KR20210049816A - 표적 특이적 융합 단백질을 사용하는 tcr 리프로그래밍을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

표적 특이적 융합 단백질을 사용하는 tcr 리프로그래밍을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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패트릭 알렉산더 바우엘르
로버트 호프메이스터
다니엘 겟츠
바니아 애쉬미노바
지안 딩
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티씨알2 테라퓨틱스 인크.
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Abstract

본원에서 T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP), 하나 이상의 MUC16 또는 IL13Rα2 또는 MSLN TFP를 발현하도록 조작된 T 세포, 및 암을 포함하는 질환의 치료를 위한 이의 사용 방법이 제공된다.

Description

표적 특이적 융합 단백질을 사용하는 TCR 리프로그래밍을 위한 조성물 및 방법
본 출원은 2018년 7월 26일 출원된 U.S 가특허 출원 번호 제62/703,824호, 2018년 8월 30일 출원된 U.S. 가특허 출원 번호 제62/725,066호, 2018년 7월 26일 출원된 U.S. 가특허 출원 번호 제62/703,834호, 2018년 9월 5일 출원된 U.S. 가특허 출원 번호 제62/727,469호, 및 2018년 9월 5일 출원된 U.S. 가특허 출원 번호 제62/727,459호의 이익을 주장하며, 이들 문헌 각각은 전문이 본원에 참조로 편입된다.
대부분의 말기 고형암 환자는 표준 요법으로는 불치이다. 게다가, 통상적인 치료 옵션(option)은 종종 심각한 부작용을 갖는다. 암 면역요법으로서 포괄적으로 지칭되는 접근법인, 환자의 면역 시스템이 암성 세포를 거부하는 데 관여하도록 하는 수많은 시도들이 되어 왔다. 그러나, 여러 가지 장애물이 임상적 효과를 달성하는 것을 상당히 어렵게 만든다. 수백 개의 소위 종양 항원이 식별되었지만, 이들은 종종 그 자신으로부터 유래되고 이에 따라 건강한 조직에 대한 암 면역요법을 지시할 수 있거나, 또는 불충분하게 면역원성이다. 더욱이, 암 세포는 다수의 메커니즘을 사용하여 그들 자신을 보이지 않게 하거나 암 면역요법에 의한 면역 공격의 개시 및 전파를 어렵게 한다.
유전적으로 조작된 T 세포를 암 세포 상의 적합한 세포-표면 분자로 재지시(redirecting)하는 것에 의존하는, 키메릭 항원 수용체(CAR) 변형된 자가 T 세포 요법을 사용하는 최근의 개발은 면역 시스템의 힘을 활용하여 B 세포 악성종양을 치료하는 데 있어 전도유망한 결과를 나타낸다(예를 들어, Sadelain et al., Cancer Discovery 3:388-398(2013) 참조). CD-19-특이적 CAR-T 세포(CTL019라고 불리움)을 이용한 임상적 결과는 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 앓고 있는 환자들에서뿐만 아니라 소아 급성 림프구성 백혈병(ALL)에서도 완전한 차도를 나타내었다(예를 들어, Kalos et al., Sci Transl Med 3:95ra73(2011), Porter et al., NEJM 365:725-733(2011), Grupp et al., NEJM 368:1509-1518(2013) 참조). 대안적인 접근법은 자가 T 세포를 유전적으로 조작하기 위해 종양-연관 펩티드 항원에 대해 선택된 T 세포수용체(TCR) 알파 및 베타 쇄(chain)의 사용이다. 이들 TCR 쇄는 완전한 TCR 복합체를 형성하고 제2 정의된 특이성에 대한 TCR이 있는 T 세포를 제공할 것이다. 유망한 결과는 윤활암종(synovial carcinoma) 환자에서 NY-ESO-1-특이적 TCR 알파 및 베타 쇄를 발현하는, 조작된 자가 T 세포를 이용해 수득되었다.
시험관내/생체외에서 개별적인 표적 세포를 인식하고 파괴하는 CAR 또는 제2 TCR을 발현하는 유전적으로 변형된 T 세포의 능력에 비해, 조작된 T 세포를 이용한 성공적인 환자 요법은 T 세포가 강한 활성, 팽창, 시간에 따른 지속을 할 수 있도록, 및, 질환이 재발하는 경우에, '기억' 반응을 할 수 있기를 요구한다. 현재 CAR-T 세포의 높은 및 관리가능한 임상적 효능은 BCMA- 및 CD-19-양성 B 세포 악성종양에 및 HLA-A2를 발현하는 NY-ESO-1-펩티드 발현 윤활 육종 환자에 제한되어 있다. 다양한 인간 악성종양에 대해 보다 넓게 작용하기 위해 유전적으로 조작된 T 세포를 개선할 분명한 필요가 있다.
T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP), 하나 이상의 TFP를 발현하도록 조작된 T 세포, 및 질환의 치료를 위한 이의 사용 방법이 본원에서 제공된다.
일 양태에 따르면, (I) 인간 대상체로부터의 T 세포; 및 (II) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 제공되며, 여기서 T 세포는, (a) (i) TCR 세포외 도메인(domain)의 적어도 부분, (ii) TCR 막관통 도메인, 및 (iii) 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인(stimulatory domain)을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛(subunit); 및 (b) 항-MUC16 결합 도메인, 항-IL13Rα2 결합 도메인 또는 항-메소텔린(MSLN) 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인;을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하고; 여기서 TCR 서브유닛 및 항원 결합 도메인은 작동가능하게 연결되고; 여기서 TFP는 T 세포에서 발현될 때 TCR과 기능적으로 상호작용한다.
일부 구현예에서, T 세포는 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 항원을 발현하는 세포에 대해, TFP를 함유하지 않은 T 세포와 비교하여 증가된 세포독성을 나타낸다.
일부 구현예에서, TCR 서브유닛의 TCR 세포외 도메인, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타로부터 유래된다.
일부 구현예에서, TCR 서브유닛의 TCR 세포외 도메인, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 복합체의 단일 서브유닛으로부터 유래되고, 여기서 단일 서브유닛은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타이다.
일 양태에 따르면, (I) 인간 대상체로부터의 T 세포; 및 (II) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 제공되며, 여기서 T 세포는 (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, (ii) 막관통 도메인, 및 (iii) 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및 (b) 항-MUC16 결합 도메인, 항-IL13Rα2 결합 도메인 또는 항-메소텔린(MSLN) 결합 도메인을 포함하는 scFv 또는 단일 도메인 항체;를 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하고; 여기서 TCR 서브유닛 및 항-MUC16 또는 항-IL13Rα2 또는 항-MSLN 결합 도메인은 작동가능하게 연결되고; 여기서 TCR 서브유닛의 세포외, 막관통, 및 세포내 신호전달 도메인은 TCR 알파 쇄 또는 TCR 베타 쇄 외의 TCR 서브 유닛으로부터만 유래되고; 여기서 TFP는 T 세포에서 발현될 때 TCR과 기능적으로 상호작용하며; 여기서 T 세포는 항-MUC16 또는 항-IL13Rα2 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 항원을 발현하는 세포에 대해, TFP를 함유하지 않은 T 세포와 비교하여 증가된 세포독성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 항-MUC16 또는 항-IL13Rα2 또는 항-MSLN 결합 도메인을 인코딩하는 서열은 링커를 인코딩하는 서열에 의해 TCR 세포외 도메인을 인코딩하는 서열과 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 (G4S)n을 포함하며, 여기서 G는 글라이신이고, S는 세린이고, n은 1 내지 4의 정수이다.
일부 구현예에서, 항-MUC16 결합 도메인은 (a) 중쇄(HC) CDR1 서열 GRTVSSLF, GRAVSSLF, 또는 GDSLDGYV, (b) HC CDR2 서열 ISRYSLYT, 또는 ISGDGSMR, 및 (c) HC CDR3 서열 ASKLEYTSNDYDS, 또는 AADPPTWDY를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-MUC16 결합 도메인은 서열번호 15, 서열번호 20, 서열번호 25, 서열번호 30, 서열번호 35, 또는 서열번호 40의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-IL13Rα2 결합 도메인은 (a) 중쇄(HC) CDR1 서열 GFTSDYYI 또는 GFASDDYI, (b) HC CDR2 서열 ISSKYANT 또는 ISSRYANT, 및 (c) HC CDR3 서열 AADTRRYTCPDIATMHRNFDS 또는 AMDSRRVTCPEISTMHRNFDS를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-IL13Rα2 결합 도메인은 서열번호 51, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 66, 서열번호 71, 또는 서열번호 76의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열 동일성은 6의 워드 크기(word size), BLOSUM62 매트릭스, 11의 존재 페널티(existence penalty) 및 1의 연장(extension) 페널티와 함께 BLAST를 사용하여 결정된다.
일부 구현예에서, 항-MSLN 결합 도메인은 서열번호 97 또는 서열번호 98의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 혈청을 실질적으로 무함유한다. 일부 구현예에서, scFv 또는 단일 도메인 항체는 scFv이다. 일부 구현예에서, scFv 또는 단일 도메인 항체는 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 VH 도메인이다. 일부 구현예에서, 인코딩된 항-TAA 결합 도메인은 항-TAA 결합 도메인을 포함하며, 여기서 T 세포는, (a) (b) CD28 세포외 도메인의 적어도 부분과 작동가능하게 연결된, 항-TAA 결합 도메인 (c) CD28 막관통 도메인 (d) CD28 세포내 도메인의 적어도 부분 및 (e) CD3 제타 세포내 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포보다 큰 또는 효율적인 세포독성 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 인코딩된 TFP 분자는 T 세포에서 발현될 때 내인성 TCR 복합체, 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드, 또는 이들의 조합물과 기능적으로 상호작용한다. 일부 구현예에서, T 세포는 1차 T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 인간 CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 인간 CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 PD-1 및 BTLA로 이루어지는 군으로부터 선택된 억제성 분자의 적어도 부분을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하며, 여기서 억제성 분자의 적어도 부분은 세포내 신호전달 도메인으로부터의 양성 신호를 포함하는 제2 폴리펩티드와 회합된다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 CD28, CD27, ICOS, CD3ζ, 41-BB, OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, 및 B7-H3으로 이루어지는 군으로부터 선택된 단백질로부터의 공자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포에 의한 IL-2 또는 IFNγ의 생산은 항-TAA 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 항원을 발현하는 세포의 존재 시 TFP를 함유하지 않는 T 세포와 비교하여 증가한다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 집단(population)이며, 여기서 집단의 개별적인 T 세포는 적어도 2개의 TFP 분자를 포함하거나, 또는 집단의 적어도 2개의 T 세포는 적어도 2개의 TFP 분자를 포괄적으로 포함하고; 여기서 적어도 2개의 TFP 분자는 항-TAA 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하며; 여기서 적어도 2개의 TFP 분자 중 적어도 하나는 내인성 TCR 복합체, 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드, 또는 이들의 조합물과 기능적으로 상호작용한다. 일부 구현예에서, TCR 서브유닛은 CD3 엡실론으로부터만 유래된다. 일부 구현예에서, TCR 서브유닛은 CD3 감마로부터만 유래된다. 일부 구현예에서, TCR 서브유닛은 CD3 델타로부터만 유래된다.
일 양태에 따르면, (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및 (ii) TCR 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및 (b) 항-TAA 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로 형질도입된 T 세포 집단의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 항-종양 면역원성을 제공하는 방법이 본원에서 제공되며; 여기서 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고, 여기서 TFP는 T 세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입하며, 여기서 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포로 치료된 포유류의 사이토킨 수준과 비교하여 더 낮은 수준의 사이토킨이 치료에 이어 방출된다. 일부 구현예에서, TCR 세포내 신호전달 도메인은 CD3 엡실론 또는 CD3 감마로부터 유래된다. 일부 구현예에서, TCR 서브유닛은 TCR 막관통 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 세포외 도메인, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 델타 쇄, TCR 감마 쇄, CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타로부터 유래된다. 일부 구현예에서, TCR 세포외 도메인, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 복합체의 단일 서브유닛으로부터 유래되며, 여기서 단일 서브유닛은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 델타 쇄, TCR 감마 쇄, CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타이다.
일부 구현예에서, 항체 도메인은 서열번호 15, 서열번호 20, 서열번호 25, 서열번호 30, 서열번호 35, 또는 서열번호 40에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 항-MUC16 VHH 도메인이다. 일부 구현예에서, 항체 도메인은 서열번호 51, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 66, 서열번호 71, 또는 서열번호 76에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 항-IL13Rα2 VHH 도메인이다. 일부 구현예에서, 서열 동일성은 6의 워드 크기, BLOSUM62 매트릭스, 11의 존재 페널티 및 1의 확장 페널티와 함께 BLAST 알고리즘을 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 세포는 자가 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 동종이계 T 세포이다. 일부 구현예에서, 포유류는 인간이다.
일 양태에 따르면, (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및 (ii) CD3 엡실론 또는 CD3 감마의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및 (b) 항-TAA 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로 형질도입된 T 세포 집단의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 종양 연관 항원(TAA)(예를 들어, MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN)의 발현과 연관된 질환을 갖는 포유류를 치료하는 방법이 본원에서 제공되며; 여기서 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고, 여기서 TFP는 T 세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입하며, 여기서 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포로 치료된 포유류의 사이토킨 수준과 비교하여 더 낮은 수준의 사이토킨이 치료에 이어 방출된다.
일부 구현예에서, 항체 도메인은 서열번호 15, 서열번호 20, 서열번호 25, 서열번호 30, 서열번호 35, 또는 서열번호 40에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인이다. 일부 구현예에서, 항체 도메인은 서열번호 51, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 66, 서열번호 71, 또는 서열번호 76에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인이다. 일부 구현예에서, 서열 동일성은 6의 워드 크기, BLOSUM62 매트릭스, 11의 존재 페널티 및 1의 확장 페널티와 함께 BLAST 알고리즘을 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 세포는 자가 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 동종이계 T 세포이다. 일부 구현예에서, TAA 발현과 연관된 질환은 증식성 질환, 암, 악성종양, 및 TAA, 예를 들어, MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN의 발현과 연관된 비-암 관련 징후(non-cancer related indication)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 질환은 교모세포종, 중피종, 콩팥세포암종, 위암(stomach cancer), 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 방광암, 요관암, 신장암, 자궁내막암, 식도암, 위암(gastric cancer), 흉선암종, 담관암종, 위암, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다. 일부 구현예에서, 질환은 교모세포종, 중피종, 유두상 장액성 난소 선암종(papillary serous ovarian adenocarcinoma), 투명 세포 난소암종(clear cell ovarian carcinoma), 혼합 뮐러 난소암종(mixed Mullerian ovarian carcinoma), 자궁내막양 점액성 난소암종(endometroid mucinous ovarian carcinoma), 췌장 선암종, 췌관 선암종(ductal pancreatic adenocarcinoma), 자궁 장액성암종, 폐 선암종, 간외담관암종(extrahepatic bile duct carcinoma), 위 선암종, 식도 선암종, 결장직장 선암종, 유방 선암종, MUC16 발현과 연관된 질환, IL13Rα2 발현과 연관된 질환, MSLN 발현과 연관된 질환, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암이다. 일부 구현예에서, TFP 분자를 발현하는 세포는 TFP 분자를 발현하는 세포의 효능을 증가시키는 제제와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 주어진 사이토킨의 경우, 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포로 치료된 포유류의 주어진 사이토킨의 양과 비교하여 적어도 10% 미만 양의 주어진 사이토킨이 치료에 이어 방출된다. 일부 구현예에서, 주어진 사이토킨은 IL-2, IFN-γ, IL-4, TNF-α, IL-6, IL-13, IL-5, IL-10, sCD137, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토킨을 포함한다. 일부 구현예에서, 포유류에서의 종양 성장은, 종양의 크기가 치료의 적어도 8일 후 TFP를 발현하지 않는 T 세포로 치료된 포유류에서의 종양의 크기의 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 또는 최대 60%이도록 억제되며, 여기서 TFP를 발현하는 T 세포로 치료된 포유류 및 TFP를 발현하지 않는 T 세포로 치료된 포유류는 치료 전 동일한 종양 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 포유류에서의 종양 성장은 완전히 억제된다. 일부 구현예에서, 포유류에서의 종양 성장은 적어도 20일, 적어도 30일, 적어도 40일, 적어도 50일, 적어도 60일, 적어도 70일, 적어도 80일, 적어도 90일, 적어도 100일, 또는 그 이상 동안 완전히 억제된다. 일부 구현예에서, TFP로 형질도입된 T 세포의 집단은 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포와 비교하여 유사한 양의 종양 세포를 사멸시킨다. 일부 구현예에서, TFP로 형질도입된 T 세포의 집단은 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포와 상이한 유전자 발현 프로파일(profile)을 갖는다. 일부 구현예에서, 유전자의 발현 수준은 TFP로 형질도입된 T 세포에서 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포에서의 유전자의 발현 수준과 상이하다. 일부 구현예에서, 유전자는 항원 제시, TCR 신호전달, 항상성, 물질대사, 케모카인 신호전달, 사이토킨 신호전달, 톨 유사 수용체 신호전달, MMP 및 접착 분자 신호전달, 또는 TNFR 관련 신호전달에서 기능을 갖는다.
일 양태에 따르면, (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및 (ii) CD3 엡실론의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및 (b) 항-TAA 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;을 포함하는 T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자가 본원에서 제공되며; 여기서 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고, 여기서 TFP는 T-세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입한다.
일 양태에 따르면, (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및 (ii) CD3 감마의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및 (b) 항-TAA 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;을 포함하는 T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자가 본원에서 제공되며; 여기서 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고, 여기서 TFP는 T-세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입한다.
일 양태에 따르면, (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및 (ii) CD3 델타의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및 (b) 항-TAA 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;을 포함하는 T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자가 본원에서 제공되며; 여기서 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고, 여기서 TFP는 T-세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입한다.
일 양태에 따르면, (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및 (ii) TCR 알파의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및 (b) 항-TAA 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;을 포함하는 T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자가 본원에서 제공되며; 여기서 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고, 여기서 TFP는 T-세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입한다.
일 양태에 따르면, (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및 (ii) TCR 베타의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및 (b) 항-TAA 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;을 포함하는 T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자가 본원에서 제공되며; 여기서 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고, 여기서 TFP는 T-세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입한다.
일부 구현예에서, 항체 도메인은 인간 또는 인간화된(humanized) 항체 도메인이다. 일부 구현예에서, 인코딩된 항원 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인과 연결된다. 일부 구현예에서, 인코딩된 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 1 내지 4이다. 일부 구현예에서, TCR 서브유닛은 TCR 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 서브유닛은 TCR 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 서브유닛은 TCR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 서브유닛은 (i) TCR 세포외 도메인, (ii) TCR 막관통 도메인, 및 (iii) TCR 세포내 도메인을 포함하고, 여기서 (i), (ii), 및 (iii) 중 적어도 2개는 동일한 TCR 서브유닛으로부터의 것이다. 일부 구현예에서, TCR 서브유닛은 CD3 엡실론, CD3 감마 또는 CD3 델타의 세포내 신호전달 도메인으로부터 선택되는 자극 도메인, 또는 서열에 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 서브유닛은 4-1BB의 기능성 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능성 신호전달 도메인으로부터 선택되는 자극 도메인, 또는 서열에 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 도메인은 항체 단편(fragment)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 도메인은 scFv 또는 VH 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 (a) 중쇄(HC) CDR1 서열 GRTVSSLF, GRAVSSLF, 또는 GDSLDGYV, (b) HC CDR2 서열 ISRYSLYT, 또는 ISGDGSMR, 및 (c) HC CDR3 서열 ASKLEYTSNDYDS, 또는 AADPPTWDY를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 (a) 중쇄(HC) CDR1 서열 GFTSDYYI 또는 GFASDDYI, (b) HC CDR2 서열 ISSKYANT 또는 ISSRYANT, 및 (c) HC CDR3 서열 AADTRRYTCPDIATMHRNFDS 또는 AMDSRRVTCPEISTMHRNFDS를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 서열번호 15, 서열번호 20, 서열번호 25, 서열번호 30, 서열번호 35, 또는 서열번호 40에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 항체 도메인은 서열번호 51, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 66, 서열번호 71, 또는 서열번호 76에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인이다. 일부 구현예에서, 서열 동일성은 6의 워드 크기, BLOSUM62 매트릭스, 11의 존재 페널티 및 1의 확장 페널티와 함께 BLAST 알고리즘을 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, TFP는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 부분, 및 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는 TCR 서브유닛의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 인코딩된 TFP는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인, 및 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 인코딩된 TFP는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 제타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인, 및 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 공자극 도메인을 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 공자극 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 및 4-1BB(CD137)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질, 및 서열에 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로부터 수득되는 기능성 신호전달 도메인이다. 일부 구현예에서, 서열에의 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형은 세포 신호전달 또는 TFP에의 리간드 결합에 반응하여 인산화되는 아미노산의 변형을 매개하는 아미노산의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 mRNA이다. 일부 구현예에서, TFP는, CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, TCR 제타 쇄, Fc 엡실론 수용체 1 쇄, Fc 엡실론 수용체 2 쇄, Fc 감마 수용체 1 쇄, Fc 감마 수용체 2a 쇄, Fc 감마 수용체 2b1 쇄, Fc 감마 수용체 2b2 쇄, Fc 감마 수용체 3a 쇄, Fc 감마 수용체 3b 쇄, Fc 베타 수용체 1 쇄, TYROBP(DAP12), CD5, CD16a, CD16b, CD22, CD23, CD32, CD64, CD79a, CD79b, CD89, CD278, CD66d, 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM; Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) 또는 이의 부분, 및 서열에 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는 TCR 서브유닛의 ITAM을 포함한다. 일부 구현예에서, ITAM은 CD3 감마, CD3 델타, 또는 CD3 엡실론의 ITAM을 대체한다. 일부 구현예에서, ITAM은 CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되며 CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 ITAM을 대체한다. 일부 구현예에서, 핵산은 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 변형된 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 잠금 핵산(locked nucleic acid; LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1',5'-안히드로헥시톨 핵산(HNA), 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 및 2'-플루오로 N3-P5'-포스포아미다이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산 분자는 리더(leader) 서열을 추가로 포함한다.
일 양태에 따르면, 본원에 기재된 재조합 핵산 분자에 의해 인코딩되는 재조합 폴리펩티드 분자가 본원에서 제공된다.
일 양태에 따르면, 항-TAA 결합 도메인(예를 들어, MUC16, IL13Ra2, 또는 MSLN 결합 도메인), TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 재조합 TFP 분자가 본원에서 제공된다.
일 양태에 따르면, 항-TAA 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 재조합 TFP 분자가 본원에서 제공되며, 여기서 TFP 분자는 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용할 수 있다.
일 양태에 따르면, 항-TAA 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 재조합 TFP 분자가 본원에서 제공되며, 여기서 TFP 분자는 내인성 TCR 복합체 내로 기능적으로 통합될 수 있다.
일부 구현예에서, 재조합 TFP 분자는 항-MUC16, 항-IL13Rα2, 또는 항-MSLN 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인은 scFv, VHH 또는 VH 도메인이다.
일부 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인은 서열번호 15, 서열번호 20, 서열번호 25, 서열번호 30, 서열번호 35, 또는 서열번호 40의 아미노산 서열에 대해 95-100% 동일성을 갖는 중쇄, 이의 기능성 단편, 또는 적어도 하나 그러나 30개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인은 서열번호 51, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 66, 서열번호 71, 또는 서열번호 76의 아미노산 서열에 대해 95-100% 동일성을 갖는 중쇄, 이의 기능성 단편, 또는 적어도 하나 그러나 30개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 서열 동일성은 6의 워드 크기, BLOSUM62 매트릭스, 11의 존재 페널티 및 1의 확장 페널티와 함께 BLAST 알고리즘을 사용하여 결정된다.
일부 구현예에서, 재조합 TFP 분자는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 부분, 및 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는 TCR 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인과 연결된다. 일부 구현예에서, 링커 영역은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 1 내지 4이다.
일 양태에 따르면, TFP를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 본원에서 제공된다.
일부 구현예에서, 핵산은 DNA 및 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 핵산은 mRNA이다. 일부 구현예에서, 핵산은 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 변형된 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1',5'-안히드로헥시톨 핵산(HNA), 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 및 2'-플루오로 N3-P5'-포스포아미다이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 핵산은 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 시험관내 전사된 핵산이다. 일부 구현예에서, 핵산은 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 3'UTR 서열을 추가로 포함한다.
일 양태에 따르면, TFP를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터가 본원에서 제공된다.
일부 구현예에서, 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스성 벡터, 라우스 육종 바이러스성(Rous sarcoma viral; RSV) 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 벡터는 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 시험관내 전사된 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터 내 핵산 서열은 폴리(A) 꼬리를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 내 핵산 서열은 3'UTR을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 핵산 분자를 포함하는 세포가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 분자가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, TFP 분자가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 핵산이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 벡터가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD8+ 또는 CD4+ T-세포 또는 CD4+CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 감마 델타 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는, 세포내 신호전달 도메인으로부터의 양성 신호를 포함하는 제2 폴리펩티드와 회합된, 억제성 분자의 적어도 부분을 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하는 억제성 분자를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 억제성 분자는 PD1의 적어도 부분, 및 공자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함한다.
일 양태에 따르면, 적어도 2개의 TFP 분자를 포함하는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포가 본원에서 제공되며, TFP 분자는 항-TAA 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하고, 여기서 TFP 분자는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 표면 내에서, 표면에서 및/또는 표면 상에서 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용할 수 있다.
일 양태에 따르면: (a) 항-TAA 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 TFP 분자; 및 (b) 적어도 하나의 내인성 TCR 서브유닛 또는 내인성 TCR 복합체를 포함하는 단백질 복합체가 본원에서 제공된다.
일부 구현예에서, TCR은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인과 연결된다. 일부 구현예에서, 링커 영역은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 1 내지 4이다.
일 양태에 따르면, (a) 본원에서 개시된 임의의 재조합 핵산 분자에 의해 인코딩된 TFP, 및 (b) 적어도 하나의 내인성 TCR 서브유닛 또는 내인성 TCR 복합체를 포함하는 단백질 복합체가 본원에서 제공된다.
일 양태에 따르면: (a) 항-TAA 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 TFP 분자; 및 (b) 적어도 하나의 내인성 TCR 서브유닛 또는 내인성 TCR 복합체를 포함하는 단백질 복합체가 본원에서 제공된다.
일부 구현예에서, TCR은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인과 연결된다. 일부 구현예에서, 링커 영역은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 1 내지 4이다.
일 양태에 따르면, 단백질 복합체 당 적어도 2개의 상이한 TFP 단백질을 포함하는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포가 본원에서 제공된다.
일 양태에 따르면, 본원에 기재된 단리된 핵산 분자에 의해 인코딩된 적어도 2개의 상이한 TFP 분자를 포함하는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포가 본원에서 제공된다.
일 양태에 따르면, 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 집단이 본원에서 제공되며, 여기서 집단의 T-세포는 적어도 2개의 TFP 분자를 개별적으로 또는 포괄적으로 포함하고, TFP 분자는 항-TAA 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하며, 여기서 TFP 분자는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 표면 내에서, 표면에서 및/또는 표면 상에서 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용할 수 있다.
일 양태에 따르면, 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 집단이 본원에서 제공되며, 여기서 집단의 T-세포는 본원에 기재된 재조합 핵산 분자에 의해 인코딩된 적어도 2개의 TFP 분자를 개별적으로 또는 포괄적으로 포함한다.
일 양태에 따르면, 본원에 기재된 재조합 핵산 분자, 본원에 기재된 핵산, 또는 본원에 기재된 벡터로 T-세포를 형질도입하는 단계를 포함하는, 세포를 만드는 방법이 본원에서 제공된다.
일 양태에 따르면, 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, RNA-조작된 세포의 집단을 생성하는 방법이 본원에서 제공되며, 이때 RNA는 본원에 기재된 TFP 분자를 인코딩하는 핵산을 포함한다.
일 양태에 따르면, 본원에 기재된 재조합 핵산 분자, 본원에 기재된 폴리펩티드 분자, 본원에 기재된 폴리펩티드 분자를 발현하는 세포, 본원에 기재된 TFP 분자, 본원에 기재된 핵산, 본원에 기재된 벡터, 또는 본원에 기재된 세포의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 항-종양 면역원성을 제공하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 세포는 자가 T-세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 동종이계 T-세포이다. 일부 구현예에서, 포유류는 인간이다.
일 양태에 따르면, 단리된 핵산 분자, 본원에 기재된 폴리펩티드 분자, 폴리펩티드 분자를 발현하는 세포, 본원에 기재된 TFP 분자, 핵산, 벡터, 또는 본원에 기재된 세포의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN의 발현과 연관된 질환을 갖는 포유류를 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN 발현과 연관된 질환은 증식성 질환, 암, 악성종양, 골수형성이상증, 골수형성이상 증후군, 전백혈병, MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN의 발현과 연관된 비-암 관련 징후로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 질환은 췌장암, 난소암, 유방암, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, TFP 분자를 발현하는 세포는 TFP 분자를 발현하는 세포의 효능을 증가시키는 제제와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 항-TAA 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T-세포의 유효량이 투여된 포유류와 비교하여 더 적은 사이토킨이 포유류에서 방출된다. 일부 구현예에서, TFP 분자를 발현하는 세포는 TFP 분자를 발현하는 세포의 투여와 연관된 하나 이상의 부작용을 개선하는 제제와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, TFP 분자를 발현하는 세포는 TAA, 예를 들어 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN과 연관된 질환을 치료하는 제제와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 의약(medicament)로서 사용하기 위한 폴리펩티드 분자, 폴리펩티드 분자를 발현하는 세포, 재조합 TFP, 핵산, 벡터, 복합체, 또는 세포.
일 양태에 따르면, 의약으로서 사용하기 위한, TFP를 인코딩하는 재조합 핵산 분자, TFP의 폴리펩티드 분자, TFP의 폴리펩티드 분자를 발현하는 세포, 재조합 TFP, TFP를 인코딩하는 핵산, TFP를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 단백질 복합체, 또는 세포가 본원에서 제공된다. 일 양태에 따르면, 재조합 핵산 분자, 폴리펩티드 분자, 폴리펩티드 분자를 발현하는 세포, 재조합 TFP 분자, 핵산, 벡터, 또는 세포의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN의 발현과 연관된 질환을 갖는 포유류를 치료하는 방법이 본원에서 제공되며, 여기서 항-TAA 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T-세포의 유효량이 투여된 포유류와 비교하여 더 적은 사이토킨이 포유류에서 방출된다.
일 양태에 따르면, (I) 인간 대상체로부터의 T 세포; 및 (II) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 제공되며, 여기서 T 세포는 (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, (ii) TCR 막관통 도메인, 및 (iii) 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및 (b) 항-IL13Rα2 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하고; 여기서 TCR 서브유닛 및 항-IL13Rα2 결합 도메인은 작동가능하게 연결되고; 여기서 TFP는 T 세포에서 발현될 때 TCR과 기능적으로 상호작용한다. 일부 구현예에서, TCR 서브유닛의 TCR 세포외, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론, CD3 델타, 또는 CD3 감마로부터 유래된다. 일부 구현예에서, TCR 서브유닛의 TCR 세포외 도메인, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 복합체의 단일 서브유닛으로부터 유래되며, 여기서 단일 서브유닛은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타이다. 일부 구현예에서, T 세포는 항-IL13Rα2 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 항원을 발현하는 세포에 대해, TFP를 함유하지 않은 T 세포와 비교하여 증가된 세포 독성을 나타낸다.
일 양태에 따르면, TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및 항-메소텔린 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인을 포함하는 T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로 형질도입된 T 세포의 집단의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 항-종양 면역원성을 제공하는 방법이 본원에서 제공되며; 여기서 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고, 여기서 TFP는 T-세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입하며, 여기서 T 세포의 집단은 더 낮은 메소텔린 발현을 하는 종양 세포와 구획된 더 높은 메소텔린 발현을 하는 종양 세포를 우선적으로 사멸시킨다.
일부 구현예에서, TCR 서브유닛은 TCR 막관통 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, TCR 세포외 도메인, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타로부터 유래된다. 일부 구현예에서, TCR 서브유닛의 TCR 세포외 도메인, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 복합체의 단일 서브유닛으로부터 유래되며, 여기서 단일 서브유닛은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타이다. 일부 구현예에서, TCR 세포내 신호전달 도메인은 CD3 엡실론 또는 CD3 감마로부터 유래된다.
참조에 의한 편입
이 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은, 각각의 개별적인 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 특이적으로 및 개별적으로 참조로 편입되도록 나타내어지는 것처럼 동일한 정도로 본원에 참조로 편입된다.
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도 1은 실시예 IL13Rα2 클론 서열을 묘사한다.
도 2는 Pall Forte Bio Dip & Read AHC 에피토프 비닝(binning) 검정이 수행되었던 방법을 예시하는 도표이다. AHC 바이오센서 팁을, 그후에 이의 Fv 도메인을 통해 항원 펩티드("Ag", 예를 들어, MUC16, IL13Ra2, MSLN)에 결합된 Fc 도메인을 통해 4H11 scFv-Fc 항체(4H11)와 커플링(coupling)하였다. 그후에 sdAbs(Ab2)를 100 nM으로 각각 첨가하여 항원에의 결합에 대한 4H11 scFv-Fc 항체와의 경쟁을 평가하였다.
도 3a는 항-IL13Rα2 나노바디(nanobody)의 시험관내 활성을 시험하는 종양 세포 용해 검정으로부터의 데이터를 묘사한다.
도 3b는 TFP T 세포의 IFNγ 및 IL-2 생산을 유도하는 능력을 나타내는 실험 데이터를 묘사한다.
도 3c는 항-IL13Rα2 나노바디의 시험관내 활성을 시험하는 종양 세포 용해 검정으로부터의 실험 데이터를 묘사한다.
도 3d는 TFP T 세포의 IFNγ 및 IL-2 생산을 유도하는 능력을 나타내는 실험 데이터를 묘사한다.
도 3e는 항-IL13Rα2 나노바디의 시험관내 활성을 시험하는 종양 세포 용해 검정으로부터의 실험 데이터를 묘사한다.
도 3f는 TFP T 세포의 IFNγ 및 IL-2 생산을 유도하는 능력을 나타내는 실험 데이터를 묘사한다.
도 4는 IL13Rα2-TFP T 세포의 효능을 시험하는 IL13Rα2 U251 GBM 모델로부터의 실험 데이터를 묘사한다. 그래프는 NGS 마우스 내로 5 x 106개의 U251 세포를 피하 주사하고 뒤이어 4일 뒤 1 x 107개의 IL13Rα2-TFP T 세포를 정맥내 투입한 후 시간에 따라 캘리퍼(caliper)에 의해 측정된 평균 종양 용적을 나타낸다.
도 5a-c는 모(라마) 및 인간화된 항-MUC16 단일 쇄 항체(VHH)의 결합 친화도(binding affinity)의 적정 및 측정을 나타낸다. 도 5a는 실시예 5에서 생산된 VHH 바인더(binder)가 NTA 바이오센서(니켈 코팅된 표면)을 사용하여 스크리닝되는 실험 절차를 예시하는 도표이다. His-태그된 MUC16 sdAb(3.25 ㎍/ml)을 바이오센서에 결합시키고, MUC16 펩티드를 0, 1.56, 6.25, 25, 50, 100 또는 200 nM의 농도로 첨가한다. 완충액: 1X Octet; 30℃에서 0.02% Tween® 20을 함유하는 1x Corning® Cellgro® PBS(카탈로그 21-040-CM). 센서: Pall Forte Bio Dip & Read(카탈로그 18-5102). 도 5b(클론 R3Mu4 모 및 인간화된 변이체) 및 도 5c(클론 R3Mu29 모 및 인간화된 변이체)는 MUC16 표적에 대한 sdAb의 결합 속도론(binding kinetics)을 나타낸다(또한 표 1 참조). 이들 곡선은 각각의 단백질에 대해 결합 친화도 상수를 유도하고 항원 결합에 대한 인간화의 효과를 평가하는 데 사용하였다.
도 6a-c는 양성 대조군으로서 사용된 MUC-16 특이적 scFv-Fc 도구 바인더 4H11과의 비교 시 항-MUC16 sdAb의 에피토프 비닝을 나타낸다. 도 6a는 도 2에서 IL13Rα2 바인더에 대해 나타난 바와 같이, Pall Forte Bio Dip & Read AHC 에피토프 비닝 검정이 수행된 방법을 예시하는 도표이다. AHC 바이오센서 팁을, 그후에 이의 Fv 도메인을 통해 MUC16 항원 펩티드(Ag)에 결합된 Fc 도메인을 통해 4H11 scFv-Fc 항체(4H11)와 커플링하였다. 그후에 sdAbs(Ab2)를 100 nM으로 각각 첨가하여 MUC16 항원에의 결합에 대한 4H11 scFv-Fc 항체와의 경쟁을 평가하였다. 도 6b에 나타난 바와 같이, MUC16 sdAb - 모(라마) R3Mu4 및 모(라마) R3Mu29는 4H11 도구 바인더가 이미 MUC16 펩티드에 결합한 후 MUC16 펩티드에 결함함을 나타내며, 이는 모 sdAb가 4H11 scFv-Fc 도구 바인더와 비교하여 MUC16 펩티드의 상이한 에피토프를 인식하고 비닝함을 입증한다. 항원(MUC16 펩티드)이 없는 음성 대조군은 결합을 나타내지 않았으며, 이는 비-특이적 결합의 임의의 기회를 제외한다. 도 6c는 MUC16 엑토도메인(ectodomain) 서열의 맥락에서 관련있는 항체의 에피토프를 묘사한다.
도 7은 TCR 서브유닛 및 항-MUC16 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 발현하는 T 세포에 의한 MUC16-엑토도메인("MUC16ecto") 발현 세포의 용량-의존적 용해의 그래프를 나타낸다. T 세포는 용량 의존적 방식으로 MUC16 형성과 연관된 C-말단 세포를 과발현하도록 형질도입된 SKVO3-MUC16Cterm 난소암 세포를 특이적으로 사멸한 반면, 모 SKOV3 MUC16-음성 세포는 T 세포 매개 사멸을 피했다. 마찬가지로, MUC16-TFP를 발현하는 T 세포는 MUC16의 세포-회합 형태를 과발현하는 OVCAR3-MUC16-Cterm 세포를 제거하였다. 낮은 수준의 MUC16을 발현하는 모 OVCAR3 세포는 가장 높은 TFP-T 세포-대-표적 세포 비율에서만 사멸되었다. 마찬가지로, TFP-T 세포는 MUC16이 표적 세포 상에 존재할 때만 사이토킨을 방출하였는데, 이는 단일-도메인 항체의 특이성을 뒷받침한다.
도 8은 높고 낮은 수준의 MUC16을 발현하는 난소 세포주를 사용한 세포 검정에서의 MUC16-TFP의 효능(potency)을 나타내는 실시예 실험 데이터를 묘사한다. 이들 연구에서, MUC16-TFP는 종양 세포 표면 상의 MUC16의 수준에 의존하는 우선적인 사멸 능력을 갖는 것으로 관찰되었다. 보다 정확하게는, MUC16-TFP는 용량 의존적인 방식으로 높은 MUC16 발현 종양 세포를 사멸시키는 것으로 관찰된 반면, 낮은 MUC16 발현 세포의 MUC16-TFP 사멸은 이들 검정에서 사용된 용량 수준에서 관찰되지 않았다.
도 9a-b는 유동-세포분석법-기반 MUC16ecto 사본 수 정량의 결과를 묘사한다. 4H11-PE 항체-염색된 종양 세포를 Quantibrite 비드와 함께 Fortessa® X-20 상에 러닝(running)하였다. 기하 중앙값 형광 강도(geometric median fluorescent intensity; gMFI)를 세포 뿐만 아니라 비드에 대해 계산하였다(도 9a). 비드 스톡(stock)은 비드 당 상이한 수의 PE 분자를 갖도록 제작된 4개 집단(높음, 중간, 낮음, 음성)을 함유한다. 표준 곡선은 각각의 비드 세트에 대해 측정된 MFI에 비교한 비드 당 PE 분자의 주어진 사본에 기반하여 생성하였다. 그후에 종양 세포 상의 MUC16ecto의 사본 수를 비드-생성된 표준 곡선에 기반하여 추정하였다. OVCAR3, OVCAR3-MUC16ecto, SKOV3 및 SKOV3-MUC16ecto 세포 상의 MUC16ecto의 사본은 각각 726, 3616, 39 및 2351개로 결정되었다(도 9b).
도 10a-d는 MUC16 TFP-T 세포에 의한 MUC16ecto 특이적 종양 세포 용해를 나타내는 일련의 그래프를 나타낸다. MUC16 TFP를 발현하는 T 세포는 MUC16의 세포-회합 형태를 과발현하는 SKOV3-MUC16ecto 세포를 특이적으로 사멸시킨 반면(도 10a), 모 SKOV3 세포는 MUC16 TFP를 발현하는 T 세포에 의해 사멸되지 않았다(도 10b). 마찬가지로, MUC16 TFP를 발현하는 T 세포는 MUC16의 세포-회합 형태를 과발현하는 OVCAR3-MUC16ecto 세포를 제거하였다(도 10c). 낮은 수준의 MUC16ecto를 발현하는 모 OVCAR3 세포는 부분적으로만 사멸되었다(도 10d).
도 11a-h는 MUC16 TFP-T 세포에 의한 MUC16ecto 특이적 사이토킨 생산을 나타내는 일련의 그래프를 나타낸다. MUC16 TFP를 발현하는 T 세포는 SKOV3-MUC16ecto 세포(각각 도 11a 및 11e) 또는 OVAR3-MUC16ecto 세포(각각 도 11c 및 11g)와 공-배양될 때 IFN-γ 및 IL-2를 분비하였지만, SKOV3 세포(각각 도 11b 및 11f) 또는 OVCAR3 세포(각각 도 11d 및 11h)와 공-배양될 때는 그렇지 않았다.
도 12는 MUC16-TFP를 발현하는 T 세포의 MUC16ecto 특이적 증식을 묘사한다. MUC16-TFP T 세포의 MUC16ecto 특이적 증식은 유세포 분석법(flow cytometry) 분석에 의해 T 세포 추적(tracing) 신호의 희석(CellTrace™의 신호 강도가 감소)을 모니터링함으로써 결정하였다. MUC16-TFP를 발현하는 T 세포는 CellTrace™ Far Red Proliferation Kit(카탈로그 번호 C34564ThermoFisher)로 표지하였고, 그후에 3일 동안 1-대-1 비율로 SKOV3 또는 SKOV3-MUC16ecto 세포와 공배양하였다. CellTrace Far Red Proliferation 키트로 표지된 MUC16-TFP를 발현하는 T 세포는 또한 3일 동안 배지 단독으로 또는 1 ㎍/mL 플레이트-결합된 항-CD3 항체(클론 OKT-3, 카탈로그 번호 14-0037-82, Invitrogen)로 자극하였다. MUC16-TFP를 발현하는 T 세포는 MUC16ecto-특이적 증식을 나타내었는데, 이는 SKOV3-MUC16ecto 세포와 공배양할 때 CellTrace 신호의 감소, 그러나 SKOV3 세포와 공배양할 때는 그렇지 않은 것에 의해 입증되었다(도 12).
도 13a-c는 MUC16-TFP T 세포의 생체내 활성을 나타내는 일련의 그래프를 묘사한다. MUC16-TFP를 발현하는 T 세포는 인간 난소암종 세포주, SKOV3-MUC16ecto 세포 및 OVCAR3-MUC16ecto 세포의 NSG 마우스 이종이식(xenograft) 모델에서 평가하였다. SKOV3-MUC16ecto 세포의 복강내 모델에서, MUC16 TFP 1은 0일(T 세포 주사 날)의 기준치 수준과 비교 시 종양 부담의 현저한 감소를 나타내었다(도 13a). 일관되게, MUC16 TFP1은 SKOV3-MUC16ecto 세포의 피하 모델에서, NT T 세포와 비교했을 때 종양 성장을 현저하게 지연시켰다(도 13b). OVCAR3-MUC16ecto 세포의 복강내 모델에서, MUC16 TFP1 및 MUC16 TFP2 둘 다는 마우스로부터 종양을 완전히 제거하였다(도 13c).
