在宿主細胞中表現。可用選擇標記物包括例如抗生素抗性基因，諸如neo及其類似物。
報告基因用於鑑定可能經轉染之細胞及評估調控序列之功能性。一 般而言，報告基因為不存在或不表現於受體生物體或組織中且編碼由某種容易偵測之性質(例如酶活性)體現其表現之多肽的基因。在已將DNA引入接受體細胞中之後在適合時間分析報告基因之表現。適合之報告基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌鹼性磷酸酶或綠色螢光蛋白基因之基因(例如Ui-Tei等人，2000 FEBS Letters 479：79-82)。適合之表現系統為眾所周知的且可使用已知技術製備或獲自市面。一般而言，具有顯示報告基因之最高表現水準之最小5'側接區的構築體係鑑定為啟動子。此種啟動子區可連接至報告基因，並用於評估劑調節啟動子驅動之轉錄的能力。
將基因引入至細胞中並表現之方法在此項技術中為已知的。在表現載體之情況下，可藉由此項技術中之任何方法將載體容易地引入至宿主細胞，例如哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母或昆蟲細胞中。舉例而言，可藉由物理、化學或生物學手段將表現載體轉移至宿主細胞中。
用於將聚核苷酸引入至宿主細胞中之物理方法包括磷酸鈣沈澱、脂質轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔及其類似方法。用於產生包含載體及/或外源核酸之細胞的方法在此項技術中為眾所周知的(參見例如Sambrook等人，2012,Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY)。一種將聚核苷酸引入至宿主細胞中之方法為磷酸鈣轉染。
用於將相關聚核苷酸引入至宿主細胞中之生物學方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體且尤其反轉錄病毒載體已成為最廣泛使用之將基因插入哺乳動物，例如人類細胞中之方法。其他病毒載體可來源於慢病毒、痘病毒、單純疱疹病毒I、腺病毒及腺相關病毒及其類似物(參見例如美國專利第5,350,674號及第5,585,362號)。
用於將聚核苷酸引入至宿主細胞中之化學方法包括膠體分散系統， 諸如巨分子複合物、奈米膠囊、微球體、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、微胞、混合微胞團及脂質體。供用作活體外及活體內遞送載體之例示性膠體系統為脂質體(例如人工膜囊)。可利用現有技術靶向性遞送核酸之其他方法，諸如用靶向性奈米粒子或其他適合次微米大小之遞送系統遞送聚核苷酸。
在利用非病毒遞送系統之情況下，例示性遞送載體為脂質體。涵蓋使用脂質調配物將核酸引入至宿主細胞中(活體外、離體或活體內)。在另一態樣中，核酸可與脂質締合。與脂質締合之核酸可包封在脂質體之水性內部中、散佈在脂質體之脂質雙層內、經由與脂質體及寡核苷酸二者締合之連接分子連接至脂質體、包埋於脂質體中、與脂質體複合、分散在含脂質之溶液中、與脂質混合、與脂質組合、作為脂質中之懸浮液包含在內、含有微胞或與微胞複合，或以其他方式與脂質締合。脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體相關組合物不限於溶液中之任何特定結構。舉例而言，其可呈微胞形式或與「凹陷」結構一起存在於雙層結構中。其亦可簡單地散佈在溶液中，從而可能形成大小或形狀不均勻之聚集體。脂質為可能為天然存在或合成脂質之脂肪物質。舉例而言，脂質包括天然存在於細胞質中之脂肪滴以及含有長鏈脂肪族烴及其衍生物，諸如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛之化合物類別。
適合使用之脂質可獲自商業來源。舉例而言，二肉豆蔻基磷脂醯膽鹼(「DMPC」)可獲自Sigma(St.Louis，Mo.)；磷酸二(十六烷基)酯(「DCP」)可獲自K&K Laboratories(Plainview，N.Y.)；膽固醇(「Choi」)可獲自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂醯甘油(「DMPG」)及其他脂質可獲自Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham，Ala.)。脂質於三氯甲烷或三氯甲烷/甲醇中之儲備溶液可儲存在約-20℃下。三氯甲烷用作惟一溶劑，因為其比甲醇更容易蒸發。「脂質體」為涵蓋由產生包封脂質雙層或聚集體而形成之多種單層及多層脂質 載體的通用術語。脂質體可以具有存在磷脂雙層膜及內部水性介質之囊泡結構為特徵。多層脂質體具有藉由水性介質隔開之多個脂質層。其在磷脂懸浮於過量水溶液中時自發形成。脂質組分在形成閉合結構之前進行自重排且截留處於脂質雙層之間的水及溶解溶質(Ghosh等人，1991 Glycobiology 5：505-10)。然而，亦涵蓋在溶液中具有與正常囊泡結構不同的結構的組合物。舉例而言，脂質可呈現微胞結構或僅作為脂質分子之不均勻聚集體存在。亦涵蓋脂質轉染胺-核酸複合物。
不考慮用於將外源核酸引入至宿主細胞中或以其他方式將細胞暴露於本發明之抑制劑的方法，為了證實宿主細胞中是否存在重組DNA序列，可進行多種分析。此種分析包括例如熟習此項技術者眾所周知的「分子生物學」分析，諸如南方及北方墨點法(Southern and Northern blotting)、RT-PCR及PCR；「生物化學」分析，諸如偵測特定肽之存在或不存在，例如藉由免疫學手段(ELISA及西方墨點法(Western blot))或藉由本文中所描述之分析法鑑定屬於本發明範疇內之劑。
基因編輯技術
在一些實施例中，對本文中揭示之經修飾T細胞使用基因編輯技術進行工程化，諸如成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR®，參見例如美國專利第8,697,359號)、轉錄活化因子樣效應因子(TALE)核酸酶(TALEN，參見例如美國專利第9,393,257號)、兆鹼基核酸酶(具有包含12至40個鹼基對之雙鏈DNA序列之大識別位點的內切去氧核糖核酸酶)、鋅指核酸酶(ZFN，參見例如Urnov等人，Nat.Rev.Genetics(2010)v11,636-646)或megaTAL核酸酶(兆鹼基核酸酶與TAL重複序列之融合蛋白)方法。以此方式，可對嵌合構築體進行工程化以組合各次單元之理想特徵，諸如構型或信號傳導能力。亦參見Sander及Joung,Nat. Biotech.(2014)v32,347-55；及June等人，2009 Nature Reviews Immunol.9.10：704-716，各文獻以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，TFP次單元之細胞外結構域、跨膜結構域或細胞質結構域中之一或多個經工程化以具有多於一個天然TCR次單元結構域(亦即，為嵌合的)之態樣。
永久改變人類基因體且在疾病相關基因中引入位點特異性基因體修飾之技術的最新發展為治療應用奠定基礎。此等技術現通常稱為「基因體編輯」。
在一些實施例中，採用基因編輯技術來破壞內源TCR基因。在一些實施例中，所提及之內源TCR基因編碼TCRα鏈、TCRβ鏈或TCRα鏈及TCRβ鏈。在一些實施例中，基因編輯技術為多重基因體編輯鋪平道路，從而允許同時破壞內源TCR基因中之多個基因體基因座。在一些實施例中，應用多重基因體編輯技術以產生缺乏內源TCR及/或人類白血球抗原(HLA)及/或程式性細胞死亡蛋白1(PD1)及/或其他基因表現之基因破壞T細胞。
當前基因編輯技術包括兆鹼基核酸酶、鋅指核酸酶(ZFN)、TAL效應子核酸酶(TALEN)及成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR)/CRISPR相關(Cas)系統。此四個主要類別之基因編輯技術在結合使用者定義之DNA序列及介導雙鏈DNA斷裂(DSB)方面具有共同作用模式。DSB隨後可藉由非同源端接合(NHEJ)或(在存在供體DNA時)同源重組(HR)(亦即引入來自供體DNA片段之同源序列的事件)來修復。另外，切口酶核酸酶產生單鏈DNA斷裂(SSB)。DSB可藉由單鏈DNA併入(ssDI)或單鏈模板修復(ssTR)(亦即引入來自供體DNA之同源序列的事件)來修復。
可使用經工程化以識別相關基因座中之DNA序列的位點特異性稀切內切核酸酶進行基因體DNA之遺傳修飾。用於產生工程化位點特異性內切核酸酶之方法在此項技術中為已知的。舉例而言，可對鋅指核酸酶(ZFN)進行工程 化以識別並切割基因體中之預定位點。ZFN為包含與Fokl限制酶之核酸酶結構域融合的鋅指DNA結合結構域的嵌合蛋白質。鋅指結構域可藉由合理或實驗手段重新設計以產生結合至預定DNA序列(長度為18個鹼基對)之蛋白質。藉由使此工程化蛋白質結構域與Fokl核酸酶融合，有可能靶向具有基因體層級特異性之DNA斷裂。ZFN已廣泛用於靶向多種真核生物體中之基因添加、移除及取代(查閱Durai等人，(2005),Nucleic Acids Res 33,5978)。同樣，可產生TAL效應子核酸酶(TALEN)以切割基因體DNA中之特定位點。如同ZFN，TALEN包含與Fokl核酸酶結構域融合之工程化位點特異性DNA結合結構域(查閱Mak等人，(2013),Curr Opin Struct Biol.23：93-9)。然而，在此情況下，DNA結合結構域包含TAL效應子結構域之串聯陣列，各TAL效應子結構域特異性識別單一DNA鹼基對。緊湊型TALEN具有替代內切核酸酶結構，從而避免對二聚化之需要(Beurdeley等人，(2013),Nat Commun.4：1762)。緊湊型TALEN包含與來自I-TevI歸巢內切核酸酶之核酸酶結構域融合的工程化位點特異性TAL效應子DNA結合結構域。不同於Fokl，I-TevI不需要二聚即可產生雙鏈DNA斷裂，因此緊湊型TALEN作為單體具功能性。
基於CRISPR/Cas9系統之工程化內切核酸酶在此項技術中亦為已知的(Ran等人，(2013),Nat Protoc.8：2281-2308；Mali等人，(2013),Nat Methods 10：957-63)。CRISPR基因編輯技術由DNA靶向特異性及切割活性可藉由短嚮導RNA或雙鏈體crRNA/TracrRNA程式化之內切核酸酶蛋白構成。CRISPR內切核酸酶包含兩種組分：(1)凋亡蛋白酶效應子核酸酶，典型地為微生物Cas9；及(2)短「嚮導RNA」或包含將核酸酶引導至基因體中之相關位置的18至20個核苷酸靶向序列的RNA雙鏈體。藉由在相同細胞中表現多個嚮導RNA(各自具有不同的靶向序列)，有可能使DNA斷裂同時靶向基因體中之多個位點(多重基因體 編輯)。
此項技術中已知兩種類別CRISPR系統(Adli(2018)Nat.Commun.9：1911)，每一類別包含多個CRISPR類型。第1類含有通常見於古細菌中之I型及III型CRISPR系統。而第II類含有II型、IV型、V型及VI型CRISPR系統。儘管最廣泛使用之CRISPR/Cas系統為II型CRISPR-Cas9系統，但研究人員已改變CRISPR/Cas系統之用途，用於基因體編輯。最近數年內已重建超過10種不同的CRISPR/Cas蛋白(Adli(2018)Nat.Commun.9：1911)。其中，對諸如來自胺基酸球菌屬之Cas12a(Cpf1)蛋白(AsCpf1)及毛螺科細菌之Cas12a(Cpf1)蛋白(LbCpf1)尤其感興趣。
歸巢內切核酸酶為一組天然存在之核酸酶，其識別通常見於植物及真菌之基因體中的15-40鹼基對切割位點。其通常與寄生物DNA元件，諸如第1組自剪接內含子及內含肽相關。其在天然情況下藉由在染色體中產生雙鏈斷裂而促進宿主基因體中特定位置之同源重組或基因插入，從而參與細胞DNA修復機制(Stoddard(2006),Q.Rev.Biophys.38：49-95)。特定胺基酸取代可重新程式化歸巢核酸酶之DNA裂解特異性(Niyonzima(2017),Protein Eng Des Sel.30(7)：503-522)。兆鹼基核酸酶(MN)為來源於細菌歸巢內切核酸酶且針對獨特靶位點進行工程化之具有固有核酸酶活性之單體蛋白質(Gersbach(2016),Molecular Therapy.24：430-446)。在一些實施例中，兆鹼基核酸酶為工程化I-CreI歸巢內切核酸酶。在其他實施例中，兆鹼基核酸酶為工程化I-SceI歸巢內切核酸酶。
除所提及之四種主要基因編輯技術以外，已對包含兆鹼基核酸酶、ZFN及TALEN融合體之嵌合蛋白質進行工程化以產生利用ZFN及TALEN之結合親和力及兆鹼基核酸酶之裂解特異性的新穎單體酶(Gersbach(2016),Molecular Therapy.24：430-446)。舉例而言，megaTAL為單一嵌合蛋白質，其為 TALEN之容易定製DNA結合結構域與兆鹼基核酸酶之高裂解效率的組合。
為了進行基因編輯技術，必須將核酸酶以及在CRISPR/Cas9系統之情況下gRNA有效地遞送至相關細胞。諸如物理、化學及病毒方法之遞送方法在此項技術中亦為已知的(Mali(2013).Indian J.Hum.Genet.19：3-8.)。在一些情況下，物理遞送方法可選自但不限於電穿孔、顯微注射或使用彈道粒子之方法。另一方面，化學遞送方法需要使用複雜分子，諸如磷酸鈣、脂質或蛋白質。在一些實施例中，將病毒遞送方法應用於使用病毒(諸如但不限於腺病毒、慢病毒及反轉錄病毒)之基因編輯技術。
本發明進一步提供包含TFP編碼核酸分子之載體。在一個態樣中，TFP載體可直接轉導至細胞，例如T細胞中。在一個態樣中，載體為選殖或表現載體，例如包括但不限於一或多種質體(例如表現質體、選殖載體、微型環、微型載體、雙微染色體)、反轉錄病毒及慢病毒載體構築體之載體。在一個態樣中，載體能夠在哺乳動物T細胞中表現TFP構築體。在一個態樣中，哺乳動物T細胞為人類T細胞。
T細胞來源
在擴增及遺傳修飾之前，自個體獲得T細胞來源。術語「個體」意欲包括可引發免疫反應之活生物體(例如哺乳動物)。個體之實例包括人類、犬、貓、小鼠、大鼠及其基因轉殖物種。T細胞可獲自許多來源，包括外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、肋膜積液、脾臟組織及腫瘤。在本發明之某些態樣中，可使用此項技術中可利用之許多T細胞株。在本發明之某些態樣中，T細胞可使用熟習此項技術者已知的許多技術(諸如FicollTM分離)而由自個體收集之血液單元獲得。在一個較佳態樣中，藉由血球分離獲得來自個體之循環血液之細胞。血球分離產物典型地含有 淋巴球，包括T細胞、單核球、顆粒球、B細胞、其他有核白血球、紅血球及血小板。在一個態樣中，可洗滌藉由血球分離收集之細胞以移除血漿級分並且將細胞置於適當緩衝液或培養基中以進行後續處理步驟。在本發明之一個態樣中，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞。在一替代態樣中，洗滌溶液缺乏鈣且可能缺乏鎂，或可能缺乏許多(若非所有)二價陽離子。初始活化步驟在不存在鈣時可引起放大活化。如熟習此項技術者將容易瞭解，洗滌步驟可藉由熟習此項技術者已知的方法，諸如藉由使用半自動化「流通式」離心機(例如，Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)根據製造商之說明來實現。在洗滌之後，可將細胞再懸浮於多種生物相容性緩衝液中，諸如無Ca無Mg型PBS、PlasmaLyte A或其他含或不含緩衝劑之生理鹽水溶液。替代地，可移除血球分離樣品之不需要組分，並且將細胞直接再懸浮於培養基中。
在一個態樣中，藉由溶解紅血球及耗竭單核球，例如藉由以PERCOLLTM梯度進行離心或藉由逆流離心淘析而自外周血淋巴球分離T細胞。可藉由陽性或陰性選擇技術進一步分離特定T細胞亞群，諸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+及CD45RO+ T細胞。舉例而言，在一個態樣中，藉由與抗CD3/抗CD28(例如，3x28)結合珠粒，諸如DYNABEADSTM M-450 CD3/CD28T一起培育足以陽性選擇所要T細胞之時段來分離T細胞。在一個態樣中，該時段為約30分鐘。在另一態樣中，該時段在30分鐘至36小時或更久之範圍內且為介於其之間的所有整數值。在另一態樣中，該時段為至少1、2、3、4、5或6小時。在另一較佳態樣中，該時段為10至24小時。在一個態樣中，該培育時段為24小時。在T細胞相較於其他細胞類型更少之任何情況下，諸如在自腫瘤組織或自免疫受損個體分離腫瘤浸潤淋巴球(TIL)時，可使用較長培育時間來分離T細胞。此外，使用較長培育時間可增加CD8+ T細胞之俘獲效率。 因而，藉由簡單縮短或延長允許T細胞與CD3/CD28珠粒結合之時間及/或藉由增加或降低珠粒與T細胞之比率(如本文中進一步描述)，可在培養開始時或在處理期間之其他時間點對或針對T細胞亞群進行優先選擇。另外，藉由增加或降低珠粒或其他表面上之抗CD3及/或抗CD28抗體之比率，可在培養起始時或在其他所要時間點對或針對T細胞亞群進行優先選擇。熟習此項技術者應認識到在本發明之情形下亦可使用多輪選擇。在某些態樣中，可能需要執行選擇程序並且在活化及擴增過程中使用「未選擇」之細胞。亦可對「未選擇」之細胞進行數輪進一步選擇。
藉由陰性選擇增濃T細胞群可利用針對陰性選擇之細胞特有之表面標記物的抗體組合來實現。一種方法為經由使用針對陰性選擇之細胞上存在之細胞表面標記物的單株抗體的混合液的陰性磁性免疫黏附或流式細胞術進行細胞分選及/或選擇。舉例而言，為了藉由陰性選擇使CD4+細胞增濃，單株抗體混合液典型地包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。在某些態樣中，可能需要增濃或陽性選擇典型地表現CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+及FoxP3+之調控T細胞。替代地，在某些態樣中，藉由抗C25結合珠粒或其他類似選擇方法耗竭T調控細胞。
在一個實施例中，可選擇表現IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、顆粒酶B及穿孔素中之一或多種或其他適當分子(例如其他細胞介素)的T細胞群體。篩檢細胞表現之方法可藉由例如PCT公開案第WO2013/126712號中所描述之方法來確定。
為了藉由陽性或陰性選擇分離所要細胞群體，可改變細胞及表面(例如粒子，諸如珠粒)之濃度。在某些態樣中，可能需要顯著減小珠粒與細胞混合在一起之體積(例如，增加細胞濃度)，以確保細胞及珠粒之最大接觸。舉例而言， 在一個態樣中，使用2,000,000,000個細胞/mL之濃度。舉例而言，在一個態樣中，使用1,000,000,000個細胞/mL之濃度。在另一態樣中，使用超過100,000,000個細胞/mL。在另一態樣中，使用10,000,000、15,000,000、20,000,000、25,000,000、30,000,000、35,000,000、40,000,000、45,000,000或50,000,000個細胞/mL之細胞濃度。在另一態樣中，使用75,000,000、80,000,000、85,000,000、90,000,000、95,000,000或100,000,000個細胞/mL之細胞濃度。在其他態樣中，可使用125,000,000或150,000,000個細胞/mL之濃度。使用高濃度可引起細胞產率增加、細胞活化及細胞擴增。此外，使用高細胞濃度允許更有效俘獲可能弱表現相關靶抗原之細胞(諸如CD28陰性T細胞)或來自存在許多腫瘤細胞之樣品(例如，白血病血液、腫瘤組織等)之細胞。此種細胞群體可能具有治療價值並且將會需要獲得。舉例而言，使用高細胞濃度允許更高效選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在一相關態樣中，可能需要使用較低細胞濃度。藉由顯著稀釋T細胞與表面之混合物(例如粒子，諸如珠粒)，使粒子與細胞之間的相互作用最小化。此選擇表現大量所要抗原之細胞與粒子結合。舉例而言，CD4+ T細胞表現較高水準之CD28且比稀濃度之CD8+ T細胞更有效地被俘獲。在一個態樣中，所使用之細胞濃度為5×106/mL。在其他態樣中，所使用之濃度可為約1×105/mL至1×106/mL及介於其之間的任何整數值。在其他態樣中，可在2-10℃下或在室溫下在旋轉器上以不同的速度將細胞培育不同的時間長度。
亦可在洗滌步驟之後將用於刺激之T細胞冷凍。不希望受理論束縛，冷凍及隨後解凍步驟藉由移除細胞群體中之顆粒球及一定程度之單核球而提供更均勻之產物。在移除血漿及血小板之洗滌步驟之後，可將細胞懸浮於冷凍溶液中。儘管許多冷凍溶液及參數在此項技術中為已知的並且將適用於此情 形，但一種方法包括使用含有20% DMSO及8%人血清白蛋白之PBS，或含有10%聚葡萄糖40及5%右旋糖、20%人血清白蛋白及7.5% DMSO或者31.25% Plasmalyte-A、31.25%右旋糖5%、0.45% NaCl、10%聚葡萄糖40及5%右旋糖、20%人血清白蛋白及7.5% DMSO之培養基，或含有例如Hespan及PlasmaLyte A之其他適合之細胞冷凍介質，隨後將細胞以1℃/min之速率冷凍至-80℃，並儲存在液氮貯槽之氣相中。可使用其他控制冷凍方法以及在-20℃下或在液氮中立即不受控制冷凍。在某些態樣中，如本文中所描述將冷凍保存之細胞解凍並洗滌，並允許在使用本發明之方法活化之前在室溫下靜置一小時。
本發明之範圍中亦涵蓋在可能需要如本文中所描述之擴增細胞之前的時段自個體收集血液樣品或血球分離產物。因而，可在任何必要時間點收集欲擴增之細胞來源，且分離並冷凍所要細胞，諸如T細胞，以供稍後用於針對將受益於T細胞療法之眾多疾病或病狀(諸如本文中描述之疾病或病狀)的T細胞療法中。在一個態樣中，血液樣品或血球分離物取自大體上健康之個體。在某些態樣中，血液樣品或血球分離物取自有罹患疾病風險但尚未罹患疾病之大體上健康之個體，且分離並冷凍相關細胞以供稍後使用。在某些態樣中，可擴增、冷凍並且稍後使用T細胞。在某些態樣中，在診斷如本文中所描述之特定疾病之後不久但在任何治療之前自患者收集樣品。在另一態樣中，在眾多相關治療模式之前自個體之血液樣品或血球分離物分離細胞，該等治療模式包括但不限於用諸如那他珠單抗(natalizumab)、依法利珠單抗(efalizumab)、抗病毒劑、化學療法、放射、免疫抑制劑(諸如環孢菌素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、胺甲喋呤(methotrexate)、黴酚酸酯(mycophenolate)及FK506)、抗體或其他免疫消除劑(諸如阿侖單抗(alemtuzumab)、抗CD3抗體、癌得星(cytoxan)、氟達拉濱(fludarabine)、環孢菌素、FK506、雷帕黴素(rapamycin)、黴酚酸、類固醇、FR901228 及輻射)之劑進行治療。
在本發明之另一態樣中，在使得個體存在功能T細胞之治療後直接自患者獲得T細胞。就此而言，已觀測到在某些癌症治療，尤其用破壞免疫系統之藥物治療後，在治療之後不久在患者通常自治療恢復之時段期間，所獲得之T細胞之品質有關T細胞離體擴增之能力可能係最佳的或有所改良。同樣，在使用本文中所描述之方法進行離體操作後，此等細胞可呈增強植入及活體內擴增之較佳狀態。因而，在本發明之範圍內設想在此恢復期期間收集血細胞，包括T細胞、樹突狀細胞或造血譜系之其他細胞。此外，在某些態樣中，可使用動員(例如，用GM-CSF動員)及處理方案在個體中創造有利於特定細胞類型之再群體化、再循環、再生及/或擴增(尤其在治療後之確定時間窗口期間)之條件。說明性細胞類型包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞及其他免疫系統細胞。
T細胞活化及擴增
T細胞一般可使用如以下文獻中所描述之方法進行活化及擴增，例如美國專利第6,352,694號、第6,534,055號、第6,905,680號、第6,692,964號、第5,858,358號、第6,887,466號、第6,905,681號、第7,144,575號、第7,067,318號、第7,172,869號、第7,232,566號、第7,175,843號、第5,883,223號、第6,905,874號、第6,797,514號、第6,867,041號及第7,572,631號。
一般而言，藉由與上面連接有刺激CD3/TCR複合物相關信號之劑及刺激T細胞表面上之共刺激分子的配位體的表面接觸來擴增本發明之T細胞。特定言之，可如本文中所描述來刺激T細胞群體，諸如藉由與固定於表面上之抗CD3抗體或其抗原結合片段或抗CD2抗體接觸，或藉由與鈣離子載體結合之蛋白激酶C活化劑(例如苔蘚抑素)接觸。為了共刺激T細胞表面上之輔助分子，使用結合輔助分子之配位體。舉例而言，可在適於刺激T細胞增殖之條件下使T 細胞群體與抗CD3抗體及抗CD28抗體接觸。為了刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之增殖，使用抗CD3抗體及抗CD28抗體。抗CD28抗體之實例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，France)，可使用該等抗CD28抗體，如此項技術中通常已知的其他方法亦可如此使用(Berg等人，Transplant Proc.30(8)：3975-3977,1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9)：13191328,1999；Garland等人，J.Immunol.Meth.227(1-2)：53-63,1999)。
已暴露於不同刺激時間之T細胞可展現不同的特徵。舉例而言，典型血液或單采之外周血單核細胞產物具有比細胞毒性或抑制性T細胞群體(TC，CD8+)更大之輔助T細胞群體(TH，CD4+)。藉由刺激CD3及CD28受體來離體擴增T細胞而產生T細胞群體，該T細胞群體在約第8-9天之前主要由TH細胞組成，而在約第8-9天之後，該T細胞群體包含日益壯大之TC細胞群體。因此，視治療目的而定，向個體輸注主要包含TH細胞之T細胞群體可能係有利的。類似地，若已分離TC細胞之抗原特異性子集，則將該子集擴增至更大程度可能係有益的。
此外，除CD4及CD8標記物以外，其他表型標記物在細胞擴增過程中顯著但很大程度上可再現地變化。因而，此種可再現性使得能夠針對特定目的定製活化T細胞產物。
一旦構築抗TAA TFP，便可使用各種分析法來評估分子之活性，諸如但不限於在抗原刺激後擴增T細胞、在不存在再刺激之情況下保持T細胞擴增及在適當活體外及動物模型中之抗癌活性的能力。評估抗TAA TFP之效應的分析更詳細描述如下。
初代T細胞中之TFP表現之西方墨點分析可用於偵測單體及二聚體之存在(參見例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009))。非常 簡單，將表現TFP之T細胞(CD4+與CD8+ T細胞之1：1混合物)在活體外擴增超過10天，繼而進行溶解及還原條件下之SDS-PAGE。藉由西方墨點法，使用針對TCR鏈之抗體偵測TFP。將相同T細胞子集用於非還原條件下之SDS-PAGE分析，以允許評估共價二聚體形成。
可藉由流式細胞術量測抗原刺激後TFP+ T細胞之活體外擴增。舉例而言，用αCD3/αCD28及APC刺激CD4+與CD8+ T細胞之混合物，繼而用在欲分析之啟動子控制下表現GFP之慢病毒載體進行轉導。例示性啟動子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。在培養之第6天，藉由流式細胞術在CD4+及/或CD8+ T細胞子集中評估GFP螢光(參見例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009))。替代地，在第0天用αCD3/αCD28塗覆之磁性珠粒刺激CD4+與CD8+ T細胞之混合物，並且在第1天使用表現TFP以及使用2A核糖體跳躍序列之eGFP之雙順反子慢病毒載體用TFP進行轉導。洗滌後在抗CD3及抗CD28抗體(K562-BBL-3/28)存在下用TAA+細胞(例如K562細胞)、野生型K562細胞(K562野生型)或表現hCD32及4-1BBL之K562細胞再次刺激培養物。每隔一天以100IU/mL向培養物中添加外源IL-2。藉由流式細胞術，使用基於珠粒之計數對GFP+ T細胞進行計數(參見例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009))。
亦可量測不存在再刺激時之持續TFP+ T細胞擴增(參見例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009))。簡而言之，在第0天用αCD3/αCD28塗覆之磁性珠粒刺激並在第1天用所指示之TFP進行轉導後，在培養第8天使用Coulter Multisizer III粒子計數器量測平均T細胞體積(fl)。
亦可使用動物模型來量測TFP-T活性。例如，使用人類TAA特異性TFP+ T細胞治療免疫缺乏小鼠之癌症的異種移植模型(參見例如Milone等人， Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009))。非常簡單地，在建立癌症之後，將小鼠隨機分至治療組。將不同數目之工程化T細胞以1：1比率共同注射至攜帶癌症之NOD/SCID/γ-/-小鼠中。T細胞注射後在不同的時間評估來自小鼠之脾臟DNA中各載體之拷貝數。以每週間隔評估動物之癌症。在注射α-TAA-ζ TFP+ T細胞或假轉導T細胞之小鼠中量測外周血TAA+癌細胞計數。使用對數秩檢驗比較各組之存活曲線。另外，亦可分析T細胞注射後4週NOD/SCID/γ-/-小鼠中之絕對外周血CD4+及CD8+ T細胞計數。對小鼠注射癌細胞且在3週後注射經工程化以藉由編碼連接至eGFP之TFP的雙順反子慢病毒載體表現TFP的T細胞。藉由在注射前與假轉導細胞混合將T細胞相對於45-50%輸入GFP+ T細胞進行正規化且藉由流式細胞術證實。以1週間隔評估動物之癌症。使用對數秩檢驗比較TFP+ T細胞組之存活曲線。
可評估劑量依賴性TFP治療反應(參見例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009))。舉例而言，在第21天用TFP T細胞、等效數目之假轉導T細胞注射或未用T細胞注射之小鼠中建立癌症之後35-70天獲得外周血。對各組之小鼠進行隨機抽血以測定外周血TAA+癌細胞計數，隨後在第35天及第49天殺死。在第57天及第70天評估其餘動物。
