JP2021530503A - 標的特異的融合タンパク質を使用してtcrをリプログラミングするための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)、1つ以上のMUC16 TFPまたはIL13Rα2 TFPまたはMSLN TFPを発現するように操作されたT細胞、及び疾患(がんを含む)を治療するためのその使用方法が本明細書で提供される。【選択図】図2
Description
相互参照
本出願は、2018年7月26日出願の米国仮特許出願第62/703,824号、2018年8月30日出願の米国仮特許出願第62/725,066号、2018年7月26日出願の米国仮特許出願第62/703,834号、2018年9月5日出願の米国仮特許出願第62/727,469号、及び2018年9月5日出願の米国仮特許出願第62/727,459号の利益を主張し、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、2018年7月26日出願の米国仮特許出願第62/703,824号、2018年8月30日出願の米国仮特許出願第62/725,066号、2018年7月26日出願の米国仮特許出願第62/703,834号、2018年9月5日出願の米国仮特許出願第62/727,469号、及び2018年9月5日出願の米国仮特許出願第62/727,459号の利益を主張し、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
末期の固形腫瘍を有する患者のほとんどは、標準的な治療では治療不可能である。さらに、従来の治療選択肢では重篤な副作用が生じることが多い。患者の免疫系が、がん性細胞を拒絶するように仕向ける試み(まとめてがん免疫療法と称される手法)が幾度となく行われているものの、臨床効果の達成を困難にする障害がいくつか存在する。いわゆる腫瘍抗原は、その同定数が数百にも達しているが、こうした腫瘍抗原は、自己に由来するものであることが多いことから、がん免疫療法を健康な組織に向かわせ得るものであるか、または免疫原性が不十分なものである。さらに、がん細胞は、がん免疫療法による免疫攻撃の開始及び伝播から自体を不可視化するか、またはそれらに自体が対抗できるようにする機構を複数使用している。
キメラ抗原受容体(CAR)修飾自家T細胞療法(遺伝子操作されたT細胞をがん細胞上の適切な細胞表面分子へと再指向化することに依存する)を使用して得られた最近の進捗は、免疫系の力を利用してB細胞悪性腫瘍を治療する上で、得られる結果が有望なものであることを示している(例えば、Sadelain et al.,Cancer Discovery 3:388−398(2013)を参照のこと)。CD−19特異的CAR−T細胞(CTL019と呼ばれる)を用いた臨床結果では、慢性リンパ球性白血病(CLL)を患う患者ならびに小児急性リンパ芽球性白血病(ALL)を患う患者において完全寛解が得られたことが示されている(例えば、Kalos et al.,Sci Transl Med 3:95ra73(2011)、Porter et al.,NEJM 365:725−733(2011)、Grupp et al.,NEJM 368:1509−1518(2013)を参照のこと)。別の手法は、自家T細胞を遺伝子操作するために、腫瘍関連ペプチド抗原に対して選択されたT細胞受容体(TCR)のアルファ鎖及びベータ鎖を使用するものである。こうしたTCR鎖は、完全なTCR複合体を形成し、第2の規定された特異性を得るためのTCRをT細胞に与えることになる。滑膜癌患者においてNY−ESO−1特異的なTCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖を発現するように操作された自家T細胞を用いて得られた結果は有望なものであった。
CARまたは第2のTCRを発現するように遺伝子改変されたT細胞が、それぞれの標的細胞をインビトロ/エクスビボで認識及び破壊する能力を有することに加えて、操作されたT細胞を用いる治療が患者において成功するには、そうしたT細胞が、長期的に強く活性化し、増殖し、存続する能力を有し、さらには、疾患が再発性の場合は「メモリー」応答を起こすことが可能である必要がある。現在のところ、CAR−T細胞の臨床効果が高く、管理可能であるのは、BCMA陽性及びCD−19陽性のB細胞悪性腫瘍、ならびにNY−ESO−1−ペプチドを発現するHLA−A2発現滑膜肉腫患者に限られている。遺伝子操作されたT細胞を改良してさまざまなヒト悪性腫瘍に対してより広く作用するようにすることが明確に求められている。
T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)、1つ以上のTFPを発現するように操作されたT細胞、及び疾患を治療するためのその使用方法が本明細書で提供される。
一態様によれば、(I)ヒト対象に由来するT細胞と、(II)医薬的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物が本明細書で提供され、T細胞は、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子を含み、TFPは、(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、(ii)TCR膜貫通ドメイン、及び(iii)細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン、を含むTCRサブユニットと、(b)抗MUC16結合ドメイン、抗IL13Rα2結合ドメイン、または抗メソテリン(MSLN)結合ドメインを含む抗原結合ドメインを含む抗原結合ドメインと、を含み、TCRサブユニットと抗原結合ドメインとは、機能可能なように連結され、TFPは、T細胞に発現すると、TCRと機能的に相互作用する。
いくつかの実施形態では、T細胞は、TFPを含まないT細胞と比較して、抗原結合ドメインと特異的に相互作用する抗原を発現する細胞に対して、増強された細胞傷害性を示す。
いくつかの実施形態では、TCRサブユニットのTCR細胞外ドメイン、TCR膜貫通ドメイン、及びTCR細胞内ドメインは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロン、CD3ガンマ、またはCD3デルタに由来する。
いくつかの実施形態では、TCRサブユニットのTCR細胞外ドメイン、TCR膜貫通ドメイン、及びTCR細胞内ドメインは、TCR複合体の単一のサブユニットに由来し、単一のサブユニットは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロン、CD3ガンマ、またはCD3デルタである。
一態様によれば、(I)ヒト対象に由来するT細胞と、(II)医薬的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物が本明細書で提供され、T細胞は、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子を含み、TFPは、(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、(ii)膜貫通ドメイン、及び(iii)細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン、を含むTCRサブユニットと、(b)抗MUC16結合ドメイン、抗IL13Rα2結合ドメインまたは抗メソテリン(MSLN)結合ドメインを含むscFvまたは単一ドメイン抗体と、を含み、TCRサブユニットと、抗MUC16結合ドメインまたは抗IL13Rα2結合ドメインまたは抗MSLN結合ドメインとは、機能可能なように連結され、TCRサブユニットの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、TCRアルファ鎖またはTCRベータ鎖以外の1つのTCRサブユニットのみに由来し、TFPは、T細胞に発現すると、TCRと機能的に相互作用し、T細胞は、TFPを含まないT細胞と比較して、抗MUC16結合ドメインまたは抗IL13Rα2結合ドメインと特異的に相互作用する抗原を発現する細胞に対して、増強された細胞傷害性を示す。
いくつかの実施形態では、抗MUC16結合ドメインまたは抗IL13Rα2結合ドメインまたは抗MSLN結合ドメインをコードする配列は、リンカーをコードする配列によって、TCR細胞外ドメインをコードする配列に連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、(G4S)nを含み、Gは、グリシンであり、Sは、セリンであり、nは、1〜4の整数である。
いくつかの実施形態では、抗MUC16結合ドメインは、(a)重鎖(HC)CDR1配列(GRTVSSLF、GRAVSSLF、またはGDSLDGYV)と、(b)HC CDR2配列(ISRYSLYTまたはISGDGSMR)と、(c)HC CDR3配列(ASKLEYTSNDYDSまたはAADPPTWDY)と、を含む。いくつかの実施形態では、抗MUC16結合ドメインは、配列番号15、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、または配列番号40の配列との配列同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗IL13Rα2結合ドメインは、(a)重鎖(HC)CDR1配列(GFTSDYYIまたはGFASDDYI)と、(b)HC CDR2配列(ISSKYANTまたはISSRYANT)と、(c)HC CDR3配列(AADTRRYTCPDIATMHRNFDSまたはAMDSRRVTCPEISTMHRNFDS)と、を含む。いくつかの実施形態では、抗IL13Rα2結合ドメインは、配列番号51、配列番号56、配列番号61、配列番号66、配列番号71、または配列番号76の配列との配列同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である配列を含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、BLASTアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長(word size)6、BLOSUM62行列、存在ペナルティ(existence penalty)11、及び伸長ペナルティ(extension penalty)1が使用される。
いくつかの実施形態では、抗MSLN結合ドメインは、配列番号97または配列番号98の配列との配列同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である配列を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、血清を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、scFvまたは単一ドメイン抗体は、scFvである。いくつかの実施形態では、scFvまたは単一ドメイン抗体は、単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、VHドメインである。いくつかの実施形態では、コードされる抗TAA結合ドメインは、抗TAA結合ドメインを含み、(a)抗TAA結合ドメイン、(b)CD28細胞外ドメインの少なくとも一部、(c)CD28膜貫通ドメイン、(d)CD28細胞内ドメインの少なくとも一部、及び(e)CD3ゼータ細胞内ドメインを含み、抗TAA結合ドメインが、CD28細胞外ドメインの少なくとも一部に機能可能なように連結されたキメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸を含むCD8+T細胞またはCD4+T細胞と比較して、T細胞の細胞傷害活性は、高いか、またはより効率的である。いくつかの実施形態では、コードされるTFP分子は、T細胞に発現すると、内在性のTCR複合体、少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチド、またはそれらの組み合わせと機能的に相互作用する。いくつかの実施形態では、T細胞は、初代T細胞である。いくつかの実施形態では、T細胞は、ヒトCD4+T細胞である。いくつかの実施形態では、T細胞は、ヒトCD8+T細胞である。いくつかの実施形態では、T細胞は、PD−1及びBTLAからなる群から選択される抑制分子の少なくとも一部を含む第1のポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、抑制分子の少なくとも一部は、正のシグナルを生成する、細胞内シグナル伝達ドメイン由来の第2のポリペプチドと結び付けられる。いくつかの実施形態では、第2のポリペプチドは、CD28、CD27、ICOS、CD3ζ、41−BB、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、LFA−1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、及びB7−H3からなる群から選択されるタンパク質に由来する共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、T細胞によるIL−2またはIFNγの産生は、TFPを含まないT細胞と比較して、抗TAA結合ドメインと特異的に相互作用する抗原を発現する細胞の存在下で増加する。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞の集団であり、集団の個々のT細胞は、少なくとも2つのTFP分子を含むか、または集団の少なくとも2種類のT細胞は、少なくとも2つのTFP分子を集合的に含み、少なくとも2つのTFP分子は、抗TAA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、少なくとも2つのTFP分子の少なくとも1つは、内在性のTCR複合体、少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチド、またはそれらの組み合わせと機能的に相互作用する。いくつかの実施形態では、TCRサブユニットは、CD3イプシロンのみに由来する。いくつかの実施形態では、TCRサブユニットは、CD3ガンマのみに由来する。いくつかの実施形態では、TCRサブユニットは、CD3デルタのみに由来する。
一態様によれば、哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法が本明細書で提供され、この方法は、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子で形質導入されたT細胞の集団を有効量で哺乳類に投与することを含み、TFPは、(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び(ii)TCR細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン、を含むTCRサブユニットと、(b)抗TAA結合ドメインである抗原結合ドメインを含む抗体ドメインと、を含み、TCRサブユニットと抗体ドメインとは、機能可能なように連結され、TFPは、T細胞に発現するとTCRに組み込まれ、同じ抗体ドメインを含むCAR−T細胞で治療された哺乳類のサイトカインのレベルと比較して、治療後に放出されるサイトカインのレベルは低い。いくつかの実施形態では、TCR細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3イプシロンまたはCD3ガンマに由来する。いくつかの実施形態では、TCRサブユニットは、TCR膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、TCR細胞外ドメイン、TCR膜貫通ドメイン、及びTCR細胞内ドメインは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRデルタ鎖、TCRガンマ鎖、CD3イプシロン、CD3ガンマ、またはCD3デルタに由来する。いくつかの実施形態では、TCR細胞外ドメイン、TCR膜貫通ドメイン、及びTCR細胞内ドメインは、TCR複合体の単一のサブユニットに由来し、単一のサブユニットは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRデルタ鎖、TCRガンマ鎖、CD3イプシロン、CD3ガンマ、またはCD3デルタである。
いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、配列番号15、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、または配列番号40に示される配列との配列同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である抗MUC16 VHHドメインである。いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、配列番号51、配列番号56、配列番号61、配列番号66、配列番号71、または配列番号76に示される配列との配列同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である抗IL13Rα2 VHHドメインである。いくつかの実施形態では、配列同一性は、BLASTアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長6、BLOSUM62行列、存在ペナルティ11、及び伸長ペナルティ1が使用される。いくつかの実施形態では、細胞は、自家T細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系T細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類は、ヒトである。
一態様によれば、腫瘍関連抗原(TAA)(例えば、MUC16、IL13Rα2、またはMSLN)の発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法が本明細書で提供され、この方法は、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子で形質導入されたT細胞の集団を有効量で哺乳類に投与することを含み、TFPは、(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び(ii)CD3イプシロンまたはCD3ガンマの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン、を含むTCRサブユニットと、(b)抗TAA結合ドメインである抗原結合ドメインを含む抗体ドメインと、を含み、TCRサブユニットと抗体ドメインとは、機能可能なように連結され、TFPは、T細胞に発現するとTCRに組み込まれ、同じ抗体ドメインを含むCAR−T細胞で治療された哺乳類のサイトカインのレベルと比較して、治療後に放出されるサイトカインのレベルは低い。
いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、配列番号15、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、または配列番号40に示される配列との配列同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%であるVHHドメインである。いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、配列番号51、配列番号56、配列番号61、配列番号66、配列番号71、または配列番号76に示される配列との配列同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%であるVHHドメインである。いくつかの実施形態では、配列同一性は、BLASTアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長6、BLOSUM62行列、存在ペナルティ11、及び伸長ペナルティ1が使用される。いくつかの実施形態では、細胞は、自家T細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系T細胞である。いくつかの実施形態では、TAA発現と関連する疾患は、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、及びTAA(例えば、MUC16、IL13Rα2、またはMSLN)の発現と関連する非がん関連徴候からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、疾患は、神経膠芽腫、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、肝癌、膵癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿管癌、腎癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌(gastric cancer)、胸腺癌、胆管癌、胃癌(stomach cancer)、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるがんである。いくつかの実施形態では、疾患は、神経膠芽腫、中皮腫、漿液性乳頭状卵巣腺癌、卵巣明細胞癌、混合型ミュラー管卵巣癌(mixed Mullerian ovarian carcinoma)、類内膜粘液性卵巣癌(endometroid mucinous ovarian carcinoma)、膵臓腺癌、膵管腺癌、子宮体部漿液性腺癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳腺癌、MUC16の発現と関連する疾患、IL13Rα2の発現と関連する疾患、MSLNの発現と関連する疾患、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるがんである。いくつかの実施形態では、TFP分子を発現する細胞は、TFP分子を発現する細胞の有効性を高める薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、所与のサイトカインについて、同じ抗体ドメインを含むCAR−T細胞で治療された哺乳類の所与のサイトカインの量と比較して、治療後に放出される所与のサイトカインの量は少なくとも10%少ない。いくつかの実施形態では、所与のサイトカインは、IL−2、IFN−γ、IL−4、TNF−α、IL−6、IL−13、IL−5、IL−10、sCD137、GM−CSF、MIP−1α、MIP−1β、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される1つ以上のサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、哺乳類における腫瘍増殖が抑制され、その結果、TFPを発現するT細胞で治療された哺乳類と、TFPを発現しないT細胞で治療された哺乳類とが、少なくとも8日間の治療の前に同じ腫瘍サイズを有した場合、当該治療の後に、腫瘍のサイズは、TFPを発現しないT細胞で治療された哺乳類における腫瘍のサイズの最大でも10%、最大でも20%、最大でも30%、最大でも40%、最大でも50%、または最大でも60%である。いくつかの実施形態では、哺乳類における腫瘍増殖は、完全に抑制される。いくつかの実施形態では、哺乳類における腫瘍増殖は、少なくとも20日間、少なくとも30日間、少なくとも40日間、少なくとも50日間、少なくとも60日間、少なくとも70日間、少なくとも80日間、少なくとも90日間、少なくとも100日間、またはそれを超える期間、完全に抑制される。いくつかの実施形態では、TFPで形質導入されたT細胞の集団は、同じ抗体ドメインを含むCAR−T細胞と比較して同様の量の腫瘍細胞を死滅させる。いくつかの実施形態では、TFPで形質導入されたT細胞の集団は、同じ抗体ドメインを含むCAR−T細胞と比較して異なる遺伝子発現プロファイルを有する。いくつかの実施形態では、遺伝子の発現レベルは、同じ抗体ドメインを含むCAR−T細胞における遺伝子の発現レベルと比較して、TFPで形質導入されたT細胞では異なる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、抗原提示、TCRシグナル伝達、ホメオスタシス、代謝、ケモカインシグナル伝達、サイトカインシグナル伝達、toll様受容体シグナル伝達、MMP及び接着分子シグナル伝達、またはTNFR関連シグナル伝達において機能を有する。
一態様によれば、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子が本明細書で提供され、TFPは、(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び(ii)CD3イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン、を含むTCRサブユニットと、(b)抗TAA結合ドメインを含む抗体ドメインと、を含み、TCRサブユニットと抗体ドメインとは、機能可能なように連結され、TFPは、T細胞に発現するとTCRに組み込まれる。
一態様によれば、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子が本明細書で提供され、TFPは、(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び(ii)CD3ガンマの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン、を含むTCRサブユニットと、(b)抗TAA結合ドメインを含む抗体ドメインと、を含み、TCRサブユニットと抗体ドメインとは、機能可能なように連結され、TFPは、T細胞に発現するとTCRに組み込まれる。
一態様によれば、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子が本明細書で提供され、TFPは、(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び(ii)CD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン、を含むTCRサブユニットと、(b)抗TAA結合ドメインを含む抗体ドメインと、を含み、TCRサブユニットと抗体ドメインとは、機能可能なように連結され、TFPは、T細胞に発現するとTCRに組み込まれる。
一態様によれば、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子が本明細書で提供され、TFPは、(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び(ii)TCRアルファの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン、を含むTCRサブユニットと、(b)抗TAA結合ドメインを含む抗体ドメインと、を含み、TCRサブユニットと抗体ドメインとは、機能可能なように連結され、TFPは、T細胞に発現するとTCRに組み込まれる。
一態様によれば、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子が本明細書で提供され、TFPは、(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び(ii)TCRベータの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン、を含むTCRサブユニットと、(b)抗TAA結合ドメインを含む抗体ドメインと、を含み、TCRサブユニットと抗体ドメインとは、機能可能なように連結され、TFPは、T細胞に発現するとTCRに組み込まれる。
いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、ヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインである。いくつかの実施形態では、コードされる抗原結合ドメインは、リンカー配列によってTCR細胞外ドメインに連結される。いくつかの実施形態では、コードされるリンカー配列は、(G4S)n(n=1〜4)を含む。いくつかの実施形態では、TCRサブユニットは、TCR細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、TCRサブユニットは、TCR膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、TCRサブユニットは、TCR細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、TCRサブユニットは、(i)TCR細胞外ドメインと、(ii)TCR膜貫通ドメインと、(iii)TCR細胞内ドメインと、を含み、(i)、(ii)、及び(iii)のうちの少なくとも2つは、同じTCRサブユニットに由来する。いくつかの実施形態では、TCRサブユニットは、CD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれに対する少なくとも1つの改変を有するアミノ酸配列、から選択される刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、TCRサブユニットは、4−1BBの機能性シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ゼータの機能性シグナル伝達ドメイン、あるいはそれに対する少なくとも1つの改変を有するアミノ酸配列、から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、scFvまたはVHドメインを含む。
いくつかの実施形態では、組換え核酸分子は、(a)重鎖(HC)CDR1配列(GRTVSSLF、GRAVSSLF、またはGDSLDGYV)と、(b)HC CDR2配列(ISRYSLYTまたはISGDGSMR)と、(c)HC CDR3配列(ASKLEYTSNDYDSまたはAADPPTWDY)と、をコードする。いくつかの実施形態では、組換え核酸分子は、(a)重鎖(HC)CDR1配列(GFTSDYYIまたはGFASDDYI)と、(b)HC CDR2配列(ISSKYANTまたはISSRYANT)と、(c)HC CDR3配列(AADTRRYTCPDIATMHRNFDSまたはAMDSRRVTCPEISTMHRNFDS)と、をコードする。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号15、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、または配列番号40に示される配列との配列同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である重鎖可変ドメインをコードする。いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、配列番号51、配列番号56、配列番号61、配列番号66、配列番号71、または配列番号76に示される配列との配列同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%であるVHHドメインである。いくつかの実施形態では、配列同一性は、BLASTアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長6、BLOSUM62行列、存在ペナルティ11、及び伸長ペナルティ1が使用される。いくつかの実施形態では、TFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及び1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、TCRサブユニットの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、コードされるTFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及び1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、コードされるTFPは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRゼータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、その機能性断片、及び1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、組換え核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM−1、LFA−1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、及び4−1BB(CD137)、ならびにそれに対する1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能性シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、それに対する1〜20個の改変は、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の改変、またはTFPに対するリガンド結合に応じてリン酸化されるアミノ酸の改変を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、mRNAである。いくつかの実施形態では、TFPは、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、TCRゼータ鎖、Fcイプシロン受容体1鎖、Fcイプシロン受容体2鎖、Fcガンマ受容体1鎖、Fcガンマ受容体2a鎖、Fcガンマ受容体2b1鎖、Fcガンマ受容体2b2鎖、Fcガンマ受容体3a鎖、Fcガンマ受容体3b鎖、Fcベータ受容体1鎖、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、その機能性断片、及びそれに対する1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)またはその一部を含む、TCRサブユニットのITAMを含む。いくつかの実施形態では、ITAMによって、CD3ガンマ、CD3デルタ、またはCD3イプシロンのITAMが交換される。いくつかの実施形態では、ITAMは、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択され、このITAMによって、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択される異なるITAMが交換される。いくつかの実施形態では、核酸は、ヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド類似体は、2’−O−メチル修飾を受けたもの、2’−O−メトキシエチル(2’−O−MOE)修飾を受けたもの、2’−O−アミノプロピル修飾を受けたもの、2’−デオキシ修飾を受けたもの、T−デオキシ−2’−フルオロ修飾を受けたもの、2’−O−アミノプロピル(2’−O−AP)修飾を受けたもの、2’−O−ジメチルアミノエチル(2’−O−DMAOE)修飾を受けたもの、2’−O−ジメチルアミノプロピル(2’−O−DMAP)修飾を受けたもの、T−O−ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’−O−DMAEOE)修飾を受けたもの、2’−O−N−メチルアセトアミド(2’−O−NMA)修飾を受けたもの、ロックド核酸(LNA)、エチレン核酸(ENA)、ペプチド核酸(PNA)、1’,5’−アンヒドロヘキシトール核酸(HNA)、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び2’−フルオロN3−P5’−ホスホロアミダイトからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組換え核酸分子は、リーダー配列をさらに含む。
一態様によれば、本明細書に記載の組換え核酸分子によってコードされる組換えポリペプチド分子が本明細書で提供される。
一態様によれば、抗TAA結合ドメイン(例えば、MUC16結合ドメイン、IL13Ra2結合ドメイン、またはMSLN結合ドメイン)、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む組換えTFP分子が本明細書で提供される。
一態様によれば、抗TAA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む組換えTFP分子が本明細書で提供され、TFP分子は、内在性のTCR複合体及び/または少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する。
一態様によれば、抗TAA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む組換えTFP分子が本明細書で提供され、TFP分子は、内在性のTCR複合体に機能的に組み込まれる能力を有する。
いくつかの実施形態では、組換えTFP分子は、抗MUC16結合ドメイン、抗IL13Rα2結合ドメイン、または抗MSLN結合ドメインを含む抗体または抗体断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、抗TAA結合ドメインは、scFv、VHH、またはVHドメインである。
いくつかの実施形態では、抗TAA結合ドメインは、配列番号15、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、もしくは配列番号40のアミノ酸配列との同一性が95〜100%である重鎖、その機能性断片、または1〜30個の改変を有するそのアミノ酸配列、を含む。いくつかの実施形態では、抗TAA結合ドメインは、配列番号51、配列番号56、配列番号61、配列番号66、配列番号71、もしくは配列番号76のアミノ酸配列との同一性が95〜100%である重鎖、その機能性断片、または1〜30個の改変を有するそのアミノ酸配列、を含む。
いくつかの実施形態では、配列同一性は、BLASTアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長6、BLOSUM62行列、存在ペナルティ11、及び伸長ペナルティ1が使用される。