도 14a-b는 MSTO-MSLNhigh 또는 MSTO-MSLNlow 종양 중 어느 하나를 지닌 NSG 마우스에서 MSLN-TFP T 세포의 MSLN 높은(MSTO-MSLNhigh, 11006개의 사본의 표면 MSLN) 및 MSLN 낮은 종양(MSTO-MSLNlow, 198개의 사본 표면 MSLN)에 대한 차별적인 사멸 능력을 나타내는 2개의 그래프이다. 종양을 지닌 마우스에 비-형질도입된 T 세포(NT, 1x107개의 총 T 세포) 또는 MSLN-TFP T 세포(1x107개의 총 T 세포)를 정맥내 주사하였다. MSLN-TFP T 세포는, NT T 세포 치료된 마우스와 비교하여, MSLN 높은 종양의 성장을 극적으로 제어하였다(도 14a). 반면에, MSLN-TFP T 세포 치료된, MSLN 낮은 종양이 있는 마우스에서는 제한된 항-종양 반응이 관찰되었다(도 14b).
현존하는 접근법의 한계를 극복할 잠재력을 갖는, CD3 엡실론, CD3 감마 및 CD3 델타를 포함하는 TCR 서브유닛의, 및 세포 표면 항원에 특이적인 결합 도메인이 있는 TCR 알파 및 TCR 베타 쇄의 신규한 융합 단백질이 본원에 기재된다.
CAR보다 효율적으로 표적 세포를 사멸시키지만, CAR와 비슷하거나 낮은 수준의 전-염증성 사이토킨을 방출하는 신규한 융합 단백질이 본원에 개시된다. 이들 융합 단백질 및 이들의 사용 방법은, CAR에 비해 T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)에 대한 이점을 나타내는데, 상승된 수준의 이들 사이토킨은 입양 CAR-T 요법(adoptive CAR-T therapy)에 대한 용량-제한 독성과 연관되었기 때문이다.
일 양태에서, TCR 서브유닛 및 항-종양 연관 항원(TAA) 결합 도메인(예를 들어, IL13Ra2, MUC16, 또는 MSLN 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)를 인코딩하는 단리된 핵산 분자가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 항체 도메인은 인간 또는 인간화된 항체 도메인이다. 일부 구현예에서, TCR 서브유닛은 TCR 세포외 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, TCR 서브유닛은 TCR 막관통 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, TCR 서브유닛은 TCR 세포내 도메인을 포함한다. 추가의 구현예에서, TCR 서브유닛은 (i) TCR 세포외 도메인, (ii) TCR 막관통 도메인, 및 (iii) TCR 세포내 도메인을 포함하며, 여기서 (i), (ii), 및 (iii) 중 적어도 2개는 동일한 TCR 서브유닛으로부터의 것이다. 또 추가의 구현예에서, TCR 서브유닛은 CD3 엡실론, CD3 감마 또는 CD3 델타의 세포내 신호전달 도메인으로부터 선택되는 자극 도메인, 또는 서열에 적어도 1개, 2개 또는 3개의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함한다. 또 추가의 구현예에서, TCR 서브유닛은 4-1BB의 기능성 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능성 신호전달 도메인으로부터 선택되는 자극 도메인, 또는 서열에 적어도 1개, 2개 또는 3개의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 (i) 본원에서 제공되는 임의의 항-TAA 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 경쇄(LC) CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3, 및/또는 (ii) 본원에서 제공되는 임의의 항-TAA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 중쇄(HC) CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 본원에서 제공되는 임의의 항-TAA 중쇄 항체 또는 단일 도메인 항체의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다. 예를 들어, 중쇄 항체 또는 단일 도메인 항체는 낙타 과(Camelidae family)의 동물에서 발견될 수 있다. 우제류(artiodactyla) 문의, 낙타아목(Tylopoda) 아목의 낙타 과(낙타: 단봉 카멜루스 드로메다리에스(one-humped Camelus dromedaries) 및 쌍봉 카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus); 라마: 라마(Lama glama), 과나코(Lama guanicoe), 비쿠냐(Lama vicugna); 알파카: 비쿠냐 파코스(Vicugna pacos))는 그들의 혈청 중 고전적 항체(classical antibody)에 더하여 특별한 유형의 항체를 갖는다. 중쇄 항체(HCAb)라고 불리는 이들 항체는 그들의 전체 경쇄 및 제1 중쇄 불변 영역(CH1) 부재의 점에서 독특하다. 낙타과(camelid) 중-쇄 단독 항체(cAb)와 유사한 항체가 또한 수염상어과(wobbegong), 너스 샤크(nurse shark) 및 스팟티드 랫피쉬(spotted ratfish)에서도 또한 발견되었다.
일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 본원에서 제공되는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1개, 2개 또는 3개의 변형 그러나 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 본원에서 제공되는 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 본원에서 제공되는 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1개, 2개 또는 3개의 변형 그러나 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 본원에서 제공되는 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, TFP는 T 세포 수용체의 알파 또는 베타 쇄, CD3 델타, CD3 엡실론, 또는 CD3 감마, 또는 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 부분, 또는 서열에 적어도 1개, 2개 또는 3개의 변형 그러나 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR 서브유닛의 세포외 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 인코딩된 TFP는 TCR의 알파, 베타 쇄 또는 TCR 서브유닛 CD3 엡실론, CD3 감마 및 CD3 델타, 또는 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인, 또는 서열에 적어도 1개, 2개 또는 3개의 변형 그러나 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 인코딩된 TFP는 TCR의 알파, 베타 또는 제타 쇄, 또는 CD3 엡실론, CD3 감마, CD3 델타, CD45, CD2, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 및 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 인코딩된 TFP는 서열에 적어도 1개, 2개 또는 3개의 변형 그러나 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 막관통 도메인을 포함하며, 여기서 단백질은 TCR의 알파, 베타 또는 제타 쇄, 또는 CD3 엡실론, CD3 감마, CD3 델타, CD45, CD2, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 및 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 인코딩된 항-TAA 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인과 연결된다. 일부 경우에서, 인코딩된 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 1 내지 4이다. 일부 경우에서, 인코딩된 링커 서열은 긴 링커(LL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 인코딩된 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 2 내지 4이다. 일부 경우에서, 인코딩된 링커 서열은 짧은 링커(SL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 인코딩된 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 1 내지 3이다.
일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 공자극 도메인을 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 공자극 도메인은 DAP10, DAP12, CD30, LIGHT, OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 및 4-1BB(CD137)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질, 또는 서열에 적어도 1개, 2개 또는 3개의 변형 그러나 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열로부터 수득된 기능성 신호전달 도메인이다.
일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 리더 서열을 추가로 포함한다.
이전에 기재된 핵산 분자 중 임의의 것에 의해 인코딩된 단리된 폴리펩티드 분자가 본원에서 또한 제공된다.
또다른 양태에서, 항-TAA 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는, 단리된 T 세포 수용체 융합 단백질(TFP) 분자가 본원에서 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 단리된 TFP 분자는 인간 또는 인간화된 항-TAA 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인은 인간 또는 인간화된 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인은 인간화되지 않는다. 일부 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인은 낙타 항체 또는 이의 항체 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 도메인은 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 도메인은 scFv, 단일-도메인 항체(sdAb), 또는 VH 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 또는 인간화된 항체 도메인은 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 또는 인간화된 항체 도메인은 scFv, 단일-도메인 항체(sdAb), 또는 VH 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인은 scFv, 단일-도메인 항체(sdAb), VHH 또는 VH 도메인이다. 다른 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인은 본원에서 제공되는 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄, 또는 이의 기능성 단편, 또는 본원에서 제공되는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1개, 2개 또는 3개의 변형 그러나 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 본원에서 제공되는 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 TFP 분자는 T 세포 수용체의 알파 또는 베타 쇄, CD3 델타, CD3 엡실론, 또는 CD3 감마로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 부분, 또는 서열에 적어도 1개, 2개 또는 3개의 변형 그러나 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR 세포외 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인과 연결된다. 일부 경우에서, 링커 영역은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 1 내지 4이다. 일부 경우에서, 링커 서열은 긴 링커(LL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 2 내지 4이다. 일부 경우에서, 링커 서열은 짧은 링커(SL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 1 내지 3이다.
일부 구현예에서, 단리된 TFP 분자는 공자극 도메인을 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 단리된 TFP 분자는 세포내 신호전달 도메인을 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 단리된 TFP 분자는 리더 서열을 추가로 포함한다.
이전에 기재된 TFP 분자 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터가 본원에서 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스성 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 벡터는 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 시험관내 전사된 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터 내 핵산 서열은 폴리(A) 꼬리를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 내 핵산 서열은 3'UTR을 추가로 포함한다.
기재된 벡터 중 임의의 것을 포함하는 세포가 본원에서 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포이다. 다른 구현예에서, 세포는 세포내 신호전달 도메인으로부터의 양성 신호를 포함하는 제2 폴리펩티드와 회합된, 억제성 분자의 적어도 부분을 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하는 억제성 분자를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 경우에서, 억제성 분자는 PD1의 적어도 부분을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 공자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
또다른 양태에서, 항-TAA 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 단리된 TFP 분자가 본원에서 제공되며, 여기서 TFP 분자는 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인은 인간 또는 인간화된 항-TAA 결합 도메인이다.
또다른 양태에서, 항-TAA 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 단리된 TFP 분자가 본원에서 또한 제공되며, 여기서 TFP 분자는 내인성 TCR 복합체 내로 기능적으로 통합될 수 있다.
또다른 양태에서, 적어도 2개의 TFP 분자를 포함하는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T 세포가 본원에서 제공되며, TFP 분자는 인간 또는 인간화된 항-TAA 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하고, 여기서 TFP 분자는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 표면 내에서, 표면에서 및/또는 표면 상에서 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용할 수 있다.
또다른 양태에서, i) 인간 또는 인간화된 항-TAA 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 TFP 분자; 및 ii) 적어도 하나의 내인성 TCR 복합체를 포함하는 단백질 복합체가 본원에서 제공된다.
일부 구현예에서, TCR은 T 세포 수용체의 알파 또는 베타 쇄, CD3 델타, CD3 엡실론, 또는 CD3 감마로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인과 연결된다. 일부 경우에서, 링커 영역은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 1 내지 4이다. 일부 경우에서, 링커 서열은 긴 링커(LL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 2 내지 4이다. 일부 경우에서, 링커 서열은 짧은 링커(SL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 1 내지 3이다.
기재된 단백질 복합체 중 임의의 것 당 적어도 2개의 상이한 TFP 단백질을 포함하는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T 세포가 본원에서 또한 제공된다.
또다른 양태에서, 인간 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 집단이 본원에서 제공되며, 여기서 집단의 T 세포는 적어도 2개의 TFP 분자를 개별적으로 또는 포괄적으로 포함하고, TFP 분자는 인간 또는 인간화된 항-TAA 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하며, 여기서 TFP 분자는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 표면 내에서, 표면에서 및/또는 표면 상에서 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용할 수 있다.
또다른 양태에서, 인간 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 집단이 본원에서 제공되며, 여기서 집단의 T 세포는 본원에서 제공되는 단리된 핵산 분자에 의해 인코딩된 적어도 2개의 TFP 분자를 개별적으로 또는 포괄적으로 포함한다.
또다른 양태에서, 기재된 벡터 중 임의의 것으로 T 세포를 형질도입하는 단계를 포함하는, 세포를 만드는 방법이 본원에서 제공된다.
또다른 양태에서, 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, RNA-조작된 세포의 집단을 생성하는 방법이 본원에서 제공되며, 이때 RNA는 기재된 TFP 분자 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
또다른 양태에서, 기재된 TFP 분자 중 임의의 것을 발현하는 세포의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 항-종양 면역원성을 제공하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 세포는 자가 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 동종이계 T 세포이다. 일부 구현예에서, 포유류는 인간이다.
또다른 양태에서, 기재된 TFP 분자 중 임의의 것을 포함하는 세포의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 종양 연관 항원(TAA)(예를 들어, MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN)의 발현과 연관된 질환을 갖는 포유류를 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, TAA(예를 들어, MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN) 발현과 연관된 질환은 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성종양 또는 전암성 병태, 예컨대 췌장암, 난소암, 위암, 중피종, 폐암, 또는 자궁내막암으로부터 선택되거나, TAA(예를 들어, MUC16, IL13Rα2, MSLN)의 발현과 연관된 비-암 관련 징후이다.
일부 구현예에서, 기재된 TFP 분자 중 임의의 것을 발현하는 세포는, TFP 분자를 발현하는 세포의 투여와 연관된 하나 이상의 부작용을 개선하는 제제와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 기재된 TFP 분자 중 임의의 것을 발현하는 세포는 TAA(예를 들어, MUC16, IL13Rα2, MSLN)와 연관된 질환을 치료하는 제제와 조합하여 투여된다.
의약으로서 사용하기 위한, 기재된 단리된 핵산 분자 중 임의의 것, 기재된 단리된 폴리펩티드 분자 중 임의의 것, 기재된 단리된 TFP 중 임의의 것, 기재된 단백질 복합체 중 임의의 것, 기재된 벡터 중 임의의 것 또는 기재된 세포 중 임의의 것이 본원에서 또한 제공된다.
정의
달리 정의되지 않는한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
용어 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭한다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약"은, 상황에 의존하여 및 당업자에 의해 공지된 또는 공지가능한 플러스 또는 마이너스 1 미만, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 또는 30 퍼센트 초과를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "대상체" 또는 "대상체들" 또는 "개체"는, 이에 제한되지는 않으나, 포유류, 예컨대, 인간 또는 비-인간 포유류, 예를 들어, 사육된, 농업용 또는 야생, 동물, 뿐만 아니라 새, 및 수생 동물을 포함할 수 있다. "환자"는 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있거나 이의 발병 위험이 있거나 달리 본원에서 제공되는 조성물 및 방법이 필요한 대상체이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 병태의 치료 또는 개선에서 성공의 임의의 표시를 지칭한다. 치료하는 것은, 예를 들어, 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소, 지연 또는 경감시키는 것을 포함할 수 있거나, 이것은 질환, 결함, 장애, 또는 유해한 병태, 등의 증상이 환자에 의해 경험되는 빈도를 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "치료하다 또는 예방하다"는 질환 또는 병태의 치료 또는 개선의 일부 수준을 유발하는 방법을 지칭하기 위해 본원에서 때때로 사용되며, 전적으로 병태의 예방을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 그 목적을 향한 결과의 범위를 고려한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "예방하는"은 환자에서, 질환 또는 병태, 예를 들어, 종양 형성의 예방을 지칭한다. 예를 들어, 종양 또는 다른 형태의 암의 발병 위험이 있는 개체가 본 발명의 방법으로 치료되고 종양 또는 다른 형태의 암이 나중에 발병하지 않는 경우에, 그러면 질환은 그 개체에서 적어도 일정 기간에 걸쳐 예방되어 왔다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료적 유효량"은 유익한 효과를 제공하기에 또는 달리 조성물이 투여되는 개체에 해로운 비-유익한 이벤트를 감소시키기에 충분한 조성물 또는 이의 활성 성분의 양이다. "치료적으로 효과적인 용량"이라는 것은 본원에서, 그것이 투여되는 하나 이상의 목적하는 또는 바람직한(예를 들어, 유익한) 효과를 생산하는 용량을 의미하고, 이러한 투여는 주어진 기간에 걸쳐 1회 이상 발생한다. 정확한 용량은 치료의 목적에 의존할 것이고, 공지된 기술(예를 들어, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999); 및 Pickar, Dosage Calculations(1999) 참조)을 사용하여 당업자에 의해 확인가능할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질" 또는 "TFP"는, 일반적으로 i) 표적 세포 상에서 표면 항원에 결합할 수 있고 ii) 전형적으로 T-세포의 표면 내에 또는 표면 상에 공-위치된 경우, 온전한 TCR 복합체의 다른 폴리펩티드 성분과 상호작용할 수 있는 TCR을 포함하는 다양한 폴리펩티드로부터 유래된 재조합 폴리펩티드를 포함한다. "TFP T 세포"는 본원에 개시된 방법에 따라서 형질도입된 및 예를 들어, 천연 TCR 내로 혼입된 TFP를 발현하는 T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 CD4+/CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, TFP T 세포는 NK 세포이다. 일부 구현예에서,
본원에서 사용되는 바와 같이, 뮤신 16 또는 CA125(암 항원 125, 암종 항원 125, 또는 탄수화물 항원 125)으로도 또한 공지된 용어 "MUC16"은 인간에서 MUC16 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 지칭한다. MUC16은 뮤신 계열(family) 당단백질의 구성원이며 특이적 유형의 암 또는 양성의 다른 병태가 있는 일부 환자의 혈액 중 상승될 수 있는 종양 마커 또는 바이오마커로서의 적용법을 발견하였다. MUC16은 난소암 검출에 대한 바이오마커로서 사용되며 자궁내막암, 나팔관암, 폐암, 유방암 및 위장암을 포함하는 다른 암에서 증가되는 것으로 발견되었다. MUC16은 암 세포에 대한 면역 반응에서 자연 살해 세포의 활성을 억누르는 것으로 또한 나타났다(예를 들어, Patankar et al., Gynecologic Oncology 99(3); 704-13 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, 분화 213A2(CD213A2)의 클러스터(cluster)로서 또한 공지된 용어 "IL13Rα2"는 인간에서 IL13Rα2 유전자에 의해 인코딩된 막-결합 단백질을 지칭한다. IL13Rα2은 인터류킨 13 수용체 복합체의 서브유닛이며 IL13 단백질의 수용체이다. IL13Rα2은 췌장, 난소, 흑색종, 및 악성 신경교종을 포함하는 다양한 암에서 과-발현되는 것으로 발견되었다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "MSLN" 또는 "메소텔린"은 40 kDa 세포-표면 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-연결된 당단백질을 지칭한다. 인간 메소텔린 단백질은 그후에 단백질가수분해적으로 처리되는 69 kD 전구체로서 합성된다. 메소텔린의 30 kD 아미노 말단이 분비되며 거핵구 강화 인자(megakaryocyte potentiating factor)로서 지칭된다(Yamaguchi et al., J. Biol. Chem. 269:805 808, 1994). 40 kD 카복실 말단은 성숙 메소텔린으로서 막에 결합된 채로 유지된다(Chang et al., Natl. Acad. Sci. USA 93:136 140, 1996; Scholler et al., Cancer Lett 247(2007), 130-136). 예시적인 핵산 및 아미노산 메소텔린 서열은 (NCBI 수탁 번호 NM_005823 또는 NCBI 수탁 번호 NM_013404에서 발견되는 MSLN 유전자 전사체로부터 또한 결정될 수 있다. 따라서, 본원에서 개시되는 콘주게이트(conjugate) 작제물이 메소텔린에 대한 참조 항체, 또는 이의 에피토프와의 교차-경쟁에 의해 특정지어지면, 메소텔린은 Scholler et al., Cancer Lett 247(2007), 130-136에 보고된 것이다.
인간 및 뮤린 아미노산 및 핵산 서열은 공공 데이터베이스, 예컨대, GenBank, UniProt 및 Swiss-Prot에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 인간 MUC16의 아미노산 서열은 UniProt/Swiss-Prot 수탁 번호 Q8WXI7로서 발견될 수 있다. 인간 MUC16을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 NM_024690에서 발견될 수 있다. 인간 MUC16 전사물 변이체 X1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 XM_017027486에서 발견될 수 있다. 인간 MUC16 전사물 변이체 X2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 XM_017027487에서 발견될 수 있다. 인간 MUC16 전사물 변이체 X3을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 XM_017027488에서 발견될 수 있다. 인간 MUC16 전사물 변이체 X4를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 XM_017027489에서 발견될 수 있다. 인간 MUC16 전사물 변이체 X5를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 XM_017027490에서 발견될 수 있다. 인간 MUC16 전사물 변이체 X6을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 XM_017027491에서 발견될 수 있다. 인간 MUC16 전사물 변이체 X7을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 XM_017027492에서 발견될 수 있다. 인간 MUC16 전사물 변이체 X8을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 XM_ 017027493에서 발견될 수 있다. 인간 MUC16 전사물 변이체 X9를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 XM_017027494에서 발견될 수 있다. 인간 MUC16 전사물 변이체 X10을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 XM_017027495에서 발견될 수 있다. 인간 MUC16 전사물 변이체 X11을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 XM_017027499에서 발견될 수 있다. 인간 MUC16 전사물 변이체 X12를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 XM_017027500에서 발견될 수 있다. 인간 MUC16 전사물 변이체 X13을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 XM_017027501에서 발견될 수 있다. 일 실시예에서, TFP의 항원-결합 부분은 신경교종 세포, 신경교종 개시 세포, 정상 또는 악성 중피종 세포, 난소암 세포, 췌장 선암종 세포, 또는 편평상피세포암종 세포 상에서 발현되는 바와 같은 MUC16 단백질의 세포외 도메인 내의 에피토프를 인식하고 이에 결합한다.
인간 IL13Rα2의 아미노산 서열은 UniProt/Swiss-Prot 수탁 번호 Q14627로서 발견될 수 있다. 인간 IL13Rα2를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 NM_000640에서 발견될 수 있다. 인간 IL13Rα2 전구체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 수탁 번호 NP_000631에서 발견될 수 있다. 일 실시예에서, TFP의 항원-결합 부분은 신경교종 세포, 신경교종 개시 세포, 정상 또는 악성 중피종 세포, 난소암 세포, 췌장 선암종 세포, 또는 편평상피세포암종 세포 상에서 발현되는 바와 같은 IL13Rα2 단백질의 세포외 도메인 내의 에피토프를 인식하고 이에 결합한다.
용어 "항체"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 항원에 특이적으로 결합하는 단백질, 또는 면역글로불린 분자로부터 유래된 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 항체는 다클론성 또는 단클론성 기원의 온전한 면역글로불린, 또는 이의 단편일 수 있으며, 천연으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다.
용어 "항체 단편" 또는 "항체 결합 도메인"은, 표적, 예컨대, 항원 및 이의 한정된 에피토프에의 항체 단편의 인식 및 특이적 결합을 부여하기에 충분한, 항원 결합 도메인, 즉, 온전한 항체의 항원성 결정 가변 영역을 함유하는, 항체의 적어도 하나의 부분, 또는 이의 재조합 변이체를 지칭한다. 항체 단편의 예는, 이에 제한되지는 않으나, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 단일-쇄(sc)Fv("scFv") 항체 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체("sdAb"라 약칭됨)(VL 또는 VH 중 어느 하나), 낙타과 VHH 도메인, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체를 포함한다.
용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 짧은 가요성의 폴리펩티드 링커를 통해 인접하게 연결되고, 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현될 수 있으며, 여기서 scFv는 이것이 유래되는 온전한 항체의 특이성을 유지한다.
항체에 관하여 "중쇄 가변 영역" 또는 "VH""(또는, 단일 도메인 항체의 경우에, 예를 들어, 나노바디, "VHH")는 프레임워크(framework) 영역으로서 공지된 플랭킹 스트레치(flanking stretch) 사이에 끼워진 3개의 CDR을 함유하는 중쇄의 단편을 지칭하며, 이들 프레임워크 영역은 일반적으로 CDR보다 더욱 고도로 보존되고 CDR을 지지하기 위해 스캐폴드를 형성한다.
명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같이 scFv는, 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단에 관하여, 어느 한 순서로 VL 및 VH 가변 영역을 가질 수 있으며, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 또는 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 본 발명의 TFP 조성물의 부분은, 항원 결합 도메인이, 예를 들어, 단일 도메인 항체 단편(sdAb) 또는 중쇄 항체 HCAb, 뮤린, 인간화된 또는 인간 항체로부터 유래된 단일 쇄 항체(scFv)를 포함하는 인접한 폴리펩티드 쇄의 일부로서 발현되어 다양한 형태로 존재할 수 있다(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). 일 양태에서, 본 개시내용의 TFP 조성물의 항원 결합 도메인은 항체 단편을 포함한다. 추가의 양태에서, TFP는 scFv 또는 sdAb를 포함하는 항체 단편을 포함한다.
용어 "항체 중쇄"는 이들의 자연적으로 발생하는 형태로 항체 분자 내에 존재하는 폴리펩티드 쇄의 2가지 유형 중 보다 큰 것을 지칭하며, 이는 보통 항체가 속하는 부류(class)를 결정한다.
용어 "항체 경쇄"는 이들의 자연적으로 발생하는 형태로 항체 분자 내에 존재하는 폴리펩티드 쇄의 2가지 유형의 보다 작은 것을 지칭한다. 카파("κ") 및 람다("λ") 경쇄는 2개의 주요한 항체 경쇄 이소타입을 지칭한다.
용어 "재조합 항체"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성되는 항체, 예컨대, 예를 들어, 박테리오파지 또는 효모 발현 시스템에 의해 발현된 항체를 지칭한다. 용어는 항체를 인코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성된 그리고 DNA 분자가 항체 단백질, 또는 항체를 명시하는 아미노산 서열을 발현하는 항체를 의미하는 것으로 또한 해석되어야 하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 이용가능하고 당해 기술분야에서 널리 공지된 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득되었다.
용어 "항원" 또는 "Ag"는 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있거나, 달리 면역 반응을 유발시키는 분자를 지칭한다. 이 면역 반응은 항체 생산, 또는 특이적인 면역학적으로-적격 세포의 활성화 중 어느 하나, 또는 둘 다를 수반할 수 있다.
당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 거대분자(macromolecule)가 항원으로서 작용할 수 있다는 사실을 이해할 것이다. 더욱이, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 당업자는, 면역 반응을 끌어내는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 임의의 DNA가 그러므로 그 용어가 본 명세서에서 사용되는 것처럼 "항원"을 인코딩한다는 사실을 이해할 것이다. 더욱이, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해 단독으로 인코딩될 필요가 없다는 사실을 이해할 것이다. 본 개시내용이 하나 초과의 유전자의 부분적인 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니라는 사실 및 이들 뉴클레오티드 서열이 다양한 조합으로 배열되어 목적하는 면역 반응을 끌어내는 폴리펩티드를 인코딩한다는 사실은 너무나 명백하다. 또한, 당업자는 항원이 "유전자"에 의해 전혀 인코딩될 필요가 없다는 사실을 이해할 것이다. 항원은 합성되어 생성될 수 있거나 생물학적 시료로부터 유래될 수 있거나, 폴리펩티드 이외의 거대분자일 수 있다는 사실이 너무나 명백하다. 이러한 생물학적 시료는, 이에 제한되지는 않으나, 조직 시료, 종양 시료, 세포 또는 다른 생물학적 성분이 있는 유체를 포함할 수 있다.
용어 "항-종양 효과"는, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 종양 용적의 감소, 종양 세포의 수의 감소, 전이의 수의 감소, 기대 수명의 증가, 종양 세포 증식의 감소, 종양 세포 생존의 감소, 또는 암성 병태와 연관된 다양한 생리적 증상의 개선을 포함하는, 다양한 수단에 의해 분명해질 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항-종양 효과"는 첫 번째 장소에서의 종양의 발생의 예방 시 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 또한 분명해질 수 있다.
용어 "자가"는 개체 내로 나중에 재-도입되는, 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "동종이계"는 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 상이한 동물 또는 상이한 환자로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 둘 이상의 개체는 하나 이상의 유전자좌(loci)에서의 유전자가 동일하지 않을 때 서로에게 동종이계라고 한다. 일부 양태에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종이계 물질은 항원성으로 상호작용하기 위해 유전자적으로 충분히 다를 수 있다.
용어 "외인성"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
용어 "암"은 비정상적 세포의 급속 및 비제어된 성장에 의해 특징지어지는 질환을 지칭한다. 암세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프 시스템을 통해 신체의 다른 부분으로 확산할 수 있다. 다양한 암의 예는 본원에 기재되며 이에 제한되지는 않으나, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 콩팥암, 간암, 뇌암, 폐암 등을 포함한다.
구절 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN "의 발현과 연관된 질환"은, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성종양 또는 전암성 병태를 포함하는, MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN의 발현과 연관된 질환, 또는 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN을 발현하는 세포와 연관된 병태를 포함한다. 일 양태에서, 암은 교모세포종이다. 일 양태에서, 암은 중피종이다. 일 양태에서, 암은 췌장암이다. 일 양태에서, 암은 난소암이다. 일 양태에서, 암은 뇌암이다. 일 양태에서, 암은 위암이다. 일 양태에서, 암은 폐암이다. 일 양태에서, 암은 자궁내막암이다. MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN의 발현과 연관된 비-암 관련 징후는, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 자가면역 질환(예를 들어, 루푸스, 류마티스성 관절염, 대장염), 염증성 장애(알러지 및 천식), 및 이식을 포함한다.
용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특징에 현저하게 영향을 미치지 않거나 이를 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당해 기술분야에서 공지된 표준 기술, 예컨대, 부위-특이적 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발에 의해 본 발명의 항체 또는 항체 단편 내로 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당해 기술분야에서 정의되었다. 이들 계열은 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하 극성 측쇄(예를 들어, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 있는 아미노산을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 TFP 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 계열로부터 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 변경된 TFP는 본원에 기재된 기능성 검정을 사용하여 시험될 수 있다.
용어 "자극"은 그의 동족(cognate) 리간드가 자극 도메인 또는 자극 분자(예를 들어, TCR/CD3 복합체)에 결합하고 그럼으로써 신호 형질도입 이벤트, 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, TCR/CD3 복합체를 통한 신호 형질도입을 매개함으로써 유도된 1차 반응을 지칭한다. 자극은 특정한 분자의 변경된 발현, 및/또는 세포골격 구조의 재구성, 등을 매개할 수 있다.
용어 "자극 분자" 또는 "자극 도메인"은 T 세포 신호전달 경로의 적어도 일부 양태에 대해 자극 방법으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호전달 서열(들)을 제공하는 T 세포에 의해 발현되는 분자 또는 이의 부분을 지칭한다. 일 양태에서, 1차 신호는, 예를 들어, 펩티드로 로딩된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체와의 결합에 의해 개시되며, 이는 이에 제한되지는 않으나, 증식, 활성화, 분화, 등을 포함하는 T 세포 반응의 매개로 이어진다. 자극성 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열(또한 "1차 신호전달 도메인"으로 지칭됨)은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 "ITAM"으로서 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 본 발명에서 특정한 용도의 것인 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는, 이에 제한되지는 않으나, TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278("ICOS"로서 또한 공지됨) 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 이의 표면 상에서 주조직적합성 복합체(MHC)와 복합체화된 외래 항원을 나타내는 면역 시스템 세포, 예컨대, 부속 세포(예를 들어, B-세포, 수지상 세포, 등)를 지칭한다. T 세포는 그들의 T 세포 수용체(TCR)를 사용하여 이들 복합체를 인식할 수 있다. APC는 항원을 처리하고 그들을 T 세포에 제시한다.
용어가 본원에서 사용되는 바와 같이, "세포내 신호전달 도메인"은 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 TFP 함유 세포, 예를 들어, TFP-발현 T 세포의 면역 효과기(effector) 기능을 촉진시키는 신호를 생성한다. 예를 들어, TFP-발현 T 세포에서, 면역 효과기 기능의 예는, 사이토킨의 분비를 포함하는, 세포용해 활성 및 T 헬퍼 세포 활성을 포함한다. 일 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 1차 세포내 신호전달 도메인은 1차 자극, 또는 항원 의존적 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 일 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 공자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공자극 세포내 신호전달 도메인은 공자극 신호, 또는 항원 독립적 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다.
1차 세포내 신호전달 도메인은 ITAM("면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프")을 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는, 이에 제한되지는 않으나, CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, DAP10 및 DAP12로부터 유래된 것을 포함한다.
용어 "공자극 분자"는 공자극 리간드와 특이적으로 결합하고, 그럼으로써 T 세포에 의한 공자극 반응, 예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 증식을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공자극 분자는 효율적인 면역 반응에 요구될 수 있는 항원 수용체 또는 그들의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공자극 분자는, 이에 제한되지는 않으나 MHC 부류 1 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체, 뿐만 아니라 DAP10, DAP12, CD30, LIGHT, OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18) 및 4-1BB(CD137)를 포함한다. 공자극 세포내 신호전달 도메인은 공자극 분자의 세포내 부분일 수 있다. 공자극 분자는 다음의 단백질 계열 내에서 나타낼 수 있다: TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토킨 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자(SLAM 단백질), 및 활성화 NK 세포 수용체. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 등을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 이것이 유래되는 분자의, 전체 세포내 부분, 또는 전체 네이티브(native) 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 기능성 단편을 포함할 수 있다. 용어 "4-1BB"는 GenBank 수탁 번호 AAA62478.2로서 제공되는 아미노산 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가의 잔기가 있는 TNFR 상계열(superfamily)의 구성원을 지칭하며; "4-1BB 공자극 도메인"은 GenBank 수탁 번호 AAA62478.2의 아미노산 잔기 214-255, 또는 비-인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가의 잔기로서 정의된다.
용어 "인코딩"은 뉴클레오티드(예를 들어, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 한정된 서열 또는 아미노산의 한정된 서열 중 어느 하나를 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 기능하는, 폴리뉴클레오티드 내 뉴클레오티드, 예컨대, 유전자, cDNA, 또는 mRNA의 특이적 서열의 내재적 특성 및 이로부터 초래되는 생물학적 특성을 지칭한다. 이에 따라, 유전자, cDNA, 또는 RNA는, 그 유전자에 대응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템내에서 단백질을 생산하는 경우에 단백질을 인코딩한다. mRNA 서열과 동일하고 서열 목록에 일반적으로 제공되는 뉴클레오티드 서열인 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥 둘 다는 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 인코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 버전을 축퇴시키는 그리고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어구 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전으로 하나 이상의 인트론을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 또한 포함할 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료학적으로 유효량"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 본원에 기재된 바와 같이 특정한 생물학적 또는 치료적 결과를 달성하기에 효과적인, 화합물, 제형, 물질, 또는 조성물의 양을 지칭한다.
용어 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 내부로부터의 또는 내부에서 생산되는 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 외부로부터 도입되거나 외부에서 생산되는 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "발현"은 프로모터에 의해 구동되는 특정한 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.
용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포의 내부에 전달하는 데 사용될 수 있는 물질의 조성물을 지칭한다. 이에 제한되지는 않으나, 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함하는 수많은 벡터가 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이에 따라, 용어 "전달 벡터"는 자체적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 용어는 세포 내로 핵산의 전달을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스성 화합물, 예컨대, 예를 들어, 폴리라이신 화합물, 리포좀, 등을 추가로 포함하는 것으로 또한 해석되어야 한다. 바이러스성 전달 벡터의 예는, 이에 제한되지는 않으나, 아데노바이러스성 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스성 벡터, 렌티바이러스성 벡터, 등을 포함한다.
용어 "발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소(cis-acting element)를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 혼입하는 코스미드, (예를 들어, 노출된 또는 리포좀 내에 함유된) 플라스미드 및 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하여, 당해 기술분야에서 공지된 모든 것을 포함한다.
용어 "렌티바이러스"는 레트로비리다에 과의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특하고; 이들은 숙주 세포의 DNA 내로 유전적 정보의 현저한 양을 전달할 수 있어서, 이들은 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV, 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다.
용어 "렌티바이러스성 벡터"는, Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464(2009)에서 제공되는 바와 같이 특히 자기-불활성화 렌티바이러스성 벡터를 포함하는, 렌티바이러스 게놈의 적어도 부분으로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 임상에서 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 다른 예는, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, Oxford BioMedica로부터의 LENTIVECTOR™ 유전자 전달 기술, Lentigen으로부터의 LENTIMAX™벡터 시스템, 등을 포함한다. 비임상 유형의 렌티바이러스성 벡터가 또한 이용가능하며 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
용어 "상동성" 및 "동일성"은 2개의 중합체성 분자 사이, 예를 들어, 2개의 핵산 분자, 예컨대, 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자 사이, 또는 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 분자 둘 다에서 서브유닛 위치가 동일한 단량체성 서브유닛에 의해 점유될 때; 예를 들어, 2개의 DNA 분자 각각 내의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우에, 그러면 이들은 그 위치에서 상동성이거나 동일하다. 2개의 서열 사이의 상동성은 매칭 또는 상동성 위치의 수의 직접 함수이다; 예를 들어, 2개의 서열 내의 위치의 절반(예를 들어, 길이가 중합체 10개인 서브유닛에서 5개의 위치)가 상동성인 경우에, 2개의 서열은 50% 상동성이다; 위치의 90%(예를 들어, 10개 중 9개)가 매칭되거나 상동성인 경우에, 2개의 서열은 90% 상동성이다.
비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예컨대, 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대개, 인간화된 항체 및 이의 항체 단편은 수령체의 상보성-결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가, 목적하는 특이성, 친화도, 및 수용력을 갖는 비-인간 종(공여체 항체), 예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체되는 인간 면역글로불린(수령체 항체 또는 항체 단편)이다. 일부 경우에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 대응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체/항체 단편은 수령체 항체, 도입된(imported) CDR 또는 프레임워크 서열 중 어디에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 또는 항체 단편 성능을 추가로 개량하고 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체 또는 이의 항체 단편은 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것인데, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 대응하거나 모든 또는 현저한 부분의 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화된 항체 또는 항체 단편은 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 또한 포함할 수 있다. 추가의 세부사항에 대해, Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992 참고.
용어 "인간" 또는 "완전히 인간"은, 전체 분자가 인간 기원의 것이거나 항체 또는 면역글로불린의 인간 형태와 동일한 아미노산 서열로 이루어지는, 면역글로불린, 예컨대, 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
용어 "단리된"은 자연 상태로부터 변경되거나 제거되는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에서 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리되지" 않지만, 그의 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된"다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 비-네이티브 환경 예컨대, 예를 들어, 숙주 세포에서 존재할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 통상적으로 발생하는 핵산 염기에 대해 다음의 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 우리딘을 지칭한다.
용어 "작동가능하게 연결된" 또는 "전사적 제어"는 조절 서열과 후자의 발현을 유발하는 이종성 핵산 서열 사이의 기능성 연결을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 주는 경우에 프로모터는 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 서로 인접할 수 있으며, 예를 들어, 2개의 단백질 코딩 영역을 잇는 데 필요하면, 동일한 해독틀 내에 있다.
용어 면역원성 조성물의 "비경구" 투여는, 예를 들어, 피하(s.c.), 정맥내(i.v.), 근육내(i.m.), 및 흉골내 주사, 종양내, 또는 주입 기술을 포함한다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태 중 어느 하나의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 물질대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 아우른다. 달리 지시되지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 보존적으로 변형된 이의 변이체(예를 들어, 축퇴 코돈 치환), 대립유전자, 오쏘로그, SNP, 및 상보성 서열뿐만 아니라 명백하게 지시된 서열을 또한 함축적으로 아우른다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081(1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608(1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994)).
용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며, 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기로 구성되는 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야만 하며, 단백질의 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 제한을 두지 않는다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 이어진 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어는, 예를 들어, 당해 기술분야에서 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로서 또한 통상적으로 지칭되는, 단쇄, 및 당해 기술 분야에서 많은 유형이 있는, 단백질로서 일반적으로 지칭되는, 장쇄 둘 다를 지칭한다. "폴리펩티드"는, 그중에서도, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 호모다이머, 헤테로다이머, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 또는 이들의 조합물을 포함한다.
용어 "프로모터"는 세포의 전사 기구, 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식된, 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적 전사를 개시할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다.
용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열과 작동가능하게 연결된 유전자 생성물의 발현을 위해 사용될 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 경우에서, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고 다른 경우에서, 이 서열은 유전자 생성물의 발현에 요구되는 인핸서 서열 및 다른 조절 요소를 또한 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은, 예를 들어, 조직 특이적 방식으로 유전자 생성물을 발현하는 것일 수 있다.
용어 "구성적" 프로모터는, 유전자 생성물을 인코딩하거나 지정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 때, 세포의 대부분 또는 모든 생리적 조건 하에 세포 내에서 유전자 생성물이 생산되도록 야기하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "유도성" 프로모터는, 유전자 생성물을 인코딩하거나 지정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 때, 프로모터에 대응하는 유도인자(inducer)가 세포 내에 존재할 때만 실질적으로 세포 내에서 유전자 생성물이 생산되도록 야기하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "조직-특이적" 프로모터는, 유전자에 의해 인코딩되거나 명시되는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 때, 세포가 프로모터에 대응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 실질적으로 세포 내에서 유전자 생성물이 생산되도록 야기하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "링커" 및 "가요성 폴리펩티드 링커"는 scFv의 맥락에서 사용되는 바와 같이 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 함께 연결하기 위해, 단독으로 또는 조합하여 사용되는 아미노산, 예컨대, 글라이신 및/또는 세린 잔기로 이루어지는 펩티드 링커를 지칭한다. 일 구현예에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 Gly/Ser 링커이고 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다. 예를 들어, n = 1, n = 2, n = 3, n = 4, n = 5, n = 6, n = 7, n = 8, n = 9 및 n = 10이다. 일 구현예에서, 가요성 폴리펩티드 링커는, 이에 제한되지는 않으나, (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)3을 포함한다. 또다른 구현예에서, 링커는 (Gly2Ser), (GlySer) 또는 (Gly3Ser)의 다수의 반복부위를 포함한다. (본원에 참고로 편입된) WO2012/138475호에 기재된 링커가 본 발명의 범주 내에 또한 포함된다. 일부 경우에서, 링커 서열은 긴 링커(LL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 2 내지 4이다. 일부 경우에서, 링커 서열은 짧은 링커(SL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 1 내지 3이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 5' 캡(또한 RNA 캡, RNA 7-메틸구아노신 캡 또는 RNA m7G 캡이라고도 불리움)은 전사의 시작 직후 진핵 메신저 RNA의 '선두' 또는 5' 말단에 부가된 변형된 구아닌 뉴클레오티드이다. 5' 캡은 제1 전사된 뉴클레오티드와 연결된 말단기로 이루어진다. 이의 존재는 리보솜에 의한 인식 및 RNase로부터의 보호에 대단히 중요하다. 캡 부가는 전사와 커플링되고, 공-전사적으로 발생하여, 각각이 다른 것에 영향을 미치도록 한다. 전사의 시작 직후, 합성되는 mRNA의 5' 말단은 RNA 폴리머라제와 회합된 캡-합성 복합체에 의해 결합된다. 이 효소 복합체는 mRNA 캡핑에 요구될 수 있는 화학 반응을 촉매화한다. 합성은 다단계 생화학적 반응으로서 진행한다. 캡핑 모이어티는 mRNA의 기능성, 예컨대, 이의 안정성 또는 번역의 효율을 바꾸기 위해 변형될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "시험관내 전사된 RNA"는, 시험관내 합성된, RNA, 바람직하게는 mRNA를 지칭한다. 일반적으로, 시험관내 전사된 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 생성된다. 시험관내 전사 벡터는 시험관내 전사된 RNA를 생성하는 데 사용되는 주형을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리(A)"는 폴리아데닐화에 의해 mRNA에 부착된 일련의 아데노신이다. 일시적 발현을 위한 작제물의 바람직한 구현예에서, 폴리A는 50개 내지 5000개, 바람직하게는 64개 초과, 보다 바람직하게는 100개 초과, 가장 바람직하게는 300개 또는 400개 초과이다. 폴리(A) 서열은 mRNA 기능성, 예컨대, 국재화, 안정성 또는 번역의 효율을 바꾸기 위해 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리아데닐화"는 메신저 RNA 분자에의 폴리아데닐릴 모이어티, 또는 이의 변형된 변이체의 공유결합을 지칭한다. 진핵 유기체에서, 대부분의 메신저 RNA(mRNA) 분자는 3' 말단에서 폴리아데닐화된다. 3' 폴리(A) 꼬리는 효소인 폴리아데닐레이트 폴리머라제의 작용을 통해 미성숙-mRNA(pre-mRNA)에 부가된 아데닌 뉴클레오티드(종종 수백 개)의 긴 서열이다. 고등의 진핵생물에서, 폴리(A) 꼬리는 특이적 서열인 폴리아데닐화 신호를 함유하는 전사체 상에 부가된다. 폴리(A) 꼬리 및 이것에 결합된 단백질은 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 mRNA 보호를 돕는다. 폴리아데닐화는 전사 종료, 핵으로부터의 mRNA의 외수송, 및 번역을 위해 또한 중요하다. 폴리아데닐화는 DNA의 RNA로의 전사 직후 핵에서 발생하지만, 추가적으로 또한 세포질에서 나중에 발생할 수 있다. 전사가 종료된 후, mRNA 쇄는 RNA 폴리머라제와 회합된 엔도뉴클레아제 복합체의 작용을 통해 절단된다. 절단 부위는 절단 부위 근처의 염기 서열 AAUAAA의 존재에 의해 일반적으로 특징지어진다. mRNA가 절단된 후, 아데노신 잔기는 절단 부위에서 유리 3' 말단에 부가된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "일시적"은 시간, 일 또는 주의 기간 동안 비-통합된 이식유전자(transgene)의 발현을 지칭하며, 여기서 발현의 기간은 게놈 내로 통합되거나 숙주 세포에서 안정적인 플라스미드 레플리콘 내에 함유되는 경우에 유전자의 발현에 대한 기간 미만이다.