先前已描述細胞增殖及細胞介素產生之評定，例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。簡而言之，藉由將經洗滌之T細胞與表現TAA或CD32及CD137之細胞(KT32-BBL)混合以達成最終T細胞：表現TAA之細胞比率為2：1而在微量滴定板中對TFP介導之增殖進行評定。在使用前用γ放射輻照表現TAA之細胞。將抗CD3(純系OKT3)及抗CD28(純系9.3)單株抗體添加至含KT32-BBL細胞之培養物中，以充當刺激T細胞增殖之陽性對照，因為此等信號支持長期CD8+ T細胞離體擴增。使用CountBrightTM螢光 珠粒(Invitrogen)及流式細胞術，如製造商所描述對培養物中之T細胞進行計數。藉由GFP表現，使用經表現eGFP-2A連接之TFP之慢病毒載體工程化的T細胞來鑑定TFP+ T細胞。對於不表現GFP之TFP+ T細胞，用生物素化重組TAA蛋白及二級親和素-PE結合物偵測TFP+ T細胞。亦用特定單株抗體(BD Biosciences)同時偵測T細胞上之CD4+及CD8+表現。對使用人類TH1/TH2細胞介素細胞計數珠粒陣列套組(BD Biosciences)，根據製造商之說明書進行再刺激後24小時收集之上清液進行細胞介素量測。使用FACScalibur流式細胞儀評定螢光，且根據製造商之說明書分析資料。
可藉由標準51Cr釋放分析來評定細胞毒性(參見例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009))。簡而言之，在37℃下在頻繁攪拌下使靶細胞負載51Cr(呈NaCrO4形式，New England Nuclear)持續2小時，在完全RPMI培養基中洗滌兩次並接種至微量滴定板中。將效應T細胞與孔中處於完全RPMI中之靶細胞以不同的效應細胞：靶細胞比率(E：T)混合。亦製備僅含有培養基(自發釋放，SR)或1% triton-X 100清潔劑溶液(總釋放，TR)之額外孔。在37℃下培育4小時之後，自各孔收集上清液。隨後使用γ粒子計數器(Packard Instrument Co.，Waltham，MA.)量測釋放之51Cr。各條件以至少一式三份進行，且使用下式計算溶解百分比：溶解%=(ER-SR)/(TR-SR)，其中ER表示各實驗條件釋放之平均51Cr。
可使用成像技術評估攜帶腫瘤之動物模型中的TFP特異性運輸及增殖。此種分析法已描述於例如Barrett等人，Human Gene Therapy 22：1575-1586(2011)中。簡而言之，對NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠IV注射癌細胞，繼而在7天後，在用TFP構築體進行電穿孔後4小時對NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠注射T細胞。用慢病毒構築體穩定轉染T細胞以表現螢火蟲螢光素酶，並且對小鼠進 行生物發光成像。替代地，可如下量測在癌症異種移植模型中單次注射TFP+ T細胞之治療效力及特異性：對NSG小鼠注射經轉導以穩定表現螢火蟲螢光素酶之癌細胞，繼而在7天後單次尾靜脈注射經TAA TFP電穿孔之T細胞。注射後在不同時間點對動物進行成像。舉例而言，可在第5天(治療前2天)及第8天(TFP+PBL後24小時)在代表性小鼠中產生螢火蟲螢光素酶陽性癌症之光子密度熱圖。
其他分析(包括本文中之實例部分中所描述之分析法以及此項技術中已知的分析)亦可用於評估本發明之抗TAA TFP構築體。
治療應用 MUC16、IL13Rα2及MSLN相關疾病及/或病症
在一個態樣中，本發明提供用於治療與MUC16、IL13Rα2或MSLN表現相關之疾病的方法。在一個態樣中，本發明提供用於治療腫瘤之一部分對MUC16、IL13Rα2或MSLN呈陰性且腫瘤之一部分對MUC16、IL13Rα2或MSLN呈陽性之疾病的方法。舉例而言，本發明之TFP可用於治療已針對與MUC16、IL13Rα2或MSLN表現升高相關之疾病進行治療之個體，其中該已針對MUC16、IL13Rα2或MSLN水準升高進行治療之個體展現與MUC16、IL13Rα2或MSLN水準升高相關之疾病。
在一個態樣中，本發明係關於一種載體，其包含可操作地連接至啟動子以便在哺乳動物T細胞中表現之抗TAA TFP。在一個態樣中，本發明提供一種表現MUC16、IL13Rα2或MSLN TFP之重組T細胞以用於分別治療表現MUC16、IL13Rα2或MSLN之腫瘤，其中表現MUC16、IL13Rα2或MSLN TFP之重組T細胞稱為MUC16、IL13Rα2或MSLN TFP-T。在一個態樣中，本發明之MUC16、IL13Rα2或MSLN TFP-T能夠使腫瘤細胞與其表面上表現之至少一 種本發明MUC16、IL13Rα2或MSLN TFP接觸，使得TFP-T靶向腫瘤細胞並抑制腫瘤生長。
在一個態樣中，本發明係關於一種抑制表現MUC16、IL13Rα2或MSLN之腫瘤細胞生長之方法，其包括使腫瘤細胞與本發明之抗MUC16、抗IL13Rα2或抗MSLN TFP T細胞接觸，使得TFP-T響應於抗原(例如，癌細胞表面上存在之MUC16、IL13Rα2或MSLN抗原)而活化並靶向癌細胞，其中腫瘤生長得到抑制。
在一個態樣中，本發明係關於一種治療個體之癌症的方法。該方法包括向個體投與本發明之抗TAATFP T細胞，從而治療個體之癌症。可藉由本發明之抗TAA TFP T細胞治療之癌症的實例為與相應TAA表現相關之癌症。在一個態樣中，癌症為間皮瘤。在一個態樣中，癌症為胰臟癌。在一個態樣中，癌症為卵巢癌。在一個態樣中，癌症為胃癌。在一個態樣中，癌症為肺癌。在一個態樣中，癌症為子宮內膜癌。在一些實施例中，抗TAA TFP療法可與一或多種額外療法組合使用。
本發明包括一種細胞療法，其中對T細胞進行遺傳修飾以表現TFP並且將表現TFP之T細胞輸注至有需要之接受體。所輸注之細胞能夠殺死接受體之腫瘤細胞。不同於抗體療法，表現TFP之T細胞能夠在活體內複製，由此獲得長期耐久性，從而可引起持續腫瘤控制。在各個態樣中，投與患者之T細胞或其子代在向患者投與T細胞之後在該患者中持續至少一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月、十二個月、十三個月、十四個月、十五個月、十六個月、十七個月、十八個月、十九個月、二十個月、二十一個月、二十二個月、二十三個月、兩年、三年、四年或五年。
本發明亦包括一種細胞療法，其中例如藉由活體外轉錄之RNA對T細胞進行修飾，以瞬時表現TFP並且將表現TFP之T細胞輸注至有需要之接受體。所輸注之細胞能夠殺死接受體之腫瘤細胞。因而，在各個態樣中，投與患者之T細胞在T細胞投與患者之後存在不足一個月，例如三週、兩週或一週。
不希望受任何特定理論束縛，由表現TFP之T細胞引發之抗腫瘤免疫反應可為主動或被動免疫反應，或替代地可歸因於直接相對於間接免疫反應。在一個態樣中，經TFP轉導之T細胞響應於表現腫瘤相關抗原(TAA)(例如MUC16、IL13Rα2或MSLN)之人類癌細胞而展現特異性促炎性細胞介素分泌及有效細胞溶解活性，抵抗可溶性TAA抑制，介導旁觀者殺死及/或介導所建立之人類腫瘤的消退。舉例而言，表現TAA之腫瘤之異質區域內的無抗原腫瘤細胞可能易於被先前已與相鄰抗原陽性癌細胞反應之TAA重定向T細胞間接破壞。
在一個態樣中，本發明之人類TFP修飾T細胞可為一種用於哺乳動物離體免疫及/或活體內療法之疫苗。在一個態樣中，哺乳動物為人類。
就離體免疫而言，在該細胞投與哺乳動物之前，在活體外發生以下至少一種：i)細胞擴增，ii)將編碼TFP之核酸引入至細胞，或iii)冷凍保存細胞。
離體程序在此項技術中為眾所周知的且更充分論述如下。簡而言之，自哺乳動物(例如人類)分離細胞，並且用表現本文中揭示之TFP的載體進行遺傳修飾(亦即，活體外轉導或轉染)。可將經TFP修飾之細胞投與哺乳動物接受體以提供治療益處。哺乳動物接受體可為人類，且經TFP修飾之細胞相對於接受體可為自體的。替代地，細胞相對於接受體可為同種異體、同基因或異種的。
用於離體擴增造血幹細胞及祖細胞之程序描述於美國專利第5,199,942號(該專利以引用之方式併入本文中)中，可應用於本發明之細胞。其他適合之方法在此項技術中為已知的，因此本發明不限於任何特定的細胞離體擴 增方法。簡而言之，T細胞之離體培養及擴增包括：(1)自外周血收集物或骨髓培植體收集哺乳動物之CD34+造血幹細胞及祖細胞；及(2)離體擴增該等細胞。除美國專利第5,199,942號中描述之細胞生長因子以外，其他因子諸如flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配位體亦可用於培養及擴增該等細胞。
除在離體免疫方面使用基於細胞之疫苗以外，本發明亦提供用於活體內免疫之組合物及方法，以便在患者中引發針對抗原之免疫反應。
一般而言，如本文中所描述活化及擴增之細胞可用於治療及預防免疫受損個體中出現之疾病。特定言之，本發明之經TFP修飾之T細胞用於治療與MUC16、IL13Rα2或MSLN表現相關之疾病、病症及病狀。在某些態樣中，本發明之細胞用於治療有罹患與MUC16、IL13Rα2或MSLN表現相關之疾病、病症及病狀之風險的患者。因而，本發明提供治療或預防與MUC16、IL13Rα2或MSLN表現相關之疾病、病症及病狀的方法，其包括向有需要之個體投與治療有效量之本發明之經TFP修飾之T細胞。
在一個態樣中，本發明之TFP-T細胞可用於治療增殖性疾病，諸如癌症或惡性病或癌前病狀。在一個態樣中，癌症為間皮瘤。在一個態樣中，癌症為胰臟癌。在一個態樣中，癌症為卵巢癌。在一個態樣中，癌症為胃癌。在一個態樣中，癌症為肺癌。在一個態樣中，癌症為乳癌。在一個態樣中，癌症為子宮內膜癌。此外，與MUC16、IL13Rα2或MSLN表現相關之疾病包括但不限於例如表現MUC16、IL13Rα2或MSLN之非典型及/或非經典癌症、惡性病、癌前病狀或增殖性疾病。與MUC16、IL13Rα2或MSLN表現相關之非癌症相關適應症包括但不限於例如自體免疫疾病(例如狼瘡)、炎症性病症(過敏反應及氣喘)、炎症性腸病、肝硬化、心臟衰竭、腹膜感染以及腹部手術及移植。
本發明之經TFP修飾之T細胞可單獨或作為與稀釋劑及/或與其他組 分(諸如IL-2)或其他細胞介素或細胞群體組合之醫藥組合物投與。
本發明亦提供抑制表現TAA之細胞增殖或減少其群體的方法，該等方法包括使包含表現TAA之細胞的細胞群體與結合表現TAA之細胞的本發明抗TAA TFP-T細胞接觸。在一些態樣中，本發明提供用於抑制表現TAA之癌細胞增殖或減少其群體的方法，該等方法包括使表現TAA之癌細胞群體與結合表現TAA之細胞的本發明抗TAA TFP-T細胞接觸。在一個態樣中，本發明提供用於抑制表現腫瘤相關抗原之癌細胞增殖或減少其群體的方法，該等方法包括使表現TAA之癌細胞群體與結合表現TAA之細胞的本發明抗TAA TFP-T細胞接觸。在某些態樣中，本發明之抗TAA TFP-T細胞使患有與表現TAA之細胞相關之癌症的個體或動物模型中的細胞及/或癌細胞之數量、數目、量或百分比相對於陰性對照減少至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%或至少99%。在一個態樣中，個體為人類。
本發明亦提供用於預防、治療及/或控制與表現TAA之細胞相關之疾病(例如表現TAA之癌症)的方法，該等方法包括向有需要之個體投與結合表現TAA之細胞的本發明抗TAA TFP-T細胞。在一個態樣中，個體為人類。與表現TAA之細胞相關之病症的非限制性實例包括自體免疫病症(諸如狼瘡)、炎症性病症(諸如過敏及氣喘)及癌症(諸如胰臟癌、卵巢癌、胃癌、肺癌或子宮內膜癌，或表現TAA之非典型癌症)。
本發明亦提供用於預防、治療及/或控制與表現TAA之細胞相關之疾病的方法，該等方法包括向有需要之個體投與結合表現TAA之細胞的本發明抗TAA TFP-T細胞。在一個態樣中，個體為人類。
本發明提供用於預防與表現TAA之細胞相關之癌症復發的方法，該等方法包括向有需要之個體投與結合表現TAA之細胞的本發明抗TAA TFP-T 細胞。在一個態樣中，該等方法包括向有需要之個體投與有效量之結合表現TAA之細胞的本文中所描述之抗TAA TFP-T細胞與有效量之另一療法的組合。
組合療法
本文中所描述之表現TFP之細胞可與其他已知劑及療法組合使用。如本文中所使用，「組合」投與意謂在個體罹患病症之過程中向個體遞送兩種(或更多種)不同的治療，例如，在個體被診斷患有病症之後在已治癒或消除病症或者出於其他原因停止治療之前遞送兩種或更多種治療。在一些實施例中，一種治療之遞送在第二治療之遞送開始時仍在發生，因此就投與而言存在重疊。此在本文中有時稱為「同時」或「併行遞送」。在其他實施例中，一種治療之遞送在另一治療之遞送開始之前結束。在任一情況之一些實施例中，治療由於組合投與而更有效。舉例而言，與在不存在第一治療之情況下投與第二治療時所見之效果相比，第二治療更有效，例如，在較少第二治療下可見等效的效果，或第二治療在更大程度上減輕症狀，或在第一治療之情況下可見類似情況。在一些實施例中，遞送使得症狀減輕或與病症有關之其他參數超過在不存在另一治療時遞送一種治療之情況下所觀測之結果。兩種治療之效果可部分加和、完全加和或超過加和。該遞送可使得當遞送第二治療時仍可偵測到所遞送之第一治療之效果。
在一些實施例中，「至少一種額外治療劑」包括表現TFP之細胞。亦提供表現多種TFP之T細胞，其結合相同或不同的靶抗原，或相同靶抗原上之相同或不同的抗原決定基。亦提供T細胞群體，其中第一T細胞子集表現第一TFP且第二T細胞子集表現第二TFP。
本文中所描述之表現TFP之細胞及至少一種額外治療劑可同時、處於相同或獨立的組合物中或依序投與。就依序投與而言，可首先投與本文中所 描述之表現TFP之細胞且可其次投與額外的劑，或可逆轉投與順序。
在其他態樣中，本文中所描述之表現TFP之細胞可與手術、化學療法、放射、免疫抑制劑(諸如環孢菌素、硫唑嘌呤、胺甲喋呤、黴酚酸酯及FK506)、抗體或其他免疫消除劑(諸如阿侖單抗、抗CD3抗體或其他抗體療法)、細胞毒素、氟達拉濱、環孢菌素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228、細胞介素及輻照組合用於治療方案中。本文中所描述之表現TFP之細胞亦可與肽疫苗組合使用，諸如Izumoto等人，2008 J Neurosurg 108：963-971所描述。在另一態樣中，本文中所描述之表現TFP之細胞亦可與骨髓細胞分化啟動子(例如全反式視黃酸)、骨髓來源之抑制細胞(MDSC)擴增抑制劑(例如c-kit受體抑制劑或VEGF抑制劑)、MDSC功能抑制(例如COX2抑制劑或磷酸二酯酶-5抑制劑)或治療消除MDSC(例如用諸如艾黴素及環磷醯胺治療等化學治療方案)組合使用。可預防MDSC擴增之其他治療劑包括胺基二膦酸酯、二磷酸酯、西地那非(sildenafil)及他達拉非(tadalafil)、硝基阿司匹靈(nitroaspirin)、維生素D3及吉西他濱(gemcitabine)。(參見例如Gabrilovich及Nagaraj,Nat.Rev.Immunol,(2009)v9(3)：162-174)。
在一個實施例中，可向個體投與降低或改善與投與表現TFP之細胞相關之副作用的劑。與投與表現TFP之細胞相關之副作用包括但不限於細胞介素釋放症候群(CRS)，及噬血球性淋巴組織細胞增生症(HLH)，亦稱為巨噬細胞活化症候群(MAS)。CRS之症狀包括高燒、噁心、短暫性低血壓、缺氧及其類似症狀。因此，本文中所描述之方法可包括向個體投與本文中所描述之表現TFP之細胞，並進一步投與可控制由用表現TFP之細胞治療引起之可溶性因子水準升高的劑。在一個實施例中，個體中升高之可溶性因子為IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-6及IL8中之一或多種。因此，用於治療此副作用之劑可為中和此等可溶性因 子中之一或多種的劑。該等劑包括但不限於類固醇、TNFα抑制劑及IL-6抑制劑。TNFα抑制劑之實例為依那西普(entanercept)。IL-6抑制劑之實例為托西珠單抗(tocilizumab)(toc)。
在一個實施例中，可向個體投與增強表現TFP之細胞之活性的劑。舉例而言，在一個實施例中，該劑可為抑制抑制性分子之劑。在一些實施例中，抑制性分子，例如程式性死亡蛋白1(PD1)可降低表現TFP之細胞建立免疫效應子反應之能力。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFRβ。抑制性分子之抑制，例如藉由在DNA、RNA或蛋白質層級上進行抑制，可最佳化表現TFP之細胞效能。在諸多實施例中，抑制性核酸(例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA)可用於抑制表現TFP之細胞中之抑制性分子表現。在一實施例中，抑制劑為shRNA。在一實施例中，抑制性分子在表現TFP之細胞內受到抑制。在此等實施例中，抑制抑制性分子之表現的dsRNA分子連接至編碼TFP之組分(例如所有組分)的核酸。在一個實施例中，抑制性信號之抑制劑可為例如結合抑制性分子之抗體或抗體片段。舉例而言，該劑可為結合PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4之抗體或抗體片段(例如伊匹單抗(ipilimumab)(亦稱為MDX-010及MDX-101且作為YervoyTM銷售；Bristol-Myers Squibb；曲美目單抗(tremelimumab)(可得自Pfizer之IgG2單株抗體，先前稱為替西木單抗(ticilimumab)、CP-675,206))。在一實施例中，該劑為結合TIM3之抗體或抗體片段。在一實施例中，該劑為結合LAG3之抗體或抗體片段。
在一些實施例中，可經由慢病毒(例如特異性靶向CD4+或CD8+ T細胞之慢病毒)在活體內(例如，藉由基因轉移)改變T細胞。(參見例如Zhou等人，J.Immunol.(2015)195：2493-2501)。
在一些實施例中，增強表現TFP之細胞之活性的劑可為例如包含第一結構域及第二結構域之融合蛋白，其中該第一結構域為抑制性分子或其片段，且該第二結構域為與陽性信號相關之多肽，例如包含如本文中所描述之細胞內信號傳導結構域的多肽。在一些實施例中，與陽性信號相關之多肽可包括例如本文中所描述之CD28、CD27、ICOS之共刺激結構域，例如CD28、CD27及/或ICOS之細胞內信號傳導結構域，及/或一級信號傳導結構域，例如CD3ζ之一級信號傳導結構域。在一個實施例中，融合蛋白由表現TFP之相同細胞表現。在另一實施例中，融合蛋白由細胞(例如不表現抗TAA TFP之T細胞)表現。
醫藥組合物
本發明之醫藥組合物可包含表現TFP之細胞(例如，如本文中所描述之複數種表現TFP之細胞)與一或多種醫藥學上或生理學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的組合。該等組合物可包含緩衝液，諸如中性緩衝生理鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水及其類似物；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或聚葡萄糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；及防腐劑。在一個態樣中，本發明之組合物經調配以供經靜脈內投與。
本發明之醫藥組合物可用適於欲治療(或預防)之疾病的方式投與。投與數量及頻率將由諸如患者之狀況以及患者之疾病之類型及嚴重程度之因素來決定，但適當劑量可藉由臨床試驗來確定。
在一個實施例中，醫藥組合物實質上不含(例如不存在)可偵測水準之例如選自由以下組成之群的污染物：內毒素、黴漿菌、複製勝任型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、殘餘抗CD3/抗CD28塗覆珠粒、小鼠抗體、彙集人類血清、牛血清白蛋白、牛血清、培養基組分、載體包裝細胞或質體組分、 細菌及真菌。在一個實施例中，細菌為選自由以下組成之群的至少一種：糞產鹼菌(Alcaligenes faecalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大腸桿菌(Escherichia coli)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)及A組釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)。
當指示「免疫有效量」、「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，欲投與之本發明組合物之確切量可由醫師在考慮患者(個體)之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度以及身體狀況之個體差異的情況下確定。一般可稱本文中所描述之包含T細胞之醫藥組合物可以104至109個細胞/公斤體重(在一些情況下以105至106個細胞/公斤體重)(包括彼等範圍內之所有整數值)之劑量投與。T細胞組合物亦可以此等劑量投與多次。可藉由使用免疫療法中通常已知的輸注技術來投與細胞(參見例如Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319：1676,1988)。
在某些態樣中，可能需要將活化T細胞投與個體，隨後再抽取血液(或進行血球分離)，根據本發明活化其中之T細胞，並且用此等經活化及擴增之T細胞對患者進行重新輸注。此過程可每數週進行多次。在某些態樣中，可自10cc至400cc之血液抽取物中活化T細胞。在某些態樣中，自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc之血液抽取物中活化T細胞。
受試組合物之投與可用任何便利之方式進行，包括藉由氣溶膠吸入、注射、攝入、輸血、植入或移植。本文中所描述之組合物可經動脈、皮下、真皮內、腫瘤內、結節內、髓內、肌肉內、藉由靜脈內(i.v.)注射或經腹膜內投與患者。在一個態樣中，藉由真皮內或皮下注射將本發明之T細胞組合物投與 患者。在一個態樣中，藉由靜脈內注射投與本發明之T細胞組合物。可將T細胞組合物直接注射至腫瘤、淋巴結或感染部位。
在一特定例示性態樣中，個體可經歷白血球分離術，其中離體收集、增濃或耗竭白血球以選擇及/或分離相關細胞，例如T細胞。可藉由此項技術中已知的方法擴增此等T細胞分離物並加以處理，以便可引入一或多種本發明之TFP構築體，從而產生本發明之表現TFP之T細胞。有需要之個體隨後可以高劑量化學療法進行標準治療，繼而進行外周血幹細胞移植。在某些態樣中，在移植後或與移植併行，個體接受輸注本發明之經擴增之TFP T細胞。在另一態樣中，在手術前或手術後投與經擴增之細胞。
欲投與患者之以上治療之劑量將隨所治療之病狀的確切性質及治療之接受體而變化。可根據技術公認之實務來標定供人類投與之劑量。舉例而言，對於成年患者，阿侖單抗之劑量一般將在1至約100mg之範圍內，通常每日投與一次，持續1至30天之時段。較佳每日劑量為每天1至10mg，但在一些情況下，可使用至多每天40mg之較大劑量(描述於美國專利第6,120,766號中)。
在一個實施例中，例如使用活體外轉錄將TFP引入T細胞中，且個體(例如人類)接受本發明之TFP T細胞之初始投與，以及本發明之TFP T細胞之一或多次後續投與，其中該一或多次後續投與在先前投與之後不足15天，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天投與。在一個實施例中，每週向個體(例如人類)投與超過一次之本發明之TFP T細胞投與，例如每週投與2、3或4次本發明之TFP T細胞。在一個實施例中，個體(例如人類個體)接受每週超過一次之TFP T細胞投與(例如，每週2、3或4次投與)(在本文中亦稱為週期)，繼而一週不進行TFP T細胞投與，隨後向個體投與一或多次額外TFP T細胞投與(例如，每週超過一次TFP T細胞投與)。在另一實施例中，個體(例如人 類個體)接受超過一個週期之TFP T細胞，且各週期之間的時間少於10、9、8、7、6、5、4或3天。在一個實施例中，每隔一天投與TFP T細胞，每週投與3次。在一個實施例中，投與本發明之TFP T細胞持續至少二、三、四、五、六、七、八或更多週。
在一個態樣中，使用慢病毒病毒載體(諸如慢病毒)產生TAA TFP T細胞。該方式產生之TFP-T細胞將具有穩定TFP表現。
在一個態樣中，TFP T細胞在轉導後4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天瞬時表現TFP載體。TFP之瞬時表現可藉由RNA TFP載體遞送來實現。在一個態樣中，藉由電穿孔將TFP RNA轉導至T細胞中。
正使用瞬時表現TFP T細胞(尤其是攜帶鼠類scFv之TFP T細胞)治療之患者可能出現之潛在問題為多次治療之後的過敏症。
不受此理論束縛，據信此種過敏反應可能由患者產生體液抗TFP反應，亦即，具有抗IgE同型之抗TFP抗體引起。據認為，當暴露於抗原中斷十至十四天時，患者之抗體產生細胞經歷自IgG同型(不引起過敏症)至IgE同型之類別轉換。
若患者在瞬時TFP療法(諸如由RNA轉導產生之彼等)過程中有產生抗TFP抗體反應之高風險，則TFP T細胞輸注中斷不應持續超過十至十四天。
細胞介素釋放
細胞介素釋放症候群為全身性炎症性反應症候群之一種形式，其作為一些疾病或感染之併發症而出現，並且亦為一些單株抗體藥物以及過繼性T細胞療法之不良效應。TFP T細胞可展現比CAR-T細胞更佳之殺死活性。投與個體之TFP T細胞可展現與投與個體之CAR-T細胞相比更佳之殺死活性。此可為TFP T細胞相對於CAR-T細胞之優勢之一。TFP T細胞可展現與CAR-T細胞 相比更少的細胞介素釋放。投與TFP T細胞之個體可展現與投與CAR-T細胞之個體相比更少的細胞介素釋放。此可為TFP T細胞療法相對於CAR-T細胞療法之優勢之一。TFP T細胞可展現與CAR-T細胞類似或更佳之殺死活性，且TFP T細胞可展現與CAR-T細胞相比更少的細胞介素釋放。投與個體之TFP T細胞可展現與投與個體之CAR-T細胞類似或更佳之殺死活性，且個體可展現與投與CAR-T細胞之個體相比更少的細胞介素釋放。此可為TFP T細胞療法相對於CAR-T細胞療法之優勢之一。
在一些情況下，TFP T細胞治療之細胞介素釋放少於CAR-T細胞治療之細胞介素釋放。在一些實施例中，TFP T細胞治療之細胞介素釋放與CAR-T細胞治療之細胞介素釋放相比少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。TFP T細胞之T細胞治療中釋放的各種細胞介素少於CAR-T細胞。在一些實施例中，細胞介素為IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6、IL-13、IL-5、IL-10、sCD137、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β或其組合。在一些情況下，TFP T細胞治療釋放之穿孔素、顆粒酶A、顆粒酶B或其組合少於CAR-T細胞治療。在一些實施例中，在用TFP T細胞治療時釋放之穿孔素、顆粒酶A或顆粒酶B與用CAR-T細胞治療相比少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%或至少60%。
在一些實施例中，對於指定細胞介素，在治療後釋放的指定細胞介素之量與用包含相同人類或人類化抗體結構域之CAR-T細胞治療之哺乳動物的指定細胞介素之量相比低至少10%。在一些實施例中，指定細胞介素包含一或多種選自由以下組成之群的細胞介素：IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6、IL-13、IL-5、IL-10、sCD137、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β，及其任何組合。
TFP T細胞在殺死腫瘤細胞方面可展現與CAR-T細胞相比類似或更 佳之活性。在一些實施例中，該哺乳動物中之腫瘤生長受到抑制，使得在治療至少8天之後，該腫瘤之大小為用不表現TFP之T細胞治療之哺乳動物中之腫瘤大小的至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%或至多60%，其中該用表現TFP之T細胞治療之哺乳動物及該用不表現TFP之T細胞治療之哺乳動物在治療之前具有相同的腫瘤大小。在一些實施例中，該哺乳動物中之腫瘤生長受到完全抑制。在一些實施例中，該哺乳動物中之腫瘤生長受到完全抑制持續至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天、至少100天或更久。在一些實施例中，經TFP轉導之T細胞群體與包含相同人類或人類化抗體結構域之CAR-T細胞相比殺死類似量之腫瘤細胞。
TFP T細胞與不表現TFP之細胞相比可展現不同的基因表現譜。在一些情況下，TFP T細胞與CAR-T細胞相比可展現類似的基因表現譜。在一些其他情況下，TFP T細胞與CAR-T細胞相比可展現不同的基因表現譜。在一些實施例中，經TFP轉導之T細胞群體與包含相同人類或人類化抗體結構域之CAR-T細胞相比具有不同的基因表現譜。在一些實施例中，經TFP轉導之T細胞中的基因表現水準不同於包含相同人類或人類化抗體結構域之CAR-T細胞中的基因表現水準。在一些實施例中，該基因在抗原呈遞、TCR信號傳導、體內平衡、代謝、趨化介素信號傳導、細胞介素信號傳導、類鐸受體信號傳導、MMP及黏附分子信號傳導或TNFR相關信號傳導中具有功能。
實例
藉由參考以下實驗實例進一步詳細描述本發明。此等實例僅出於說明目的而提供且除非另外說明，否則並非意圖進行限制。因而，本發明決不應被視為受限於以下實例，而應視為涵蓋由於本文中提供之教示而顯而易知的任 何及所有變化。無需進一步描述，據信熟習此項技術者可使用先前描述及以下說明性實例來製造及利用本發明之化合物以及實踐所主張之方法。以下工作實例明確指出本發明之各個態樣，而不應被視為以任何方式限制本發明之其餘部分。
實例1：TFP構築體