いくつかの実施形態では、組換えTFP分子は、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及び1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCR細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗TAA結合ドメインは、リンカー配列によってTCR細胞外ドメインに連結される。いくつかの実施形態では、リンカー領域は、(G4S)n(n=1〜4)を含む。
一態様によれば、TFPをコードする配列を含む核酸が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、核酸は、DNA及びRNAからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸は、mRNAである。いくつかの実施形態では、核酸は、ヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド類似体は、2’−O−メチル修飾を受けたもの、2’−O−メトキシエチル(2’−O−MOE)修飾を受けたもの、2’−O−アミノプロピル修飾を受けたもの、2’−デオキシ修飾を受けたもの、T−デオキシ−2’−フルオロ修飾を受けたもの、2’−O−アミノプロピル(2’−O−AP)修飾を受けたもの、2’−O−ジメチルアミノエチル(2’−O−DMAOE)修飾を受けたもの、2’−O−ジメチルアミノプロピル(2’−O−DMAP)修飾を受けたもの、T−O−ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’−O−DMAEOE)修飾を受けたもの、2’−O−N−メチルアセトアミド(2’−O−NMA)修飾を受けたもの、ロックド核酸(LNA)、エチレン核酸(ENA)、ペプチド核酸(PNA)、1’,5’−アンヒドロヘキシトール核酸(HNA)、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び2’−フルオロN3−P5’−ホスホロアミダイトからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸は、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸は、インビトロで転写された核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は、ポリ(A)尾部をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸は、3’UTR配列をさらに含む。
一態様によれば、TFPをコードする核酸分子を含むベクターが本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、ベクターは、DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ベクターは、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、インビトロで転写されるベクターである。いくつかの実施形態では、ベクター中の核酸配列は、ポリ(A)尾部をさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクター中の核酸配列は、3’UTRをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子を含む細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、TFP分子が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、核酸が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ベクターが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトT細胞である。いくつかの実施形態では、T細胞は、CD8+T細胞もしくはCD4+T細胞、またはCD4+CD8+T細胞である。いくつかの実施形態では、T細胞は、ガンマデルタT細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、正のシグナルを生成する、細胞内シグナル伝達ドメイン由来の第2のポリペプチドと結び付いた、抑制分子の少なくとも一部を含む第1のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、抑制分子は、PD1の少なくとも一部を含む第1のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第2のポリペプチドと、を含む。
一態様によれば、少なくとも2つのTFP分子を含むヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞が本明細書で提供され、これらのTFP分子は、抗TAA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、TFP分子は、ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞の中、特定位置、及び/または表面上の内在性のTCR複合体及び/または少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する。
一態様によれば、(a)抗TAA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子と、(b)少なくとも1つの内在性のTCRサブユニットまたは内在性のTCR複合体と、を含むタンパク質複合体が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、TCRは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。いくつかの実施形態では、抗TAA結合ドメインは、リンカー配列によってTCR細胞外ドメインに連結される。いくつかの実施形態では、リンカー領域は、(G4S)n(n=1〜4)を含む。
一態様によれば、(a)本明細書に開示の組換え核酸分子のいずれかによってコードされるTFPと、(b)少なくとも1つの内在性のTCRサブユニットまたは内在性のTCR複合体と、を含むタンパク質複合体が本明細書で提供される。
一態様によれば、(a)抗TAA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子と、(b)少なくとも1つの内在性のTCRサブユニットまたは内在性のTCR複合体と、を含むタンパク質複合体が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、TCRは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。いくつかの実施形態では、抗TAA結合ドメインは、リンカー配列によってTCR細胞外ドメインに連結される。いくつかの実施形態では、リンカー領域は、(G4S)n(n=1〜4)を含む。
一態様によれば、タンパク質複合体当たり少なくとも2つの異なるTFPタンパク質を含むヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞が本明細書で提供される。
一態様によれば、本明細書に記載の単離された核酸分子によってコードされる少なくとも2つの異なるTFP分子を含むヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞が本明細書で提供される。
一態様によれば、ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞の集団が本明細書で提供され、集団のT細胞は、少なくとも2つのTFP分子を個々または集合的に含み、これらのTFP分子は、抗TAA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、TFP分子は、ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞の中、特定位置、及び/または表面上の内在性のTCR複合体及び/または少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する。
一態様によれば、ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞の集団が本明細書で提供され、集団のT細胞は、本明細書に記載の組換え核酸分子によってコードされる少なくとも2つのTFP分子を個々または集合的に含む。
一態様によれば、細胞を調製する方法が本明細書で提供され、この方法は、本明細書に記載の組換え核酸分子、本明細書に記載の核酸、または本明細書に記載のベクターでT細胞の形質導入を行うことを含む。
一態様によれば、RNAで操作された細胞の集団を生成させる方法が本明細書で提供され、この方法は、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを細胞に導入することを含み、RNAは、本明細書に記載のTFP分子をコードする核酸を含む。
一態様によれば、哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法が本明細書で提供され、この方法は、本明細書に記載の組換え核酸分子、本明細書に記載のポリペプチド分子、本明細書に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載のTFP分子、本明細書に記載の核酸、本明細書に記載のベクター、または本明細書に記載の細胞を有効量で哺乳類に投与することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、自家T細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系T細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類は、ヒトである。
一態様によれば、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNの発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法が本明細書で提供され、この方法は、本明細書に記載の単離された核酸分子、本明細書に記載のポリペプチド分子、本明細書に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、本明細書に記載のTFP分子、本明細書に記載の核酸、本明細書に記載のベクター、または本明細書に記載の細胞を有効量で哺乳類に投与することを含む。いくつかの実施形態では、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNの発現と関連する疾患は、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、前白血病、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNの発現と関連する非がん関連徴候からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、疾患は、膵癌、卵巣癌、乳癌、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、TFP分子を発現する細胞は、TFP分子を発現する細胞の有効性を高める薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、当該哺乳類において放出されるサイトカインは、抗TAAキメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞が有効量で投与された哺乳類と比較して少ない。いくつかの実施形態では、TFP分子を発現する細胞は、TFP分子を発現する細胞の投与と関連する1つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、TFP分子を発現する細胞は、TAA(例えば、MUC16、IL13Rα2、またはMSLN)と関連する疾患を治療する薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子、ポリペプチド分子を発現する細胞、組換えTFP、核酸、ベクター、複合体、または細胞は、薬剤として使用するためのものである。
一態様によれば、薬剤として使用するための、TFPをコードする組換え核酸分子、TFPのポリペプチド分子、TFPのポリペプチド分子を発現する細胞、組換えTFP、TFPをコードする核酸、TFPをコードする核酸を含むベクター、タンパク質複合体、または細胞が本明細書で提供される。一態様によれば、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNの発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法が本明細書で提供され、この方法は、組換え核酸分子、ポリペプチド分子、ポリペプチド分子を発現する細胞、組換えTFP分子、核酸、ベクター、または細胞を有効量で哺乳類に投与することを含み、当該哺乳類において放出されるサイトカインは、抗TAAキメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞が有効量で投与された哺乳類と比較して少ない。
一態様によれば、(I)ヒト対象に由来するT細胞と、(II)医薬的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物が本明細書で提供され、T細胞は、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子を含み、TFPは、(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、(ii)TCR膜貫通ドメイン、及び(iii)細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン、を含むTCRサブユニットと、(b)抗IL13Rα2結合ドメインを含む抗原結合ドメインと、を含み、TCRサブユニットと抗IL13Rα2結合ドメインとは、機能可能なように連結され、TFPは、T細胞に発現すると、TCRと機能的に相互作用する。いくつかの実施形態では、TCRサブユニットのTCR細胞外ドメイン、TCR膜貫通ドメイン、及びTCR細胞内ドメインは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロン、CD3デルタ、またはCD3ガンマに由来する。いくつかの実施形態では、TCRサブユニットのTCR細胞外ドメイン、TCR膜貫通ドメイン、及びTCR細胞内ドメインは、TCR複合体の単一のサブユニットに由来し、単一のサブユニットは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロン、CD3ガンマ、またはCD3デルタである。いくつかの実施形態では、T細胞は、TFPを含まないT細胞と比較して、抗IL13Rα2結合ドメインと特異的に相互作用する抗原を発現する細胞に対して、増強された細胞傷害性を示す。
一態様によれば、哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法が本明細書で提供され、この方法は、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子で形質導入されたT細胞の集団を有効量で哺乳類に投与することを含み、TFPは、TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン、を含むTCRサブユニットと、抗メソテリン結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインと、を含み、TCRサブユニットと抗体ドメインとは、機能可能なように連結され、TFPは、T細胞に発現するとTCRに組み込まれ、T細胞の集団は、メソテリンを低発現する腫瘍細胞と比較して、メソテリンを高発現する腫瘍細胞を優先的に死滅させる。
いくつかの実施形態では、TCRサブユニットは、TCR膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、TCR細胞外ドメイン、TCR膜貫通ドメイン、及びTCR細胞内ドメインは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロン、CD3ガンマ、またはCD3デルタに由来する。いくつかの実施形態では、TCRサブユニットのTCR細胞外ドメイン、TCR膜貫通ドメイン、及びTCR細胞内ドメインは、TCR複合体の単一のサブユニットに由来し、単一のサブユニットは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロン、CD3ガンマ、またはCD3デルタである。いくつかの実施形態では、TCR細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3イプシロンまたはCD3ガンマに由来する。
参照による組み込み
本明細書で言及される刊行物、特許、及び特許出願はすべて、個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ、参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示される場合と同様に、参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書で言及される刊行物、特許、及び特許出願はすべて、個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ、参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示される場合と同様に、参照によって本明細書に組み込まれる。
特許ファイルまたは出願ファイルは、カラーで描かれた図面を少なくとも1つ含む。カラーの図面(複数可)を含むこの特許公開公報または特許出願公開公報のコピーは、要望及び必要経費の支払いに応じて特許庁から提供されることになる。本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に示される。例示の実施形態(本発明の原理が利用される)を示す後述の詳細な説明、及びそうした実施形態に関する添付の図面を参照することによって本発明の特徴及び利点についての理解が深まるであろう。
本明細書には、TCRサブユニット(CD3イプシロン、CD3ガンマ、及びCD3デルタを含む)と細胞表面抗原に特異的な結合ドメインとの新規の融合タンパク質、ならびにTCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖と細胞表面抗原に特異的な結合ドメインとの新規の融合タンパク質が記載されており、こうした融合タンパク質は、現存する手法の限界を克服する潜在力を有する。
本明細書には、CARと比較してより効率的に標的細胞を死滅させるが、炎症促進性サイトカインの放出レベルが同等以下である新規の融合タンパク質が記載されている。こうした融合タンパク質及びその使用方法は、CARと比較してT細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)に優位性があることを示すものであり、この優位性は、こうしたサイトカインのレベル上昇が、養子CAR−T療法に対する用量制限毒性と関連していることに起因する。
一態様では、T細胞受容体(TCR)サブユニットと、抗腫瘍関連抗原(TAA)結合ドメイン(例えば、IL13Ra2結合ドメイン、MUC16結合ドメイン、またはMSLN結合ドメイン)を含む抗体ドメインと、を含むTCR融合タンパク質(TFP)をコードする単離された核酸分子が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、ヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインである。いくつかの実施形態では、TCRサブユニットは、TCR細胞外ドメインを含む。他の実施形態では、TCRサブユニットは、TCR膜貫通ドメインを含む。さらに他の実施形態では、TCRサブユニットは、TCR細胞内ドメインを含む。別の実施形態では、TCRサブユニットは、(i)TCR細胞外ドメインと、(ii)TCR膜貫通ドメインと、(iii)TCR細胞内ドメインと、を含み、(i)、(ii)、及び(iii)のうちの少なくとも2つは、同じTCRサブユニットに由来する。さらに別の実施形態では、TCRサブユニットは、CD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれに対する少なくとも1つ、少なくとも2つ、もしくは少なくとも3つの改変を有するアミノ酸配列、から選択される刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインを含む。さらに別の実施形態では、TCRサブユニットは、4−1BBの機能性シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ゼータの機能性シグナル伝達ドメイン、あるいはそれに対する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または少なくとも3つの改変を有するアミノ酸配列、から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、(i)本明細書で提供される任意の抗TAA軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖(LC)CDR1、LC CDR2、及びLC CDR3、及び/または(ii)本明細書で提供される任意の抗TAA重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖(HC)CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3を含む。
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、本明細書で提供される任意の抗TAA重鎖抗体または抗TAA単一ドメイン抗体のHC CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3を含む。例えば、重鎖抗体または単一ドメイン抗体は、Camelidae科の動物に見られるものであり得る。Artiodactyla目Tylopoda亜目Camelidae科(ラクダ:ヒトコブのCamelus dromedaries及びフタコブのCamelus bactrianus、ラマ:Lama glama、Lama guanicoe、Lama vicugna、アルパカ:Vicugna pacos)は、その血清中に古典的な抗体に加えて特殊な型の抗体を有する。こうした抗体は、重鎖抗体(HCAb)と呼ばれており、軽鎖全体及び第1の重鎖定常領域(CH1)が存在しないという点において独特のものである。ラクダの重鎖のみの抗体(cAb)と類似の抗体は、ウォビゴン、テンジクザメ、及びスポッテッドラットフィッシュにも見られている。
いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対する1、2、もしくは3〜30個、20個、もしくは10個の改変を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列との同一性が95〜99%である配列を含む。他の実施形態では、重鎖可変領域は、本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列に対する1、2、もしくは3〜30個、20個、もしくは10個の改変を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列との同一性が95〜99%である配列を含む。
いくつかの実施形態では、TFPは、T細胞受容体のアルファ鎖もしくはベータ鎖、CD3デルタ、CD3イプシロン、もしくはCD3ガンマ、またはその機能性断片、あるいはそれに対する1、2、または3〜20個、10個、または5つの改変を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、TCRサブユニットの細胞外ドメインを含む。他の実施形態では、コードされるTFPは、TCRのアルファ鎖、TCRのベータ鎖、もしくはTCRサブユニット(CD3イプシロン、CD3ガンマ、及びCD3デルタ)、またはその機能性断片、あるいはそれに対する1、2、または3〜20個、10個、または5つの改変を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、コードされるTFPは、TCRのアルファ鎖、ベータ鎖、もしくはゼータ鎖、またはCD3イプシロン、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD45、CD2、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、及びその機能性断片からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、コードされるTFPは、自体に対する1、2、または3〜20個、10個、または5つの改変を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の膜貫通ドメインを含み、タンパク質は、TCRのアルファ鎖、ベータ鎖、もしくはゼータ鎖、またはCD3イプシロン、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD45、CD2、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、及びその機能性断片からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、コードされる抗TAA結合ドメインは、リンカー配列によってTCR細胞外ドメインに連結される。場合によっては、コードされるリンカー配列は、(G4S)n(n=1〜4)を含む。場合によっては、コードされるリンカー配列は、長鎖リンカー(LL)配列を含む。場合によっては、コードされる長鎖リンカー配列は、(G4S)n(n=2〜4)を含む。場合によっては、コードされるリンカー配列は、短鎖リンカー(SL)配列を含む。場合によっては、コードされる短鎖リンカー配列は、(G4S)n(n=1〜3)を含む。
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。場合によっては、共刺激ドメインは、DAP10、DAP12、CD30、LIGHT、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM−1、LFA−1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、及び4−1BB(CD137)、またはそれに対する1、2、もしくは3〜20個、10個、もしくは5つの改変を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能性シグナル伝達ドメインである。
いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、リーダー配列をさらに含む。
前述の核酸分子のいずれかによってコードされる単離されたポリペプチド分子もまた、本明細書で提供される。
別の態様では、抗TAA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む単離されたT細胞受容体融合タンパク質(TFP)分子もまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、単離されたTFP分子は、ヒト抗TAA結合ドメインまたはヒト化抗TAA結合ドメインを含む抗体または抗体断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗TAA結合ドメインは、ヒト結合ドメインまたはヒト化結合ドメインである。いくつかの実施形態では、抗TAA結合ドメインは、ヒト化されたものではない。いくつかの実施形態では、抗TAA結合ドメインは、ラクダ抗体またはその抗体断片を含む。
いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体ドメインは、scFv、単一ドメイン抗体(sdAb)、またはVHドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインは、抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、ヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインは、scFv、単一ドメイン抗体(sdAb)、またはVHドメインを含む。
いくつかの実施形態では、抗TAA結合ドメインは、scFv、単一ドメイン抗体(sdAb)、VHH、またはVHドメインである。他の実施形態では、抗TAA結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び重鎖、もしくはその機能性断片、または本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対する1、2、もしくは3〜30個、20個、もしくは10個の改変を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列との同一性が95〜99%である配列を含む。
いくつかの実施形態では、単離されたTFP分子は、T細胞受容体のアルファ鎖もしくはベータ鎖、CD3デルタ、CD3イプシロン、またはCD3ガンマ、あるいはそれに対する1、2、または3〜20個、10個、または5つの改変を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCR細胞外ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、抗TAA結合ドメインは、リンカー配列によってTCR細胞外ドメインに連結される。場合によっては、リンカー領域は、(G4S)n(n=1〜4)を含む。場合によっては、リンカー配列は、長鎖リンカー(LL)配列を含む。場合によっては、長鎖リンカー配列は、(G4S)n(n=2〜4)を含む。場合によっては、リンカー配列は、短鎖リンカー(SL)配列を含む。場合によっては、短鎖リンカー配列は、(G4S)n(n=1〜3)を含む。
いくつかの実施形態では、単離されたTFP分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。他の実施形態では、単離されたTFP分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列をさらに含む。さらに他の実施形態では、単離されたTFP分子は、リーダー配列をさらに含む。
前述のTFP分子のいずれかをコードする核酸分子を含むベクターもまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ベクターは、プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、インビトロで転写されるベクターである。いくつかの実施形態では、ベクター中の核酸配列は、ポリ(A)尾部をさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクター中の核酸配列は、3’UTRをさらに含む。
記載のベクターのいずれかを含む細胞もまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトT細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、CD8+T細胞またはCD4+T細胞である。他の実施形態では、細胞は、正のシグナルを生成する、細胞内シグナル伝達ドメイン由来の第2のポリペプチドと結び付いた、抑制分子の少なくとも一部を含む第1のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む。場合によっては、抑制分子は、PD1の少なくとも一部を含む第1のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第2のポリペプチドと、を含む。
別の態様では、抗TAA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたTFP分子が本明細書で提供され、TFP分子は、内在性のTCR複合体及び/または少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する。いくつかの実施形態では、抗TAA結合ドメインは、ヒト抗TAA結合ドメインまたはヒト化抗TAA結合ドメインである。
別の態様では、抗TAA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたTFP分子が本明細書で提供され、TFP分子は、内在性のTCR複合体に機能的に組み込まれる能力を有する。
別の態様では、少なくとも2つのTFP分子を含むヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞が本明細書で提供され、これらのTFP分子は、ヒト抗TAA結合ドメインまたはヒト化抗TAA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、TFP分子は、ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞の中、特定位置、及び/または表面上の内在性のTCR複合体及び/または少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する。
別の態様では、i)ヒト抗TAA結合ドメインまたはヒト化抗TAA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子と、ii)少なくとも1つの内在性のTCR複合体と、を含むタンパク質複合体が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、TCRは、T細胞受容体のアルファ鎖もしくはベータ鎖、CD3デルタ、CD3イプシロン、またはCD3ガンマからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。いくつかの実施形態では、抗TAA結合ドメインは、リンカー配列によってTCR細胞外ドメインに連結される。場合によっては、リンカー領域は、(G4S)n(n=1〜4)を含む。場合によっては、リンカー配列は、長鎖リンカー(LL)配列を含む。場合によっては、長鎖リンカー配列は、(G4S)n(n=2〜4)を含む。場合によっては、リンカー配列は、短鎖リンカー(SL)配列を含む。場合によっては、短鎖リンカー配列は、(G4S)n(n=1〜3)を含む。
記載のタンパク質複合体のいずれか当たり少なくとも2つの異なるTFPタンパク質を含むヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞もまた、本明細書で提供される。
別の態様では、ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞の集団が本明細書で提供され、集団のT細胞は、少なくとも2つのTFP分子を個々または集合的に含み、これらのTFP分子は、ヒト抗TAA結合ドメインまたはヒト化抗TAA結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、TFP分子は、ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞の中、特定位置、及び/または表面上の内在性のTCR複合体及び/または少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する。
別の態様では、ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞の集団が本明細書で提供され、集団のT細胞は、本明細書で提供される単離された核酸分子によってコードされる少なくとも2つのTFP分子を個々または集合的に含む。
別の態様では、細胞を調製する方法が本明細書で提供され、この方法は、記載のベクターのいずれかでT細胞の形質導入を行うことを含む。
別の態様では、RNAで操作された細胞の集団を生成させる方法が本明細書で提供され、この方法は、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを細胞に導入することを含み、RNAは、記載のTFP分子のいずれかをコードする核酸を含む。
別の態様では、哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法が本明細書で提供され、この方法は、記載のTFP分子のいずれかを発現する細胞を有効量で哺乳類に投与することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、自家T細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系T細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類は、ヒトである。
別の態様では、腫瘍関連抗原(TAA)(例えば、MUC16、IL13Rα2、またはMSLN)の発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法が本明細書で提供され、この方法は、記載のTFP分子のいずれかを含む細胞を有効量で哺乳類に投与することを含む。いくつかの実施形態では、TAA(例えば、MUC16、IL13Rα2、MSLN)の発現と関連する疾患は、増殖性疾患(がんもしくは悪性腫瘍または前がん性状態(膵癌、卵巣癌、胃癌、中皮腫、肺癌、または子宮内膜癌など)など)から選択されるか、あるいはTAA(例えば、MUC16、IL13Rα2、MSLN)の発現と関連する非がん関連徴候である。