용어 "신호 형질도입 경로"는 세포의 한 부분에서 세포의 또다른 부분까지 신호의 전송에서 역할을 하는 다양한 신호 형질도입 분자 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. 어구 "세포 표면 수용체"는 신호를 수신하고 세포의 막을 가로질러 신호를 전송할 수 있는 분자 및 분자의 복합체를 포함한다.
용어 "대상체"는 면역 반응을 끌어낼 수 있는 살아있는 유기체(예를 들어, 포유류, 인간)을 포함하는 것으로 의도된다.
용어, "실질적으로 정제된" 세포는 본질적으로 다른 세포 유형을 무함유하는 세포를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 이의 자연적으로 발생하는 상태에서 정상적으로 회합되는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 또한 지칭한다. 일부 경우에서, 실질적으로 정제된 세포의 집단은 세포의 균질한 집단을 지칭한다. 다른 경우에서, 이 용어는 단순히 이들의 자연 상태에서 자연적으로 회합되는 세포로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 양태에서, 세포는 시험관내에서 배양된다. 다른 양태에서, 세포는 시험관내에서 배양되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "치료적"은 치료를 의미한다. 치료적 효과는 질환 상태의 감소, 억제, 차도, 또는 박멸에 의해 수득된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "예방"은 질환 또는 질환 상태의 예방 또는 보호적 치료를 의미한다.
본 발명의 맥락에서, "종양 항원" 또는 "과증식성 장애 항원" 또는 "과증식성 장애와 연관된 항원"은 특이적 과증식성 장애에 공통된 항원을 지칭한다. 특정한 양태에서, 본 발명의 과증식성 장애 항원은 원발성 또는 전이성 흑색종, 신경교종, 중피종, 콩팥세포암종, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 간암, 췌장암, 신장, 자궁내막 및 위암을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 암으로부터 유래된다.
일부 경우에서, 질환은 중피종, 신경교종, 유두상 장액성 난소 선암종, 투명 세포 난소암종, 혼합 뮐러 난소암종, 자궁내막양 점액성 난소암종, 악성 늑막 질환, 췌장 선암종, 췌관 선암종, 자궁 장액성암종, 폐 선암종, 간외담관암종, 위 선암종, 식도 선암종, 결장직장 선암종, 유방 선암종, MUC16, IL13Rα2, 또는 MSN 발현과 연관된 질환, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다.
용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염되거나 형질전환되거나 형질도입된 것이다. 세포는 1차 대상체 세포 및 이의 자손을 포함한다.
용어 "특이적으로 결합하다"는, 시료에 존재하는 동족 결합 파트너(예를 들어, MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN)를 인식하고 이에 결합하지만, 시료에서 다른 분자를 필연적으로 그리고 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 항체, 항체 단편 또는 특이적 리간드를 지칭한다.
범위: 이 개시내용 전체를 통해, 본 개시내용의 다양한 양태를 범위 양식으로 나타낼 수 있다. 범위 양식으로의 상세한 설명은 단지 편의성과 간결화를 위한 것임이 이해되어야 하며 본 개시내용의 범주 상의 불변의 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 따라서, 범위의 상세한 설명은 모든 가능한 하위범위뿐만 아니라 그 범위 이내의 개별적인 수치를 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 범위의 상세한 설명, 예컨대, 1 내지 6은 하위범위, 예컨대, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 뿐만 아니라 그 범위 이내의 개별적인 수, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 또다른 예로서, 범위 예컨대, 95-99% 동일성은 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 동일성이 있는 것을 포함하며, 하위범위 예컨대, 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% 및 98-99% 동일성을 포함한다. 이것은 범위의 폭과 무관하게 적용한다.
상세한 설명
T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질을 사용하는, 질환, 예컨대, 암의 치료를 위한 물질의 조성물 및 사용 방법이 본원에서 제공된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질" 또는 "TFP"는 일반적으로 i) 표적 세포 상에서 표면 항원에 결합할 수 있고 ii) 전형적으로 T 세포의 표면 내에 또는 표면 상에 공-위치될 때, 온전한 TCR 복합체의 다른 폴리펩티드 성분과 상호작용할 수 있는 TCR을 포함하는 다양한 폴리펩티드로부터 유래된 재조합 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 제공되는 바와 같이, TFP는 키메릭 항원 수용체와 비교하여 실질적인 이익을 제공한다. 용어 "키메릭 항원 수용체" 또는 대안적으로 "CAR"은 scFv의 형태인 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 하기에 정의된 바와 같이 자극 분자로부터 유래된 기능성 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인(또한 본원에서 "세포내 신호전달 도메인"으로서 지칭됨)을 포함하는 재조합 폴리펩티드를 지칭한다. 일반적으로, CAR의 중심 세포내 신호전달 도메인은 TCR 복합체와 회합되어 정상적으로 발견되는 CD3 제타 쇄로부터 유래된다. CD3 제타 신호전달 도메인은, 적어도 하나의 공-자극 분자, 예컨대, 4-1BB(즉, CD137), CD27 및/또는 CD28로부터 유래된 하나 이상의 기능성 신호전달 도메인과 융합될 수 있다.
MUC16
MUC16은 기관지, 나팔관, 및 자궁의 점막에서 인간 시각적 표면 상피에 의해 발현되는, 종양 연관된 항원 폴리펩티드이다. MUC16의 하나의 제안된 기능은 점막 표면에서 입자 및 감염성 제제에 대한 보호성의, 윤활 장벽을 제공하는 것일 수 있다. 고도로 다형성인 MUC16은 3개의 도메인인 Ser-/Thr-풍부 N-말단 도메인, 11개 내지 60개 초과의, 각각 평균 156개의 아미노산의 부분적 보존 일렬(tandem) 반복부위의 반복부위 도메인, 및 막관통 서열 및 짧은 세포질 꼬리를 함유하는 C-말단 비-반복 도메인으로 구성된다. MUC16은 아주 많이 O-글리코실화되고 N-글리코실화될 수 있다. MUC16 유전자로부터 발현되는 MUC16 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA는, 특정한 유형의 인간 암성 난소, 유방 및 췌장 종양에서, 각각 대응하는 정상 인간 난소, 유방 및 췌장 조직과 비교하여 현저하게, 재현가능하게 및 검출가능하게 과발현될 수 있다. MUC16 발현에 대해 정량적으로 분석된, 다양한 독립적이고 상이한 유형의 암성 인간 난소 조직 시료는, 암성 시료 중 MUC16의 발현 수준이 가변성일 수 있음을 나타내며, 현저한 수의 암성 시료는, 분석된 정상 난소 조직 시료의 군에 대한 MUC16 평균 발현 수준과 비교할 때 MUC16 발현의 적어도 6-배(약 580-배만큼 높은 정도까지)의 증가를 나타낸다. 특히, 검출가능하고 재현가능한 MUC16 과발현은, 정상 난소 조직과 비교하여, 난소암 유형; 유두상 및 투명 세포 선암종을 포함하여, 자궁내막 선암종, 장액성 선암종의 경우에 관찰될 수 있다. 특정한 인간 종양에서의 이의 과발현으로 인해, MUC16 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 다양한 포유류 조직 시료 중에서 정량적이고 질적인 비교를 위한 표적이다. MUC16 폴리펩티드의 발현 프로파일, 및 그 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 포유류에서 특정한 유형의 암성 종양의 진단 및 치료적 치료를 위해 활용될 수 있다.
CA125(암종 항원 125(O772P, CA-O772P, CA-125)은 MUC16 유전자에 의해 인코딩되는 세포외 창고(shed) 단백질이며, 난소암 환자를 모니터링하기 위해 관례대로 사용되는 혈청 마커이다. CA125는 상피 난소암 세포에서 과발현되고 혈중으로 분비되는 뮐러관 분화 항원이지만, 이의 발현이 난소암에 전적으로 제한될 수 없다. 혈청 CA125 수준은 상피 난소암(EOC) 환자의 약 80%에서 그러나 건강한 여성의 1% 미만에서 상승할 수 있다. CA125는 베타-갈락토시드-결합과 회합된 종양 세포의 세포 표면 상에 제시되는 거대한 뮤신-유사 당단백질, 세포-표면 렉틴인데, 세포 접착, 아폽토시스, 세포 증식 및 종양 진행의 조절에 책임이 있는 세포외 매트릭스의 성분이 될 수 있다. CA125의 높은 혈청 농도는 장액성 난소 선암종을 대표할 수 있는 반면에, 이것은 점액성 난소암에서는 상승하지 않는다. CA125는 정상적인 수준이 종양을 배제하지 않을 수 있기 때문에 난소암 스크리닝을 위해 추천되지 않을 수 있다. 그러나, CA125 검출은 조직학적으로 확인된 악성종양을 갖는 환자에서 임상 경과 및 질환 상태의 모니터링 시 표준 도구가 될 수 있다. 수많은 연구가 EOC 환자의 진전의 모니터링 시, 및 암 혈청 마커로서의 CA125 수준의 유용성을 확인해왔다. CA125 수준의 증가는 전형적으로 약 3개월만큼 임상적 감지에 선행한다. 화학요법 동안, 혈청 CA125 수준의 변화는 질환의 경과와 상관관계가 있을 수 있다. CA125는 신규 약물의 임상시험에서 임상적 반응에 대한 대리 마커로서 사용될 수 있다. 반면에, CA125는 많은 양성 병태에서의 이의 상승 때문에 EOC의 초기 진단 시에는 유용하지 않을 수 있다. CA125-특이적 항체 MAb-B43.13(오레고보맙, OvaRex MAb-B43.13)이 면역요법제로서 난소암종 환자에 대한 임상 시험 중에 있다.
MUC16(CA-125)은 여러가지 상이한 메커니즘에 의해 종양형성 및 종양 증식을 진행시키는 역할을 할 수 있다. MUC16이 종양의 성장을 돕는 한 가지 방법은 자연 살해 세포의 반응을 억제하여, 그럼으로써 암세포를 면역 반응으로부터 보호하는 것에 의한 것일 수 있다. MUC16이 면역계로부터 종양 세포를 보호할 수 있다는 추가의 증거는 MUC16의 아주 많이 당화된 일렬 반복부위 도메인이 갈렉틴-1(면역억제성 단백질)에 결합할 수 있다는 발견일 수 있다. MUC16은 종양 세포의 전이를 가능하게하는 세포-대-세포 상호작용에 참여할 수 있다. 이것은, MUC16이 복막(복강의 내벽)의 중피 세포에 의해 정상적으로 발현되는 당단백질인 메소텔린에 선택적으로 결합할 수 있음을 나타내는 증거에 의해 뒷받침될 수 있다. MUC16 및 메소텔린 상호작용은 복막의 종양 세포 침습 시 첫 번째 단계를 제공할 수 있다. 메소텔린은 중피종, 난소암 및 편평세포암종을 포함하는 여러가지 유형의 암에서 발현되는 것으로 또한 발견되었다. 메소텔린이 종양 세포에 의해 또한 발현되므로, MUC16과 중피 상호작용은 다른 종양 세포를 전이의 위치로 모아, 이에 따라 전이의 크기를 증가시키는 데 도움이 될 수 있다. 증거는 MUC16의 세포질 꼬리의 발현이 종양 세포의 성장을 가능하게 하고 세포 운동성을 촉진할 수 있으며 침습을 용이하게 할 수 있다는 사실을 뒷받침한다. 이것은 MUC16의, C-말단 도메인의 E-캐드헤린의 발현 감소 및 N-캐드헤린 및 비멘틴의 발현 증가를 초래하는 신호전달을 용이하게 하는 능력으로 인한 것으로 보이는데, 이는 상피-간엽 이행(epithelial-mesenchymal transition)과 일치하는 발현 패턴일 수 있다. MUC16은 약물 요법에 대한 암세포의 감수성을 감소시키는 데 또한 역할을 할 수 있다. 예를 들어, MUC16의 과발현은 유전자독성 약물, 예컨대 시스플라틴의 효과로부터 세포를 보호할 수 있다.
IL13Rα2
인터류킨-13은 정상적인 생리적 상태 하에서 및 또한 암에서 면역 반응 동안의 면역 미세환경 조절자이다. IL-13은 2가지 상이한 수용체 IL13Rα1 및 IL13Rα2에 결합한다. 대부분의 세포에서, IL-13은 낮은 친화도로 수용체 IL13Rα1 단량체에 결합하고 IL4Ra에 결합하여 신호 변환자 및 전사 활성자(STAT) 6의 다운스트림(downstream) 경로 활성화를 초래하는 헤테로다이머 복합체를 형성한다. 일부 정상적인 세포, 예컨대 정소 세포에서 IL-13은 IL13Rα2 수용체에 결합하지만 이것은 또한 암 세포에서 높은 친화도로 IL13Rα2 수용체에 결합한다.
Xq13.1-q28에 위치된 IL13Rα2 유전자에 대한 RNA 전사체는 26개-아미노산 신호전달 서열 및 짧은 17개-아미노산 세포내 도메인을 포함하는 380개-아미노산 단백질을 인코딩한다. 교모세포종 세포에서, IL13Rα2는 IL-13 단백질에 대한 최대 30,000개의 결합 부위를 발현한다.
IL13Rα2의 한 가지 제안된 기능은 IL-13의 IL13Rα1로부터의 격리를 초래하는 미끼 수용체(decoy receptor)로서의 것이다. IL13Rα2는 이용가능한 IL-13과 높은 친화도로 결합하고 IL13Rα1과 비교하여 보다 많은 결합 부위를 제공하므로, IL-13의 격리가 세포에서 촉진된다. 정상적인 세포에서, IL13Rα1에 결합하는 IL-13은 STAT6을 활성화시키는데, 이는 핵으로 이동시키며, 이때 이것은 N6-성장 억류(arrest) 특이적 프로모터, 예컨대 15-리포옥시게나제-1을 함유하는 유전자에 대한 전사적 제어를 행사한다. 이것은 증가된 카스파아제-3 활성을 통해 아폽토시스를 초래할 수 있다. 이에 따라 IL-13 격리는 종양 세포의 아폽토시스 탈출 메커니즘이 될 수 있다. IL13Rα2의 또다른 제안된 기능은, STST6의 수용체에의 도킹(docking)을 물리적으로 블로킹(blocking)함으로써의 IL13Rα2에 의한 IL13Rα1의 블로킹이다. STAT6 도킹의 흠결은 아폽토시스의 다운스트림 활성화를 방해한다. IL13Rα2는 신경교종 세포에서 STAT3 및 B-세포 림프종 2의 상향조절을 또한 유도한다.
IL13Rα2는 신경교종 개시 세포 상에서 발현되고 성인 암 종양의 약 58% 및 소아 암 종양의 약 83%에서 발현된다. 난소 및 췌장암에서, 이것은 세포외 신호-조절된 키나제/활성화인자 단백질 1의 경로를 통해 침습 및 전이를 촉진한다. 면역 세포, 예컨대 골수 유래된 억제인자 세포에서의 IL13Rα2의 발현은 전환 성장 인자(transforming growth factor) β의 상향조절을 통해 종양 면역 탈출 및 진행을 또한 촉진한다. IL13Rα2의 증가된 발현은 신경교종 및 다른 종양 모델에서 종양 진행을 촉진할 수 있다. IL13Rα2의 발현은 신경교종 악성종양 등급과 함께 증가하며 이에 따라 환자 생존에 대한 진단적 지표를 제공할 수 있다. IL13Rα2 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 발현 프로파일은 포유류에서 특정한 유형의 암성 종양의 진단 및 치료적 치료를 위해 활용될 수 있다.
T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)
본 개시내용은 TFP를 인코딩하는 재조합 DNA 작제물을 아우르며, 여기서 TFP는 특이적으로 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN, 예를 들어, 인간 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN에 결합하는 항체 단편을 포함하고, 여기서 항체 단편의 서열은 TCR 서브유닛 또는 이의 부분을 인코딩하는 핵산 서열로서 동일한 해독틀과 인접하고 동일한 해독틀에 있다. 본원에서 제공되는 TFP는 기능성 TCR 복합체를 형성하기 위해 하나 이상의 내인성(또는 대안적으로, 하나 이상의 외인성, 또는 내인성 및 외인성의 조합) TCR 서브유닛과 회합될 수 있다.
일 양태에서, 본 개시내용의 TFP는 달리 항원 결합 도메인으로서 지칭되는 표적-특이적 결합 요소를 포함한다. 모이어티의 선택은 표적 세포의 표면을 한정하는 표적 항원의 유형 및 수에 의존한다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 특정한 질환 상태와 연관된 표적 세포 상에서 세포 표면 마커로서 작용하는 표적 항원을 인식하기 위해 선택될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 TFP에서 항원 결합 도메인에 대한 표적 항원으로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스성, 박테리아성 및 기생충성 감염; 자가면역 질환; 및 암성 질환(예를 들어, 악성 질환)과 연관된 것을 포함한다.
일 양태에서, TFP-매개된 T 세포 반응은 목적하는 항원에 특이적으로 결합하는 TFP 내로의 항원-결합 도메인을 조작하는 방법에 의해 관심 있는 항원에 대해 지시될 수 있다.
일 양태에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 TFP의 부분은 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN을 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일 양태에서, 항원 결합 도메인은 인간 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN을 표적화할 수 있다.
항원 결합 도메인은, 이에 제한되지는 않으나 단일-도메인 항체, 예컨대, 낙타과 유래된 나노바디의 중쇄 가변 도메인(VH), 경쇄 가변 도메인(VL) 및 가변 도메인(VHH), 및 항원 결합 도메인, 예컨대, 재조합 파이브로넥틴 도메인, 안티칼린, DARPIN 등으로서 기능하기 위해 당해 기술분야에서 공지된 대안적인 스캐폴드를 포함하는, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 및 이들의 기능성 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 항원에 결합하는 임의의 도메인일 수 있다. 마찬가지로 표적 항원을 특이적으로 인식하고 결합하는 천연 또는 합성 리간드는 TFP에 대한 항원 결합 도메인으로서 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 항원 결합 도메인이 TFP가 궁극적으로 사용될 동일한 종으로부터 유래되는 것이 유익하다. 예를 들어, 인간에서의 사용을 위해, TFP의 항원 결합 도메인이 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 도메인에 대해 인간 또는 인간화된 잔기를 포함하는 것이 유익할 수 있다.
이에 따라, 일 양태에서, 항원-결합 도메인은 인간화된 또는 인간 항체 또는 항체 단편, 또는 낙타과 항체 또는 항체 단편, 또는 뮤린 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 인간화된 또는 인간 항-TAA 결합 도메인은 본원에 기재된 인간화된 또는 인간 항-TAA 결합 도메인의 1개 이상의(예를 들어, 모두 3개의) 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LC CDR3), 및/또는 본원에 기재된 인간화된 또는 인간 항-TAA 결합 도메인의 1개 이상의(예를 들어, 모두 3개의) 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3), 예를 들어, 1개 이상의, 예를 들어, 모두 3개의 LC CDR 및 1개 이상의, 예를 들어, 모두 3개의 HC CDR을 포함하는 인간화된 또는 인간 항-TAA 결합 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 인간화된 또는 인간 항-TAA 결합 도메인은 본원에 기재된 인간화된 또는 인간 항-TAA 결합 도메인의 1개 이상의(예를 들어, 모두 3개의) 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3)을 포함하며, 예를 들어, 인간화된 또는 인간 항-TAA (결합 도메인은 2개의 가변 중쇄 영역을 갖고, 여기서 각각은 본원에 기재된 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함한다. 일 구현예에서, 인간화된 또는 인간 항-TAA 결합 도메인은 본원에 기재된 인간화된 또는 인간 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 인간화된 또는 인간 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 인간화된 또는 인간 항-TAA 결합 도메인은 본원에 기재된 인간화된 중쇄 가변 영역, 예를 들어, 본원에 기재된 적어도 2개의 인간화된 또는 인간 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인은 본원에서 제공되는 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 일 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인(예를 들어, scFv)는 다음을 포함한다: 본원에서 제공되는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1개, 2개 또는 3개의 변형(예를 들어, 치환) 그러나 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 본원에서 제공되는 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 본원에서 제공되는 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1개, 2개 또는 3개의 변형(예를 들어, 치환) 그러나 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형(예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 본원에서 제공되는 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역. 일 구현예에서, 인간화된 또는 인간 항-TAA 결합 도메인은 scFv이며, 본원에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어, 본원에 기재된 링커를 통해, 본원에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 일 구현예에서, 인간화된 항-TAA 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 3 또는 4이다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어, 다음의 배향 중 임의의 것일 수 있다: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역. 일부 경우에서, 링커 서열은 긴 링커(LL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 2 내지 4이다. 일부 경우에서, 링커 서열은 짧은 링커(SL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 1 내지 3이다.
일부 양태에서, 비-인간 항체는 인간화되며, 이때 항체의 특이적 서열 또는 영역은 인간에서 자연적으로 생산된 항체 또는 이의 단편과의 유사성을 증가시키도록 변형된다. 일 양태에서, 항원 결합 도메인은 인간화된다.
인간화된 항체는, 이에 제한되지는 않으나, CDR-그라프팅(예를 들어, 유럽 특허 번호 EP 239,400호; 국제 공개 번호 WO 91/09967호; 및 미국 특허 번호 제5,225,539호, 제5,530,101호, 및 제5,585,089호를 참조하고, 이들 문헌 각각은 본원에 그 전문이 참조로 편입됨), 베니어링(veneering) 또는 재표면화(예를 들어, 유럽 특허 번호 EP 592,106호 및 EP 519,596호; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; and Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973을 참조하고, 이들 문헌 각각은 본원에 그 전문이 참조로 편입됨), 쇄 셔플링(예를 들어, 미국 특허 번호 제5,565,332호를 참조하며, 이 특허는 본원에 그 전문이 참조로 편입됨), 및 예를 들어, 문헌 각각이 본원에 그 전문이 참조로 편입되는, 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0042664호, 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0048617호, 미국 특허 번호 6,407,213호, 미국 특허 번호 5,766,886호, 국제 공개 번호 WO 9317105호, Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25(2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994), 및 Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)에 개시된 기술을 포함하는, 당해 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 종종, 프레임워크 영역에서 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경하기 위해, 예를 들어, 개선하기 위해, CDR 공여체 항체로부터 대응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임워크 치환은 당해 기술분야에 널리-공지된 방법에 의해, 예를 들어, 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 식별하기 위한 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정한 위치에서의 흔치 않은 프레임워크 잔기를 식별하기 위한 서열 비교에 의해 식별된다(예를 들어, Queen 등의 미국 특허 번호 제5,585,089호; 및 Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323을 참조하며, 이들 문헌은 본원에 그 전문이 참조로 편입됨).
인간화된 항체 또는 항체 단편은 그것 내에 비인간인 공급원으로부터 남아있는 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는, 전형적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 입수되는, "도입" 잔기로 종종 지칭된다. 본원에서 제공되는 바와 같이, 인간화된 항체 또는 항체 단편은 비인간 면역글로불린 분자 및 프레임워크 영역으로부터의 1개 이상의 CDR를 포함하며 여기서 프레임워크를 포함하는 아미노산 잔기는 인간 생식세포계열로부터 완전히 또는 주로 유래된다. 항체 또는 항체 단편의 인간화를 위한 다수의 기술은, 당해 기술분야에 널리-공지되어 있으며, 인간 항체의 대응하는 서열에 대한 설치류 CDR 또는 CDR 서열의 치환, 즉, CDR-그라프팅(EP 239,400호; PCT 공개 번호 WO 91/09967호; 및 미국 특허 번호 제4,816,567호; 제6,331,415호; 제5,225,539호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제6,548,640호, 이들의 내용은 본원에 그 전문이 참조로 편입됨)에 의해, Winter 및 동료의 방법(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))에 따라 본질적으로 수행될 수 있다. 이러한 인간화된 항체 및 항체 단편에서, 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 보다 적게 비인간 종으로부터의 대응하는 서열에 의해 치환되어 왔다. 인간화된 항체는 종종 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크(FR) 잔기가 설치류 항체 내의 유사 부위로부터 잔기에 의해 치환되는 인간 항체이다. 항체 및 항체 단편의 인간화는 베니어링 또는 재표면화(EP 592,106호; EP 519,596호; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); 및 Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)) 또는 쇄 셔플링(미국 특허 번호 제5,565,332호)에 의해 또한 달성될 수 있으며, 이들 문헌의 내용은 본원에 그 전문이 참조로 편입된다.
인간화된 항체를 만들 때 사용될, 경 및 중 모두인, 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는 것이다. 소위 "최적화" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 그후에 설치류의 것과 가장 근접한 인간 서열이 인간화된 항체에 대한 인간 프레임워크(FR)로서 허용된다(Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987), 이들 문헌의 내용은 본원에 그 전문이 참조로 본원에 편입됨). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크는 여러가지 상이한 인간화된 항체에 대해 사용될 수 있다(예를 들어, Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)을 참조하며, 이들 문헌의 내용은 본원에 그 전문이 참조로 본원에 편입됨). 일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역, 예를 들어, 모두 4개의 프레임워크 영역은 VH4-4-59 생식세포계열 서열로부터 유래된다. 일 구현예에서, 프레임워크 영역은 대응하는 뮤린 서열에서, 예를 들어, 아미노산으로부터, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 변형, 예를 들어, 치환을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역, 예를 들어, 모두 4개의 프레임워크 영역은 VK3-1.25 생식세포계열 서열로부터 유래된다. 일 구현예에서, 프레임워크 영역은 대응하는 뮤린 서열에서, 예를 들어, 아미노산으로부터, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 변형, 예를 들어, 치환을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 항체 단편을 포함하는 본 개시내용의 TFP 조성물의 부분은 표적 항원에 대한 높은 친화도의 보유 및 다른 호의적인 생물학적 특성과 함께 인간화된다. 본 개시내용의 일 양태에 따르면, 인간화된 항체 및 항체 단편은 모 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 사용한 모 서열의 분석 과정 및 다양한 개념적인 인간화된 생성물에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하며 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보자 면역글로불린 서열의 개연성 있는 3차원 형태적 구조를 예시하고 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 표시의 점검은 후보자 면역글로불린 서열의 기능화 시 잔기의 가능한 역할의 분석, 예를 들어, 표적 항원에 결합하는 후보자 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이 방법으로, 목적하는 항체 또는 항체 단편 특징, 예컨대 표적 항원에 대한 증가된 친화도가 달성되도록, FR 잔기는 수령체 및 도입 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는 데 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 수반된다.
인간화된 항체 또는 항체 단편은 본래의 항체와 유사한 항원 특이성, 예를 들어, 본 개시내용에서, 인간 종양 연관 항원 예컨대 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN에 결합하는 능력을 유지할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체 또는 항체 단편은 개선된 친화도 및/또는 인간 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN에의 결합의 특이성을 가질 수 있다.
일 양태에서, 항-TAA 결합 도메인(즉, MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN 결합 도메인)은 항체 또는 항체 단편의 특정한 기능적 특질 또는 특성에 의해 특징지어진다. 예를 들어, 일 양태에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 TFP 조성물의 부분은 인간 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN에 특이적으로 결합한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항원 결합 도메인에 관한 것이며, 여기서 항체 결합 도메인은 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하며, 여기서 항체 또는 항체 단편은 본원에서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄를 포함한다. 특정한 양태에서, scFv는 리더 서열로서 동일한 해독틀과 인접하고 동일한 해독틀 내에 있다.
일 양태에서 항-TAA 결합 도메인은 단편, 예를 들어, 단일 쇄 가변 단편(scFv)이다. 일 양태에서, 항-TAA 결합 도메인은 Fv, Fab, (Fab')2, 또는 이(bi)-기능성(예를 들어 이-특이적) 하이브리드 항체이다(예를 들어, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). 일 양태에서, 본원에 개시된 항체 및 이의 단편은 야생형 또는 강화된 친화도로 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN에 결합한다.
또한 표적 항원(예를 들어, MUC16, IL13Rα2, MLSN, 또는 융합 모이어티 결합 도메인의 표적에 대해 본원에서 다른 곳에 기재된 임의의 표적 항원)에 특이적인 항체 항원 결합 도메인을 수득하기 위한 방법이 본원에서 제공되며, 방법은 본원에 제시된 VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환 또는 삽입의 방법으로, VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제공하는 단계, 이에 따라 하나 이상의 VL 도메인과 함께 제공된 VH 도메인을 임의로 조합하는 단계, 및 임의로 하나 이상의 목적하는 특성이 있고 관심있는 표적 항원(예를 들어, MUC16, IL13Rα2, MSLN)에 대해 특이적인 결합 구성원 또는 특이적인 항체 항원 결합 도메인을 식별하기 위해 VH 도메인 또는 VH/VL 조합물 및 조합물들을 시험하는 단계를 포함한다.
일부 경우에서, VH 도메인 및 scFvs는 당해 기술분야에서 공지된 방법(예를 들어, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조)에 따라 제조될 수 있다. scFv 분자는 가요성 폴리펩티드 링커를 사용하여 VH 및 VL 영역을 함께 연결함으로써 생산될 수 있다. scFv 분자는 최적화된 길이 및/또는 아미노산 조성을 갖는 링커(예를 들어, Ser-Gly 링커)를 포함한다. 링커 길이는 scFv의 가변 영역이 어떻게 폴딩하고 상호작용하는지에 크게 영향을 미칠 수 있다. 사실, 짧은 폴리펩티드 링커가 이용되는 경우에(예를 들어, 5 내지 10개의 아미노산) 쇄-내 폴딩이 예방된다. 쇄-간 폴딩은 2개의 가변 영역이 함께 기능성 에피토프 결합 부위를 형성하는 것을 실현시키도록 또한 요구될 수 있다. 일부 경우에서, 링커 서열은 긴 링커(LL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 2 내지 4이다. 일부 경우에서, 링커 서열은 짧은 링커(SL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 1 내지 3이다. 링커 배향 및 크기의 예에 대해, 예를 들어, Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, 미국 특허 번호 제7,695,936호, 미국 특허 출원 공개 번호 제20050100543호 및 제20050175606호, 및 PCT 공개 번호 WO2006/020258호 및 WO2007/024715호를 참조하며, 이들 모든 문헌은 본원에 참조로 편입된다.
scFv는 이의 VL과 VH 영역 사이에 약 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 15개 초과의 잔기의 링커를 포함할 수 있다. 링커 서열은 임의의 자연적으로 발생하는 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 아미노산 글라이신 및 세린을 포함한다. 또다른 구현예에서, 링커 서열은 글라이신 및 세린 반복부위의 세트, 예컨대, (Gly4Ser)n을 포함하며, 이때 n은 1 이상의 양의 정수이다. 일 구현예에서, 링커는 (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)3일 수 있다. 링커 길이에서의 변이를 유지할 수 있고 활성을 강화하여, 활성 연구 시 우월한 효능을 일으킬 수 있다. 일부 경우에서, 링커 서열은 긴 링커(LL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 2 내지 4이다. 일부 경우에서, 링커 서열은 짧은 링커(SL) 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 여기서 n = 1 내지 3이다.
안정성 및 돌연변이
항-TAA 결합 도메인, 예를 들어, scFv 분자(예를 들어, 가용성 scFv)의 안정성은 종래의 대조군 scFv 분자 또는 전장 항체의 생체물리학적 특성(예를 들어, 열 안정성)을 참조하여 평가될 수 있다. 일 구현예에서, 인간화된 또는 인간 scFv는 기재된 검정에서 부모 scFv보다 약 0.1, 약 0.25, 약 0.5, 약 0.75, 약 1, 약 1.25, 약 1.5, 약 1.75, 약 2, 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 약 10 섭씨 온도 약 11 섭씨 온도, 약 12 섭씨 온도, 약 13 섭씨 온도, 약 14 섭씨 온도, 또는 약 15 섭씨 온도 초과인 열 안정성을 갖는다.
항-TAA 결합 도메인, 예를 들어, scFv의 개선된 열 안정성은 후속하여 전체 TAA-TFP 작제물에 부여되어, 항-TAA TFP 작제물의 개선된 치료적 특성을 초래한다. 항-TAA 결합 도메인, 예를 들어, scFv의 열 안정성은 종래의 항체와 비교하여 적어도 약 2℃ 또는 3℃만큼 개선될 수 있다. 일 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인, 예를 들어, scFv는 종래의 항체와 비교하여 1℃ 개선된 열 안정성을 갖는다. 또다른 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인, 예를 들어, scFv는 종래의 항체와 비교하여 2℃ 개선된 열 안정성을 갖는다. 또다른 구현예에서, scFv는 종래의 항체와 비교하여 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 또는 15℃ 개선된 열 안정성을 갖는다. 예를 들어, 본원에 개시된 scFv 분자와, scFv VH 및 VL이 유래된 항체의 scFv 분자 또는 Fab 단편의 사이에서 비교가 이루어질 수 있다. 열 안정성은 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, TM이 측정될 수 있다. TM을 측정하는 방법 및 단백질 안정성을 결정하는 다른 방법은 하기에 기재된다.
(가용성 scFv의 인간화 또는 돌연변이유발을 통해 발생하는) scFv 내 돌연변이는 scFv의 안정성을 변경하고 scFv 및 항-TAA TFP 작제물의 전반적인 안정성을 개선한다. 인간화된 scFv의 안정성은 측정, 예컨대, TM, 온도 변성 및 온도 응집을 사용하여 뮤린 scFv에 대해 비교된다. 일 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인, 예를 들어, scFv는 돌연변이된 scFv가 항-TAA TFP 작제물에 개선된 안정성을 부여하도록 인간화 과정으로부터 발생하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 또다른 구현예에서, 항-TAA 결합 도메인, 예를 들어, scFv는 돌연변이된 scFv가 항-TAA-TFP 작제물에 개선된 안정성을 부여하도록 인간화 과정으로부터 발생하는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개의 돌연변이를 포함한다.
일 양태에서, TFP의 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 항원 결합 도메인 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 포함하며, 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 항-TAA 항체 단편의 목적하는 기능적 특성을 유지한다. 일 특정한 양태에서, 본 발명의 TFP 조성물은 항체 단편을 포함한다. 추가의 양태에서, 그 항체 단편은 scFv를 포함한다.
다양한 양태에서, TFP의 항원 결합 도메인은 하나의 또는 양쪽 가변 영역(예를 들어, VH 및/또는 VL) 내에서의, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 내에서의 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내에서의 하나 이상의 아미노산을 변형함으로써 조작된다. 일 특정한 양태에서, 본 발명의 TFP 조성물은 항체 단편을 포함한다. 추가의 양태에서, 그 항체 단편은 scFv를 포함한다.
본 개시내용의 항체 또는 항체 단편은, 그들이 (예를 들어, 야생형으로부터의) 아미노산 서열 내에서 변화하지만, 목적하는 활성에서는 아니도록 추가로 변형될 수 있다는 사실이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, "비-필수적인" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 초래하는 추가적인 뉴클레오티드 치환은 단백질로 만들어질 수 있다. 예를 들어, 분자에서 비필수적인 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 계열로부터 또다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 또다른 구현예에서, 일련의 아미노산은 측쇄 계열 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 일련으로 대체될 수 있고, 예를 들어, 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는, 보존적 치환이 이루어질 수 있다.
유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은, 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하 극성 측쇄(예를 들어, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하여, 당해 기술분야에서 정의되었다.
2개 이상의 핵산 및 폴리펩티드 서열의 맥락에서 백분율 동일성은 동일한 2개 이상의 서열을 지칭한다. 비교 창, 또는 다음의 서열 비교 알고리즘의 또는 수동 정렬 및 시각적 검사 중 어느 하나를 사용하여 측정된 바와 같은 설계된 영역 상에서 최대 관련성에 대해 비교되고 정렬될 때, 2개의 서열이 동일한(예를 들어, 명시적 영역 상에서, 또는, 명시적이지 않을 때, 전체 서열 상에서 60% 동일성, 임의로 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율을 가지는 경우에, 2개의 서열은 "실질적으로 동일하다". 임의로, 동일성은 길이가 적어도 약 50개의 뉴클레오티드(또는 10개의 아미노산)인 영역 상에서, 또는 보다 바람직하게는 길이가 100개 내지 500개 또는 1000개 이상의 뉴클레오티드(또는 20개, 50개, 200개 이상의 아미노산)인 영역 상에서 존재한다.
서열 비교의 경우, 전형적으로 1개의 서열은 참조 서열로서 작용하고, 여기에 시험 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터에 입력되고, 부분서열 좌표(subsequence coordinate)가 지정되며, 필요한 경우에, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수(parameter)가 지정된다. 디폴트 프로그램 매개변수가 사용될 수 있거나, 대안적인 매개변수가 지정될 수 있다. 그후에 서열 비교 알고리즘은, 프로그램 매개변수에 기반하여, 참조 서열에 비해 시험 서열에 대한 백분율 서열 동일성을 계산한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은, 예를 들어, Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444의 유사성 방법용 조사에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(위스콘신주 매디슨 575 사이언스 드라이브에 소재한 Genetics Computer Group의 Wisconsin Genetics Software Package에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 시각적 검사(예를 들어, Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology 참조)에 의해 수행될 수 있다. 백분율 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 2개의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 각각 Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; 및 Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용가능하다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 결정하는 뉴클레오티드 BLAST를 사용하기 위한 알고리즘 매개변수는 1, -2의 매치/미스매치 점수와 함께 점수화(scoring) 매개변수를 사용할 수 있으며 여기서 갭 비용은 선형이다. BLAST 알고리즘에서 정렬을 개시하는 서열의 길이 또는 워드 크기는 서열 정렬의 경우 28로 설정될 수 있다. 펩티드 서열 동일성을 결정하는 단백질 BLAST를 사용하기 위한 알고리즘 매개변수는 BLOSUM62 매트릭스와 함께 점수화 매개변수를 사용하여 잔기의 정렬 쌍(aligning pair)에 대한 점수를 할당할 수 있고, 전반적인 정렬 점수를 결정하며, 여기서 갭 비용은 11의 존재 페널티 및 1의 확장 페널티를 가질 수 있다. 서열의 아미노산 조성을 보정하는 매트릭스 조정 방법은 조건부 조합 점수 매트릭스 조정(conditional compositional score matrix adjustment)일 수 있다. BLAST 알고리즘에서 정렬을 개시하는 서열의 길이 또는 워드 크기는 서열 정렬의 경우 6으로 설정될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 기능적으로 동등한 분자를 생성하는 개시 항체 또는 단편(예를 들어, scFv) 아미노산 서열의 변형을 고려한다. 예를 들어, TFP에 포함된, 항-TAA 결합 도메인, 예를 들어, scFv의 VH 또는 VL은 항-TAA 결합 도메인, 예를 들어, scFv의 개시 VH 또는 VL 프레임워크 영역의 적어도 약 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 유지하도록 변형될 수 있다. 본 발명은 전체 TFP 작제물의 변형, 예를 들어, 기능적으로 동등한 분자를 생성하기 위한 TFP 작제물의 다양한 도메인의 하나 이상의 아미노산 서열 내의 변형을 고려한다. TFP 작제물은 개시 TFP 작제물의 적어도 약 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 유지하도록 변형될 수 있다.
세포외 도메인
세포외 도메인은 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연이면, 도메인은 임의의 단백질로부터, 그러나 특히 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 일 양태에서 세포외 도메인은 막관통 도메인과 회합될 수 있다. 이 본 개시내용에서 특정한 용도의 세포외 도메인은 적어도, 예를 들어, T-세포 수용체의 알파, 베타, 감마, 델타, 또는 제타 쇄, 또는 CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타의 세포외 영역(들)을 포함할 수 있거나, 또는 대안적인 구현예에서, 세포외 도메인은 적어도 CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD154의 세포외 영역 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, TCR 세포외 도메인은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 부분, 및 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함한다.
막관통 도메인
일반적으로, TFP 서열은 단일 게놈 서열에 의해 인코딩된 세포외 도메인 및 막관통 도메인을 함유한다. 대안적인 구현예에서, TFP는 TFP의 세포외 도메인에 대해 이종성인 막관통 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 막관통 도메인은 막관통 영역에 인접한 하나 이상의 추가적인 아미노산, 예를 들어, 막관통이 유래된 단백질의 세포외 영역과 회합된 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 세포외 영역의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 또는 그 이상의 아미노산) 및/또는 막관통 단백질이 유래된 단백질의 세포내 영역과 회합된 하나 이상의 추가적인 아미노산(예를 들어, 세포내 영역의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 또는 그 이상의 아미노산)을 포함할 수 있다. 일부 사례에서, 막관통 도메인은 세포외 영역의 적어도 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 사례에서, 막관통 도메인은 세포내 영역의 적어도 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 막관통 도메인은 TFP의 다른 도메인 중 하나가 사용되는 것과 회합되는 것이다. 일부 경우에서, 막관통 도메인은 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에의 이러한 도메인의 결합을 방지하기 위해, 예를 들어, 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택 또는 변형될 수 있다. 일 양태에서, 막관통 도메인은 TFP T 세포 표면에서 또다른 TFP와 동종이량체화(homodimerization)될 수 있다. 상이한 양태에서 막관통 도메인의 아미노산 서열은 동일한 TFP 내에 존재하는 네이티브 결합 파트너의 결합 도메인과의 상호 작용을 최소화하기 위해 변형 또는 치환될 수 있다.
막관통 도메인은 천연 공급원으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연이면, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 일 양태에서 막관통 도메인은 TFP가 표적에 결합한 때마다 세포내 도메인(들)에 신호전달할 수 있다. 일부 경우에서, TCR 서브유닛은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, TCR 제타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인, 및 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 경우에서, 막관통 도메인은 TFP의 세포외 영역, 예를 들어, TFP의 항원 결합 도메인에, 힌지, 예를 들어, 인간 단백질로부터의 힌지를 통해 부착될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 힌지는 인간 면역글로불린(Ig) 힌지, 예를 들어, IgG4 힌지, 또는 CD8a 힌지일 수 있다.
링커
임의로, 길이가 2개 내지 10개의 아미노산인, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커가 TFP의 막관통 도메인과 세포질 영역 사이에 연결을 형성할 수 있다. 글라이신-세린 더블릿(doublet)은 특히 적합한 링커를 제공한다. 예를 들어, 일 양태에서, 링커는 GGGGSGGGGS(서열번호 99)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(서열번호 100)의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 다른 예시적인 링커는 표 4에 제시되어 있다.
세포질 도메인
TFP의 세포질 도메인은, TFP가 CD3 감마, 델타 또는 엡실론 폴리펩티드를 함유하는 경우에, 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다; TCR 알파 및 TCR 베타 서브유닛은 일반적으로 신호전달 도메인이 결여되어 있다. 세포내 신호전달 도메인은 일반적으로 TFP가 도입된 면역 세포의 정상적인 효과기 기능의 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 용어 "효과기 기능"은 세포의 특화된 기능을 지칭한다. T 세포의 효과기 기능은, 예를 들어, 사이토킨의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 이에 따라 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 변환하고 특화된 기능을 수행하도록 세포를 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 보통 전체 세포내 신호전달 도메인이 이용될 수 있지만, 많은 사례에서 전체 쇄를 사용하는 것은 필요하지 않다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용되는 정도까지, 이러한 절단된 부분은 이것이 효과기 기능 신호를 변환하는 한 온전한 쇄 대신에 사용될 수 있다. 이에 따라 용어 세포내 신호전달 도메인은 효과기 기능 신호를 변환하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 TFP에서의 사용을 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는 항원 수용체 참여에 이어 신호 변환을 개시하는 것에 협력하여 작용하는 T 세포 수용체(TCR) 및 공-수용체의 세포질 서열, 뿐만 아니라 동일한 기능적 능력을 갖는 이들 서열의 유도체 또는 변이체 및 임의의 재조합 서열을 포함한다.