可藉由將利用編碼短連接子(SL)：AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO：2)或長連接子(LL)：AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO：3)之DNA序列連接至CD3或TCR DNA片段之抗TAA VHH結構域(或SD結構域)DNA片段選殖至p510載體((System Biosciences(SBI))中XbaI及EcoR1位點處將抗TAA TFP構築體工程化。亦可使用其他載體，例如pLRPO載體。
所產生之抗TAA TFP構築體之實例包括p510_抗TAA_LL_TCRα(抗TAA VHH-長連接子-人類全長T細胞受體α鏈)、p510_TAA_LL_TCR αC(抗TAA VHH-長連接子-人類T細胞受體α恆定結構域鏈)、p510_抗TAA_LL_TCRβ(抗TAA VHH-長連接子-人類全長T細胞受體β鏈)、p510_抗TAA_LL_TCRβC(抗TAA VHH-長連接子-人類T細胞受體β恆定結構域鏈)、p510_抗TAA_LL_CD3γ(抗TAA VHH-長連接子-人類CD3γ鏈)、p510_抗TAA_LL_CD3δ(抗TAA VHH-長連接子-人類CD3δ鏈)、p510_抗TAA_LL_CD3ε(抗TAA VHH-長連接子-人類CD3ε鏈)、p510_抗TAA_SL_TCRβ(抗TAA VHH-短連接子-人類全長T細胞受體β鏈)、p510_抗TAA_SL_CD3γ(抗TAAVHH-短連接子-人類CD3γ鏈)、p510_抗TAA_SL_CD3δ(抗TAA VHH-短連接子-人類CD3δ鏈)、p510_抗TAA_SL_CD3ε(抗TAA VHH-短連接子-人類CD3ε鏈)。
本文中所使用之抗MUC16可為人類MUC16特異性scFv，例如 4H11。
相應抗MUC16、抗IL13Ra2或抗MSLN A CAR構築體、p510_抗TAA_28ζ之實例可藉由將編碼抗TAA、部分CD28細胞外結構域、CD28跨膜結構域、CD28細胞內結構域及CD3ζ之合成DNA選殖至p510載體中XbaI及EcoR1位點處來產生。
可使用各種其他載體來產生融合蛋白構築體。
實例2：抗體序列 抗體序列之產生 scFv之產生
人類或人類化抗TAA IgG可用於產生TFP構築體之scFv序列。可獲得編碼人類或人類化VL及VH結構域之DNA序列，且可視情況最佳化構築體之密碼子以便在來自智人之細胞中表現。VL及VH結構域在scFv中出現之順序為可變的(亦即，VL-VH或VH-VL取向)，且三個「G4S(SEQ ID NO：122)」拷貝或「G4S(SEQ ID NO：122)」次單元(G4S)3(SEQ ID NO：112)連接可變結構域以產生scFv結構域。抗TAA scFv質體構築體可具有視情況選用之Flag、His或其他親和力標籤，且可電穿孔至HEK293或其他適合人類或哺乳動物細胞株中並純化。驗證分析包括藉由FACS之結合分析、使用Proteon之動力學分析及MUC16、IL13Rα2或MSLN表現細胞之染色。
可與本文中描述之組合物及方法一起使用之抗MUC16、抗IL13Rα2或抗MSLN結合結構域(包括VL結構域、VH結構域及CDR)之實例可見於一些出版物及/或商業來源。舉例而言，某些抗MUC16抗體，包括3A5及11D10，已揭示於WO 2007/001851中，該案之內容以引用之方式併入。3A5單株抗體結合MUC16多肽之多個位點，根據OVCAR-3 Scatchard分析，親和力為433pM。 VL及VH結構域、CDR及編碼其之核苷酸序列之實例分別可為以下單株抗體之彼等：GTX10029、GTX21107、MA5-124525、MA5-11579、25450002、ABIN1584127、ABIN93655、112889、120204、LS-C356195、LS-B6756、TA801241、TA801279、V3494、V3648、666902、666904、HPA065600、AMAb91056。
人類IL13Rα2多肽經典序列為UniProt登錄號Q14627。提供能夠特異性結合至人類MUC16、IL13Rα2或MSLN多肽及其片段或結構域之抗體多肽。可使用多種技術產生抗TAA抗體(參見例如Nicholson等人，1997)。在鼠類抗TAA抗體用作起始材料時，臨床環境需要鼠類抗TAA抗體人類化，其中小鼠特異性殘基可在接受T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)治療，亦即，經TFP.TAA構築體轉導之T細胞治療之個體中誘導人類抗小鼠抗原(HAMA)反應。藉由將來自鼠類抗TAA抗體之CDR區移植至適當人類生殖系受體構架上(視情況包括對CDR及/或構架區進行其他修飾)來實現人類化。如本文中所提供，抗體及抗體片段殘基編號遵循Kabat(Kabat E.A.等人，1991；Chothia等人，1987)。
單結構域結合物
駱駝抗體及其他單結構域抗體亦可用於產生抗MUC16、IL13Rα2、MSLN或其他抗腫瘤抗原TFP構築體。VHH結構域可用於與各種TCR次單元融合。在一些實施例中，使用單結構域(例如VHH)結合物，諸如表4中所示之單結構域結合物(參見例如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：98之非限制性實例)。抗TAA單結構域抗體之製備進一步描述於實例3及實例5中。
TCR次單元之來源
人類T細胞受體(TCR)複合物之次單元均含有細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域。人類TCR複合物含有CD3ε多肽、CD3γ多肽、CD3δ多肽、CD3ζ多肽、TCRα鏈多肽及TCRβ鏈多肽。人類CD3ε多肽典型序列為Uniprot登錄號P07766。人類CD3γ多肽典型序列為Uniprot登錄號P09693。人類CD3δ多肽典型序列為Uniprot登錄號P043234。人類CD3ζ多肽典型序列為Uniprot登錄號P20963。人類TCRα鏈典型序列為Uniprot登錄號Q6ISU1。人類TCRβ鏈C區經典序列為Uniprot登錄號P01850，人類TCRβ鏈V區序列為P04435。
人類CD3ε多肽典型序列為：
Figure 108126642-A0202-12-0115-1
Figure 108126642-A0202-12-0115-2
Figure 108126642-A0202-12-0115-3
(SEQ ID NO：4)。
人類CD3γ多肽典型序列為：
Figure 108126642-A0202-12-0115-8
Figure 108126642-A0202-12-0115-4
Figure 108126642-A0202-12-0115-9
(SEQ ID NO：5)。
人類CD3δ多肽典型序列為：
Figure 108126642-A0202-12-0115-489
Figure 108126642-A0202-12-0115-5
Figure 108126642-A0202-12-0115-6
(SEQ ID NO： 6)。
人類CD3ζ多肽典型序列為：
Figure 108126642-A0202-12-0116-12
Figure 108126642-A0202-12-0116-11
Figure 108126642-A0202-12-0116-13
(SEQ ID NO：7)。
人類TCRα鏈典型序列為：
Figure 108126642-A0202-12-0116-14
Figure 108126642-A0202-12-0116-15
Figure 108126642-A0202-12-0116-16
(SEQ ID N O：8)。
人類TCRα鏈C區典型序列為：
Figure 108126642-A0202-12-0116-17
Figure 108126642-A0202-12-0116-18
Figure 108126642-A0202-12-0116-19
(SEQ ID NO：9)。
人類TCRα鏈V區CTL-L17典型序列為：
Figure 108126642-A0202-12-0116-20
Figure 108126642-A0202-12-0116-21
Figure 108126642-A0202-12-0116-22
(SEQ ID NO：10)。
人類TCRβ鏈C區典型序列為：
Figure 108126642-A0202-12-0116-23
Figure 108126642-A0202-12-0116-10
(SEQ ID NO：11)。
人類TCRβ鏈V區CTL-L17典型序列為：
Figure 108126642-A0202-12-0117-24
Figure 108126642-A0202-12-0117-25
Figure 108126642-A0202-12-0117-26
(SEQ ID NO：12)。
人類TCRβ鏈V區YT35典型序列為：
Figure 108126642-A0202-12-0117-27
Figure 108126642-A0202-12-0117-28
Figure 108126642-A0202-12-0117-29
(SEQ ID NO：13)。
由TCR結構域及scFv產生TFP
可使用連接子序列(諸如G4S(SEQ ID NO：122)、(G4S)2(SEQ ID NO：123)、(G4S)3(SEQ ID NO：112)或(G4S)4)(SEQ ID NO：111)將MUC16、IL13Rα2或MSLN scFv重組連接至CD3ε或其他TCR次單元。可利用各種連接子及scFv構型。可使用TCRα及TCRβ鏈來產生TFP，呈全長多肽或僅其恆定結構域形式。TCRα及TCRβ鏈之任何可變序列均可用於製造TFP。
TFP表現載體
提供表現載體，其包括：啟動子(巨細胞病毒(CMV)增強子-啟動子)、能夠分泌之信號序列、聚腺苷酸化信號及轉錄終止子(牛生長激素(BGH)基因)、允許附加型複製及在原核生物中複製之元件(例如，SV40起點及ColE1或此項技術中已知的其他元件)及允許選擇之元件(安比西林(ampicillin)抗性基因及吉歐黴素(zeocin)標記物)。
可將編碼TFP之核酸構築體選殖至慢病毒表現載體中，且基於經TFP.TAA轉導之T細胞(「TAA.TFP」或「TAA.TFP T細胞」或「TFP.TAA」或 「TFP.TAA T細胞」)響應於TAA+靶細胞之效應T細胞反應之量及品質來驗證表現，其中『TAA』為例如MUC16、IL13Ra2或MSLN。效應T細胞反應包括但不限於細胞擴增、增殖、倍增、細胞介素產生及靶細胞溶解或細胞溶解活性(亦即，去顆粒)。
抗TAA TFP慢病毒轉移載體可用於產生包裝至VSV-G假型慢病毒顆粒中之基因體物質。將慢病毒轉移載體DNA與VSV-G、gag/pol及rev三種包裝組分與Lipofectamine®試劑之組合混合，以將其共同轉染至HEK-293(胚胎腎，ATCC® CRL-1573TM)細胞中。在24及48小時之後，收集培養基，過濾並藉由超速離心加以濃縮。將所得病毒製劑儲存在-80℃下。轉導單元之數目可藉由在Sup-T1(T細胞淋巴母細胞性淋巴瘤，ATCC® CRL-1942TM)細胞上滴定來測定。藉由用例如抗CD3抗CD28珠粒將新鮮原初T細胞活化24小時，隨後添加適當數目之轉導單位以獲得所要百分比之經轉導T細胞來產生重定向之TFP T細胞。將允許此等經修飾之T細胞擴增直至其靜息並減小其大小，此時將其冷凍保存以供稍後分析。使用Coulter MultisizerTM III量測細胞數目及大小。在冷凍保存之前，藉由流式細胞術分析來測定經轉導(在細胞表面上表現TFP)之細胞之百分比及該表現之相對螢光強度。根據直方圖，可藉由比較轉導百分比與其相對螢光強度來檢查TFP之相對表現水準。
在一些實施例中，藉由用多個病毒載體對T細胞進行轉導來引入多個TFP。
評估人類化TFP重定向T細胞之細胞溶解活性、增殖能力及細胞介素分泌
TFP T細胞產生細胞表面表現之TFP以及殺死靶腫瘤細胞、增殖及分泌細胞介素之功能能力可使用此項技術中已知的分析來測定。
將用人類介白素-2(IL-2)處理人類外周血單核細胞(PBMC，例如來自 將藉由對T細胞、CD4+及CD8+淋巴球進行陰性選擇來獲得其原初T細胞之正常血球分離供體之血液)，隨後例如在10% RPMI中在37℃、5% CO2下用抗CD3x抗CD28珠粒活化，隨後用編碼TFP之慢病毒載體進行轉導。將使用流式細胞術分析證實細胞表面TFP之存在，諸如藉由抗FLAG抗體或抗鼠類可變結構域抗體。將使用ELISA或其他分析量測細胞介素(例如IFN-γ)產生。
實例3：抗IL13Rα2奈米抗體之產生 庫構築 免疫
在第0天、第7天、第14天、第21天、第28天及第35天對美洲駝進行皮下注射，每一次用約150μg與人類IgG1之Fc結構域融合之重組人類IL13Rα2(hIL13Rα2-Fc)(R&D Systems)。所使用之佐劑為GERBU佐劑P(GERBU Biotechnik GmbH)。在第40天，自美洲駝收集約100ml抗凝血以用於淋巴球製備。
構築VHH庫
由美洲駝淋巴球構築VHH庫以篩檢抗原特異性奈米抗體之存在。為此目的，使用來自外周血淋巴球之總RNA作為模板以便用寡(dT)引子進行第一鏈cDNA合成。使用此cDNA，藉由PCR擴增VHH編碼序列，用PstI及NotI消化並選殖至噬菌體質體載體pMECS之PstI及NotI位點中。由此獲得之VHH庫稱為Core 94。該庫由約7×108個獨立的轉型體組成，其中100%轉型體攜帶具有適當插入物大小之載體。
分離人類IL13Rα2特異性奈米抗體
在塗覆(100μg/ml，處於100mM NaHCO3 pH 8.2中)hIL13Rα2抗原之固相上將Core 94庫淘選3輪：藉由因子Xa對hIL13Rα2-Fc抗原進行Fc移除。 藉由重組人類IgG1 Fc(R&D Systems，目錄號110-HG)及因子Xa(各自之最終濃度為1μM)競爭噬菌體與塗覆於孔上之抗原上之任何剩餘人類IgG1 Fc及任何污染因子Xa的結合。在每一輪淘選之後藉由比較自經抗原塗覆之孔溶析之噬菌體質體粒子數目與自陰性對照(未經塗覆經阻斷)孔溶析之噬菌體質體粒子數目來評定抗原特異性噬菌體之增濃。此等實驗表明，噬菌體群體就抗原特異性噬菌體而言在第1輪、第2輪及第3輪之後分別增濃約7倍、200倍及1000倍。總計隨機選擇190個菌落(95個來自第2輪且95個來自第3輪)且藉由ELISA分析其周質提取物中抗原特異性奈米抗體之存在(ELISA使用包括可溶性奈米抗體之粗周質提取物)。用於ELISA篩檢之抗原與用於淘選之抗原相同，使用未經塗覆經阻斷之孔及經重組人類IgG1 Fc與因子Xa之混合物塗覆之孔作為陰性對照。二級抗體(抗小鼠抗體)在經重組人類IgG1 Fc/Xa塗覆之孔上產生微弱背景信號(在405nm下約0.3 OD)，由此將5個純系標記為與Fc交叉反應。在此分析中，此190個菌落中有141個菌落評分為對hIL13Rα2呈陽性，但對hIgG1 Fc/因子Xa混合物則不然。基於141個hIL13Rα2陽性但hIgG1 Fc/因子Xa混合物非陽性之菌落之序列資料，辨別54種不同的全長奈米抗體，屬於16個不同的CDR3組(B細胞譜系)。屬於相同CDR3組(相同B細胞譜系)之奈米抗體非常相似，且其胺基酸序列表明其來自由體細胞過度突變產生之選殖相關B細胞，或來自相同B細胞但由於庫構築期間之RT及/或PCR誤差而多樣化。屬於相同CDR3組之奈米抗體識別相同抗原決定基，但其其他特徵(例如親和力、效力、穩定性、表現產率等)可能不同。亦藉由ELISA測試人類IL13Rα2特異性奈米抗體與His標籤化人類IL13Rα1(Acro Biosystems，目錄號IL1-H5224)之結合。此等ELISA實驗顯示IL13Rα2特異性奈米抗體無一結合人類IL13Rα1。來自此等淘選之純系在其名稱中帶有以下代碼：TIG。
hIL13Rα2特異性奈米抗體之流式細胞術分析 奈米抗體及細胞
用與以上所描述之初步ELISA篩檢相同的方式針對各抗hIL13Rα2 Nb產生周質提取物。將來自各細胞株之細胞(U251_Luc_Mch及A431_Luc)解凍，洗滌並計數。將來自各Nb純系之周質提取物與約2×105個細胞一起培育。洗滌之後，將細胞與小鼠抗HA標籤抗體與抗小鼠-PE之混合物一起培育。在另一洗滌之後，將Topro作為活/死染色劑添加至各樣品中且在流式細胞儀上分析細胞。作為陽性對照Mab，使用PE偶聯抗IL13Rα2純系47(+Topro)。各細胞株之陰性對照為：含無關Nb之樣品(BCII10-細菌β內醯胺酶特異性)、含所有偵測Mab之樣品、僅含二級抗小鼠-PE Mab之樣品及僅含細胞之樣品(有及無Topro)。
抗體人類化
選擇兩個純系用於人類化。圖1顯示純系1及純系2之序列比對，包含各自之親本(非人類化)序列及十個人類化變異體。利用抗原(IL13Rα2-Fc)之125nM、41.66nM及13.86nM之三倍稀釋液，藉由Octet在Ni-NTA感測器上在500nM下分析各人類化奈米抗體。實驗程序之圖示於圖2中。圖1中所描繪之各人類化變異體之八重量測之彙總示於表1(純系1)及表2(純系2)中。
Figure 108126642-A0202-12-0121-30
Figure 108126642-A0202-12-0122-31
Figure 108126642-A0202-12-0122-32
選擇各純系之兩個人類化序列用於進一步研究，且其分別對應於SEQ ID NO：19-28及35-43。
實例4：抗IL13Rα2奈米抗體之活體外活性
將實例3中所描述之人類化sdAb表現於pLRPO主鏈上且併入至CD3ε TFP中。在表現IL-13之細胞株(U87)及IL13Rα2陰性細胞株(A431)上測試相應IL13Rα2-TFP T細胞活性。純系1及純系2 TFP T細胞二者均誘導U87細胞中之腫瘤細胞溶解，但在A431細胞中則不然(圖3A)。
測試相同TFP T細胞誘導IFNγ及IL-2產生之能力。如圖3B中所示，TFP T細胞不誘導IL13Rα2陰性細胞(A431)之IFNγ或IL-2，但純系1及純系2 TFP T細胞引起大於3000pg/ml之IFNγ反應及約100pg/ml之低IL-2產生。當在U251神經膠質母細胞瘤細胞中重複時可見類似結果。
實例5：產生並鑑定人類MUC16肽：NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP(SEQ ID NO：96)特異性奈米抗體 材料及方法 VHH之轉型、再選殖及表現 用重組pMECS GG對非抑制性菌株(例如WK6)進行轉型
在pMECS GG載體中選殖之奈米抗體基因含有處於N末端之PelB信號序列以及處於C末端之HA標籤及His6標籤(SEQ ID NO：124)(PelB前導序列-奈米抗體-HA-His6(SEQ ID NO：124))。PelB前導序列將奈米抗體引導至大腸桿菌之周質間隙，且HA標籤及His6標籤可用於純化及偵測奈米抗體(例如，在ELISA、西方墨點法等中)。
在pMECS GG載體中，His6標籤(SEQ ID NO：124)之後為琥珀終止密碼子(TAG)，且此琥珀終止密碼子之後為M13噬菌體之基因III。在抑制性大腸桿菌菌株(例如TG1)中，琥珀終止密碼子讀作麩醯胺酸，且因此奈米抗體表現為具有噬菌體之蛋白III之融合蛋白，從而允許奈米抗體展示在噬菌體外殼上以供淘選。在非抑制性大腸桿菌菌株(例如WK6)中，琥珀終止密碼子讀作終止密碼子，且因此所得奈米抗體未與蛋白III融合。
為了表現及純化在pMECS GG載體中選殖之奈米抗體，僅製備含有相關奈米抗體之基因的pMECS GG並且用此質體對非抑制性菌株(例如WK6)進行轉型。使用MP057引子(5'-TTATGCTTCCGGCTCGTATG-3'(SEQ ID NO：101))對所得純系之奈米抗體進行定序，以驗證純系之一致性。藉由ELISA或任何其他適當分析再測試抗原結合能力。現可使用含有具有奈米抗體基因之重組pMECS GG載體的非抑制性菌株(例如WK6)來表現及純化奈米抗體。
將奈米抗體基因自pMECS GG再選殖至pHEN6c載體 引子序列：
-引子A6E(5’GAT GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGR GGA GG 3’(SEQ ID NO： 102))。
-引子PMCF(5’CTA GTG CGG CCG CTG AGG AGA CGG TGA CCT GGG T 3’(SEQ ID NO：103))。
-通用反向引子(5’TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C 3’(SEQ ID NO：104))。
-通用正向引子(5 CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3’(SEQ ID NO：105))。
藉由PCR，使用含有攜帶奈米抗體基因(作為模板)以及引子A6E及PMCF之重組pMECS GG的大腸桿菌來擴增奈米抗體基因(約30個PCR週期，各週期由在94℃下30秒、在55℃下30秒及在72℃下45秒組成，繼而在PCR結束時在72℃下延伸10分鐘)。擴增約400bp之片段。隨後對PCR產物進行純化(例如，藉由來自Qiagen之QiaqQuick PCR純化套組)且用PstI消化隔夜。
純化PCR產物且用BstEII(或用得自Fermentas之Eco91I)消化隔夜。如以上純化PCR產物且用PstI將pHEN6c載體消化3小時；如以上純化經消化之載體，隨後用BstEII消化2至3小時。在1%瓊脂糖凝膠上運作經消化之載體，自凝膠中切出載體條帶並加以純化(例如，藉由得自Qiagen之QiaQuick凝膠提取套組)。連接PCR產物及載體。用連接反應對電穿孔法勝任WK6細胞進行轉型。使用LB/瓊脂/安比西林(100μg/ml)/葡萄糖(1-2%)板選擇轉型體。
表現及純化奈米抗體：
使用新近轉型之WK6菌落接種10-20ml LB+安比西林(100μg/ml)+葡萄糖(1%)，且在37℃下在以200-250rpm振盪之情況下培育隔夜。將1ml此預培養物添加至330ml補充有100μg/ml安比西林、2mM MgCl2及0.1%葡萄糖之TB培養基中且在37℃下在振盪(200-250rpm)下生長直至OD600達到0.6-0.9。藉由添加IPTG達至最終濃度1mM來誘導奈米抗體表現，且在28℃下在振盪下 將培養物培育隔夜(約16-18小時；OD600在隔夜誘導之後理想地應在25與30之間)。
將培養物以8000rpm離心8分鐘並將得自1公升培養物之糰粒再懸浮於12ml TES中並且在冰上振盪1小時。每使用12ml TES，添加18ml TES/4且在冰上進一步培育一小時(在振盪下)，隨後在4℃下以8000rpm離心30分鐘。上清液含有自周質間隙提取之蛋白質。
藉由IMAC進行純化：
用PBS使His-select平衡：每來源於1公升培養物之周質提取物添加1ml樹脂(約2ml His-select溶液)至50ml falcon管，添加PBS達至最終容積50ml並且混合，隨後以2000rpm離心2分鐘並丟棄上清液。用PBS將樹脂洗滌兩次，隨後添加周質提取物且在室溫下在輕微振盪下培育30分鐘至1小時(更長之培育時間可能導致非特異性結合)。
將樣品負載至底部有過濾器之PD-10管柱(GE healthcare，目錄號17-0435-01)上且用50至100ml PBS(每使用1ml樹脂用50-100ml PBS)洗滌。進行3次溶析，每次每使用1ml樹脂用1ml PBS/0.5M咪唑，並且在4℃下針對PBS透析隔夜(截止值3500道爾頓(dalton))以移除咪唑。
此時可藉由對溶析之樣品進行OD280量測來評估蛋白質之量。可在Expasy蛋白質組學伺服器上藉由protParam工具在一級結構分析下測定各純系之消光係數。可藉由不同的方法達成奈米抗體之進一步純化。舉例而言，可藉由在4℃下以2000rpm離心來濃縮(Vivaspin 5000MW截止值，Vivascience)樣品，直至獲得適於負載於Superdex 75 16/60上之體積(最多4ml)。隨後將濃縮之樣品負載至經PBS平衡之Superdex 75 16/60管柱上。彙集峰溶析份且在OD280下量測樣品以進行定量。將等分試樣以約1mg/ml之濃度儲存在-20℃下。
免疫
在第0天、第7天、第14天、第21天、第28天及第35天對美洲駝經皮下注射與KLH結合之人類MUC16肽(hMUC16)(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP-C-KLH(SEQ ID NO：125))及/或在C末端生物素化之人類MUC16肽(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP-C-生物素(SEQ ID NO：126))及/或在N末端生物素化之人類MUC16肽(生物素-NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP(SEQ ID NO：127)。在注射之前將生物素化肽與中性親和素混合。所使用之佐劑為GERBU佐劑P(GERBU Biotechnik GmbH)。在第40天，自美洲駝收集約100ml抗凝血以用於淋巴球製備。
構築VHH庫
由美洲駝淋巴球構築VHH庫以篩檢抗原特異性奈米抗體之存在。為此目的，使用來自外周血淋巴球之總RNA作為模板以便用寡(dT)引子進行第一鏈cDNA合成。使用此cDNA，藉由PCR擴增VHH編碼序列，用SAPI消化並選殖至噬菌體質體載體pMECS-GG之SAPI位點中。由此獲得之VHH庫稱為Core 93GG。該庫由約108個獨立的轉型體組成，其中約87%轉型體攜帶具有適當插入物大小之載體。
分離人類MUC16肽特異性奈米抗體
在C末端或N末端生物素化之hMUC16肽NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP(SEQ ID NO：965)(bio-hMUC16)上將Core 93GG庫淘選4輪。允許bio-hMUC16肽與經鏈黴親和素塗覆之板相互作用，此後將來自庫之噬菌體添加至該板。在每一輪淘選之 後藉由比較自經抗原塗覆之孔溶析之噬菌體質體粒子數目與自陰性對照孔(經鏈黴親和素塗覆且經阻斷但不含肽)溶析之噬菌體質體粒子數目來評定抗原特異性噬菌體之增濃。此等實驗表明，在第2輪之後，噬菌體群體就抗原特異性噬菌體而言增濃約2倍。在第1輪、第3輪及第4輪之後未觀測到增濃。總計隨機選擇380個菌落(190個來自第3輪、190個來自第4輪)且藉由ELISA分析其周質提取物中抗原特異性奈米抗體之存在(ELISA使用包括可溶性奈米抗體之粗周質提取物)。用於ELISA篩檢之肽與用於淘選之肽相同，使用不含肽之經阻斷經鏈黴親和素塗覆之孔作為陰性對照。在此分析中，此380個菌落中有34個菌落評分為陽性。基於陽性菌落之序列資料，辨別6種不同的全長奈米抗體，屬於2個不同的CDR3組(B細胞譜系)(參見Excel檔案)。屬於相同CDR3組(相同B細胞譜系)之奈米抗體非常相似，且其胺基酸序列表明其來自由體細胞過度突變產生之選殖相關B細胞，或來自相同B細胞但由於庫構築期間之RT及/或PCR誤差而多樣化。屬於相同CDR3組之奈米抗體識別相同抗原決定基，但其其他特徵(例如親和力、效力、穩定性、表現產率等)可能不同。來自此等淘選之純系在其名稱中帶有以下代碼：MU。
hMUC16肽特異性奈米抗體之流式細胞術分析 奈米抗體及細胞
用與以上所描述之初步ELISA篩檢相同的方式針對各抗hMUC16肽Nb產生周質提取物。將來自各細胞株之細胞(SKOV3 Muc16 Luc、OVCAR 3 Muc16 Luc、Expi-293及Jurkat)解凍，洗滌並計數。將來自各Nb純系之周質提取物與約2×105個細胞一起培育。洗滌之後，將細胞與小鼠抗HA標籤抗體與抗小鼠-PE之混合物一起培育。在另一洗滌之後，將Topro作為活/死染色劑添加至各樣品中且在流式細胞儀上分析細胞。作為陽性對照Mab，將人類抗Muc16-4h11 (+抗人類IgG-PE+Topro)用於SKOV3 Muc16 Luc及OVCAR 3 Muc16 Luc細胞。作為陰性對照，吾等針對各細胞株使用：含無關Nb之樣品(BCII10-細菌β內醯胺酶特異性)、含所有偵測Mab之樣品、僅含二級抗小鼠-PE Mab之樣品及僅含細胞之樣品(有及無Topro)。
實例6：篩檢針對hMUC16標靶之抗MUC16 sdAb
使用NTA生物感測器(鎳管柱；關於概述該方法之圖，參見圖5A)篩檢實例5中產生之VHH結合物。His標籤化MUC16 sdAb(3.25μg/ml)與管柱結合，隨後使MUC16肽以200、100、50、25、6.25、1.56及0nM之濃度通過管柱。緩衝液：含0.02% Tween® 20之1×Corning® Cellgro® PBS pH 7.4(目錄號21-040-CM)，30℃。感測器：Pall Forte Bio Dip & Read(目錄號18-5102)。
兩個純系R3Mu4(圖1C)及R3Mu29(圖1D)美洲駝及人類化sdAb與MUC16標靶之飽和結合顯示親本及人類化αMuc16 sdAb變異體對MUC16胞外域(「MUC16ecto」)肽展現高親和力結合，與KD值在6-94nM範圍內相關。人類化變異體與其各別親本美洲駝純系相比顯示一定的親和力損失。彙總提供於表3中。
Figure 108126642-A0202-12-0128-263
實例7：抗MUC16結合物相較於4H11工具結合物之抗原決定基分區
為了確定MUC16親本R3Mu4及親本R3Mu29 sdAb與4H11 scFv-Fc 工具結合物(來自4H11雜交瘤)相比係結合至相同抑或不同的抗原決定基，使用夾心分析(參見圖6A)。
如圖6B中所示，MUC 16 sdAb-親本(美洲駝)R3Mu4及親本(美洲駝)R3Mu29在4H11工具結合物暴露後顯示結合，證明親本sdAb與4H11 scFv-Fc工具結合物相比識別並分區至不同的MUC16肽抗原決定基。無抗原(MUC16肽)陰性對照顯示無結合，從而排除任何非特異性結合之機會。顯示親本美洲駝抗體R3Mu4及R3Mu29之結合抗原決定基的圖示於圖6C中。
實例8：用表現MUC16-TFP之T細胞進行臨床前研究