いくつかの実施形態では、記載のTFP分子のいずれかを発現する細胞は、TFP分子を発現する細胞の投与と関連する1つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、記載のTFP分子のいずれかを発現する細胞は、TAA(例えば、MUC16、IL13Rα2、MSLN)と関連する疾患を治療する薬剤と組み合わせて投与される。
薬剤として使用するための、記載の単離された核酸分子のいずれか、記載の単離されたポリペプチド分子のいずれか、記載の単離されたTFPのいずれか、記載のタンパク質複合体のいずれか、記載のベクターのいずれか、または記載の細胞のいずれかも本明細書で提供される。
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
「a」及び「an」という用語は、冠詞の文法的な対象が1つまたは複数(すなわち、少なくとも1つ)であることを指す。例として、「要素(an element)」は、1つの要素または複数の要素を意味する。
本明細書で使用される「約」は、状況に加えて、当業者に知られるか、または当業者が知り得るかに応じて、±1パーセント未満もしくは±1パーセント、±2パーセント、±3パーセント、±4パーセント、±5パーセント、±6パーセント、±7パーセント、±8パーセント、±9パーセント、±10パーセント、±11パーセント、±12パーセント、±13パーセント、±14パーセント、±15パーセント、±16パーセント、±17パーセント、±18パーセント、±19パーセント、±20パーセント、±25パーセント、±30パーセント、または±30パーセント超を意味し得る。
本明細書で使用される「対象(subject)」または「対象(subjects)」または「個体」は、限定されないが、哺乳類(ヒトまたは非ヒト哺乳類(例えば、家畜化動物、農業用動物、もしくは野生動物)など)、ならびに鳥類及び水生動物を含み得る。「患者」は、疾患、障害、もしくは状態を患っているか、またはその発症リスクを有するか、あるいは本明細書で提供される組成物及び方法をその他の理由で必要とする対象である。
本明細書で使用される「治療すること」または「治療」は、疾患または状態の治療または改善が成功する任意の徴候を指す。治療することには、例えば、疾患もしくは状態の症状の1つ以上の重症度を低減、遅延、もしくは緩和させることが含まれ得るか、または疾患、異常、障害、もしくは有害な状態の症状、及び同様のものを患者が経験する頻度を低減することが含まれ得る。本明細書で使用される「治療または予防する」は、方法によって疾患または状態が何らかのレベルで治療または改善されることを指すために本明細書で使用されることがあり、その目標(限定されないが、状態の完全な予防を含む)に導かれるある一定範囲の結果を企図するものである。
本明細書で使用される「予防すること」は、患者における疾患または状態(腫瘍形成)の予防を指す。例えば、腫瘍または他の形態のがんを発症するリスクを有する個体が本発明の方法で治療され、その後にそうした腫瘍または他の形態のがんを発症しないのであれば、そうした疾患は、その個体において少なくとも一定期間にわたって予防されている。
本明細書で使用される「治療的に有効な量」は、組成物またはその活性成分が、そうした組成物が投与される個体に対して有益な作用を及ぼすか、または有害な非有益事象をその他の様式で低減する上で十分な量である。本明細書で使用される「治療的に有効な用量」は、その投与目的である1つ以上の所望の作用または望ましい作用(例えば、有益な作用)を生じさせる用量が意図され、そのような投与は、所与の期間にわたって1回以上行われる。正確な用量は、治療の目的に依存することになり、既知の手法を使用して当業者によって確かめられることになる(例えば、Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1−3,1992)、Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)、及びPickar,Dosage Calculations(1999)を参照のこと)。
本明細書で使用される「T細胞受容体(TCR)融合タンパク質」または「TFP」は、i)標的細胞上の表面抗原に結合すること、及びii)インタクトなTCR複合体の他のポリペプチド要素と相互作用すること(この相互作用は、典型的には、T細胞の中または表面上でそうした他のポリペプチド要素と共局在化するときに生じる)、が一般に可能な、さまざまなTCR構成ポリペプチド由来の組換えポリペプチドを含む。「TFP T細胞」は、本明細書に開示の方法に従って形質導入されており、TFP(例えば、天然のTCRに組み込まれるもの)を発現するT細胞である。いくつかの実施形態では、T細胞は、CD4+T細胞、CD8+T細胞、またはCD4+/CD8+T細胞である。いくつかの実施形態では、TFP T細胞は、NK細胞である。いくつかの実施形態において、
本明細書で使用される「MUC16」という用語は、ムチン16またはCA125(がん抗原125(cancer antigen 125)、がん抗原125(carcinoma antigen 125)、もしくは糖質抗原125)としても知られており、MUC16遺伝子によってコードされるヒトタンパク質を指す。MUC16は、ムチンファミリー糖タンパク質のメンバーであり、特定の型のがんまたは他の良性状態を有する患者によってはその血液中で上昇し得る腫瘍マーカーまたはバイオマーカーとしての用途が見出されているものである。MUC16は、卵巣癌を検出するためのバイオマーカーとして使用され、他のがん(子宮内膜癌、卵管癌、肺癌、乳癌、及び胃腸癌を含む)においても上昇することが明らかとなっている。MUC16は、がん細胞に対する免疫応答においてナチュラルキラー細胞の活性を抑制することも示されている(例えば、Patankar et al.,Gynecologic Oncology 99(3);704−13を参照のこと)。
本明細書で使用される「IL13Rα2」という用語は、表面抗原分類213A2(CD213A2)としても知られており、IL13Rα2遺伝子によってコードされる膜結合型ヒトタンパク質を指す。IL13Rα2は、インターロイキン13受容体複合体のサブユニットであり、IL13タンパク質の受容体である。IL13Rα2は、膵癌、卵巣癌、メラノーマ、及び悪性神経膠腫を含めて、さまざまながんにおいて過剰発現することが明らかになっている。
本明細書で使用される「MSLN」または「メソテリン」という用語は、40kDaの細胞表面グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)結合型糖タンパク質を指す。ヒトメソテリンタンパク質は、69kDの前駆体として合成され、その後、この前駆体は、タンパク質分解によるプロセシングを受ける。メソテリンの30kDのアミノ末端は分泌され、このアミノ末端は、巨核球増強因子と称される(Yamaguchi et al.,J.Biol.Chem.269:805 808,1994)。40kDのカルボキシル末端は、成熟メソテリンとして膜結合状態で残存する(Chang et al.,Natl.Acad.Sci.USA 93:136 140,1996、Scholler et al.,Cancer Lett 247(2007),130−136)。メソテリンの核酸配列及びアミノ酸配列の例は、NCBI受入番号NM_005823またはNCBI受入番号NM_013404にて見られるMSLN遺伝子転写物から特定することもできる。したがって、本明細書に開示の複合体コンストラクトが、メソテリンまたはそのエピトープに対する参照抗体との交差競合によって特徴付けられる場合、メソテリンは、Scholler et al.,Cancer Lett 247(2007),130−136に報告されているものである。
ヒト及びマウスのアミノ酸配列及び核酸配列は、公的なデータベース(GenBank、UniProt、及びSwiss−Protなど)において見つけることができる。例えば、ヒトMUC16のアミノ酸配列は、UniProt/Swiss−Prot受入番号Q8WXI7として見つけることができる。ヒトMUC16をコードするヌクレオチド配列は、受入番号NM_024690にて見つけることができる。ヒトMUC16転写物バリアントX1をコードするヌクレオチド配列は、受入番号XM_017027486にて見つけることができる。ヒトMUC16転写物バリアントX2をコードするヌクレオチド配列は、受入番号XM_017027487にて見つけることができる。ヒトMUC16転写物バリアントX3をコードするヌクレオチド配列は、受入番号XM_017027488にて見つけることができる。ヒトMUC16転写物バリアントX4をコードするヌクレオチド配列は、受入番号XM_017027489にて見つけることができる。ヒトMUC16転写物バリアントX5をコードするヌクレオチド配列は、受入番号XM_017027490にて見つけることができる。ヒトMUC16転写物バリアントX6をコードするヌクレオチド配列は、受入番号XM_017027491にて見つけることができる。ヒトMUC16転写物バリアントX7をコードするヌクレオチド配列は、受入番号XM_017027492にて見つけることができる。ヒトMUC16転写物バリアントX8をコードするヌクレオチド配列は、受入番号XM_017027493にて見つけることができる。ヒトMUC16転写物バリアントX9をコードするヌクレオチド配列は、受入番号XM_017027494にて見つけることができる。ヒトMUC16転写物バリアントX10をコードするヌクレオチド配列は、受入番号XM_017027495にて見つけることができる。ヒトMUC16転写物バリアントX11をコードするヌクレオチド配列は、受入番号XM_017027499にて見つけることができる。ヒトMUC16転写物バリアントX12をコードするヌクレオチド配列は、受入番号XM_017027500にて見つけることができる。ヒトMUC16転写物バリアントX13をコードするヌクレオチド配列は、受入番号XM_017027501にて見つけることができる。一例では、TFPの抗原結合部分は、神経膠腫細胞上、神経膠腫始原細胞上、通常もしくは悪性の中皮腫細胞上、卵巣癌細胞上、膵臓腺癌細胞上、または扁平上皮癌細胞上に発現するMUC16タンパク質の細胞外ドメイン内のエピトープを認識し、それに結合する。
ヒトIL13Rα2のアミノ酸配列は、UniProt/Swiss−Prot受入番号Q14627として見つけることができる。ヒトIL13Rα2をコードするヌクレオチド配列は、受入番号NM_000640にて見つけることができる。ヒトIL13Rα2前駆体をコードするヌクレオチド配列は、受入番号NP_000631にて見つけることができる。一例では、TFPの抗原結合部分は、神経膠腫細胞上、神経膠腫始原細胞上、通常もしくは悪性の中皮腫細胞上、卵巣癌細胞上、膵臓腺癌細胞上、または扁平上皮癌細胞上に発現するIL13Rα2タンパク質の細胞外ドメイン内のエピトープを認識し、それに結合する。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合するタンパク質を指すか、または抗原に特異的に結合する、免疫グロブリン分子由来のポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナル起源もしくはモノクローナル起源のインタクトな免疫グロブリンまたはその断片であり得、天然または組換えの供給源に由来し得る。
「抗体断片」または「抗体結合ドメイン」という用語は、抗体またはその組換えバリアントの少なくとも1つの抗原結合ドメイン含有部分を指し、こうした抗原結合ドメインは、すなわち、インタクトな抗体の抗原決定可変領域であり、抗体断片が標的(抗原及びその規定エピトープなど)を認識し、それに特異的に結合するようになる上で十分なものである。抗体断片の例としては、限定されないが、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、及びFv断片、一本鎖(sc)Fv(「scFv」)抗体断片、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体(「sdAb」と略される)(VLまたはVHのいれずれか)、ラクダVHHドメイン、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
「scFv」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片と、重鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片と、を含む融合タンパク質を指し、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とは、短い可動性ポリペプチドリンカーを介して隣接して連結され、単一のポリペプチド鎖として発現する能力を有し、scFvは、その由来元であるインタクトな抗体の特異性を保持する。
抗体に関する「重鎖可変領域」もしくは「VH」(単一ドメイン抗体(例えば、ナノボディ)の場合は「VHH」)は、フレームワーク領域として知られる隣接区間の間に介在する3つのCDRを含む重鎖断片を指し、こうしたフレームワーク領域は、一般に、CDRと比較して保存度が高く、CDRを支持する骨格を形成する。
別段の指定がない限り、本明細書で使用されるscFvは、VL可変領域及びVH可変領域をいずれかの順序(例えば、当該ポリペプチドのN末端及びC末端に関する順序)で有し得、scFvは、VL−リンカー−VHを含み得るか、またはVH−リンカー−VLを含み得る。
本発明のTFP組成物のうちで抗体またはその抗体断片を含む部分は、抗原結合ドメインが連続ポリペプチド鎖の一部として発現するさまざまな形態で存在し得、こうした形態には、例えば、単一ドメイン抗体断片(sdAb)または重鎖抗体(HCAb)、マウス抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体に由来する一本鎖抗体(scFv)が含まれる(Harlow et al.,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.、Harlow et al.,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.、Houston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883、Bird et al.,1988,Science 242:423−426)。一態様では、本開示のTFP組成物の抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。別の態様では、TFPは、scFvまたはsdAbを含む抗体断片を含む。
「抗体重鎖」という用語は、天然に生じる高次構造を有する抗体分子に存在する2つの型のポリペプチド鎖のうちの大きい方のポリペプチド鎖を指し、このポリペプチド鎖によって、抗体が属するクラスが通常は決定される。
「抗体軽鎖」という用語は、天然に生じる高次構造を有する抗体分子に存在する2つの型のポリペプチド鎖のうちの小さい方のポリペプチド鎖を指す。カッパ(「κ」)軽鎖及びラムダ(「λ」)軽鎖は、2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
「組換え抗体」という用語は、組換えDNA技術を使用して生成される抗体を指し、こうした抗体は、例えば、バクテリオファージまたは酵母による発現系によって発現する抗体などである。この用語は、抗体をコードするDNA分子(抗体タンパク質を発現する)を合成するか、または抗体を規定するアミノ酸配列を合成することによって生成されている抗体を意味するとも解釈されるべきであり、こうしたDNAまたはアミノ酸配列は、当該技術分野でよく知られる利用可能な組換えDNA技術またはアミノ酸配列技術を使用して得られている。
「抗原」または「Ag」という用語は、抗体による特異的な結合を受ける能力を有するか、またはその他の様式で免疫応答を誘発する分子を指す。この免疫応答は、抗体産生を伴うものであるか、もしくは免疫学的に能力を有する特定の細胞の活性化を伴うものであるか、またはこれら両方を伴うものであり得る。
事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の巨大分子が抗原として働き得ることを当業者なら理解するであろう。さらに、抗原は、組換えDNAまたはゲノムDNAにも由来し得る。任意のDNAが、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含んでおり、それ故に、本明細書の用語として使用される「抗原」をコードすることを当業者なら理解するであろう。さらに、抗原は、1つの遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことを当業者なら理解するであろう。複数の遺伝子の部分的なヌクレオチド配列を使用すること(このことに限定されない)を本開示が含み、こうしたヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするようにさまざまな組み合わせで配置されることは容易に理解されよう。さらに、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことも当業者なら理解するであろう。抗原は、合成で生成され得るか、もしくは生物学的試料に由来し得るか、またはポリペプチド以外の巨大分子であり得ることも容易に理解されよう。そのような生物学的試料には、限定されないが、組織試料、腫瘍試料、細胞、または他の生物学的成分を含む液体が含まれ得る。
「抗腫瘍作用」という用語は、さまざまな手段によって明らかになり得る生物学的作用を指し、こうした生物学的作用には、限定されないが、例えば、腫瘍体積の低減、腫瘍細胞数の低減、転移数の低減、平均余命の長期化、腫瘍細胞増殖の低減、腫瘍細胞生存率の低減、またはがん性状態と関連するさまざまな生理学的症状の改善が含まれる。「抗腫瘍作用」は、最初に腫瘍が発生することを予防する能力を本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、及び抗体が有することによっても明らかになり得る。
「自家」という用語は、任意の材料が、それが後に再導入される個体と同じ個体に由来するものであることを指す。
「同種異系」という用語は、任意の材料が、同じ種の異なる動物に由来するか、または当該材料が導入される個体とは異なる患者に由来するものであることを指す。2体以上の個体は、1つ以上の遺伝子座における遺伝子が同一ではない場合、互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様では、同じ種の個体に由来する同種異系材料は、抗原的に相互作用する上で遺伝子学的に十分に異なり得る。
「異種」という用語は、移植片が、異なる種の動物に由来するものであることを指す。
「がん」という用語は、異常な細胞が急速かつ無制御に増殖することによって特徴付けられる疾患を指す。がん細胞は、局所的に拡散するか、または血流及びリンパ系を介して体の他の部分に拡散し得る。本明細書には、さまざまながんの例が記載されており、こうした例としては、限定されないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、脳癌、肺癌、及び同様のものが挙げられる。
MUC16、IL13Rα2、またはMSLN「の発現と関連する疾患」という語句は、限定されないが、MUC16、IL13Rα2、もしくはMSLNの発現と関連する疾患、またはMUC16、IL13Rα2、もしくはMSLNを発現する細胞と関連する状態を含み、こうした疾患及び状態には、例えば、増殖性疾患(がんもしくは悪性腫瘍または前がん性状態など)が含まれる。一態様では、がんは、神経膠芽腫である。一態様では、がんは、中皮腫である。一態様では、がんは、膵癌である。一態様では、がんは、卵巣癌である。一態様では、がんは、脳癌である。一態様では、がんは、胃癌である。一態様では、がんは、肺癌である。一態様では、がんは、子宮内膜癌である。MUC16、IL13Rα2、またはMSLNの発現と関連する非がん関連徴候には、限定されないが、例えば、自己免疫疾患(例えば、エリテマトーデス、関節リウマチ、大腸炎)、炎症性障害(アレルギー及び喘息)、ならびに移植が挙げられる。
「保存的配列改変」という用語は、そのアミノ酸配列を含む抗体または抗体断片の結合特徴に顕著な影響または変化を与えないアミノ酸改変を指す。そのような保存的改変には、アミノ酸の置換、追加、及び欠失が含まれる。改変は、当該技術分野で知られる標準的な手法(部位特異的変異導入及びPCR介在性変異導入など)によって本発明の抗体または抗体断片に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、類似側鎖を有するアミノ酸残基によってアミノ酸残基が交換される置換である。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。こうしたファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ−分岐側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。したがって、本発明のTFPに含まれるアミノ酸残基の1つ以上を、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ酸残基によって交換することができ、改変されたTFPは、本明細書に記載の機能アッセイを使用して試験され得る。
「刺激」という用語は、刺激ドメインまたは刺激分子(例えば、TCR/CD3複合体)がその同族リガンドと結合し、それによってシグナル伝達事象(限定されないが、TCR/CD3複合体を介するシグナル伝達など)が媒介されることによって一次応答が誘導されることを指す。刺激は、ある特定の分子の発現変化、及び/または細胞骨格構造の再編成、ならびに同様のものを媒介し得る。
「刺激分子」または「刺激ドメイン」という用語は、T細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの側面について刺激性の様式でTCR複合体の一次活性化を制御する一次細胞質シグナル伝達配列(複数可)を与えるT細胞発現分子またはその一部を指す。一態様では、一次シグナルは、例えば、ペプチドが組み込まれたMHC分子とTCR/CD3複合体が結合することによって開始され、これによってT細胞応答が媒介される。こうしたT細胞応答には、限定されないが、増殖、活性化、分化、及び同様のものが含まれる。刺激性の様式で働く一次細胞質シグナル伝達配列(「一次シグナル伝達ドメイン」とも称される)は、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたは「ITAM」として知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。ITAMを含む一次細胞質シグナル伝達配列のうちで本発明において特に有用なものの例としては、限定されないが、TCRゼータに由来するもの、FcRガンマに由来するもの、FcRベータに由来するもの、CD3ガンマに由来するもの、CD3デルタに由来するもの、CD3イプシロンに由来するもの、CD5に由来するもの、CD22に由来するもの、CD79aに由来するもの、CD79bに由来するもの、CD278(「ICOS」としても知られる)に由来するもの、及びCD66dに由来するものが挙げられる。
「抗原提示細胞」または「APC」という用語は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)と複合体化した外来抗原を自体の表面上にディスプレイする免疫系細胞(アクセサリー細胞(例えば、B細胞、樹状細胞、及び同様のもの)など)を指す。T細胞は、そのT細胞受容体(TCR)を使用してこうした複合体を認識し得る。APCは、抗原のプロセシングを行い、それをT細胞に提示する。
本明細書で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、TFP含有細胞(例えば、TFP発現T細胞)の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。免疫エフェクター機能(例えば、TFP発現T細胞におけるもの)の例としては、細胞溶解活性及びヘルパーT細胞活性(サイトカインの分泌を含む)が挙げられる。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。一次細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、一次刺激または抗原依存性刺激を担う分子に由来するものが挙げられる。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、共刺激シグナルまたは抗原非依存性刺激を担う分子に由来するものが挙げられる。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ITAM(「免疫受容体チロシン活性化モチーフ」)を含み得る。ITAMを含む一次細胞質シグナル伝達配列の例としては、限定されないが、CD3ゼータに由来するもの、FcRガンマに由来するもの、FcRベータに由来するもの、CD3ガンマに由来するもの、CD3デルタに由来するもの、CD3イプシロンに由来するもの、CD5に由来するもの、CD22に由来するもの、CD79aに由来するもの、CD79bに由来するもの、CD66dに由来するもの、DAP10に由来するもの、及びDAP12に由来するものが挙げられる。
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによってT細胞による共刺激応答(限定されないが、増殖など)を媒介する、T細胞上の同族の結合パートナーを指す。共刺激分子は、抗原受容体以外の細胞表面分子、または効果的な免疫応答に必要であり得るそのリガンドである。共刺激分子には、限定されないが、MHCクラス1分子、BTLA、及びTollリガンド受容体、ならびにDAP10、DAP12、CD30、LIGHT、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM−1、LFA−1(CD11a/CD18)、及び4−1BB(CD137)が含まれる。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、下記のタンパク質ファミリーに代表され得る:TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、及びNK細胞活性化受容体。そのような分子の例としては、CD27、CD28、4−1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、リンパ球機能関連抗原−1(LFA−1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7−H3、及びCD83と特異的に結合するリガンド、ならびに同様のものが挙げられる。細胞内シグナル伝達ドメインは、その由来元である分子の細胞内部分全体もしくは天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはその機能性断片を含み得る。「4−1BB」という用語は、GenBank受入番号AAA62478.2として提供されるアミノ酸配列を有するか、または非ヒト種(例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿、及び同様のもの)に由来する同等残基を有するTNFRスーパーファミリーのメンバーを指す。「4−1BB共刺激ドメイン」は、GenBank受入番号AAA62478.2のアミノ酸残基214〜255として定義されるか、または非ヒト種(例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿、及び同様のもの)に由来する同等残基として定義されるものである。
「コードする」という用語は、ポリヌクレオチド(遺伝子、cDNA、またはmRNAなど)中の特定のヌクレオチド配列が、生物学的プロセスにおいて他のポリマー及び巨大分子(規定されたヌクレオチド配列(例えば、rRNA、tRNA、及びmRNA)または規定されたアミノ酸配列、ならびにそれから生じる生物学的特性を有するもの)を合成するためのテンプレートとして働くという固有の特性を有すること指す。したがって、遺伝子、cDNA、またはRNAは、その遺伝子に対応するmRNAの転写及び翻訳によって細胞または他の生物学的系にタンパク質が生じるのであれば、当該タンパク質をコードする。コード鎖(mRNA配列と同一のヌクレオチド配列であり、配列表にて通常は提供されるもの)及び非コード鎖(遺伝子またはcDNAを転写するためのテンプレートとして使用されるもの)は共に、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードするものと称され得る。
別段の指定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに変性したバージョンであるヌクレオチド配列、及び同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をすべて含む。タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列という語句は、当該タンパク質をコードする当該ヌクレオチド配列が、そのバージョンによっては含み得る1以上のイントロン数の範囲内で、イントロンも含み得る。
「有効量」または「治療的に有効な量」という用語は、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載の化合物、製剤、材料、または組成物が特定の生物学的結果または治療結果を達成する上で有効な量を指す。
「内在性」という用語は、任意の材料の由来元または生成元が生物、細胞、組織、または系の内部であることを指す。
「外来性」という用語は、任意の材料の導入元または生成元が生物、細胞、組織、または系の外部であることを指す。
「発現」という用語は、プロモーターによって特定のヌクレオチド配列の転写及び/または翻訳が生じることを指す。
「導入ベクター」という用語は、単離された核酸を含み、こうした単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用され得る組成物を指す。当該技術分野では多数のベクターが知られており、こうしたベクターには、限定されないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性の化合物と結び付いたポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが含まれる。したがって、「導入ベクター」という用語は、自己複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語は、細胞への核酸の導入を促進する非プラスミド化合物及び非ウイルス化合物(例えば、ポリリジン化合物、リポソーム、及び同様のものなど)もさらに含むと解釈されるべきである。ウイルス導入ベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及び同様のものが挙げられる。
「発現ベクター」という用語は、発現対象のヌクレオチド配列に機能可能なように連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシスエレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって供給され得るか、またはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターには、当該技術分野で知られるものがすべて含まれ、そうした発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドが組み込まれたコスミド、プラスミド(例えば、ネイキッドプラスミドまたはリポソームに含められたプラスミド)、ならびにウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス)が含まれる。
「レンチウイルス」という用語は、Retroviridae科の一属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することが可能であるという点においてレトロウイルスの中でも独特のものである。レンチウイルスは、かなりの量の遺伝情報を宿主細胞のDNAに送達し得るため、遺伝子送達ベクターの中で最も効率的な方法の1つである。HIV、SIV、及びFIVはすべて、レンチウイルスの例である。
「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指し、こうしたベクターには、特に、Milone et al.,Mol.Ther.17(8):1453−1464(2009)に提供される自己不活化型レンチウイルスベクターが含まれる。医療機関において使用され得るレンチウイルスベクターの他の例としては、限定されないが、例えば、Oxford BioMedicaから提供されるLENTIVECTOR(商標)遺伝子送達技術、Lentigenから提供されるLENTIMAX(商標)ベクター系、及び同様のものが挙げられる。非臨床型のレンチウイルスベクターもまた、利用可能であり、当業者には知られているであろう。
「相同」または「同一性」という用語は、2つのポリマー分子(例えば、2つの核酸分子(2つのDNA分子もしくは2つのRNA分子など)または2つのポリペプチド分子)の間のサブユニット配列同一性を指す。2つの分子の両方におけるサブユニット位置が、同じモノマーサブユニットによって占有される場合(例えば、2つのDNA分子のそれぞれにおける位置がアデニンによって占有される場合)、それらの分子は、その位置で相同または同一である。2つの配列の間の相同性は、マッチ位置または相同位置の数の直接的な関数である。例えば、2つの配列の全位置の半分(サブユニット長が10のポリマーの5つの位置)が相同である場合、これら2つの配列は50%相同であり、全位置の90%(例えば、10のうちの9)がマッチするか、または相同である場合、これら2つの配列は90%相同である。
「ヒト化」形態の非ヒト(例えば、マウス)抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列の含有率が最小限にとどまるキメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片(Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、または抗体の他の抗原結合部分配列など)である。ほとんどの場合、ヒト化抗体及びその抗体断片は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)に由来する残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)(マウス、ラット、またはウサギなど)のCDRに由来する残基によって交換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体または抗体断片)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって交換される。さらに、ヒト化抗体/抗体断片は、レシピエント抗体にも、移入されたCDR配列またはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。こうした改変は、抗体または抗体断片の能力をさらに洗練及び最適化し得るものである。一般に、ヒト化抗体またはその抗体断片は、少なくとも1つ(典型的には2つ)の可変ドメインを実質的にすべて含むことになり、こうした可変ドメインでは、CDR領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域のすべてまたはかなりの部分が、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体または抗体断片は、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部も含み得、このFcは、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものである。追加詳細については、Jones et al.,Nature,321:522−525,1986、Reichmann et al.,Nature,332:323−329,1988、Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593−596,1992を参照のこと。
「ヒト」または「完全ヒト」という用語は、免疫グロブリン(抗体または抗体断片)の分子全体が、ヒト起源であるか、またはヒト形態の抗体もしくは免疫グロブリンと同一のアミノ酸配列からなることを指す。
「単離された」という用語は、天然の状況から変更または取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離された」ことにはならないが、同じ核酸またはペプチドが、その天然の状況では共存する物質から部分的または完全に分離されているのであれば、そうした核酸またはペプチドは「単離された」ことになる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または非天然環境(例えば、宿主細胞など)に存在し得る。
本発明との関連では、一般に生じる核酸塩基に対して下記の略語が使用される。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、「U」はウリジンを指す。
「機能可能なように連結された」または「転写制御」という用語は、異種核酸配列が発現するように制御配列と異種核酸配列とが機能的に連結されていることを指す。例えば、第1の核酸配列が、第2の核酸配列との機能的関連性が得られるように配置される場合、第1の核酸配列は、第2の核酸配列と機能可能なように連結されている。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与えるのであれば、そのコード配列に機能可能なように連結されている。機能可能なように連結されたDNA配列は、互いに隣接し得、例えば2つのタンパク質コード領域が連結される必要がある場合、同じリーディングフレームに存在する。