TCR 단독을 통해 생성된 신호가 네이티브 T 세포의 완전 활성화에 불충분할 수 있다는 점 및 2차 및/또는 공자극 신호가 요구될 수 있다는 점이 공지되어 있다. 이에 따라, 미경험 T 세포 활성화는 세포질 신호전달 서열의 2개의 별개의 부류에 의해 매개된다고 할 수 있다: TCR(1차 세포내 신호전달 도메인)을 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 것 및 2차 및 공자극 신호(2차 세포질 도메인, 예를 들어, 공자극 도메인)을 제공하기 위해 항원-독립적 방식으로 작용하는 것.
1차 신호전달 도메인은 자극성 방법, 또는 억제성 방법 중 어느 하나로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절할 수 있다. 자극성 방식으로 작용하는 1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)로서 공지되어 있는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에서 특정 용도의 것인 1차 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d의 것을 포함한다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 TFP는 CD3-엡실론의 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, 1차 신호전달 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 1차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM 도메인, 예를 들어, 네이티브 ITAM 도메인과 비교하여 변경된(예를 들어, 증가된 또는 감소된) 활성을 갖는 돌연변이된 ITAM 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 1차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM-함유 1차 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, 최적화된 및/또는 절단된 ITAM-함유 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 1차 신호전달 도메인은 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 ITAM 모티프를 포함한다.
TFP의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인 그 자신을 포함할 수 있거나 이것은 본 개시내용의 TFP의 맥락에서 유용한 임의의 다른 목적하는 세포내 신호전달 도메인(들)과 조합될 수 있다. 예를 들어, TFP의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 엡실론 쇄 부분 및 공자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 공자극 신호전달 도메인은 공자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 TFP의 부분을 지칭한다. 공자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 요구될 수 있는 항원 수용체 또는 이의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, DAP10, DAP12, CD30, CD40, PD1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 예를 들어, CD27 공자극은 시험관내 인간 TFP-T 세포의 확장, 효과기 기능, 및 생존을 강화하는 것으로 입증되었고 생체내 인간 T 세포 지속성 및 항종양 활성을 늘린다(Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706).
본 개시내용의 TFP의 세포질 부분 내의 세포내 신호전달 서열은 무작위 또는 명시된 순서로 서로와 연결될 수 있다. 임의로, 예를 들어, 길이가 2개 내지 10개의 아미노산(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산인) 짧은 올리고- 및 폴리펩티드 링커는 세포내 신호전달 서열 사이에 연결을 형성할 수 있다.
일 구현예에서, 글라이신-세린 더블릿은 적합한 링커로서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 단일 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 글라이신은 적합한 링커로서 사용될 수 있다.
일 양태에서, 본원에 기재된 TFP-발현 세포는 제2 TFP, 예를 들어, 예를 들어 동일한 표적(예를 들어, MUC16, IL13Rα2, MSLN) 또는 상이한 표적(예를 들어, CD123)에 대한, 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 TFP를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, TFP-발현 세포가 2개 이상의 상이한 TFP를 포함할 때, 상이한 TFP의 항원 결합 도메인은 항원 결합 도메인이 다른 것과 상호작용하지 않도록 하는 것일 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 TFP를 발현하는 세포는 제1 TFP의 항원 결합 도메인을, 예를 들어, 제2 TFP의 항원 결합 도메인과 회합하지 않는 단편, 예를 들어, scFv로서 가질 수 있고, 예를 들어, 제2 TFP의 항원 결합 도메인은 VHH이다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 SD1(서열번호 15), SD2(서열번호 20), SD3(서열번호 25), SD4(서열번호 30), SD5(서열번호 35), 또는 SD6(서열번호 40)이다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 LSD1(서열번호 51), H1-LSD1(서열번호 56), H2-LSD1(서열번호 61), LSD2(서열번호 66), H1-LSD1(서열번호 71), 또는 H2-LSD2(서열번호 76)이다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항-MSLN VHH1(서열번호 96) 또는 항-MSLN VHH2(서열번호 97)이다.
또다른 양태에서, 본원에 기재된 TFP-발현 세포는 또다른 제제, 예를 들어, TFP-발현 세포의 활성을 강화하는 제제를 추가로 발현할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 제제는 억제성 분자를 억제하는 제제일 수 있다. 억제성 분자, 예를 들어, PD1은, 일부 구현예에서, 면역 효과기 반응을 시작하기 위해 TFP-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제성 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 일 구현예에서, 억제성 분자를 억제하는 제제는, 예를 들어, 세포에 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인과 회합된, 제1 폴리펩티드, 예를 들어, 억제성 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 제제는, 예를 들어, 억제성 분자, 예컨대, PD1, LAG3, CTLA4, CD160, BTLA, LAIR1, TIM3, 2B4 및 TIGIT, 또는 임의의 이들의 단편(예를 들어, 이들 중 임의의 것의 세포외 도메인의 적어도 부분)의 제1 폴리펩티드, 및 (예를 들어, 공자극 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어, 4-1BB, CD27 또는 CD28을 포함하는) 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 제제는 PD1 또는 이의 단편(예를 들어, PD1의 세포외 도메인의 적어도 부분)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, 본원에 기재된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다. PD1은 CD28, CTLA-4, ICOS, 및 BTLA를 또한 포함하는 수용체의 CD28 계열의 억제성 구성원이다. PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포 상에서 발현될 수 있다(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). PD1, 프로그램화된 사멸-리간드 1(Programmed Death-Ligand 1; PD-L1) 및 프로그램화된 사멸-리간드 2(PD-L2)에 대한 2개의 리간드는 PD1에의 결합 시 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 나타났다(Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1은 인간 암에서 풍부할 수 있다(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). 면역 억제는 PD-L1과 PD1의 국부적 상호작용을 억제함으로써 뒤집을 수 있다.
일 구현예에서, 제제는 억제성 분자의 세포외 도메인(ECD)을 포함하고, 예를 들어, 프로그램화된 사멸 1(PD1)은 막관통 도메인 및 임의로 세포내 신호전달 도메인, 예컨대, 41BB 및 CD3 제타(또한 본원에서 PD1 TFP로서 지칭됨)와 융합될 수 있다. 일 구현예에서, PD1 TFP는, 본원에 기재된 항-TAA TFP와 조합하여 사용될 때, T 세포의 지속성을 개선한다. 일 구현예에서, TFP는 PD 1의 세포외 도메인을 포함하는 PD1 TFP이다. 대안적으로, PD-L1 또는 PD-L2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예컨대, scFv를 함유하는 TFP가 제공된다.
또다른 양태에서, 본 개시내용은 TFP-발현 T 세포, 예를 들어, TFP-T 세포의 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, TFP-발현 T 세포의 집단은 상이한 TFP를 발현하는 세포의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, TFP-T 세포의 집단은 본원에 기재된 항-TAA 결합 도메인을 갖는 TFP를 발현하는 제1 세포, 및 상이한 항-TAA 결합 도메인, 예를 들어, 제1 세포에 의해 발현되는 TFP에서의 항-TAA 결합 도메인과는 상이한 본원에 기재된 항-TAA 결합 도메인을 갖는 TFP를 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다. 또다른 예로서, TFP-발현 세포의 집단은, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 항-TAA 결합 도메인을 포함하는 TFP를 발현하는 제1 세포, 및 제1 세포의 항-TAA TFP 이외의 표적(예를 들어, MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN에 특이성이 있는)(예를 들어, 또다른 종양-연관 항원)에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 TFP를 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다.
또다른 양태에서, 본 개시내용은 세포의 집단을 제공하며 여기서 집단 중 적어도 하나의 세포는 본원에 기재된 항-TAA 도메인을 갖는 TFP를 발현하며, 제2 세포가 또다른 제제, 예를 들어, TFP-발현 세포의 활성을 강화하는 제제를 발현한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 제제는 억제성 분자를 억제하는 제제일 수 있다. 억제성 분자는, 예를 들어, 일부 구현예에서, 면역 효과기 반응을 시작하기 위해 TFP-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제성 분자의 예는 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 일 구현예에서, 억제성 분자를 억제하는 제제는 세포에 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인과 회합된, 제1 폴리펩티드, 예를 들어, 억제성 분자를 포함한다.
TFP를 인코딩하는 시험관내 전사된 RNA를 생산하는 방법이 본원에 개시된다. 본 발명은 세포에 직접적으로 형질감염될 수 있는 TFP 인코딩 RNA 작제물을 또한 포함한다. 형질감염 시 사용하기 위한 mRNA를 생성하는 방법은 특별히 설계된 프라이머가 있는 주형의 시험관내 전사(IVT), 뒤이어 폴리A 부가를 포함하여, 3' 및 5' 미번역 서열("UTR"), 5' 캡 및/또는 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 발현될 핵산, 및 전형적으로 길이가 50개-2000개 염기인 폴리A 꼬리를 함유하는 작제물을 생산할 수 있다. 이렇게 생산된 RNA는 상이한 종류의 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다. 일 양태에서, 주형은 TFP에 대한 서열을 포함한다.
일 양태에서, 항-TAA TFP는 메신저 RNA(mRNA)에 의해 인코딩된다. 일 양태에서 항-TAA TFP를 인코딩하는 mRNA는 TFP-T 세포의 생산을 위해 T 세포에 도입된다. 일 구현예에서, 시험관내 전사된 RNA TFP는 일시적인 형질감염의 형태로서 세포에 도입될 수 있다. RNA는 폴리머라제 쇄 반응(PCR)-생성된 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생산된다. 임의의 공급원으로부터의 관심있는 DNA는 적절한 프라이머 및 RNA 폴리머라제를 사용하는 시험관내 mRNA 합성을 위해 주형 내로 PCR에 의해 직접적으로 전환될 수 있다. DNA의 공급원은, 예를 들어, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 DNA의 임의의 다른 적절한 공급원일 수 있다. 시험관내 전사를 위해 목적하는 주형은 본 발명의 TFP이다. 일 구현예에서, PCR을 위해 사용될 DNA는 열린 해독틀을 함유한다. DNA는 유기체의 게놈으로부터의 자연적으로 발생하는 DNA 서열로부터의 것일 수 있다. 일 구현예에서, 핵산은 일부 또는 모든 5' 및/또는 3' 미번역 영역(UTR)을 포함할 수 있다. 핵산은 엑손 및 인트론을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, PCR을 위해 사용될 DNA는 인간 핵산 서열이다. 또다른 구현예에서, PCR을 위해 사용될 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는 인간 핵산 서열이다. DNA는 대안적으로 자연적으로 발생하는 유기체에서 정상적으로 발현되지 않는 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시적인 인공 DNA 서열은 함께 결찰되어 융합 단백질을 인코딩하는 열린 해독틀을 형성하는 유전자의 부분을 함유하는 것이다. 함께 결찰되는 DNA의 부분은 단일 유기체로부터 또는 하나 초과의 유기체로부터의 것일 수 있다.
PCR은 형질감염을 위해 사용되는 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 생성하는 데 사용된다. PCR을 수행하는 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. PCR에서 사용하기 위한 프라이머는 PCR을 위한 주형으로서 사용될 DNA의 영역에 실질적으로 상보성인 영역을 갖도록 설계된다. "실질적으로 상보성인"은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 프라이머 서열 내의 다수 또는 모든 염기가 상보성이거나, 하나 이상의 염기가 비-상보성이거나, 미스매치되는 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보성인 서열은 PCR을 위해 사용된 어닐링(annealing) 조건 하에서 의도된 DNA 표적으로 어닐링 또는 하이브리드화할 수 있다. 프라이머는 DNA 주형의 임의의 부분에 실질적으로 상보성이도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는, 5' 및 3' UTR을 포함하는, 세포(열린 해독틀)에서 정상적으로 전사되는 핵산의 부분을 증폭시키도록 설계될 수 있다. 프라이머는 관심있는 특정한 도메인을 인코딩하는 핵산의 부분을 증폭시키도록 또한 설계될 수 있다. 일 구현예에서, 프라이머는, 5' 및 3' UTR의 모두 또는 부분을 포함하는, 인간 cDNA의 코딩 영역을 증폭시키도록 설계된다. PCR에 유용한 프라이머는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있는 합성 방법에 의해 생성될 수 있다. "순방향(forward) 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 업스트림인 DNA 주형 상에서 뉴클레오티드에 실질적으로 상보성인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "업스트림"은 코딩 가닥에 비해 증폭될 DNA 서열에 대해, 위치 5를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. "역방향(reverse) 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 다운스트림인 이중-가닥 DNA 주형에 실질적으로 상보성인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "다운스트림"은 코딩 가닥에 비해 증폭될 DNA 서열에 대해 위치 3'을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
PCR에 유용한 임의의 DNA 폴리머라제는 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 시약 및 폴리머라제는 수많은 공급원으로부터 상업적으로 이용가능하다.
안정성 및/또는 번역 효율을 촉진시키는 능력을 갖는 화학 구조가 또한 사용될 수 있다. RNA는 바람직하게는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 일 구현예에서, 5' UTR은 길이가 1개 내지 3,000개 뉴클레오티드이다. 코딩 영역에 부가될 5' 및 3' UTR 서열의 길이는, 이에 제한되지는 않으나, UTR의 상이한 영역에 어닐링되는 PCR을 위한 프라이머 설계를 포함하는 상이한 방법에 의해 변경될 수 있다. 이 접근법을 사용하여, 당업자는 전사된 RNA의 형질감염에 이어 최적의 번역 효율을 달성하는 데 사용될 수 있는 5' 및 3' UTR 길이를 변형할 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심있는 핵산에 대한 자연적으로 발생하는, 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심있는 핵산에 대해 내인성이 아닌 UTR 서열은 순방향 및 역방향 프라이머로 UTR 서열을 혼입함으로써 또는 주형의 임의의 다른 변형에 의해 부가될 수 있다. 관심있는 핵산에 대해 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 변형하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 3'UTR 서열 내의 AU-풍부 요소는 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있다는 사실이 공지되어 있다. 그러므로, 3' UTR은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있는 UTR의 특성에 기반하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 설계될 수 있다.
일 구현예에서, 5' UTR은 내인성 핵산의 코작(Kozak) 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 관심있는 핵산에 대해 내인성이 아닌 5' UTR이 상기에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 부가되고 있을 때, 공통 코작 서열은 5' UTR 서열을 부가함으로써 재설계될 수 있다. 코작 서열은 일부 RNA 전사체의 번역의 효율을 증가시킬 수 있지만, 모든 RNA에 효율적인 번역이 가능하도록 요구되는 것처럼 보이지 않는다. 다른 구현예에서 5' UTR은 RNA 게놈이 세포에서 안정적인 RNA 바이러스의 5'UTR일 수 있다. 다른 구현예에서 다양한 뉴클레오티드 유사체가 3' 또는 5' UTR에서 사용되어 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해할 수 있다.
유전자 클로닝에 대한 필요성 없이 DNA 주형로부터의 RNA의 합성을 가능하게 하기 위해, 전사의 프로모터는 전사될 서열의 DNA 주형 업스트림에 부착되어야 한다. RNA 폴리머라제에 대한 프로모터로서 기능하는 서열이 순방향 프라이머의 5' 말단에 부가될 때, RNA 폴리머라제 프로모터는 전사될 열린 해독틀의 PCR 생성물 업스트림 내로 혼입된다. 일 바람직한 구현예에서, 프로모터는 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이, T7 폴리머라제 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터는, 이에 제한되지는 않으나, T3 및 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함한다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 공통 뉴클레오티드 서열은 당해 기술분야에 공지되어 있다.
바람직한 구현예에서, mRNA는 세포에서 리보솜 결합, 번역의 개시 및 안정성 mRNA를 결정하는 5' 말단 및 3' 폴리(A) 꼬리 상에 캡을 둘 다 갖는다. 원형 DNA 주형, 예를 들어, 플라스미드 DNA 상에서, RNA 폴리머라제는 진핵 세포에서의 발현에 적합하지 않은 긴 연쇄동일서열(concatameric) 생성물을 생산한다. 3' UTR의 말단에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 전사 후 폴리아데닐화되더라도 진핵 형질감염 시 효과적이지 않은 정상 크기의 mRNA를 유발한다.
선형 DNA 주형 상에서, 파지 T7 RNA 폴리머라제는 주형의 마지막 염기를 넘어 전사체의 3' 말단을 확장할 수 있다(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).
DNA 주형 내로의 폴리A/T 스트레치(stretch)의 통합의 종래 방법은 분자 클로닝이다. 그러나 플라스미드 DNA 내로 통합된 폴리 A/T 서열은 플라스미드 불안정을 야기할 수 있고, 이는 박테리아 세포로부터 수득된 플라스미드 DNA 주형이 결실 및 다른 이상으로 종종 매우 오염되는 이유이다. 이것은 클로닝 절차를 힘들고 시간이 걸리게 할 뿐만 아니라 종종 신뢰할 수 없게 만든다. 이것이 클로닝 없이 폴리A/T 3' 스트레치가 있는 DNA 주형의 작제를 허용하는 방법이 매우 바람직한 이유이다.
전사 DNA 주형의 폴리A/T 세그먼트(segment)는 폴리T 꼬리, 예컨대, 100개의 T 꼬리(크기는 50개-5000개의 T일 수 있음)를 함유하는 역방향 프라이머를 사용함으로써 PCR 동안, 또는 PCR 후 이에 제한되지는 않으나, DNA 결찰 또는 시험관내 재조합을 포함하는, 임의의 다른 방법에 의해 생산될 수 있다. 폴리(A) 꼬리는 또한 RNA에 안정성을 제공하고 이들의 분해를 감소시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 꼬리의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양으로 상관관계가 있다. 일 구현예에서, 폴리(A) 꼬리는 100개 내지 5000개의 아데노신이다.
RNA의 폴리(A) 꼬리는 폴리(A) 폴리머라제, 예컨대, 이. 콜라이(E. coli) 폴리A 폴리머라제(E-PAP)의 사용으로 시험관내 전사에 이어 추가로 확장될 수 있다. 일 구현예에서, 100개의 뉴클레오티드에서 300개 내지 400개의 뉴클레오티드로의 폴리(A) 꼬리의 길이의 증가는 RNA의 번역 효율에서 약 2-배수 증가를 유발한다. 추가적으로, 3' 말단에의 상이한 화학기의 부착은 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 이러한 부착은 변형된/인공 뉴클레오티드, 압타머(aptamer) 및 다른 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체는 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 폴리(A) 꼬리 내로 혼입될 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다.
5' 캡스 온(caps on)은 RNA 분자에 안정성을 또한 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 당해 기술분야에서 공지된 그리고 본원에 기재된 기술을 사용하여 제공된다(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).
본원에 개시된 방법에 의해 생산된 RNA는 내부 리보솜 유입 부위(IRES) 서열을 또한 함유할 수 있다. IRES 서열은 mRNA에 캡-독립적인 리보솜 결합을 개시하고 번역의 개시를 가능하게 하는 임의의 바이러스성, 염색체의 또는 인공적으로 설계된 서열일 수 있다. 세포 투과도 및 생존도를 촉진하는 인자, 예컨대, 당, 펩티드, 지질, 단백질, 항산화제, 및 계면활성제를 함유할 수 있는, 세포 전기천공에 적합한 임의의 용질이 포함될 수 있다.
RNA는 임의의 수의 상이한 방법, 예를 들어, 이에 제한되지는 않으나, 전기천공(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, 독일 쾰른 소재)), (ECM 830(BTX) (Harvard Instruments, 메사추세츠주 보스톤 소재) 또는 Gene Pulser II(BioRad, 콜로라도주 덴버 소재), Multiporator(Eppendort, 독일 함부르크 소재), 리포펙션을 사용한 양이온성 리포좀 매개 형질감염, 중합체 캡슐화, 펩티드 매개 형질감염, 또는 바이오리스틱(biolistic) 입자 전달 시스템, 예컨대, "유전자 총"(예를 들어, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001) 참조)을 포함하는 상업적으로 이용가능한 방법을 사용하여 표적 세포 내로 도입될 수 있다.
TFP를 인코딩하는 핵산 작제물
본 개시내용은 본원에 기재된 하나 이상의 TFP 작제물을 인코딩하는 핵산 분자를 또한 제공한다. 일 양태에서, 핵산 분자는 메신저 RNA 전사체로서 제공된다. 일 양태에서, 핵산 분자는 DNA 작제물로서 제공된다.
목적하는 분자를 코딩하는 핵산 서열은 당해 기술분야에 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예컨대, 예를 들어 표준 기술을 사용하여, 유전자를 발현하는 세포로부터의 라이브러리를 스크리닝함으로써, 동일한 것을 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터의 유전자를 유도함으로써, 또는 동일한 것을 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접적으로 단리함으로써 수득될 수 있다. 대안적으로, 관심있는 유전자는 클로닝보다는 합성으로 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 핵산을 포함하는 벡터가 본원에 개시된다. 일부 경우에서, 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스성 벡터, 아데노-연관 바이러스성 벡터(AAV), 라우스 육종 바이러스성(RSV) 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에서, 벡터는 AAV6 벡터이다. 일부 경우에서, 벡터는 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 벡터는 시험관내 전사된 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 (예를 들어, 동시계류중인 가특허 출원 번호 제62/836,977호에 개시된 바와 같은) 원형 RNA 벡터이다.
본 개시내용은 본 발명의 DNA가 삽입되는 벡터를 또한 제공한다. 레트로바이러스, 예컨대, 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 이들이 이식유전자의 장기간, 안정한 통합 및 딸 세포에서의 이의 증식을 허용하므로 장기간 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 렌티바이러스성 벡터는 이들이 비-증식성 세포, 예컨대, 간세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 온코(onco)-레트로바이러스, 예컨대, 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 부가된 이점을 갖는다. 이들은 낮은 면역원성의 부가된 이점을 또한 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 재조합 핵산을 포함하는 벡터가 본원에 개시된다.
또다른 구현예에서, 본 개시내용의 목적하는 TFP를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 아데노바이러스성 벡터(A5/35)이다. 또다른 구현예에서, TFP를 인코딩하는 핵산의 발현은 트랜스포존, 예컨대, 슬리핑 뷰티(sleeping beauty), 크리스퍼(crisper), CAS9, 및 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease)의 사용으로 달성될 수 있다(June et al. 2009 Nature Reviews Immunol. 9.10: 704-716을 참조하며, 이 문헌은 본원에 참조로 편입됨).
본 개시내용의 발현 작제물은 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용하여, 핵산 면역화 및 유전자 요법을 위해 또한 사용될 수 있다. 유전자 전달을 위한 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, 본원에 전문이 참조로 편입되는 미국 특허 번호 제5,399,346호, 제5,580,859호, 제5,589,466호 참조). 또다른 구현예에서, 본 개시내용은 유전자 요법 벡터를 제공한다.
핵산은 많은 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은, 이에 제한되지는 않으나, 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드를 포함하는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특정한 관심있는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 및 서열분석 벡터를 포함한다.
추가로, 발현 벡터는 바이러스성 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스성 벡터 기술은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY)에, 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는, 이에 제한되지는 않으나, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함한다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선별 마커(selectable marker)에서의 기능적 복제의 기원을 함유한다(예를 들어, WO 01/96584호; WO 01/29058호; 및 미국 특허 번호 제6,326,193호).
많은 바이러스성 기반 시스템이 포유류 세포 내로의 유전자 전달을 위해 개발되어 왔다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 벡터 내로 삽입될 수 있고 당해 기술분야에서 공지된 기술을 사용하여 레트로바이러스성 입자에서 패키징(packaging)될 수 있다. 그후에 재조합 바이러스가 단리될 수 있고 생체내 또는 생체외 중 어느 하나로 대상체의 세포에 전달될 수 있다. 많은 레트로바이러스성 시스템이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 많은 아데노바이러스 벡터가 당해 기술분야에 공지되어 있다. 일 구현예에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
추가적인 프로모터 요소, 예를 들어, 인핸서가 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 시작 부위의 영역 30-110 bp 업스트림에 위치하지만, 뿐만 아니라 많은 프로모터가 시작 부위의 다운스트림에 기능성 요소를 함유하는 것으로 나타났다. 프로모터 요소 사이의 간격은 자주 가요성이어서, 요소가 다른 하나에 비해 역전되거나 이동될 때 프로모터 기능이 보존된다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성이 쇠퇴하기 시작하기 전에 별도로 50 bp까지 증가될 수 있다. 프로모터에 의존하여, 개별적인 요소는 전사를 활성화하기 위해 협력하여 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다.
포유류 T 세포에서 TFP 이식유전자를 발현할 수 있는 프로모터의 예는 EF1a 프로모터이다. 네이티브 EF1a 프로모터는, 리보솜에 아미노아실 tRNA의 효소적 전달을 담당하는, 신장 인자-1 복합체의 알파 서브유닛의 발현을 구동한다. EF1a 프로모터는 포유류 발현 플라스미드에서 광범위하게 사용되어왔고 렌티바이러스성 벡터 내로 클로닝된 이식유전자로부터의 TFP 발현을 구동하는 데 효과적인 것으로 나타났다(예를 들어, Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009) 참조). 프로모터의 또다른 예는 즉시 초기 사이토메갈로바이러스(immediate early cytomegalovirus(CMV)) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 서열과 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 구동할 수 있는 강한 구성적 프로모터 서열이다. 그러나, 이에 제한되지는 않으나 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부위(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡슈타인-바르 바이러스 즉시 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 신장 인자-1a 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하여, 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 추가로, 본 개시내용은 구성적 프로모터의 사용에 제한되지 않아야 한다. 유도성 프로모터가 본 발명의 일부로서 또한 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 이러한 발현을 목적할 때 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 시작, 또는 발현을 목적하지 않을 때 발현을 중지시킬 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는, 이에 제한되지는 않으나 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라시클린-조절된 프로모터를 포함한다.
TFP 폴리펩티드 또는 이의 부분의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 선별 마커 유전자 또는 리포터 유전자 중 어느 하나 또는 둘 다를 또한 함유하여 바이러스성 벡터를 통해 형질감염되거나 감염되려는 세포의 집단으로부터 발현 세포의 식별 및 선택을 또한 용이하게 할 수 있다. 다른 양태에서, 선별 마커는 DNA의 별개의 조각 상에 운반되어 있을 수 있고 동시-형질감염 절차에서 사용될 수 있다. 선별 마커 및 리포터 유전자 둘 다는 숙주 세포에서의 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열과 플랭킹(flanking)될 수 있다. 유용한 선별 마커는, 예를 들어, 항생제-저항성 유전자, 예컨대, 네오(neo) 등을 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 식별하기 위해 및 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수령체 유기체 또는 조직에서 존재하지 않거나 이들에 의해 발현되지 않는 그리고 발현이 일부 용이하게 검출가능한 특성, 예를 들어, 효소적 활성에 의해 분명해지는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수령체 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 분석된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로르암페니콜 아세틸 전달효소, 분비된 알칼리성 포스파타제를 인코딩하는 유전자, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). 적합한 발현 시스템은 널리 공지되어 있으며 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있거나 상업적으로 수득될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 발현의 최고 수준을 나타내는 최소 5' 플랭킹 영역이 있는 작제물은 프로모터로서 식별된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자와 연결될 수 있고 프로모터-구동된 전사를 바꾸는 능력에 대해 제제를 평가하는 데 사용될 수 있다.
세포 내로 유전자를 도입하고 발현하는 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 당해 기술분야에서의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어, 포유류, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 이동될 수 있다.
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격(particle bombardment), 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당해 기술분야에 널리-공지되어 있다(예를 들어, Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY 참조). 숙주 세포 내로의 폴리뉴클레오티드 도입을 위한 한 가지 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
숙주 세포 내로 관심있는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스성 벡터, 및 특히 레트로바이러스성 벡터는 포유류, 예를 들어, 인간 세포 내로 유전자를 삽입하기 위한 가장 광범위하게 사용되는 방법이 되어왔다. 다른 바이러스성 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 제5,350,674호 및 제5,585,362호 참조).
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 화학적 방법은 콜로이드성 분산 시스템, 예컨대, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구형체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 마이셀, 혼합된 마이셀, 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포좀(예를 들어, 인공 막 소포)이다. 핵산의 최첨단의 표적화된 전달의 다른 방법, 예컨대, 표적화된 나노입자 또는 다른 적합한 1 마이크론 미만(submicron) 크기의 전달 시스템을 이용한 폴리뉴클레오티드의 전달이 이용가능하다.
비-바이러스성 전달 시스템이 이용되는 경우에, 예시적인 전달 비히클은 리포좀이다. 지질 제형의 사용이 숙주 세포 내로의 (시험관내, 생체외 또는 생체내) 핵산의 도입을 위해 고려된다. 또다른 양태에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포좀의 수성 내부에서 캡슐화될 수 있거나, 리포좀의 지질 이중층 내에 산재될 수 있거나, 리포좀 및 올리고뉴클레오티드 둘 다와 회합된 연결 분자를 통해 리포좀에 부착될 수 있거나, 리포좀 내에 포획될 수 있거나, 리포좀과 복합체화될 수 있거나, 지질을 함유한 용액 중에 분산될 수 있거나, 지질과 혼합될 수 있거나, 지질과 조합될 수 있거나, 지질 중 현탁액으로서 함유될 수 있거나, 마이셀과 함께 함유 또는 복합체화될 수 있거나, 달리 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 연관 조성물은 용액 중 임의의 특정한 구조에 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조에서, 마이셀로서, 또는 "붕괴된" 구조와 함께 존재할 수 있다. 이들은 또한 용액 중에 단순히 산재되어 가능하게는 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집물을 형성할 수 있다. 지질은 자연적으로 발생하거나 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 액적뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체, 예컨대, 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올, 및 알데히드를 함유하는 화합물의 부류를 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 상업적인 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma로부터 수득할 수 있고; 디세틸 포스페이트("DCP")는 K & K Laboratories(뉴욕주 플레인뷰 소재)로부터 수득할 수 있고; 콜레스테롤("Choi")은 Calbiochem-Behring으로부터 수득할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc.(앨라배마주 버밍햄 소재)로부터 수득할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중 지질의 저장액(stock solution)은 약 -20℃에서 저장될 수 있다. 클로로포름은 이것이 메탄올보다 보다 용이하게 증발되므로 용매로서만 사용된다. "리포좀"은 봉입된 지질 이중층 또는 응집물의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중층 지질 비히클을 아우르는 일반적인 용어이다. 리포좀은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질이 있는 소포성 구조를 갖는 것으로서 특징지어질 수 있다. 다중층 리포좀은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 이들은 인지질이 과잉의 수용액 중에 현탁될 때 자발적으로 형성한다. 지질 성분은 폐쇄된 구조의 형성 전 자기-재배열을 겪고 지질 이중층 사이에 물 및 용해된 용질을 포집한다(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 정상적인 소포성 구조보다 용액에서 상이한 구조를 갖는 조성물이 또한 아울러진다. 예를 들어, 지질은 마이셀 구조를 지닐 수 있거나 단지 지질 분자의 비균일한 응집물로서 존재할 수 있다. 리포펙타민-핵산 복합체가 또한 고려된다.
숙주 세포 내로 외인성 핵산을 도입하는 데 또는 달리 본 발명의 억제제에 세포를 노출시키는 데 사용되는 방법과 무관하게, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어, 당업자에게 널리 공지된 "분자 생물학적" 검정, 예컨대, 서던 및 노던 블로팅, RT-PCR 및 PCR; "생화학적" 검정, 예컨대, 예를 들어, 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의한 또는 본 발명의 범주 내에 속하는 제제를 식별하기 위해 본원에 기재된 검정에 의한 특정한 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다.
유전자 편집(Gene editing) 기술
일부 구현예에서, 본원에 개시된 변형된 T 세포가 유전자 편집 기술, 예컨대 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(clustered regularly interspaced short palindromic repeats; CRISPR®, 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,697,359호 참조), 전사 활성인자-유사 효과기(transcription activator-like effector; TALE) 뉴클레아제(TALEN, 예를 들어, 제9,393,257호 참조), 메가뉴클레아제(12개 내지 40개 염기쌍의 이중-가닥 DNA 서열을 포함하는 큰 인식 부위를 갖는 엔도데옥시리보뉴클레아제), 징크 핑커 뉴클레아제(ZFN, 예를 들어, Urnov et al., Nat. Rev. Genetics (2010) v11, 636-646 참조), 또는 메가TAL 뉴클레아제(TAL 반복부위에 대한 메가뉴클레아제의 융합 단백질) 방법을 사용하여 조작된다. 이 방법으로, 키메릭 작제물이 조작되어 각각의 서브유닛의 바람직한 특징, 예컨대 형태 또는 신호전달 역량을 조합할 수 있다. 또한 Sander & Joung, Nat. Biotech. (2014) v32, 347-55; 및 June et al., 2009 Nature Reviews Immunol. 9.10: 704-716을 참조하며, 이들 문헌 각각은 본원에 참조로 편입된다. 일부 구현예에서, TFP 서브유닛의 하나 이상의 세포외 도메인, 막관통 도메인, 또는 세포질 도메인은 하나 초과의 천연 TCR 서브유닛 도메인의 측면을 갖도록 조작된다(즉, 키메릭이다).
인간 게놈을 영구적으로 변경하고 질환 관련 유전자에서 부위-특이적 게놈 변형을 도입하기 위한 최근의 기술 개발은 치료적 적용법의 기초를 놓는다. 이들 기술은 현재 통상적으로 "게놈 편집으로 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 기술은 내인성 TCR 유전자를 파괴하는 데 이용된다. 일부 구현예에서, 언급된 내인성 TCR 유전자는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, 또는 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 기술은 다중 게놈 편집(multiplex genomic editing)을 위한 길을 여는데, 이는 내인성 TCR 유전자 내의 다수의 게놈 위치의 동시 파괴를 허용한다. 일부 구현예에서, 다중 게놈 편집 기술은 내인성 TCR, 및/또는 인간 백혈구 항원(HLA), 및/또는 프로그램화된 세포사멸 단백질 1(PD1). 및/또는 다른 유전자의 발현 시 결함이 있는 유전자-파괴된 T 세포를 생성하기 위해 적용된다.
현재의 유전자 편집 기술은 메가뉴클레아제, 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), TAL 효과기 뉴클레아제(TALEN), 및 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(CRISPR)/CRISPR)-연관(Cas) 시스템을 포함한다. 이들 4개의 주요 부류의 유전자-편집 기술은 DNA의 사용자-정의된 서열에 결합하고 이중-가닥 DNA 절단(break)(DSB)을 매개한다는 점에서 공통적인 작용 양식을 공유한다. 그후에 DSB는 비-상동성 말단 봉합(non-homologous end joining; NHEJ) 또는 - 공여체 DNA가 존재할 때 - 공여체 DNA 단편으로부터 상동성 서열을 도입하는 사건인, 상동성 재조합(HR) 중 어느 하나에 의해 수선될 수 있다. 추가적으로, 니카아제(nikase) 뉴클레아제는 단일-가닥 DNA 절단(SSB)을 생성한다. DSB는 공여체 DNA로부터 상동성 서열을 도입하는 사건인 단일 가닥 DNA 혼입(ssDI) 또는 단일 가닥 주형 수선(ssTR)에 의해 수선될 수 있다.
게놈 DNA의 유전적 변형은 관심있는 위치에서 DNA 서열을 인식하도록 조작된 부위-특이적인, 레어-커팅(rare-cutting) 엔도뉴클레아제를 사용하여 수행될 수 있다. 조작된, 부위-특이적인 엔도뉴클레아제를 생산하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN)는 게놈 내 사전결정된 부위를 인식하고 자르도록 조작될 수 있다. ZFN은 Fok1 제한 효소의 뉴클레아제 도메인과 융합된 징크 핑거 DNA-결합 도메인을 포함하는 키메릭 단백질이다. 징크 핑거 도메인은 합리적 또는 실험적 수단을 통해 재설계되어 사전정의된, 길이가 18개 염기쌍인 - DNA 서열에 결합하는 단백질을 생산할 수 있다. 이 조작된 단백질 도메인을 Fok1 뉴클레아제와 융합함으로써, 게놈-수준의 특이성으로 DNA 절단을 표적화하는 것이 가능하다. ZFN은 넓은 범위의 진핵 유기체에서 유전자 부가, 제거, 및 치환을 표적화하는 데 광범위하게 사용되어왔다(Durai et al. (2005), Nucleic Acids Res 33, 5978에서 검토됨). 마찬가지로, TAL-효과기 뉴클레아제(TALEN)는 게놈 DNA에서 특이적인 부위를 절단하도록 생성될 수 있다. ZFN과 마찬가지로, TALEN은 Fok1 뉴클레아제 도메인과 융합된, 조작된, 부위-특이적인 DNA-결합 도메인을 포함한다(Mak et al. (2013), Curr Opin Struct Biol. 23:93-9에서 검토됨). 그러나, 이 경우에서는, DNA 결합 도메인이 TAL-효과기 도메인의 일렬 배열(array)을 포함하는데, 이들 각각은 단일 DNA 염기쌍을 특이적으로 인식한다. 콤팩트(compact) TALEN은 이량체화에 대한 필요성을 방지하는 대안적인 엔도뉴클레아제 구성을 갖는다(Beurdeley et al. (2013), Nat Commun. 4: 1762). 콤팩트 TALEN은 I-TevI 호밍(homing) 엔도뉴클레아제로부터의 뉴클레아제 도메인과 융합된, 조작된, 부위-특이적인 TAL-효과기 DNA-결합 도메인을 포함한다. FokI과 달리, I-TevI는 이중-가닥 DNA 절단을 생산하기 위해 이량체화될 필요가 없어 콤팩트 TALEN은 단량체로서 기능적이다.
CRISPR/Cas9 시스템에 기반한 조작된 엔도뉴클레아제가 또한 당해 기술분야에 공지되어 있다(Ran et al. (2013), Nat Protoc. 8:2281-2308; Mali et al. (2013), Nat Methods 10:957-63). CRISPR 유전자-편집 기술은 DNA-표적화 특이성 및 컷팅 활성이 짧은 가이드 RNA 또는 이중쇄(duplex) crRNA/TracrRNA에 의해 프로그램화될 수 있는 엔도뉴클레아제 단백질로 구성된다. CRISPR 엔도뉴클레아제는 두 가지 성분을 포함한다: (1) 카스파아제 효과기 뉴클레아제, 전형적으로 미생물 Cas9; 및 (2) 뉴클레아제를 게놈 내 관심있는 위치로 지시하는 18개 내지 20개의 뉴클레오티드 표적화 서열을 포함하는 짧은 "가이드 RNA" 또는 RNA 이중쇄. 각각이 상이한 표적화 서열을 갖는 다수의 가이드 RNA를 동일한 세포에서 발현함으로써, 게놈 내 다수의 부위에 동시적으로 DNA 절단을 표적화하는 것이 가능하다(다중 게놈 편집).
당해 기술분야에 공지된 2개 부류의 CRISPR 시스템이 있는데(Adli (2018) Nat. Commun. 9:1911), 각각은 다수의 CRISPR 유형을 함유한다. 부류 1은 고세균류에서 공통적으로 발견되는 I 유형 및 III 유형 CRISPR 시스템을 함유한다. 그리고, 부류 II는 II, IV, V, 및 VI 유형 CRISPR 시스템을 함유한다. 가장 널리 사용되는 CRISPR/Cas 시스템은 II 유형 CRISPR-Cas9 시스템이지만, CRISPR/Cas 시스템은 게놈 편집을 위해 연구자들에 의해 용도변경되어왔다. 10개 초과의 상이한 CRISPR/Cas 단백질이 지난 몇년 내에 재모델링되어왔다(Adli (2018) Nat. Commun. 9:1911). 이들 중에서, 예컨대 악시다미코쿠스 종(Ascpf1) 및 라크노스피라시에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium)(LbCpf1)으로부터의 Cas12a(Cpf1) 단백질이 특히 흥미롭다.
호밍 엔도뉴클레아제는 식물 및 진균류의 게놈에서 공통적으로 발견되는 15개-40개의 염기-쌍 절단 부위를 인식하는 자연적으로-발생하는 뉴클레아제의 군이다. 이들은 기생충성 DNA 요소, 예컨대 그룹 1 자가-스플라이싱 인트론 및 인테인과 자주 회합된다. 이들은 세포 DNA-수선 기구를 모집하는 염색체 내의 이중-가닥 절단을 생산함으로써 숙주 게놈 내의 특정한 위치에서 상동성 재조합 또는 유전자 삽입을 자연적으로 촉진한다(Stoddard (2006), Q. Rev. Biophys. 38: 49-95). 특이적인 아미노산 치환은 호밍 뉴클레아제의 DNA 절단 특이성을 리프로그래밍할 수 있다(Niyonzima (2017), Protein Eng Des Sel. 30(7): 503-522). 메가뉴클레아제(MN)는 박테리아 호밍 엔도뉴클레아제로부터 유래되고 유일한 표적 부위를 위해 조작된 선천적인 뉴클레아제 활성이 있는 단량체성 단백질이다(Gersbach (2016), Molecular Therapy. 24: 430-446). 일부 구현예에서, 메가뉴클레아제는 조작된 I-CreI 호밍 엔도뉴클레아제이다. 다른 구현예에서, 메가뉴클레아제는 조작된 I-SceI 호밍 엔도뉴클레아제이다.
언급된 4개의 주요 유전자 편집 기술에 더하여, 메가뉴클레아제, ZFN, 및 TALEN의 융합을 포함하는 키메릭 단백질이, ZFN 및 TALEN의 결합 친화도 및 메가뉴클레아제의 절단 특이성의 이점을 취하는 신규한 단량체성 효소를 생성하도록 조작되었다(Gersbach (2016), Molecular Therapy. 24: 430-446). 예를 들어, 메가TAL은 단일 키메릭 단백질인데, 이는 TALEN으로부터의 쉬운 맞춤(easy-to-tailor) DNA 결합 도메인과 메가뉴클레아제의 높은 절단 효율의 조합물인 단일 키메릭 단백질이다.
유전자 편집 기술을 수행하기 위해, 뉴클레아제, 및 CRISPR/Cas9 시스템의 경우에, gRNA는 관심있는 세포에 효율적으로 전달되어야만 한다. 전달 방법, 예컨대 물리적, 화학적, 및 바이러스성 방법이 당해 기술분야에 또한 공지되어 있다(Mali (2013). Indian J. Hum. Genet. 19: 3-8.). 일부 경우에서, 물리적 전달 방법은 이에 제한되지는 않으나 전기천공, 미세주입, 또는 탄도 입자(ballistic particle)의 사용의 방법으로부터 선택될 수 있다. 반면에, 화학적 전달 방법은 복합체 분자, 예컨대 인산칼슘, 지질, 또는 단백질의 사용을 요구한다. 일부 구현예에서, 바이러스성 전달 방법은 바이러스, 이에 제한되지는 않으나 예컨대 아데노바이러스, 렌티바이러스, 및 레트로바이러스를 사용하여 유전자 편집 기술에 적용된다.
본 발명은 TFP 인코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 일 양태에서, TFP 벡터는 세포, 예를 들어 T 세포 내로 직접적으로 형질도입될 수 있다. 일 양태에서, 벡터는 클로닝 또는 발현 벡터, 예를 들어, 이에 제한되지는 않으나, 하나 이상의 플라스미드(예를 들어, 발현 플라스미드, 클로닝 벡터, 미니서클, 미니벡터, 미소쌍염색체(double minute chromosome)), 레트로바이러스성 및 렌티바이러스성 벡터 작제물을 포함하는 벡터이다. 일 양태에서, 벡터는 포유류 T 세포에서 TFP 작제물을 발현할 수 있다. 일 양태에서, 포유류 T 세포는 인간 T 세포이다.