在臨床前活體外研究中評估表現MUC16-TFP之T細胞(圖7)。表現MUC16-TFP之T細胞特異性殺死經轉導以便以劑量依賴性方式過度表現C末端細胞締合MUC16形式之SKOV3-MUC16Cterm卵巢癌細胞，而親本SKOV3 MUC16陰性細胞倖免於表現MUC16-TFP之T細胞介導之殺死。同樣，表現MUC16-TFP之T細胞消除過度表現細胞締合MUC16形式之OVCAR3-MUC16-Cterm細胞。表現低水準MUC16之親本OVCAR3細胞僅在最高TFP-T細胞與靶細胞比率下被殺死，此強調腫瘤細胞之劑量依賴性溶解。同樣，TFP-T細胞在靶細胞上存在MUC16時僅釋放細胞介素。圖8描繪顯示MUC16-TFP在使用表現高水準及低水準MUC16之卵巢細胞株的細胞分析中的效力的實例實驗資料。在此等研究中，觀測到MUC16-TFP具有優先殺死能力，視腫瘤細胞表面上之MUC16水準而定。更確切言之，觀測到MUC16-TFP以劑量依賴性方式殺死表現高MUC16之腫瘤細胞，而在此等分析中所使用之劑量水準下未觀測到表現低MUC16之細胞的MUC16-TFP殺死。
實例9. 基於MUC16 ecto 拷貝數定量之流式細胞術
根據美國專利第9,169,328號產生C末端細胞締合MUC16形式 (MUC16ecto)特異性抗體4H11，隨後與PE結合。估計每個抗體之PE分子平均數目為約1。將卵巢癌細胞株OVCAR3及SKOV3，或穩定過度表現MUC16ecto之衍生物(OVCAR3-MUC16ecto及SKOV3-MUC16ecto細胞)用4H11-PE Ab以2μg/樣品進行染色。藉由Quantibrite Beads PE螢光定量套組(BD Bioscience)根據製造商之說明書估計細胞表面MUC16ecto之拷貝數。將經4H11-PE抗體染色之腫瘤細胞與Quantibrite珠粒一起在Fortessa® X-20上運作。計算細胞以及珠粒之幾何中值螢光強度(gMFI)。珠粒儲備含有4個群體，該等群體製造為每個珠粒具有不同數目之PE分子(高、中、低、陰性)。基於每個珠粒之指定PE分子拷貝相對於各組珠粒之量測MFI來產生標準曲線。隨後基於珠粒產生之標準曲線來估計腫瘤細胞上MUC16ecto之拷貝數。OVCAR3、OVCAR3-MUC16ecto、SKOV3及SKOV3-MUC16ecto細胞上之MUC16ecto拷貝分別測定為726、3616、39及2351(圖9B)。
實例10. MUC16-TFP T細胞之MUC16 ecto 特異性腫瘤細胞溶解
藉由活體外細胞毒性分析評估MUC16-TFP T細胞之MUC16ecto特異性腫瘤細胞溶解。對有或無MUC16ecto表現之腫瘤細胞株進行穩定轉導以表現作為報告因子之螢火蟲螢光素酶。在24小時共培養之後，用Bright-GloTM螢光素酶分析系統(Promega，目錄號E2610)測定共培養之細胞的螢光素酶活性，作為殘餘活腫瘤細胞之替代指標。隨後用下公式計算腫瘤細胞殺死百分比：腫瘤細胞溶解%=100%×[1-RLU(腫瘤細胞+T細胞)/RLU(腫瘤細胞)]。
表現MUC16-TFP之T細胞特異性殺死SKOV3-MUC16ecto細胞(圖10A)，而親本SKOV3細胞倖免於表現MUC16-TFP之T細胞介導之殺死(圖10B)。同樣，表現MUC16-TFP之T細胞消除過度表現細胞締合MUC16形式之OVCAR3-MUC16ecto細胞(圖10C)。僅部分殺死表現低水準MUC16ecto之親本 OVCAR3細胞(圖10D)。
實例11. MUC16-TFP T細胞之MUC16 ecto 特異性細胞介素產生
針對自有或無MUC16ecto表現之各種腫瘤細胞與MUC16-TFP T細胞之共培養物收集之上清液測定MUC16-TFP T細胞之MUC16ecto特異性細胞介素產生。使用MAGPIX Luminex® xMAP技術(EMD Millipore)，以2重套組(Millipore，目錄號HCYTOMAG-60K)分析上清液中之人類IFN-γ及IL-2水準。
表現MUC16-TFP之T細胞以抗原特異性方式分泌促炎性細胞介素。表現MUC16-TFP之T細胞當與SKOV3-MUC16ecto細胞(分別為圖11A及圖11E)或OVCAR3-MUC16ecto細胞(分別為圖11C及圖11G)共培養時分泌IFN-γ及IL-2，但與SKOV3細胞(分別為圖11B及圖11F)或OVCAR3細胞(分別為圖11D及圖11H)共培養時則不然。
實例12. 表現MUC16-TFP之T細胞之MUC16 ecto 特異性增殖
藉由以流式細胞術分析監測T細胞追蹤信號之稀釋(CellTraceTM之信號強度降低)來確定MUC16-TFP T細胞之MUC16ecto特異性增殖。用CellTraceTM遠紅光增殖套組(目錄號C34564ThermoFisher)標記表現MUC16-TFP之T細胞，隨後與SKOV3或SKOV3-MUC16ecto細胞以1：1比率共培養3天。亦用單獨培養基或用1μg/mL板結合抗CD3抗體(純系OKT-3，目錄號14-0037-82，Invitrogen)將經CellTrace遠紅光增殖套組標記之表現MUC16-TFP之T細胞刺激3天。表現MUC16-TFP之T細胞顯示MUC16ecto特異性增殖，藉由當與SKOV3-MUC16ecto細胞共培養時存在CellTracer信號減少但與SKOV3細胞共培養時則不然來證明(圖12)。
實例13. MUC16-TFP T細胞之活體內活性
在人類卵巢癌細胞株SKOV3-MUC16ecto細胞及OVCAR3-MUC16ecto 細胞之NSG小鼠異種移植模型中評估表現MUC16-TFP之T細胞。將6週齡雌性NSG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtmlWjl/SzJ，The Jackson Laboratory，物料編號005557)小鼠經腹膜內接種SKOV3-MUC16ecto細胞(5×105個細胞/小鼠)或OVCAR3-MUC16ecto細胞(5×106個細胞/小鼠)或經皮下接種SKOV3-MUC16ecto細胞(5×106個細胞/小鼠，與Matrigel®之1：1混合物)。藉由經腹膜內注射0.2ml稀釋於PBS中之螢光素受質(VWR)(150mg/kg)之腹膜內模型之生物發光成像(BLI)來測定腫瘤負荷。藉由卡尺將皮下模型之腫瘤負荷量測為腫瘤體積。一旦建立腫瘤模型(腹膜內模型：BLI信號>108；皮下模型：腫瘤體積>75mm3)，便以107個T細胞/小鼠之劑量經靜脈內注射表現MUC16-TFP(MUC16 TFP1及MUC16 TFP2)之T細胞或未轉導T細胞(NT)或媒劑(PBS)。
在SKOV3-MUC16ecto細胞及OVCAR3-MUC16ecto細胞之腹膜內及皮下模型中觀測表現MUC16 TFP之T細胞之活體內效力。在SKOV3-MUC16ecto細胞之腹膜內模型中，MUC16 TFP1顯示腫瘤負荷與第0天(T細胞注射當天)之基線水準相比顯著減少(圖13A)。一致地，在SKOV3-MUC16ecto細胞之皮下模型中，MUC16 TFP1當與NT T細胞相比時顯著延遲腫瘤生長(圖13B)。在OVCAR3-MUC16ecto細胞之腹膜內模型中，MUC16 TFP1及MUC16 TFP2均完全清除了小鼠中之腫瘤(圖13C)。
實例14：使用抗MUC16單結構域抗體Fe融合蛋白對正常人類組織進行免疫組織化學染色
研究目標為獲得關於正常人類組織之MUC16表現之資訊。
用遺傳融合至小鼠Fc區以便使用HRP結合抗小鼠Fc二級抗體進行偵測之抗MUC16單結構域抗體將對照材料及FFPE切片染色。陽性對照由來自兩個供體之人類卵巢腫瘤之FFPE切片組成。陰性對照為人類心臟FFPE切片。 測試組織小組包括以下：血細胞、小腦或大腦皮層、胃腸道(食道、小腸、胃、結腸-可利用時)、脾臟、腎臟(腎小球、腎小管)、肝臟、淋巴結、皮膚、胎盤、睪丸及扁桃體，各自來自一個供體。
結果：來自不同供體之兩個人類卵巢癌組織用作陽性對照且顯示以不同的強度染色，就贅生性細胞膜及細胞質而言在1-3+(偶爾至頻繁)及1-4+(偶爾至頻繁)之範圍內。正常組織均顯示MUC16陰性染色，但兩個除外：1)人類胃上皮、胃壁(細胞質、細胞質顆粒)-1-2+(偶爾至頻繁)，及2)人類扁桃體上皮表面、隱窩(膜、細胞質及其他元件)-1-3+(稀少至偶爾)。
此等資料顯示MUC16在正常人類組織中具有有限表現且在某些腫瘤中具有升高表現。此使MUC16成為MUC16陽性惡性病之癌症療法之有吸引力標靶。MUC16特異性單結構域抗體能夠結合並染色抗原陽性組織。
實例15：臨床研究
將徵募患有復發性或難治性疾病之不可切除卵巢癌患者進行表現MUC16 TFP之T細胞之臨床研究。初步研究將探索表現MUC16 TFP之T細胞之安全性概況並且將探索細胞動力學及藥效學結果。此等結果將為進一步研究之劑量選擇提供資訊，隨後將該等劑量投與較大佇列之不可切除卵巢癌患者以確定表現MUC16 TFP之T細胞之效力概況。
實例16：抗MSLN TFP T細胞優先殺死具有高MSLN表現之腫瘤細胞。
在攜帶MSTO-MSLN高或MSTO-MSLN低腫瘤之NSG小鼠中追溯到MSLN-TFP T細胞對高MSLN腫瘤(MSTO-MSLN高，表面MSLN之11006個拷貝)及低MSLN腫瘤(MSTO-MSLN低，表面MSLN之198個拷貝)之差異性殺死能力。
將MSTO-MSLN高及MSTO-MSLN低細胞以1×106個細胞/100μL之 濃度再懸浮於無菌PBS(pH 7.4)中。隨後將PBS細胞懸浮液與冰冷Matrigel® 1：1混合，每隻小鼠之最終注射體積為200μL。針對所有動物，將處於無菌PBS/Matrigel®中之200μL腫瘤細胞懸浮液藉由皮下投與注射在背側後脇底部。藉由腫瘤體積監測腫瘤生長，每週藉由卡尺量測兩次。一旦建立腫瘤模型(腫瘤注射之後14天)，在平均腫瘤體積達到約300mm3之情況下，對攜帶腫瘤之小鼠經靜脈內注射未轉導T細胞(NT，1×107個總T細胞)或MSLN-TFP T細胞(1×107個總T細胞)。
與經NT T細胞治療之小鼠相比，MSLN-TFP T細胞顯著控制高MSLN腫瘤之生長(圖14A)。另一方面，在經MSLN-TFP T細胞治療之具有氏MSLN腫瘤之小鼠中觀測到有限的抗腫瘤反應(圖14B)。儘管在一隻動物中觀測到腫瘤消退，但其他9隻經MSLN-TFP T細胞治療之小鼠顯示相對於接受NT T細胞之動物更慢(n=2)或類似(n=6)之腫瘤進展速率(圖14B)。
附注
儘管本文中已顯示並描述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者將顯而易知該等實施例僅以實例方式提供。熟習此項技術者現在將在不背離本發明之情況下想到眾多變更、變化及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例之各種替代方案可用於實踐本發明。意欲以下申請專利範圍定義本發明之範疇且從而涵蓋在此等申請專利範圍之範疇內的方法及結構及其等效形式。
Figure 108126642-A0202-12-0134-264
Figure 108126642-A0202-12-0135-265
Figure 108126642-A0202-12-0136-266
Figure 108126642-A0202-12-0137-267
Figure 108126642-A0202-12-0138-268
Figure 108126642-A0202-12-0139-269
Figure 108126642-A0202-12-0140-270
Figure 108126642-A0202-12-0141-271
<110> 美商TCR2療法股份有限公司(TCR2 THERAPEUTICS INC.)
<120> 使用靶特異性融合蛋白進行TCR再程式化之組合物及方法
<140> 108126642
<141> 2019-07-26
<150> 62/727,469
<151> 2018-09-05
<150> 62/727,459
<151> 2018-09-05
<150> 62/725,066
<151> 2018-08-30
<150> 62/703,824
<151> 2018-07-26
<150> 62/703,834
<151> 2018-07-26
<160> 143
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 1
Figure 108126642-A0202-12-0142-272
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 2
Figure 108126642-A0202-12-0142-273
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 3
Figure 108126642-A0202-12-0142-274
Figure 108126642-A0202-12-0143-275
<210> 4
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Figure 108126642-A0202-12-0143-276
<210> 5
<211> 182
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Figure 108126642-A0202-12-0144-277
<210> 6
<211> 172
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Figure 108126642-A0202-12-0144-278
Figure 108126642-A0202-12-0145-279
<210> 7
<211> 164
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Figure 108126642-A0202-12-0145-280
Figure 108126642-A0202-12-0146-281
<210> 8
<211> 281
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Figure 108126642-A0202-12-0146-282
Figure 108126642-A0202-12-0147-283
<210> 9
<211> 142
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Figure 108126642-A0202-12-0147-284
<210> 10
<211> 139
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Figure 108126642-A0202-12-0147-285
Figure 108126642-A0202-12-0148-286
<210> 11
<211> 177
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Figure 108126642-A0202-12-0148-287
Figure 108126642-A0202-12-0149-288
<210> 12
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Figure 108126642-A0202-12-0149-290
<210> 13
<211> 135
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Figure 108126642-A0202-12-0149-289
Figure 108126642-A0202-12-0150-291
<210> 14
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 14
Figure 108126642-A0202-12-0150-292
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 15
Figure 108126642-A0202-12-0150-293
Figure 108126642-A0202-12-0151-295
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 16
Figure 108126642-A0202-12-0151-483
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 17
Figure 108126642-A0202-12-0151-297
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 18
Figure 108126642-A0202-12-0151-298
<210> 19
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 19
Figure 108126642-A0202-12-0151-294
Figure 108126642-A0202-12-0152-299
<210> 20
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 20
Figure 108126642-A0202-12-0152-300
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 21
Figure 108126642-A0202-12-0152-302
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 22
Figure 108126642-A0202-12-0152-301
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 23
Figure 108126642-A0202-12-0153-304
<210> 24
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 24
Figure 108126642-A0202-12-0153-305
<210> 25
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 25
Figure 108126642-A0202-12-0153-303
Figure 108126642-A0202-12-0154-306
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 26
Figure 108126642-A0202-12-0154-307
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 27
Figure 108126642-A0202-12-0154-308
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 28
Figure 108126642-A0202-12-0154-309
<210> 29
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 29
Figure 108126642-A0202-12-0154-310
<210> 30
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 30
Figure 108126642-A0202-12-0155-311
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 31
Figure 108126642-A0202-12-0155-485
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 32
Figure 108126642-A0202-12-0155-313
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 33
Figure 108126642-A0202-12-0156-314
<210> 34
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 34
Figure 108126642-A0202-12-0156-315
<210> 35
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 35
Figure 108126642-A0202-12-0156-316
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 36
Figure 108126642-A0202-12-0157-317
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 37
Figure 108126642-A0202-12-0157-318
<210> 38
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 38
Figure 108126642-A0202-12-0157-319
<210> 39
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 39
Figure 108126642-A0202-12-0157-320
<210> 40
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 40
Figure 108126642-A0202-12-0157-321
Figure 108126642-A0202-12-0158-322
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 41
Figure 108126642-A0202-12-0158-323
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 42
Figure 108126642-A0202-12-0158-324
<210> 43
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 43
Figure 108126642-A0202-12-0158-325
<210> 44
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 44
Figure 108126642-A0202-12-0159-326
<210> 45
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 45
Figure 108126642-A0202-12-0159-327
Figure 108126642-A0202-12-0160-328
<210> 46
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 46
Figure 108126642-A0202-12-0160-329
<210> 47
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 47
Figure 108126642-A0202-12-0160-330
Figure 108126642-A0202-12-0161-331
<210> 48
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 48
Figure 108126642-A0202-12-0161-332
<210> 49
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 49
Figure 108126642-A0202-12-0161-333
Figure 108126642-A0202-12-0162-334
<210> 50
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 50
Figure 108126642-A0202-12-0162-335
<210> 51
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 51
Figure 108126642-A0202-12-0162-336
Figure 108126642-A0202-12-0163-337
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 52
Figure 108126642-A0202-12-0163-338
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 53
Figure 108126642-A0202-12-0163-339
<210> 54
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 54
Figure 108126642-A0202-12-0163-340
<210> 55
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 55
Figure 108126642-A0202-12-0164-341
<210> 56
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 56
Figure 108126642-A0202-12-0164-342
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 57
Figure 108126642-A0202-12-0164-343
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 58
Figure 108126642-A0202-12-0165-486
<210> 59
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 59
Figure 108126642-A0202-12-0165-345
<210> 60
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 60
Figure 108126642-A0202-12-0165-346
<210> 61
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 61
Figure 108126642-A0202-12-0165-347
Figure 108126642-A0202-12-0166-348
<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 62
Figure 108126642-A0202-12-0166-349
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 63
Figure 108126642-A0202-12-0166-350
<210> 64
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 64
Figure 108126642-A0202-12-0166-351
<210> 65
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 65
Figure 108126642-A0202-12-0167-352
<210> 66
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 66
Figure 108126642-A0202-12-0167-353
<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 67
Figure 108126642-A0202-12-0168-354
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 68
Figure 108126642-A0202-12-0168-355
<210> 69
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 69
Figure 108126642-A0202-12-0168-356
<210> 70
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 70
Figure 108126642-A0202-12-0168-357
<210> 71
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 71
Figure 108126642-A0202-12-0168-358
Figure 108126642-A0202-12-0169-359
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 72
Figure 108126642-A0202-12-0169-360
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 73
Figure 108126642-A0202-12-0169-361
<210> 74
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 74
Figure 108126642-A0202-12-0169-362
<210> 75
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 75
Figure 108126642-A0202-12-0170-363
<210> 76
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 76
Figure 108126642-A0202-12-0170-487
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 77