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下(s.c.)注射、静脈内(i.v.)注射、筋肉内(i.m.)注射、もしくは胸骨内注射、腫瘍内投与、または注入手法を含む。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖形態または二本鎖形態のデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)、及びそのポリマーを指す。別段の指定がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然起源のヌクレオチドと同様の様式で代謝される既知の天然ヌクレオチド類似体を含む核酸を包含する。別段の指定がない限り、特定の核酸配列は、明示的に示される配列だけでなく、保存的に改変されたそのバリアント(例えば、縮重コドン置換体)、アレル、オルソログ、SNP、及び相補的配列も暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換体は、1つ以上の選択コドン(またはすべてのコドン)の3番目の位置が混合塩基及び/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成させることによって得ることができる(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)、Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605−2608(1985)、及びRossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91−98(1994))。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合で連結されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質配列またはペプチド配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに連結された2つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で使用されるこの用語は、短鎖(一般に、当該技術分野では、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも称される)と、長鎖(一般に、当該技術分野ではタンパク質と称される)と、の両方を指し、これらには多くの型が存在する。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、ポリペプチドの生物学的に活性な断片、ポリペプチドの実質的な相同ポリペプチド、ポリペプチドのオリゴペプチド、ポリペプチドのホモダイマー、ポリペプチドのヘテロダイマー、ポリペプチドのバリアント、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然のペプチド、組換えペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的な転写を開始し得る細胞の転写装置または導入された合成装置によって認識されるDNA配列を指す。
「プロモーター/制御配列」という用語は、遺伝子産物の発現に使用され得る核酸配列を指し、こうした遺伝子産物は、当該プロモーター/制御配列に機能可能なように連結される。場合によっては、この配列は、コアプロモーター配列であり得、他の場合では、この配列は、エンハンサー配列、及び遺伝子産物の発現に必要な他の制御エレメントも含み得る。プロモーター/制御配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現させるものであり得る。
「構成的」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードまたは特定化するポリヌクレオチドと機能可能なように連結されると、ほとんどまたはすべての生理学的細胞条件の下で遺伝子産物を細胞に産生させるヌクレオチド配列を指す。
「誘導性」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードまたは特定化するポリヌクレオチドと機能可能なように連結されると、実質的に、プロモーターに対応する誘導物質が細胞に存在するときにのみ、遺伝子産物を細胞に産生させるヌクレオチド配列を指す。
「組織特異的」プロモーターという用語は、遺伝子をコードするか、または遺伝子によって特定化されるポリヌクレオチドと機能可能なように連結されると、実質的に、細胞が、プロモーターに対応する組織型の細胞であるときにのみ、遺伝子産物を細胞に産生させるヌクレオチド配列を指す。
scFvと関連して使用される「リンカー」及び「可動性ポリペプチドリンカー」という用語は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結して一緒にするために単独または組み合わせて使用されるアミノ酸(グリシン残基及び/またはセリン残基など)からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態では、可動性ポリペプチドリンカーは、Gly/Serリンカーであり、(Gly−Gly−Gly−Ser)n(nは、1以上の正の整数である)というアミノ酸配列を含む。例えば、n=1、n=2、n=3、n=4、n=5、n=6、n=7、n=8、n=9、及びn=10。一実施形態では、可動性ポリペプチドリンカーには、限定されないが、(Gly4Ser)4または(Gly4Ser)3が含まれる。別の実施形態では、リンカーは、(Gly2Ser)、(GlySer)、または(Gly3Ser)が複数回繰り返す配列を含む。WO2012/138475(参照によって本明細書に組み込まれる)に記載のリンカーもまた、本発明の範囲に含まれる。場合によっては、リンカー配列は、長鎖リンカー(LL)配列を含む。場合によっては、長鎖リンカー配列は、(G4S)n(n=2〜4)を含む。場合によっては、リンカー配列は、短鎖リンカー(SL)配列を含む。場合によっては、短鎖リンカー配列は、(G4S)n(n=1〜3)を含む。
本明細書で使用される5’キャップ(RNAキャップ、RNA 7−メチルグアノシンキャップ、またはRNA m7Gキャップとも呼ばれる)は、転写の開始直後に真核生物メッセンジャーRNAの「先端」または5’末端に付加される修飾グアニンヌクレオチドである。5’キャップは、最初に転写されたヌクレオチドに連結された末端基からなる。5’キャップの存在は、リボソームによる認識及びRNaseからの保護に非常に重要である。キャップの付加は転写と結び付いており、かつ転写と同時に生じる結果、それぞれが互いに影響を及ぼし合う。転写の開始直後に、RNAポリメラーゼと結び付いたキャップ合成複合体が合成中のmRNAの5’末端に結合する。この酵素複合体は、mRNAキャッピングに必要となり得る化学反応を触媒する。合成は、多段階生化学反応として進行する。キャッピング部分は、修飾されることでmRNAの機能性(その安定性または翻訳効率など)を調節し得る。
本明細書で使用される「インビトロで転写されたRNA」は、インビトロで合成されたRNA、好ましくはmRNAを指す。一般に、インビトロで転写されたRNAは、インビトロ転写ベクターから生成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロで転写されたRNAの生成に使用されるテンプレートを含む。
本明細書で使用される「ポリ(A)」は、mRNAに対するポリアデニル化によって付加される一連のアデノシンである。一過性発現のためのコンストラクトの好ましい実施形態では、ポリAは、50〜5000であり、好ましくは64超であり、より好ましくは100超であり、最も好ましくは300超または400超である。ポリ(A)配列は、化学的または酵素的に修飾されることでmRNAの機能性(局在化、安定性、または翻訳効率など)を調節し得る。
本明細書で使用される「ポリアデニル化」は、ポリアデニル部分またはその修飾バリアントがメッセンジャーRNA分子へと共有結合することを指す。真核生物では、メッセンジャーRNA(mRNA)分子のほとんどが、その3’末端にポリアデニル化を受ける。3’ポリ(A)尾部は、酵素(ポリアデニル酸ポリメラーゼ)の作用によってpre−mRNAに付加されるアデニンヌクレオチド(多くの場合、数百)の長い配列である。高等真核生物では、ポリ(A)尾部は、特定の配列(ポリアデニル化シグナル)を含む転写物に付加される。ポリ(A)尾部及びそれに結合するタンパク質によって、エキソヌクレアーゼによる分解からのmRNAの保護が支援される。ポリアデニル化は、転写終結、核からのmRNAの搬出、及び翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、DNAがRNAに転写された直後に核中で生じるが、細胞質中でも後に付加的に生じ得る。転写が終結した後、RNAポリメラーゼと結び付いたエンドヌクレアーゼの作用によってmRNA鎖が切断される。切断部位は、通常、切断部位付近にAAUAAAという塩基配列が存在することによって特徴付けられる。mRNAが切断された後、切断部位の遊離3’末端にアデノシン残基が付加される。
本明細書で使用される「一過性」は、数時間、数日、または数週間という期間、導入遺伝子が組み込まれることなく発現することを指し、こうした発現期間は、遺伝子がゲノムに組み込まれるか、または宿主細胞中の安定なプラスミドレプリコン内に含まれた場合に当該遺伝子が発現する期間と比較すると短い。
「シグナル伝達経路」という用語は、細胞の一部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を担うさまざまなシグナル伝達分子の間の生化学的関係を指す。「細胞表面受容体」という語句は、シグナルを受け、細胞膜を横切ってシグナルを伝達する能力を有する分子及び分子複合体を含む。
「対象」という用語は、免疫応答を誘発し得る生体(例えば、哺乳類、ヒト)を含むことが意図される。
「実質的に精製された」細胞という用語は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞は、それが天然に生じる状況では通常は伴う他の細胞型から分離されている細胞も指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団は、均一な細胞集団を指す。他の場合では、この用語は、自体の天然の状況では天然に伴う細胞から分離されている細胞を単に指す。いくつかの態様では、細胞は、インビトロで培養される。他の態様では、細胞は、インビトロで培養されない。
本明細書で使用される「治療」という用語は、処置を意味する。治療効果は、病状の低減、抑制、寛解、または根絶によって得られる。
本明細書で使用される「予防」という用語は、疾患または病状の阻止または保護的治療を意味する。
本発明との関連では、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原」または「過剰増殖性障害と関連する抗原」は、特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。ある特定の態様では、本発明の過剰増殖性障害抗原は、がんに由来するものであり、こうしたがんには、限定されないが、原発性または転移性のメラノーマ、神経膠芽腫、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、肝癌、膵癌、腎癌、子宮内膜癌、及び胃癌が含まれる。
場合によっては、疾患は、中皮腫、神経膠芽腫、漿液性乳頭状卵巣腺癌、卵巣明細胞癌、混合型ミュラー管卵巣癌、類内膜粘液性卵巣癌、悪性胸膜疾患、膵臓腺癌、膵管腺癌、子宮体部漿液性腺癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳腺癌、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNの発現と関連する疾患、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるがんである。
「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」という用語は、外来性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」された細胞は、外来性核酸を用いるトランスフェクション、形質転換、または形質導入が行われている細胞である。こうした細胞には、初代対象細胞及びその子孫が含まれる。
「特異的に結合する」という用語は、抗体、抗体断片、または特異的リガンドが、試料に存在する同族の結合パートナー(例えば、MUC16、IL13Rα2、またはMSLN)を認識し、それに結合するが、試料における他の分子は、必然的かつ実質的に、認識しないか、またはそれには結合しないことを指す。
範囲:本開示を通じて、本開示のさまざまな態様は、範囲形式で示され得る。範囲形式の説明は、単に、簡便性を得るためのものであり、本開示の範囲を変更不可能に限定するものであると解釈すべきでないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の可能な部分範囲ならびに個々の数値をすべて具体的に開示しているものと考えられたい。例えば、ある範囲(1〜6など)の説明は、その範囲内の部分範囲(1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6など)ならびに個々の数値(例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、及び6)を具体的に開示しているものと考えられたい。別の例として、95〜99%の同一性などの範囲は、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する何かを含み、さらには、96〜99%、96〜98%、96〜97%、97〜99%、97〜98%、及び98〜99%の同一性などの部分範囲を含む。このことは、範囲の幅を問わず適用される。
説明
T細胞受容体(TCR)融合タンパク質を使用する疾患(がんなど)の治療に使用するための組成物及び方法が本明細書で提供される。本明細書で使用される「T細胞受容体(TCR)融合タンパク質」または「TFP」は、i)標的細胞上の表面抗原に結合すること、及びii)インタクトなTCR複合体の他のポリペプチド要素と相互作用すること(この相互作用は、典型的には、T細胞の中または表面上でそうした他のポリペプチド要素と共局在化するときに生じる)、が一般に可能な、さまざまなTCR構成ポリペプチド由来の組換えポリペプチドを含む。本明細書で提供されるTFPは、キメラ抗原受容体と比較して実質的な利益を提供する。「キメラ抗原受容体」または代替的に使用される「CAR」という用語は、scFvの形態の細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、以下に定義される刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン(本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される)と、を含む組換えポリペプチドを指す。一般に、CARの中心的な細胞内シグナル伝達ドメインは、TCR複合体と結び付いた状態で通常は見られるCD3ゼータ鎖に由来する。CD3ゼータシグナル伝達ドメインは、少なくとも1つの共刺激分子(4−1BB(すなわち、CD137)、CD27、及び/またはCD28など)に由来する1つ以上の機能性シグナル伝達ドメインと融合され得る。
T細胞受容体(TCR)融合タンパク質を使用する疾患(がんなど)の治療に使用するための組成物及び方法が本明細書で提供される。本明細書で使用される「T細胞受容体(TCR)融合タンパク質」または「TFP」は、i)標的細胞上の表面抗原に結合すること、及びii)インタクトなTCR複合体の他のポリペプチド要素と相互作用すること(この相互作用は、典型的には、T細胞の中または表面上でそうした他のポリペプチド要素と共局在化するときに生じる)、が一般に可能な、さまざまなTCR構成ポリペプチド由来の組換えポリペプチドを含む。本明細書で提供されるTFPは、キメラ抗原受容体と比較して実質的な利益を提供する。「キメラ抗原受容体」または代替的に使用される「CAR」という用語は、scFvの形態の細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、以下に定義される刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン(本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される)と、を含む組換えポリペプチドを指す。一般に、CARの中心的な細胞内シグナル伝達ドメインは、TCR複合体と結び付いた状態で通常は見られるCD3ゼータ鎖に由来する。CD3ゼータシグナル伝達ドメインは、少なくとも1つの共刺激分子(4−1BB(すなわち、CD137)、CD27、及び/またはCD28など)に由来する1つ以上の機能性シグナル伝達ドメインと融合され得る。
MUC16
MUC16は、管支、卵管、及び子宮の粘膜に存在する腫瘍関連抗原ポリペプチドであり、このポリペプチドは、ヒトの眼表面上皮によっても発現する。粒子及び感染性病原体に対する保護的な潤滑バリアを粘膜表面に付与し得ることがMUC16の機能の1つとして提唱されている。MUC16は、高度に多型性であり、Ser/Thr高含有N末端ドメインと、平均各156個のアミノ酸が11〜60回超、直列に繰り返す部分的に保存された反復配列を有する反復配列ドメインと、膜貫通配列及び短い細胞質尾部を含むC末端非反復配列ドメインと、からなる3のドメインから構成される。MUC16は、重度にO−グリコシル化及びN−グリコシル化され得る。MUC16遺伝子から発現するMUC16ポリペプチドをコードするmRNAは、ある特定の型のがん性のヒト卵巣腫瘍、ヒト乳房腫瘍、及びヒト膵臓腫瘍では、それぞれ対応する正常なヒト卵巣組織、ヒト乳房組織、及びヒト膵臓組織と比較して、顕著に、再現性よく、かつ検出可能なほどに過剰発現し得る。さまざまな独立した異なる型のがん性ヒト卵巣組織試料のMUC16発現の定量的な分析から、そうしたがん性試料におけるMUC16の発現レベルが可変であり得、分析された正常な卵巣組織試料の群の平均MUC16発現レベルと比較すると、顕著な数のがん性試料においてMUC16発現が少なくとも6倍(〜最大で約580倍)に増加していることが示されている。具体的には、卵巣癌型(類内膜腺癌、漿液性嚢胞腺癌(乳頭状腺癌及び明細胞腺癌を含む))では、正常な卵巣組織と比較して、検出可能かつ再現性のよいMUC16過剰発現が観測され得る。ある特定のヒト腫瘍ではMUC16が過剰発現することから、MUC16ポリペプチド及び当該ポリペプチドをコードする核酸は、さまざまな哺乳類組織試料の間で定量的及び定性的な比較を行うための標的となっている。MUC16ポリペプチドの発現プロファイル、及び当該ポリペプチドをコードする核酸の発現プロファイルは、哺乳類におけるある特定の型のがん性腫瘍の診断及び治療的処置に利用できるものである。
MUC16は、管支、卵管、及び子宮の粘膜に存在する腫瘍関連抗原ポリペプチドであり、このポリペプチドは、ヒトの眼表面上皮によっても発現する。粒子及び感染性病原体に対する保護的な潤滑バリアを粘膜表面に付与し得ることがMUC16の機能の1つとして提唱されている。MUC16は、高度に多型性であり、Ser/Thr高含有N末端ドメインと、平均各156個のアミノ酸が11〜60回超、直列に繰り返す部分的に保存された反復配列を有する反復配列ドメインと、膜貫通配列及び短い細胞質尾部を含むC末端非反復配列ドメインと、からなる3のドメインから構成される。MUC16は、重度にO−グリコシル化及びN−グリコシル化され得る。MUC16遺伝子から発現するMUC16ポリペプチドをコードするmRNAは、ある特定の型のがん性のヒト卵巣腫瘍、ヒト乳房腫瘍、及びヒト膵臓腫瘍では、それぞれ対応する正常なヒト卵巣組織、ヒト乳房組織、及びヒト膵臓組織と比較して、顕著に、再現性よく、かつ検出可能なほどに過剰発現し得る。さまざまな独立した異なる型のがん性ヒト卵巣組織試料のMUC16発現の定量的な分析から、そうしたがん性試料におけるMUC16の発現レベルが可変であり得、分析された正常な卵巣組織試料の群の平均MUC16発現レベルと比較すると、顕著な数のがん性試料においてMUC16発現が少なくとも6倍(〜最大で約580倍)に増加していることが示されている。具体的には、卵巣癌型(類内膜腺癌、漿液性嚢胞腺癌(乳頭状腺癌及び明細胞腺癌を含む))では、正常な卵巣組織と比較して、検出可能かつ再現性のよいMUC16過剰発現が観測され得る。ある特定のヒト腫瘍ではMUC16が過剰発現することから、MUC16ポリペプチド及び当該ポリペプチドをコードする核酸は、さまざまな哺乳類組織試料の間で定量的及び定性的な比較を行うための標的となっている。MUC16ポリペプチドの発現プロファイル、及び当該ポリペプチドをコードする核酸の発現プロファイルは、哺乳類におけるある特定の型のがん性腫瘍の診断及び治療的処置に利用できるものである。
CA125(がん抗原125(O772P、CA−O772P、CA−125))は、MUC16遺伝子によってコードされる細胞外切断型タンパク質であり、卵巣癌患者を監視するために日常的に使用される血清マーカーでもある。CA125は、ミュラー管分化抗原であり、この抗原は、上皮性卵巣癌細胞に過剰発現し、血液中に分泌されるものであるが、その発現は卵巣癌に完全には限局し得ない。血清中CA125レベルは、上皮性卵巣癌(EOC)患者の約80%で上昇し得るが、健康な女性でこの上昇が生じる率は1%に満たない。CA125は、ベータ−ガラクトシド結合性の細胞表面レクチンと結び付いた腫瘍細胞の細胞表面上に存在する巨大なムチン様糖タンパク質であり、こうしたレクチンは、細胞接着、アポトーシス、細胞増殖、及び腫瘍進行の制御に関与する細胞外マトリックスの構成成分であり得る。CA125の血清中濃度が高いことは、漿液性卵巣腺癌に典型的なことであり得る一方で、粘液性卵巣癌ではCA125の血清中濃度は上昇しない。CA125は、そのレベルが正常であっても腫瘍が存在する可能性を排除し得ないため、卵巣癌のスクリーニングには推奨され得ない。しかしながら、CA125を検出することは、組織学的に確認された悪性腫瘍を有する患者において臨床経過及び病状を監視する際の標準ツールとなり得る。EOC患者の進行監視においてCA125レベルが有用であることに加えて、がん血清マーカーとしてもCA125レベルが有用であることが多数の研究によって確認されている。CA125レベルは、典型的には、臨床検出の約3ヶ月前に上昇し得る。化学療法の間、血清中CA125レベルの変化は、疾患の経過と相関し得る。CA125は、新たな薬物の試験における臨床応答のサロゲートマーカーとして使用され得る。一方、CA125は、いくつかの良性状態において上昇することから、EOCの初期診断においては有用ではない可能性がある。CA125特異的抗体MAb−B43.13(オレゴボマブ、OvaRex MAb−B43.13)は、卵巣癌患者を対象とする臨床試験において免疫療法剤として試験された。
MUC16(CA−125)は、いくつかの異なる機構によって、腫瘍発生及び腫瘍増殖の進行において役割を担い得る。ナチュラルキラー細胞の応答を抑制し、それによって免疫応答からがん細胞を保護することが、MUC16が腫瘍の増殖を支援する1つの手段であり得る。MUC16の重度にグリコシル化された直列反復配列ドメインがガレクチン−1(免疫抑制タンパク質)に結合し得るという発見は、MUC16が免疫系から腫瘍細胞を保護し得るというさらなる証拠であり得る。MUC16は、腫瘍細胞の転移を可能にする細胞間相互作用に関与し得る。このことは、MUC16がメソテリン(腹膜(腹腔の内膜)の中皮細胞が通常発現する糖タンパク質)に選択的に結合し得ることを示す証拠によって裏付けられ得る。MUC16とメソテリンとの相互作用は、腫瘍細胞が腹膜に浸潤する第1のステップとなり得る。メソテリンは、中皮腫、卵巣癌、及び扁平上皮癌を含めて、いくつかの型のがんにおいても発現することが明らかになっている。メソテリンは、腫瘍細胞も発現するものであることから、MUC16と中皮との相互作用は、他の腫瘍細胞を転移位置に集め、それによって転移のサイズを大きくすることを助長し得る。MUC16の細胞質尾部の発現は、腫瘍細胞の増殖及び細胞運動性の促進を可能にし得ると共に、浸潤を促進し得ることが、証拠によって示唆されている。このことは、E−カドヘリンの発現の減少、ならびにN−カドヘリン及びビメンチンの発現の増加を引き起こすシグナル伝達を促進する能力をMUC16のC末端ドメインが有することに起因していると思われ、こうした発現減少及び発現増加は、上皮間葉転換と一致する発現パターンであり得る。MUC16は、薬物療法に対するがん細胞の感受性低減においても役割を担い得る。例えば、MUC16が過剰発現すると、遺伝毒性剤(シスプラチンなど)の作用から細胞が保護され得る。
IL13Rα2
インターロイキン−13は、正常な生理学的条件の下だけでなく、がんにおいても、免疫応答の間に免疫微小環境を制御する因子である。IL−13は、IL13Rα1及びIL13Rα2という2つの異なる受容体に結合する。ほとんどの細胞では、IL−13は、受容体IL13Rα1モノマーに低親和性で結合し、さらにIL4Raに結合することでヘテロダイマー複合体を形成し、これによってシグナル伝達兼転写活性化因子(STAT)6の経路を下流で活性化する。IL−13は、いくつかの正常細胞(精巣細胞など)においてIL13Rα2受容体に結合するだけでなく、がん細胞においてもIL13Rα2受容体に結合し、これらの結合は高い親和性を伴って生じる。
インターロイキン−13は、正常な生理学的条件の下だけでなく、がんにおいても、免疫応答の間に免疫微小環境を制御する因子である。IL−13は、IL13Rα1及びIL13Rα2という2つの異なる受容体に結合する。ほとんどの細胞では、IL−13は、受容体IL13Rα1モノマーに低親和性で結合し、さらにIL4Raに結合することでヘテロダイマー複合体を形成し、これによってシグナル伝達兼転写活性化因子(STAT)6の経路を下流で活性化する。IL−13は、いくつかの正常細胞(精巣細胞など)においてIL13Rα2受容体に結合するだけでなく、がん細胞においてもIL13Rα2受容体に結合し、これらの結合は高い親和性を伴って生じる。
Xq13.1−q28に位置するIL13Rα2遺伝子のRNA転写物は、アミノ酸数26のシグナル伝達配列と、アミノ酸数17の短い細胞内ドメインと、を含むアミノ酸数380のタンパク質をコードする。神経膠芽腫細胞では、IL13Rα2の発現によってIL−13タンパク質に対する結合部位が当該細胞当たり最大で30,000個創出される。
IL13Rα1からIL−13を隔離するデコイ受容体として働くことがIL13Rα2の提唱機能の1つである。IL13Rα2は、IL13Rα1と比較して、利用可能なIL−13とより高い親和性で結合することに加えて、より多くの結合部位を提供することで、細胞におけるIL−13の隔離が促進される。正常細胞では、IL−13がIL13Rα1に結合するとSTAT6が活性化され、活性化されたSTAT6は核に移動し、核において、N6−増殖停止特異的プロモーターを含む遺伝子(15−リポキシゲナーゼ−1など)に対する転写制御を行う。これによって、カスパーゼ−3の活性上昇を介したアポトーシスが生じ得る。したがって、IL−13を隔離することが、腫瘍細胞がアポトーシスを免れる機構となり得る。IL13Rα2の別の提唱機能は、IL13Rα1へのSTST6のドッキングをIL13Rα2が物理的に遮断することによるIL13Rα1の遮断である。STAT6のドッキングが生じないと、下流のアポトーシス活性化が妨害される。IL13Rα2は、神経膠腫細胞においてSTAT3及びB細胞リンパ腫2の上方制御も誘導する。
IL13Rα2は、神経膠腫始原細胞上に発現し、成人脳腫瘍の約58%及び小児脳腫瘍の約83%で発現する。卵巣癌及び膵癌では、IL13Rα2は、細胞外シグナル制御キナーゼ/アクチベータータンパク質1の経路を介して浸潤及び転移を促進する。免疫細胞(骨髄系由来サプレッサー細胞など)にIL13Rα2が発現しても、トランスフォーミング増殖因子βの上方制御を介して腫瘍の免疫回避及び進行が促進される。神経膠腫及び他の腫瘍モデルでは、IL13Rα2の発現が増加すると腫瘍進行が促進され得る。IL13Rα2の発現は、神経膠腫の悪性度と共に増加するため、患者生存の予後指標となり得る。IL13Rα2ポリペプチドの発現プロファイル、及び当該ポリペプチドをコードする核酸の発現プロファイルは、哺乳類におけるある特定の型のがん性腫瘍の診断及び治療的処置に利用できるものである。
T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)
本開示は、TFPをコードする組換えDNAコンストラクトを包含し、TFPは、MUC16、IL13Rα2、またはMSLN(例えば、ヒトのMUC16、IL13Rα2、またはMSLN)に特異的に結合する抗体断片を含み、抗体断片の配列は、TCRサブユニットまたはその一部をコードする核酸配列と隣接し、当該核酸配列と同じリーディングフレームに存在する。本明細書で提供されるTFPは、1つ以上の内在性のTCRサブユニット(または代替的に、1つ以上の外来性のTCRサブユニット、もしくは内在性のTCRサブユニットと外来性のTCRサブユニットとの組み合わせ)と結び付いて機能性のTCR複合体を形成することが可能である。
本開示は、TFPをコードする組換えDNAコンストラクトを包含し、TFPは、MUC16、IL13Rα2、またはMSLN(例えば、ヒトのMUC16、IL13Rα2、またはMSLN)に特異的に結合する抗体断片を含み、抗体断片の配列は、TCRサブユニットまたはその一部をコードする核酸配列と隣接し、当該核酸配列と同じリーディングフレームに存在する。本明細書で提供されるTFPは、1つ以上の内在性のTCRサブユニット(または代替的に、1つ以上の外来性のTCRサブユニット、もしくは内在性のTCRサブユニットと外来性のTCRサブユニットとの組み合わせ)と結び付いて機能性のTCR複合体を形成することが可能である。
一態様では、本開示のTFPは、標的特異的結合エレメント(抗原結合ドメインとも称される)を含む。この部分の選択は、標的細胞の表面を規定する標的抗原の型及び数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病状と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして働く標的抗原を認識するように選択され得る。したがって、本発明のTFPにおける抗原結合ドメインの標的抗原として働き得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス感染症、細菌感染症、及び寄生虫感染症と関連するもの、自己免疫疾患と関連するもの、ならびにがん性疾患(例えば、悪性疾患)と関連するものが挙げられる。
一態様では、TFP介在性のT細胞応答は、抗原結合ドメインをTFPに操作導入してTFPが所望の抗原に特異的に結合するようにすることによって目的抗原へと指向化され得る。
一態様では、TFPのうちで抗原結合ドメインを含む部分は、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNを標的とする抗原結合ドメインを含む。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒトのMUC16、IL13Rα2、またはMSLNを標的とする。
抗原結合ドメインは、抗原に結合する任意のドメインであり得、こうしたドメインには、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及びその機能性断片(限定されないが、単一ドメイン抗体(重鎖可変ドメイン(VH)、軽鎖可変ドメイン(VL)、及びラクダ由来のナノボディの可変ドメイン(VHH)など)を含む)、ならびに抗原結合ドメインとして機能することが当該技術分野で知られる代替骨格(組換えフィブロネクチンドメイン、anticalin、DARPIN、及び同様のものなど)が含まれる。同様に、標的抗原を特異的に認識し、それに結合する天然リガンドまたは合成リガンドが、TFPのための抗原結合ドメインとして使用され得る。場合によっては、抗原結合ドメインの由来元が、TFPが最終的に使用されることになる種と同じ種であることが有益である。例えば、ヒトにおける使用については、TFPの抗原結合ドメインが、抗体または抗体断片の抗原結合ドメインのためのヒト残基またはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
したがって、一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化された抗体もしくは抗体断片、またはヒトの抗体もしくは抗体断片、あるいはラクダの抗体もしくは抗体断片、あるいはマウスの抗体もしくは抗体断片を含む。一実施形態では、ヒト化抗TAA結合ドメインまたはヒト抗TAA結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化抗TAA結合ドメインもしくはヒト抗TAA結合ドメインの軽鎖相補性決定領域1(LC CDR1)、軽鎖相補性決定領域2(LC CDR2)、及び軽鎖相補性決定領域3(LC CDR3)の1つ以上(例えば、3つすべて)、及び/または本明細書に記載のヒト化抗TAA結合ドメインもしくはヒト抗TAA結合ドメインの重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)、及び重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)の1つ以上(例えば、3つすべて)を含み、例えば、ヒト化抗TAA結合ドメインまたはヒト抗TAA結合ドメインは、LC CDRの1つ以上(例えば、3つすべて)と、HC CDRの1つ以上(例えば、3つすべて)と、を含む。一実施形態では、ヒト化抗TAA結合ドメインまたはヒト抗TAA結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化抗TAA結合ドメインまたはヒト抗TAA結合ドメインの重鎖相補性決定領域1(HC CDR1)、重鎖相補性決定領域2(HC CDR2)、及び重鎖相補性決定領域3(HC CDR3)の1つ以上(例えば、3つすべて)を含み、例えば、ヒト化抗TAA結合ドメインまたはヒト抗TAA結合ドメインは、2つの重鎖可変領域を含み、それぞれの重鎖可変領域は、本明細書に記載のHC CDR1、HC CDR2、及びHC CDR3を含む。一実施形態では、ヒト化抗TAA結合ドメインまたはヒト抗TAA結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化軽鎖可変領域もしくはヒト軽鎖可変領域、及び/または本明細書に記載のヒト化重鎖可変領域もしくはヒト重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗TAA結合ドメインまたはヒト抗TAA結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化重鎖可変領域を含み、例えば、本明細書に記載のヒト化重鎖可変領域またはヒト重鎖可変領域を少なくとも2つ含む。一実施形態では、抗TAA結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含むscFvである。一実施形態では、抗TAA結合ドメイン(例えば、scFv)は、本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対する1、2、もしくは3〜30個、20個、もしくは10個の改変(例えば、置換)を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列との同一性が95〜99%である配列を含む軽鎖可変領域、及び/または本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列に対する1、2、もしくは3〜30個、20個、もしくは10個の改変(例えば、置換)を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列との同一性が95〜99%である配列を含む重鎖可変領域、を含む。一実施形態では、ヒト化抗TAA結合ドメインまたはヒト抗TAA結合ドメインは、scFvであり、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域へと、リンカー(例えば、本明細書に記載のリンカー)を介して結合される。一実施形態では、ヒト化抗TAA結合ドメインは、(Gly4−Ser)nリンカー(nは、1、2、3、4、5、または6であり、好ましくは3または4である)を含む。scFvの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、下記の配向のいずれかのものであり得る:軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域、または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。場合によっては、リンカー配列は、長鎖リンカー(LL)配列を含む。場合によっては、長鎖リンカー配列は、(G4S)n(n=2〜4)を含む。場合によっては、リンカー配列は、短鎖リンカー(SL)配列を含む。場合によっては、短鎖リンカー配列は、(G4S)n(n=1〜3)を含む。
いくつかの態様では、非ヒト抗体は、ヒト化され、ヒトにおいて天然に産生される抗体またはその断片に対する類似性が向上するように抗体の特定の配列または領域が改変される。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化される。