T 세포의 공급원
확장 및 유전적 변형에 앞서, T 세포의 공급원은 대상체로부터 수득된다. 용어 "대상체"는 면역 반응이 끌어내질 수 있는 살아있는 유기체(예를 들어, 포유류)을 포함하도록 의도된다. 대상체의 예는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 이들의 트랜스제닉(transgenic) 종을 포함한다. T 세포는, 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 가슴샘 조직, 감염, 복수, 늑막 삼출의 부위로부터의 조직, 비장 조직, 및 종양을 포함하는, 많은 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정한 양태에서, 당해 기술분야에서 이용가능한 여러 가지 T 세포주가 사용될 수 있다. 본 발명의 특정한 양태에서, T 세포는 당업자에게 공지된 여러 가지 기술, 예컨대, Ficoll™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액의 유닛(unit)으로부터 수득될 수 있다. 일 바람직한 양태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 분리반출법(apheresis)에 의해 수득된다. 분리반출법 생성물은 전형적으로 T 세포를 포함하는, 림프구, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵의 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 함유한다. 일 양태에서, 분리반출법에 의해 수집된 세포는 세척되어 혈장 분획을 제거하고 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지 중에 세포를 배치할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 일 대안적인 양태에서, 세척 용액은 칼슘이 결여되어 있고 마그네슘이 결여되어 있을 수 있거나 모든 2가 양이온이 아니더라도 많이 결여되어 있을 수 있다. 칼슘의 부재 시 초기 활성화 단계는 확대된 활성화를 초래할 수 있다. 당업자가 용이하게 인지할 바와 같이 세척 단계는 당업자에게 공지된 방법, 예컨대, 제조업체의 지시에 따라 세미-자동화 "통과액" 원심분리기(예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 사용함으로써 달성될 수 있다. 세척 후, 세포는 다양한 생체적합성 완충액, 예컨대, 예를 들어, Ca-무함유, Mg-무함유 PBS, PlasmaLyte A, 또는 다른 염수 용액 중에 완충액과 함께 또는 완충액 없이 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 분리반출법 시료의 바람직하지 않은 성분은 제거될 수 있고 세포는 직접적으로 배양 배지 중에 재현탁될 수 있다.
일 양태에서, T 세포는, 예를 들어, PERCOLLTM 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심 세정(counterflow centrifugal elutriation)에 의해, 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. T 세포의 특이적인 하위집단, 예컨대, CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+ T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 일 양태에서, T 세포는 항-CD3/항-CD28(예를 들어, 3x28)-콘주게이트된 비드, 예컨대, DYNABEADS™ M-450 CD3/CD28 T와 함께, 목적하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 기간 동안 인큐베이션(incubation)에 의해 단리된다. 일 양태에서, 기간은 약 30분이다. 추가의 양태에서, 기간은 30분 내지 36시간 이상 및 그 사이에 있는 모든 정수값의 범위에 이른다. 추가의 양태에서, 기간은 적어도 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 또는 6시간이다. 더욱 또다른 바람직한 양태에서, 기간은 10시간 내지 24시간이다. 일 양태에서, 인큐베이션 기간은 24시간이다. 보다 긴 인큐베이션 시간이 다른 세포 유형과 비교하여 소수의 T 세포가 있는 임의의 상황에서, 예컨대 종양 조직으로부터 또는 면역약화된 개체로부터의 종양 침윤 림프구(TIL)의 단리 시에도 T 세포를 단리시키는 데 사용될 수 있다. 추가로, 보다 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포착 효율을 증가시킬 수 있다. 이에 따라, 시간을 단순히 단축하거나 연장함으로써 T 세포를 CD3/CD28 비드에 결합하도록 허용하고/하거나 (본원에 추가로 기재된 바와 같이), 비드 대 T 세포의 비율을 증가시키거나 증가시킴으로써, T 세포의 하위집단이 처리 동안 배양 개시 또는 다른 시점에서 향배에 따라 우선적으로 선택될 수 있다. 추가적으로, 비드 또는 다른 표면 상에서 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가시키거나 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시 또는 다른 목적하는 시점에서 향배에 따라 우선적으로 선택될 수 있다. 당업자는 다횟수의 선택이 본 발명의 맥락에서 또한 사용될 수 있다는 점을 인식할 것이다. 특정한 양태에서, 선택 절차를 수행하는 것 및 활성화 및 확장 과정에서 "미선택된" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "미선택된" 세포는 추가 횟수의 선택을 또한 받을 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성으로 선택된 세포에 독특한 표면 마커로 지시되는 항체의 조합물로 달성될 수 있다. 하나의 방법은 음성으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커로 지시되는 단클론성 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유세포 분석법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의한 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 단클론성 항체 칵테일은 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 전형적으로 포함한다. 특정한 양태에서, CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+, 및 FoxP3+를 전형적으로 발현하는 조절 T-세포의 경우 농축하거나 양성으로 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 특정한 양태에서, T 조절 세포는 항-C25 콘주게이트된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 격감된다.
일 구현예에서, 하나 이상의 IFN-γ, TNF-알파, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B, 및 퍼포린, 또는 다른 적절한 분자, 예를 들어, 다른 사이토킨을 발현하는 T 세포 집단이 선택될 수 있다. 세포 발현을 위한 스크리닝 방법은, 예를 들어, PCT 공개 번호: WO 2013/126712호에 기재된 방법에 의해 결정될 수 있다.
양성 또는 음성 선택에 의한 세포의 목적하는 집단의 단리를 위해, 세포의 농도 및 표면(예를 들어, 입자, 예컨대, 비드)은 변화될 수 있다. 특정한 양태에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해, 비드와 세포가 함께 혼합되는 용적을 현저하게 감소(예를 들어, 세포의 농도를 증가)시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 양태에서, 20억 개 세포/㎖의 농도가 사용된다. 일 양태에서, 10억 개 세포/㎖의 농도가 사용된다. 추가의 양태에서, 1억 개 초과 세포/㎖가 사용된다. 추가의 양태에서, 1천만, 1천5백만, 2천만, 2천5백만, 3천만, 3천5백만, 4천만, 4천5백만, 또는 5천만 개 세포/㎖의 세포의 농도가 사용된다. 보다 일 양태에서, 7천5백만, 8천만, 8천5백만, 9천만, 9천5백만, 또는 1억 개 세포/㎖부터의 세포의 농도가 사용된다. 추가의 양태에서, 1억2천5백만 또는 1억5천만 개 세포/㎖의 농도가 사용될 수 있다. 고 농도를 사용하는 것은 증가된 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장을 유발할 수 있다. 추가로, 고 세포 농도의 사용은 관심있는 표적 항원, 예컨대, CD28-음성 T 세포를 약하게 발현할 수 있는, 또는 존재하는 많은 종양 세포가 있는 시료(예를 들어, 백혈병성 혈액, 종양 조직 등)로부터의 세포의 보다 효율적인 포착을 허용한다. 이러한 세포의 집단은 치료 가치를 가질 수 있고 수득하기에 바람직할 것이다. 예를 들어, 고 농도의 세포를 사용하는 것은 정상적으로 보다 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 허용한다.
관련된 양태에서, 세포의 보다 낮은 농도를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포의 혼합물 및 표면(예를 들어, 입자, 예컨대, 비드)을 현저하게 희석함으로써, 입자와 세포 사이의 상호작용이 최소화된다. 이것은 입자에 결합될 다량의 목적하는 항원을 발현하는 세포에 대해 선택한다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 희석 농도에서 CD28의 보다 높은 수준을 발현하고 CD8+ T 세포보다 보다 효율적으로 포착된다. 일 양태에서, 사용되는 세포의 농도는 5 x 106/㎖이다. 다른 양태에서, 사용되는 농도는 약 1 x 105/㎖ 내지 1 x 106/㎖, 및 그 사이의 임의의 정수값일 수 있다. 다른 양태에서, 세포는 2-10℃에서 또는 상온에서 변화하는 속도로 변화하는 시간의 길이 동안 회전자(rotator)에서 인큐베이션될 수 있다.
자극을 위한 T 세포는 세척 단계 후 또한 냉동될 수 있다. 이론에 의해 구속되고자 함 없이, 냉동 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도까지 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 냉동 용액 중에 현탁될 수 있다. 많은 냉동 용액 및 매개변수가 당해 기술분야에 공지되어 있고 이 맥락에서 유용할 것이지만, 하나의 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% Plasmalyte-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지 또는, 예를 들어, Hespan 및 PlasmaLyte A를 함유하는 다른 적합한 세포 냉동 배지를 사용하는 것을 수반하고, 그후에 세포는 분당 1의 속도로 -80℃로 냉동되고 액체 질소 저장 탱크의 증기상에서 저장된다. 제어된 냉동의 다른 방법 뿐만 아니라 -20℃에서 또는 액체 질소 중 비제어된 즉시 냉동이 사용될 수 있다. 특정한 양태에서, 동결보존된 세포는 본원에 기재된 바와 같이 해동되고 세척되며 본 발명의 방법을 사용한 활성화에 앞서 상온에서 1시간 동안 두도록 허용된다.
또한 본 발명의 맥락에서 본원에 기재된 바와 같이 확장된 세포가 필요할 수 있을 때에 앞선 기간에서 대상체로부터 혈액 시료 또는 분리반출법 생성물의 수집이 고려된다. 이와 같이, 확장될 세포의 공급원은 필요한 임의의 시점에서 수집될 수 있고, 목적하는 세포, 예컨대, T 세포는 T 세포 요법, 예컨대, 본원에 기재된 것으로부터 이익이 될 여러 가지 질환 또는 병태에 대한 T 세포 요법에서 나중 사용을 위하여 단리되고 냉동될 수 있다. 일 양태에서 혈액 시료 또는 분리반출법은 일반적으로 건강한 대상체로부터 취해진다. 특정한 양태에서, 혈액 시료 또는 분리반출법은 질환을 발병시킬 위험이 있지만, 아직 질환을 발병시키지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 취해지고, 관심있는 세포는 나중 사용을 위하여 단리되고 냉동된다. 특정한 양태에서, T 세포는 확장될 수 있고, 냉동될 수 있고, 나중 시간에 사용될 수 있다. 특정한 양태에서, 시료는 본원에 기재된 바와 같은 특정한 질환의 진단 직후 그러나 임의의 치료에 앞서 환자로부터 수집된다. 추가의 양태에서, 세포는 이에 제한되지는 않으나, 제제, 예컨대, 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대, 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제(immunoablative agent), 예컨대, 알렘투주맙, 항-CD3 항체, 사이톡산, 플루다라빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 및 조사(irradiation)를 이용한 치료를 포함하는, 여러 가지 관련된 치료 양식에 앞서 대상체로부터 혈액 시료 또는 분리반출법으로 단리된다.
본 발명의 추가의 양태에서, T 세포는 대상체에 기능성 T 세포를 남기는 치료에 이어 직접적으로 환자로부터 수득된다. 이와 관련하여, 다음의 특정한 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물을 이용한 치료에 이어, 환자가 치료로부터 정상적으로 회복되고 있을 기간 동안의 치료 직후, 수득된 T 세포의 질이 최적일 수 있거나 생체외에서 확장하는 그들의 능력에 대해 개선될 수 있다는 사실이 관찰되어왔다. 마찬가지로, 본원에 기재된 방법을 사용한 생체외 조작(manipulation)에 이어, 이들 세포는 향상된 생착(engraftment) 및 생체내 확장에 대해 바람직한 상태에 있을 수 있다. 이에 따라, 이 회복기 동안, T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함하는, 혈액 세포를 수집하는 것이 본 발명의 맥락 내에서 고려된다. 추가로, 특정한 양태에서, 동원(mobilization)(예를 들어, GM-CSF를 이용한 동원) 및 컨디셔닝 섭생(conditioning regimen)은 대상체에서 병태를 창출하는 데 사용될 수 있고 여기서 특정한 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생, 및/또는 확장은, 특히 요법에 이은 제한된 시간대 동안 유리하다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
T 세포의 활성화 및 확장
T 세포는, 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호, 및 제7,572,631호에 기재된 바와 같은 방법을 일반적으로 사용하여 활성화되고 확장될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 T 세포는 CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 제제 및 T 세포의 표면 상에서 공자극 분자를 자극하는 리간드가 서열에 부착된 표면과 접촉시킴으로써 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은 본원에 기재된 바와 같이, 예컨대, 항-CD3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 표면 상에 고정된 항-CD2 항체와 접촉시킴으로써, 또는 칼슘 이오노포어(ionophore)와 함께 단백질 키나제 C 활성인자(예를 들어, 브리오스타틴)와 접촉시킴으로써 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상에서 부속 분자의 공-자극을 위해, 부속 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기 위한 적절한 조건하에서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 중 어느 하나의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD28 항체의 예는 당해 기술분야에서 통상적으로 공지된 다른 방법이 할 수 있는 것처럼 사용될 수 있는 9.3, B-T3, XR-CD28(Diaclone, 프랑스 브장송 소재)을 포함한다(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol. Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
변화되는 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 전형적인 혈액 또는 분리반출된 말초 혈액 단핵 세포 생성물은 세포독성 또는 억제자 T 세포 집단(TC, CD8+)보다 큰 헬퍼 T-세포 집단(TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체의 자극에 의한 T 세포의 생체외 확장은 약 8-9일에 앞서 우세하게 TH 세포로 구성되는 T 세포의 집단을 생산하는 반면, 약 8-9일 후, T 세포의 집단은 갈수록 더 TC 세포의 보다 큰 집단을 포함한다. 따라서, 치료의 목적에 의존하여, 우세하게 TH 세포를 포함하는 T 세포 집단을 대상체에 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원-특이적 서브셋(subset)이 단리되었을 경우에 이 서브셋을 보다 큰 정도로 확장하는 것이 유익할 수 있다.
추가로, CD4 및 CD8 마커에 더하여, 다른 표현형 마커는 현저하게, 그러나 큰 부분에서, 세포 확장 과정의 경과 동안 재생가능하게 변화한다. 이에 따라, 이러한 재현성은 특이적 목적을 위해 활성화된 T 세포 생성물을 조정하는 능력을 가능하게 한다.
일단 항-TAA TFP가 작제되면, 다양한 검정이 사용되어 분자의 활성, 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 항원 자극에 이어 T-세포를 확장하고, 재-자극의 부재 시 T 세포의 확장을 지속시키는 능력, 및 적절한 시험관내 및 동물 모델에서 항-암 활성을 평가할 수 있다. 항-TAA TFP의 효과를 평가하는 검정은 하기에서 더욱 상세히 기재된다.
1차 T 세포에서 TFP 발현의 웨스턴 블롯 분석은 단량체 및 이량체의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009) 참조). 매우 간략하게, TFP를 발현하는 T 세포(CD4+ 및 CD8+ T 세포의 1:1 혼합물)는 10일 초과 동안 시험관내에서 확장되고 뒤이어 용해 및 환원 조건 하에서 SDS-PAGE가 적용된다. TFP는 TCR 쇄에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블로팅에 의해 검출된다. 동일한 T 세포 서브셋은 공유적인 이량체 형성의 평가를 허용하는 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE 분석을 위해 사용된다.
항원 자극에 이은 TFP+ T 세포의 시험관내 확장은 유세포 분석법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물은 알파CD3/알파CD28 및 APC로 자극되고 뒤이어 분석될 프로모터의 제어 하에서 GFP를 발현하는 렌티바이러스성 벡터로 형질도입된다. 예시적인 프로모터는 CMV IE 유전자, EF-1알파, 유비퀴틴 C, 또는 포스포글리세로키나제(PGK) 프로모터를 포함한다. GFP 형광은 유세포 분석법에 의해 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 서브셋에서 배양의 6일 째에 평가된다(예를 들어, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009) 참조). 대안적으로, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물은 0일 째에 알파CD3/알파CD28 코팅된 자기 비드로 자극되고, 2A 리보좀 스키핑 서열(ribosomal skipping sequence)을 사용하여 eGFP와 함께 TFP를 발현하는 비시스트론성(bicistronic) 렌티바이러스성 벡터를 사용하여 1일 째에 TFP로 형질도입된다. 배양액은 세척에 이어 TAA+ 세포(예를 들어, K562 세포) 야생형 K562 세포(K562 야생형) 또는, 항CD3 및 항-CD28 항체의 존재 시 hCD32 및 4-1BBL을 발현하는 K562 세포(K562-BBL-3/28) 중 어느 하나로 재-자극된다. 외인성 IL-2는 100 IU/㎖로 격일마다 배양액에 첨가된다. GFP+ T 세포는 비드-기반 계수를 사용하여 유세포 분석법에 의해 열거된다(예를 들어, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009) 참조).
재-자극의 부재 시 지속되는 TFP+ T 세포 확장이 또한 측정될 수 있다(예를 들어, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009) 참조). 간략하게, 평균 T 세포 용적(fl)은 0일 째에 알파CD3/알파CD28 코팅된 자기 비드를 이용한 자극, 및 1일 째의 지시된 TFP를 이용한 형질도입에 이어 Coulter Multisizer III 입자 카운터를 사용하여 배양의 8일 째에 측정된다.
동물 모델이 TFP-T 활성을 측정하는 데 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역결핍 마우스에서 암을 치료하기 위해 인간 TAA-특이적 TFP+ T-세포를 사용하는 이종이식 모델(예를 들어, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009) 참조). 매우 간략하게, 암의 확립 후, 마우스는 치료군에 관하여 무작위화된다. 상이한 수의 조작된 T 세포는 암을 지닌 NOD/SCID/γ-/- 마우스 내로 1:1 비로 공동주사된다. 마우스로부터의 비장 DNA 내의 각각의 벡터의 사본 수는 T 세포 주사에 이어 다양한 시간에 평가된다. 동물은 주 간격으로 암에 대해 평가된다. 말초 혈액 TAA+ 암세포 수는 알파TAA-제타 TFP+ T 세포 또는 모의-형질도입된 T-세포가 주사되는 마우스에서 측정된다. 군에 대한 생존 곡선은 로그-순위 시험을 사용하여 비교된다. 더욱이, NOD/SCID/γ-/- 마우스 내의 T 세포 주사에 이어 4주에 절대적인 말초 혈액 CD4+ 및 CD8+ T 세포 수가 또한 분석될 수 있다. 마우스는 암 세포가 주사되고 3주 뒤에 eGFP와 연결된 TFP를 인코딩하는 비시스트론성 렌티바이러스성 벡터에 의해 TFP를 발현하도록 조작된 T 세포가 주사된다. T 세포는 주사에 앞서 모의-형질도입된 세포와 혼합함으로써 45-50% 투입 GFP+ T 세포로 정규화되고, 유세포 분석법에 의해 확인된다. 동물은 1-주 간격으로 암에 대해 평가된다. TFP+ T 세포 군에 대한 생존 곡선은 로그-순위 시험을 사용하여 비교된다.
용량 의존적 TFP 치료 반응이 평가될 수 있다(예를 들어, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009) 참조). 예를 들어, 말초 혈액은 21일 째에 TFP T 세포, 동등한 수의 모의-형질도입된 T 세포와 함께, 또는 T 세포 없이 주사된 마우스에서 암 확립 후 35-70일에 수득된다. 각각의 군으로부터의 마우스는 말초 혈액 TAA+ 암세포 수의 결정을 위해 무작위로 채혈되고 그후에 35일 및 49일 째에 사망한다. 나머지 동물은 57일 및 70일 째에 평가된다.
세포 증식 및 사이토킨 생산의 평가는, 예를 들어, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)에 이전에 기재되었다. 간략하게, TFP-매개된 증식의 평가는 2:1의 최종 T 세포:TAA를 발현하는 세포 비율에 대해 T 세포를 TAA 또는 CD32 및 CD137(KT32-BBL)을 발현하는 세포와 혼합함으로써 미세적정판(microtiter plate)에서 수행된다. TAA를 발현하는 세포는 사용에 앞서 감마-방사선으로 조사된다. 항-CD3(클론 OKT3) 및 항-CD28(클론 9.3) 단클론성 항체는, 이들 신호가 생체외 장기간 CD8+ T 세포 확장을 뒷받침하므로 T 세포 증식을 자극하는 것에 대해 양성 대조군으로서 작용하는 KT32-BBL 세포가 있는 배양액에 부가된다. T 세포는 제조업자에 의해 기재된 바와 같이 CountBright™ 형광 비드(Invitrogen) 및 유세포 분석법을 사용하여 배양액 중에 나열된다. TFP+ T 세포는 eGFP-2A 연결된 TFP-발현 렌티바이러스성 벡터를 이용해 조작되는 T 세포를 사용하여 GFP 발현에 의해 식별된다. GFP를 발현하지 않는 TFP+ T 세포의 경우, TFP+ T 세포는 비오티닐화된 재조합 TAA 단백질 및 2차 아비딘-PE 콘주게이트와 함께 검출된다. T 세포 상의 CD4+ 및 CD8+ 발현은 특이적 단클론성 항체(BD Biosciences)를 이용해 또한 동시에 검출된다. 사이토킨 측정은 제조업자의 지시에 따라 인간 TH1/TH2 사이토킨 혈구계산 비드 어레이 키트(BD Biosciences)를 사용하여 재-자극에 이어 24시간에 수집된 상층액 상에서 수행된다. 형광은 FACScalibur 유세포 분석기를 사용하여 평가되고, 데이터는 제조업자의 지시에 따라 분석된다.
세포독성은 표준 51Cr-방출 검정(예를 들어, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009) 참조)에 의해 평가될 수 있다. 간략하게, 표적 세포는 빈번한 진탕(agitation)과 함께 2시간 동안 37℃에서 51Cr(NaCrO4로서, New England Nuclear)과 함께 장입(loading)되고, 완전 RPMI 배지에서 2회 세척되며 미세적정판 내로 플레이팅된다. 효과기 T 세포는 효과기 세포:표적 세포(E:T)의 변화하는 비율로 완전 RPMI 배지 내 웰에서 표적 세포와 혼합된다. 배지 단독(자발적인 방출, SR) 또는 트리톤-X 100 세제의 1% 용액(총 방출, TR)을 함유한 추가적인 웰이 또한 제조된다. 37℃에서 4시간의 인큐베이션 후, 각각의 웰들로부터의 상층액이 수확된다. 그후에 방출된 51Cr은 감마 입자 카운터(Packard Instrument Co., 매사추세츠주 월섬 소재)를 사용하여 측정된다. 각각의 조건은 적어도 삼중으로 수행되고, 용해의 백분율은 다음 식을 사용하여 계산된다: % 용해=(ER-SR)/(TR-SR), 여기서 ER은 각각의 실험 조건에 대해 방출된 평균 51Cr을 나타낸다.
이미징(imaging) 기술은 종양을 지닌 동물 모델에서 TFP의 특이적 체내이동(trafficking) 및 증식을 평가하는 데 사용될 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어, Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)에 기재되어 있다. 간략하게, NOD/SCID/γc-/-(NSG) 마우스는 암 세포로 IV 주사되고 뒤따라 7일 뒤에 전기천공 후 4시간에 TFP 작제물과 함께 T 세포가 IV 주사된다. T 세포는 파이어플라이 루시퍼라제를 발현하는 렌티바이러스성 작제물로 안정하게 형질감염되고, 마우스는 생물발광에 대해 이미지화된다. 대안적으로, 암 이종이식 모델에서 TFP+ T 세포의 단일 주사의 치료적 효능 및 특이성은 다음과 같이 측정될 수 있다: NSG 마우스는 파이어플라이 루시퍼라제를 안정하게 발현하도록 형질도입된 암세포가 주사되고 뒤이어 7일 뒤에 TAA TFP와 함께 전기천공된 T 세포의 단일 꼬리-정맥 주사를 받는다. 동물은 주사 이후 다양한 시점에서 이미지화된다. 예를 들어, 5일(치료 전 2일) 및 8일(TFP+ PBL 이후 24시간)에 대표적인 마우스에서 파이어플라이 루시퍼라제 양성 암의 광자-밀도 열 지도(photon-density heat map)가 생성될 수 있다.
본원에서 실시예 섹션에 기재된 것뿐만 아니라 당해 기술분야에 공지되어 있는 것을 포함하는, 다른 검정이 또한 본 개시내용의 항-TAA TFP 작제물을 평가하는 데 사용될 수 있다.
치료적 적용
MUC16, IL13Rα2, 및 MSLN 연관 질환 및/또는 장애
일 양태에서, 본 개시내용은 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN 발현과 연관된 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 종양의 일부가 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN에 대해 음성이고 종양의 일부가 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN에 대해 양성인 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용의 TFP는 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN의 상승된 발현과 연관된 질환에 대해 치료를 겪은 대상체를 치료하는 데 유용하고, 여기서 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN의 상승된 수준에 대해 치료를 겪은 대상체는 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN의 상승된 수준과 연관된 질환을 나타낸다.
일 양태에서, 본 개시내용은 포유류 T 세포에서의 발현을 위한 프로모터와 작동가능하게 연결된 항-TAA TFP를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일 양태에서, 본 개시내용은 각각 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN-발현 종양의 치료 시 사용하기 위해 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN TFP를 발현하는 재조합 T 세포를 제공하며, 여기서 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN TFP를 발현하는 재조합 T 세포는 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN TFP-T로 일컬어진다. 일 양태에서, 본 개시내용의 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN TFP-T는 이의 표면 상에서 발현되는 본 발명의 적어도 하나의 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN TFP와 종양 세포를 접촉시킬 수 있어 TFP-T가 종양 세포를 표적화하고 종양의 성장이 억제되도록 한다.
일 양태에서, 본 개시내용은, MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN-발현 종양 세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이며, 이는 종양 세포를 본 개시내용의 항-MUC16, 항-IL13Rα2, 또는 항-MSLN TFP T 세포와 접촉시켜 TFP-T가 항원(예를 들어, 암세포의 표면 상에 존재하는 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN 항원)에 응답하여 활성화되고 암세포를 표적화하도록 하는 단계를 포함하고, 여기서 종양의 성장이 억제된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 본 개시내용의 항-TAA TFP T 세포를 대상체에 투여하여 암이 대상체에서 치료되도록 하는 단계를 포함한다. 본 발명의 항-TAA TFP T 세포에 의해 치료가능한 암의 예는 대응하는 TAA의 발현과 연관된 암이다. 일 양태에서, 암은 중피종이다. 일 양태에서, 암은 췌장암이다. 일 양태에서, 암은 난소암이다. 일 양태에서, 암은 위암이다. 일 양태에서, 암은 폐암이다. 일 양태에서, 암은 자궁내막암이다. 일부 구현예에서, 항-TAA TFP 요법은 하나 이상의 추가적인 요법과 조합하여 사용될 수 있다.
본 개시내용은 T 세포가 TFP를 발현하도록 유전적으로 변형되고 TFP-발현 T-세포가 TFP-발현 T-세포를 필요로 하는 수령체에 주입되는 세포 요법의 한 유형을 포함한다. 주입된 세포는 수령체에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과 달리, TFP-발현 T 세포는 생체내에서 복제할 수 있어, 지속되는 종양 제어를 초래할 수 있는 장기간 지속성을 유발한다. 다양한 양태에서, 환자에게 투여된 T 세포, 또는 이들의 자손은 환자에의 T 세포의 투여 후 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 또는 5년 동안 환자에서 지속된다.
본 개시내용은, T 세포가 TFP를 일시적으로 발현하도록, 예를 들어, 시험관내 전사된 RNA에 의해 변형되고 TFP-발현 T 세포가 TFP-발현 T 세포를 필요로 하는 수령체에 주입되는 세포 요법의 한 유형을 또한 포함한다. 주입된 세포는 수령체에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 이에 따라, 다양한 양태에서, 환자에게 투여된 T 세포는 환자에의 T 세포의 투여 후, 1개월 미만, 예를 들어, 3주, 2주, 또는 1주 동안 존재한다.
임의의 특정한 이론에 의해 구속되고자 함 없이, TFP-발현 T 세포에 의해 끌어내지는 항-종양 면역력 반응은 능동적 또는 수동적 면역 반응일 수 있거나, 대안적으로 직접적 대 간접적 면역 반응에 기인한 것일 수 있다. 일 양태에서, TFP 형질도입된 T 세포는 종양 연관 항원(TAA)(예를 들어, MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN)을 발현하는 인간 암세포에 반응하여 특이적 전염증성 사이토킨 분비 및 강력한 세포용해 활성을 나타내고, 가용성 TAA 억제에 저항하고, 구경꾼 살해(bystander killing)를 매개하고/하거나 확립된 인간 종양의 퇴행을 매개한다. 예를 들어, TAA-발현 종양의 이종 영역 이내의 항원-없는 종양 세포는 인접한 항원-양성 암세포에 대해 이전에 반응한 TAA-재지시된 T 세포에 의한 간접적인 파괴에 민감할 수 있다.
일 양태에서, 본 개시내용의 인간 TFP-변형된 T 세포는 포유류에서 생체외 면역화 및/또는 생체내 요법을 위한 백신의 한 유형일 수 있다. 일 양태에서, 포유류는 인간이다.
생체외 면역화에 관해, 다음 중 적어도 하나가 포유류 내로 세포를 투여하기에 앞서 시험관내에서 발생한다: i) 세포의 확장, ii) 세포에 TFP를 인코딩하는 핵산의 도입 또는 iii) 세포의 동결보존.
생체외 절차는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있고 하기에 보다 충분히 논의된다. 간략하게, 세포는 포유류(예를 들어, 인간)로부터 단리되고 본원에 개시된 TFP를 발현하는 벡터를 이용해 유전적으로 변형된다(즉, 시험관내에서 형질도입 또는 형질감염된다). TFP-변형된 세포는 치료적 이익을 제공하기 위해 포유류 수령체에 투여될 수 있다. 포유류 수령체는 인간일 수 있고 TFP-변형된 세포는 수령체에 관해 자가적일 수 있다. 대안적으로, 세포는 수령체에 관해 동종이계, 동계 또는 이종계일 수 있다.
조혈 줄기 및 간세포(progenitor cell)의 생체외 확장에 대한 절차는 본원에 참조로 편입되는 미국 특허 번호 제5,199,942호에 기재되어 있으며, 본 발명의 세포에 적용될 수 있다. 다른 적합한 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 그러므로 본 발명은 세포의 생체외 확장의 임의의 특정한 방법에 제한되지 않는다. 간략하게, T 세포의 생체외 배양 및 확장은: (1) 말초 혈액 수확 또는 골수 외식편으로부터 포유류로부터의 CD34+ 조혈 줄기 및 간세포의 수집; 및 (2) 이러한 세포의 생체외 확장을 포함한다. 미국 특허 번호 제5,199,942호에 기재된 세포 성장 인자에 더하여, 다른 인자, 예컨대 flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-키트 리간드가 세포의 배양 및 확장을 위해 사용될 수 있다.
생체외 면역화의 관점에서의 세포-기반 백신을 사용하는 것에 더하여, 본 발명은 환자에서 항원을 향한 면역 반응을 끌어내는 생체내 면역화를 위한 조성물 및 방법을 또한 제공한다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 활성화되고 확장된 세포는 면역손상된 개체에서 일어나는 질환의 치료 및 예방에 이용될 수 있다. 특히, 본 발명의 TFP-변형된 T 세포는 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN의 발현과 연관된 질환, 장애 및 병태의 치료에 사용된다. 특정한 양태에서, 본 발명의 세포는 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN의 발현과 연관된 질환, 장애 및 병태의 발병 위험이 있는 환자의 치료에 사용된다. 이에 따라, 본 발명은 본 개시내용의 TFP-변형된 T 세포의 치료적 유효량을, MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN의 발현과 연관된 질환, 장애 및 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN발현과 연관된 질환, 장애 및 병태의 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공한다.
일 양태에서 본 개시내용의 TFP-T 세포는 증식성 질환, 예컨대, 암 또는 악성종양, 또는 전암성 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일 양태에서, 암은 중피종이다. 일 양태에서, 암은 췌장암이다. 일 양태에서, 암은 난소암이다. 일 양태에서, 암은 위암이다. 일 양태에서, 암은 폐암이다. 일 양태에서, 암은 유방암이다. 일 양태에서, 암은 자궁내막암이다. 추가로 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN 발현과 연관된 질환은, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 비정형 및/또는 비-고전적 암, 악성종양, 전암성 병태 또는 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN을 발현하는 증식성 질환을 포함한다. MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN의 발현과 연관된 비-암 관련 징후는, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 자가면역 질환(예를 들어, 루푸스), 염증성 장애(알러지 및 천식), 염증성 장 질환, 간경화증, 심부전, 복막 감염, 및 복부 수술 및 이식을 포함한다.
본 개시내용의 TFP-변형된 T 세포는 단독으로, 또는 희석제와 및/또는 다른 성분, 예컨대 IL-2 또는 다른 사이토킨 또는 세포 집단과 조합하여 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명은 증식을 억제하거나 TAA-발현 세포 집단을 감소시키기 위한 방법을 또한 제공하며, 방법은 TAA-발현 세포를 포함하는 세포의 집단을, TAA-발현 세포에 결합하는 본 개시내용의 항-TAA TFP-T 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 증식을 억제하거나 TAA를 발현하는 암세포의 집단을 감소시키기 위한 방법을 제공하며, 방법은 TAA-발현 암세포 집단을, TAA-발현 세포에 결합하는 본 개시내용의 항-TAA TFP-T 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 증식을 억제하거나 종양 연관 항원을 발현하는 암 세포의 집단을 감소시키기 위한 방법을 제공하며, 방법은 TAA-발현 암세포 집단을, TAA-발현 세포에 결합하는 본 개시내용의 항-TAA TFP-T 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정한 양태에서, 본 개시내용의 항-TAA TFP-T 세포는 음성 대조군에 비해 TAA-발현 세포와 연관된 암이 있는 대상체 또는 동물 모델에서 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%만큼 세포 및/또는 암세포의 수량, 수, 양 또는 백분율을 감소시킨다. 일 양태에서, 대상체는 인간이다.
본 개시내용은 TAA-발현 세포와 연관된 질환(예를 들어, TAA를 발현하는 암)의 예방, 치료 및/또는 관리를 위한 방법을 또한 제공하며, 방법은 TAA-발현 세포에 결합하는 본 개시내용의 항-TAA TFP-T 세포를, TAA-발현 세포와 연관된 질환의 예방, 치료 및/또는 관리를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 대상체는 인간이다. TAA-발현 세포와 연관된 장애의 비-제한적인 예는 자가면역 장애(예컨대, 루푸스), 염증성 장애(예컨대, 알러지 및 천식) 및 암(예컨대, 췌장암, 난소암, 위암, 폐암, 또는 자궁내막암. 또는 TAA를 발현하는 비정형 암)을 포함한다.
본 개시내용은 TAA-발현 세포와 연관된 질환의 예방, 치료 및/또는 관리를 위한 방법을 또한 제공하며, 방법은 TAA-발현 세포에 결합하는 본 개시내용의 항-TAA TFP-T 세포를, TAA-발현 세포와 연관된 질환의 예방, 치료 및/또는 관리를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 대상체는 인간이다.
본 개시내용은 TAA-발현 세포와 관련된 암의 재발을 예방하기 위한 방법을 제공하며, 방법은 TAA-발현 세포에 결합하는 본 개시내용의 항-TAA TFP-T 세포를, TAA-발현 세포와 관련된 암의 재발의 예방을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 방법은 또다른 요법의 유효량과 조합하여 TAA-발현 세포에 결합하는 본원에 기재된 항-TAA TFP-T 세포의 유효량을, TAA-발현 세포와 관련된 암의 재발의 예방을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
조합 요법
본원에 기재된 TFP-발현 세포는 다른 공지된 제제 및 요법과 조합하여 사용될 수 있다. "조합하여" 투여된다는 것은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 장애가 있는 대상체의 고통의 경과 동안 2가지(또는 이상) 상이한 치료가 대상체에게 전달되는 것, 예를 들어, 대상체가 장애가 있는 것으로 진단된 후 및 장애가 치유되거나 제거되기 전 또는 치료가 다른 이유로 중단되기 전 2가지 이상의 치료가 전달되는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 하나의 치료의 전달은 제2의 전달이 시작할 때 여전히 발생하여, 투여의 면에서 중첩이 있게 된다. 이것은 때때로 본원에서 "동시적인" 또는 "동시 전달"로서 지칭된다. 다른 구현예에서, 하나의 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작하기 전 종료된다. 어느 한 경우의 일부 구현예에서, 치료는 조합된 투여 때문에 보다 효과적이다. 예를 들어, 제2 치료는 보다 효과적이고, 예를 들어, 동등한 효과가 보다 적은 제2 치료로 나타나거나, 제2 치료는, 제2 치료가 제1 치료의 부재 시 투여된 경우에 또는 유사한 상황이 제1 치료로 나타나는 경우에 나타날 것보다 큰 정도로 증상을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 전달은 증상, 또는 장애와 관련된 다른 매개변수의 감소가 다른 것의 부재 시 전달된 하나의 치료와 함께 관찰될 것보다 크도록 하는 것이다. 2가지 치료의 효과는 부분적으로 부가적, 전체적으로 부가적, 또는 부가적 초과일 수 있다. 전달은 전달된 제1 치료의 효과가 제2 치료가 전달될 때 여전히 검출가능하도록 하는 것일 수 있다.
일부 구현예에서, "적어도 하나의 추가적인 치료제"는 TFP-발현 세포를 포함한다. 동일한 또는 상이한 표적 항원, 또는 동일한 표적 항원 상의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합하는, 다수의 TFP를 발현하는 T 세포가 또한 제공된다. T 세포의 제1 서브셋이 제1 TFP를 발현하고 T 세포의 제2 서브셋이 제2 TFP를 발현하는 T 세포의 집단이 또한 제공된다.
본원에 기재된 TFP-발현 세포 및 적어도 하나의 추가적인 치료제는 동시적으로, 동일한 또는 별개의 조성물 중, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적 투여의 경우, 본원에 기재된 TFP-발현 세포가 첫 번째로 투여될 수 있고, 추가적인 제제가 두 번째로 투여될 수 있거나, 투여의 순서가 역전될 수 있다.
추가의 양태에서, 본원에 기재된 TFP-발현 세포는 수술, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대, 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제, 예컨대, 알렘투주맙, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 사이톡신, 플루다라빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토킨, 및 조사와 조합하여 치료 섭생에서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 TFP-발현 세포는 펩티드 백신, 예컨대 Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971에 기재된 것과 조합하여 또한 사용될 수 있다. 추가의 양태에서, 본원에 기재된 TFP-발현 세포는 골수성 세포분화의 촉진제(예를 들어, 올-트랜스 레티노산), 골수-유래 억제세포(MDSC) 확장의 억제제(예를 들어, c-키트 수용체의 억제제 또는 VEGF 억제제), MDSC 기능의 억제(예를 들어, COX2 억제제 또는 포스포디에스테라제-5 억제제), 또는 MDSC의 치료적 제거(예를 들어, 화학요법 섭생, 예컨대 독소루비신 및 시클로포스파마이드를 이용한 치료를 이용함)와 조합하여 또한 사용될 수 있다. MDSC의 확장을 예방할 수 있는 다른 치료제는 아미노-바이포스포네이트, 바이포스페이트, 실데나필 및 타다라필, 니트로아스피린, 비타민 D3, 및 겜시타빈을 포함한다. (예를 들어, Gabrilovich and Nagaraj, Nat. Rev. Immunol, (2009) v9(3): 162-174 참조).
일 구현예에서, 대상체는 TFP-발현 세포의 투여와 연관된 부작용을 감소시키거나 개선하는 제제가 투여될 수 있다. TFP-발현 세포의 투여와 연관된 부작용은, 이에 제한되지는 않으나 사이토킨 방출 증후군(CRS), 및 또한 대식세포 활성화 증후군(MAS)이라고 불리는, 혈구탐식성 림프조직구증(HLH)을 포함한다. CRS의 증상은 고열, 메스꺼움, 일시적 저혈압, 저산소증 등을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 TFP-발현 세포를 대상체에 투여하는 단계 및 추가로 TFP-발현 세포를 이용한 치료에 기인하는 가용성 인자의 상승된 수준을 관리하는 제제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 대상체에서 상승된 가용성 인자는 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-6 및 IL-8 중 어느 하나 이상이다. 그러므로, 이 부작용을 치료하기 위해 투여되는 제제는 이들 가용성 인자들 중 어느 하나 이상을 중화시키는 제제일 수 있다. 이러한 제제는, 이에 제한되지는 않으나, 스테로이드, TNFα의 억제제, 및 IL-6의 억제제를 포함한다. TNFα 억제제의 예는 엔타네르셉트(entanercept)이다. IL-6 억제제의 예는 토실리주맙(toc)이다.
일 구현예에서, 대상체는 TFP-발현 세포의 활성을 강화하는 제제가 투여될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 제제는 억제성 분자를 억제하는 제제일 수 있다. 억제성 분자, 예를 들어, 프로그램화된 사멸 1(PD1)은, 일부 구현예에서, 면역 효과기 반응을 시작하는 TFP-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제성 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질 수준에서의 억제에 의한, 억제성 분자의 억제는 TFP-발현 세포 성능을 최적화할 수 있다. 구현예에서, 억제성 핵산, 예를 들어, 억제성 핵산, 예를 들어, dsRNA, 예를 들어, siRNA 또는 shRNA는 TFP-발현 세포에서 억제성 분자의 발현을 억제하는 데 사용될 수 있다. 일 구현예에서 억제제는 shRNA이다. 일 구현예에서, 억제성 분자는 TFP-발현 세포 내에서 억제된다. 이들 구현예에서, 억제성 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자는 TFP의 성분, 예를 들어, 모든 성분을 인코딩하는 핵산과 연결된다. 일 구현예에서, 억제 신호의 억제제는, 예를 들어, 억제성 분자에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 예를 들어, 제제는 PD1, PD-L1, PD-L2 또는 CTLA4(예를 들어, 이필리무맙(또한 MDX-010 및 MDX-101로 또한 지칭되며, Yervoy™로서 거래됨; Bristol-Myers Squibb; 트레멜리무맙(tremelimumab)(틸실리무맙, CP-675,206으로서 예전에 공지된, Pfizer로부터 이용가능한 IgG2 단클론성 항체)에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 일 구현예에서, 제제는 TIM3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 일 구현예에서, 제제는 LAG3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다.
일부 구현예에서, T 세포는 렌티바이러스, 예를 들어, CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 특이적으로 표적화하는 렌티바이러스를 통해서 생체내에서 (예를 들어, 유전자 전달에 의해) 변경될 수 있다(예를 들어, Zhou et al., J. Immunol. (2015) 195:2493-2501 참조).
일부 구현예에서, TFP-발현 세포의 활성을 강화하는 제제는, 예를 들어, 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 여기서 제1 도메인은 억제성 분자, 또는 이의 단편이며, 제2 도메인은 양성 신호와 연관된 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 양성 신호와 연관된 폴리펩티드는 CD28, CD27, ICOS의 공자극 도메인, 예를 들어, CD28, CD27 및/또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인, 및/또는 예를 들어, 본원에 기재된, 예를 들어, CD3 제타의 1차 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 TFP를 발현한 동일한 세포에 의해 발현된다. 또다른 구현예에서, 융합 단백질은 세포, 예를 들어, 항-TAA TFP를 발현하지 않는 T 세포에 의해 발현된다.
약제학적 조성물
본 개시내용의 약제학적 조성물은 TFP-발현 세포, 예를 들어, 복수의 TFP-발현 세포를, 본원에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충액, 예컨대, 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대, 포도당, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대, 글라이신; 항산화제; 킬레이트제, 예컨대, EDTA 또는 글루타티온; 애주번트(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 일 양태에서 정맥내 투여를 위해 제형화된다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 치료될(또는 예방될) 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 적절한 복용량(dosage)이 임상시험에 의해 결정될 수 있지만, 투여의 수량 및 빈도는 환자의 병태, 및 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
일 구현예에서, 약제학적 조성물은 예를 들어, 내독소, 마이코플라스마, 복제 적격 렌티바이러스(RCL), p24, VSV-G 핵산, HIV gag, 잔여의 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드, 마우스 항체, 풀링(pooling)된 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소 혈청, 배양 배지 성분, 벡터 패키징 세포 또는 플라스미드 성분, 박테리아 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 오염물질을 실질적으로 무함유하고, 예를 들어, 이의 검출가능한 수준이 없다. 일구현예에서, 박테리아는 알칼리게네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 나이세리아 메닝기티데스(Neisseria meningitides), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 연쇄상구균 폐렴균(Streptococcus pneumonia), 및 연쇄상구균 파이오제네스 그룹 A(Streptococcus pyogenes group A)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나이다.