Figure 108126642-A0202-12-0171-365
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 78
Figure 108126642-A0202-12-0171-366
<210> 79
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 79
Figure 108126642-A0202-12-0171-367
<210> 80
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 80
Figure 108126642-A0202-12-0171-368
Figure 108126642-A0202-12-0172-369
<210> 81
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 81
Figure 108126642-A0202-12-0172-370
<210> 82
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 82
Figure 108126642-A0202-12-0172-371
Figure 108126642-A0202-12-0173-372
<210> 83
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 83
Figure 108126642-A0202-12-0173-373
<210> 84
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 84
Figure 108126642-A0202-12-0173-374
Figure 108126642-A0202-12-0174-375
<210> 85
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 85
Figure 108126642-A0202-12-0174-376
<210> 86
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 人工序列描述：合成多肽
<220>
<400> 86
Figure 108126642-A0202-12-0175-377
<210> 87
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 87
Figure 108126642-A0202-12-0175-378
Figure 108126642-A0202-12-0176-379
<210> 88
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多狀
<400> 88
Figure 108126642-A0202-12-0176-380
<210> 89
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 89
Figure 108126642-A0202-12-0176-381
Figure 108126642-A0202-12-0177-382
<210> 90
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 90
Figure 108126642-A0202-12-0177-383
<210> 91
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 91
Figure 108126642-A0202-12-0178-384
<210> 92
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 92
Figure 108126642-A0202-12-0178-385
<210> 93
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 93
Figure 108126642-A0202-12-0179-386
<210> 94
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 94
Figure 108126642-A0202-12-0179-387
Figure 108126642-A0202-12-0180-388
<210> 95
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 95
Figure 108126642-A0202-12-0180-389
<210> 96
<211> 58
<212> PRT
<213> 智人
<400> 96
Figure 108126642-A0202-12-0180-390
Figure 108126642-A0202-12-0181-391
<210> 97
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 97
Figure 108126642-A0202-12-0181-392
<210> 98
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 98
Figure 108126642-A0202-12-0181-393
Figure 108126642-A0202-12-0182-394
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 99
Figure 108126642-A0202-12-0182-395
<210> 100
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<400> 100
Figure 108126642-A0202-12-0182-398
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<400> 101
Figure 108126642-A0202-12-0182-396
<210> 102
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<400> 102
Figure 108126642-A0202-12-0182-397
<210> 103
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<400> 103
Figure 108126642-A0202-12-0183-399
<210> 104
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<400> 104
Figure 108126642-A0202-12-0183-400
<210> 105
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<400> 105
Figure 108126642-A0202-12-0183-401
<210> 106
<211> 280
<212> PRT
<213> 智人
<400> 106
Figure 108126642-A0202-12-0183-402
Figure 108126642-A0202-12-0184-403
<210> 107
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(20)
<223> 此序列可包含1-4組"Gly Gly Gly Gly Ser"之重複單元
<400> 107
Figure 108126642-A0202-12-0184-404
<210> 108
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(20)
<223> 此序列可包含2-4組"Gly Gly Gly Gly Ser"之重複單元
<400> 108
Figure 108126642-A0202-12-0185-405
<210> 109
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> 此序列可包含1-3組"Gly Gly Gly Gly Ser"之重複單元
<400> 109
Figure 108126642-A0202-12-0185-406
<210> 110
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<220>
<223> 取代及較佳態樣之描述請參申請時說明書
<400> 110
Figure 108126642-A0202-12-0185-488
<210> 111
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 111
Figure 108126642-A0202-12-0185-407
<210> 112
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 112
Figure 108126642-A0202-12-0186-409
<210> 113
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 113
Figure 108126642-A0202-12-0186-410
<210> 114
<211> 5000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 此序列可包含50-5000個核苷酸
<222> (1)..(5000)
<220>
<223> 取代及較佳態樣之描述請參申請時說明書
<400> 114
Figure 108126642-A0202-12-0186-408
Figure 108126642-A0202-12-0187-411
Figure 108126642-A0202-12-0188-412
<210> 115
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 此序列可包含1-6組"Gly Gly Gly Gly Ser"之重複單元
<222> (1)..(30)
<220>
<223> 取代及較佳態樣之描述請參申請時說明書
<400> 115
Figure 108126642-A0202-12-0189-414
<210> 116
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<220>
<223> 取代及較佳態樣之描述請參申請時說明書
<400> 116
Figure 108126642-A0202-12-0189-415
<210> 117
<211> 2000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2000)
<223> 此序列可包含50-2000個核苷酸
<400> 117
Figure 108126642-A0202-12-0189-413
Figure 108126642-A0202-12-0190-416
<210> 118
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 118
Figure 108126642-A0202-12-0190-417
<210> 119
<211> 5000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5000)
<223> 此序列可包含50-5000個核苷酸
<400> 119
Figure 108126642-A0202-12-0191-418
Figure 108126642-A0202-12-0192-419
Figure 108126642-A0202-12-0193-420
<210> 120
<211> 5000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5000)
<223> 此序列可包含100-5000個核苷酸
<400> 120
Figure 108126642-A0202-12-0193-421
Figure 108126642-A0202-12-0194-422
Figure 108126642-A0202-12-0195-423
Figure 108126642-A0202-12-0196-424
<210> 121
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 此序列可包含100-400個核苷酸
<222> (1)..(400)
<220>
<223> 取代及較佳態樣之描述請參申請時說明書
<400> 121
Figure 108126642-A0202-12-0196-425
<210> 122
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 122
Figure 108126642-A0202-12-0196-426
<210> 123
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 123
Figure 108126642-A0202-12-0196-427
<210> 124
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成6xHis標籤
<400> 124
Figure 108126642-A0202-12-0197-428
<210> 125
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 125
Figure 108126642-A0202-12-0197-429
<210> 126
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 126
Figure 108126642-A0202-12-0197-430
<210> 127
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 127
Figure 108126642-A0202-12-0197-431
Figure 108126642-A0202-12-0198-432
<210> 128
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 128
Figure 108126642-A0202-12-0198-433
<210> 129
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 129
Figure 108126642-A0202-12-0198-434
Figure 108126642-A0202-12-0199-435
<210> 130
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 130
Figure 108126642-A0202-12-0199-436
<210> 131
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 131
Figure 108126642-A0202-12-0200-437
<210> 132
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 132
Figure 108126642-A0202-12-0200-438
<210> 133
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 133
Figure 108126642-A0202-12-0201-439
<210> 134
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 134
Figure 108126642-A0202-12-0201-440
Figure 108126642-A0202-12-0202-441
<210> 135
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 135
Figure 108126642-A0202-12-0202-442
<210> 136
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 136
Figure 108126642-A0202-12-0202-443
Figure 108126642-A0202-12-0203-444
<210> 137
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 137
Figure 108126642-A0202-12-0203-445
<210> 138
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 138
Figure 108126642-A0202-12-0204-446
<210> 139
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 139
Figure 108126642-A0202-12-0204-447
Figure 108126642-A0202-12-0205-448
<210> 140
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 140
Figure 108126642-A0202-12-0205-449
<210> 141
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 141
Figure 108126642-A0202-12-0205-450
Figure 108126642-A0202-12-0206-451
<210> 142
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 142
Figure 108126642-A0202-12-0206-452
<210> 143
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 143
Figure 108126642-A0202-12-0206-453
Figure 108126642-A0202-12-0207-454

Claims (291)

  1. 一種醫藥組合物，其包含
    (I)來自人類個體之T細胞，其中該T細胞包含編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之重組核酸分子，該T細胞受體融合蛋白包含
    (a)TCR次單元，其包含
    (i)TCR細胞外結構域之至少一部分，
    (ii)TCR跨膜結構域，及
    (iii)TCR細胞內結構域，其包含來自TCR細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及
    (b)抗原結合結構域，其包含抗MUC16結合結構域；及
    (II)醫藥學上可接受之載劑；
    其中該TCR次單元及該抗MUC16結合結構域可操作地連接；
    其中該TFP當表現於該T細胞中時與TCR在功能上相互作用。
  2. 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中編碼該抗MUC16結合結構域之序列經由編碼連接子之序列連接至編碼該TCR細胞外結構域之序列。
  3. 如申請專利範圍第2項之醫藥組合物，其中該連接子包含(G4S)n，其中G為甘胺酸，S為絲胺酸，且n為整數1至4(SEQ ID NO：107)。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之醫藥組合物，其中該抗MUC16結合結構域包含
    (i)重鏈(HC)CDR1序列GRTVSSLF(SEQ ID NO：16)、GRAVSSLF(SEQ ID NO：21)或GDSLDGYV(SEQ ID NO：31)，
    (ii)HC CDR2序列ISRYSLYT(SEQ ID NO：17)或ISGDGSMR(SEQ ID NO：32)，及
    (iii)HC CDR3序列ASKLEYTSNDYDS(SEQ ID NO：18)或AADPPTWDY(SEQ ID NO：33)。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之醫藥組合物，其中該抗MUC16結合結構域包含與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：40具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列一致性之序列。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物實質上不含血清。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之醫藥組合物，其中該抗原結合結構域為scFv。
  8. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之醫藥組合物，其中該抗原結合結構域為單結構域抗體。
  9. 如申請專利範圍第8項之醫藥組合物，其中該單結構域抗體為VH結構域。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之醫藥組合物，其中該編碼抗MUC16結合結構域包含抗MUC16結合結構域，且其中該等T細胞之細胞毒性活性比包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核酸的CD8+或CD4+ T細胞更高或更高效，該嵌合抗原受體包含(a)該抗MUC16結合結構域，其可操作地連接至(b)CD28細胞外結構域之至少一部分，(c)CD28跨膜結構域，(d)CD28細胞內結構域之至少一部分，及(e)CD3ζ細胞內結構域。
  11. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之醫藥組合物，其中該編碼TFP分子當表現於該T細胞中時與內源TCR複合物、至少一種內源 TCR多肽或其組合在功能上相互作用。
  12. 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之醫藥組合物，其中該T細胞為初代T細胞。
  13. 如申請專利範圍第1項至第12項中任一項之醫藥組合物，其中該T細胞為人類CD4+ T細胞。
  14. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之醫藥組合物，其中該T細胞為人類CD8+ T細胞。
  15. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之醫藥組合物，其中該T細胞進一步包含編碼第一多肽之核酸，該第一多肽包含選自由PD-1及BTLA組成之群的抑制性分子之至少一部分，其中該抑制性分子之至少一部分與包含細胞內信號傳導結構域之正信號的第二多肽締合。
  16. 如申請專利範圍第15項之醫藥組合物，其中該第二多肽包含來自選自由以下組成之群的蛋白質的共刺激結構域及一級信號傳導結構域：CD28、CD27、ICOS、CD3ζ、41-BB、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160及B7-H3。
  17. 如申請專利範圍第1項至第16項中任一項之醫藥組合物，其中在表現與該抗MUC16結合結構域特異性相互作用之抗原的細胞存在下，由該T細胞產生之IL-2或IFNγ與不含該TFP之T細胞相比有所增加。
  18. 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之醫藥組合物，其中該細胞為人類CD8+或CD4+ T細胞群體，其中該群體之個別T細胞包含至少兩種TFP分子，或該群體之至少兩種T細胞共同包含至少兩種TFP分子；其中該至少兩種TFP分子包含抗MUC16結合結構域、TCR細胞外結構域、 跨膜結構域及細胞內結構域；且其中該至少兩種TFP分子中之至少一種與內源TCR複合物、至少一種內源TCR多肽或其組合在功能上相互作用。
  19. 如申請專利範圍第1項至第18項中任一項之醫藥組合物，其中該TCR次單元僅來源於CD3ε。
  20. 如申請專利範圍第1項至第18項中任一項之醫藥組合物，其中該TCR次單元僅來源於CD3γ。
  21. 如申請專利範圍第1項至第18項中任一項之醫藥組合物，其中該TCR次單元僅來源於CD3δ。
  22. 如申請專利範圍第1項至第18項中任一項之醫藥組合物，其中該TCR次單元之該TCR細胞外結構域、該TCR跨膜結構域及該TCR細胞內結構域來源於TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRγ鏈、TCRδ鏈、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
  23. 如申請專利範圍第1項至第18項中任一項之醫藥組合物，其中該TCR次單元之該TCR細胞外結構域、該TCR跨膜結構域及該TCR細胞內結構域來源於TCR複合物之單一次單元，其中該單一次單元為TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRγ鏈、TCRδ鏈、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
  24. 如申請專利範圍第1項至第23項中任一項之醫藥組合物，其中該T細胞與不含該TFP之T細胞相比對表現與該抗MUC16結合結構域特異性相互作用之抗原的細胞展現增加之細胞毒性。
  25. 一種在哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性之方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之經編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之重組核酸分子轉導之T細胞群體，該T細胞受體融合蛋白包含
    (a)TCR次單元，其包含
    (i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及
    (ii)TCR細胞內結構域，其包含來自TCR細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及
    (b)抗體結構域，其包含抗原結合結構域抗MUC16結合結構域；
    其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，
    其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中，且
    其中在治療後釋放之細胞介素之水準相較於經包含該相同抗體結構域之CAR-T細胞治療之哺乳動物之細胞介素水準更低。
  26. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該抗體結構域為與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：40中所示之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列一致性之VHH結構域。
  27. 如申請專利範圍第25項或第26項之方法，其中該細胞為自體T細胞。
  28. 如申請專利範圍第25項或第26項之方法，其中該細胞為同種異體T細胞。
  29. 如申請專利範圍第25項至第28項中任一項之方法，其中該哺乳動物為人類。
  30. 一種治療患有與MUC16表現相關之疾病的哺乳動物的方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之經編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之重組核酸分子轉導之T細胞群體，該T細胞受體融合蛋白包含
    (a)TCR次單元，其包含
    (i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及
    (ii)TCR細胞內結構域，其包含來自TCR細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及
    (b)抗體結構域，其包含抗原結合結構域抗MUC16結合結構域；
    其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，
    其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中，且
    其中在治療後釋放之細胞介素之水準相較於經包含該相同抗體結構域之CAR-T細胞治療之哺乳動物之細胞介素水準更低。
  31. 如申請專利範圍第30項之方法，其中該抗體結構域為與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：40中所示之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列一致性之VHH結構域。
  32. 如申請專利範圍第30項或第31項之方法，其中該細胞為自體T細胞。
  33. 如申請專利範圍第30項或第31項之方法，其中該細胞為同種異體T細胞。