ヒト化抗体は、当該技術分野で知られるさまざまな手法を使用して生成させることができ、こうした手法には、限定されないが、CDR移植(例えば、欧州特許第EP239,400号、国際公開公報第WO91/09967号、ならびに米国特許第5,225,539号、同第5,530,101号、及び同第5,585,089号(これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照のこと)、ベニヤリング(veneering)またはリサーフェイシング(resurfacing)(例えば、欧州特許第EP592,106号及び同第EP519,596号、Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489−498、Studnicka et al.,1994,Protein Engineering,7(6):805−814、ならびにRoguska et al.,1994,PNAS,91:969−973(これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照のこと)、鎖シャッフリング(例えば、米国特許第5,565,332号(当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照のこと)、ならびに例えば、米国特許出願公開公報第US2005/0042664号、米国特許出願公開公報第US2005/0048617号、米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、国際公開公報第WO9317105号、Tan et al.,J.Immunol.,169:1119−25(2002)、Caldas et al.,Protein Eng.,13(5):353−60(2000)、Morea et al.,Methods,20(3):267−79(2000)、Baca et al.,J.Biol.Chem.,272(16):10678−84(1997)、Roguska et al.,Protein Eng.,9(10):895−904(1996)、Couto et al.,Cancer Res.,55(23 Supp):5973s−5977s(1995)、Couto et al.,Cancer Res.,55(8):1717−22(1995)、Sandhu J S,Gene,150(2):409−10(1994)、及びPedersen et al.,J.Mol.Biol.,235(3):959−73(1994)(これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)に開示の手法が含まれる。多くの場合、フレームワーク領域中のフレームワーク残基は、CDRドナー抗体に由来する対応残基で置換されることになり、その結果、抗原結合が変更(例えば、改善)される。こうしたフレームワーク置換は、当該技術分野でよく知られる方法によって特定され、こうした方法は、例えば、CDR残基とフレームワーク残基との相互作用をモデル化して抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定することによるもの、及び配列を比較して特定の位置に稀なフレームワーク残基を特定することによるものである(例えば、Queen et al.,米国特許第5,585,089号、及びRiechmann et al.,1988,Nature,332:323(これらの文献は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。
ヒト化された抗体または抗体断片には、非ヒト供給源に由来するアミノ酸残基が1つ以上残存する。こうした非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称されることが多く、こうした「移入」残基は、典型的には、「移入」可変ドメインから取得される。本明細書で提供されるヒト化された抗体または抗体断片は、非ヒト免疫グロブリン分子に由来する1つ以上のCDRと、フレームワーク領域と、を含み、フレームワークを構成するアミノ酸残基は、完全にヒト生殖系列に由来するものであるか、またはほとんどがヒト生殖系列に由来するものである。抗体または抗体断片をヒト化するための手法については、多く手法が当該技術分野でよく知られており、こうした手法は、げっ歯類のCDRまたはCDR配列でヒト抗体の対応配列を置換すること(すなわち、CDR移植(EP239,400、PCT公開公報第WO91/09967号、及び米国特許第4,816,567号、同第6,331,415号、同第5,225,539号、同第5,530,101号、同第5,585,089号、同第6,548,640号(これらの文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)))によって、本質的には、下記のWinter及び共同研究者らの方法に従って実施され得る(Jones et al.,Nature,321:522−525(1986)、Riechmann et al.,Nature,332:323−327(1988)、Verhoeyen et al.,Science,239:1534−1536(1988))。そのようなヒト化された抗体及び抗体断片では、インタクトなヒト可変ドメインに実質的に満たない部分が、非ヒト種に由来する対応配列によって置換されている。ヒト化抗体は、いくつかのCDR残基及び可能性としてはいくつかのフレームワーク(FR)残基が、げっ歯類抗体の類似部位に由来する残基によって置換されたヒト抗体であることが多い。抗体及び抗体断片のヒト化は、ベニヤリングまたはリサーフェイシング(EP592,106、EP519,596、Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489−498、Studnicka et al.,Protein Engineering,7(6):805−814(1994)、及びRoguska et al.,PNAS,91:969−973(1994))または鎖シャッフリング(米国特許第5,565,332号)(これらの文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)によっても達成され得る。
ヒト化抗体の調製において行われるべきヒト可変ドメイン(軽鎖及び重鎖の両方のもの)の選択の目的は、抗原性の低減である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対して、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列がスクリーニングされる。次に、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(FR)として認められる(Sims et al.,J.Immunol.,151:2296(1993)、Chothia et al.,J.Mol.Biol.,196:901(1987)(これらの文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定の部分群に属するすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークが使用される。いくつかの異なるヒト化抗体に対して同じフレームワークが使用され得る(例えば、Nicholson et al.Mol.Immun.34(16−17):1157−1165(1997)、Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)、Presta et al.,J.Immunol.,151:2623(1993)(これらの文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域のフレームワーク領域(例えば、4つすべてのフレームワーク領域)は、VH4−4−59生殖系列配列に由来する。一実施形態では、フレームワーク領域は、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの改変(例えば、置換)を含み得、こうした改変は、例えば、対応するマウス配列のアミノ酸を使用したものである。一実施形態では、軽鎖可変領域のフレームワーク領域(例えば、4つすべてのフレームワーク領域)は、VK3−1.25生殖系列配列に由来する。一実施形態では、フレームワーク領域は、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの改変(例えば、置換)を含み得、こうした改変は、例えば、対応するマウス配列のアミノ酸を使用したものである。
いくつかの態様では、本開示のTFP組成物のうちで抗体断片を含む部分は、標的抗原に対する親和性の高さ、及び他の好ましい生物学的特性を維持しつつヒト化される。本開示の一態様によれば、ヒト化された抗体及び抗体断片は、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して親配列及び様々な概念的なヒト化産物を解析するプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体構造を図示及び表示するコンピュータープログラムが利用可能である。こうした表示を検証することで、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基の考え得る役割を解析することが可能となり、例えば、候補免疫グロブリンが標的抗原に結合する能力に影響を与える残基を解析することが可能となる。このように、レシピエント配列及び移入配列からFR残基を選択及び組み合わせることができ、その結果、所望の抗体特徴または抗体断片特徴(標的抗原に対する親和性の上昇など)が達成される。一般に、CDR残基は、直接的かつほぼ実質的に抗原結合に影響を与えるものである。
ヒト化された抗体または抗体断片は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持し得、例えば、本開示の場合、ヒト腫瘍関連抗原(MUC16、IL13Rα2、またはMSLNなど)に結合する能力を保持し得る。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体または抗体断片は、ヒトのMUC16、IL13Rα2、またはMSLNに対する親和性及び/または結合特異性が改善されたものであり得る。
一態様では、抗TAA結合ドメイン(すなわち、MUC16結合ドメイン、IL13Rα2結合ドメイン、またはMSLN結合ドメイン)は、抗体または抗体断片の特定の機能特徴または機能特性によって特徴付けられる。例えば、一態様では、本発明のTFP組成物のうちで抗原結合ドメインを含む部分は、ヒトのMUC16、IL13Rα2、またはMSLNに特異的に結合する。一態様では、本開示は、抗体または抗体断片を含む抗原結合ドメインに関し、抗体結合ドメインは、MUC16タンパク質、IL13Rα2タンパク質、もしくはMSLNタンパク質、またはその断片に特異的に結合し、抗体または抗体断片は、本明細書で提供されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖及び/または可変重鎖を含む。ある特定の態様では、scFvは、リーダー配列と隣接し、当該リーダー配列と同じリーディングフレームに存在する。
一態様では、抗TAA結合ドメインは、断片(例えば、一本鎖可変断片(scFv))である。一態様では、抗TAA結合ドメインは、Fv、Fab、(Fab’)2、または二機能性(例えば二重特異性)ハイブリッド抗体(例えば、Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17,105(1987))である。一態様では、本明細書に開示の抗体及びその断片は、野生型の親和性または強化された親和性でMUC16タンパク質、IL13Rα2タンパク質、またはMSNタンパク質に結合する。
標的抗原(例えば、MUC16、IL13Rα2、MLSN、または融合部分である結合ドメインの標的として本明細書の他の箇所に記載される任意の標的抗原)に特異的な抗体抗原結合ドメインを得るための方法も本明細書で提供され、この方法は、本明細書に示されるVHドメインのアミノ酸配列に1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入を導入することによって当該VHドメインのアミノ酸配列バリアントであるVHドメインを提供すること、このようにして提供されるVHドメインを1つ以上のVLドメインと任意選択で組み合わせること、及びこのVHドメインまたはVH/VLの組み合わせ(複数可)を試験して、目的の標的抗原(例えば、MUC16、IL13Rα2、MSLN)に対して特異的であり、1つ以上の所望の特性を任意選択で有する特異的な結合メンバーまたは抗体抗原結合ドメインを同定すること、を含む。
場合によっては、VHドメイン及びscFvは、当該技術分野で知られる方法に従って調製され得る(例えば、Bird et al.,(1988)Science 242:423−426、及びHuston et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883を参照のこと)。scFv分子は、可動性ポリペプチドリンカーを使用してVH領域とVL領域とを連結して一緒にすることによって生成され得る。scFv分子は、長さ及び/またはアミノ酸組成が最適化されたリンカー(例えば、Ser−Glyリンカー)を含む。リンカーの長さは、scFvの可変領域がどのようにフォールディングし、相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短いポリペプチドリンカー(例えば、アミノ酸数5〜10)が用いられる場合、鎖内フォールディングが阻止される。2つの可変領域を一緒にして機能性のエピトープ結合部位を形成させるには鎖間フォールディングが必要にもなり得る。場合によっては、リンカー配列は、長鎖リンカー(LL)配列を含む。場合によっては、長鎖リンカー配列は、(G4S)n(n=2〜4)を含む。場合によっては、リンカー配列は、短鎖リンカー(SL)配列を含む。場合によっては、短鎖リンカー配列は、(G4S)n(n=1〜3)を含む。リンカーの配向及びサイズの例については、例えば、Hollinger et al.1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444−6448、米国特許第7,695,936号、米国特許出願公開公報第20050100543号及び同第20050175606号、ならびにPCT公開公報第WO2006/020258号及び同第WO2007/024715号(これらの文献はすべて、参照によって本明細書に組み込まれる)を参照のこと。
scFvは、そのVL領域とVH領域との間に、残基数が約10、約11、約12、約13、約14、約15、または15を超えるリンカーを含み得る。リンカー配列は、天然起源の任意のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、アミノ酸グリシン及びアミノ酸セリンを含む。別の実施形態では、リンカー配列は、グリシン及びセリンが繰り返す配列のセット((Gly4Ser)n(nは、1以上の正の整数である)など)を含む。一実施形態では、リンカーは、(Gly4Ser)4または(Gly4Ser)3であり得る。リンカーの長さを変化させると、活性が保持または増強されることで、活性試験において優れた効力が生じ得る。場合によっては、リンカー配列は、長鎖リンカー(LL)配列を含む。場合によっては、長鎖リンカー配列は、(G4S)n(n=2〜4)を含む。場合によっては、リンカー配列は、短鎖リンカー(SL)配列を含む。場合によっては、短鎖リンカー配列は、(G4S)n(n=1〜3)を含む。
安定性及び変異
抗TAA結合ドメイン(例えば、scFv分子(例えば、可溶性scFv))の安定性は、従来の対照scFv分子または全長抗体の生物物理学的特性(例えば、熱安定性)に関して評価され得る。一実施形態では、記載のアッセイにおけるヒト化scFvまたはヒトscFvの熱安定性は、親scFvと比較して、約0.1℃、約0.25℃、約0.5℃、約0.75℃、約1℃、約1.25℃、約1.5℃、約1.75℃、約2℃、約2.5℃、約3℃、約3.5℃、約4℃、約4.5℃、約5℃、約5.5℃、約6℃、約6.5℃、約7℃、約7.5℃、約8℃、約8.5℃、約9℃、約9.5℃、約10℃、約11℃、約12℃、約13℃、約14℃、または約15℃高い。
抗TAA結合ドメイン(例えば、scFv分子(例えば、可溶性scFv))の安定性は、従来の対照scFv分子または全長抗体の生物物理学的特性(例えば、熱安定性)に関して評価され得る。一実施形態では、記載のアッセイにおけるヒト化scFvまたはヒトscFvの熱安定性は、親scFvと比較して、約0.1℃、約0.25℃、約0.5℃、約0.75℃、約1℃、約1.25℃、約1.5℃、約1.75℃、約2℃、約2.5℃、約3℃、約3.5℃、約4℃、約4.5℃、約5℃、約5.5℃、約6℃、約6.5℃、約7℃、約7.5℃、約8℃、約8.5℃、約9℃、約9.5℃、約10℃、約11℃、約12℃、約13℃、約14℃、または約15℃高い。
抗TAA結合ドメイン(例えば、scFv)の熱安定性が改善されると、この改善はその後にTAA−TFPコンストラクト全体に波及し、抗TAA TFPコンストラクトの治療特性が改善される。抗TAA結合ドメイン(例えば、scFv)の熱安定性は、従来の抗体と比較して少なくとも約2℃または3℃改善され得る。一実施形態では、抗TAA結合ドメイン(例えば、scFv)の熱安定性は、従来の抗体と比較して1℃改善されている。別の実施形態では、抗TAA結合ドメイン(例えば、scFv)の熱安定性は、従来の抗体と比較して2℃改善している。別の実施形態では、scFvの熱安定性は、従来の抗体と比較して4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、または15℃改善されている。比較は、例えば、本明細書に開示のscFv分子と、当該scFvのVH及びVLの由来元である抗体のscFv分子またはFab断片と、の間で行われ得る。熱安定性は、当該技術分野で知られる方法を使用して測定され得る。例えば、一実施形態では、TMが測定され得る。TMの測定方法、及びタンパク質の安定性を決定する他の方法は、以下に記載される。
scFvの変異(可溶性scFvのヒト化または変異導入を介して生じる)は、scFvの安定性を変化させ、scFv及び抗TAA TFPコンストラクトの全体安定性を改善する。ヒト化scFvの安定性は、測定値(TM、変性温度、及び凝集温度など)を使用してマウスscFvと比較される。一実施形態では、抗TAA結合ドメイン(例えば、scFv)は、ヒト化プロセスから生じる少なくとも1つの変異を含み、その結果、変異したscFvは、抗TAA TFPコンストラクトの安定性を改善する。別の実施形態では、抗TAA結合ドメイン(例えば、scFv)は、ヒト化プロセスから生じる少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10個の変異を含み、その結果、変異したscFvは、抗TAA−TFPコンストラクトの安定性を改善する。
一態様では、TFPの抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗原結合ドメインアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を含み、抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗TAA抗体断片の所望の機能特性を保持する。特定の一態様では、本発明のTFP組成物は、抗体断片を含む。別の態様では、その抗体断片は、scFvを含む。
さまざまな態様において、TFPの抗原結合ドメインは、一方または両方の可変領域(例えば、VH及び/またはVL)(例えば、1つ以上のCDR領域及び/または1つ以上のフレームワーク領域)に含まれるアミノ酸を1つ以上改変することによって操作される。特定の一態様では、本発明のTFP組成物は、抗体断片を含む。別の態様では、その抗体断片は、scFvを含む。
本開示の抗体または抗体断片は、さらに改変され得る結果、そうした抗体または抗体断片のアミノ酸配列は変化する(例えば、野生型から変化する)が、所望の活性は不変であることを当業者なら理解するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基のアミノ酸置換が生じる追加のヌクレオチド置換がタンパク質に対して行われ得る。例えば、分子中の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基によって交換され得る。別の実施形態では、アミノ酸の鎖を、側鎖ファミリーメンバーの順序及び/または組成が異なる構造的に類似した鎖によって交換することができ、例えば、保存的置換(アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基によって交換される)が行われ得る。
類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されており、こうしたファミリーには、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ−分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。
2つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列と関連する同一性パーセントは、2つ以上の配列が同じであることを指す。下記の配列比較アルゴリズムのうちの1つを使用して測定するか、または手動でアライメントし、目視で検証することによって、比較範囲または指定領域にわたって最大一致が得られるように2つの配列の比較及びアライメントを行うと、それら2つの配列が、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定のパーセントで有する場合(例えば、特定の領域にわたる同一性、または指定がないときは配列全体にわたる同一性が、60%であるか、任意選択で、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%である場合)、それら2つの配列は「実質的に同一」である。任意選択で、同一性が存在する領域は、長さが少なくとも約50個のヌクレオチド(または10個のアミノ酸)の領域、あるいはより好ましくは、長さが100〜500個もしくは1000個以上のヌクレオチド(または20個、50個、200個、もしくはそれを超える数のアミノ酸)の領域である。
配列比較については、典型的には1つの配列が参照配列として働き、この参照配列に対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列がコンピューターに入力され、部分配列座標が指定され、必要に応じて配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターが使用され得るか、または代替のパラメーターが指定され得る。次に、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントが配列比較アルゴリズムによって計算される。配列比較アライメント方法は、当該技術分野でよく知られている。最適な配列比較アライメントを実施することができ、こうした配列比較アライメントは、例えば、Smith and Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.2:482cの局所的相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443の相同性アライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444の類似性検索方法、こうしたアルゴリズムがコンピューター化されて実装されたもの(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.のGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA)、または手動でアライメントし、目視で検証するもの(例えば、Brent et al.,(2003)Current Protocols in Molecular Biologyを参照のこと)によって実施される。配列同一性及び配列類似性のパーセントの決定に適したアルゴリズムの例としては、BLASTアルゴリズム及びBLAST2.0アルゴリズムの2つが挙げられ、これらのアルゴリズムについては、それぞれAltschul et al.,(1977)Nuc.Acids Res.25:3389−3402、及びAltschul et al.,(1990)J.Mol.Biol.215:403−410に記載されている。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを通じて公的に利用可能である。ヌクレオチドBLASTを使用してヌクレオチド配列同一性を決定するためのアルゴリズムパラメーターは、1、−2のマッチ/ミスマッチスコアを用いるスコア付けパラメーターを使用するものであり得、ギャップコストは線形である。配列アライメントについては、アライメントを開始する配列の長さ、またはBLASTアルゴリズムにおける文字列長は28に設定され得る。タンパク質BLASTを使用してペプチド配列同一性を決定するためのアルゴリズムパラメーターは、残基対をアライメントし、全アライメントスコアを決定するためのスコアを割り当てるためにBLOSUM62行列を用いるスコア付けパラメーターを使用するものであり得、ギャップコストは、11の存在ペナルティ及び1の伸長ペナルティを有するものであり得る。配列のアミノ酸組成を補正するための行列調整法は、条件的組成スコア行列調整であり得る。配列アライメントについては、アライメントを開始する配列の長さ、またはBLASTアルゴリズムにおける文字列長は6に設定され得る。
一態様では、本発明は、出発抗体または出発断片(例えば、scFv)のアミノ酸配列を改変して機能的に同等の分子を得ることを企図する。例えば、TFPに含める抗TAA結合ドメイン(例えば、scFv)のVHまたはVLは、当該抗TAA結合ドメイン(例えば、scFv)の出発VHフレームワーク領域または出発VLフレームワーク領域との同一性が少なくとも約70%、少なくとも約71%、少なくとも約72%、少なくとも約73%、少なくとも約74%、少なくとも約75%、少なくとも約76%、少なくとも約77%、少なくとも約78%、少なくとも約79%、少なくとも約80%、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%に維持されるように改変され得る。本発明は、TFPコンストラクト全体を改変して(例えば、TFPコンストラクトのさまざまなドメインのアミノ酸配列を1つ以上改変して)機能的に同等の分子を得ることを企図する。TFPコンストラクトは、出発TFPコンストラクトとの同一性が少なくとも約70%、少なくとも約71%、少なくとも約72%、少なくとも約73%、少なくとも約74%、少なくとも約75%、少なくとも約76%、少なくとも約77%、少なくとも約78%、少なくとも約79%、少なくとも約80%、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%に維持されるように改変され得る。
細胞外ドメイン
細胞外ドメインは、天然または組換えの供給源に由来し得る。供給源が天然のものの場合、このドメインは、任意のタンパク質に由来し得るが、具体的には、膜結合型または膜貫通型のタンパク質に由来し得る。一態様では、細胞外ドメインは、膜貫通ドメインと結び付く能力を有する。本開示における特定用途の細胞外ドメインは、細胞外領域(複数可)(例えば、T細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、ガンマ鎖、デルタ鎖、もしくはゼータ鎖の細胞外領域、またはCD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタの細胞外領域)を少なくとも含み得るか、あるいは代替の実施形態では、細胞外ドメインは、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、またはCD154の細胞外ドメインを少なくとも含み得る。場合によっては、TCR細胞外ドメインは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及び1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。
細胞外ドメインは、天然または組換えの供給源に由来し得る。供給源が天然のものの場合、このドメインは、任意のタンパク質に由来し得るが、具体的には、膜結合型または膜貫通型のタンパク質に由来し得る。一態様では、細胞外ドメインは、膜貫通ドメインと結び付く能力を有する。本開示における特定用途の細胞外ドメインは、細胞外領域(複数可)(例えば、T細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、ガンマ鎖、デルタ鎖、もしくはゼータ鎖の細胞外領域、またはCD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタの細胞外領域)を少なくとも含み得るか、あるいは代替の実施形態では、細胞外ドメインは、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、またはCD154の細胞外ドメインを少なくとも含み得る。場合によっては、TCR細胞外ドメインは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及び1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む。
膜貫通ドメイン
一般に、TFP配列は、単一のゲノム配列によってコードされる細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含む。代替の実施形態では、TFPは、当該TFPの細胞外ドメインに対して異種である膜貫通ドメインを含むように設計され得る。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する1つ以上の追加のアミノ酸を含み得る。この1つ以上の追加のアミノ酸は、例えば、膜貫通タンパク質の由来元であるタンパク質の細胞外領域と結び付いた1つ以上のアミノ酸(例えば、細胞外領域の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、少なくとも30個、もしくはそれを超える数のアミノ酸)、及び/または膜貫通タンパク質の由来元であるタンパク質の細胞内領域と結び付いた1つ以上の追加のアミノ酸(例えば、細胞内領域の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、もしくはそれを超える数のアミノ酸)である。場合によっては、膜貫通ドメインは、細胞外領域の少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、少なくとも55個、少なくとも60個、またはそれを超える数のアミノ酸を含み得る。場合によっては、膜貫通ドメインは、細胞内領域の少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、少なくとも55個、少なくとも60個、またはそれを超える数のアミノ酸を含み得る。一態様では、TFPのその他のドメインのうちの1つと結び付いたものが膜貫通ドメインとして使用される。場合によっては、膜貫通ドメインを、そのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することが回避されるように、選択されるか、またはアミノ酸置換によって改変することができ、この改変の結果、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用が最小化される。一態様では、膜貫通ドメインは、TFP T細胞表面上の別のTFPとホモダイマー化する能力を有する。異なる態様では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じTFPに存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用が最小化するように改変または置換され得る。
一般に、TFP配列は、単一のゲノム配列によってコードされる細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含む。代替の実施形態では、TFPは、当該TFPの細胞外ドメインに対して異種である膜貫通ドメインを含むように設計され得る。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する1つ以上の追加のアミノ酸を含み得る。この1つ以上の追加のアミノ酸は、例えば、膜貫通タンパク質の由来元であるタンパク質の細胞外領域と結び付いた1つ以上のアミノ酸(例えば、細胞外領域の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、少なくとも30個、もしくはそれを超える数のアミノ酸)、及び/または膜貫通タンパク質の由来元であるタンパク質の細胞内領域と結び付いた1つ以上の追加のアミノ酸(例えば、細胞内領域の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、もしくはそれを超える数のアミノ酸)である。場合によっては、膜貫通ドメインは、細胞外領域の少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、少なくとも55個、少なくとも60個、またはそれを超える数のアミノ酸を含み得る。場合によっては、膜貫通ドメインは、細胞内領域の少なくとも30個、少なくとも35個、少なくとも40個、少なくとも45個、少なくとも50個、少なくとも55個、少なくとも60個、またはそれを超える数のアミノ酸を含み得る。一態様では、TFPのその他のドメインのうちの1つと結び付いたものが膜貫通ドメインとして使用される。場合によっては、膜貫通ドメインを、そのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することが回避されるように、選択されるか、またはアミノ酸置換によって改変することができ、この改変の結果、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用が最小化される。一態様では、膜貫通ドメインは、TFP T細胞表面上の別のTFPとホモダイマー化する能力を有する。異なる態様では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じTFPに存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用が最小化するように改変または置換され得る。
膜貫通ドメインは、天然または組換えの供給源に由来し得る。供給源が天然のものの場合、このドメインは、膜結合型または膜貫通型の任意のタンパク質に由来し得る。一態様では、膜貫通ドメインは、TFPが標的に結合しているときはいつでも細胞内ドメイン(複数可)にシグナル伝達を行う能力を有する。場合によっては、TCRサブユニットは、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、TCRゼータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、その機能性断片、及び1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。場合によっては、膜貫通ドメインは、ヒンジ(例えば、ヒトタンパク質に由来するヒンジ)を介してTFPの細胞外領域(例えば、TFPの抗原結合ドメイン)に付加され得る。例えば、一実施形態では、ヒンジは、ヒト免疫グロブリン(Ig)ヒンジ(例えば、IgG4ヒンジまたはCD8aヒンジ)であり得る。
リンカー
任意選択で、アミノ酸数が2〜10の長さの短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーによって、TFPの膜貫通ドメインと細胞質領域との間に結合が形成され得る。グリシン−セリンダブレットは、特に適したリンカーを与える。例えば、一態様では、リンカーは、GGGGSGGGGSというアミノ酸配列(配列番号99)を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCCというヌクレオチド配列(配列番号100)によってコードされる。リンカーの他の例は表4に示される。
任意選択で、アミノ酸数が2〜10の長さの短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーによって、TFPの膜貫通ドメインと細胞質領域との間に結合が形成され得る。グリシン−セリンダブレットは、特に適したリンカーを与える。例えば、一態様では、リンカーは、GGGGSGGGGSというアミノ酸配列(配列番号99)を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCCというヌクレオチド配列(配列番号100)によってコードされる。リンカーの他の例は表4に示される。
細胞質ドメイン
TFPの細胞質ドメインは、TFPがCD3ガンマポリペプチド、CD3デルタポリペプチド、またはCD3イプシロンポリペプチドを含むのであれば、細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る(TCRアルファサブユニット及びTCRベータサブユニットは、一般に、シグナル伝達ドメインを含まない)。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般に、TFPが導入されている免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも1つを活性化することを担う。「エフェクター機能」という用語は、特殊な細胞機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、タンパク質のうちで、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞が特殊機能を発揮するように導く部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメイン全体が通常は利用され得るが、多くの場合、鎖全体を使用することは必ずしも必要ではない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分が使用されるされる場合、そのような短縮部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むことが意図される。
TFPの細胞質ドメインは、TFPがCD3ガンマポリペプチド、CD3デルタポリペプチド、またはCD3イプシロンポリペプチドを含むのであれば、細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る(TCRアルファサブユニット及びTCRベータサブユニットは、一般に、シグナル伝達ドメインを含まない)。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般に、TFPが導入されている免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも1つを活性化することを担う。「エフェクター機能」という用語は、特殊な細胞機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、タンパク質のうちで、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞が特殊機能を発揮するように導く部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメイン全体が通常は利用され得るが、多くの場合、鎖全体を使用することは必ずしも必要ではない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分が使用されるされる場合、そのような短縮部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むことが意図される。