"면역학적 유효량", "항-종양 유효량", "종양-억제하는 효과적인 유효량", 또는 "치료량"이 지시될 때, 투여될 본 개시내용의 조성물의 정밀량은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 환자(대상체)의 병태에서의 개별적인 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 본원에 기재된 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물은, 그 범위 이내의 모든 정수값을 포함하여, 104 내지 109개 세포/㎏ 체중의 복용량, 일부 경우에서 105 내지 106개 세포/㎏ 체중으로 투여될 수 있다는 점이 일반적으로 언급될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이들 복용량으로 다수 회 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에서 통상적으로 공지된 주입 기술을 사용함으로써 투여될 수 있다(예를 들어, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988 참조).
특정한 양태에서, 활성화된 T 세포를 대상체에 투여하고 그후에 후속하여 피를 다시뽑고(또는 분리반출법을 수행하고), 본 개시내용에 따라 거기로부터 T 세포를 활성화하며, 이들 활성화되고 확장된 T 세포를 환자에게 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이 과정은 몇 주마다 다수 회 수행될 수 있다. 특정한 양태에서, T 세포는 10 ㏄ 내지 400 ㏄의 혈액 채취로부터 활성화될 수 있다. 특정한 양태에서, T 세포는 20 ㏄, 30 ㏄, 40 ㏄, 50 ㏄, 60 ㏄, 70 ㏄, 80 ㏄, 90 ㏄, 또는 100 ㏄의 혈액 채취로부터 활성화된다.
대상체 조성물의 투여는, 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수액, 이식(implantation) 또는 이식(transplantation)을 포함하여, 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 환자에게 경동맥으로, 피하로, 진피내로, 종양내로, 결절내로, 골수내로, 근육내로, 정맥내(i.v.) 주사에 의해, 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일 양태에서, 본 개시내용의 T 세포 조성물은 환자에게 진피내 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 일 양태에서, 본 개시내용의 T 세포 조성물은 i.v. 주사에 의해 투여된다. T 세포의 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염의 부위에 직접적으로 주사될 수 있다.
특정한 예시적인 양태에서, 대상체는 백혈구성분채집술을 겪을 수 있으며, 여기서 백혈구는 관심이 있는 세포, 예를 들어, T 세포를 선택 및/또는 단리하기 위해 생체외에서 수집, 농축, 또는 감손된다. 이들 T 세포 단리물은 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 확장될 수 있고 본 개시내용의 하나 이상의 TFP 작제물이 도입되어, 그럼으로써 본 개시내용의 TFP-발현 T 세포를 창출하도록 처리될 수 있다. 표준치료에 뒤이어 말초 혈액 줄기세포 이식을 필요로 하는 대상체는 후속하여 고용량 화학요법을 이용한 표준치료에 뒤이어 말초 혈액 줄기세포 이식을 겪을 수 있다. 특정한 양태에서, 이식에 이어 또는 이식과 동시에, 대상체는 본 개시내용의 확장된 TFP T 세포의 주입을 받는다. 추가적인 양태에서, 확장된 세포는 수술 전 또는 수술에 이어 투여된다.
환자에게 투여될 상기한 치료의 복용량은 치료 중인 병태의 정확한 본성 및 치료의 수령체에 따라 변화할 것이다. 인간 투여를 위한 복용량의 스케일링(scaling)은 기술-허용된(art-accepted) 실시에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 알렘투주맙의 경우 용량은 일반적으로 1 내지 30일의 기간 동안 일반적으로 매일 투여되는, 성인 환자에 대해 일반적으로 1 내지 약 100 mg 범위에 있을 것이다. 일부 경우에서 (미국 특허 번호 제6,120,766호에 기재된 바와 같이) 일일 최대 40 mg의 보다 큰 용량이 사용될 수 있지만, 바람직한 1일 용량은 일일 1 내지 10 mg이다.
일 구현예에서, TFP는, 예를 들어, 시험관내 전사를 사용하여, T 세포 내로 도입되고, 대상체(예를 들어, 인간)는 본 개시내용의 TFP T 세포의 초기 투여, 및 본 개시내용의 TFP T 세포의 1회 이상의 후속 투여를 받으며, 여기서 1회 이상의 후속 투여는, 이전의 투여 후 15일 미만, 예를 들어, 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일. 또는 2일 투여된다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 TFP T 세포의 1회 초과 투여는 주마다 대상체(예를 들어, 인간)에게 투여되고, 예를 들어, 본 개시내용의 TFP T 세포의 2회, 3회, 또는 4회 투여가 주마다 투여된다. 일 구현예에서, 대상체(예를 들어, 인간 대상체)는 주당 1회 초과의 TFP T 세포의 투여(예를 들어, 주당 2회, 3회 또는 4회 투여)(또한 본원에서 주기(cycle)로서 지칭됨)를 받고, 뒤이어 1주간 TFP T 세포 투여가 없고, 그후에 1회 이상 추가적인 TFP T 세포의 투여(예를 들어, 주당 1회 초과의 TFP T 세포의 투여)가 대상체에 투여된다. 또다른 구현예에서, 대상체(예를 들어, 인간 대상체)는 1회 초과 주기의 TFP T 세포를 받고 각각의 주기 사이의 시간은 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 또는 3일 미만이다. 일 구현예에서, TFP T 세포는 주 당 3회 투여에 대해 격일로 투여된다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 TFP T 세포는 적어도 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주 이상 동안 투여된다.
일 양태에서, TAA TFP T 세포는 렌티바이러스성 바이러스성 벡터, 예컨대 렌티바이러스를 사용하여 생성된다. 이 방법으로 생성된 TFP-T 세포는 안정한 TFP 발현을 가질 것이다.
일 양태에서, TFP T 세포는 형질도입 후 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일 동안 TFP 벡터를 일시적으로 발현한다. TFP의 일시적 발현은 RNA TFP 벡터 전달에 의해 영향받을 수 있다. 일 양태에서, TFP RNA는 전기천공에 의해 T 세포 내로 형질도입된다.
TFP T 세포의 일시적 발현을 사용하여(특히 TFP T 세포를 지닌 뮤린 scFv를 이용한) 치료 중인 환자에서 일어날 수 있는 잠재적인 문제는 다수의 치료 후의 아나필락시스이다.
이 이론에 의해 구속되고자 함 없이, 이러한 아나필락시스성 반응은 체액성 항-TFP 반응, 즉, 항-IgE 이소타입을 갖는 항-TFP 항체를 발달시키는 환자에 의해 야기될 수 있다는 점이 믿어진다. 세포를 생산하는 환자의 항체는 항원에의 노출 시 10일 내지 14일 중단이 있을 때 (아나필락시스를 야기하지 않는) IgG 이소타입으로부터 IgE 이소타입으로의 부류 전환(class switch)을 겪는 것으로 여겨진다.
환자가 일시적 TFP 요법(예컨대 RNA 형질도입에 의해 생성된 것)의 경과 동안 항-TFP 항체 반응을 생성할 높은 위험이 있는 경우에, TFP T 세포 주입 중단은 10일 내지 14일 초과를 지속하지 않아야 한다.
사이토킨 방출
사이토킨 방출 증후군은 일부 질환 또는 감염의 합병증으로서 일어나는 전신성 염증 반응 증후군의 형태이며, 또한 일부 단클론성 항체 약물, 뿐만 아니라 입양 T 세포 요법의 부작용이다. TFP T 세포는 CAR-T 세포보다 양호한 사멸 활성을 나타낼 수 있다. 대상체에 투여된 TFP T 세포는 대상체에 투여된 CAR-T 세포보다 양호한 사멸 활성을 나타낼 수 있다. 이것은 CAR-T 세포에 대한 TFP T 세포의 이점 중 하나일 수 있다. TFP T 세포는 CAR-T 세포보다 적은 사이토킨 방출을 나타낼 수 있다. TFP T 세포가 투여된 대상체는 CAR-T 세포가 투여된 대상체보다 적은 사이토킨 방출을 나타낼 수 있다. 이것은 CAR-T 세포 요법에 대한 TFP T 세포 요법의 이점 중 하나일 수 있다. TFP T 세포는 CAR-T 세포와 유사하거나 이보다 양호한 사멸 활성을 나타낼 수 있으며 TFP T 세포는 CAR-T 세포보다 적은 사이토킨 방출을 나타낼 수 있다. 대상체에 투여된 TFP T 세포는 대상체에 투여된 CAR-T 세포와 유사하거나 이보다 양호한 사멸 활성을 나타낼 수 있으며 대상체는 CAR-T 세포가 투여된 대상체보다 적은 사이토킨 방출을 나타낼 수 있다. 이것은 CAR-T 세포 요법에 대한 TFP T 세포 요법의 이점 중 하나일 수 있다.
일부 경우에서, TFP T 세포를 이용한 치료의 사이토킨 방출은 CAR-T 세포를 이용한 치료의 사이토킨 방출보다 적다. 일부 구현예에서, TFP T 세포를 이용한 치료의 사이토킨 방출은 CAR-T 세포를 이용한 치료의 사이토킨 방출보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 적다. 다양한 사이토킨이 TFP T 세포를 이용한 T 세포 치료 시 CAR-T 세포보다 적게 방출될 수 있다. 일부 구현예에서, 사이토킨은 IL-2, IFN-γ, IL-4, TNF-α, IL-6, IL-13, IL-5, IL-10, sCD137, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, 또는 이들의 조합물이다. 일부 경우에서, TFP T 세포를 이용한 치료는 CAR-T 세포를 이용한 치료보다, 적은 퍼포린, 그랜자임 A, 그랜자임 B, 또는 이들의 조합물을 방출한다. 일부 구현예에서, TFP T 세포를 이용한 치료 시 방출되는 퍼포린, 그랜자임 A, 또는 그랜자임 B는 CAR-T 세포를 이용한 치료보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 60% 적다.
일부 구현예에서, 주어진 사이토킨에 대해, 동일한 인간 또는 인간화된 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포로 치료된 포유류의 주어진 사이토킨의 양과 비교하여, 주어진 사이토킨의 적어도 10% 적은 양이 치료에 이어 방출된다. 일부 구현예에서, 주어진 사이토킨은 IL-2, IFN-γ, IL-4, TNF-α, IL-6, IL-13, IL-5, IL-10, sCD137, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토킨을 포함한다.
TFP T 세포는 종양 세포의 사멸 시 CAR-T 세포와 유사하거나 이보다 양호한 활성을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 포유류에서의 종양 성장은, 종양의 크기가, 치료의 적어도 8일 후, TFP를 발현하지 않는 T 세포로 치료된 포유류에서의 종양의 크기의 많아야 10%, 많아야 20%, 많아야 30%, 많아야 40%, 많아야 50%, 또는 많아야 60%이도록 억제되며, 여기서 TFP를 발현하는 T 세포로 치료된 포유류 및 TFP를 발현하지 않는 T 세포로 치료된 포유류는 치료 전 동일한 종양 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 포유류에서의 종양 성장은 완전히 억제된다. 일부 구현예에서, 포유류에서의 종양 성장은 적어도 20일, 적어도 30일, 적어도 40일, 적어도 50일, 적어도 60일, 적어도 70일, 적어도 80일, 적어도 90일, 적어도 100일, 또는 그 이상 동안 완전히 억제된다. 일부 구현예에서, TFP로 형질도입된 T 세포의 집단은 동일한 인간 또는 인간화된 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포와 비교하여 유사한 양의 종양 세포를 사멸시킨다.
TFP T 세포는 TFP를 발현하지 않는 세포와 상이한 유전자 발현 프로파일을 나타낼 수 있다. 일부 사례에서, TFP T 세포는 CAR-T 세포와 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타낼 수 있다. 일부 다른 사례에서, TFP T 세포는 CAR-T 세포와 상이한 유전자 발현 프로파일을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, TFP로 형질도입된 T 세포의 집단은 동일한 인간 또는 인간화된 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포와 상이한 유전자 발현 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, TFP로 형질도입된 T 세포에서 유전자의 발현 수준은 동일한 인간 또는 인간화된 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포 내의 유전자의 발현 수준과 상이하다. 일부 구현예에서, 유전자는 항원 제시, TCR 신호전달, 항상성, 물질대사, 케모카인 신호전달, 사이토킨 신호전달, 톨 유사 수용체 신호전달, MMP 및 접착 분자 신호전달, 또는 TNFR 관련 신호전달에서 기능을 갖는다.
실시예
본 개시내용은 다음의 실험 실시예를 참고하여 보다 상세히 추가로 기재된다. 이들 실시예는 오직 예시의 목적을 위해 제공되며, 달리 명시되지 않는 한, 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 이에 따라, 본 개시내용은 결코 다음의 실시예들에 제한되는 것으로 이해되지 않아야 하며, 오히려, 본원에서 제공되는 교시사항의 결과로써 자명해지는 임의의 및 모든 변이를 아우르는 것으로 이해되어야 한다. 추가의 상세한 설명 없이도, 당업자는 전술한 상세한 설명 및 다음의 예시적인 실시예를 사용하여, 본 개시내용의 화합물들을 만들고 이용하며, 청구된 방법을 실시할 수 있을 것으로 여겨진다. 다음의 작업 실시예는 본 개시내용의 다양한 측면을 특이적으로 지적하며, 결코 개시내용의 나머지 내용을 제한하는 것으로 이해되지 않는다.
실시예 1: TFP 작제물
항-TAA TFP 작제물은 XbaI 및 EcoR1 부위에서 짧은 링커(SL): AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE(서열번호 2) 또는 긴 링커(LL): AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE(서열번호 3)를 인코딩하는 DNA 서열 중 어느 하나에 의해 CD3 또는 TCR DNA 단편과 연결된 항-TAA VHH 도메인(또는 SD 도메인) DNA 단편을 p510 벡터(System Biosciences (SBI))내로 클로닝함으로써 조작될 수 있다. 다른 벡터, 예를 들어, pLRPO 벡터가 또한 사용될 수 있다.
생성된 항-TAA TFP 작제물의 예는, p510_항-TAA_LL_TCRα(항-TAA VHH - 긴 링커- 인간 전장 T 세포 수용체 α쇄), p510_TAA_LL_TCR αC(항-TAA VHH - 긴 링커 - 인간 T 세포 수용체 α 불변 도메인 쇄), p510_항-TAA_LL_TCRβ(항-TAA VHH - 긴 링커 - 인간 전장 T 세포 수용체 β쇄), p510_항-TAA_LL_TCRβC(항-TAA VHH - 긴 링커- 인간 T 세포 수용체 β 불변 도메인 쇄), p510_ 항-TAA _LL_CD3γ(항-TAA VHH - 긴 링커 - 인간 CD3γ쇄), p510_ 항-TAA _LL_CD3δ(항-TAA VHH - 긴 링커 - 인간 CD3δ쇄), p510_ 항-TAA _LL_CD3ε(항-TAA VHH - 긴 링커 - 인간 CD3ε쇄), p510_ 항-TAA _SL_TCRβ(항-TAA VHH - 짧은 링커 - 인간 전장 T 세포 수용체 β쇄), p510_ 항-TAA _SL_CD3γ(항-TAAVHH - 짧은 링커 - 인간 CD3γ쇄), p510_ 항-TAA _SL_CD3δ (항-TAA VHH - 짧은 링커 - 인간 CD3δ쇄), p510_ 항-TAA _SL_CD3ε(항-TAA VHH - 짧은 링커 - 인간 CD3ε쇄)을 포함한다.
본원에서 사용되는 항-MUC16은 인간 MUC16 특이적 scFv, 예를 들어, 4H11일 수 있다.
대응하는 항-MUC16, 항-IL13Ra2, 또는 항-MSLN A CAR 작제물, p510_항-TAA_28ζ의 예는 XbaI 및 EcoR1 부위에서 항-TAA, 부분 CD28 세포외 도메인, CD28 막관통 도메인, CD28 세포내 도메인 및 CD3 제타를 인코딩하는 합성 DNA를 p510 벡터 내로 클로닝함으로써 생성될 수 있다.
다양한 다른 벡터가 융합 단백질 작제물을 생성하는 데 사용될 수 있다.
실시예 2: 항체 서열
항체 서열의 생성
scFv의 생성
인간 또는 인간화된 항-TAA IgG가 TFP 작제물을 위한 scFv 서열을 생성하는 데 사용될 수 있다. 인간 또는 인간화된 VL 또는 VH 도메인을 코딩하는 DNA 서열이 수득될 수 있으며, 작제물에 대한 코돈은, 임의로, 호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터의 세포에서 발현을 위해 최적화될 수 있다. scFv에서 VL 및 VH 도메인이 나타나는 순서는(즉, VL-VH, 또는 VH-VL 방향) 변화될 수 있으며, "G4S" 또는 "G4S" 서브유닛 (G4S)3의 3개의 사본은 가변 도메인을 연결하여 scFv 도메인을 창출한다. 항-TAA scFv 플라스미드 작제물은 임의의 Flag, His 또는 다른 친화도 태그를 가질 수 있으며, HEK293 또는 다른 적합한 인간 또는 포유류 세포주 내로 전기천공되고 정제될 수 있다. 유효성 검정(validation assay)은 FACS에 의한 결합 분석, Proteon을 사용한 동력학적 분석, 및 MUC16-, IL13Rα2-, 또는 MSLN-발현 세포의 염색을 포함한다.
VL 도메인, VH 도메인, 및 CDR을 포함하는, 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 항-MUC16, 항-IL13Rα2, 또는 항-MSLN 결합 도메인의 예는 일부 간행물 및/또는 상업적인 공급원 중에 있을 수 있다. 예를 들어, 3A5 및 11D10을 포함하는 특정한 항-MUC16 항체는 WO 2007/001851호에 개시되었으며, 이의 내용은 참조로 편입된다. 3A5 단클론성 항체는 OVCAR-3 스캐차드(scatchard) 분석에 의해 433 pM 친화도로 MUC16 폴리펩티드의 다수 부위에 결합한다. VL 및 VH 도메인, CDR 및 이들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 예는, 각각, 다음의 단클론성 항체의 것일 수 있다: GTX10029, GTX21107, MA5-124525, MA5-11579, 25450002, ABIN1584127, ABIN93655, 112889, 120204, LS-C356195, LS-B6756, TA801241, TA801279, V3494, V3648, 666902, 666904, HPA065600, AMAb91056.
인간 IL13Rα2 폴리펩티드 표준적(canonical) 서열은 UniProt 수탁 번호 Q14627이다. 인간 MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN 폴리펩티드, 및 이들의 단편 또는 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 폴리펩티드가 제공된다. 항-TAA 항체는 다양한 기술(예를 들어, Nicholson et al, 1997 참조)을 사용하여 생성될 수 있다. 뮤린 항-TAA 항체가 출발 재료로서 사용되면, 뮤린 항-TAA 항체의 인간화가 임상적 설정(setting)을 위해 목적되며, 이때 마우스-특이적 잔기가 T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP) 치료, 즉 TFP.TAA 작제물로 형질도입된 T 세포를 이용한 치료를 받는 대상체에서 인간-항-마우스 항원(HAMA) 반응을 유도할 수 있다. 인간화는 뮤린 항-TAA 항체로부터의 CDR 영역을, 임의로 CDR 및/또는 프레임워크 영역에 대한 다른 변형을 포함하는, 적절한 인간 생식세포계열 수용체 프레임워크 상으로 그라프팅(grafting)함으로써 달성된다. 본원에서 제공되는 바와 같이, 항체 및 항체 단편 잔기 넘버링(numbering)은 Kabat(Kabat E. A. et al, 1991; Chothia et al, 1987)을 따른다.
단일 도메인 바인더
낙타과 및 다른 단일 도메인 항체가 항-MUC16, IL13Rα2, MSLN, 또는 다른 항-종양 항원 TFP 작제물을 생성하는 데 또한 사용될 수 있다. VHH 도메인이 다양한 TCR 서브유닛과 융합하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일-도메인(예를 들어, VHH) 바인더, 예컨대 표 4에 제시된 것들이 사용될 수 있다(예를 들어, 서열번호 15, 서열번호 20, 서열번호 25, 서열번호 30, 서열번호 35, 서열번호 40, 서열번호 44, 서열번호 48, 서열번호 51, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 66, 서열번호 71, 서열번호 76, 서열번호 97, 또는 서열번호 98의 비-제한적인 예 참조). 항-TAA 단일 도메인 항체의 제조가 실시예 3 및 5에 추가로 기재된다.
TCR 서브유닛의 공급원
인간 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 서브유닛은 모두 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 함유한다. 인간 TCR 복합체는 CD3-엡실론 폴리펩티드, CD3-감마 폴리펩티드, CD3-델타 폴리펩티드, CD3-제타 폴리펩티드, TCR 알파쇄 폴리펩티드 및 TCR 베타쇄 폴리펩티드를 함유한다. 인간 CD3-엡실론 폴리펩티드 표준적 서열은 Uniprot 수탁 번호 P07766이다. 인간 CD3-감마 폴리펩티드 표준적 서열은 Uniprot 수탁 번호 P09693이다. 인간 CD3-델타 폴리펩티드 표준적 서열은 Uniprot 수탁 번호 P043234이다. 인간 CD3-제타 폴리펩티드 표준적 서열은 Uniprot 수탁 번호 P20963이다. 인간 TCR 알파쇄 표준적 서열은 Uniprot 수탁 번호 Q6ISU1이다. 인간 TCR 베타쇄 C 영역 표준적 서열은 Uniprot 수탁 번호 P01850이고, 인간 TCR 베타쇄 V 영역 서열은 P04435이다.
인간 CD-엡실론 폴리펩티드 표준적 서열은:
Figure pct00001
이다.
인간 CD3-감마 폴리펩티드 표준적 서열은:
Figure pct00002
이다.
인간 CD3-델타 폴리펩티드 표준적 서열은:
Figure pct00003
이다.
인간 CD3-제타 폴리펩티드 표준적 서열은:
Figure pct00004
이다.
인간 TCR 알파쇄 표준적 서열은:
Figure pct00005
이다.
인간 TCR 알파쇄 C 영역 표준적 서열은:
Figure pct00006
이다.
인간 TCR 알파쇄 V 영역 CTL-L17 표준적 서열은:
Figure pct00007
이다.
인간 TCR 베타쇄 C 영역 표준적 서열은:
Figure pct00008
이다.
인간 TCR 베타쇄 V 영역 CTL-L17 표준적 서열은:
Figure pct00009
이다.
인간 TCR 베타쇄 V 영역 YT35 표준적 서열은:
Figure pct00010
이다.
TCR 도메인 및 scFv로부터 TFP의 생성
MUC16, IL13Rα2, 또는 MSLN scFv는, 링커 서열, 예컨대 G4S, (G4S)2 (G4S)3 또는 (G4S)4를 사용하여 CD-엡실론 또는 다른 TCR 서브유닛과 재조합적으로 연결될 수 있다. 다양한 링커 및 scFv 배열이 이용될 수 있다. TCR 알파 및 TCR 베타 쇄는 전장 폴리펩티드 또는 오직 그들의 불변 도메인 중 어느 하나로서 TFP의 생성을 위해 사용될 수 있다. 임의의 다양한 서열의 TCR 알파 및 TCR 베타 쇄가 TFP를 만들기 위해 허용될 수 있다.
TFP 발현 벡터
다음을 포함하는 발현 벡터가 제공된다: 프로모터(사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서-프로모터), 분비를 가능하게 하는 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결자(소 성장 호르몬(BGH) 유전자), 에피좀 복제 및 원핵생물에서의 복제를 허용하는 요소(예를 들어, SV40 기원 및 ColE1 또는 당해 기술분야에 공지된 다른 것) 및 선별을 허용하는 요소(암피실린 저항성 유전자 및 제오신 마커).
TFP-인코딩 핵산 작제물은 렌티바이러스성 발현 벡터 내로 클로닝되고 발현은 TAA+ 표적 세포에 반응하여 TFP.TAA-형질도입된 T 세포("TAA.TFP" 또는 "TAA.TFP T 세포" 또는 "TFP.TAA" 또는 "TFP.TAA T 세포")의 효과기 T 세포 반응의 양 및 질에 기반하여 입증되며, 여기서 'TAA'는, 예를 들어, MUC16, IL13Ra2, 또는 MSLN이다. 효과기 T-세포 반응은, 이에 제한되지는 않으나, 세포 확장, 증식, 배가(doubling), 사이토킨 생산 및 표적 세포 용해 또는 세포용해 활성(즉, 탈과립화)을 포함한다.
항-TAA TFP 렌티바이러스성 전달 벡터는 VSV-G 슈도타이핑(pseudotyping)된 렌티바이러스성 입자 내로 패키징되는 게놈 물질을 생산하는 데 사용될 수 있다. 렌티바이러스성 전달 벡터 DNA는 Lipofectamine® 시약과 조합하여 VSV-G, gag/pol 및 rev의 3개 패키징 성분과 혼합되어 이들을 함께 HEK-293(배아 신장, ATCC® CRL-1573™) 세포 내로 형질감염시킨다. 24 및 48시간 후, 배지를 수집하고, 여과시키고 초원심분리에 의해 농축시킨다. 결과적인 바이러스성 제제(preparation)는 -80℃에서 저장된다. 형질도입 유닛의 수는 Sup-T1(T 세포 림프모구 림프종, ATCC® CRL-1942™) 세포 상의 적정에 의해 결정될 수 있다. 재지시된 TFP T 세포는 24시간 동안, 예를 들어, 항-CD3 항-CD28 비드를 이용해 신선한 미경험 T 세포의 활성화 및 그후의 형질도입된 T 세포의 목적하는 백분율을 수득하기 위한 적절한 수의 형질도입 유닛의 첨가에 의해 생산된다. 이들 변형된 T 세포는 이들이 휴지되고 크기가 작아질 때까지 확장하도록 허용될 것이며 이 시점에서 이들은 나중의 분석을 위하여 동결보존된다. 세포 수 및 크기는 Coulter Multisizer™ III를 사용하여 측정된다. 동결보존 전, (세포 표면 상에서 TFP를 발현하는) 형질도입된 세포의 백분율 및 그 발현의 상대적 형광 강도는 유세포 분석법 분석에 의해 결정될 것이다. 히스토그램 플롯으로부터, TFP의 상대적 발현 수준은 그들의 상대적 형광 강도를 이용해 형질도입된 백분율을 비교함으로써 시험될 수 있다.
일부 구현예에서, 다수의 TFP가 다수의 바이러스성 벡터를 이용한 T 세포 형질도입에 의해 도입된다.
인간화된 TFP 재지시된 T 세포의 세포용해 활성, 증식 능력 및 사이토킨 분비 평가
세포-표면 발현된 TFP를 생산하는, 그리고 표적 종양 세포를 사멸하고, 사이토킨을 증식시키고 분비하는 TFP T 세포의 기능적 능력은 당해 기술분야에 공지된 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
인간 말초 단핵구 세포(PBMC, 예를 들어, 미경험 T 세포가 T 세포, CD4+ 및 CD8+ 림프구에 대해 음성 선택에 의해 수득될 정상 분리반출된 공여체로부터의 혈액)는 인간 인터류킨-2(IL-2)로 처리되고 그후에 TFP-인코딩 렌티바이러스성 벡터로 형질도입하기에 앞서 37℃, 5% CO2에서, 예를 들어, 10% RPMI 중에서 항-CD3x 항-CD28 비드를 이용해 활성화될 것이다. 유세포 분석법 검정은, 예컨대, 항-FLAG 항체 또는 항-뮤린 가변 도메인 항체에 의해 TFP의 세포 표면 존재를 확인하는 데 사용될 수 있다. 사이토킨(예를 들어, IFN-γ) 생산은 ELISA 또는 다른 검정을 사용하여 측정될 것이다.
실시예 3: 항-IL13Rα2 나노바디의 생산
라이브러리 작제
면역화
각 시간에 인간 IgG1의 Fc 도메인과 융합된 약 150 ㎍ 재조합 인간 IL13Rα2(hIL13Rα2-Fc)(R&D Systems)을 0일, 7일, 14일, 21일, 28일 및 35일에 라마에 피하로 주사하였다. 사용된 애주번트는 GERBU 애주번트 P(GERBU Biotechnik GmbH)였다. 40일에, 림프구 제조를 위해 약 100 ml 항응고화 혈액을 라마로부터 수집하였다.
VHH 라이브러리의 작제
VHH 라이브러리를 라마 림프구로부터 작제하여 항원-특이적 나노바디의 존재에 대해 스크리닝하였다. 이것을 위해, 말초 혈액 림프구로부터의 총 RNA를 올리고(dT) 프라이머와 함께 첫 번째 가닥 cDNA 합성을 위한 주형으로서 사용하였다. 이 cDNA를 사용하여, VHH 인코딩 서열을 PCR로 증폭하였고, PstI 및 NotI으로 소화시켰으며, 파지미드 벡터 pMECS의 PstI 및 NotI 부위 내로 클로닝하였다. 이에 따라 수득된 VHH 라이브러리는 코어 94(Core 94)로 불린다. 라이브러리는 올바른 삽입 크기를 갖는 벡터를 지닌 100%의 형질전환체와 함께, 약 7 x 108개의 독립적인 형질전환체로 이루어진다.
인간 IL13Rα2-특이적 나노바디의 단리
코어 94 라이브러리를 고-상 코팅된(100 mM NaHCO3 pH 8.2 중 100 μg/ml) hIL13Rα2 항원 상에서 3 라운드 동안 패닝(panning)하였다: hIL13Rα2-Fc 항원은 인자 Xa에 의해 Fc 제거를 받았다. 웰 상에 코팅된 항원에의 임의의 잔여의 인간 IgG1 Fc에 대한 파지의 결합 및 임의의 오염 인자 Xa를, 각각 1 μM의 최종 농도에서 재조합 인간 IgG1 Fc(R&D Systems, 카탈로그 번호 110-HG) 및 인자 Xa에 의해 경쟁시켰다. 항원-특이적 파지에 대한 농축은, 음성 대조군(비코팅되고 블로킹된) 웰로부터 용리된 파지미드 입자의 수와 항원-코팅된 웰로부터 용리된 파지미드 입자의 수를 비교함으로써 각 라운드의 패닝 후 평가하였다. 이들 실험은 파지 집단이 항원-특이적 파지에 대해 첫 번째, 두 번째, 및 세 번째 라운드 후 각각 약 7-배, 200-배 및 1000-배 농축되었다는 사실을 뒷받침하였다. 총 190개의 콜로니(라운드 2로부터 95개 및 라운드 3으로부터 95개)를 무작위적으로 선택하였고 그들의 주변세포질 추출물 중에서 항원-특이적 나노바디의 존재에 대해 ELISA(가용성 나노바디를 포함하는 조 주변세포질 추출물을 사용한 ELISA)에 의해 분석하였다. ELISA 스크리닝을 위해 사용된 항원은 패닝을 위해 사용된 것과 동일하였으며, 이는 음성 대조군으로서 비코팅되고 블로킹된 웰 및 재조합 인간 IgG1 Fc 인자 Xa의 혼합물로 코팅된 웰을 사용하였다. 2차 항체(항-마우스 항체)는 Fc에 대해 교차반응을 일으킬 수 있는 5개의 클론을 표지하는 재조합 인간 IgG1 Fc/Xa(405 nm에서 약 0.3 OD)으로 코팅된 웰 상에서 약간의 백그라운드 신호를 제공하였다. 이 검정에서 이들 190개의 콜로니 중 141개의 콜로니가 hIL13Rα2에 대해 양의 점수를 기록하였지만 hIgG1 Fc/인자 Xa 혼합물에 대해서는 그렇지 않았다. hIL13Rα2에 대해 양성인, 그러나 hIgG1 Fc/인자 Xa 혼합물에 대해서는 아닌, 141개의 콜로니의 서열 데이터에 기반하여, 54개의 상이한 전장 나노바디를 구별하였으며, 이는 16개의 상이한 CDR3 군(B-세포 세포계통)에 속하였다. 동일한 CDR3 군(동일한 B-세포 세포계통)에 속한 나노바디는 매우 유사하였고 그들의 아미노산 서열은 그들이 체세포 초돌연변이로부터 또는 동일하지만 라이브러리 작제 동안의 RT 및/또는 PCR 에러로 인해 다양화된 B-세포로부터 생성된 클론성으로-관련된 B-세포로부터의 것이라는 사실을 뒷받침한다. 동일한 CDR3 군에 속한 나노바디는 동일한 에피토프를 인식하지만, 그들의 다른 특징(예를 들어, 친화도, 효능, 안정성, 발현 수율 등)은 상이할 수 있다. 또한 인간 IL13Rα2-특이적 나노바디의 His-태그된 인간 IL13Rα1(Acro Biosystems, 카탈로그 번호 IL1-H5224)에 대한 결합이, ELISA에 의해 시험되었다. 이들 ELISA 실험은 IL13Rα2-특이적 나노바디 중 어느 것도 인간 IL13Rα1에 결합하지 않는다는 사실을 드러냈다. 이들 패닝으로부터의 클론들은 그들의 이름 중에 다음의 코드를 지닌다: TIG.
hIL13Rα2-특이적 나노바디의 유세포 분석법 분석
나노바디 및 세포
주변세포질 추출물을 상기에 기재된 초기 ELISA 스크리닝을 위해 행해졌던 바와 동일한 방법으로 각각의 항-hIL13Rα2 Nb에 대해 생성하였다. 각각의 세포주로부터의 세포(U251_Luc_Mch 및 A431_Luc)를 해동시키고, 세척하고 계수하였다. 각각의 Nb 클론으로부터의 주변세포질 추출물을 약 2 x 105개의 세포와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포를 마우스 항-HA 태그 항체 및 항-마우스-PE의 혼합물과 함께 인큐베이션하였다. 또다른 세척 후, Topro를 라이브/데드(live/dead) 염색으로서 각각의 시료에 부가하였고 세포를 유세포 분석기 상에서 분석하였다. 양성 대조군 Mab로서, PE 커플링된 항-IL13Rα2 클론 47(+Topro)를 사용하였다. 각각의 세포주에 대한 음성 대조군은: 무관한 Nb(BCII10 - 박테리아성 β락타마아제 특이적)가 있는 시료, 모든 검출 Mab가 있는 시료, 2차 항-마우스-PE Mab 단독만 있는 시료 및 (Topro와 함께 또는 없이) 세포 단독만 있는 시료였다.
항체의 인간화
2개의 클론을 인간화를 위해 선택하였다. 도 1은 클론 1 및 클론 2의 서열 정렬을 나타내며, 이는 각각에 대한 모(비-인간화된) 서열 및 10개의 인간화된 변이체를 포함한다. 각각의 인간화된 나노바디는 125 nM, 41.66 nM, 및 13.86 nM에서 항원(IL13Rα2-Fc)의 3배 희석물과 함께, Ni-NTA 센서 상에서 500 nM의 Octet에 의해 분석하였다. 실험 절차의 도면이 도 2에 나타나있다. 도 1에 묘사된 인간화된 변이체들 각각에 대한 옥티드(octed) 측정의 요약이 표 1(클론 1) 및 표 2(클론 2)에 나타나있다.
표 1: 클론 1 모 및 인간화된 변이체 분석
Figure pct00011
표 2: 클론 1 모 및 인간화된 변이체 분석
Figure pct00012
추가의 연구를 위해, 각각의 클론에 대해 2개의 인간화된 서열을 선택하였고, 이들은 각각 서열번호 19-28 및 35-43에 대응한다.
실시예 4: 항-IL13Rα2 나노바디의 시험관내 활성
실시예 3에 기재된 인간화된 sdAb를 pLRPO 주쇄 상에서 발현시키고 CD3ε TFP 내로 혼입시켰다. 대응하는 IL13Rα2-TFP T 세포의 활성을 IL-13-발현 세포주(U87) 및 IL13Rα2-음성 세포주(A431) 상에서 시험하였다. 클론 1 및 클론 2 TFP T 세포 둘 다는 U87 세포에서 종양 세포 용해를 유도하였지만, A431, 세포에서는 그렇지 않았다(도 3a)
동일한 TFP T 세포를 IFNγ 및 IL-2 생산을 유도하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 도 3b에 나타난 바와 같이, TFP T 세포는 IL13Rα2 음성 세포(A431)로부터 IFNγ 또는 IL-2를 유도하지 않았지만, 클론 1 및 클론 2 TFP T 세포는 3000 pg/ml 보다 큰 IFNγ 반응 및 약 100 pg/ml의 낮은 IL-2 생산을 이끌어냈다. U251 교모세포종 세포에서 반복될 때 유사한 결과가 나타났다.
실시예 5: 인간 MUC16 펩티드에 대해 특이적인 나노바디의 생성 및 식별: NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP
재료 및 방법
형질전환, 재클로닝 및 VHH의 발현
재조합 pMECS GG를 이용한 비-억제자 균주(예를 들어 WK6)의 형질전환
pMECS GG 벡터에서 클로닝된 나노바디 유전자는 N-말단에서 PelB 신호 서열을 및 C-말단에서 HA 태그 및 His6 태그를 함유한다(PelB 리더-나노바디-HA-His6). PelB 리더 서열은 나노바디가 이.콜라이(E.coli)의 주변세포질 공간을 향하도록 지시하고 HA 및 His6 태그는 (예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯 등에서) 나노바디의 정제 및 검출을 위해 사용될 수 있다.
pMECS GG 벡터에서, His6 태그는 앰버(amber) 정지 코돈(TAG)에 이어지며 이 앰버 정지 코돈은 M13 파지의 유전자 III의 다음에 이어진다. 억제자 이.콜라이 균주(예를 들어 TG1)에서, 앰버 정지 코돈은 글루타민으로서 해독되며 그러므로 나노바디는, 패닝을 위한 파지 코트(coat) 상의 나노바디의 전시를 허용하는 파지의 단백질 III과의 융합 단백질로서 발현된다. 비-억제자 이.콜라이 균주(예를 들어, WK6)에서, 앰버 정지 코돈은 정지 코돈으로서 해독되며 그러므로 결과적인 나노바디는 단백질 III과 융합되지 않는다.
pMECS GG 벡터에서 클로닝된 나노바디를 발현하고 정제하기 위해, 관심있는 나노바디의 유전자를 함유하는 pMECS GG를 간단하게 제조하고 이 플라스미드로 비-억제자 균주(예를 들어, WK6)를 형질전환시킨다. 클론의 정체성을 확인하기 위해 MP057 프라이머(5'-TTATGCTTCCGGCTCGTATG-3')를 사용하여 결과적인 클론의 나노바디를 서열분석한다. 항원 결합 능력을 ELISA 또는 임의의 다른 적절한 검정에 의해 재시험한다. 이제, 나노바디 유전자와 함께 재조합 pMECS GG 벡터를 함유하는 비-억제제 균주(예를 들어, WK6)는 나노바디의 발현 및 정제를 위해 사용될 수 있다.
pMECS GG에서 pHEN6c 벡터까지의 나노바디 유전자의 재클로닝
프라이머 서열:
프라이머 A6E (5' GAT GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGR GGA GG 3').
프라이머 PMCF (5' CTA GTG CGG CCG CTG AGG AGA CGG TGA CCT GGG T 3').
보편적인 역방향 프라이머 (5' TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C 3').
보편적인 순방향 프라이머 (5 CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3').
나노바디 유전자를 주형으로서 나노바디 유전자를 보유하는 재조합 pMECS GG를 함유하는 이.콜라이 및 프라이머 A6E 및 PMCF 사용하여 PCR에 의해 증폭한다(PCR의 약 30주기, 각각의 주기는 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 45초, 뒤이어 PCR의 종료 시 72℃에서 10분 연장으로 이루어짐). 약 400 bp의 단편이 증폭된다. 그후에 PCR 생성물을 (예를 들어 Qiagen으로부터의 QiaqQuick PCR 정제 키트에 의해) 정제하고 PstI로 밤새도록 소화시킨다.
PCR 생성물을 정제하고 BstEII로(또는 Fermentas로부터의 Eco91I로) 밤새도록 소화시킨다. PCR 생성물을 상기와 같이 정제하고 pHEN6c 벡터를 3시간 동안 PstI로 소화시킨다; 소화된 벡터를 상기와 같이 정제하고 그후에 2 내지 3시간 동안 BstEII로 소화시킨다 소화된 벡터를 1% 아가로스 겔 상에 올리고, 벡터 밴드를 겔에서 잘라내고 (예를 들어, Qiagen으로부터의 QiaQuick 겔 추출 키트에 의해) 정제한다. PCR 생성물 및 벡터를 결찰한다. 전기적격성(electrocompetent) WK6 세포를 결찰 반응과 함께 형질전환시킨다. 형질전환체를 LB/아가/암피실린(100 ㎍/ml)/포도당(1-2%) 플레이트를 사용하여 선별한다.
나노바디의 발현 및 정제:
갓 형질전환된 WK6 콜로니를 LB+ 암피실린(100 ㎍/ml) + 포도당(1%)의 10-20 ml를 접종하는 데 사용하고 200-250 rpm에서의 쉐이킹(shaking)과 함께 밤새도록 37℃에서 인큐베이션한다. 이 전-배양물의 1 ml를 100 ㎍/ml 암피실린, 2 mM MgCl2및 0.1% 포도당으로 보충된 330 ml TB 배지에 부가하고, 0.6-0.9의 OD600에 도달할 때까지 쉐이킹(200-250 rpm)과 함께 37℃에서 성장시킨다. 나노바디 발현을 1 mM의 최종 농도까지 IPTG의 부가에 의해 유도하고 배양물을 밤새도록 쉐이킹과 함께 28℃에서 인큐베이션한다(약 16-18시간; 밤새도록의 유도 후 OD600은 이상적으로 25 내지 30이어야 함).
배양물을 8000 rpm에서 8분 동안 원심분리하고 펠렛(pellet)을 12 ml TES 중 1리터 배양물로부터 재현탁하고 얼음 상에서 1시간 동안 쉐이킹한다. 사용된 각각의 12 ml TES 당, 18 ml TES/4를 부가하고 추가로 추가적인 시간 동안(쉐이킹과 함께) 얼음 상에서 인큐베이션하고 그후에 4℃, 8000 rpm에서 30분 동안 원심분리한다. 상층액은 주변세포질 공간으로부터 추출된 단백질을 함유한다.
IMAC에 의한 정제:
His-선택은 PBS를 이용해 평형을 유지한다: 1리터 배양물로부터 유래된 주변세포질 추출물 당, 1 ml 수지(약 2 ml His-선택 용액)를 50 ml 팔콘 튜브에 부가하고, PBS를 최종 부피 50 ml로 부가하고 혼합하며 그후에 2분 동안 2000 rpm에서 원심분리하고 상층액을 버린다. 수지를 PBS로 2회 세척하고 그후에 주변세포질 추출물을 부가하고 30분 내지 1시간 동안 실온에서 부드러운 쉐이킹과 함께 인큐베이션한다(보다 긴 인큐베이션 시간은 비-특이적 결합을 유발할 수 있음).
시료를 바닥에 필터가 있는 PD-10 컬럼(GE healthcare, 카탈로그 번호 17-0435-01) 상으로 로딩하고 50 내지 100 ml PBS(사용된 1 ml 수지 당 50-100 ml PBS)로 세척한다. 용리를 3회 수행하였는데, 각각의 때에 사용된 1 ml 수지 당 1 ml PBS/0.5 M 이미다졸을 이용하였고, PBS에 대해 4℃에서 밤새도록 투석하여(컷오프 3500 달톤) 이미다졸을 제거한다.
이 시점에서 용리된 시료의 OD280 측정에 의해 단백질의 양을 추정할 수 있다. 각각의 클론의 흡광 계수는 Expasy 프로테오믹스 서버에서의 1차 구조 분석 하에서 protParam 도구에 의해 결정할 수 있다. 나노바디의 추가의 정제는 상이한 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 시료는 Superdex 75 16/60 상에의 로딩을 위한 적절한 부피가 수득될 때까지(최대 4 ml) 4℃, 2000 rpm에서 원심분리함으로써 농축될 수 있다(Vivaspin 5000 MW 컷오프, Vivascience). 그후에 농축된 시료를 PBS로 평형이 유지된 Superdex 75 16/60 컬럼 상으로 로딩한다. 정량화를 위해 피크 분획을 풀링하고 시료를 OD280에서 측정한다. 분취액을 약 1 mg/ml의 농도로 -20℃에서 저장한다.