  34. 如申請專利範圍第25項至第33項中任一項之方法，其中該TFP之該TCR次單元進一步包含TCR跨膜結構域。
  35. 如申請專利範圍第34項之方法，其中該TCR細胞外結構域、該TCR跨膜結構域及該TCR細胞內結構域來源於TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRγ鏈、TCRδ鏈、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
  36. 如申請專利範圍第34項之方法，其中該TCR次單元之該TCR細胞外結構域、該TCR跨膜結構域及該TCR細胞內結構域來源於TCR複合物之單一次單元，其中該單一次單元為TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRγ鏈、TCRδ 鏈、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
  37. 如申請專利範圍第25項至第36項中任一項之方法，其中該TCR細胞內信號傳導結構域來源於CD3ε或CD3γ。
  38. 如申請專利範圍第30項至第33項中任一項之方法，其中該與MUC16表現相關之疾病係選自由以下組成之群：增殖性疾病、癌症、惡性病及與MUC16表現相關之非癌症相關適應症。
  39. 如申請專利範圍第30項至第38項中任一項之方法，其中該疾病為選自由以下組成之群的癌症：間皮瘤、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、結腸癌、子宮頸癌、腦癌、肝癌、胰臟癌、甲狀腺癌、膀胱癌、輸尿管癌、腎癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、胸腺癌、膽管型肝癌、胃癌及其任何組合。
  40. 如申請專利範圍第30項至第38項中任一項之方法，其中該疾病為選自由以下組成之群的癌症：間皮瘤、乳頭狀漿液性卵巢腺癌、透明細胞卵巢癌、混合型密勒氏卵巢癌(mixed Mullerian ovarian carcinoma)、子宮內膜樣黏液性卵巢癌、胰臟腺癌、導管型胰臟腺癌、子宮漿液性癌、肺腺癌、肝外膽管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳房腺癌、與MUC16表現相關之疾病及其任何組合。
  41. 如申請專利範圍第30項至第40項中任一項之方法，其中該等表現TFP分子之細胞係與使表現TFP分子之細胞之效力增加的劑組合投與。
  42. 如申請專利範圍第25項至第41項中任一項之方法，其中對於指定細胞介素，在治療後釋放的該指定細胞介素之量與用包含該相同抗體結構域之CAR-T細胞治療之哺乳動物的該指定細胞介素之量相比低至少10%。
  43. 如申請專利範圍第42項之方法，其中該指定細胞介素包含一或 多種選自由以下組成之群的細胞介素：IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6、IL-13、IL-5、IL-10、sCD137、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β及其任何組合。
  44. 如申請專利範圍第25項至第43項中任一項之方法，其中該哺乳動物中之腫瘤生長受到抑制，使得在治療至少8天之後，該腫瘤之大小為用不表現該TFP之T細胞治療之哺乳動物中之腫瘤大小的至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%或至多60%，其中該用表現TFP之T細胞治療之哺乳動物及該用不表現該TFP之T細胞治療之哺乳動物在該治療之前具有相同的腫瘤大小。
  45. 如申請專利範圍第44項之方法，其中該哺乳動物中之該腫瘤生長受到完全抑制。
  46. 如申請專利範圍第45項之方法，其中該哺乳動物中之該腫瘤生長受到完全抑制持續至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天、至少100天或更久。
  47. 如申請專利範圍第25項至第46項中任一項之方法，其中經該TFP轉導之該T細胞群體與包含該相同抗體結構域之該等CAR-T細胞相比殺死類似量之腫瘤細胞。
  48. 如申請專利範圍第25項至第47項中任一項之方法，其中經該TFP轉導之該T細胞群體與包含該相同抗體結構域之該等CAR-T細胞相比具有不同的基因表現譜。
  49. 如申請專利範圍第48項之方法，其中經該TFP轉導之該等T細胞中基因的表現水準不同於包含該相同抗體結構域之該等CAR-T細胞中該基因的表現水準。
  50. 如申請專利範圍第49項之方法，其中該基因在抗原呈遞、TCR 信號傳導、體內平衡、代謝、趨化介素信號傳導、細胞介素信號傳導、類鐸(toll like)受體信號傳導、MMP及黏附分子信號傳導或TNFR相關信號傳導中具有功能。
  51. 一種重組核酸分子，其編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該T細胞受體融合蛋白包含
    (a)TCR次單元，其包含
    (i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及
    (ii)TCR細胞內結構域，其包含來自CD3ε細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及
    (b)抗體結構域，其包含抗MUC16結合結構域；
    其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，且
    其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中。
  52. 一種重組核酸分子，其編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該T細胞受體融合蛋白包含
    (a)TCR次單元，其包含
    (i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及
    (ii)TCR細胞內結構域，其包含來自CD3γ細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及
    (b)抗體結構域，其包含抗MUC16結合結構域；
    其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，且
    其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中。
  53. 一種重組核酸分子，其編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該T細胞受體融合蛋白包含
    (a)TCR次單元，其包含
    (i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及
    (ii)TCR細胞內結構域，其包含來自CD3δ細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及
    (b)抗體結構域，其包含抗MUC16結合結構域；
    其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，且
    其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中。
  54. 一種重組核酸分子，其編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該T細胞受體融合蛋白包含
    (a)TCR次單元，其包含
    (i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及
    (ii)TCR細胞內結構域，其包含來自TCRα鏈細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及
    (b)抗體結構域，其包含抗MUC16結合結構域；
    其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，且
    其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中。
  55. 一種重組核酸分子，其編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該T細胞受體融合蛋白包含
    (a)TCR次單元，其包含
    (i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及
    (ii)TCR細胞內結構域，其包含來自TCRβ鏈細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及
    (b)抗體結構域，其包含抗MUC16結合結構域；
    其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，且
    其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中。
  56. 如申請專利範圍第51項至第55項中任一項之重組核酸分子，其中該抗體結構域為人類或人類化抗體結構域。
  57. 如申請專利範圍第51項至第56項中任一項之重組核酸分子，其中該編碼抗原結合結構域係藉由連接子序列連接至該TCR細胞外結構域。
  58. 如申請專利範圍第57項之重組核酸分子，其中該編碼連接子序列包含(G4S)n，其中n=1至4(SEQ ID NO：107)。
  59. 如申請專利範圍第51項至第58項中任一項之重組核酸分子，其中該TCR次單元包含TCR細胞外結構域。
  60. 如申請專利範圍第51項至第59項中任一項之重組核酸分子，其中該TCR次單元包含TCR跨膜結構域。
  61. 如申請專利範圍第51項至第60項中任一項之重組核酸分子，其中該TCR次單元包含TCR細胞內結構域。
  62. 如申請專利範圍第51項至第61項中任一項之重組核酸分子，其中該TCR次單元包含(i)TCR細胞外結構域，(ii)TCR跨膜結構域，及(iii)TCR細胞內結構域，其中(i)、(ii)及(iii)中至少兩個來自相同TCR次單元。
  63. 如申請專利範圍第51項至第62項中任一項之重組核酸分子，其中該TCR次單元包含TCR細胞內結構域，該TCR細胞內結構域包含選自CD3ε、CD3γ或CD3δ之細胞內信號傳導結構域的刺激結構域，或具有至少一個針對其之修飾的胺基酸序列。
  64. 如申請專利範圍第51項至第63項中任一項之重組核酸分子，其中該TCR次單元包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含選自4-1BB功能 信號傳導結構域及/或CD3ζ功能信號傳導結構域之刺激結構域，或具有至少一個針對其之修飾的胺基酸序列。
  65. 如申請專利範圍第51項至第64項中任一項之重組核酸分子，其中該抗體結構域包含抗體片段。
  66. 如申請專利範圍第51項至第65項中任一項之重組核酸分子，其中該抗體結構域包含scFv或VH結構域。
  67. 如申請專利範圍第51項至第66項中任一項之重組核酸分子，其編碼
    (i)重鏈(HC)CDR1序列GRTVSSLF(SEQ ID NO：16)、GRAVSSLF(SEQ ID NO：21)或GDSLDGYV(SEQ ID NO：31)，
    (ii)HC CDR2序列ISRYSLYT(SEQ ID NO：17)或ISGDGSMR(SEQ ID NO：32)，及
    (iii)HC CDR3序列ASKLEYTSNDYDS(SEQ ID NO：18)或AADPPTWDY(SEQ ID NO：33)。
  68. 如申請專利範圍第51項至第67項中任一項之重組核酸分子，其編碼與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：40中所示之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列一致性之重鏈可變結構域。
  69. 如申請專利範圍第51項至第68項中任一項之重組核酸分子，其中該TFP包括TCR次單元之細胞外結構域，該細胞外結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的細胞外結構域或其一部分：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、其功能片段，及其具 有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。
  70. 如申請專利範圍第51項至第69項中任一項之重組核酸分子，其中該編碼TFP包括跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的跨膜結構域：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。
  71. 如申請專利範圍第51項至第70項中任一項之重組核酸分子，其中該編碼TFP包括跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的跨膜結構域：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR ζ鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。
  72. 如申請專利範圍第51項至第71項中任一項之重組核酸分子，其進一步包含編碼共刺激結構域之序列。
  73. 如申請專利範圍第72項之重組核酸分子，其中該共刺激結構域為獲自選自由以下組成之群的蛋白質的功能信號傳導結構域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)，及其具有至少一個但不超過20個針對其之修飾的胺基酸序列。
  74. 如申請專利範圍第51項至第73項中任一項之重組核酸分子，其中該至少一個但不超過20個針對其之修飾包含介導細胞信號傳導之胺基酸修飾或響應於配位體結合至該TFP而磷酸化之胺基酸修飾。
  75. 如申請專利範圍第51項至第74項中任一項之重組核酸分子，其中該分離之核酸分子為mRNA。
  76. 如申請專利範圍第51項至第75項中任一項之重組核酸分子，其中該TFP包括TCR次單元之基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)，其包含選自由以下組成之群的蛋白質的ITAM或其一部分：CD3ζ TCR次單元、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、TCR ζ鏈、Fcε受體1鏈、Fcε受體2鏈、Fcγ受體1鏈、Fcγ受體2a鏈、Fcγ受體2b1鏈、Fcγ受體2b2鏈、Fcγ受體3a鏈、Fcγ受體3b鏈、Fcβ受體1鏈、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個針對其之修飾的胺基酸序列。
  77. 如申請專利範圍第76項之重組核酸分子，其中該ITAM置換CD3γ、CD3δ或CD3ε之ITAM。
  78. 如申請專利範圍第76項之重組核酸分子，其中該ITAM係選自由以下組成之群：CD3ζ TCR次單元、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元，且置換選自由以下組成之群的不同ITAM：CD3ζ TCR次單元、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元。
  79. 如申請專利範圍第51項至第78項中任一項之重組核酸分子，其中該核酸包含核苷酸類似物。
  80. 如申請專利範圍第79項之重組核酸分子，其中該核苷酸類似物係選自由以下組成之群：經2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-胺基丙基、2’-去氧、T-去氧-2’-氟、2’-O-胺基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基胺基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基胺基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙醯胺基(2’-O-NMA)修飾之鎖核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-無水己糖醇核酸(HNA)、 嗎啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸及2’-氟N3-P5’-亞磷醯胺。
  81. 如申請專利範圍第51項至第80項中任一項之重組核酸分子，其進一步包含前導序列。
  82. 一種重組多肽分子，其係由如申請專利範圍第51項至第81項中任一項之重組核酸分子編碼。
  83. 一種重組TFP分子，其包含抗MUC16結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域。
  84. 一種重組TFP分子，其包含抗MUC16結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，其中該TFP分子能夠與內源TCR複合物及/或至少一種內源TCR多肽在功能上相互作用。
  85. 一種重組TFP分子，其包含抗MUC16結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，其中該TFP分子能夠功能整合至內源TCR複合物中。
  86. 如申請專利範圍第83項之重組TFP分子，其包含含有抗MUC16結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域之抗體或抗體片段。
  87. 如申請專利範圍第83項至第86項中任一項之重組TFP分子，其中該抗MUC16結合結構域為scFv、VHH或VH結構域。
  88. 如申請專利範圍第83項至第87項中任一項之重組TFP分子，其中該抗MUC16結合結構域包含與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：40之胺基酸序列具有95-100%一致性之重鏈、其功能片段或其具有至少一個但不超過30個修飾之胺基酸序列。
  89. 如申請專利範圍第83項至第88項中任一項之重組TFP分子，其包含TCR細胞外結構域，該TCR細胞外結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的細胞外結構域或其一部分：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈、TCR δ鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。
  90. 如申請專利範圍第83項至第89項中任一項之重組TFP分子，其中該抗MUC16結合結構域係藉由連接子序列連接至該TCR細胞外結構域。
  91. 如申請專利範圍第90項之重組TFP分子，其中該連接子區包含(G4S)n，其中n=1至4(SEQ ID NO：107)。
  92. 一種核酸，其包含編碼如申請專利範圍第83項至第91項中任一項之TFP之序列。
  93. 如申請專利範圍第92項之核酸，其中該核酸係選自由以下組成之群：DNA及RNA。
  94. 如申請專利範圍第92項或第93項之核酸，其中該核酸為mRNA。
  95. 如申請專利範圍第92項至第94項中任一項之核酸，其中該核酸包含核苷酸類似物。
  96. 如申請專利範圍第95項之核酸，其中該核苷酸類似物係選自由以下組成之群：經2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-胺基丙基、2’-去氧、T-去氧-2’-氟、2’-O-胺基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基胺基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基胺基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙醯胺基(2’-O-NMA)修飾之鎖核酸 (LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-無水己糖醇核酸(HNA)、嗎啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸及2’-氟N3-P5’-亞磷醯胺。
  97. 如申請專利範圍第92項至第96項中任一項之核酸，其進一步包含啟動子。
  98. 如申請專利範圍第92項至第97項中任一項之核酸，其中該核酸為活體外轉錄之核酸。
  99. 如申請專利範圍第92項至第98項中任一項之核酸，其中該核酸進一步包含編碼聚(A)尾之序列。
  100. 如申請專利範圍第92項至第99項中任一項之核酸，其中該核酸進一步包含3’UTR序列。
  101. 一種載體，其包含編碼如申請專利範圍第83項至第100項中任一項之TFP之核酸分子。
  102. 如申請專利範圍第101項之載體，其中該載體係選自由以下組成之群：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體、勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma viral，RSV)載體或反轉錄病毒載體。
  103. 如申請專利範圍第101項或第102項之載體，其進一步包含啟動子。
  104. 如申請專利範圍第101項至第103項中任一項之載體，其中該載體為活體外轉錄之載體。
  105. 如申請專利範圍第101項至第104項中任一項之載體，其中該載體中之核酸序列進一步包含聚(A)尾。
  106. 如申請專利範圍第101項至第105項中任一項之載體，其中該載體中之核酸序列進一步包含3’UTR。
  107. 一種細胞，其包含如申請專利範圍第51項至第81項中任一項之重組核酸分子、如申請專利範圍第82項之多肽分子、如申請專利範圍第83項至第91項中任一項之TFP分子、如申請專利範圍第92項至第100項中任一項之核酸、如申請專利範圍第101項至第106項中任一項之載體。
  108. 如申請專利範圍第107項之細胞，其中該細胞為人類T細胞。
  109. 如申請專利範圍第108項之細胞，其中該T細胞為CD8+或CD4+ T細胞。
  110. 如申請專利範圍第107項至第109項中任一項之細胞，其進一步包含編碼抑制性分子之核酸，該抑制性分子包含第一多肽，該第一多肽包含抑制性分子之至少一部分，該抑制性分子之至少一部分與包含細胞內信號傳導結構域之正信號的第二多肽締合。
  111. 如申請專利範圍第110項之細胞，其中該抑制性分子包含第一多肽及第二多肽，該第一多肽包含PD1之至少一部分，該第二多肽包含共刺激結構域及一級信號傳導結構域。
  112. 一種人類CD8+或CD4+ T細胞，其包含至少兩種TFP分子，該等TFP分子包含抗MUC16結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，其中該TFP分子能夠與人類CD8+或CD4+ T細胞中、處及/或表面上之內源TCR複合物及/或至少一種內源TCR多肽在功能上相互作用。
  113. 一種蛋白質複合物，其包含：
    i)TFP分子，其包含抗MUC16結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域；及
    ii)至少一種內源TCR次單元或內源TCR複合物。
  114. 如申請專利範圍第113項之蛋白質複合物，其中該TCR包含選自由以下組成之群的蛋白質的細胞外結構域或其一部分：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈、TCR δ鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元。
  115. 如申請專利範圍第113項或第114項之蛋白質複合物，其中該抗MUC16結合結構域係藉由連接子序列連接至該TCR細胞外結構域。
  116. 如申請專利範圍第115項之蛋白質複合物，其中該連接子區包含(G4S)n，其中n=1至4(SEQ ID NO：107)。
  117. 一種蛋白質複合物，其包含
    (a)由如申請專利範圍第51項至第81項中任一項之重組核酸分子編碼之TFP，及
    (b)至少一種內源TCR次單元或內源TCR複合物。
  118. 一種蛋白質複合物，其包含：
    i)TFP分子，其包含抗MUC16結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域；及
    ii)至少一種內源TCR次單元或內源TCR複合物。
  119. 如申請專利範圍第118項之蛋白質複合物，其中該TCR包含選自由以下組成之群的蛋白質的細胞外結構域或其一部分：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈、TCR δ鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元。
  120. 如申請專利範圍第118項或第119項之蛋白質複合物，其中該抗MUC16結合結構域係藉由連接子序列連接至該TCR細胞外結構域。
  121. 如申請專利範圍第120項之蛋白質複合物，其中該連接子區包含 (G4S)n，其中n=1至4(SEQ ID NO：107)。
  122. 一種人類CD8+或CD4+ T細胞，其包含每種如申請專利範圍第113項至第121項中任一項之蛋白質複合物至少兩種不同的TFP蛋白質。
  123. 一種人類CD8+或CD4+ T細胞，其包含由如申請專利範圍第51項至第81項中任一項之分離之核酸分子編碼的至少兩種不同的TFP分子。
  124. 一種人類CD8+或CD4+ T細胞群體，其中該群體之該等T細胞個別或共同包含至少兩種TFP分子，該等TFP分子包含抗MUC16結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，其中該TFP分子能夠與該人類CD8+或CD4+ T細胞中、處及/或表面上之內源TCR複合物及/或至少一種內源TCR多肽在功能上相互作用。
  125. 一種人類CD8+或CD4+ T細胞群體，其中該群體之該等T細胞個別或共同包含至少兩種由如申請專利範圍第51項至第81項中任一項之重組核酸分子編碼之TFP分子。
  126. 一種製造細胞之方法，其包括用如申請專利範圍第51項至第81項中任一項之重組核酸分子、如申請專利範圍第92項至第100項中任一項之核酸或如申請專利範圍第101項至第106項中任一項之載體對T細胞進行轉導。
  127. 一種產生RNA工程化細胞群體之方法，其包括將活體外轉錄之RNA或合成RNA引入細胞中，其中該RNA包含編碼如申請專利範圍第83項至第91項中任一項之TFP分子的核酸。
  128. 一種在哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性之方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之如申請專利範圍第51項至第81項中任一項之重組核酸分子、如申請專利範圍第82項之多肽分子、表現如申請專利範圍第82項之多肽分 子的細胞、如申請專利範圍第83項至第91項中任一項之TFP分子、如申請專利範圍第92項至第100項中任一項之核酸、如申請專利範圍第101項至第106項中任一項之載體或如申請專利範圍第107項至第112項及第122項至第126項中任一項之細胞。
  129. 如申請專利範圍第128項之方法，其中該細胞為自體T細胞。
  130. 如申請專利範圍第128項之方法，其中該細胞為同種異體T細胞。
  131. 如申請專利範圍第128項至第130項中任一項之方法，其中該哺乳動物為人類。
  132. 一種治療患有與MUC16表現相關之疾病的哺乳動物的方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之如申請專利範圍第51項至第81項中任一項之分離之核酸分子、如申請專利範圍第82項之多肽分子、表現如申請專利範圍第82項之多肽分子的細胞、如申請專利範圍第83項至第91項中任一項之TFP分子、如申請專利範圍第92項至第100項中任一項之核酸、如申請專利範圍第101項至第106項中任一項之載體或如申請專利範圍第107項至第112項及第122項至第125項中任一項之細胞。
  133. 如申請專利範圍第132項之方法，其中該與MUC16表現相關之疾病係選自由以下組成之群：增殖性疾病、癌症、惡性病、骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群、白血病前期、與MUC16表現相關之非癌症相關適應症。
  134. 如申請專利範圍第132項之方法，其中該疾病為胰臟癌、卵巢癌、乳癌或其任何組合。
  135. 如申請專利範圍第132項之方法，其中該等表現TFP分子之細 胞係與使表現TFP分子之細胞之效力增加的劑組合投與。
  136. 如申請專利範圍第132項至第135項中任一項之方法，其中與投與有效量之表現抗MUC16嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的哺乳動物相比，該哺乳動物中釋放更少細胞介素。
  137. 如申請專利範圍第132項至第136項中任一項之方法，其中該等表現TFP分子之細胞係與改善一或多種與投與表現TFP分子之細胞相關之副作用的劑組合投與。