本発明のTFPにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原と受容体との結合後にシグナル伝達が開始されるように協奏的に働くT細胞受容体(TCR)及び共受容体の細胞質配列、ならびにこうした配列の任意の誘導体またはバリアント、及び同じ機能的能力を有する任意の組換え配列が挙げられる。
ナイーブT細胞が完全に活性化するにはTCRのみを介して生成するシグナルでは不十分であり得、二次シグナル及び/または共刺激シグナルが必要となり得ることが知られている。したがって、ナイーブT細胞の活性化は、2つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると言うことができ、この2つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列は、TCRを介して抗原依存的一次活性化を開始するもの(一次細胞内シグナル伝達ドメイン)、及び抗原非依存的様式で働いて二次シグナルまたは共刺激シグナルを生成するもの(二次細胞質ドメイン(例えば、共刺激ドメイン))である。
一次シグナル伝達ドメインは、刺激様式または抑制様式のいずれかでTCR複合体の一次活性化を制御し得る。刺激性の様式で働く一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)として知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
ITAMを含む一次細胞内シグナル伝達ドメインで本発明に特に有用なものの例としては、CD3ゼータのもの、FcRガンマのもの、FcRベータのもの、CD3ガンマのもの、CD3デルタのもの、CD3イプシロンのもの、CD5のもの、CD22のもの、CD79aのもの、CD79bのもの、及びCD66dのものが挙げられる。一実施形態では、本開示のTFPは、細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、CD3−イプシロンの一次シグナル伝達ドメイン)を含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、改変ITAMドメイン(例えば、天然のITAMドメインと比較して活性が変化(例えば、増加または減少)している変異ITAMドメイン)を含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、改変ITAM含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、最適化され及び/または短縮されたITAM含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上のITAMモチーフを含む。
TFPの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータシグナル伝達ドメインを単独で含み得るか、または本開示のTFPとの関連で有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメイン(複数可)と組み合わせられ得る。例えば、TFPの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3イプシロン鎖部分及び共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、TFPのうちで、共刺激分子の細胞内ドメインを含む部分を指す。共刺激分子は、抗原に対してリンパ球が効率的に応答する上で必要となり得る、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例としては、CD27、CD28、4−1BB(CD137)、OX40、DAP10、DAP12、CD30、CD40、PD1、ICOS、リンパ球機能関連抗原−1(LFA−1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7−H3、及びCD83に特異的に結合するリガンド、ならびに同様のものが挙げられる。例えば、CD27共刺激は、インビトロでヒトTFP−T細胞の増殖、エフェクター機能、及び生存を増進し、インビボでヒトT細胞の存続性及び抗腫瘍活性を増強することが実証されている(Songet al.Blood.2012;119(3):696−706)。
本開示のTFPの細胞質部分に含まれる細胞内シグナル伝達配列は、無作為な順序または特定の順序で互いに 連結され得る。任意選択で、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー(例えば、アミノ酸数が2〜10(例えば、アミノ酸数が2、3、4、5、6、7、8、9、または10)の長さのもの)によって細胞内シグナル伝達配列間に結合が形成され得る。
一実施形態では、適切なリンカーとしてグリシン−セリンダブレットが使用され得る。一実施形態では、適切なリンカーとして単一のアミノ酸(例えば、アラニン、グリシン)が使用され得る。
一態様では、本明細書に記載のTFP発現細胞は、第2のTFP(例えば、異なる抗原結合ドメイン(例えば、同じ標的(例えば、MUC16、IL13Rα2、MSLN)または異なる標的(例えば、CD123)に対するもの)を含む第2のTFP)をさらに含み得る。一実施形態では、TFP発現細胞が2つ以上の異なるTFPを含む場合、それらの異なるTFPの抗原結合ドメインは、それらの抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものであり得る。例えば、第1のTFP及び第2のTFPを発現する細胞は、第1のTFPの抗原結合ドメインを、例えば、第2のTFPの抗原結合ドメインと結び付かない断片(例えば、scFv)として有し得、例えば、第2のTFPの抗原結合ドメインは、VHHである。一実施形態では、抗原結合ドメインは、SD1(配列番号15)、SD2(配列番号20)、SD3(配列番号25)、SD4(配列番号30)、SD5(配列番号35)、またはSD6(配列番号40)である。一実施形態では、抗原結合ドメインは、LSD1(配列番号51)、H1−LSD1(配列番号56)、H2−LSD1(配列番号61)、LSD2(配列番号66)、H1−LSD1(配列番号71)、またはH2−LSD2(配列番号76)である。一実施形態では、抗原結合ドメインは、抗MSLN VHH1(配列番号96)または抗MSLN VHH2(配列番号97)である。
別の態様では、本明細書に記載のTFP発現細胞は、別の薬剤(例えば、TFP発現細胞の活性を増進する薬剤)をさらに発現し得る。例えば、一実施形態では、薬剤は、抑制分子を阻害する薬剤であり得る。抑制分子(例えば、PD1)は、いくつかの実施形態では、TFP発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低減し得る。抑制分子の例としては、PD1、PD−L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、及びTGFRベータが挙げられる。一実施形態では、抑制分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを与える第2のポリペプチド(例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン)と結び付いた第1のポリペプチド(例えば、抑制分子)を含む。一実施形態では、薬剤は、第1のポリペプチド(例えば、抑制分子(PD1、LAG3、CTLA4、CD160、BTLA、LAIR1、TIM3、2B4、及びTIGIT、またはこれらのいずれかの断片(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部)など)であるもの)と、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、4−1BB、CD27、もしくはCD28のもの(例えば、本明細書に記載のもの)、及び/または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、本明細書に記載のCD3ゼータシグナル伝達ドメイン)を含むもの)である第2のポリペプチドと、を含む。一実施形態では、薬剤は、PD1またはその断片(例えば、PD1の細胞外ドメインの少なくとも一部)である第1のポリペプチドと、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、本明細書に記載のCD28シグナル伝達ドメイン及び/または本明細書に記載のCD3ゼータシグナル伝達ドメイン)である第2のポリペプチドと、を含む。PD1は、CD28、CTLA−4、ICOS、及びBTLAも含むCD28受容体ファミリーの抑制メンバーである。PD1は、活性化B細胞上、活性化T細胞上、及び活性化骨髄系細胞上に発現し得る(Agata et al.1996 Int.Immunol 8:765−75)。PD1に対する2つのリガンド(プログラム細胞死リガンド1(PD−L1)及びプログラム細胞死リガンド2(PD−L2))は、PD1に結合するとT細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et al.2000 J Exp Med 192:1027−34、Latchman et al.2001 Nat Immunol 2:261−8、Carter et al.2002 Eur J Immunol 32:634−43)。PD−L1は、ヒトのがんに大量に存在し得る(Dong et al.2003 J Mol Med 81:281−7、Blank et al.2005 Cancer Immunol.Immunother 54:307−314、Konishi et al.2004 Clin Cancer Res 10:5094)。PD1とPD−L1との局所的な相互作用を阻害することによって免疫抑制を逆転させることができる。
一実施形態では、薬剤は、抑制分子(例えば、プログラム細胞死1(PD1))の細胞外ドメイン(ECD)(膜貫通ドメイン及び任意選択で細胞内シグナル伝達ドメイン(41BB及びCD3ゼータなど)と融合され得る)を含む(本明細書ではPD1 TFPとも称される)。一実施形態では、PD1 TFPは、本明細書に記載の抗TAA TFPと組み合わせて使用されると、T細胞の存続性を改善する。一実施形態では、TFPは、PD 1の細胞外ドメインを含むPD1 TFPである。あるいは、PD−L1またはPD−L2に特異的に結合する抗体または抗体断片(scFvなど)を含むTFPが提供される。
別の態様では、本開示は、TFP発現T細胞(例えば、TFP−T細胞)の集団を提供する。いくつかの実施形態では、TFP発現T細胞の集団は、異なるTFPを発現する細胞の混合物を含む。例えば、一実施形態では、TFP−T細胞の集団は、本明細書に記載の抗TAA結合ドメインを有するTFPを発現する第1の細胞と、異なる抗TAA結合ドメイン(例えば、第1の細胞が発現するTFP中の抗TAA結合ドメインとは異なる本明細書に記載の抗TAA結合ドメイン)を有するTFPを発現する第2の細胞と、を含み得る。別の例として、TFP発現細胞の集団は、抗TAA結合ドメイン(例えば、本明細書に記載のもの)を含むTFPを発現する第1の細胞と、第1の細胞の抗TAA TFP(例えば、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNに特異性を有するもの)の標的とは異なる標的(例えば、別の腫瘍関連抗原)に対する抗原結合ドメインを含むTFPを発現する第2の細胞と、を含み得る。
別の態様では、本開示は、細胞の集団(当該集団における少なくとも1種類の細胞は、本明細書に記載の抗TAAドメインを有するTFPを発現する)と、別の薬剤(例えば、TFP発現細胞の活性を増進する薬剤)を発現する第2の細胞と、を提供する。例えば、一実施形態では、薬剤は、抑制分子を阻害する薬剤であり得る。抑制分子は、例えば、いくつかの実施形態では、TFP発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低減し得る。抑制分子の例としては、PD1、PD−L1、PD−L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、及びTGFRベータが挙げられる。一実施形態では、抑制分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを与える第2のポリペプチド(例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメイン)と結び付いた第1のポリペプチド(例えば、抑制分子)を含む。
TFPをコードするインビトロで転写されたRNAを生成させる方法が本明細書に開示される。本発明は、細胞に直接的にトランスフェクションし得るTFPコードRNAコンストラクトも含む。トランスフェクションにおいて使用するためのmRNAを生成させる方法は、特別に設計されたプライマーを用いてテンプレートのインビトロ転写(IVT)を行った後にポリAを付加することで、3’非翻訳配列(「UTR」)及び5’UTR、5’キャップ、及び/または配列内リボソーム進入部位(IRES)、発現対象の核酸、ならびにポリA尾部(典型的には長さが50〜2000塩基のもの)、を含むコンストラクトを得るというものであり得る。そのようにして生成したRNAは、異なる種類の細胞に効率的にトランスフェクションされ得る。一態様では、テンプレートは、TFPのための配列を含む。
一態様では、抗TAA TFPは、メッセンジャーRNA(mRNA)によってコードされる。一態様では、抗TAA TFPをコードするmRNAは、TFP−T細胞を得るためにT細胞に導入される。一実施形態では、インビトロで転写されたRNA TFPは、一過性のトランスフェクションの形態として細胞に導入され得る。RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生成したテンプレートを使用するインビトロ転写によって生成される。適切なプライマー及びRNAポリメラーゼを使用するインビトロでのmRNA合成のためのテンプレートへと、任意の供給源に由来する目的DNAをPCRによって直接的に変換することができる。DNAの供給源は、例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列、または任意の他の適切なDNA供給源であり得る。インビトロ転写のための所望のテンプレートは、本発明のTFPである。一実施形態では、PCRに使用すべきDNAは、オープンリーディングフレームを含む。DNAは、生物のゲノムに由来する天然起源のDNA配列に由来するものであり得る。一実施形態では、核酸は、5’非翻訳領域(UTR)及び/または3’UTRをいくらかまたはすべて含み得る。核酸は、エクソン及びイントロンを含み得る。一実施形態では、PCRに使用すべきDNAは、ヒト核酸配列である。別の実施形態では、PCRに使用すべきDNAは、5’UTR及び3’UTRを含むヒト核酸配列である。あるいは、DNAは、天然起源の生物に通常は発現しない人工DNA配列であり得る。人工DNA配列の例は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するように、連結されて一緒になった複数の遺伝子部分を含むものである。連結されて一緒になる複数のDNA部分は、単一の生物または複数の生物に由来し得る。
トランスフェクションに使用されるmRNAのインビトロ転写のためのテンプレートを生成させるためにPCRが使用される。PCRを実施するための方法は、当該技術分野でよく知られている。PCRにおいて使用するためのプライマーは、PCRのためのテンプレートとして使用すべきDNAの領域と実質的に相補的な領域を有するように設計される。本明細書で使用される「実質的に相補的」は、ヌクレオチドの配列が、プライマー配列中の塩基の大部分もしくはすべてと相補的であるか、または1つ以上の塩基と非相補的であるか、もしくはミスマッチであることを指す。実質的に相補的な配列は、PCRに使用されるアニーリング条件の下で、意図されるDNA標的とアニーリングまたはハイブリダイズすることが可能である。DNAテンプレートの任意の部分と実質的に相補的になるようにプライマーを設計することができる。例えば、プライマーは、核酸のうちで、5’UTR及び3’UTRを含めて、細胞において通常は転写される部分(オープンリーディングフレーム)が増幅されるように設計され得る。プライマーは、核酸のうちで特定の目的ドメインをコードする部分が増幅されるようにも設計され得る。一実施形態では、プライマーは、5’UTR及び3’UTRのすべてまたは一部を含めて、ヒトcDNAのコード領域が増幅されるように設計される。PCRに有用なプライマーは、当該技術分野でよく知られる合成方法によって生成され得る。「フォワードプライマー」は、増幅対象のDNA配列の上流に位置するDNAテンプレート上のヌクレオチドと実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「上流」は、コード鎖を基準として増幅対象のDNA配列の5’側の位置を指すために本明細書で使用される。「リバースプライマー」は、二本鎖DNAテンプレートと実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含み、この領域が、増幅対象のDNA配列の下流に位置するプライマーである。「下流」は、コード鎖を基準として増幅対象のDNA配列の3’側の位置を指すために本明細書で使用される。
本明細書に開示の方法では、PCRに有用な任意のDNAポリメラーゼが使用され得る。試薬及びポリメラーゼは、多くの供給源から市販されている。
安定性及び/または翻訳効率を高める能力を有する化学構造も使用され得る。RNAは、好ましくは、5’UTR及び3’UTRを有する。一実施形態では、5’UTRは、ヌクレオチド数が1〜3,000の長さを有する。コード領域に付加されるべき5’UTR配列及び3’UTR配列の長さは、さまざまな方法によって変更することができ、こうした方法には、限定されないが、UTRの異なる領域にアニーリングするPCRプライマーを設計するものが含まれる。この手法を使用することで、転写されたRNAをトランスフェクションした後の翻訳効率の最適化達成に使用され得る5’UTR長及び3’UTR長を当業者なら改変することができる。
5’UTR及び3’UTRは、目的核酸に対して内在性である天然起源の5’UTR及び3’UTRであり得る。あるいは、目的核酸に対して内在性ではないUTR配列が、フォワードプライマー及びリバースプライマーにそうしたUTR配列を組み込むことによって付加されるか、またはテンプレートの任意の他の改変によって付加され得る。目的核酸に対して内在性ではないUTR配列を使用することは、RNAの安定性及び/または翻訳効率の改変に有用であり得る。例えば、AU高含有エレメントが3’UTR配列に存在するとmRNAの安定性が低下し得ることが知られている。したがって、当該技術分野でよく知られるUTRの特性に基づいて、転写されたRNAの安定性が向上するように3’UTRが選択または設計され得る。
一実施形態では、5’UTRは、内在性の核酸のコザック配列を含み得る。あるいは、目的核酸に対して内在性ではない5’UTRが、上記のようにPCRによって付加されている場合、当該5’UTR配列の付加によってコンセンサスコザック配列が再設計され得る。コザック配列は、RNA転写物によってはその翻訳効率を向上させ得るが、効率的な翻訳を可能にする上ですべてのRNAに必要なものではないと思われる。他の実施形態では、5’UTRは、細胞において自体のRNAゲノムが安定に存在するRNAウイルスの5’UTRであり得る。他の実施形態では、エキソヌクレアーゼによってmRNAが分解されることを妨げるために、3’UTRまたは5’UTR中にさまざまなヌクレオチド類似体が使用され得る。
遺伝子クローニングを必要とすることなくDNAテンプレートからRNAが合成されることを可能にするために、転写対象の配列の上流に位置するようにDNAテンプレートに転写プロモーターが付加されるべきである。RNAポリメラーゼに対するプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの5’末端に付加される場合、当該RNAポリメラーゼプロモーターは、PCR産物に組み込まれて転写対象のオープンリーディングフレームの上流に位置する。好ましい一実施形態では、プロモーターは、T7ポリメラーゼプロモーターであり、このことは本明細書の他の箇所に記載される。他の有用なプロモーターには、限定されないが、T3 RNAポリメラーゼプロモーター及びSP6 RNAポリメラーゼプロモーターが含まれる。T7プロモーター、T3プロモーター、及びSP6プロモーターのためのコンセンサスヌクレオチド配列は、当該技術分野で知られている。
好ましい実施形態では、mRNAは、5’末端上のキャップも3’ポリ(A)尾部も有し、これらによってリボソームの結合、翻訳の開始、及び細胞中でのmRNAの安定性が決定される。環状DNAテンプレート(例えば、プラスミドDNA)では、真核細胞における発現に適さない長い鎖状産物がRNAポリメラーゼによって生成される。3’UTRの末端位置で直鎖化したプラスミドDNAの転写では通常サイズのmRNAが得られるが、このmRNAは、転写後にポリアデニル化されたとしても、真核生物へのトランスフェクションに有効なものではない。
直鎖DNAテンプレートでは、ファージT7 RNAポリメラーゼは、テンプレートの最終塩基を超えて転写物の3’末端を延長し得る(Schenborn and Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223−36(1985)、Nacheva and Berzal−Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485−65(2003)。
ポリA/T区間をDNAテンプレートに組み込む従来の方法は分子クローニングである。しかしながら、ポリA/T配列がプラスミドDNAに組み込まれるとプラスミドが不安定化し得る。このことが、細菌細胞から得られるプラスミドDNAテンプレートには欠失及び他の異常が高度に混入することが多い理由である。このことによってクローニング手順が難儀かつ時間のかかるものとなっているだけでなく、不確実なものにもなっている。このことが、クローニングを伴うことなくポリA/T3’区間を有するDNAテンプレートを構築することを可能にする方法が非常に望ましい理由である。
転写DNAテンプレートのポリA/Tセグメントは、ポリT尾部(T数が100の尾部など)(T数50〜5000のサイズのものであり得る)を含むリバースプライマーを使用してPCRの間に生成されるか、または任意の他の方法(限定されないが、DNAライゲーションもしくはインビトロでの組換えを含む)によってPCRの後に生成され得る。ポリ(A)尾部は、RNAに安定性を付与すると共に、RNAの分解も低減する。一般に、ポリ(A)尾部の長さは、転写されたRNAの安定性と正に相関する。一実施形態では、ポリ(A)尾部のアデノシン数は、100〜5000である。
ポリ(A)ポリメラーゼ(E.coliポリAポリメラーゼ(E−PAP)など)を使用するとインビトロ転写後にRNAのポリ(A)尾部をさらに伸長させることができる。一実施形態では、ポリ(A)尾部の長さをヌクレオチド数100からヌクレオチド数300〜400に伸ばすと、RNAの翻訳効率が約2倍に増加する。さらに、異なる化学基を3’末端に付加すると、mRNAの安定性が向上し得る。そのような付加は、修飾/人工ヌクレオチド、アプタマー、及び他の化合物を含み得る。例えば、ポリ(A)ポリメラーゼを使用してATP類似体がポリ(A)尾部に組み込まれ得る。ATP類似体は、RNAの安定性をさらに向上させ得る。
5’キャップの付加もまた、RNA分子に安定性を付与する。好ましい実施形態では、本明細書に開示の方法によって生成されるRNAは、5’キャップを含む。5’キャップは、当該技術分野で知られる手法及び本明細書に記載の方法を使用して生成される(Cougot,et al.,Trends in Biochem.Sci.,29:436−444(2001)、Stepinski,et al.,RNA,7:1468−95(2001)、Elango,et al.,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958−966(2005))。
本明細書に開示の方法によって生成されるRNAは、配列内リボソーム進入部位(IRES)配列も含み得る。IRES配列は、mRNAへのキャップ非依存的なリボソーム結合を開始させ、翻訳の開始を促進する任意のウイルス配列、染色体配列、または人工的に設計された配列であり得る。細胞の電気穿孔に適した任意の溶質(細胞の透過性及び生存率を促進する因子(糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤、及び界面活性剤など)を含み得る)が含められ得る。
標的細胞へのRNAの導入は、多くの異なる方法(例えば、商業的に利用可能な方法)のいずれかを使用して行われ得る。こうした商業的に利用可能な方法には、限定されないが、電気穿孔(Amaxa Nucleofector−II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)、もしくはGene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany)、リポフェクションを使用する陽イオン性リポソーム介在性のトランスフェクション、ポリマー被包、ペプチド介在性のトランスフェクション、または微粒子送達系(「遺伝子銃」など)(例えば、Nishikawa,et al.Hum Gene Ther.,12(8):861−70(2001)を参照のこと)が含まれる。
TFPをコードする核酸コンストラクト
本開示は、本明細書に記載のTFPコンストラクトを1つ以上コードする核酸分子も提供する。一態様では、核酸分子は、メッセンジャーRNA転写物として提供される。一態様では、核酸分子は、DNAコンストラクトとして提供される。
本開示は、本明細書に記載のTFPコンストラクトを1つ以上コードする核酸分子も提供する。一態様では、核酸分子は、メッセンジャーRNA転写物として提供される。一態様では、核酸分子は、DNAコンストラクトとして提供される。
所望の分子をコードする核酸配列は、当該技術分野で知られる組換え方法を使用して得ることができ、こうした方法は、例えば、遺伝子を発現する細胞に由来するライブラリーをスクリーニングすることによるもの、遺伝子を含むことが知られるベクターから遺伝子を得ることによるもの、または遺伝子を含む細胞及び組織から直接的に遺伝子を単離することによるものなど(標準的な手法を使用して行われる)である。あるいは、目的遺伝子は、クローニングではなく、合成的に生成され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組換え核酸を含むベクターが本明細書で提供される。場合によっては、ベクターは、DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。場合によっては、ベクターは、AAV6ベクターである。場合によっては、ベクターは、プロモーターをさらに含む。場合によっては、ベクターは、インビトロで転写されるベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、環状RNAベクター(例えば、同時係属中の仮特許出願第62/836,977号に開示にもの)である。
本開示は、本発明のDNAが挿入されたベクターも提供する。レトロウイルス(レンチウイルスなど)に由来するベクターは、導入遺伝子を長期的かつ安定的に組み込み、組み込んだ導入遺伝子を娘細胞に受け継がせて複製することを可能にするため、遺伝子の長期的な導入達成に適したツールである。レンチウイルスベクターは、非増殖細胞(肝細胞など)への形質導入を生じさせ得るという点において、オンコレトロウイルス(マウス白血病ウイルスなど)に由来するベクターを上回る追加利点を有する。レンチウイルスベクターは、免疫原性が低いという追加利点も有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組換え核酸を含むベクターが開示される。
別の実施形態では、本開示の所望のTFPをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター(A5/35)である。別の実施形態では、TFPをコードする核酸の発現は、トランスポゾン(スリーピングビューティーなど)、crisper、CAS9、及びジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して達成され得る(June et al.2009 Nature Reviews Immunol.9.10:704−716(参照によって本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。
本開示の発現コンストラクトは、標準的な遺伝子送達プロトコールを使用する核酸による免疫化及び遺伝子治療にも使用され得る。遺伝子送達のための方法は、当該技術分野で知られている(例えば、米国特許第5,399,346号、同第5,580,859号、同第5,589,466号(これらの文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照のこと))。別の実施形態では、本開示は、遺伝子治療ベクターを提供する。
核酸は、多くの型のベクターにクローニングされ得る。例えば、核酸をベクターにクローニングすることができ、こうしたベクターには、限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドが含まれる。特定目的のベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及びシークエンシングベクターが含まれる。
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に導入され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野でよく知られており、例えば、Sambrook et al.,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,volumes 1−4,Cold Spring Harbor Press,NY、ならびにウイルス学及び分子生物学の他の手引書に記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが含まれる。一般に、適切なベクターは、少なくとも1つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び1つ以上の選択可能マーカー(例えば、WO01/96584、WO01/29058、及び米国特許第6,326,193号)を含む。
哺乳類細胞への遺伝子導入についてはウイルスベースの系が多く開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットホームを提供する。当該技術分野で知られる手法を使用して選択遺伝子がベクターに挿入され、レトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次に、組換えウイルスが単離され、インビボまたはエクスビボのいずれかで対象の細胞に送達され得る。当該技術分野では多くのレトロウイルス系が知られている。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。当該技術分野では多くのアデノウイルスベクターが知られている。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
追加のプロモーターエレメント(例えば、エンハンサー)は、転写開始の頻度を制御する。典型的には、こうしたものは、開始部位から30〜110bp上流の領域に位置するが、多くのプロモーターは開始部位の下流にも機能性エレメントを含むことが示されている。プロモーターエレメント間の間隔は融通が利くことが多く、結果的に、エレメントを互いに反転または移動させてもプロモーター機能は保たれる。チミジンキナーゼ(tk)プロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔を空けていくと、間隔が50bpに到達したところで初めて活性の低下が始まり得る。プロモーターに応じて、個々のエレメントが協同的または独立的に機能して転写を活性化し得るものと思われる。
哺乳類T細胞においてTFP導入遺伝子を発現させる能力を有するプロモーターの一例は、EF1aプロモーターである。天然のEF1aプロモーターは、伸長因子−1複合体のアルファサブユニット(アミノアシルtRNAを酵素的にリボソームに送達することを担う)の発現を生じさせる。EF1aプロモーターは、哺乳類発現プラスミドにおいて広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローニングされた導入遺伝子からTFP発現を生じさせる上で有効であることが示されている(例えば、Milone et al.,Mol.Ther.17(8):1453−1464(2009)を参照のこと)。プロモーターの別の例は、サイトメガロウイルス(CMV)の前初期プロモーター配列である。このプロモーター配列は、そこに機能可能なように連結された任意のポリヌクレオチド配列の発現を高レベルで生じさせる能力を有する強力な構成的プロモーター配列である。一方で、他の構成的プロモーター配列を使用することもでき、こうした構成的プロモーター配列には、限定されないが、サルウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の長い末端反復配列(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター(限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子−1aプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターなど)が含まれる。さらに、本開示は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきものではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターを使用することで、それが機能可能なように連結されたポリヌクレオチド配列の発現をそのような発現が望まれるときに生じさせるか、または発現が望まれないときには発現を生じさせなくする能力を有する分子スイッチが得られる。誘導性プロモーターの例としては、限定されないが、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリン制御型プロモーターが挙げられる。
TFPポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入すべき発現ベクターは、選択可能マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれか、またはこれら両方も含むことで、ウイルスベクターを介したトランスフェクションまたは感染の対象である細胞の集団から発現細胞を同定及び選択することが容易になり得る。他の態様では、選択可能マーカーは、別個のDNA断片上に組み込まれ、コトランスフェクション手順において使用され得る。選択可能マーカー及びレポーター遺伝子は共に、適切な制御配列と隣接することで、宿主細胞での発現が可能になり得る。有用な選択可能マーカーには、例えば、抗生物質耐性遺伝子(ネオマイシン耐性遺伝子など)及び同様のものが含まれる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクションされた可能性のある細胞を同定すること、及び制御配列の機能性を評価することに使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物もしくはレシピエント組織に存在しないか、またはレシピエント生物もしくはレシピエント組織が発現しない遺伝子であって、検出が容易に可能な何らかの特性(例えば、酵素活性)によって自体の発現が明らかとなるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞に導入された後の適切な時間にアッセイされる。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼをコードする遺伝子、ベータ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子が含まれ得る(例えば、Ui−Tei et al.,2000 FEBS Letters 479:79−82)。適切な発現系はよく知られており、既知の手法を使用して調製されるか、または商業的に得ることができる。一般に、最小の5’隣接領域でレポーター遺伝子の発現が最大レベルとなるコンストラクトが、プロモーターを有するものとして同定される。そのようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーターによって生じる転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用され得る。
細胞へ遺伝子を導入し、発現させる方法は、当該技術分野で知られている。発現ベクターとの関連では、当該技術分野の任意の方法によってベクターが宿主細胞(例えば、哺乳類細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞)に容易に導入され得る。例えば、物理的、化学的、または生物学的な手段によって発現ベクターが宿主細胞に導入され得る。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的な方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、パーティクルボンバードメント、マイクロインジェクション、電気穿孔、及び同様のものが含まれる。ベクター及び/または外来性核酸を含む細胞を調製するための方法は、当該技術分野でよく知られている(例えば、Sambrook et al.,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,volumes 1−4,Cold Spring Harbor Press,NYを参考のこと)。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための方法の1つは、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