면역화
KLH(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP-C-KLH)에 콘주게이트된 인간 MUC16 펩티드(hMUC16) 및/또는 C-말단에서 비오티닐화된 인간 MUC16 펩티드(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP-C-비오틴) 및/또는 N-말단에서 비오티닐화된 인간 MUC16 펩티드(비오틴-NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP을 0일, 7일, 14일, 21일, 28일 및 35일에 라마에 피하로 주사하였다. 비오티닐화된 펩티드는 주사 전 뉴트라라이트 아비딘(neutralite avidin)과 함께 혼합하였다. 사용된 애주번트는 GERBU 애주번트 P(GERBU Biotechnik GmbH)였다. 40일에, 림프구 제조를 위해 약 100 ml 항응고화 혈액을 라마로부터 수집하였다.
VHH 라이브러리의 작제
VHH 라이브러리를 라마 림프구로부터 작제하여 항원-특이적 나노바디의 존재에 대해 스크리닝하였다. 이것을 위해, 말초 혈액 림프구로부터의 총 RNA를 올리고(dT) 프라이머와 함께 첫 번째 가닥 cDNA 합성을 위한 주형으로서 사용하였다. 이 cDNA를 사용하여, VHH 인코딩 서열을 PCR에 의해 증폭하였고, SAPI로 소화시켰으며, 파지미드 벡터 pMECS-GG의 SAPI 부위 내로 클로닝하였다. 이에 따라 수득된 VHH 라이브러리는 코어 93GG로 불렸다. 라이브러리는 올바른 삽입 크기를 갖는 벡터를 지닌 약 87%의 형질전환체와 함께, 108개의 독립적인 형질전환체로 이루어졌다.
인간 MUC16 펩티드-특이적 나노바디의 단리
코어 93GG 라이브러리를 C-또는 N-말단 중 어느 하나에서 비오티닐화된 hMUC16 펩티드 NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP(bio-hMUC16) 상에서 4 라운드 동안 패닝하였다. bio-hMUC16 펩티드를 스트렙타비딘 코팅된 플레이트와 상호작용하도록 허용하였고 그후 라이브러리로부터의 파지를 플레이트에 부가하였다. 항원 특이적 파지에 대한 농축은, (스트렙타비딘으로 코팅되고 블로킹되었지만 어떤 펩티드도 함유하지 않은) 음성 대조군 웰로부터 용리된 파지미드 입자의 수와 항원-코팅된 웰로부터 용리된 파지미드 입자의 수를 비교함으로써 각 라운드의 패닝 후 평가하였다. 이들 실험은 파지 집단이 항원-특이적 파지에 대해 두 번째 라운드 후 약 2-배 농축되었다는 사실을 뒷받침하였다. 첫 번째, 세 번째 및 네 번째 라운드 후에는 어떤 농축도 관찰되지 않았다. 총, 380개의 콜로니(라운드 3으로부터 190개, 라운드 4로부터 190개)를 무작위적으로 선택하였고 그들의 주변세포질 추출물 중 항원-특이적 나노바디의 존재에 대해 ELISA(가용성 나노바디를 포함하는 조 주변세포질 추출물을 사용한 ELISA)에 의해 분석하였다. ELISA 스크리닝를 위해 사용된 펩티드는 패닝을 위해 사용된 것과 동일하였으며, 이는 음성 대조군으로서 펩티드 없이 블로킹된 스트렙타비딘-코팅된 웰을 사용하였다. 이 검정에서 이들 380개의 콜로니 중 34개의 콜로니가 양의 점수를 기록하였다. 양성인 콜로니의 서열 데이터에 기반하여, 6개의 상이한 전장 나노바디를 구별하였으며, 이는 2개의 상이한 CDR3 군(B-세포 세포계통)에 속하였다(엑셀 파일 참조). 동일한 CDR3 군(동일한 B-세포 세포계통)에 속한 나노바디는 매우 유사하였고 그들의 아미노산 서열은 그들이 체세포 초돌연변이로부터 또는 동일하지만 라이브러리 작제 동안의 RT 및/또는 PCR 에러로 인해 다양화된 B-세포로부터 생성된 클론성으로-관련된 B-세포로부터의 것이라는 사실을 뒷받침한다. 동일한 CDR3 군에 속한 나노바디는 동일한 에피토프를 인식하지만, 그들의 다른 특성(예를 들어, 친화도, 효능, 안정성, 발현 수율 등)은 상이할 수 있다. 이들 패닝으로부터의 클론들은 그들의 이름 중에 다음의 코드를 지닌다: MU.
hMUC16 펩티드-특이적 나노바디의 유세포 분석법 분석
나노바디 및 세포
주변세포질 추출물을 상기에 기재된 초기 ELISA 스크리닝을 위해 행해졌던 바와 동일한 방법으로 각각의 항-hMUC16-펩티드 Nb에 대해 생성하였다. 각각의 세포주로부터의 세포(SKOV3 Muc16 Luc, OVCAR 3 Muc16 Luc, Expi-293 및 Jurkat)를 해동시키고, 세척하고 계수하였다. 각각의 Nb 클론으로부터의 주변세포질 추출물을 2 x 105개의 세포와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포를 마우스 항-HA 태그 항체 및 항-마우스-PE의 혼합물과 함께 인큐베이션하였다. 또다른 세척 후, Topro를 라이브/데드 염색으로서 각각의 시료에 부가하였고 세포를 유세포 분석기 상에서 분석하였다. 양성 대조군 Mab로서, 인간 항-Muc16-4h11(+ 항-인간 IgG-PE + Topro)을 SKOV3 Muc16 Luc 및 OVCAR 3 Muc16 Luc 세포 상에서 사용하였다. 음성 대조군으로서, 본 발명자들은 각각의 세포주에 대해: 무관한 Nb(BCII10 - 박테리아성 β락타마아제 특이적)가 있는 시료, 모든 검출 Mab가 있는 시료, 2차 항-마우스-PE Mab 단독만 있는 시료 및 (Topro와 함께 또는 없이) 세포 단독만 있는 시료를 사용하였다.
실시예 6: hMUC16 표적에 대한 항-MUC16 sdAb의 스크리닝
실시예 5에서 생산된 VHH 바인더를 NTA 바이오센서(니켈 컬럼, 방법의 개요를 그린 도면에 대해 도 5a 참조)를 사용하여 스크리닝하였다. His-태그된 MUC16 sdAb(3.25 μg/ml)를 컬럼에 결합시키고, 그후에 MUC16 펩티드를 200, 100, 50, 25, 6.25, 1.56, 및 0 nM의 농도에서 컬럼을 통과시킨다. 완충액: 30℃에서 0.02% Teen® 20을 함유하는 1X Corning® Cellgro® PBS pH 7.4(카탈로그 21-040-CM). 센서: Pall Forte Bio Dip & Read(카탈로그 18-5102).
MUC16 표적에 대한 2개의 클론, R3Mu4(도 1c) 및 R3Mu29(도 1d) 라마 및 인간화된 sdAb의 포화 결합은 모 및 인간화된 αMuc16 sdAb 변이체가 6-94 nM의 범위에 이르는 KD 값과 연관된, MUC16 엑토도메인("MUC16ecto") 펩티드에 대해 높은 친화도 결합을 나타낸다는 사실을 입증한다. 그들의 개별적인 모 라마 클론과 비교하여 인간화된 변이체에 의해 입증된 친화도에는 일부 손실이 있다. 요약을 표 3에 제공한다.
표 3. 적정 결합의 1:1 전체적 적합 모델(global fit model)로부터 KD의 결정
Figure pct00013
실시예 7: 4H11 도구 바인더와 비교 시 항-MUC16 바인더의 에피토프 비닝
MUC16 모 R3Mu4 및 모 R3Mu29 sdAb가 (4H11 하이브리도마로부터의) 4H11 scFv-Fc 도구 바인더와 비교하여 동일하거나 상이한 에피토프에 비닝하는지 여부를 결정하기 위해, 샌드위치 검정을 사용하였다(도 6a 참조).
도 6b에 나타난 바와 같이, MUC 16 sdAb - 모(라마) R3Mu4 및 모(라마) R3Mu29는 4H11 도구 바인더 노출에 이은 결합을 나타내며, 이는 모 sdAb가 4H11 scFv-Fc 도구 바인더와 비교하여 MUC16 펩티드의 상이한 에피토프를 인식하고 이에 비닝한다는 사실을 입증한다. 항원(MUC16 펩티드)이 없는 음성 대조군은 어떤 결합도 나타내지 않으며, 비-특이적 결합의 어떤 기회도 배제한다. 모 라마 항체 R3Mu4 및 R3Mu29의 결합 에피토프를 나타내는 도표를 도 6c에 나타낸다.
실시예 8: MUC16-TFP를 발현하는 T 세포를 이용한 전임상 연구
MUC16-TFP를 발현하는 T 세포를 전임상 시험관내 연구에서 평가하였다(도 7). MUC16-TFP를 발현하는 T 세포는 MUC16 형태와 회합된 C-말단 세포를 과발현하도록 형질도입된 SKOV3-MUC16Cterm 난소암 세포를 용량-의존적 방식으로 특이적으로 사멸시킨 반면, 모 SKOV3 MUC16-음성 세포는 MUC16-TFP를 발현하는 T 세포 매개 사멸을 피했다. 마찬가지로, MUC16-TFP를 발현하는 T 세포는 MUC16의 세포-회합 형태를 과발현하는 OVCAR3-MUC16-Cterm 세포를 제거하였다. 낮은 수준의 MUC16을 발현하는 모 OVCAR3 세포는 가장 높은 TFP-T 세포-대-표적 세포 비율에서만 사멸되었는데, 이는 종양 세포의 용량-의존적 용해를 분명히 보여준다. 마찬가지로, TFP-T 세포는 MUC16이 표적 세포 상에 존재할 때만 사이토킨을 방출하였다. 도 8은 높고 낮은 수준의 MUC16을 발현하는 난소 세포주를 사용한 세포 검정에서의 MUC16-TFP의 효능을 나타내는 실시예 실험 데이터를 묘사한다. 이들 연구에서, MUC16-TFP는 종양 세포 표면 상의 MUC16의 수준에 의존하여 우선적인 사멸 능력을 갖는 것으로 관찰되었다. 보다 정확하게는, MUC16-TFP는 용량 의존적 방식으로 높은 MUC16 발현 종양 세포를 사멸시키는 것으로 관찰되었으며, 반면에 낮은 MUC16 발현 세포의 MUC16-TFP 사멸은 이들 검정에서 사용된 용량 수준에서는 관찰되지 않았다.
실시예 9. 유세포 분석법 기반 MUC16 ecto 사본 수 정량
항체 4H11에 특이적인 C 말단 세포 회합된 MUC16 형태(MUC16ecto)는 미국 특허 번호 제9,169,328호에 따라 생산하였고 그후에 PE와 콘주게이트하였다. 항체 당 PE 분자의 평균 수는 약 1일 것으로 추정하였다. 난소암종 세포주 OVCAR3 및 SKOV3, 또는 MUC16ecto를 안정적으로 과발현하는 유도체(OVCAR3-MUC16ecto 및 SKOV3-MUC16ecto 세포)를 4H11-PE Ab를 이용해 시료 당 2 ㎍으로 염색하였다. 세포-표면 MUC16ecto의 사본 수를 제조업자의 지시에 따라 Quantibrite Beads PE Fluorescence Quantitation 키트(BD Bioscience)를 이용해 추정하였다. 4H11-PE 항체-염색된 종양 세포를 Quantibrite 비드와 함께 Fortessa® X-20 상에서 수행하였다. 기하 중앙값 형광 강도(gMFI)를 각각의 세포 뿐만 아니라 비드에 대해 계산하였다. 비드 스톡(stock)은 비드 당 상이한 수(높은, 중간의, 낮은, 음성)의 PE 분자를 갖도록 조작된 4개의 집단을 함유한다. 표준 곡선을 각각의 비드의 세트에 대해 측정된 MFI에 비해 비드 당 주어진 사본의 PE 분자에 기반하여 생성하였다. 그후에 종양 세포 상의 MUC16ecto의 사본 수는 비드-생성된 표준 곡선에 기반하여 추정하였다. OVCAR3, OVCAR3-MUC16ecto, SKOV3 및 SKOV3-MUC16ecto 세포 상의 MUC16ecto의 사본은 각각 726개, 3616개, 39개 및 2351개인 것으로 결정되었다(도 9b).
실시예 10. MUC16-TFP T 세포에 의한 MUC16 ecto 특이적 종양 세포 용해
MUC16-TFP T 세포에 의한 MUC16ecto 특이적 종양 세포 용해를 시험관내 세포독성 검증에 의해 평가하였다. MUC16ecto 발현과 함께 또는 없이 종양 세포주를 리포터로서 파이어플라이 루시퍼라제를 발현하도록 안정하게 형질도입하였다. 24시간 공동-배양 후, 공동-배양된 세포의 루시퍼라제 활성을, 잔여의 살아있는 종양 세포의 대리물로서, Bright-GloTM Luciferase Assay System(Promega, 카탈로그# E2610)를 이용해 결정하였다. 그후에 종양 세포 사멸의 백분율을 다음의 식을 이용해 계산하였다: 종양 세포 용해의 % = 100% X [1 - RLU(종양 세포 + T 세포) / RLU(종양 세포)].
MUC16-TFP를 발현하는 T 세포는 SKOV3-MUC16ecto 세포를 특이적으로 사멸하였으며(도 10a), 반면 모 sKOV3 세포는 MUC16-TFP를 발현하는 T 세포 매개 사멸을 피했다(도 10b). 마찬가지로, MUC16-TFP를 발현하는 T 세포는 세포-회합 형태의 MUC16을 과발현하는 OVCAR3-MUC16ecto 세포를 제거하였다(도 10c). 낮은 수준의 MUC16ecto를 발현하는 모 OVCAR3 세포는 단지 부분적으로 사멸되었다(도 10d).
실시예 11. MUC16-TFP T 세포에 의한 MUC16 ecto 특이적 사이토킨 생산
MUC16-TFP T 세포에 의한 MUC16ecto 특이적 사이토킨 생산을, MUC16ecto 발현 및 MUC16-TFP T 세포와 함께 또는 없이, 다양한 동양 세포의 공동-배양물로부터 수확한 상층액에 대해 결정하였다. 상층액 중 인간 IFN-γ 및 IL-2의 수준을, 2-플렉스 키트(Millipore, 카탈로그# HCYTOMAG-60K)와 함께, MAGPIX Luminex® xMAP Technology(EMD Millipore)를 사용하여 분석하였다.
MUC16-TFP를 발현하는 T 세포는 항원-특이적 방식으로 전-염증성 사이토킨을 분비하였다. MUC16-TFP를 발현하는 T 세포는, SKOV3-MUC16ecto 세포(각각 도 11a 및 11e) 또는 OVCAR3-MUC16ecto 세포(각각 도 11c 및 11g)와 공동-배양될 때 IFN-γ 및 IL-2를 분비하였지만, SKOV3 세포(각각 도 11b 및 11f) 또는 OVCAR3 세포(각각 도 11d 및 11h)와는 그렇지 않았다.
실시예 12. MUC16-TFP를 발현하는 T 세포의 MUC16 ecto 특이적 증식
MUC16-TFP T 세포의 MUC16ecto 특이적 증식을 유세포 분석법 분석에 의해 T 세포 추적 신호의 희석(CellTrace™의 신호 강도의 감소)을 모니터링함으로써 결정하였다. MUC16-TFP를 발현하는 T 세포를 CellTrace™ Far Red Proliferation Kit(카탈로그# C34564ThermoFisher)로 표지하였고, 그후에 SKOV3 또는 SKOV3-MUC16ecto 세포와 1-대-1 비율로 3일 동안 공동배양하였다. CellTrace Far Red Proliferation 키트로 표지된 MUC16-TFP를 발현하는 T 세포를 배지 단독으로 또는 1 ㎍/mL의 플레이트-결합된 항-CD3 항체(클론 OKT-3, 카탈로그# 14-0037-82, Invitrogen)로 3일 동안 또한 자극하였다. MUC16-TFP를 발현하는 T 세포는 MUC16ecto 특이적 증식을 나타내었는데, 이는 SKOV3-MUC16ecto 세포와 공동-배양될 때 CellTracer 신호가 감소하지만, SKOV3 세포는 그렇지 않음에 의해 입증되었다(도 12).
실시예 13. MUC16-TFP T 세포의 생체내 활성
MUC16-TFP를 발현하는 T 세포를, 인간 난소암종 세포주 SKOV3-MUC16ecto 세포 및 OVCAR3-MUC16ecto 세포의 NSG 마우스 이종이식 모델에서 평가하였다. 6-주령의 암컷 NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ, The Jackson Laboratory, 스톡 번호 005557) 마우스에 SKOV3-MUC16ecto 세포(5 x 105개 세포/마우스) 또는 OVCAR3-MUC16ecto 세포(5 x 106개 세포/마우스)를 복강내로 접종하거나, SKOV3-MUC16ecto 세포(5 x 106개 세포/마우스, Matrigel®과의 1-대-1 혼합물)를 피하로 접종하였다. 복강내 모델의 경우 종양 부담은 PBS(150 mg/kg) 중 희석된 0.2 ml의 루시페린 기질(VWR)의 복강내 주입을 이용해 생물발광 이미징(BLI)에 의해 결정하였다. 피하 모델의 종양 부담은 Caliper에 의해 종양 용적으로서 측정하였다. 종양 모델이 확립되면(복강내 모델: BLI 신호 > 108, 피하 모델: 종양 용적 > 75 mm3), MUC16-TFP를 발현하는 T 세포(MUC16 TFP1 및 MUC16 TFP2) 또는 비-형질도입된 T 세포(NT), 또는 비히클(PBS)을 마우스 당 107개의 T 세포의 용량으로 정맥내 주사하였다.
SKOV3-MUC16ecto 세포 및 OVCAR3-MUC16ecto 세포의 복강내 및 피하 모델에 걸쳐 MUC16 TFP를 발현하는 T 세포의 생체내 효능이 관찰되었다. SKOV3-MUC16ecto 세포의 복강내 모델에서, MUC16 TFP 1은 0일(T 세포 주사 날)에서의 기준치 수준과 비교 시 종양 부담의 현저한 감소를 나타내었다(도 13a). 일관되게, MUC16 TFP1은, NT T 세포와 비교할 때, SKOV3-MUC16ecto 세포의 피하 모델에서 종양 성장을 현저하게 지연시켰다(도 13b). OVCAR3-MUC16ecto 세포의 복강내 모델에서, MUC16 TFP1 및 MUC16 TFP2 둘 다는 마우스로부터 종양을 완전히 제거하였다(도 13c).
실시예 14: 항-MUC16 단일 도메인 항체 Fc 융합 단백질을 사용한 정상적인 인간 조직의 면역조직화학 염색
연구의 목적은 정상적인 인간 조직의 MUC16 발현에 대한 정보를 수득하는 것이었다.
대조군 재료 및 FFPE 박편(section)을, HRP 콘주게이트된 항-마우스 Fc 2차 항체를 사용한 검출을 위해 마우스 Fc 영역과 유전적으로 융합된 항-MUC16 단일 도메인 항체로 염색하였다. 양성 대조군은 두 공여체로부터의 인간 난소 종양의 FFPE 박편으로 이루어졌다. 음성 대조군은 인간 심장의 FFPE 박편이었다. 시험된 조직의 패널(panel)은 다음을 포함하였다: 한 공여체 각각으로부터의 혈액 세포, 소뇌 또는 대뇌피질, 위장관(식도, 소장, 위, 결장 - 이용가능한 바), 비장, 신장(사구체, 세관), 간, 림프절, 피부, 태반, 고환 및 편도선.
결과: 상이한 공여체로부터의 2개의 인간 난소암종 조직을 양성 대조군으로서 사용하였고, 신생물 세포막 및 세포질에 대해 1-3+(가끔 에서 자주) 및 1-4+(가끔 에서 자주)의 범위에 이르는, 상이한 강도에서의 염색을 나타내었다. 정상 조직으로부터, 모든 것은 MUC16에 대해서는 음성 염색을 그러나 2가지: 1) 인간 위 상피, 체벽(세포질, 세포질 과립) - 1-2+(가끔 에서 자주), 및 2) 인간 편도선 상피 표면, 소낭선(막, 세포질 및 다른 요소) - 1-3+ 드문 에서 가끔을 나타내었다.
이들 데이터는 MUC16이 정상적인 인간 조직에서는 제한된 발현을 및 특정한 종양에서 상승된 발현을 갖는다는 점을 입증한다. 이는 이것을 MUC16 양성 악성종양의 암 요법을 위한 매력적인 표적으로 만든다. MUC16-특이적 단일 도메인 항체는 항원 양성 조직에 결합할 수 있고 이를 염색할 수 있다.
실시예 15: 임상 연구
재발된 또는 난치성 질환으로 절제불가능한 난소암을 갖는 환자가 MUC16 TFP를 발현하는 T 세포의 임상 연구에 등록될 것이다. 초기 연구는 MUC16 TFP를 발현하는 T 세포의 안정성 프로파일을 탐색할 것이며 세포 동역학 및 약물역학 결과를 탐색할 것이다. 이들 결과는 추가의 연구를 위한 복용량의 선택에 영향을 줄 것인데, 이는 그후에 절제불가능한 난소암 환자의 보다 큰 코호트에 투여되어 MUC16 TFP를 발현하는 T 세포의 효능 프로파일을 정의할 것이다.
실시예 16: 항-MSLN TFP T 세포는 높은 MSLN 발현이 있는 종양 세포를 우선적으로 사멸시킨다.
MSLN 높은(MSTO-MSLNhigh, 표면 MSLN의 11006개의 사본) 및 MSLN 낮은 종양(MSTO-MSLNlow, 198개의 사본 표면 MSLN)에 대한 MSLN-TFP T 세포의 구별되는 사멸 능력을 MSTO-MSLNhigh 또는 MSTO-MSLNlow 종양 중 어느 하나를 지닌 NSG 마우스에서 다루었다.
MSTO-MSLNhigh 및 MSTO-MSLNlow 세포를 1 x 106개 세포/100 ㎕의 농도로 멸균 PBS(pH 7.4)에 재현탁시켰다. 그후에 PBS 세포 현탁액을 마우스 당 200 ㎕의 최종 주사 부피를 위해 얼음처럼 차가운 Matrigel®과 1:1 혼합하였다. 모든 동물에, 멸균 PBS/Matrigel® 중 종양 세포 현탁액 200 ㎕를 배측 후방 측면을 기반으로 하여 피하 투여에 의해 주사하였다. 종양 성장을 캘리퍼에 의해 주 2회 측정되는 종양 용적에 의해 모니터링하였다. 평균 종양 용적이 ~300 mm3에 도달한 종양 모델이 확립되면(종양 주입 후 14일), 종양을 지닌 마우스에 비-형질도입된 T 세포(NT, 1 x 107개의 총 T 세포) 또는 MSLN-TFP T 세포(1 x 107개의 총 T 세포)를 정맥내 주사하였다.
MSLN-TFP T 세포는, NT T 세포 치료된 마우스와 비교하여, MSLN 높은 종양의 성장을 극적으로 제어하였다(도 14a). 반면에, 제한된 항-종양 반응이 MSLN 낮은 종양과 함께 MSLN-TFP T 세포로 치료된 마우스에서 관찰되었다(도 14b). 종양 퇴행이 1마리의 동물에서 관찰된 반면, 다른 9마리의 MSLN-TFP T 세포 치료된 마우스는 NT T 세포를 받은 동물에 대해 보다 느리거나(n = 2) 유사한(n = 6) 비율 중 어느 하나의 종양 퇴행을 나타내었다(도 14b).
미주
본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 나타나고 기재되었지만, 이러한 구현예가 단지 예로서 제공되는 것임은 당업자에게 명백할 것이다. 수많은 변이체, 변화, 및 치환이 이제 본 발명으로부터 벗어나지 않고 당업자에게 발견될 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시함에 있어서 이용될 수 있다는 사실이 이해되어야 한다. 다음의 청구범위는 본 발명의 범주를 정의한다는 점 및 이들 청구범위 및 이들의 등가물의 범주 내에서의 방법 및 구조가 이로써 포함된다는 점이 의도된다.
표 4 - 서열
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
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Figure pct00017
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Figure pct00019
Figure pct00020
SEQUENCE LISTING <110> TCR2 THERAPEUTICS INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TCR REPROGRAMMING USING TARGET SPECIFIC FUSION PROTEINS <130> 48538-718.601 <140> PCT/US2019/043690 <141> 2019-07-26 <150> 62/727,469 <151> 2018-09-05 <150> 62/727,459 <151> 2018-09-05 <150> 62/725,066 <151> 2018-08-30 <150> 62/703,824 <151> 2018-07-26 <150> 62/703,834 <151> 2018-07-26 <160> 143 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu 1 5 10 15 Glu <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Glu 20 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro 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Synthetic peptide <400> 28 Ala Ser Lys Leu Glu Tyr Thr Ser Asn Asp Tyr Asp Ser 1 5 10 <210> 29 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 29 caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggt ttggtgcagc ctggggattc tatgagactc 60 tcctgtgcag ccgaggggga ctctttggat ggttatgtag taggttggtt ccgccaggcc 120 ccagggaagg agcgccaggg ggtctcaagt attagtggcg atggcagtat gcgatacgtt 180 gctgactccg tgaaggggcg attcaccatc tcccgagaca acgccaagaa cacggtgtat 240 ctgcaaatga tcgacctgaa acctgaggac acaggcgttt attactgtgc agcagaccca 300 cccacttggg actactgggg tcaggggacc caggtcaccg tctcctca 348 <210> 30 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Ala Glu Gly Asp Ser Leu Asp Gly Tyr 20 25 30 Val Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gln Gly Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser 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acctgaggac acggccgttt attactgtgc atcaaagttg 300 gaatatactt ctaatgacta tgactcctgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360 <210> 40 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 40 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser Leu 20 25 30 Phe Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Arg Tyr Ser Leu Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Lys Leu Glu Tyr Thr Ser Asn Asp Tyr Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Gly Arg Thr Val Ser Ser Leu Phe 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Ile Ser Arg Tyr Ser Leu Tyr Thr 1 5 <210> 43 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Ala Ser Lys Leu Glu Tyr Thr Ser Asn Asp Tyr Asp Ser 1 5 10 <210> 44 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 44 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Val Ser Ser Leu 20 25 30 Phe Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Arg Tyr Ser Leu Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Lys Leu Glu Tyr Thr Ser Asn Asp Tyr Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val 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atgcacagga actttgattc ctggggccag 360 gggacccagg tcaccgtctc ctca 384 <210> 51 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 51 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr 20 25 30 Ile Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Lys Tyr Ala Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Gln Ser Arg Gly Ala Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Thr Arg Arg Tyr Thr Cys Pro Asp Ile Ala Thr Met His 100 105 110 Arg Asn Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Gly Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr Ile 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr 20 25 30 Ile Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Lys Tyr Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Thr Arg Arg Tyr Thr Cys Pro Asp Ile Ala Thr Met His 100 105 110 Arg Asn Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Gly Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr Ile 1 5 <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Ile Ser Ser Lys Tyr Ala Asn Thr 1 5 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Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Met Gly Pro Lys Pro Gly Tyr Glu Leu Gly Pro Asp Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 85 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 85 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Pro Ser Gly Arg Ser Phe Ser Phe Arg 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ala Ser Trp Ile Tyr Ala Thr Thr Asp Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asp Thr Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Val Arg Gly Thr Ser Asp Thr Val Leu Pro Pro Arg Ser Asp 100 105 110 Tyr Glu Tyr Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 86 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 86 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Thr Asn Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe 35 40 45 Val Ala Ala Phe Arg Trp Gly Phe Ala Asn Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Gln Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ala Ser Ser Glu Trp Thr Thr Glu Ala Val Lys Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 87 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 87 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ser Ser Asn Ala Met 20 25 30 Ala Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val Ala Ala 35 40 45 Phe His Trp Arg Phe Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala 85 90 95 Arg Gln Gly Ser Val Tyr Gly Gly Ser Ser Pro Val Asp Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 88 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 88 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ile Trp Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Asn Arg Pro Met Gly Arg Ser Thr Gly Tyr Asn Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 89 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 89 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Asp Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Trp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Gly Leu Leu Pro Val Thr Ala Ala Arg Glu Tyr Thr Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 90 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 90 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Arg Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Ser Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Arg Trp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Gly Asp Ser Ala Lys Asn Met Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Glu Asn Ser Ser Asp Gln Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 91 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 91 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ile Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Phe Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Gly Trp Ser Gly Ala Asp Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Lys Met Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Arg Gly Ser Thr Trp Ser Thr Ser Thr Tyr Ser Ile Arg 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 92 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 92 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Ser Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Phe Asn Ser Asp Tyr Ala Asp Ser Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Arg Gly Ile Gly Asp Ser Arg Ser Ala Thr Ala Tyr Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 93 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 93 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Leu Thr Asp Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Thr Glu Ser Asn Trp Arg Gly Gly Asn His Tyr Tyr Leu Asp Ser Ile 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Asn Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Arg Arg Thr Ala Arg Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 94 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 94 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Met Tyr 20 25 30 Gly Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ser Ile Arg Trp Ser Asp Asn Ser Thr His Tyr Ala Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Gly Arg Ala Gly Ser Pro Leu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 95 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 95 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Ala Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Thr Ala Ile Thr Trp Ser Ala Gly Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Gln Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Pro Leu Pro Val Thr Ser Pro Ser Ser Tyr Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 96 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 98 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Pro Ser Gly Ser Ile Phe Gly Ile Arg 20 25 30 Thr Met Asp Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Arg Ile Thr Met Asp Gly Arg Val Phe His Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Ser Gly Ser Arg Asp Gly Ala Ser Asn Ala Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg 85 90 95 Tyr Ser Gly Leu Thr Ser Arg Glu Asp Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 99 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 99 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 100 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 100 ggtggcggag gttctggagg tggaggttcc 30 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 ttatgcttcc ggctcgtatg 20 <210> 102 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29 <210> 103 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 ctagtgcggc cgctgaggag acggtgacct gggt 34 <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 tcacacagga aacagctatg ac 22 <210> 105 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 cgccagggtt ttcccagtca cgac 24 <210> 106 <211> 280 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro 20 25 30 Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu 35 40 45 Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser 50 55 60 Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro 65 70 75 80 Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser 85 90 95 Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly 100 105 110 Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu 115 120 125 Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro 130 135 140 Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu 145 150 155 160 Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala 165 170 175 Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly 180 185 190 Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr 195 200 205 Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro 210 215 220 Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val Trp Gly Glu Gly Ser Tyr Leu 225 230 235 240 Ser Ser Tyr Pro Thr Cys Pro Ala Gln Ala Trp Cys Ser Arg Ser Ala 245 250 255 Leu Arg Ala Pro Ser Ser Ser Leu Gly Ala Phe Phe Ala Gly Asp Leu 260 265 270 Pro Pro Pro Leu Gln Ala Gly Ala 275 280 <210> 107 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> This sequence may encompass 1-4 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <400> 107 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 108 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> This sequence may encompass 2-4 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <400> 108 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 109 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> This sequence may encompass 1-3 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <400> 109 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 110 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 110 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 111 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 111 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 112 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 112 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 113 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 113 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 114 <211> 5000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> This sequence may encompass 50-5000 nucleotides <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 114 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000 <210> 115 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> This sequence may encompass 1-6 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 115 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 116 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 116 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 117 <211> 2000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2000) <223> This sequence may encompass 50-2000 nucleotides <400> 117 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> This sequence may encompass 50-5000 nucleotides <400> 119 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 180 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 240 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 300 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 360 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 420 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 480 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 540 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 600 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 660 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 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1560 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1620 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1680 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1740 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1800 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1860 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1920 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1980 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2040 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2100 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2160 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2220 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2280 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2340 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2400 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 126 Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu 1 5 10 15 Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr 20 25 30 Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn 35 40 45 Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro 50 55 <210> 127 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 127 Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu 1 5 10 15 Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr 20 25 30 Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn 35 40 45 Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro 50 55 <210> 128 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 128 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 131 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr 20 25 30 Ile Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Lys Tyr Ala Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Thr Arg Arg Tyr Thr Cys Pro Asp Ile Ala Thr Met His 100 105 110 Arg Asn Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 132 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 132 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr 20 25 30 Ile Met Gly Trp 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Synthetic polypeptide <400> 135 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr 20 25 30 Ile Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Lys Tyr Ala Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Gln Ser Arg Gly Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Thr Arg Arg Tyr Thr Cys Pro Asp Ile Ala Thr Met His 100 105 110 Arg Asn Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 136 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 136 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Ser Asp Asp Tyr 20 25 30 Ile Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser 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Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Ser Asp Asp Tyr 20 25 30 Ile Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Arg Tyr Ala Asn Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Met Asp Ser Arg Arg Val Thr Cys Pro Glu Ile Ser Thr Met His 100 105 110 Arg Asn Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 140 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 140 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Ser Asp Asp Tyr 20 25 30 Ile Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Arg Tyr Ala Asn Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr 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Claims (291)

  1. 약제학적 조성물로서,
    (I) 인간 대상체로부터의 T 세포; 및
    (II) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하되,
    상기 T 세포는,
    (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분,
    (ii) TCR 막관통 도메인, 및
    (iii) TCR 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛(subunit); 및
    (b) 항-MUC16 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인
    을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하고,
    상기 TCR 서브유닛 및 항-MUC16 결합 도메인은 작동가능하게 연결되며;
    상기 TFP는 T 세포에서 발현될 때 TCR과 기능적으로 상호작용하는, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-MUC16 결합 도메인을 인코딩하는 서열은 링커를 인코딩하는 서열에 의해 TCR 세포외 도메인을 인코딩하는 서열과 연결되는, 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 링커는 (G4S)n을 포함하고, 상기 G는 글리이신이고, S는 세린이며, n은 1 내지 4의 정수인, 약제학적 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-MUC16 결합 도메인은
    (i) 중쇄(HC) CDR1 서열 GRTVSSLF, GRAVSSLF, 또는 GDSLDGYV,
    (ii) HC CDR2 서열 ISRYSLYT, 또는 ISGDGSMR, 및
    (iii) HC CDR3 서열 ASKLEYTSNDYDS, 또는 AADPPTWDY
    를 포함하는, 약제학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-MUC16 결합 도메인은 서열번호 15, 서열번호 20, 서열번호 25, 서열번호 30, 서열번호 35, 또는 서열번호 40의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 실질적으로 혈청을 무함유하는, 약제학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인은 scFv인, 약제학적 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인은 단일 도메인 항체인, 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 단일 도메인 항체는 VH 도메인인, 약제학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인코딩된 항-MUC16 결합 도메인은 항-MUC16 결합 도메인을 포함하며, 상기 T 세포는 (a) (b) CD28 세포외 도메인의 적어도 부분과 작동가능하게 연결된, 항-MUC16 결합 도메인 (c) CD28 막관통 도메인 (d) CD28 세포내 도메인의 적어도 부분 및 (e) CD3 제타 세포내 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포보다 큰 또는 보다 효과적인 세포독성 활성을 갖는, 약제학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인코딩된 TFP 분자는 T 세포에서 발현될 때 내인성 TCR 복합체, 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드, 또는 이들의 조합물과 기능적으로 상호작용하는, 약제학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 1차 T 세포인, 약제학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 인간 CD4+ T 세포인, 약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 인간 CD8+ T 세포인, 약제학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 PD-1 및 BTLA로 이루어진 군으로부터 선택되는 억제성 분자의 적어도 부분을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하며, 상기 억제성 분자의 적어도 부분은 세포내 신호전달 도메인으로부터의 양성 신호를 포함하는 제2 폴리펩티드와 회합되는, 약제학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드는 CD28, CD27, ICOS, CD3ζ, 41-BB, OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, 및 B7-H3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질로부터의 공자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는, 약제학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포에 의한 IL-2 또는 IFNγ의 생산은, 항-MUC16 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 항원을 발현하는 세포의 존재 시 TFP를 함유하지 않는 T 세포와 비교하여 증가되는, 약제학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 집단이고, 상기 집단의 개별적인 T 세포는 적어도 2개의 TFP 분자를 포함하거나, 또는 집단의 적어도 2개의 T 세포는 적어도 2개의 TFP 분자를 포괄적으로 포함하고; 상기 적어도 2개의 TFP 분자는 항-MUC16 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하며; 상기 적어도 2개의 TFP 분자 중 적어도 하나는 내인성 TCR 복합체, 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드, 또는 이들의 조합물과 기능적으로 상호작용하는, 약제학적 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 CD3 엡실론으로부터만 유래되는, 약제학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 CD3 감마로부터만 유래되는, 약제학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 CD3 델타로부터만 유래되는, 약제학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛의 TCR 세포외 도메인, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타로부터 유래되는, 약제학적 조성물.
  23. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛의 TCR 세포외 도메인, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 복합체의 단일 서브유닛으로부터 유래되며, 상기 단일 서브유닛은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타인, 약제학적 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 항-MUC16 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 항원을 발현하는 세포에 대해 TFP를 함유하지 않는 T 세포와 비교하여 증가된 세포독성을 나타내는, 약제학적 조성물.
  25. T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로 형질도입된 T 세포 집단의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 항-종양 면역원성을 제공하는 방법으로서,
    (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및
    (ii) TCR 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및
    (b) 항-MUC16 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;
    을 포함하되,
    상기 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되며,
    상기 TFP는 T 세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입되고,
    상기 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포로 치료된 포유류의 사이토킨 수준과 비교하여 보다 낮은 수준의 사이토킨이 치료에 이어 방출되는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 항체 도메인은 서열번호 15, 서열번호 20, 서열번호 25, 서열번호 30, 서열번호 35, 또는 서열번호 40에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인인, 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 세포는 자가 T 세포인, 방법.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 세포는 동종이계 T 세포인, 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류는 인간인, 방법.
  30. T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로 형질도입된 T 세포 집단의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, MUC16의 발현과 연관된 질환을 갖는 포유류를 치료하는 방법으로서,
    (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및
    (ii) TCR 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및
    (b) 항-MUC16 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;
    을 포함하되,
    상기 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되며,
    상기 TFP는 T 세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입되고,
    상기 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포로 치료된 포유류의 사이토킨 수준과 비교하여 보다 낮은 수준의 사이토킨이 치료에 이어 방출되는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 항체 도메인은 서열번호 15, 서열번호 20, 서열번호 25, 서열번호 30, 서열번호 35, 또는 서열번호 40에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인인, 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 세포는 자가 T 세포인, 방법.
  33. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 세포는 동종이계 T 세포인, 방법.
  34. 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFP의 TCR 서브유닛은 TCR 막관통 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 TCR 세포외 도메인, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타로부터 유래되는, 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛의 TCR 세포외 도메인, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 복합체의 단일 서브유닛으로부터 유래되며, 상기 단일 서브유닛은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타인, 방법.
  37. 제25항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 세포내 신호전달 도메인은 CD3 엡실론 또는 CD3 감마로부터 유래되는, 방법.
  38. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MUC16 발현과 연관된 질환은 증식성 질환, 암, 악성종양, 및 MUC16의 발현과 연관된 비-암 관련 징후로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  39. 제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은 중피종, 콩팥세포암종, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 방광암, 요관암, 신장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 흉선암종, 담관암종, 위암, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암인, 방법.
  40. 제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은 중피종, 유두상 장액성 난소 선암종(papillary serous ovarian adenocarcinoma), 투명 세포 난소암종(clear cell ovarian carcinoma), 혼합 뮐러 난소암종(mixed Mullerian ovarian carcinoma), 자궁내막양 점액성 난소암종(endometroid mucinous ovarian carcinoma), 췌장 선암종, 췌관 선암종(ductal pancreatic adenocarcinoma), 자궁 장액성암종, 폐 선암종, 간외담관암종(extrahepatic bile duct carcinoma), 위 선암종, 식도 선암종, 결장직장 선암종, 유방 선암종, MUC16 발현과 연관된 질환, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암인, 방법.
  41. 제30항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFP 분자를 발현하는 세포는 TFP 분자를 발현하는 세포의 효능을 증가시키는 제제와 조합하여 투여되는, 방법.
  42. 제25항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주어진 사이토킨의 경우, 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포로 치료된 포유류의 주어진 사이토킨의 양과 비교하여 적어도 10% 미만 양의 주어진 사이토킨이 치료에 이어 방출되는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 주어진 사이토킨은 IL-2, IFN-γ, IL-4, TNF-α, IL-6, IL-13, IL-5, IL-10, sCD137, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토킨을 포함하는, 방법.
  44. 제25항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류에서의 종양 성장은, 종양의 크기가, 치료의 적어도 8일 후, TFP를 발현하지 않는 T 세포로 치료된 포유류에서의 종양의 크기의 많아야 10%, 많아야 20%, 많아야 30%, 많아야 40%, 많아야 50%, 또는 많아야 60%이도록 억제되며, 상기 TFP를 발현하는 T 세포로 치료되는 포유류 및 TFP를 발현하지 않는 T 세포로 치료되는 포유류는 치료 전 동일한 종양 크기를 갖는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 포유류에서의 종양 성장은 완전히 억제되는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 포유류에서의 종양 성장은 적어도 20일, 적어도 30일, 적어도 40일, 적어도 50일, 적어도 60일, 적어도 70일, 적어도 80일, 적어도 90일, 적어도 100일, 또는 그 이상 동안 완전히 억제되는, 방법.
  47. 제25항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFP로 형질도입된 T 세포의 집단은 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포와 비교하여 유사한 양의 종양 세포를 사멸시키는, 방법.
  48. 제25항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFP로 형질도입된 T 세포의 집단은 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포와 상이한 유전자 발현 프로파일을 갖는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 TFP로 형질도입된 T 세포에서 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포에서의 유전자의 발현 수준과 상이한, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 유전자는 항원 제시, TCR 신호전달, 항상성, 물질대사, 케모카인 신호전달, 사이토킨 신호전달, 톨 유사 수용체 신호전달, MMP 및 접착 분자 신호전달, 또는 TNFR 관련 신호전달에서 기능을 갖는, 방법.
  51. T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로서,
    (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및
    (ii) CD3 엡실론의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및
    (b) 항-MUC16 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;
    을 포함하되,
    상기 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고,
    상기 TFP는 T-세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입하는, 재조합 핵산 분자.
  52. T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로서,
    (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및
    (ii) CD3 감마의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및
    (b) 항-MUC16 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;
    을 포함하되,
    상기 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고,
    상기 TFP는 T-세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입하는, 재조합 핵산 분자.
  53. T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로서,
    (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및
    (ii) CD3 델타의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및
    (b) 항-MUC16 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;
    을 포함하되,
    상기 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고,
    상기 TFP는 T-세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입하는, 재조합 핵산 분자.
  54. T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로서,
    (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및
    (ii) TCR 알파 쇄의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및
    (b) 항-MUC16 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;
    을 포함하되,
    상기 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고,
    상기 TFP는 T-세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입하는, 재조합 핵산 분자.
  55. T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로서,
    (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및
    (ii) TCR 베타 쇄의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및
    (b) 항-MUC16 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;
    을 포함하되,
    상기 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고,
    상기 TFP는 T-세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입하는, 재조합 핵산 분자.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 도메인은 인간 또는 인간화된 항체 도메인인, 재조합 핵산 분자.
  57. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인코딩된 항원 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인과 연결되는, 재조합 핵산 분자.
  58. 제57항에 있어서, 상기 인코딩된 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 상기 n = 1 내지 4인, 재조합 핵산 분자.
  59. 제51항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 TCR 세포외 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  60. 제51항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 TCR 막관통 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  61. 제51항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 TCR 세포내 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  62. 제51항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 (i) TCR 세포외 도메인, (ii) TCR 막관통 도메인, 및 (iii) TCR 세포내 도메인을 포함하며, 상기 (i), (ii), 및 (iii) 중 적어도 2개는 동일한 TCR 서브유닛으로부터의 것인, 재조합 핵산 분자.