  138. 如申請專利範圍第132項至第137項中任一項之方法，其中該等表現TFP分子之細胞係與治療與MUC16相關之疾病的劑組合投與。
  139. 如申請專利範圍第51項至第81項中任一項之重組核酸分子、如申請專利範圍第82項之多肽分子、表現如申請專利範圍第82項之多肽分子的細胞、如申請專利範圍第83項至第91項中任一項之重組TFP、如申請專利範圍第92項至第100項中任一項之核酸、如申請專利範圍第101項至第106項中任一項之載體、如申請專利範圍第113項至第121項中任一項之複合物或如申請專利範圍第107項至第112項及第122項至第125項中任一項之細胞，其係用作藥物。
  140. 一種治療患有與MUC16表現相關之疾病的哺乳動物的方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之如申請專利範圍第51項至第81項中任一項之重組核酸分子、如申請專利範圍第82項之多肽分子、表現如申請專利範圍第82項之多肽分子的細胞、如申請專利範圍第83項至第91項中任一項之重組TFP分子、如申請專利範圍第92項至第100項中任一項之核酸、如申請專利範圍第101項至第106項中任一項之載體或如申請專利範圍第107項至第112項及第122項至第125項中任一項之細胞，其中與投與有效量之 表現抗MUC16嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的哺乳動物相比，該哺乳動物中釋放更少細胞介素。
  141. 一種醫藥組合物，其包含
    (I)來自人類個體之T細胞，其中該T細胞包含編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之重組核酸分子，該T細胞受體融合蛋白包含
    (a)TCR次單元，其包含
    (i)TCR細胞外結構域之至少一部分，
    (ii)TCR跨膜結構域，及
    (iii)TCR細胞內結構域，其包含來自細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及
    (b)抗原結合結構域，其包含抗IL13Rα2結合結構域；及
    (II)醫藥學上可接受之載劑；
    其中該TCR次單元及該抗IL13Rα2結合結構域可操作地連接；
    其中該TFP當表現於該T細胞中時與TCR在功能上相互作用。
  142. 如申請專利範圍第141項之醫藥組合物，其中該TCR次單元之該TCR細胞外結構域、該TCR跨膜結構域及該TCR細胞內結構域來源於TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRγ鏈、TCRδ鏈、CD3ε、CD3δ或CD3γ。
  143. 如申請專利範圍第141項之醫藥組合物，其中該TCR次單元之該TCR細胞外結構域、該TCR跨膜結構域及該TCR細胞內結構域來源於TCR複合物之單一次單元，其中該單一次單元為TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRγ鏈、TCRδ鏈、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
  144. 如申請專利範圍第141項至第143項中任一項之醫藥組合物，其中該T細胞與不含該TFP之T細胞相比對表現與該抗IL13Rα2結合結構域 特異性相互作用之抗原的細胞展現增加之細胞毒性。
  145. 如申請專利範圍第141項至第144項中任一項之醫藥組合物，其中編碼該抗IL13Rα2結合結構域之序列經由編碼連接子之序列連接至編碼該TCR細胞外結構域之序列。
  146. 如申請專利範圍第145項之醫藥組合物，其中該連接子包含(G4S)n，其中G為甘胺酸，S為絲胺酸，且n為整數1至4(SEQ ID NO：107)。
  147. 如申請專利範圍第141項至第146項中任一項之醫藥組合物，其中該抗IL13Rα2結合結構域包含
    (i)重鏈(HC)CDR1序列GFTSDYYI(SEQ ID NO：52)或GFASDDYI(SEQ ID NO：67)，
    (ii)HC CDR2序列ISSKYANT(SEQ ID NO：53)或ISSRYANT(SEQ ID NO：68)，及
    (iii)HC CDR3序列AADTRRYTCPDIATMHRNFDS(SEQ ID NO：54)或AMDSRRVTCPEISTMHRNFDS(SEQ ID NO：69)。
  148. 如申請專利範圍第141項至第147項中任一項之醫藥組合物，其中該抗IL13Rα2結合結構域包含與SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：76具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列一致性之序列。
  149. 如申請專利範圍第148項之醫藥組合物，其中使用BLAST算法以字組大小6、BLOSUM62矩陣、存在罰分11及延伸罰分1確定序列一致性。
  150. 如申請專利範圍第141項至第149項中任一項之醫藥組合物，其 中該醫藥組合物實質上不含血清。
  151. 如申請專利範圍第141項至第150項中任一項之醫藥組合物，其中該抗原結合結構域為scFv。
  152. 如申請專利範圍第141項至第150項中任一項之醫藥組合物，其中該抗原結合結構域為單結構域抗體。
  153. 如申請專利範圍第152項之醫藥組合物，其中該單結構域抗體為VH結構域。
  154. 如申請專利範圍第141項至第153項中任一項之醫藥組合物，其中該編碼抗IL13Rα2結合結構域包含抗IL13Rα2結合結構域，且其中該等T細胞之細胞毒性活性比包含編碼嵌合抗原受體(CAR)之核酸的CD8+或CD4+ T細胞更高或更高效，該嵌合抗原受體包含(a)該抗IL13Rα2結合結構域，其可操作地連接至(b)CD28細胞外結構域之至少一部分，(c)CD28跨膜結構域，(d)CD28細胞內結構域之至少一部分，及(e)CD3ζ細胞內結構域。
  155. 如申請專利範圍第141項至第154項中任一項之醫藥組合物，其中該編碼TFP分子當表現於該T細胞中時與內源TCR複合物、至少一種內源TCR多肽或其組合在功能上相互作用。
  156. 如申請專利範圍第141項至第155項中任一項之醫藥組合物，其中該T細胞為初代T細胞。
  157. 如申請專利範圍第141項至第156項中任一項之醫藥組合物，其中該T細胞為人類CD4+ T細胞。
  158. 如申請專利範圍第141項至第156項中任一項之醫藥組合物，其中該T細胞為人類CD8+ T細胞。
  159. 如申請專利範圍第141項至第158項中任一項之醫藥組合物，其 中該T細胞進一步包含編碼第一多肽之核酸，該第一多肽包含選自由PD-1及BTLA組成之群的抑制性分子之至少一部分，其中該抑制性分子之至少一部分與包含細胞內信號傳導結構域之正信號的第二多肽締合。
  160. 如申請專利範圍第159項之醫藥組合物，其中該第二多肽包含選自由以下組成之群的蛋白質的共刺激結構域及一級信號傳導結構域：CD28、CD27、ICOS、CD3ζ、41-BB、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160及B7-H3。
  161. 如申請專利範圍第141項至第160項中任一項之醫藥組合物，其中在表現與該抗IL13Rα2結合結構域特異性相互作用之抗原的細胞存在下，由該T細胞產生之IL-2或IFNγ與不含該TFP之T細胞相比有所增加。
  162. 如申請專利範圍第141項至第161項中任一項之醫藥組合物，其中該細胞為人類CD8+或CD4+ T細胞群體，其中該群體之個別T細胞包含至少兩種TFP分子，或該群體之至少兩種T細胞共同包含至少兩種TFP分子；其中該至少兩種TFP分子包含抗IL13Rα2結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域；且其中該至少兩種TFP分子中之至少一種與內源TCR複合物、至少一種內源TCR多肽或其組合在功能上相互作用。
  163. 如申請專利範圍第141項至第162項中任一項之醫藥組合物，其中該TCR次單元僅來源於CD3ε。
  164. 如申請專利範圍第141項至第162項中任一項之醫藥組合物，其中該TCR次單元僅來源於CD3γ。
  165. 如申請專利範圍第141項至第162項中任一項之醫藥組合物，其 中該TCR次單元僅來源於CD3δ。
  166. 一種在哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性之方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之經編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之重組核酸分子轉導之T細胞群體，該T細胞受體融合蛋白包含
    (a)TCR次單元，其包含
    (i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及
    (ii)TCR細胞內結構域，其包含來自TCR細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及
    (b)抗體結構域，其包含抗原結合結構域抗IL13Rα2結合結構域；
    其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，
    其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中，且
    其中在治療後釋放之細胞介素之水準相較於經包含該相同抗體結構域之CAR-T細胞治療之哺乳動物之細胞介素水準更低。
  167. 如申請專利範圍第166項之方法，其中該抗體結構域為與SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：76中所示之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列一致性之VHH結構域。
  168. 如申請專利範圍第167項之方法，其中使用BLAST算法以字組大小6、BLOSUM62矩陣、存在罰分11及延伸罰分1確定序列一致性。
  169. 如申請專利範圍第166項至第168項中任一項之方法，其中該細胞為自體T細胞。
  170. 如申請專利範圍第166項至第168項中任一項之方法，其中該細胞為同種異體T細胞。
  171. 如申請專利範圍第166項至第170項中任一項之方法，其中該哺乳動物為人類。
  172. 一種治療患有與IL13Rα2表現相關之疾病的哺乳動物的方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之經編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之重組核酸分子轉導之T細胞群體，該T細胞受體融合蛋白包含
    (a)TCR次單元，其包含
    (i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及
    (ii)TCR細胞內結構域，其包含來自TCR細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及
    (b)抗體結構域，其包含抗原結合結構域抗IL13Rα2結合結構域；
    其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，
    其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中，且
    其中在治療後釋放之細胞介素之水準相較於經包含該相同抗體結構域之 CAR-T細胞治療之哺乳動物之細胞介素水準更低。
  173. 如申請專利範圍第172項之方法，其中該抗體結構域為與SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：76中所示之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列一致性之VHH結構域。
  174. 如申請專利範圍第173項之方法，其中使用BLAST算法以字組大小6、BLOSUM62矩陣、存在罰分11及延伸罰分1確定序列一致性。
  175. 如申請專利範圍第172項至第174項中任一項之方法，其中該細胞為自體T細胞。
  176. 如申請專利範圍第172項至第174項中任一項之方法，其中該細 胞為同種異體T細胞。
  177. 如申請專利範圍第166項至第176項中任一項之方法，其中該TFP之該TCR次單元進一步包含TCR跨膜結構域。
  178. 如申請專利範圍第177項之方法，其中該TCR細胞外結構域、該TCR跨膜結構域及該TCR細胞內結構域來源於TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRγ鏈、TCRδ鏈、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
  179. 如申請專利範圍第177項之方法，其中該TCR次單元之該TCR細胞外結構域、該TCR跨膜結構域及該TCR細胞內結構域來源於TCR複合物之單一次單元，其中該單一次單元為TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRγ鏈、TCRδ鏈、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
  180. 如申請專利範圍第166項至第179項中任一項之方法，其中該TCR細胞內信號傳導結構域來源於CD3ε或CD3γ。
  181. 如申請專利範圍第172項至第180項中任一項之方法，其中該與IL13Rα2表現相關之疾病係選自由以下組成之群：增殖性疾病、癌症、惡性病及與IL13Rα2表現相關之非癌症相關適應症。
  182. 如申請專利範圍第172項至第181項中任一項之方法，其中該疾病為選自由以下組成之群的癌症：神經膠質母細胞瘤、間皮瘤、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、結腸癌、子宮頸癌、腦癌、肝癌、胰臟癌、甲狀腺癌、膀胱癌、輸尿管癌、腎癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、胸腺癌、膽管型肝癌、胃癌及其任何組合。
  183. 如申請專利範圍第172項至第181項中任一項之方法，其中該疾病為選自由以下組成之群的癌症：神經膠質母細胞瘤、間皮瘤、乳頭狀漿液性卵巢腺癌、透明細胞卵巢癌、混合型密勒氏卵巢癌、子宮內膜樣黏液性卵 巢癌、胰臟腺癌、導管型胰臟腺癌、子宮漿液性癌、肺腺癌、肝外膽管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳房腺癌、與IL13Rα2表現相關之疾病及其任何組合。
  184. 如申請專利範圍第166項至第183項中任一項之方法，其中該等表現TFP分子之細胞係與使表現TFP分子之細胞之效力增加的劑組合投與。
  185. 如申請專利範圍第166項至第184項中任一項之方法，其中對於指定細胞介素，在治療後釋放的該指定細胞介素之量與用包含該相同抗體結構域之CAR-T細胞治療之哺乳動物的該指定細胞介素之量相比低至少10%。
  186. 如申請專利範圍第185項之方法，其中該指定細胞介素包含一或多種選自由以下組成之群的細胞介素：IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6、IL-13、IL-5、IL-10、sCD137、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β及其任何組合。
  187. 如申請專利範圍第166項至第186項中任一項之方法，其中該哺乳動物中之腫瘤生長受到抑制，使得在治療至少8天之後，該腫瘤之大小為用不表現該TFP之T細胞治療之哺乳動物中之腫瘤大小的至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%或至多60%，其中該用表現TFP之T細胞治療之哺乳動物及該用不表現該TFP之T細胞治療之哺乳動物在該治療之前具有相同的腫瘤大小。
  188. 如申請專利範圍第187項之方法，其中該哺乳動物中之該腫瘤生長受到完全抑制。
  189. 如申請專利範圍第188項之方法，其中該哺乳動物中之該腫瘤生長受到完全抑制持續至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少 60天、至少70天、至少80天、至少90天、至少100天或更久。
  190. 如申請專利範圍第166項至第189項中任一項之方法，其中經該TFP轉導之該T細胞群體與包含該相同抗體結構域之該等CAR-T細胞相比殺死類似量之腫瘤細胞。
  191. 如申請專利範圍第166項至第190項中任一項之方法，其中經該TFP轉導之該T細胞群體與包含該相同抗體結構域之該等CAR-T細胞相比具有不同的基因表現譜。
  192. 如申請專利範圍第191項之方法，其中經該TFP轉導之該等T細胞中基因的表現水準不同於包含該相同抗體結構域之該等CAR-T細胞中該基因的表現水準。
  193. 如申請專利範圍第192項之方法，其中該基因在抗原呈遞、TCR信號傳導、體內平衡、代謝、趨化介素信號傳導、細胞介素信號傳導、類鐸受體信號傳導、MMP及黏附分子信號傳導或TNFR相關信號傳導中具有功能。
  194. 一種重組核酸分子，其編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該T細胞受體融合蛋白包含
    (a)TCR次單元，其包含
    (i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及
    (ii)TCR細胞內結構域，其包含來自CD3ε細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及
    (b)抗體結構域，其包含抗IL13Rα2結合結構域；
    其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，且
    其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中。
  195. 一種重組核酸分子，其編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該T細胞受體融合蛋白包含
    (a)TCR次單元，其包含
    (i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及
    (ii)TCR細胞內結構域，其包含來自CD3γ細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及
    (b)抗體結構域，其包含抗IL13Rα2結合結構域；
    其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，且
    其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中。
  196. 一種重組核酸分子，其編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該T細胞受體融合蛋白包含
    (a)TCR次單元，其包含
    (i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及
    (ii)TCR細胞內結構域，其包含來自CD3δ細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及
    (b)抗體結構域，其包含抗IL13Rα2結合結構域；
    其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，且
    其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中。
  197. 一種重組核酸分子，其編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該T細胞受體融合蛋白包含
    (a)TCR次單元，其包含
    (i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及
    (ii)TCR細胞內結構域，其包含來自TCRα細胞內信號傳導結構域之刺 激結構域；及
    (b)抗體結構域，其包含抗IL13Rα2結合結構域；
    其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，且
    其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中。
  198. 一種重組核酸分子，其編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)，該T細胞受體融合蛋白包含
    (a)TCR次單元，其包含
    (i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及
    (ii)TCR細胞內結構域，其包含來自TCRβ細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及
    (b)抗體結構域，其包含抗IL13Rα2結合結構域；
    其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，且
    其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中。
  199. 如申請專利範圍第194項至第198項中任一項之重組核酸分子，其中該抗體結構域為人類或人類化抗體結構域。
  200. 如申請專利範圍第194項至第199項中任一項之重組核酸分子，其中該編碼抗原結合結構域係藉由連接子序列連接至該TCR細胞外結構域。
  201. 如申請專利範圍第200項之重組核酸分子，其中該編碼連接子序列包含(G4S)n，其中n=1至4(SEQ ID NO：107)。
  202. 如申請專利範圍第194項至第201項中任一項之重組核酸分子，其中該TCR次單元包含TCR細胞外結構域。
  203. 如申請專利範圍第194項至第202項中任一項之重組核酸分子， 其中該TCR次單元包含TCR跨膜結構域。
  204. 如申請專利範圍第194項至第203項中任一項之重組核酸分子，其中該TCR次單元包含TCR細胞內結構域。
  205. 如申請專利範圍第194項至第204項中任一項之重組核酸分子，其中該TCR次單元包含(i)TCR細胞外結構域，(ii)TCR跨膜結構域，及(iii)TCR細胞內結構域，其中(i)、(ii)及(iii)中至少兩個來自相同TCR次單元。
  206. 如申請專利範圍第194項至第205項中任一項之重組核酸分子，其中該TCR次單元包含TCR細胞內結構域，該TCR細胞內結構域包含選自CD3ε、CD3γ或CD3δ之細胞內信號傳導結構域的刺激結構域，或具有至少一個針對其之修飾的胺基酸序列。
  207. 如申請專利範圍第194項至第206項中任一項之重組核酸分子，其中該TCR次單元包含細胞內結構域，該細胞內結構域包含選自4-1BB功能信號傳導結構域及/或CD3ζ功能信號傳導結構域之刺激結構域，或具有至少一個針對其之修飾的胺基酸序列。
  208. 如申請專利範圍第194項至第207項中任一項之重組核酸分子，其中該抗體結構域包含抗體片段。
  209. 如申請專利範圍第194項至第208項中任一項之重組核酸分子，其中該抗體結構域包含scFv或VH結構域。
  210. 如申請專利範圍第194項至第209項中任一項之重組核酸分子，其編碼
    (i)重鏈(HC)CDR1序列GFTSDYYI(SEQ ID NO：52)或GFASDDYI(SEQ ID NO：67)，
    (ii)HC CDR2序列ISSKYANT(SEQ ID NO：53)或ISSRYANT(SEQ ID NO：68)，及
    (iii)HC CDR3序列AADTRRYTCPDIATMHRNFDS(SEQ ID NO：54)或AMDSRRVTCPEISTMHRNFDS(SEQ ID NO：69)。
  211. 如申請專利範圍第194項至第210項中任一項之重組核酸分子，其編碼與SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：76中所示之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列一致性之重鏈可變結構域。
  212. 如申請專利範圍第211項之重組核酸分子，其中使用BLAST算法以字組大小6、BLOSUM62矩陣、存在罰分11及延伸罰分1確定序列一致性。
  213. 如申請專利範圍第194項至第212項中任一項之重組核酸分子，其中該TFP包括TCR次單元之細胞外結構域，該細胞外結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的細胞外結構域或其一部分：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。
  214. 如申請專利範圍第194項至第213項中任一項之重組核酸分子，其中該編碼TFP包括跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的跨膜結構域：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。
  215. 如申請專利範圍第194項至第214項中任一項之重組核酸分子，其中該編碼TFP包括跨膜結構域，該跨膜結構域包含選自由以下組成之群的 蛋白質的跨膜結構域：TCR α鏈、TCR β鏈、TCRγ鏈、TCRβ鏈、TCRζ鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。
  216. 如申請專利範圍第194項至第215項中任一項之重組核酸分子，其進一步包含編碼共刺激結構域之序列。
  217. 如申請專利範圍第216項之重組核酸分子，其中該共刺激結構域為獲自選自由以下組成之群的蛋白質的功能信號傳導結構域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)，及其具有至少一個但不超過20個針對其之修飾的胺基酸序列。
  218. 如申請專利範圍第194項至第217項中任一項之重組核酸分子，其中該至少一個但不超過20個針對其之修飾包含介導細胞信號傳導之胺基酸修飾或響應於配位體結合至該TFP而磷酸化之胺基酸修飾。
  219. 如申請專利範圍第194項至第218項中任一項之重組核酸分子，其中該分離之核酸分子為mRNA。
  220. 如申請專利範圍第194項至第219項中任一項之重組核酸分子，其中該TFP包括TCR次單元之基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)，其包含選自由以下組成之群的蛋白質的ITAM或其一部分：CD3ζ TCR次單元、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、TCR ζ鏈、Fcε受體1鏈、Fcε受體2鏈、Fcγ受體1鏈、Fcγ受體2a鏈、Fcγ受體2b1鏈、Fcγ受體2b2鏈、Fcγ受體3a鏈、Fcγ受體3b鏈、Fcβ受體1鏈、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、 CD79b、CD89、CD278、CD66d、其功能片段，及其具有至少一個但不超過20個針對其之修飾的胺基酸序列。
  221. 如申請專利範圍第220項之重組核酸分子，其中該ITAM置換CD3γ、CD3δ或CD3ε之ITAM。
  222. 如申請專利範圍第221項之重組核酸分子，其中該ITAM係選自由以下組成之群：CD3ζ TCR次單元、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元，且置換選自由以下組成之群的不同ITAM：CD3ζ TCR次單元、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元。
  223. 如申請專利範圍第194項至第222項中任一項之重組核酸分子，其中該核酸包含核苷酸類似物。
  224. 如申請專利範圍第223項之重組核酸分子，其中該核苷酸類似物係選自由以下組成之群：經2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-胺基丙基、2’-去氧、T-去氧-2’-氟、2’-O-胺基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基胺基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基胺基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙醯胺基(2’-O-NMA)修飾之鎖核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-無水己糖醇核酸(HNA)、嗎啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸及2’-氟N3-P5’-亞磷醯胺。
  225. 如申請專利範圍第194項至第224項中任一項之重組核酸分子，其進一步包含前導序列。
  226. 一種重組多肽分子，其係由如申請專利範圍第194項至第225項中任一項之重組核酸分子編碼。
  227. 一種重組TFP分子，其包含抗IL13Rα2結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域。