目的ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的な方法には、DNAベクター及びRNAベクターを使用するものが含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類(例えば、ヒト)の細胞に挿入するために最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI型、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス、ならびに同様のものに由来するものであり得る(例えば、米国特許第5,350,674号及び同第5,585,362号を参照のこと)。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的な方法には、コロイド分散系が含まれ、こうしたコロイド分散系は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、及び脂質ベースの系(水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む)などである。インビトロ及びインビボでの送達媒体として使用するためのコロイド系の例は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。他の最先端の標的化核酸送達方法も利用可能であり、こうした方法は、標的化ナノ粒子または他の適切なサブミクロンサイズの送達系を用いてポリヌクレオチドを送達するものなどである。
非ウイルス送達系が利用される場合、送達媒体の例はリポソームである。宿主細胞への核酸の導入(インビトロ、エクスビボ、またはインビボでのもの)については脂質製剤の使用が企図される。別の態様では、核酸は、脂質と結び付けられ得る。脂質と結び付いた核酸は、リポソームの水性内部に被包されるか、リポソームの脂質二重層内に散在されるか、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方を結び付ける連結分子を介してリポソームに付加されるか、リポソームに封入されるか、リポソームと複合体化されるか、脂質を含む溶液に分散されるか、脂質と混合されるか、脂質と組み合わせられるか、懸濁液として脂質に含められるか、ミセルに含められるか、もしくはミセルと複合体化されるか、またはその他の様式で脂質と結び付けられ得る。脂質、脂質/DNA、または脂質/発現ベクターと結び付いた組成物は、いずれの特定の溶液中構造にも限定されない。例えば、そうした組成物は、ミセルとして二重層構造中に存在し得るか、または「崩壊」構造をとって存在し得る。そうした組成物は、単純に溶液中に散在し、サイズまたは形状が不均一な集合体を形成する可能性もあり得る。脂質は、天然起源の脂質または合成の脂質であり得る脂肪性物質である。例えば、脂質には、細胞質に天然に生じる脂肪滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体を含むクラスの化合物(脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドなど)が含まれる。
使用に適した脂質は、商業的な供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(「DMPC」)は、Sigma,St.Louis,Mo.から入手することができる。リン酸ジセチル(「DCP」)は、K & K Laboratories(Plainview,N.Y.)から入手することができる。コレステロール(「Choi」)は、Calbiochem−Behringから入手することができる。ジミリスチルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)及び他の脂質は、Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,Ala.)から入手することができる。脂質を含むクロロホルムまたはクロロホルム/メタノールの保存溶液は、約−20℃で保管され得る。クロロホルムは、メタノールと比較してより容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、閉鎖された脂質二重層または凝集体が生成することによって形成されるさまざまな単層脂質媒体及び多重層脂質媒体を包含する一般用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜を有し、内部に水性媒体を含む小胞構造を有するものとして特徴付けられ得る。多重層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。多重層リポソームは、過剰な水溶液にリン脂質が懸濁されると自発的に形成される。脂質成分は、自己再編成を起こした後、閉鎖構造を形成し、脂質二重層の間に水及び溶解溶質を閉じ込める(Ghosh et al.,1991 Glycobiology 5:505−10)。しかしながら、溶液中の構造が通常の小胞構造とは異なる組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造をとることが想定されるか、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在し得る。lipofectamine−核酸複合体も企図される。
外来性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法、またはその他の様式で本発明の阻害剤に細胞を曝露するために使用される方法にかかわらず、組換えDNA配列が宿主細胞に存在するかを確認するために、さまざまなアッセイが実施され得る。そのようなアッセイには、例えば、当業者によく知られる「分子生物学的」アッセイ(サザンブロット及びノーザンブロット、RT−PCR、ならびにPCRなど)、「生化学的」アッセイ(特定のペプチドの存在有無を検出するもの(例えば、免疫学的な手段(ELISA及びウエスタンブロット)によって検出するもの、または本発明の範囲に入る薬剤を同定するための本明細書に記載のアッセイによって検出するもの)など)が含まれる。
外来性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法、またはその他の様式で本発明の阻害剤に細胞を曝露するために使用される方法にかかわらず、組換えDNA配列が宿主細胞に存在するかを確認するために、さまざまなアッセイが実施され得る。そのようなアッセイには、例えば、当業者によく知られる「分子生物学的」アッセイ(サザンブロット及びノーザンブロット、RT−PCR、ならびにPCRなど)、「生化学的」アッセイ(特定のペプチドの存在有無を検出するもの(例えば、免疫学的な手段(ELISA及びウエスタンブロット)によって検出するもの、または本発明の範囲に入る薬剤を同定するための本明細書に記載のアッセイによって検出するもの)など)が含まれる。
遺伝子編集技術
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の改変T細胞は、遺伝子編集手法を使用して操作され、こうした遺伝子編集手法は、規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列(CRISPR(登録商標)、例えば、米国特許第8,697,359号を参照のこと)、転写活性化因子様エフェクター(TALE)ヌクレアーゼ(TALEN、例えば、米国特許第9,393,257号を参照のこと)、メガヌクレアーゼ(12〜40塩基対の二本鎖DNA配列を含む大きな認識部位を有するエンドデオキシリボヌクレアーゼ)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN、例えば、Urnov et al.,Nat.Rev.Genetics(2010)v11,636−646を参照のこと)、またはメガTALヌクレアーゼ(メガヌクレアーゼとTAL反復配列との融合タンパク質)を使用する方法などである。このように、各サブユニットの望ましい特徴(高次構造またはシグナル伝達能力など)が組み合わさるようにキメラコンストラクトが操作創出され得る。Sander & Joung,Nat.Biotech.(2014)v32,347−55、及びJune et al.,2009 Nature Reviews Immunol.9.10:704−716(それぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる)も併せて参照のこと。いくつかの実施形態では、TFPサブユニットの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞質ドメインの1つ以上は、複数の天然のTCRサブユニットドメインの側面を有するように操作される(すなわち、キメラとされる)。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の改変T細胞は、遺伝子編集手法を使用して操作され、こうした遺伝子編集手法は、規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列(CRISPR(登録商標)、例えば、米国特許第8,697,359号を参照のこと)、転写活性化因子様エフェクター(TALE)ヌクレアーゼ(TALEN、例えば、米国特許第9,393,257号を参照のこと)、メガヌクレアーゼ(12〜40塩基対の二本鎖DNA配列を含む大きな認識部位を有するエンドデオキシリボヌクレアーゼ)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN、例えば、Urnov et al.,Nat.Rev.Genetics(2010)v11,636−646を参照のこと)、またはメガTALヌクレアーゼ(メガヌクレアーゼとTAL反復配列との融合タンパク質)を使用する方法などである。このように、各サブユニットの望ましい特徴(高次構造またはシグナル伝達能力など)が組み合わさるようにキメラコンストラクトが操作創出され得る。Sander & Joung,Nat.Biotech.(2014)v32,347−55、及びJune et al.,2009 Nature Reviews Immunol.9.10:704−716(それぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる)も併せて参照のこと。いくつかの実施形態では、TFPサブユニットの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞質ドメインの1つ以上は、複数の天然のTCRサブユニットドメインの側面を有するように操作される(すなわち、キメラとされる)。
ヒトゲノムを恒久的に変化させるための技術、及びゲノム改変を部位特異的に疾患関連遺伝子に導入するための技術が最近開発されたことによって、治療への応用の基礎が築かれている。こうした技術は、今や「ゲノム編集」として一般に知られている。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集手法は、内在性のTCR遺伝子を破壊するために用いられる。いくつかの実施形態では、言及した内在性のTCR遺伝子は、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、またはTCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子編集手法は、マルチプレックスゲノム編集への道を切り開いており、マルチプレックスゲノム編集では、内在性のTCR遺伝子における複数のゲノム遺伝子座を同時に破壊することが可能である。いくつかの実施形態では、マルチプレックスゲノム編集手法が適用されることで、内在性のTCR及び/またはヒト白血球抗原(HLA)及び/またはプログラム細胞死タンパク質1(PD1)及び/または他の遺伝子を発現しない遺伝子破壊T細胞が得られる。
現在の遺伝子編集技術は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、及び規則的な間隔でクラスター化した短鎖反復回文配列(CRISPR)/CRISPR関連(Cas)系を含む。これら4つの主要クラスの遺伝子編集手法は、使用者が定義したDNA配列に結合すること、及び二本鎖DNA切断(DSB)を媒介することにおいて共通の作用様式を共有している。次に、DSBは、非相同末端結合(NHEJ)によって修復されるか、またはドナーDNAが存在する場合は、相同組換え(HR)(ドナーDNA断片に由来する相同的配列を導入する事象)によって修復され得る。さらに、ニッカーゼヌクレアーゼは、一本鎖DNA切断(SSB)を生成させる。DSBは、一本鎖DNA組み込み(ssDI)または一本鎖テンプレート修復(ssTR)(ドナーDNAに由来する相同的配列を導入する事象)によって修復され得る。
ゲノムDNAの遺伝子改変は、目的遺伝子座中のDNA配列を認識するように操作された部位特異的レアカッターエンドヌクレアーゼを使用して実施され得る。操作された部位特異的エンドヌクレアーゼを得る方法は、当該技術分野で知られている。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、ゲノム中の所定部位を認識及び切断するように操作され得る。ZFNは、Fokl制限酵素のヌクレアーゼドメインと融合したジンクフィンガーDNA結合ドメインを含むキメラタンパク質である。ジンクフィンガードメインは、合理的または実験的な手段によって長さが〜18塩基対の所定のDNA配列に結合するタンパク質が得られるように再設計され得る。この操作されたタンパク質ドメインをFoklヌクレアーゼと融合させることによって、ゲノムレベルの特異性でDNA切断が生じるように狙いを定めることが可能である。ZFNは、広範な真核生物において遺伝子の付加、除去、及び置換が生じるように狙いを定めるために広く使用されている(Durai et al.(2005),Nucleic Acids Res 33,5978に概説されている)。同様に、ゲノムDNA中の特定の部位を切断するようにTAL−エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を生成させることができる。ZFNと同様に、TALENは、Foklヌクレアーゼドメインと融合した操作された部位特異的DNA結合ドメインを含む(Mak et al.(2013),Curr Opin Struct Biol.23:93−9に概説されている)。しかしながら、この場合、DNA結合ドメインは、直列に配置された複数のTAL−エフェクタードメインを含み、これらのTAL−エフェクタードメインはそれぞれ、単一のDNA塩基対を特異的に認識する。コンパクトTALENは、二量体化が必要とならない代替のエンドヌクレアーゼ構造を有する(Beurdeley et al.(2013),Nat Commun.4:1762)。コンパクトTALENは、I−TevIホーミングエンドヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインと融合した操作された部位特異的TAL−エフェクターDNA結合ドメインを含む。Foklとは異なり、I−TevIは、二本鎖DNA切断を生成する上で二量体化する必要がないため、コンパクトTALENは、モノマーとして機能する。
CRISPR/Cas9系に基づく操作されたエンドヌクレアーゼもまた、当該技術分野で知られている(Ran et al.(2013),Nat Protoc.8:2281−2308、Mali et al.(2013),Nat Methods 10:957−63)。CRISPR遺伝子編集技術は、短いガイドRNAまたは二本鎖crRNA/TracrRNAによってDNA標的化特異性及び切断活性をプログラミングすることが可能なエンドヌクレアーゼタンパク質から構成される。CRISPRエンドヌクレアーゼは、(1)カスパーゼエフェクターヌクレアーゼ(典型的には、微生物Cas9)、及び(2)ゲノム中の目的位置へとヌクレアーゼを指向化するヌクレオチド数18〜20の標的化配列を含む短い「ガイドRNA」またはRNA二本鎖、という2つの構成要素を含む。異なる標的化配列をそれぞれが有する複数のガイドRNAを同じ細胞に発現させることによって、ゲノム中の複数の部位に同時にDNA切断が生じるように狙いを定めることが可能である(マルチプレックスゲノム編集)。
CRISPR系には2つのクラスが存在することが当該技術分野では知られており(Adli(2018)Nat.Commun.9:1911)、それぞれのクラスは、複数のCRISPR型を含む。クラス1は、古細菌に一般に見られるI型及びIII型のCRISPR系を含む。クラスIIは、II型、IV型、V型、及びVI型のCRISPR系を含む。最も広く使用されるCRISPR/Cas系はII型のCRISPR−Cas9系であるが、研究者は数々のCRISPR/Cas系をゲノム編集という本来とは別の目的で使用している。この数年の間に10を超える異なるCRISPR/Casタンパク質がリモデリングされている(Adli(2018)Nat.Commun.9:1911)。こうしたものの中でも、Acidaminococcus属の1種に由来するCas12a(Cpf1)タンパク質(AsCpf1)、及びLachnospiraceae bacteriumに由来するCas12a(Cpf1)タンパク質(LbCpf1)などは、特に興味深いものである。
CRISPR系には2つのクラスが存在することが当該技術分野では知られており(Adli(2018)Nat.Commun.9:1911)、それぞれのクラスは、複数のCRISPR型を含む。クラス1は、古細菌に一般に見られるI型及びIII型のCRISPR系を含む。クラスIIは、II型、IV型、V型、及びVI型のCRISPR系を含む。最も広く使用されるCRISPR/Cas系はII型のCRISPR−Cas9系であるが、研究者は数々のCRISPR/Cas系をゲノム編集という本来とは別の目的で使用している。この数年の間に10を超える異なるCRISPR/Casタンパク質がリモデリングされている(Adli(2018)Nat.Commun.9:1911)。こうしたものの中でも、Acidaminococcus属の1種に由来するCas12a(Cpf1)タンパク質(AsCpf1)、及びLachnospiraceae bacteriumに由来するCas12a(Cpf1)タンパク質(LbCpf1)などは、特に興味深いものである。
ホーミングエンドヌクレアーゼは、植物及び真菌のゲノムに一般に見られる15〜40塩基対の切断部位を認識する天然起源のヌクレアーゼの一群である。ホーミングエンドヌクレアーゼは、寄生虫DNAエレメント(群1の自己スプライシング型のイントロン及びインテインなど)と関連することが多い。ホーミングエンドヌクレアーゼは、天然では、染色体に二本鎖切断を生じさせ、これによって細胞のDNA修復装置を動員することによって宿主ゲノム中の特定の位置に対する相同組換えまたは遺伝子挿入を促進する(Stoddard(2006),Q.Rev.Biophys.38:49−95)。特定のアミノ酸置換を行えば、ホーミングヌクレアーゼのDNA切断特異性がリプログラミングされ得る(Niyonzima(2017),Protein Eng Des Sel.30(7):503−522)。メガヌクレアーゼ(MN)は、細菌のホーミングエンドヌクレアーゼに由来する、固有のヌクレアーゼ活性を有するモノマータンパク質であり、特有の標的部位を標的とするように操作される(Gersbach(2016),Molecular Therapy.24:430−446)。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼは、操作されたI−CreIホーミングエンドヌクレアーゼである。他の実施形態では、メガヌクレアーゼは、操作されたI−SceIホーミングエンドヌクレアーゼである。
言及した4つの主要な遺伝子編集技術に加えて、メガヌクレアーゼ、ZFN、及びTALENの融合体を含むキメラタンパク質が操作されることで、ZFN及びTALENの結合親和性、ならびにメガヌクレアーゼの切断特異性を利用する新規のモノマー酵素が得られている(Gersbach(2016),Molecular Therapy.24:430−446)。例えば、メガTALは、TALEN由来のDNA結合ドメインの調整容易性とメガヌクレアーゼの高い切断効率性とを兼ね備えた単一のキメラタンパク質である。
遺伝子編集手法を実施するために、ヌクレアーゼ、及びCRISPR/Cas9系の場合はgRNAが目的細胞に効率的に送達されなくてはならない。当該技術分野では、送達方法(物理的方法、化学的方法、及びウイルスを使用する方法など)も知られている(Mali(2013).Indian J.Hum.Genet.19:3−8.)。場合によっては、物理的な送達方法は、限定されないが、電気穿孔法、マイクロインジェクション法、または加速粒子を利用する方法から選択され得る。一方で、化学的な送達方法では、複合体形成分子(リン酸カルシウム、脂質、またはタンパク質など)を使用する必要がある。いくつかの実施形態では、ウイルスによる送達方法は、ウイルス(限定されないが、アデノウイルス、レンチウイルス、及びレトロウイルスなど)を使用する遺伝子編集手法に適用される。
本発明は、TFPをコードする核酸分子を含むベクターをさらに提供する。一態様では、TFPベクターを使用して細胞(例えば、T細胞)への直接的な形質導入が行われ得る。一態様では、ベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、例えば、こうしたベクターには、限定されないが、1つ以上のプラスミド(例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体)、レトロウイルスベクターコンストラクト、及びレンチウイルスベクターコンストラクトが含まれる。一態様では、ベクターは、哺乳類T細胞においてTFPコンストラクトを発現させる能力を有する。一態様では、哺乳類T細胞は、ヒトT細胞である。
T細胞の供給源
増殖及び遺伝子改変に先立って、対象からT細胞の供給源が得られる。「対象」という用語は、免疫応答を誘発し得る生体(例えば、哺乳類)を含むことが意図される。対象の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が挙げられる。T細胞は、多くの供給源から得ることができ、こうした供給源には、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍が含まれる。本発明のある特定の態様では、当該技術分野で利用可能な任意の数のT細胞株が使用され得る。本発明のある特定の態様では、当業者に知られる任意の数の手法(Ficoll(商標)による分離など)を使用して対象から収集された血液単位からT細胞を得ることができる。好ましい一態様では、アフェレーシスによって個体の循環血液に由来する細胞が得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、リンパ球(T細胞を含む)、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含む。一態様では、アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄によって血漿画分が除去され、その後の処理ステップに適した緩衝液または培地に細胞が含められ得る。本発明の一態様では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄される。代替の態様では、洗浄溶液はカルシウムを含まず、かつマグネシウムを含み得ないか、またはすべてではないにせよ二価陽イオンの多くを含み得ない。最初の活性化ステップでは、カルシウムを存在させないことが活性化の増強に繋がり得る。当業者なら容易に理解するであろうが、洗浄ステップは、製造者の説明に従って、当業者に知られる方法(半自動化「フロースルー」遠心分離機(例えば、Cobe2991細胞プロセッサー、Baxter CytoMate、またはHaemonetics Cell Saver 5)を使用することによるものなど)によって達成され得る。洗浄後、さまざまな生体適合性緩衝液(例えば、CaもMgも含まないPBS、PlasmaLyteA、または緩衝剤含有もしくは緩衝剤非含有の他の生理食塩水など)に細胞が再浮遊され得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去することができ、細胞が培養培地に直接的に再浮遊される。
増殖及び遺伝子改変に先立って、対象からT細胞の供給源が得られる。「対象」という用語は、免疫応答を誘発し得る生体(例えば、哺乳類)を含むことが意図される。対象の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が挙げられる。T細胞は、多くの供給源から得ることができ、こうした供給源には、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍が含まれる。本発明のある特定の態様では、当該技術分野で利用可能な任意の数のT細胞株が使用され得る。本発明のある特定の態様では、当業者に知られる任意の数の手法(Ficoll(商標)による分離など)を使用して対象から収集された血液単位からT細胞を得ることができる。好ましい一態様では、アフェレーシスによって個体の循環血液に由来する細胞が得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、リンパ球(T細胞を含む)、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含む。一態様では、アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄によって血漿画分が除去され、その後の処理ステップに適した緩衝液または培地に細胞が含められ得る。本発明の一態様では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄される。代替の態様では、洗浄溶液はカルシウムを含まず、かつマグネシウムを含み得ないか、またはすべてではないにせよ二価陽イオンの多くを含み得ない。最初の活性化ステップでは、カルシウムを存在させないことが活性化の増強に繋がり得る。当業者なら容易に理解するであろうが、洗浄ステップは、製造者の説明に従って、当業者に知られる方法(半自動化「フロースルー」遠心分離機(例えば、Cobe2991細胞プロセッサー、Baxter CytoMate、またはHaemonetics Cell Saver 5)を使用することによるものなど)によって達成され得る。洗浄後、さまざまな生体適合性緩衝液(例えば、CaもMgも含まないPBS、PlasmaLyteA、または緩衝剤含有もしくは緩衝剤非含有の他の生理食塩水など)に細胞が再浮遊され得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去することができ、細胞が培養培地に直接的に再浮遊される。
一態様では、T細胞は、赤血球の溶解及び単球の枯渇によって末梢血リンパ球から単離される(例えば、PERCOLLTMグラジエントを介する遠心分離法、または対向流遠心溶出法によって行われる)。正の選択手法または負の選択手法によってT細胞の特定の亜集団(CD3+T細胞、CD28+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD45RA+T細胞、及びCD45RO+T細胞など)がさらに単離され得る。例えば、一態様では、T細胞は、抗CD3/抗CD28(例えば、3×28)結合型ビーズ(DYNABEADS(商標)M−450 CD3/CD28Tなど)と共に、所望のT細胞の正の選択に十分な時間インキュベートすることによって単離される。一態様では、時間は、約30分である。別の態様では、時間は、30分〜36時間以上の範囲であり、そこに介在するすべての整数値を含む。別の態様では、時間は、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、または少なくとも6時間である。さらに別の好ましい態様では、時間は、10〜24時間である。一態様では、インキュベート時間は、24時間である。他の細胞型と比較してT細胞の存在数が少ない任意の状況ではインキュベート時間を長くしてT細胞が単離され得る。こうした状況は、腫瘍組織から腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を単離する場合、または免疫が損なわれた個体からTILを単離する場合などである。さらに、インキュベート時間を長くすると、CD8+T細胞の捕捉効率が向上し得る。したがって、T細胞をCD3/CD28ビーズに結合させる時間を単に短縮もしくは延長し、及び/またはT細胞に対するビーズの比を上昇もしくは低下させることによって(このことについては、本明細書にさらに記載される)、培養開始時点またはプロセス中の他の時点で、T細胞の亜集団を得るための選択、またはT細胞の亜集団に対する選択が優先的に行われ得る。さらに、ビーズ上または他の表面上の抗CD3抗体及び/または抗CD28抗体の比を上昇または低下させることによって、培養開始時点または他の所望の時点で、T細胞の亜集団を得るための選択、またはT細胞の亜集団に対する選択が優先的に行われ得る。本発明との関連では複数回の選択も行われ得ることを当業者なら認識するであろう。ある特定の態様では、選択手順を実施し、「非選択」細胞を活性化プロセス及び増殖プロセスにおいて使用することが望ましくあり得る。「非選択」細胞をさらなる複数回の選択に供すこともできる。
負の選択によるT細胞集団の濃縮は、負の選択を受ける細胞に特有の表面マーカーに指向化された抗体の組み合わせを用いて達成され得る。1つの方法は、負の選択を受ける細胞上に存在する細胞表面マーカーに指向化されたモノクローナル抗体のカクテルを使用する負の磁気免疫粘着またはフローサイトメトリーを介して細胞を選別及び/または選択するものである。例えば、負の選択によってCD4+細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14に対する抗体、CD20に対する抗体、CD11bに対する抗体、CD16に対する抗体、HLA−DRに対する抗体、及びCD8に対する抗体を含む。ある特定の態様では、制御性T細胞(典型的には、発現がCD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+、及びFoxP3+である)の濃縮または正の選択を行うことが望ましくあり得る。あるいは、ある特定の態様では、抗C25結合型ビーズまたは他の同様の選択方法によって制御性T細胞の枯渇が行われる。
一実施形態では、IFN−γ、TNF−アルファ、IL−17A、IL−2、IL−3、IL−4、GM−CSF、IL−10、IL−13、グランザイムB、及びパーフォリンのうちの1つ以上、または他の適切な分子(例えば、他のサイトカイン)を発現するT細胞集団が選択され得る。細胞発現をスクリーニングするための方法は、例えば、PCT公開公報第WO2013/126712号に記載の方法によって決定され得る。
正の選択または負の選択によって所望の細胞集団を単離するために、細胞及び表面(例えば、ビーズなどの粒子)の濃度が変更され得る。ある特定の態様では、ビーズと細胞とが一緒に混合される体積を大幅に減らして(例えば、細胞の濃度を上昇させて)細胞とビーズとが確実に最大限接触するようにすることが望ましくあり得る。例えば、一態様では、20億個細胞/mLの濃度が使用される。一態様では、10億個細胞/mLの濃度が使用される。別の態様では、1億超個細胞/mLが使用される。別の態様では、1千万個細胞/mL、1千5百万個細胞/mL、2千万個細胞/mL、2千5百万個細胞/mL、3千万個細胞/mL、3千5百万個細胞/mL、4千万個細胞/mL、4千5百万個細胞/mL、または5千万個細胞/mLの細胞濃度が使用される。さらなる一態様では、7千5百万個細胞/mL、8千万個細胞/mL、8千5百万個細胞/mL、9千万個細胞/mL、9千5百万個細胞/mL、または1億個細胞/mLの細胞濃度が使用される。別の態様では、1億2千5百万個細胞/mLまたは1億5千万個細胞/mLの濃度が使用され得る。濃度を高めると、細胞収量、細胞活性化、及び細胞増殖が増大し得る。さらに、細胞濃度を高めることで、目的の標的抗原の発現が弱くあり得る細胞(CD28陰性T細胞など)の捕捉効率を向上させることが可能になるか、または腫瘍細胞が多く存在する試料(例えば、白血病血液、腫瘍組織など)に由来する細胞の捕捉効率を向上させることが可能になる。そのような細胞集団は、治療的な価値を有し得、取得することが望ましいと想定される。例えば、細胞濃度を高めることで、CD28の発現が通常は弱いCD8+T細胞の選択効率を向上させることが可能になる。
関連する態様では、細胞濃度を下げることが望ましくあり得る。T細胞と表面(例えば、ビーズなどの粒子)との混合物を大幅に希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用が最小化される。これによって、粒子に結合すべき所望の抗原の発現量が多い細胞が選択される。例えば、CD4+T細胞は、CD28をより高いレベルで発現しており、希釈濃度ではCD8+T細胞と比較して高い効率で捕捉される。一態様では、使用される細胞濃度は5×106個/mLである。他の態様では、使用される濃度は、約1×105個/mL〜1×106個/mL、及びこの範囲に介在する任意の整数値であり得る。他の態様では、細胞は、ローテーター上でさまざまな速度でさまざまな時間、2〜10℃または室温でインキュベートされ得る。
刺激のためのT細胞もまた、洗浄ステップ後に凍結され得る。理論によって拘束されることは望まないが、凍結及びその後の解凍ステップを行うことで、細胞集団における顆粒球及びある程度の単球が除去されることによって均一性が向上した産物が得られる。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップの後、凍結用溶液に細胞が再浮遊され得る。当該技術分野では多くの凍結用溶液及びパラメーターが知られており、こうした状況において有用であろうが、1つの方法は、DMSO含有率20%及びヒト血清アルブミン含有率8%のPBS、またはデキストラン40含有率10%及びデキストロース含有率5%、ヒト血清アルブミン含有率20%、ならびにDMSO含有率7.5%の培養培地、もしくはPlasmalyte−A含有率31.25%、5%デキストロース含有率31.25%、NaCl含有率0.45%、デキストラン40含有率10%及びデキストロース含有率5%、ヒト血清アルブミン含有率20%、ならびにDMSO含有率7.5%の培地、あるいは他の適切な細胞凍結媒体(例えば、Hespan及びPlasmaLyteAを含むもの)を使用し、次に、細胞を1/分の速度で−80℃にして凍結し、液体窒素保管タンクの気相中で保管するというものである。−20℃または液体窒素中で制御を行わずに急速凍結するものに加えて、他の制御凍結方法も使用され得る。ある特定の態様では、凍結保存された細胞は、解凍され、本明細書に記載のように洗浄され、室温での1時間の休息が与えられた後、本発明の方法を使用して活性化される。
本発明との関連では、本明細書に記載のように増殖させる細胞が必要となり得る時点よりも前の時点に対象から血液試料またはアフェレーシス産物の収集を行うことも企図される。したがって、増殖すべき細胞の供給源を必要な任意の時点で収集することができ、所望の細胞(T細胞など)が単離され、T細胞療法から恩恵を受けると想定される任意の数の疾患または状態(本明細書に記載のものなど)に対するT細胞療法において後に使用するために凍結される。一態様では、血液試料またはアフェレーシス産物は、総体的に健康な対象から採取される。ある特定の態様では、血液試料またはアフェレーシス産物は、疾患を発症するリスクがあるが、今のところは疾患を発症していない総体的に健康な対象から採取され、目的細胞が単離され、後に使用するために凍結される。ある特定の態様では、T細胞は、増殖され、凍結され、後の時点で使用され得る。ある特定の態様では、試料は、本明細書に記載の特定の疾患の診断後すぐに、いずれかの治療を行う前に患者から収集される。別の態様では、細胞は、任意の数の適切な治療方法を行う前に、対象から得られた血液試料またはアフェレーシス産物から単離され、こうした治療方法には、限定されないが、薬剤(ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤など)、化学療法、放射線、免疫抑制薬剤(シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びFK506など)、抗体、または他の免疫除去剤(アレムツズマブ、抗CD3抗体、cytoxan、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、及び照射など)を用いて治療するものが含まれる。
本発明の別の態様では、T細胞は、対象の機能性T細胞が残る治療が行われた直後に患者から取得される。これに関しては、ある特定のがん治療、具体的には免疫系が損なわれる薬物での治療が行われてからすぐ(通常ならそうした治療から患者が回復すると想定される期間中)に、エクスビボでの増殖能力について取得T細胞の品質が最適化または改善され得ることが観測されている。同様に、本明細書に記載の方法を使用するエクスビボでの操作の後に、こうした細胞は、生着及びインビボでの増殖が増進する上で好ましい状態とされ得る。したがって、本発明との関連では、この回復期の間に血液細胞(T細胞、樹状細胞、または他の造血系細胞を含む)を収集することが企図される。さらに、ある特定の態様では、動員(例えば、GM−CSFを用いる動員)及びコンディショニングレジメンを使用することで対象においてある状態を創出することができ、こうした状態では、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、及び/または増殖が生じることが好ましく、特に、治療後の規定時間範囲中にこうしたことが生じることが好ましい。細胞型の例としては、T細胞、B細胞、樹状細胞、及び他の免疫系細胞が挙げられる。
T細胞の活性化及び増殖
T細胞の活性化及び増殖は、一般に、例えば、米国特許第6,352,694号、同6,534,055号、同6,905,680号、同6,692,964号、同5,858,358号、同6,887,466号、同6,905,681号、同7,144,575号、同7,067,318号、同7,172,869号、同7,232,566号、同7,175,843号、同5,883,223号、同6,905,874号、同6,797,514号、同6,867,041号、及び同7,572,631号に記載の方法を使用して行われ得る。