  63. 제51항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 CD3 엡실론, CD3 감마 또는 CD3 델타의 세포내 신호전달 도메인으로부터 선택되는 자극 도메인, 또는 그것에 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  64. 제51항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 4-1BB의 기능성 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능성 신호전달 도메인으로부터 선택되는 자극 도메인, 또는 서열에 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  65. 제51항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 도메인은 항체 단편을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  66. 제51항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 도메인은 scFv 또는 VH 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  67. 제51항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 중쇄(HC) CDR1 서열 GRTVSSLF, GRAVSSLF, 또는 GDSLDGYV,
    (ii) HC CDR2 서열 ISRYSLYT, 또는 ISGDGSMR, 및
    (iii) HC CDR3 서열 ASKLEYTSNDYDS, 또는 AADPPTWDY을 인코딩하는, 재조합 핵산 분자.
  68. 제51항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 15, 서열번호 20, 서열번호 25, 서열번호 30, 서열번호 35, 또는 서열번호 40에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는, 재조합 핵산 분자.
  69. 제51항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFP는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 부분, 및 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는 TCR 서브유닛의 세포외 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  70. 제51항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인코딩된 TFP는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인, 및 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  71. 제51항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인코딩된 TFP는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 제타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인, 및 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  72. 제51항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 공자극 도메인을 인코딩하는 서열을 추가로 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  73. 제72항에 있어서, 상기 공자극 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 및 4-1BB(CD137)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질, 및 서열에 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로부터 수득되는 기능성 신호전달 도메인인, 재조합 핵산 분자.
  74. 제51항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열에의 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형은 세포 신호전달을 매개하는 아미노산의 변형 또는 TFP에 결합하는 리간드에 반응하여 인산화되는 아미노산의 변형을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  75. 제51항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 핵산 분자는 mRNA인, 재조합 핵산 분자.
  76. 제51항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFP는, CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, TCR 제타 쇄, Fc 엡실론 수용체 1 쇄, Fc 엡실론 수용체 2 쇄, Fc 감마 수용체 1 쇄, Fc 감마 수용체 2a 쇄, Fc 감마 수용체 2b1 쇄, Fc 감마 수용체 2b2 쇄, Fc 감마 수용체 3a 쇄, Fc 감마 수용체 3b 쇄, Fc 베타 수용체 1 쇄, TYROBP(DAP12), CD5, CD16a, CD16b, CD22, CD23, CD32, CD64, CD79a, CD79b, CD89, CD278, CD66d, 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM) 또는 이의 부분, 및 서열에 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는 TCR 서브유닛의 ITAM을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  77. 제76항에 있어서, 상기 ITAM은 CD3 감마, CD3 델타, 또는 CD3 엡실론의 ITAM을 대체하는, 재조합 핵산 분자.
  78. 제76항에 있어서, 상기 ITAM은 CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되며 CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 ITAM을 대체하는, 재조합 핵산 분자.
  79. 제51항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 유사체를 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  80. 제79항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 변형된 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 잠금 핵산(locked nucleic acid; LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1',5'-안히드로헥시톨 핵산(HNA), 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 및 2'-플루오로 N3-P5'-포스포아미다이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 핵산 분자.
  81. 제51항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 리더(leader) 서열을 추가로 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  82. 제51항 내지 제81항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자에 의해 인코딩되는 재조합 폴리펩티드 분자.
  83. 항-MUC16 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 재조합 TFP 분자.
  84. 항-MUC16 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 재조합 TFP 분자로서, 상기 TFP 분자는 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용할 수 있는, 재조합 TFP 분자.
  85. 항-MUC16 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 재조합 TFP 분자로서, 상기 TFP 분자는 내인성 TCR 복합체 내로 기능적으로 통합할 수 있는, 재조합 TFP 분자.
  86. 제83항에 있어서, 항-MUC16 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 재조합 TFP 분자.
  87. 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-MUC16 결합 도메인은 scFv, VHH 또는 VH 도메인인, 재조합 TFP 분자.
  88. 제83항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-MUC16 결합 도메인은 서열번호 15, 서열번호 20, 서열번호 25, 서열번호 30, 서열번호 35, 또는 서열번호 40의 아미노산 서열에 대해 95-100% 동일성이 있는 중쇄, 이의 기능성 단편, 또는 적어도 하나 그러나 30개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 TFP 분자.
  89. 제83항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 부분, 및 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는 TCR 세포외 도메인을 포함하는, 재조합 TFP 분자.
  90. 제83항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-MUC16 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인과 연결되는, 재조합 TFP 분자.
  91. 제90항에 있어서, 상기 링커 영역은 (G4S)n을 포함하고, 상기 n = 1 내지 4인, 재조합 TFP 분자.
  92. 제83항 내지 제91항 중 어느 한 항의 TFP를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산.
  93. 제92항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 및 RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산.
  94. 제92항 또는 제93항에 있어서, 상기 핵산은 mRNA인, 핵산.
  95. 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 유사체를 포함하는, 핵산.
  96. 제95항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 변형된 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1',5'-안히드로헥시톨 핵산(HNA), 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 및 2'-플루오로 N3-P5'-포스포아미다이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산.
  97. 제92항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터를 추가로 포함하는, 핵산.
  98. 제92항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 시험관내 전사된 핵산인, 핵산.
  99. 제92항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
  100. 제92항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 3'UTR 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
  101. 제83항 내지 제100항 중 어느 한 항의 TFP를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  102. 제101항에 있어서, 상기 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스성 벡터, 라우스 육종 바이러스성(RSV) 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  103. 제101항 또는 제102항에 있어서, 프로모터를 추가로 포함하는, 벡터.
  104. 제101항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 시험관내 전사된 벡터인, 벡터.
  105. 제101항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 내의 핵산 서열은 폴리(A) 꼬리를 추가로 포함하는, 벡터.
  106. 제101항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 내의 핵산 서열은 3'UTR을 추가로 포함하는, 벡터.
  107. 제51항 내지 제81항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 서열, 제82항의 폴리펩티드 분자, 제83항 내지 제91항 중 어느 한 항의 TFP 분자, 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항의 핵산, 제101항 내지 제106항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포.
  108. 제107항에 있어서, 상기 세포는 인간 T-세포인, 세포.
  109. 제108항에 있어서, 상기 T-세포는 CD8+ 또는 CD4+ T-세포인, 세포.
  110. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인으로부터의 양성 신호를 포함하는 제2 폴리펩티드와 회합된, 억제성 분자의 적어도 부분을 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하는 억제성 분자를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 세포.
  111. 제110항에 있어서, 상기 억제성 분자는 PD1의 적어도 부분, 및 공자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하는, 세포.
  112. 적어도 2개의 TFP 분자를 포함하는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포로서, TFP 분자는 항-MUC16 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하고, 상기 TFP 분자는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 표면 내에서, 표면에서 및/또는 표면 상에서 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용할 수 있는, 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포.
  113. i) 항-MUC16 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 TFP 분자; 및
    ii) 적어도 하나의 내인성 TCR 서브유닛 또는 내인성 TCR 복합체
    를 포함하는 단백질 복합체.
  114. 제113항에 있어서, 상기 TCR은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 부분을 포함하는, 단백질 복합체.
  115. 제113항 또는 제114항에 있어서, 상기 항-MUC16 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인과 연결되는, 단백질 복합체.
  116. 제115항에 있어서, 상기 링커 영역은 (G4S)n을 포함하고, 상기 n = 1 내지 4인, 단백질 복합체.
  117. (a) 제51항 내지 제81항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자에 의해 인코딩되는 TFP,
    및
    (b) 적어도 하나의 내인성 TCR 서브유닛 또는 내인성 TCR 복합체
    를 포함하는, 단백질 복합체.
  118. i) 항-MUC16 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 TFP 분자; 및
    ii) 적어도 하나의 내인성 TCR 서브유닛 또는 내인성 TCR 복합체
    를 포함하는 단백질 복합체.
  119. 제118항에 있어서, 상기 TCR은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 부분을 포함하는, 단백질 복합체.
  120. 제118항 또는 제119항에 있어서, 상기 항-MUC16 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인과 연결되는, 단백질 복합체.
  121. 제120항에 있어서, 상기 링커 영역은 (G4S)n을 포함하고, 상기 n = 1 내지 4인, 단백질 복합체.
  122. 제113항 내지 제121항 중 어느 한 항의 단백질 복합체 당 적어도 2개의 상이한 TFP 단백질을 포함하는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포.
  123. 제51항 내지 제81항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자에 의해 인코딩되는 적어도 2개의 상이한 TFP 분자를 포함하는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포.
  124. 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 집단으로서, 상기 집단의 T-세포는 적어도 2개의 TFP 분자를 개별적으로 또는 포괄적으로 포함하고, TFP 분자는 항-MUC16 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하며, 상기 TFP 분자는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 표면 내에서, 표면에서 및/또는 표면 상에서 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용할 수 있는, 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 집단.
  125. 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 집단으로서, 상기 집단의 T-세포는 제51항 내지 제81항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자에 의해 인코딩된 적어도 2개의 TFP 분자를 개별적으로 또는 포괄적으로 포함하는, 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 집단.
  126. 제51항 내지 제81항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항의 핵산, 또는 제101항 내지 제106항 중 어느 한 항의 벡터로 T-세포를 형질도입하는 단계를 포함하는, 세포를 만드는 방법.
  127. 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, RNA-조작된 세포의 집단을 생성하는 방법으로서, 이때 RNA가 제83항 내지 제91항 중 어느 한 항의 TFP 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 방법.
  128. 제51항 내지 제81항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 제82항의 폴리펩티드 분자, 제82항의 폴리펩티드 분자를 발현하는 세포, 제83항 내지 제91항 중 어느 한 항의 TFP 분자, 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항의 핵산, 제101항 내지 제106항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제107항 내지 제112항 및 제122항 내지 제126항 중 어느 한 항의 세포의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 항-종양 면역원성을 제공하는 방법.
  129. 제128항에 있어서, 상기 세포는 자가 T-세포인, 방법.
  130. 제128항에 있어서, 상기 세포는 동종이계 T-세포인, 방법.
  131. 제128항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류는 인간인, 방법.
  132. 제51항 내지 제81항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자, 제82항의 폴리펩티드 분자, 제82항의 폴리펩티드 분자를 발현하는 세포, 제83항 내지 제91항 중 어느 한 항의 TFP 분자, 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항의 핵산, 제101항 내지 제106항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제107항 내지 제112항 및 제122항 내지 제125항 중 어느 한 항의 세포의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, MUC16의 발현과 연관된 질환을 갖는 포유류를 치료하는 방법.
  133. 제132항에 있어서, 상기 MUC16 발현과 연관된 질환은 증식성 질환, 암, 악성종양, 골수형성이상증, 골수형성이상 증후군, 전백혈병, MUC16의 발현과 연관된 비-암 관련 징후로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  134. 제132항에 있어서, 상기 질환은 췌장암, 난소암, 유방암, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
  135. 제132항에 있어서, 상기 TFP 분자를 발현하는 세포는 TFP 분자를 발현하는 세포의 효능을 증가시키는 제제와 조합하여 투여되는, 방법.
  136. 제132항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-MUC16 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T-세포의 유효량이 투여된 포유류와 비교하여 보다 적은 사이토킨이 포유류에서 방출되는, 방법.
  137. 제132항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFP 분자를 발현하는 세포는 TFP 분자를 발현하는 세포의 투여와 연관된 하나 이상의 부작용을 개선하는 제제와 조합하여 투여되는, 방법.
  138. 제132항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFP 분자를 발현하는 세포는 MUC16과 연관된 질환을 치료하는 제제와 조합하여 투여되는, 방법.
  139. 의약으로서 사용하기 위한, 제51항 내지 제81항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 제82항의 폴리펩티드 분자, 제82항의 폴리펩티드 분자를 발현하는 세포, 제83항 내지 제91항 중 어느 한 항의 재조합 TFP, 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항의 핵산, 제101항 내지 제106항 중 어느 한 항의 벡터, 제113항 내지 제121항 중 어느 한 항의 복합체, 또는 제107항 내지 제112항 및 제122항 내지 제125항 중 어느 한 항의 세포.
  140. 제51항 내지 제81항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 제82항의 폴리펩티드 분자, 제82항의 폴리펩티드 분자를 발현하는 세포, 제83항 내지 제91항 중 어느 한 항의 재조합 TFP 분자, 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항의 핵산, 제101항 내지 제106항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제107항 내지 제112항 및 제122항 내지 제125항 중 어느 한 항의 세포의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, MUC16의 발현과 연관된 질환을 갖는 포유류를 치료하는 방법으로서, 상기 항-MUC16 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T-세포의 유효량이 투여된 포유류와 비교하여 보다 적은 사이토킨이 포유류에서 방출되는, 방법.
  141. 약제학적 조성물로서,
    (I) 인간 대상체로부터의 T 세포; 및
    (II) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하되,
    상기 T 세포는,
    (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분,
    (ii) TCR 막관통 도메인, 및
    (iii) 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는, TCR 서브유닛; 및
    (b) 항-IL13Rα2 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 도메인;을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하고,
    상기 TCR 서브유닛 및 항-IL13Rα2 결합 도메인은 작동가능하게 연결되고;
    상기 TFP는 T 세포에서 발현될 때 TCR과 기능적으로 상호작용하는, 약제학적 조성물.
  142. 제141항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛의 TCR 세포외 도메인, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론, CD3 델타, 또는 CD3 감마로부터 유래되는, 약제학적 조성물.
  143. 제141항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛의 TCR 세포외 도메인, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 복합체의 단일 서브유닛으로부터 유래되며, 상기 단일 서브유닛은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타인, 약제학적 조성물.
  144. 제141항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 항-IL13Rα2결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 항원을 발현하는 세포에 대해 TFP를 함유하지 않는 T 세포와 비교하여 증가된 세포독성을 나타내는, 약제학적 조성물.
  145. 제141항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL13Rα2 결합 도메인을 인코딩하는 서열은 링커를 인코딩하는 서열에 의해 TCR 세포외 도메인을 인코딩하는 서열과 연결되는, 약제학적 조성물.
  146. 제145항에 있어서, 상기 링커는 (G4S)n을 포함하고, 상기 G는 글라이신이고, S는 세린이며, n은 1 내지 4의 정수인, 약제학적 조성물.
  147. 제141항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL13Rα2 결합 도메인은
    (i) 중쇄(HC) CDR1 서열 GFTSDYYI 또는 GFASDDYI,
    (ii) HC CDR2 서열 ISSKYANT 또는 ISSRYANT, 및
    (iii) HC CDR3 서열 AADTRRYTCPDIATMHRNFDS 또는 AMDSRRVTCPEISTMHRNFDS
    를 포함하는, 약제학적 조성물.
  148. 제141항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL13Rα2 결합 도메인은 서열번호 51, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 66, 서열번호 71, 또는 서열번호 76의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  149. 제148항에 있어서, 상기 서열 동일성은 6의 워드 크기(word size), BLOSUM62 매트릭스, 11의 존재 페널티(existence penalty) 및 1의 연장(extension) 페널티와 함께 BLAST 알고리즘을 사용하여 결정되는, 약제학적 조성물.
  150. 제141항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 실질적으로 혈청을 무함유하는, 약제학적 조성물.
  151. 제141항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인은 scFv인, 약제학적 조성물.
  152. 제141항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인은 단일 도메인 항체인, 약제학적 조성물.
  153. 제152항에 있어서, 상기 단일 도메인 항체는 VH 도메인인, 약제학적 조성물.
  154. 제141항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인코딩된 항-IL13Rα2 결합 도메인은 항-IL13Rα2 결합 도메인을 포함하며, 상기 T 세포는 (a) (b) CD28 세포외 도메인의 적어도 부분과 작동가능하게 연결된, 항-IL13Rα2 결합 도메인 (c) CD28 막관통 도메인 (d) CD28 세포내 도메인의 적어도 부분 및 (e) CD3 제타 세포내 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포보다 큰 또는 보다 효과적인 세포독성 활성을 갖는, 약제학적 조성물.
  155. 제141항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인코딩된 TFP 분자는 T 세포에서 발현될 때 내인성 TCR 복합체, 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드, 또는 이들의 조합물과 기능적으로 상호작용하는, 약제학적 조성물.
  156. 제141항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 1차 T 세포인, 약제학적 조성물.
  157. 제141항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 인간 CD4+ T 세포인, 약제학적 조성물.
  158. 제141항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 인간 CD8+ T 세포인, 약제학적 조성물.
  159. 제141항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 PD-1 및 BTLA로 이루어진 군으로부터 선택되는 억제성 분자의 적어도 부분을 포함하는 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하며, 상기 억제성 분자의 적어도 부분은 세포내 신호전달 도메인으로부터의 양성 신호를 포함하는 제2 폴리펩티드와 회합되는, 약제학적 조성물.
  160. 제159항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드는 CD28, CD27, ICOS, CD3ζ, 41-BB, OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, 및 B7-H3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질로부터의 공자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는, 약제학적 조성물.
  161. 제141항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포에 의한 IL-2 또는 IFNγ의 생산은, 항-IL13Rα2 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 항원을 발현하는 세포의 존재 시 TFP를 함유하지 않는 T 세포와 비교하여 증가되는, 약제학적 조성물.
  162. 제141항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 집단이고, 상기 집단의 개별적인 T 세포는 적어도 2개의 TFP 분자를 포함하거나, 또는 집단의 적어도 2개의 T 세포는 적어도 2개의 TFP 분자를 포괄적으로 포함하고; 상기 적어도 2개의 TFP 분자는 항-IL13Rα2 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하며; 상기 적어도 2개의 TFP 분자 중 적어도 하나는 내인성 TCR 복합체, 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드, 또는 이들의 조합물과 기능적으로 상호작용하는, 약제학적 조성물.
  163. 제141항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 CD3 엡실론으로부터만 유래되는, 약제학적 조성물.
  164. 제141항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 CD3 감마로부터만 유래되는, 약제학적 조성물.
  165. 제141항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 CD3 델타로부터만 유래되는, 약제학적 조성물.
  166. T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로 형질도입된 T 세포 집단의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 항-종양 면역원성을 제공하는 방법으로서,
    (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및
    (ii) TCR 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및
    (b) 항-IL13Rα2 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;
    을 포함하되,
    상기 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고,
    상기 TFP는 T 세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입하며,
    상기 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포로 치료된 포유류의 사이토킨 수준과 비교하여 보다 낮은 수준의 사이토킨이 치료에 이어 방출되는, 방법.
  167. 제166항에 있어서, 상기 항체 도메인은 서열번호 51, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 66, 서열번호 71, 또는 서열번호 76에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인인, 방법.
  168. 제167항에 있어서, 상기 서열 동일성은 6의 워드 크기, BLOSUM62 매트릭스, 11의 존재 페널티 및 1의 연장 페널티와 함께 BLAST 알고리즘을 사용하여 결정되는, 방법.
  169. 제166항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 자가 T 세포인, 방법.
  170. 제166항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 동종이계 T 세포인, 방법.
  171. 제166항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류는 인간인, 방법.
  172. T 세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로 형질도입된 T 세포 집단의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, IL13Rα2의 발현과 연관된 질환을 갖는 포유류를 치료하는 방법으로서,
    (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및
    (ii) TCR 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및
    (b) 항-IL13Rα2 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;
    을 포함하되,
    상기 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고,
    상기 TFP는 T 세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입하며,
    상기 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포로 치료된 포유류의 사이토킨 수준과 비교하여 보다 낮은 수준의 사이토킨이 치료에 이어 방출되는, 방법.
  173. 제172항에 있어서, 상기 항체 도메인은 서열번호 51, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 66, 서열번호 71, 또는 서열번호 76에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VHH 도메인인, 방법.
  174. 제173항에 있어서, 상기 서열 동일성은 6의 워드 크기, BLOSUM62 매트릭스, 11의 존재 페널티 및 1의 연장 페널티와 함께 BLAST 알고리즘을 사용하여 결정되는, 방법.
  175. 제172항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 자가 T 세포인, 방법.
  176. 제172항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 동종이계 T 세포인, 방법.
  177. 제166항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, TFP의 TCR 서브유닛은 TCR 막관통 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
  178. 제177항에 있어서, 상기 TCR 세포외 도메인, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타로부터 유래되는, 방법.
  179. 제177항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛의 TCR 세포외 도메인, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 복합체의 단일 서브유닛으로부터 유래되며, 상기 단일 서브유닛은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타인, 방법.
  180. 제166항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 세포내 신호전달 도메인은 CD3 엡실론 또는 CD3 감마로부터 유래되는, 방법.
  181. 제172항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL13Rα2 발현과 연관된 질환은 증식성 질환, 암, 악성종양, 및 IL13Rα2의 발현과 연관된 비-암 관련 징후로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  182. 제172항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은 교모세포종, 중피종, 콩팥세포암종, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 방광암, 요관암, 신장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 흉선암종, 담관암종, 위암, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암인, 방법.
  183. 제172항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은 교모세포종, 중피종, 유두상 장액성 난소 선암종, 투명 세포 난소암종, 혼합 뮐러 난소암종, 자궁내막양 점액성 난소암종, 췌장 선암종, 췌관 선암종, 자궁 장액성암종, 폐 선암종, 간외담관암종, 위 선암종, 식도 선암종, 결장직장 선암종, 유방 선암종, IL13Rα2 발현과 연관된 질환, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암인, 방법.
  184. 제166항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFP 분자를 발현하는 세포는 TFP 분자를 발현하는 세포의 효능을 증가시키는 제제와 조합하여 투여되는, 방법.
  185. 제166항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주어진 사이토킨의 경우, 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포로 치료된 포유류의 주어진 사이토킨의 양과 비교하여 적어도 10% 미만 양의 주어진 사이토킨이 치료에 이어 방출되는, 방법.
  186. 제185항에 있어서, 상기 주어진 사이토킨은 IL-2, IFN-γ, IL-4, TNF-α, IL-6, IL-13, IL-5, IL-10, sCD137, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토킨을 포함하는, 방법.
  187. 제166항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류에서의 종양 성장은, 종양의 크기가, 치료의 적어도 8일 후, TFP를 발현하지 않는 T 세포로 치료된 포유류에서의 종양의 크기의 많아야 10%, 많아야 20%, 많아야 30%, 많아야 40%, 많아야 50%, 또는 많아야 60%이도록 억제되며, 상기 TFP를 발현하는 T 세포로 치료되는 포유류 및 TFP를 발현하지 않는 T 세포로 치료되는 포유류는 치료 전 동일한 종양 크기를 갖는, 방법.
  188. 제187항에 있어서, 상기 포유류에서의 종양 성장은 완전히 억제되는, 방법.
  189. 제188항에 있어서, 상기 포유류에서의 종양 성장은 적어도 20일, 적어도 30일, 적어도 40일, 적어도 50일, 적어도 60일, 적어도 70일, 적어도 80일, 적어도 90일, 적어도 100일, 또는 그 이상 동안 완전히 억제되는, 방법.
  190. 제166항 내지 제189항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFP로 형질도입된 T 세포의 집단은 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포와 비교하여 유사한 양의 종양 세포를 사멸시키는, 방법.
  191. 제166항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFP로 형질도입된 T 세포의 집단은 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포와 상이한 유전자 발현 프로파일을 갖는, 방법.
  192. 제191항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 TFP로 형질도입된 T 세포에서 동일한 항체 도메인을 포함하는 CAR-T 세포에서의 유전자의 발현 수준과 상이한, 방법.
  193. 제192항에 있어서, 상기 유전자는 항원 제시, TCR 신호전달, 항상성, 물질대사, 케모카인 신호전달, 사이토킨 신호전달, 톨 유사 수용체 신호전달, MMP 및 접착 분자 신호전달, 또는 TNFR 관련 신호전달에서 기능을 갖는, 방법.
  194. T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로서,
    (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및
    (ii) CD3 엡실론의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및
    (b) 항-IL13Rα2 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;
    을 포함하되,
    상기 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고,
    상기 TFP는 T-세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입하는, 재조합 핵산 분자.
  195. T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로서,
    (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및
    (ii) CD3 감마의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및
    (b) 항-IL13Rα2 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;
    을 포함하되,
    상기 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고,
    상기 TFP는 T-세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입하는, 재조합 핵산 분자.
  196. T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로서,
    (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및
    (ii) CD3 델타의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및
    (b) 항-IL13Rα2 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;
    을 포함하되,
    상기 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고,
    상기 TFP는 T-세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입하는, 재조합 핵산 분자.
  197. T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로서,
    (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및
    (ii) TCR 알파의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및
    (b) 항-IL13Rα2 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;
    을 포함하되,
    상기 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고,
    상기 TFP는 T-세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입하는, 재조합 핵산 분자.
  198. T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 인코딩하는 재조합 핵산 분자로서,
    (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및
    (ii) TCR 베타의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및
    (b) 항-IL13Rα2 결합 도메인을 포함하는 항체 도메인;
    을 포함하되,
    상기 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고,
    상기 TFP는 T-세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입하는, 재조합 핵산 분자.
  199. 제194항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 도메인은 인간 또는 인간화된 항체 도메인인, 재조합 핵산 분자.
  200. 제194항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인코딩된 항원 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인과 연결되는, 재조합 핵산 분자.
  201. 제200항에 있어서, 상기 인코딩된 링커 서열은 (G4S)n을 포함하며, 상기 n = 1 내지 4인, 재조합 핵산 분자.
  202. 제194항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 TCR 세포외 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  203. 제194항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 TCR 막관통 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  204. 제194항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 TCR 세포내 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  205. 제194항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 (i) TCR 세포외 도메인, (ii) TCR 막관통 도메인, 및 (iii) TCR 세포내 도메인을 포함하며, 상기 (i), (ii), 및 (iii) 중 적어도 2개는 동일한 TCR 서브유닛으로부터의 것인, 재조합 핵산 분자.
  206. 제194항 내지 제205항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 CD3 엡실론, CD3 감마 또는 CD3 델타의 세포내 신호전달 도메인으로부터 선택되는 자극 도메인, 또는 서열에 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  207. 제194항 내지 제206항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 4-1BB의 기능성 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능성 신호전달 도메인으로부터 선택되는 자극 도메인, 또는 서열에 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  208. 제194항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 도메인은 항체 단편을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  209. 제194항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 도메인은 scFv 또는 VH 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  210. 제194항 내지 제209항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 중쇄(HC) CDR1 서열 GFTSDYYI 또는 GFASDDYI,
    (ii) HC CDR2 서열 ISSKYANT 또는 ISSRYANT, 및
    (iii) HC CDR3 서열 AADTRRYTCPDIATMHRNFDS 또는 AMDSRRVTCPEISTMHRNFDS
    를 인코딩하는, 재조합 핵산 분자.
  211. 제194항 내지 제210항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 51, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 66, 서열번호 71, 또는 서열번호 76에 제시된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는, 재조합 핵산 분자.
  212. 제211항에 있어서, 상기 서열 동일성은 6의 워드 크기, BLOSUM62 매트릭스, 11의 존재 페널티 및 1의 연장 페널티와 함께 BLAST 알고리즘을 사용하여 결정되는, 재조합 핵산 분자.
  213. 제194항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFP는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 부분, 및 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는 TCR 서브유닛의 세포외 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  214. 제194항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인코딩된 TFP는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인, 및 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  215. 제194항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인코딩된 TFP는 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 제타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인, 및 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  216. 제194항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 공자극 도메인을 인코딩하는 서열을 추가로 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  217. 제216항에 있어서, 상기 공자극 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 및 4-1BB(CD137)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질, 및 서열에 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로부터 수득되는 기능성 신호전달 도메인인, 재조합 핵산 분자.
  218. 제194항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열에의 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형은 세포 신호전달을 매개하는 아미노산의 변형 또는 TFP에 결합하는 리간드에 반응하여 인산화되는 아미노산의 변형을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  219. 제194항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 핵산 분자는 mRNA인, 재조합 핵산 분자.
  220. 제194항 내지 제219항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFP는, CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, TCR 제타 쇄, Fc 엡실론 수용체 1 쇄, Fc 엡실론 수용체 2 쇄, Fc 감마 수용체 1 쇄, Fc 감마 수용체 2a 쇄, Fc 감마 수용체 2b1 쇄, Fc 감마 수용체 2b2 쇄, Fc 감마 수용체 3a 쇄, Fc 감마 수용체 3b 쇄, Fc 베타 수용체 1 쇄, TYROBP(DAP12), CD5, CD16a, CD16b, CD22, CD23, CD32, CD64, CD79a, CD79b, CD89, CD278, CD66d, 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM) 또는 이의 부분, 및 서열에 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는 TCR 서브유닛의 ITAM을 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  221. 제220항에 있어서, 상기 ITAM은 CD3 감마, CD3 델타, 또는 CD3 엡실론의 ITAM을 대체하는, 재조합 핵산 분자.
  222. 제221항에 있어서, 상기 ITAM은 CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되며 CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 ITAM을 대체하는, 재조합 핵산 분자.
  223. 제194항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 유사체를 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  224. 제223항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 변형된 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1',5'-안히드로헥시톨 핵산(HNA), 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 및 2'-플루오로 N3-P5'-포스포아미다이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 핵산 분자.
  225. 제194항 내지 제224항 중 어느 한 항에 있어서, 리더 서열을 추가로 포함하는, 재조합 핵산 분자.
  226. 제194항 내지 제225항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자에 의해 인코딩되는 재조합 폴리펩티드 분자.
  227. 항-IL13Rα2 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 재조합 TFP 분자.
  228. 항-IL13Rα2 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 재조합 TFP 분자로서, 상기 TFP 분자는 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용할 수 있는, 재조합 TFP 분자.
  229. 항-IL13Rα2 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 재조합 TFP 분자로서, 상기 TFP 분자는 내인성 TCR 복합체 내로 기능적으로 통합할 수 있는, 재조합 TFP 분자.
  230. 제227항에 있어서, 항-IL13Rα2 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 재조합 TFP 분자.
  231. 제227항 내지 제230항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL13Rα2 결합 도메인은 scFv, VHH 또는 VH 도메인인, 재조합 TFP 분자.
  232. 제227항 내지 제231항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL13Rα2 결합 도메인은 서열번호 51, 서열번호 56, 서열번호 61, 서열번호 66, 서열번호 71, 또는 서열번호 76의 아미노산 서열에 대해 95-100% 동일성이 있는 중쇄, 이의 기능성 단편, 또는 적어도 하나 그러나 30개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 TFP 분자.
  233. 제232항에 있어서, 상기 서열 동일성은 6의 워드 크기, BLOSUM62 매트릭스, 11의 존재 페널티 및 1의 연장 페널티와 함께 BLAST 알고리즘을 사용하여 결정되는, 재조합 TFP 분자.
  234. 제227항 내지 제233항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, 이들의 기능성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 부분, 및 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는 TCR 세포외 도메인을 포함하는, 재조합 TFP 분자.
  235. 제227항 내지 제234항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL13Rα2 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인과 연결되는, 재조합 TFP 분자.
  236. 제235항에 있어서, 상기 링커 영역은 (G4S)n을 포함하고, 상기 n = 1 내지 4인, 재조합 TFP 분자.
  237. 제227항 내지 제236항 중 어느 한 항의 TFP를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산.
  238. 제237항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 및 RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산.
  239. 제237항 또는 제238항에 있어서, 상기 핵산은 mRNA인, 핵산.
  240. 제237항 내지 제239항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 뉴클레오티드 유사체를 포함하는, 핵산.
  241. 제240항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 변형된 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩티드 핵산(PNA), 1',5'-안히드로헥시톨 핵산(HNA), 모르폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오티드, 티올포스포네이트 뉴클레오티드, 및 2'-플루오로 N3-P5'-포스포아미다이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산.
  242. 제237항 내지 제241항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터를 추가로 포함하는, 핵산.
  243. 제237항 내지 제242항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 시험관내 전사된 핵산인, 핵산.
  244. 제237항 내지 제243항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 폴리(A) 꼬리를 인코딩하는 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
  245. 제237항 내지 제244항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 3'UTR 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
  246. 제227항 내지 제236항 중 어느 한 항의 TFP를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  247. 제246항에 있어서, 상기 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스성 벡터, 라우스 육종 바이러스성(RSV) 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  248. 제246항 또는 제247항에 있어서, 프로모터를 추가로 포함하는, 벡터.
  249. 제246항 내지 제248항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 시험관내 전사된 벡터인, 벡터.
  250. 제246항 내지 제249항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 내의 핵산 서열은 폴리(A) 꼬리를 추가로 포함하는, 벡터.
  251. 제246항 내지 제250항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 내의 핵산 서열은 3'UTR을 추가로 포함하는, 벡터.
  252. 제194항 내지 제225항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 제226항의 폴리펩티드 분자, 제227항 내지 제236항 중 어느 한 항의 TFP 분자, 제237항 내지 제245항 중 어느 한 항의 핵산, 제246항 내지 제251항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포.
  253. 제252항에 있어서, 상기 세포는 인간 T 세포인, 세포.
  254. 제253항에 있어서, 상기 인간 T 세포는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포인, 세포.
  255. 제252항 내지 제254항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인으로부터의 양성 신호를 포함하는 제2 폴리펩티드와 회합된, 억제성 분자의 적어도 부분을 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하는 억제성 분자를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 세포.
  256. 제255항에 있어서, 상기 억제성 분자는 PD1의 적어도 부분, 및 공자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하는, 세포.
  257. 적어도 2개의 TFP 분자를 포함하는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포로서, TFP 분자는 항-IL13Rα2 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하고, 상기 TFP 분자는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 표면 내에서, 표면에서 및/또는 표면 상에서 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용할 수 있는, 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포.
  258. i) 항-IL13Rα2 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 TFP 분자; 및
    ii) 적어도 하나의 내인성 TCR 서브유닛 또는 내인성 TCR 복합체
    를 포함하는 단백질 복합체.
  259. 제258항에 있어서, 상기 TCR은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 부분을 포함하는, 단백질 복합체.
  260. 제258항 또는 제259항에 있어서, 상기 항-IL13Rα2 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인과 연결되는, 단백질 복합체.
  261. 제260항에 있어서, 상기 링커 영역은 (G4S)n을 포함하고, 상기 n = 1 내지 4인, 단백질 복합체.
  262. (a) 제194항 내지 제225항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자에 의해 인코딩되는 TFP,
    및
    (b) 적어도 하나의 내인성 TCR 서브유닛 또는 내인성 TCR 복합체
    를 포함하는, 단백질 복합체.
  263. iii) 항-IL13Rα2 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 TFP 분자; 및
    iv) 적어도 하나의 내인성 TCR 서브유닛 또는 내인성 TCR 복합체
    를 포함하는 단백질 복합체.
  264. 제263항에 있어서, 상기 TCR은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 부분을 포함하는, 단백질 복합체.
  265. 제263항 또는 제264항에 있어서, 상기 항-IL13Rα2 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인과 연결되는, 단백질 복합체.
  266. 제265항에 있어서, 상기 링커 영역은 (G4S)n을 포함하고, 상기 n = 1 내지 4인, 단백질 복합체.
  267. 제258항 내지 제266항 중 어느 한 항의 단백질 복합체 당 적어도 2개의 상이한 TFP 단백질을 포함하는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포.
  268. 제194항 내지 제225항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자에 의해 인코딩되는 적어도 2개의 상이한 TFP 분자를 포함하는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T 세포.
  269. 인간 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 집단으로서, 상기 집단의 T 세포는 적어도 2개의 TFP 분자를 개별적으로 또는 포괄적으로 포함하고, TFP 분자는 항-IL13Rα2 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하며, 상기 TFP 분자는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 표면 내에서, 표면에서 및/또는 표면 상에서 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩티드와 기능적으로 상호작용할 수 있는, 인간 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 집단.
  270. 인간 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 집단으로서, 상기 집단의 T 세포는 제194항 내지 제225항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자에 의해 인코딩되는 적어도 2개의 TFP 분자를 개별적으로 또는 포괄적으로 포함하는, 인간 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 집단.
  271. 제194항 내지 제225항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 제237항 내지 제245항 중 어느 한 항의 핵산, 또는 제246항 내지 제251항 중 어느 한 항의 벡터로 T 세포를 형질도입하는 단계를 포함하는, 세포를 만드는 방법.
  272. 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, RNA-조작된 세포의 집단을 생성하는 방법으로서, 이때 RNA가 제227항 내지 제236항 중 어느 한 항의 재조합 TFP 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 방법.
  273. 제194항 내지 제225항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 제226항의 폴리펩티드 분자, 제226항의 폴리펩티드 분자를 발현하는 세포, 제227항 내지 제236항 중 어느 한 항의 재조합 TFP 분자, 제237항 내지 제245항 중 어느 한 항의 핵산, 제246항 내지 제251항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제252항 내지 제257항 및 제267항 내지 제270항 중 어느 한 항의 세포의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 항-종양 면역원성을 제공하는 방법.
  274. 제273항에 있어서, 상기 세포는 자가 T 세포인, 방법.
  275. 제273항에 있어서, 상기 세포는 동종이계 T 세포인, 방법.
  276. 제273항 내지 제275항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류는 인간인, 방법.
  277. 제194항 내지 제225항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자, 제226항의 폴리펩티드 분자, 제226항의 폴리펩티드 분자를 발현하는 세포, 제227항 내지 제236항 중 어느 한 항의 재조합 TFP 분자, 제237항 내지 제245항 중 어느 한 항의 핵산, 제246항 내지 제251항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제252항 내지 제257항 및 제267항 내지 제270항 중 어느 한 항의 세포의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, IL13Rα2의 발현과 연관된 질환을 갖는 포유류를 치료하는 방법.
  278. 제277항에 있어서, 상기 IL13Rα2 발현과 연관된 질환은 증식성 질환, 암, 악성종양, 골수형성이상증, 골수형성이상 증후군, 전백혈병, IL13Rα2의 발현과 연관된 비-암 관련 징후로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  279. 제277항에 있어서, 상기 질환은 췌장암, 난소암, 유방암, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
  280. 제277항에 있어서, 상기 TFP 분자를 발현하는 세포는 TFP 분자를 발현하는 세포의 효능을 증가시키는 제제와 조합하여 투여되는, 방법.
  281. 제277항 내지 제280항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-IL13Rα2 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T-세포의 유효량이 투여된 포유류와 비교하여 보다 적은 사이토킨이 포유류에서 방출되는, 방법.
  282. 제277항 내지 제281항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFP 분자를 발현하는 세포는 TFP 분자를 발현하는 세포의 투여와 연관된 하나 이상의 부작용을 개선하는 제제와 조합하여 투여되는, 방법.
  283. 제277항 내지 제282항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFP 분자를 발현하는 세포는 IL13Rα2과 연관된 질환을 치료하는 제제와 조합하여 투여되는, 방법.
  284. 의약으로서 사용하기 위한, 제194항 내지 제225항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 제226항의 폴리펩티드 분자, 제226항의 폴리펩티드 분자를 발현하는 세포, 제227항 내지 제236항 중 어느 한 항의 재조합 TFP, 제237항 내지 제245항 중 어느 한 항의 핵산, 제246항 내지 제251항 중 어느 한 항의 벡터, 제258항 내지 제266항 중 어느 한 항의 복합체, 또는 제252항 내지 제257항 및 제267항 내지 제270항 중 어느 한 항의 세포.
  285. 제194항 내지 제225항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 제226항의 폴리펩티드 분자, 제226항의 폴리펩티드 분자를 발현하는 세포, 제227항 내지 제236항 중 어느 한 항의 재조합 TFP 분자, 제237항 내지 제245항 중 어느 한 항의 핵산, 제246항 내지 제251항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제252항 내지 제257항 및 제267항 내지 제270항 중 어느 한 항의 세포의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, IL13Rα2의 발현과 연관된 질환을 갖는 포유류를 치료하는 방법으로서, 상기 항-IL13Rα2 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T-세포의 유효량이 투여된 포유류와 비교하여 보다 적은 사이토킨이 포유류에서 방출되는, 방법.
  286. IL13Rα2을 발현하는 세포를 포함하는 고형 암을 갖는 포유류를 치료하는 방법으로서, 방법은 제194항 내지 제225항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 제226항의 폴리펩티드 분자, 제226항의 폴리펩티드 분자를 발현하는 세포, 제227항 내지 제236항 중 어느 한 항의 재조합 TFP 분자, 제237항 내지 제245항 중 어느 한 항의 핵산, 제246항 내지 제251항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제252항 내지 제257항 및 제267항 내지 제270항 중 어느 한 항의 세포의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 종양의 용적이 감소되거나 종양의 성장이 억제되는, 방법.
  287. T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)를 인코딩하는 재조합 핵산 분자로 형질도입된 T 세포의 집단의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서 항-종양 면역원성을 제공하는 방법으로서,
    (a) (i) TCR 세포외 도메인의 적어도 부분, 및
    (ii) 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및
    (b) 항-메소텔린 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인을 포함하되,
    상기 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동가능하게 연결되고, 상기 TFP는 T-세포에서 발현될 때 TCR 내로 혼입하며, 상기 T 세포의 집단은 보다 낮은 메소텔린 발현을 하는 종양 세포와 구획된 보다 높은 메소텔린 발현을 하는 종양 세포를 우선적으로 사멸시키는, 방법.
  288. 제287항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 TCR 막관통 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
  289. 제287항 또는 제288항에 있어서, 상기 TCR 세포외 도메인, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타로부터 유래되는, 방법.
  290. 제287항 또는 제288항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛의 TCR 세포외 도메인, TCR 막관통 도메인, 및 TCR 세포내 도메인은 TCR 복합체의 단일 서브유닛으로부터 유래되며, 상기 단일 서브유닛은 TCR 알파 쇄, TCR 베타 쇄, TCR 감마 쇄, TCR 델타 쇄, CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타인, 방법.
  291. 제287항 내지 제290항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 세포내 신호전달 도메인은 CD3 엡실론 또는 CD3 감마로부터 유래되는, 방법.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3298033B2 (en) 2015-05-18 2023-07-12 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and medical uses for tcr reprogramming using fusion proteins
EP3494138A1 (en) 2016-08-02 2019-06-12 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
DK3445787T3 (da) 2016-10-07 2021-03-01 Tcr2 Therapeutics Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til omprogrammering af t-cellereceptorer under anvendelse af fusionsproteiner
AU2017363311A1 (en) 2016-11-22 2019-06-13 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
WO2022006451A2 (en) * 2020-07-02 2022-01-06 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins and pd-1 antibodies
CN111925990B (zh) * 2020-09-02 2022-08-26 北京立康生命科技有限公司 一种针对卵巢癌的Anti-MUC16 CAR-T细胞及其制备方法
EP4263590A1 (en) 2020-12-21 2023-10-25 Allogene Therapeutics, Inc. Protease-activating cd45-gate car
WO2022165233A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Allogene Therapeutics, Inc. KNOCKDOWN OR KNOCKOUT OF ONE OR MORE OF TAP2, NLRC5, β2m, TRAC, RFX5, RFXAP AND RFXANK TO MITIGATE T CELL RECOGNITION OF ALLOGENEIC CELL PRODUCTS
WO2023133424A2 (en) * 2022-01-05 2023-07-13 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins and anti-pd-1 fusion peptides
US20240042030A1 (en) 2022-07-29 2024-02-08 Allogene Therapeutics, Inc. Engineered cells with reduced gene expression to mitigate immune cell recognition
CN117736335A (zh) * 2022-09-20 2024-03-22 深圳先进技术研究院 靶向间皮素和nkg2d配体的双靶向car-t细胞及其应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6822082B2 (en) * 2000-06-30 2004-11-23 Zymogenetics, Inc. Polynucleotides for mammalian secreted protein, Z1055G2P
WO2004041865A2 (en) * 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
ES2621874T3 (es) * 2010-03-26 2017-07-05 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Anticuerpos para MUC16 y métodos de uso de los mismos
WO2012008860A2 (en) * 2010-07-16 2012-01-19 Auckland Uniservices Limited Bacterial nitroreductase enzymes and methods relating thereto
EP3145954A1 (en) * 2014-05-23 2017-03-29 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Anti- egfr conformational single domain antibodies and uses thereof
EP3250609A4 (en) * 2015-01-26 2018-07-11 The University of Chicago Il13ra alpha 2 binding agents and use thereof in cancer treatment
EP3298033B2 (en) * 2015-05-18 2023-07-12 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and medical uses for tcr reprogramming using fusion proteins
AU2017363311A1 (en) * 2016-11-22 2019-06-13 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
US11965021B2 (en) * 2017-04-26 2024-04-23 Eureka Therapeutics, Inc. Cells expressing chimeric activating receptors and chimeric stimulating receptors and uses thereof

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