  228. 一種重組TFP分子，其包含抗IL13Rα2結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，其中該TFP分子能夠與內源TCR複合物及/或至少一種內源TCR多肽在功能上相互作用。
  229. 一種重組TFP分子，其包含抗IL13Rα2結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，其中該TFP分子能夠功能整合至內源TCR複合物中。
  230. 如申請專利範圍第227項之重組TFP分子，其包含含有抗IL13Rα2結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域之抗體或抗體片段。
  231. 如申請專利範圍第227項至第230項中任一項之重組TFP分子，其中該抗IL13Rα2結合結構域為scFv、VHH或VH結構域。
  232. 如申請專利範圍第227項至第231項中任一項之重組TFP分子，其中該抗IL13Rα2結合結構域包含與SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：76之胺基酸序列具有95-100%一致性之重鏈、其功能片段或其具有至少一個但不超過30個修飾之胺基酸序列。
  233. 如申請專利範圍第232項之重組TFP分子，其中使用BLAST算法以字組大小6、BLOSUM62矩陣、存在罰分11及延伸罰分1確定序列一致性。
  234. 如申請專利範圍第227項至第233項中任一項之重組TFP分子，其包含TCR細胞外結構域，該TCR細胞外結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的細胞外結構域或其一部分：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈、TCR δ鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元、其功能片 段，及其具有至少一個但不超過20個修飾之胺基酸序列。
  235. 如申請專利範圍第227項至第234項中任一項之重組TFP分子，其中該抗IL13Rα2結合結構域係藉由連接子序列連接至該TCR細胞外結構域。
  236. 如申請專利範圍第235項之重組TFP分子，其中該連接子區包含(G4S)n，其中n=1至4。
  237. 一種核酸，其包含編碼如申請專利範圍第227項至第236項中任一項之TFP之序列。
  238. 如申請專利範圍第237項之核酸，其中該核酸係選自由以下組成之群：DNA及RNA。
  239. 如申請專利範圍第237項或第238項之核酸，其中該核酸為mRNA。
  240. 如申請專利範圍第237項至第239項中任一項之核酸，其中該核酸包含核苷酸類似物。
  241. 如申請專利範圍第240項之核酸，其中該核苷酸類似物係選自由以下組成之群：經2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-胺基丙基、2’-去氧、T-去氧-2’-氟、2’-O-胺基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基胺基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基胺基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙醯胺基(2’-O-NMA)修飾之鎖核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-無水己糖醇核酸(HNA)、嗎啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸及2’-氟N3-P5’-亞磷醯胺。
  242. 如申請專利範圍第237項至第241項中任一項之核酸，其進一步包含啟動子。
  243. 如申請專利範圍第237項至第242項中任一項之核酸，其中該核酸為活體外轉錄之核酸。
  244. 如申請專利範圍第237項至第243項中任一項之核酸，其中該核酸進一步包含編碼聚(A)尾之序列。
  245. 如申請專利範圍第237項至第244項中任一項之核酸，其中該核酸進一步包含3'UTR序列。
  246. 一種載體，其包含編碼如申請專利範圍第227項至第236項中任一項之TFP之核酸分子。
  247. 如申請專利範圍第246項之載體，其中該載體係選自由以下組成之群：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體、勞氏肉瘤病毒(RSV)載體或反轉錄病毒載體。
  248. 如申請專利範圍第246項或第247項之載體，其進一步包含啟動子。
  249. 如申請專利範圍第246項至第248項中任一項之載體，其中該載體為活體外轉錄之載體。
  250. 如申請專利範圍第246項至第249項中任一項之載體，其中該載體中之核酸序列進一步包含聚(A)尾。
  251. 如申請專利範圍第246項至第250項中任一項之載體，其中該載體中之核酸序列進一步包含3'UTR。
  252. 一種細胞，其包含如申請專利範圍第194項至第225項中任一項之重組核酸分子、如申請專利範圍第226項之多肽分子、如申請專利範圍第227項至第236項中任一項之TFP分子、如申請專利範圍第237項至第245項中任一項之核酸、如申請專利範圍第246項至第251項中任一項之載體。
  253. 如申請專利範圍第252項之細胞，其中該細胞為人類T細胞。
  254. 如申請專利範圍第253項之細胞，其中該人類T細胞為CD8+或CD4+ T細胞。
  255. 如申請專利範圍第252項至第254項中任一項之細胞，其進一步包含編碼抑制性分子之核酸，該抑制性分子包含第一多肽，該第一多肽包含抑制性分子之至少一部分，該抑制性分子之至少一部分與包含細胞內信號傳導結構域之正信號的第二多肽締合。
  256. 如申請專利範圍第255項之細胞，其中該抑制性分子包含第一多肽及第二多肽，該第一多肽包含PD1之至少一部分，該第二多肽包含共刺激結構域及一級信號傳導結構域。
  257. 一種人類CD8+或CD4+ T細胞，其包含至少兩種TFP分子，該等TFP分子包含抗IL13Rα2結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，其中該TFP分子能夠與人類CD8+或CD4+ T細胞中、處及/或表面上之內源TCR複合物及/或至少一種內源TCR多肽在功能上相互作用。
  258. 一種蛋白質複合物，其包含：
    i)TFP分子，其包含抗IL13Rα2結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域；及
    ii)至少一種內源TCR次單元或內源TCR複合物。
  259. 如申請專利範圍第258項之蛋白質複合物，其中該TCR包含選自由以下組成之群的蛋白質的細胞外結構域或其一部分：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元。
  260. 如申請專利範圍第258項或第259項之蛋白質複合物，其中該抗 IL13Rα2結合結構域係藉由連接子序列連接至該TCR細胞外結構域。
  261. 如申請專利範圍第260項之蛋白質複合物，其中該連接子區包含(G4S)n，其中n=1至4(SEQ ID NO：107)。
  262. 一種蛋白質複合物，其包含
    (a)由如申請專利範圍第194項至第225項中任一項之重組核酸分子編碼之TFP，及
    (b)至少一種內源TCR次單元或內源TCR複合物。
  263. 一種蛋白質複合物，其包含：
    iii)TFP分子，其包含抗IL13Rα2結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域；及
    iv)至少一種內源TCR次單元或內源TCR複合物。
  264. 如申請專利範圍第263項之蛋白質複合物，其中該TCR包含選自由以下組成之群的蛋白質的細胞外結構域或其一部分：TCR α鏈、TCR β鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元及CD3δ TCR次單元。
  265. 如申請專利範圍第263項或第264項之蛋白質複合物，其中該抗IL13Rα2結合結構域係藉由連接子序列連接至該TCR細胞外結構域。
  266. 如申請專利範圍第265項之蛋白質複合物，其中該連接子區包含(G4S)n，其中n=1至4(SEQ ID NO：107)。
  267. 一種人類CD8+或CD4+ T細胞，其包含每種如申請專利範圍第258項至第266項中任一項之蛋白質複合物至少兩種不同的TFP蛋白質。
  268. 一種人類CD8+或CD4+ T細胞，其包含由如申請專利範圍第194項至第225項中任一項之重組核酸分子編碼的至少兩種不同的TFP分子。
  269. 一種人類CD8+或CD4+ T細胞群體，其中該群體之該等T細胞 個別或共同包含至少兩種TFP分子，該等TFP分子包含抗IL13Rα2結合結構域、TCR細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域，其中該TFP分子能夠與該人類CD8+或CD4+ T細胞中、處及/或表面上之內源TCR複合物及/或至少一種內源TCR多肽在功能上相互作用。
  270. 一種人類CD8+或CD4+ T細胞群體，其中該群體之該等T細胞個別或共同包含至少兩種由如申請專利範圍第194項至第225項中任一項之重組核酸分子編碼之TFP分子。
  271. 一種製造細胞之方法，其包括用如申請專利範圍第194項至第225項中任一項之重組核酸分子、如申請專利範圍第237項至第245項中任一項之核酸或如申請專利範圍第246項至第251項中任一項之載體對T細胞進行轉導。
  272. 一種產生RNA工程化細胞群體之方法，其包括將活體外轉錄之RNA或合成RNA引入細胞中，其中該RNA包含編碼如申請專利範圍第227項至第236項中任一項之重組TFP分子的核酸。
  273. 一種在哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性之方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之如申請專利範圍第194項至第225項中任一項之重組核酸分子、如申請專利範圍第226項之多肽分子、表現如申請專利範圍第226項之多肽分子的細胞、如申請專利範圍第227項至第236項中任一項之重組TFP分子、如申請專利範圍第237項至第245項中任一項之核酸、如申請專利範圍第246項至第251項中任一項之載體或如申請專利範圍第252項至第257項及第267項至第270項中任一項之細胞。
  274. 如申請專利範圍第273項之方法，其中該細胞為自體T細胞。
  275. 如申請專利範圍第273項之方法，其中該細胞為同種異體T細 胞。
  276. 如申請專利範圍第273項至第275項中任一項之方法，其中該哺乳動物為人類。
  277. 一種治療患有與IL13Rα2表現相關之疾病的哺乳動物的方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之如申請專利範圍第194項至第225項中任一項之分離之核酸分子、如申請專利範圍第226項之多肽分子、表現如申請專利範圍第226項之多肽分子的細胞、如申請專利範圍第227項至第236項中任一項之重組TFP分子、如申請專利範圍第237項至第245項中任一項之核酸、如申請專利範圍第246項至第251項中任一項之載體或如申請專利範圍第252項至第257項及第267項至第270項中任一項之細胞。
  278. 如申請專利範圍第277項之方法，其中該與IL13Rα2表現相關之疾病係選自由以下組成之群：增殖性疾病、癌症、惡性病、骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群、白血病前期、與IL13Rα2表現相關之非癌症相關適應症。
  279. 如申請專利範圍第277項之方法，其中該疾病為胰臟癌、卵巢癌、乳癌或其任何組合。
  280. 如申請專利範圍第277項之方法，其中該等表現TFP分子之細胞係與使表現TFP分子之細胞之效力增加的劑組合投與。
  281. 如申請專利範圍第277項至第280項中任一項之方法，其中與投與有效量之表現抗IL13Rα2嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的哺乳動物相比，該哺乳動物中釋放更少細胞介素。
  282. 如申請專利範圍第277項至第281項中任一項之方法，其中該等表現TFP分子之細胞係與改善一或多種與投與表現TFP分子之細胞相關之 副作用的劑組合投與。
  283. 如申請專利範圍第277項至第282項中任一項之方法，其中該等表現TFP分子之細胞係與治療與IL13Rα2相關之疾病的劑組合投與。
  284. 如申請專利範圍第194項至第225項中任一項之重組核酸分子、如申請專利範圍第226項之多肽分子、表現如申請專利範圍第226項之多肽分子的細胞、如申請專利範圍第227項至第236項中任一項之重組TFP、如申請專利範圍第237項至第245項中任一項之核酸、如申請專利範圍第246項至第251項中任一項之載體、如申請專利範圍第258項至第266項中任一項之複合物或如申請專利範圍第252項至第257項及第267項至第270項中任一項之細胞，其係用作藥物。
  285. 一種治療患有與IL13Rα2表現相關之疾病的哺乳動物的方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之如申請專利範圍第194項至第225項中任一項之重組核酸分子、如申請專利範圍第226項之多肽分子、表現如申請專利範圍第226項之多肽分子的細胞、如申請專利範圍第227項至第236項中任一項之重組TFP分子、如申請專利範圍第237項至第245項中任一項之核酸、如申請專利範圍第246項至第251項中任一項之載體或如申請專利範圍第252項至第257項及第267項至第270項中任一項之細胞，其中與投與有效量之表現抗IL13Rα2嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的哺乳動物相比，該哺乳動物中釋放更少細胞介素。
  286. 一種治療患有包含表現IL13Rα2之細胞之實體腫瘤之哺乳動物的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量之如申請專利範圍第194項至第225項中任一項之重組核酸分子、如申請專利範圍第226項之多肽分子、表現如申請專利範圍第226項之多肽分子的細胞、如申請專利範圍第227項 至第236項中任一項之重組TFP分子、如申請專利範圍第237項至第245項中任一項之核酸、如申請專利範圍第246項至第251項中任一項之載體或如申請專利範圍第252項至第257項及第267項至第270項中任一項之細胞，其中該腫瘤之體積得以減小或該腫瘤之生長受到抑制。
  287. 一種在哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性之方法，其包括向該哺乳動物投與有效量之經編碼T細胞受體(TCR)融合蛋白(TFP)之重組核酸分子轉導之T細胞群體，該T細胞受體融合蛋白包含
    (a)TCR次單元，其包含
    (i)TCR細胞外結構域之至少一部分，及
    (ii)TCR細胞內結構域，其包含來自細胞內信號傳導結構域之刺激結構域；及
    (b)人類或人類化抗體結構域，其包含抗原結合結構域抗間皮素結合結構域；其中該TCR次單元及該抗體結構域可操作地連接，其中該TFP當表現於T細胞中時併入TCR中，且其中該T細胞群體優先殺死與具有較低間皮素表現之腫瘤細胞隔開的具有較高間皮素表現之腫瘤細胞。
  288. 如申請專利範圍第287項之方法，其中該TCR次單元進一步包含TCR跨膜結構域。
  289. 如申請專利範圍第287項或第288項之方法，其中該TCR細胞外結構域、該TCR跨膜結構域及該TCR細胞內結構域來源於TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRγ鏈、TCRδ鏈、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
  290. 如申請專利範圍第287項或第288項之方法，其中該TCR次單元之該TCR細胞外結構域、該TCR跨膜結構域及該TCR細胞內結構域來源於TCR複合物之單一次單元，其中該單一次單元為TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRγ 鏈、TCRδ鏈、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
  291. 如申請專利範圍第287項至第290項中任一項之方法，其中該TCR細胞內信號傳導結構域來源於CD3ε或CD3γ。
TW108126642A 2018-07-26 2019-07-26 使用靶特異性融合蛋白進行ｔｃｒ再程式化之組合物及方法 TW202023580A (zh)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862703834P 2018-07-26 2018-07-26
US201862703824P 2018-07-26 2018-07-26
US62/703,834 2018-07-26
US62/703,824 2018-07-26
US201862725066P 2018-08-30 2018-08-30
US62/725,066 2018-08-30
US201862727459P 2018-09-05 2018-09-05
US201862727469P 2018-09-05 2018-09-05
US62/727,469 2018-09-05
US62/727,459 2018-09-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202023580A true TW202023580A (zh) 2020-07-01

Family

ID=69181995

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108126642A TW202023580A (zh) 2018-07-26 2019-07-26 使用靶特異性融合蛋白進行ｔｃｒ再程式化之組合物及方法

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20210315933A1 (zh)
EP (1) EP3827013A4 (zh)
JP (1) JP2021530503A (zh)
KR (1) KR20210049816A (zh)
CN (1) CN113039197A (zh)
AU (1) AU2019312358A1 (zh)
BR (1) BR112021001338A2 (zh)
CA (1) CA3106559A1 (zh)
MX (1) MX2021001009A (zh)
SG (1) SG11202100838QA (zh)
TW (1) TW202023580A (zh)
WO (1) WO2020023888A2 (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3298033B2 (en) 2015-05-18 2023-07-12 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and medical uses for tcr reprogramming using fusion proteins
EP3494138A1 (en) 2016-08-02 2019-06-12 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
DK3445787T3 (da) 2016-10-07 2021-03-01 Tcr2 Therapeutics Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til omprogrammering af t-cellereceptorer under anvendelse af fusionsproteiner
AU2017363311A1 (en) 2016-11-22 2019-06-13 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
WO2022006451A2 (en) * 2020-07-02 2022-01-06 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins and pd-1 antibodies
CN111925990B (zh) * 2020-09-02 2022-08-26 北京立康生命科技有限公司 一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞及其制备方法
EP4263590A1 (en) 2020-12-21 2023-10-25 Allogene Therapeutics, Inc. Protease-activating cd45-gate car
WO2022165233A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Allogene Therapeutics, Inc. KNOCKDOWN OR KNOCKOUT OF ONE OR MORE OF TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP AND RFXANK TO MITIGATE T CELL RECOGNITION OF ALLOGENEIC CELL PRODUCTS
WO2023133424A2 (en) * 2022-01-05 2023-07-13 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins and anti-pd-1 fusion peptides
US20240042030A1 (en) 2022-07-29 2024-02-08 Allogene Therapeutics, Inc. Engineered cells with reduced gene expression to mitigate immune cell recognition
CN117736335A (zh) * 2022-09-20 2024-03-22 深圳先进技术研究院 靶向间皮素和nkg2d配体的双靶向car-t细胞及其应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6822082B2 (en) * 2000-06-30 2004-11-23 Zymogenetics, Inc. Polynucleotides for mammalian secreted protein, Z1055G2P
WO2004041865A2 (en) * 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
ES2621874T3 (es) * 2010-03-26 2017-07-05 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Anticuerpos para MUC16 y métodos de uso de los mismos
WO2012008860A2 (en) * 2010-07-16 2012-01-19 Auckland Uniservices Limited Bacterial nitroreductase enzymes and methods relating thereto
EP3145954A1 (en) * 2014-05-23 2017-03-29 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Anti- egfr conformational single domain antibodies and uses thereof
EP3250609A4 (en) * 2015-01-26 2018-07-11 The University of Chicago Il13ra alpha 2 binding agents and use thereof in cancer treatment
EP3298033B2 (en) * 2015-05-18 2023-07-12 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and medical uses for tcr reprogramming using fusion proteins
AU2017363311A1 (en) * 2016-11-22 2019-06-13 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
US11965021B2 (en) * 2017-04-26 2024-04-23 Eureka Therapeutics, Inc. Cells expressing chimeric activating receptors and chimeric stimulating receptors and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020023888A3 (en) 2020-07-30
CN113039197A (zh) 2021-06-25
EP3827013A4 (en) 2022-05-25
AU2019312358A1 (en) 2021-02-11
JP2021530503A (ja) 2021-11-11
BR112021001338A2 (pt) 2021-05-04
CA3106559A1 (en) 2020-01-30
EP3827013A2 (en) 2021-06-02
SG11202100838QA (en) 2021-02-25
WO2020023888A2 (en) 2020-01-30
MX2021001009A (es) 2021-07-02
US20210315933A1 (en) 2021-10-14
KR20210049816A (ko) 2021-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7262535B2 (ja) 融合タンパク質を用いたｔｃｒの再プログラミングのための組成物及び方法
TWI790213B (zh) 用於使用融合蛋白之tcr重編程的組合物及方法
JP7109789B2 (ja) 融合タンパク質を使用したｔｃｒの再プログラム化のための組成物及び方法
JP7291396B2 (ja) 融合タンパク質を用いたｔｃｒの再プログラミングのための組成物及び方法
US20210079057A1 (en) Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
TW202023580A (zh) 使用靶特異性融合蛋白進行ｔｃｒ再程式化之組合物及方法
JP2022188163A (ja) がん治療用に操作されたｔ細胞
CN111954714A (zh) 使用融合蛋白进行tcr重编程的组合物和方法
WO2022006451A2 (en) Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins and pd-1 antibodies
TW202026006A (zh) 使用融合蛋白進行tcr再程式化之組成物及方法
WO2022056321A1 (en) Compositions and methods for tcr reprogramming using gpc3 specific fusion proteins
WO2021133959A2 (en) Compositions and methods for gamma delta tcr reprogramming using fusion proteins
CN114828862A (zh) 使用融合蛋白进行tcr重编程的组合物和方法
US20240117002A1 (en) Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
WO2022232277A1 (en) COMPOSITIONS AND METHODS FOR TCR REPROGRAMMING USING FUSION PROTEINS AND TGFβR SWITCH
WO2022056304A1 (en) Compositions and methods for tcr reprogramming using nectin-4 specific fusion proteins
WO2021226289A2 (en) Compositions and methods for tcr reprogramming using cd70 specific fusion proteins
WO2023034220A2 (en) Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins and cxcr6
WO2023133424A2 (en) Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins and anti-pd-1 fusion peptides
WO2023172967A2 (en) Compositions and methods for tcr reprogramming using gpc3 specific fusion proteins