T細胞の活性化及び増殖は、一般に、例えば、米国特許第6,352,694号、同6,534,055号、同6,905,680号、同6,692,964号、同5,858,358号、同6,887,466号、同6,905,681号、同7,144,575号、同7,067,318号、同7,172,869号、同7,232,566号、同7,175,843号、同5,883,223号、同6,905,874号、同6,797,514号、同6,867,041号、及び同7,572,631号に記載の方法を使用して行われ得る。
一般に、本発明のT細胞は、CD3/TCR複合体関連シグナルを刺激する薬剤と、T細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドと、が付加された表面と接触させることによって増殖し得る。具体的には、本明細書に記載のようにT細胞集団を刺激することができ、こうした刺激は、表面上に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片または抗CD2抗体と接触させるか、あるいはカルシウムイオノフォアと共にタンパク質キナーゼCアクチベーター(例えば、ブリオスタチン)と接触させるなどすることによって行われる。T細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激については、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞の集団は、T細胞の増殖刺激に適した条件の下で、抗CD3抗体及び抗CD28抗体と接触され得る。CD4+T細胞またはCD8+T細胞のいずれかの増殖を刺激するには、抗CD3抗体及び抗CD28抗体が使用される。抗CD28抗体の例としては、9.3、B−T3、XR−CD28(Diaclone,Besancon,France)が挙げられ、こうした抗CD28抗体は、当該技術分野で一般に知られる他の方法と同様に使用され得る(Berg et al.,Transplant Proc.30(8):3975−3977,1998、Haanen et al.,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999、Garland et al.,J.Immunol.Meth.227(1−2):53−63,1999)。
刺激に曝露された回数が異なるT細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシス末梢血単核球産物は、細胞傷害性または抑制性のT細胞集団(TC、CD8+)と比較してヘルパーT細胞集団(TH、CD4+)を多く含む。CD3受容体及びCD28受容体を刺激することによってT細胞をエクスビボで増殖させると、約8〜9日目に至る前には主にTH細胞からなるT細胞集団が得られる一方で、約8〜9日目以後はTC細胞集団の含量が日増しに高まったT細胞集団が得られる。したがって、治療の目的によっては、主にTH細胞を含むT細胞集団を対象に注入することが有利であり得る。同様に、TC細胞の抗原特異的サブセットが単離されているのであれば、このサブセットの増殖を大幅に進めることが有利であり得る。
さらに、CD4マーカー及びCD8マーカーに加えて、他の表現型マーカーもまた、細胞増殖プロセスの過程で、ごく一部を除いて再現性良く顕著に異なる。したがって、そのような再現性の良さによって、特定の目的に合わせて活性化T細胞産物を調製することが可能になる。
抗TAA TFPが構築されると、さまざまなアッセイを使用して当該分子の活性を評価することができ、こうした活性は、限定されないが、抗原刺激後にT細胞を増殖させ、再刺激がなくてもT細胞の増殖を維持し、適切なインビトロモデル及び動物モデルにおいて抗がん活性を生じさせる能力などである。抗TAA TFPの作用を評価するためのアッセイについては、以下にさらに詳述される。
初代T細胞におけるTFP発現のウエスタンブロット分析を行うことで、モノマー及びダイマーの存在を検出することができる(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453−1464(2009)を参照のこと)。非常に簡潔に記載すると、TFPを発現するT細胞(CD4+T細胞とCD8+T細胞との1:1混合物)をインビトロで10日超増殖させた後、溶解させ、還元条件下でSDS−PAGEが実施される。TFPは、TCR鎖に対する抗体を使用してウエスタンブロットによって検出される。同じT細胞サブセットを非還元条件下でのSDS−PAGE分析に使用することで共有結合ダイマーの形成を評価することが可能になる。
抗原刺激後のTFP+T細胞のインビトロでの増殖は、フローサイトメトリーによって測定され得る。例えば、CD4+T細胞とCD8+T細胞との混合物が、アルファCD3/アルファCD28及びAPCで刺激された後、プロモーターの制御下でGFPを発現するレンチウイルスベクターを用いる形質導入に供されて分析される。プロモーターの例としては、CMV IE遺伝子、EF−1アルファ、ユビキチンC、またはホスホグリセロキナーゼ(PGK)のプロモーターが挙げられる。培養6日目にCD4+T細胞サブセット及び/またはCD8+T細胞サブセットにおけるGFP蛍光がフローサイトメトリーによって評価される(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453−1464(2009)を参照のこと)。あるいは、CD4+T細胞とCD8+T細胞との混合物が、アルファCD3/アルファCD28でコートされた磁気ビーズで0日目に刺激され、2Aリボソームスキッピング配列の使用によってeGFPと共にTFPを発現するバイシストロン性レンチウイルスベクターを使用するTFPの形質導入に1日目に供される。洗浄後、TAA+細胞(例えば、K562細胞)、野生型K562細胞(K562野生型)、または抗CD3抗体及び抗CD28抗体の存在下でhCD32及び4−1BBLを発現するK562細胞(K562−BBL−3/28)、のいずれかを用いて培養物の再刺激が行われる。培養物には外来性のIL−2が1日おきに100IU/mLで添加される。ビーズベースの計数を行ってフローサイトメトリーによってGFP+T細胞の数が数えられる。(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453−1464(2009)を参照のこと)。
再刺激がなくてもTFP+T細胞の増殖が維持されるかということも測定され得る(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453−1464(2009)を参照のこと)。簡潔に記載すると、アルファCD3/アルファCD28でコートされた磁気ビーズを用いた刺激が0日目に行われ、1日目に指定のTFPでの形質導入が行われ、その後、Coulter Multisizer III粒子計測器を使用して培養8日目に平均T細胞体積(fl)が測定される。
動物モデルを使用してTFP−T活性も測定され得る。例えば、異種移植モデルにおいてヒトTAA特異的TFP+T細胞を使用して免疫不全マウスにおけるがん治療が行われる(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453−1464(2009)を参照のこと)。非常に簡潔に記載すると、がんが確立された後、処理群にマウスが無作為化される。異なる数の操作されたT細胞が、NOD/SCID/γ−/−担癌マウスへと1:1の比で同時注射される。T細胞の注射後、マウスに由来する脾臓DNAにおける各ベクターのコピー数が、さまざまな回数で評価される。1週間に1回の間隔で動物のがんが評価される。アルファ−TAA−ゼータTFP+T細胞またはモック形質導入T細胞が注射されたマウスにおいて末梢血TAA+癌細胞の数が測定される。ログランク検定を使用して群ごとの生存曲線が比較される。さらに、T細胞注射から4週間後に、NOD/SCID/γ−/−マウスにおける末梢血中のCD4+T細胞及びCD8+T細胞の絶対数も分析され得る。マウスには、がん細胞が注射され、eGFPに連結されたTFPをコードするバイシストロン性レンチウイルスベクターによってTFPを発現するように操作されたT細胞が3週間後に注射される。T細胞は、注射前にモック形質導入細胞と混合されることによってインプットGFP+T細胞が45〜50%となるように正規化され、フローサイトメトリーによって確認される。1週間に1回の間隔で動物のがんが評価される。ログランク検定を使用してTFP+T細胞群ごとの生存曲線が比較される。
用量依存的TFP治療応答が評価され得る(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453−1464(2009)を参照のこと)。例えば、TFP T細胞、等しい数のモック形質導入T細胞、またはT細胞なしの注射を21日目に行ったマウスにおいて、がんの確立から35〜70日後に末梢血が取得される。末梢血TAA+癌細胞の数を決定するために各群から無作為に選んだマウスの採血が行われた後、35日目及び49日目にマウスが屠殺される。残った動物の評価は57日目及び70日目に行われる。
細胞増殖及びサイトカイン産生の評価については、以前に報告されており、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453−1464(2009)に記載されている。簡潔に記載すると、TFP介在性の増殖の評価は、洗浄したT細胞を、TAA発現細胞またはCD32及びCD137を発現する細胞(KT32−BBL)とT細胞:TAA発現細胞の最終比が2:1となるように混合することによってマイクロタイタープレートにおいて実施される。TAA発現細胞は、使用前にガンマ線照射される。KT32−BBL細胞を含む培養物は、抗CD3(クローンOKT3)モノクローナル抗体及び抗CD28(クローン9.3)モノクローナル抗体が添加されることで、T細胞増殖刺激に対する陽性対象として役立てられ、これは、これらのシグナルによってエクスビボでのCD8+T細胞の増殖が長期的に支援されることによるものである。CountBright(商標)蛍光ビーズ(Invitrogen)及びフローサイトメトリーを製造者の説明に沿って使用して培養物中のT細胞数が数えられる。eGFP−2Aが連結されたTFPを発現させるレンチウイルスベクターで操作されたT細胞を使用することで、GFP発現によってTFP+T細胞が同定される。GFPを発現しないTFP+T細胞については、ビオチン化組換えTAAタンパク質及び二次アビジン−PE結合体を用いてTFP+T細胞が検出される。特異的モノクローナル抗体(BD Biosciences)を用いてT細胞上のCD4+発現及びCD8+発現も同時に検出される。再刺激から24時間後に収集した上清に対するサイトカイン測定が、製造者の説明に従ってヒトTH1/TH2サイトカインサイトメトリービーズアレイキット(BD Biosciences)を使用して実施される。蛍光は、FACScaliburフローサイトメーターを使用して評価され、データは、製造者の説明に従って解析される。
細胞傷害性は、標準的な51Cr放出アッセイによって評価され得る(例えば、Milone et al.,Molecular Therapy 17(8):1453−1464(2009)を参照のこと)。簡潔に記載すると、頻繁に攪拌しながら37℃で2時間、51Cr(NaCrO4としてのもの、New England Nuclear)が標的細胞に組み込まれ、完全RPMI培地で標的細胞が2回洗浄された後、マイクロタイタープレートに蒔かれる。完全RPMIを含むウェル中でエフェクターT細胞が標的細胞とさまざまなエフェクター細胞:標的細胞(E:T)比で混合される。培地のみを含むウェル(自発的放出(SR))、またはtriton−X100界面活性剤の1%溶液を含むウェル(全放出(TR))も追加調製される。37℃での4時間のインキュベート後、各ウェルから上清が収集される。次に、放出された51Crが、ガンマ粒子計測器(Packard Instrument Co.,Waltham,Mass.)を使用して測定される。各条件は、少なくとも3回反復実施され、溶解%=(ER−SR)/(TR−SR)という式(式中、ERは、各実験条件の平均51Cr放出を表す)を使用して溶解パーセントが計算される。
画像化技術を使用して担腫瘍動物モデルにおけるTFPの特異的な輸送及び増加が評価され得る。そのようなアッセイは報告されており、例えば、Barrett et al.,Human Gene Therapy 22:1575−1586(2011)に記載されている。簡潔に記載すると、がん細胞がNOD/SCID/γc−/−(NSG)マウスにIV注射され、その7日後に、TFPコンストラクトを用いた電気穿孔から4時間後のT細胞がマウスにIV注射される。このT細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現するようにレンチウイルスコンストラクトが安定的にトランスフェクションされたものであり、生物発光についてマウスの画像化が行われる。あるいは、がん異種移植モデルにおけるTFP+T細胞の単回注射による治療の有効性及び特異性が下記のように測定され得る:ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するように形質導入されたがん細胞がNSGマウスに注射された後、その7日後に、TAA TFP7を用いた電気穿孔が行われたT細胞が尾静脈に単回注射される。注射後のさまざまな時点で動物の画像化が行われる。例えば、5日目(処理の2日前)及び8日目(TFP+PBLから24時間後)に、代表的なマウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性癌の光子密度ヒートマップが作成され得る。
本明細書の実施例セクションに記載のものならびに当該技術分野で知られるものを含めて、他のアッセイもまた、本開示の抗TAA TFPコンストラクトの評価に使用され得る。
治療への応用
MUC16、IL13Rα2、及びMSLNと関連する疾患及び/または障害
一態様では、本開示は、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNの発現と関連する疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、本開示は、腫瘍の一部がMUC16陰性、IL13Rα2陰性、またはMSLN陰性であり、腫瘍の一部がMUC16陽性、IL13Rα2陽性、またはMSLN陽性である疾患を治療するための方法を提供する。例えば、本開示のTFPは、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNの発現上昇と関連する疾患の治療を受けている対象の治療に有用であり、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNのレベル上昇の治療を受けている対象は、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNのレベル上昇と関連する疾患を患っている。
MUC16、IL13Rα2、及びMSLNと関連する疾患及び/または障害
一態様では、本開示は、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNの発現と関連する疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、本開示は、腫瘍の一部がMUC16陰性、IL13Rα2陰性、またはMSLN陰性であり、腫瘍の一部がMUC16陽性、IL13Rα2陽性、またはMSLN陽性である疾患を治療するための方法を提供する。例えば、本開示のTFPは、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNの発現上昇と関連する疾患の治療を受けている対象の治療に有用であり、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNのレベル上昇の治療を受けている対象は、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNのレベル上昇と関連する疾患を患っている。
一態様では、本開示は、哺乳類T細胞における発現のためのプロモーターに機能可能なように連結された抗TAA TFPを含むベクターに関する。一態様では、本開示は、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNを発現する腫瘍の治療において使用するための、それぞれMUC16 TFP発現組換えT細胞、IL13Rα2 TFP発現組換えT細胞、またはMSLN TFP発現組換えT細胞を提供し、MUC16 TFP発現組換えT細胞、IL13Rα2 TFP発現組換えT細胞、またはMSLN TFP発現組換えT細胞は、MUC16 TFP−T、IL13Rα2 TFP−T、またはMSLN TFP−Tと呼ばれる。一態様では、本開示のMUC16 TFP−T、IL13Rα2 TFP−T、またはMSLN TFP−Tは、その表面に発現した少なくとも1つの本発明のMUC16 TFP、IL13Rα2 TFP、またはMSLN TFPと腫瘍細胞を接触させる能力を有し、その結果、TFP−Tは、腫瘍細胞を標的とし、腫瘍の増殖が抑制される。
一態様では、本開示は、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法に関し、この方法は、本開示の抗MUC16 TFP T細胞、抗IL13Rα2 TFP T細胞、または抗MSLN TFP T細胞と腫瘍細胞を接触させることを含み、その結果、抗原(例えば、がん細胞の表面上に存在するMUC16抗原、IL13Rα2抗原、またはMSLN抗原)に応答してTFP−Tが活性化され、がん細胞を標的とし、腫瘍の増殖が抑制される。
一態様では、本開示は、対象におけるがんを治療する方法に関する。この方法は、本開示の抗TAA TFP T細胞を対象に投与することを含み、その結果、がんが対象において治療される。本発明の抗TAA TFP T細胞によって治療することが可能ながんの一例は、対応するTAAの発現と関連する癌である。一態様では、がんは、中皮腫である。一態様では、がんは、膵癌である。一態様では、がんは、卵巣癌である。一態様では、がんは、胃癌である。一態様では、がんは、肺癌である。一態様では、がんは、子宮内膜癌である。いくつかの実施形態では、抗TAA TFP治療は、1つ以上の追加の治療と組み合わせて行われ得る。
本開示は、TFPを発現するようにT細胞が遺伝子改変され、TFP発現T細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される型の細胞療法を含む。注入された細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を死滅させることが可能である。抗体治療とは異なり、TFP発現T細胞は、インビボで複製することが可能であり、結果的に、腫瘍制御の維持に繋がり得る長期的な存続性が得られる。さまざまな態様において、T細胞は、患者またはその子孫に投与され、患者へのT細胞の投与後、少なくとも1ヶ月間、少なくとも2ヶ月間、少なくとも3ヶ月間、少なくとも4ヶ月間、少なくとも5ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、少なくとも7ヶ月間、少なくとも8ヶ月間、少なくとも9ヶ月間、少なくとも10ヶ月間、少なくとも11ヶ月間、少なくとも12ヶ月間、少なくとも13ヶ月間、少なくとも14ヶ月間、少なくとも15ヶ月間、少なくとも16ヶ月間、少なくとも17ヶ月間、少なくとも18ヶ月間、少なくとも19ヶ月間、少なくとも20ヶ月間、少なくとも21ヶ月間、少なくとも22ヶ月間、少なくとも23ヶ月間、少なくとも2年間、少なくとも3年間、少なくとも4年間、または少なくとも5年間、患者において存続する。
本開示は、TFPを一過性に発現するようにT細胞が改変され(例えば、インビトロで転写されたRNAによって改変される)、TFP発現T細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される型の細胞療法も含む。注入された細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を死滅させることが可能である。したがって、さまざまな態様において、T細胞は、患者に投与され、患者へのT細胞の投与後、1ヶ月未満の期間(例えば、3週間、2週間、または1週間)存在する。
いずれの特定の理論によっても拘束されることは望まないが、TFP発現T細胞によって誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動的または受動的な免疫応答であり得るか、あるいは直接的または間接的な免疫応答に起因するものであり得る。一態様では、TFP形質導入T細胞は、腫瘍関連抗原(TAA)(例えば、MUC16、IL13Rα2、またはMSLN)を発現するヒト癌細胞に応答して生じる特定の炎症促進性サイトカインの分泌及び強力な細胞溶解活性を示し、可溶性TAAによる阻害に抵抗し、バイスタンダー効果による死滅を媒介し、及び/または確立されたヒト腫瘍の退縮を媒介する。例えば、TAA発現腫瘍の不均一領域内の無抗原腫瘍細胞は、隣接する抗原陽性癌細胞に対して既に反応しているTAA再指向化T細胞による間接的な破壊に感受性であり得る。
一態様では、本開示のヒトTFP改変T細胞は、エクスビボでの免疫化及び/または哺乳類におけるインビボでの治療のための型のワクチンであり得る。一態様では、哺乳類は、ヒトである。
エクスビボでの免疫化に関しては、細胞を哺乳類に投与する前に、下記のもののうちの少なくとも1つがインビトロで行われる:i)細胞を増殖させること、ii)TFPをコードする核酸を細胞に導入すること、またはiii)細胞を凍結保存すること。
エクスビボでの手順は、当該技術分野でよく知られており、より完全に以下に論じられる。簡潔に記載すると、細胞は、哺乳類(例えば、ヒト)から単離され、本明細書に開示のTFPを発現させるベクターを用いて遺伝子改変される(すなわち、インビトロで形質導入またはトランスフェクションされる)。TFP改変細胞は、哺乳類レシピエントに投与されることで治療効果を与え得る。哺乳類レシピエントは、ヒトであり得、TFP改変細胞は、レシピエントに対して自家のものであり得る。あるいは、細胞は、レシピエントに対して同種異系、同系、または異種のものであり得る。
造血幹細胞及び前駆細胞をエクスビボで増殖させるための手順は、米国特許第5,199,942号(参照によって本明細書に組み込まれる)に記載されており、本発明の細胞に適用され得る。適切な方法は当該技術分野で他にも知られており、したがって、本発明は、細胞をエクスビボで増殖させる特定の方法のいずれにも限定されない。簡潔に記載すると、エクスビボでのT細胞の培養及び増殖は、(1)収集末梢血または骨髄外植片から哺乳類由来のCD34+造血幹細胞及び前駆細胞を収集すること、及び(2)そのような細胞をエクスビボで増殖させること、を含む。米国特許第5,199,942号に記載の細胞増殖因子に加えて、他の因子(flt3−L、IL−1、IL−3、及びc−kitリガンドなど)も細胞の培養及び増殖に使用され得る。
エクスビボでの免疫化に関して細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本発明は、インビボでの免疫化を行うことで、患者の抗原に対して指向化された免疫応答を誘発するための組成物及び方法も提供する。
一般に、本明細書に記載ように活性化及び増殖させた細胞は、免疫が損なわれている個体で生じる疾患の治療及び予防に利用され得る。具体的には、本発明のTFP改変T細胞は、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNの発現と関連する疾患、障害、及び状態の治療において使用される。ある特定の態様では、本発明の細胞は、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNの発現と関連する疾患、障害、及び状態を発症するリスクを有する患者の治療において使用される。したがって、本発明は、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNの発現と関連する疾患、障害、及び状態を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に対して本開示のTFP改変T細胞を治療的に有効な量で投与することを含む。
一態様では、本開示のTFP−T細胞は、増殖性疾患(がんもしくは悪性腫瘍または前がん性状態など)の治療に使用され得る。一態様では、がんは、中皮腫である。一態様では、がんは、膵癌である。一態様では、がんは、卵巣癌である。一態様では、がんは、胃癌である。一態様では、がんは、肺癌である。一態様では、がんは、乳癌である。一態様では、がんは、子宮内膜癌である。MUC16、IL13Rα2、またはMSLNの発現と関連する別の疾患には、限定されないが、例えば、MUC16、IL13Rα2、またはMSLNを発現する非定型的及び/または非古典的な癌、悪性腫瘍、前がん性状態、あるいは増殖性疾患が含まれる。MUC16、IL13Rα2、またはMSLNの発現と関連する非がん関連徴候には、限定されないが、例えば、自己免疫疾患(例えば、エリテマトーデス)、炎症性障害(アレルギー及び喘息)、炎症性腸疾患、肝硬変、心不全、腹膜感染症、ならびに腹部手術及び移植が含まれる。
本開示のTFP改変T細胞は、単独で投与されるか、あるいは希釈剤及び/または他の成分(IL−2もしくは他のサイトカイン、または細胞集団など)と組み合わせた医薬組成物として投与され得る。
本発明は、TAA発現細胞集団の増殖抑制または低減のための方法も提供し、この方法は、TAA発現細胞を含む細胞集団を、TAA発現細胞に結合する本開示の抗TAA TFP−T細胞と接触させることを含む。いくつかの態様では、本開示は、TAAを発現する癌細胞集団の増殖抑制または低減のための方法を提供し、この方法は、TAA発現癌細胞集団を、TAA発現細胞に結合する本開示の抗TAA TFP−T細胞と接触させることを含む。一態様では、本開示は、腫瘍関連抗原を発現する癌細胞集団の増殖抑制または低減のための方法を提供し、この方法は、TAA発現癌細胞集団を、TAA発現細胞に結合する本開示の抗TAA TFP−T細胞と接触させることを含む。ある特定の態様では、本開示の抗TAA TFP−T細胞は、陰性対象と比較して、TAA発現細胞と関連する癌を有する対象または動物モデルにおいて細胞及び/またはがん細胞の含量、数、量、またはパーセントを少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも65%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、または少なくとも99%低減する。一態様では、対象は、ヒトである。
本開示は、TAA発現細胞と関連する疾患(例えば、TAAを発現する癌)を予防、治療、及び/または管理するための方法も提供し、この方法は、必要な対象に対して、TAA発現細胞に結合する本開示の抗TAA TFP−T細胞を投与することを含む。一態様では、対象は、ヒトである。TAA発現細胞と関連する障害の例としては、限定されないが、自己免疫障害(エリテマトーデスなど)、炎症性障害(アレルギー及び喘息など)、ならびにがん(膵癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、もしくは子宮内膜癌、またはTAAを発現する非定型癌など)が挙げられる。
本開示は、TAA発現細胞と関連する疾患を予防、治療、及び/または管理するための方法も提供し、この方法は、必要な対象に対して、TAA発現細胞に結合する本開示の抗TAA TFP−T細胞を投与することを含む。一態様では、対象は、ヒトである。
本開示は、TAA発現細胞と関連するがんの再発を予防するための方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に対して、TAA発現細胞に結合する本開示の抗TAA TFP−T細胞を投与することを含む。一態様では、方法は、それを必要とする対象に対して、別の治療を有効量で組み合わせて、TAA発現細胞に結合する本明細書に記載の抗TAA TFP−T細胞を有効量で投与することを含む。
併用療法
本明細書に記載のTFP発現細胞は、他の既知の薬剤及び治療と組み合わせて使用され得る。本明細書で使用される「組み合わせて」投与されるとは、対象が障害に罹患している過程において2つ(または3つ以上)の異なる治療が対象に送達されることを意味し、例えば、障害を有すると対象が診断された後であり、かつ障害が治癒するか、もしくは除去されるか、または治療が他の理由で中止される前に、2つ以上の治療が送達されることを意味する。いくつかの実施形態では、1つの治療の送達は、第2の治療の送達が始まった時にも依然として行われており、その結果、投与に関してオーバーラップが存在する。このことは、「同時(simultaneous)送達」または「同時(concurrent)送達」と本明細書で称されることがある。他の実施形態では、一方の治療の送達は、もう一方の治療の送達が始まる前に終了する。いずれかの場合の実施形態のいくつかでは、治療は、組み合わせて行うことで、その有効性が向上する。例えば、第1の治療を行うことなく第2の治療が行われた場合に見られると想定されるものと比較すると、第2の治療の有効性が向上し、例えば、第2の治療を減らしても同等の効果が見られるか、もしくは第2の治療が低減する症状の度合いが上昇し、または類似の状況が第1の治療で見られる。いくつかの実施形態では、送達は、一方の治療がもう一方の治療を行うことなく送達された場合に観測されると想定されるものと比較して、症状の低減度、または障害と関連する他のパラメーターの低減度が大きいものである。2つの治療の効果は、部分的に相加的であるか、完全に相加的であるか、または相加を超え得る。送達は、送達される第1の治療の効果が、第2の治療が送達されるときに依然として検出可能なものであり得る。
本明細書に記載のTFP発現細胞は、他の既知の薬剤及び治療と組み合わせて使用され得る。本明細書で使用される「組み合わせて」投与されるとは、対象が障害に罹患している過程において2つ(または3つ以上)の異なる治療が対象に送達されることを意味し、例えば、障害を有すると対象が診断された後であり、かつ障害が治癒するか、もしくは除去されるか、または治療が他の理由で中止される前に、2つ以上の治療が送達されることを意味する。いくつかの実施形態では、1つの治療の送達は、第2の治療の送達が始まった時にも依然として行われており、その結果、投与に関してオーバーラップが存在する。このことは、「同時(simultaneous)送達」または「同時(concurrent)送達」と本明細書で称されることがある。他の実施形態では、一方の治療の送達は、もう一方の治療の送達が始まる前に終了する。いずれかの場合の実施形態のいくつかでは、治療は、組み合わせて行うことで、その有効性が向上する。例えば、第1の治療を行うことなく第2の治療が行われた場合に見られると想定されるものと比較すると、第2の治療の有効性が向上し、例えば、第2の治療を減らしても同等の効果が見られるか、もしくは第2の治療が低減する症状の度合いが上昇し、または類似の状況が第1の治療で見られる。いくつかの実施形態では、送達は、一方の治療がもう一方の治療を行うことなく送達された場合に観測されると想定されるものと比較して、症状の低減度、または障害と関連する他のパラメーターの低減度が大きいものである。2つの治療の効果は、部分的に相加的であるか、完全に相加的であるか、または相加を超え得る。送達は、送達される第1の治療の効果が、第2の治療が送達されるときに依然として検出可能なものであり得る。
いくつかの実施形態では、「少なくとも1つの追加の治療剤」は、TFP発現細胞を含む。複数のTFPを発現するT細胞も提供され、これらのTFPは、同じもしくは異なる標的抗原に結合するか、または同じ標的抗原上の同じもしくは異なるエピトープに結合する。第1のT細胞サブセットが第1のTFPを発現し、第2のT細胞サブセットが第2のTFPを発現するT細胞集団も提供される。
本明細書に記載のTFP発現細胞、及び少なくとも1つの追加の治療剤は、同じもしくは別々の組成物において同時に投与されるか、または連続的に投与され得る。連続投与については、本明細書に記載のTFP発現細胞は最初に投与され得、追加の薬剤は2番目に投与され得るか、または投与順序が逆にされ得る。
別の態様では、本明細書に記載のTFP発現細胞は、手術、化学療法、放射線、免疫抑制薬剤(シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びFK506など)、抗体、または他の免疫除去剤(アレムツズマブ、抗CD3抗体もしくは他の抗体治療、サイトキシン(cytoxin)、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、及び照射など)と組み合わせる治療レジメンにおいて使用され得る。本明細書に記載のTFP発現細胞は、ペプチドワクチン(Izumoto et al.2008 J Neurosurg 108:963−971に記載のものなど)と組み合わせても使用され得る。別の態様では、本明細書に記載のTFP発現細胞は、骨髄系細胞分化の促進剤(例えば、全トランス型レチノイン酸)、骨髄由来免疫抑制細胞(MDSC)増殖の阻害剤(例えば、c−kit受容体の阻害剤もしくはVEGF阻害剤)、MDSC機能の阻害剤(例えば、COX2阻害剤もしくはホスホジエステラーゼ−5阻害剤)、またはMDSCの治療的除去(例えば、化学療法レジメン(ドキソルビシン及びシクロホスファミドを用いる治療など)を用いるもの)と組み合わせても使用され得る。MDSCの増殖を阻止し得る他の治療剤には、アミノ−ビホスホネート(amino−biphosphonate)、ビホスファネート(biphosphanate)、シルデナフィル及びタダラフィル、ニトロアスピリン、ビタミンD3、ならびにゲムシタビンが含まれる(例えば、Gabrilovich and Nagaraj,Nat.Rev.Immunol,(2009)v9(3):162−174を参照のこと)が含まれる。
一実施形態では、TFP発現細胞の投与と関連する副作用を低減または改善する薬剤が対象に投与され得る。TFP発現細胞の投与と関連する副作用には、限定されないが、サイトカイン放出症候群(CRS)、及び血球貪食性リンパ組織球症(HLH)(マクロファージ活性化症候群(MAS)とも呼ばれる)が含まれる。CRSの症状には、高熱、嘔気、一過性低血圧、低酸素、及び同様のものが含まれる。したがって、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のTFP発現細胞を対象に投与すること、この投与に加えて、TFP発現細胞を用いる治療に起因する可溶性因子のレベル上昇を管理するための薬剤を投与すること、を含み得る。一実施形態では、対象において上昇する可溶性因子は、IFN−γ、TNFα、IL−2、IL−6、及びIL8のうちの1つ以上である。したがって、この副作用を治療するために投与される薬剤は、こうした可溶性因子の1つ以上を中和する薬剤であり得る。そのような薬剤には、限定されないが、ステロイド、TNFαの阻害剤、及びIL−6の阻害剤が含まれる。TNFα阻害剤の一例は、エンタネルセプト(entanercept)である。IL−6阻害剤の一例は、トシリズマブ(toc)である。
一実施形態では、TFP発現細胞の活性を増進する薬剤が対象に投与され得る。例えば、一実施形態では、薬剤は、抑制分子を阻害する薬剤であり得る。抑制分子(例えば、プログラム細胞死1(PD1))は、いくつかの実施形態では、TFP発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低減し得る。抑制分子の例としては、PD1、PD−L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、及びTGFRベータが挙げられる。抑制分子の阻害(例えば、DNAレベル、RNAレベル、またはタンパク質レベルでの阻害によるもの)は、TFP発現細胞の能力を最適化し得る。いくつかの実施形態では、阻害核酸(例えば、dsRNA(例えば、siRNAまたはshRNA)などの阻害核酸)は、TFP発現細胞における抑制分子の発現を阻害するために使用され得る。一実施形態では、阻害剤は、shRNAである。一実施形態では、抑制分子は、TFP発現細胞内で阻害される。こうした実施形態では、抑制分子の発現を阻害するdsRNA分子は、TFPの要素(例えば、TFPの要素のすべて)をコードする核酸に連結される。一実施形態では、抑制シグナルの阻害剤は、例えば、抑制分子に結合する抗体または抗体断片であり得る。例えば、薬剤は、PD1、PD−L1、PD−L2、またはCTLA4に結合する抗体または抗体断片(例えば、イピリムマブ(MDX−010及びMDX−101とも称され、Yervoy(商標)(Bristol−Myers Squibb)として市販されている)、トレメリムマブ(Pfizerから入手可能なIgG2モノクローナル抗体であり、正式にはチシリムマブ(CP−675,206)として知られる))であり得る。一実施形態では、薬剤は、TIM3に結合する抗体または抗体断片である。一実施形態では、薬剤は、LAG3に結合する抗体または抗体断片である。
いくつかの実施形態では、T細胞は、レンチウイルス(例えば、CD4+T細胞またはCD8+T細胞を特異的に標的とするレンチウイルス)を介してインビボで(例えば、遺伝子導入によって)改変され得る(例えば、Zhou et al.,J.Immunol.(2015)195:2493−2501を参照のこと)。
いくつかの実施形態では、TFP発現細胞の活性を増進する薬剤は、例えば、第1のドメイン及び第2のドメインを含む融合タンパク質であり得、第1のドメインは、抑制分子またはその断片であり、第2のドメインは、正のシグナルと関連するポリペプチド(例えば、本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチド)である。いくつかの実施形態では、正のシグナルと関連するポリペプチドは、CD28、CD27、ICOSの共刺激ドメイン(例えば、CD28、CD27、及び/またはICOSの細胞内シグナル伝達ドメイン)、及び/または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、本明細書に記載のもの)(例えば、CD3ゼータの一次シグナル伝達ドメイン)を含み得る。一実施形態では、融合タンパク質は、TFPを発現する細胞と同じ細胞によって発現する。別の実施形態では、融合タンパク質は、細胞(例えば、抗TAA TFPを発現しないT細胞)によって発現する。
医薬組成物
本開示の医薬組成物は、医薬的または生理学的に許容可能な1つ以上の担体、希釈剤、または医薬品添加物と組み合わせて、本明細書に記載のTFP発現細胞(例えば、複数のTFP発現細胞)を含み得る。そのような組成物は、緩衝剤(中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、及び同様のものなど)、糖質(グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトールなど)、タンパク質、ポリペプチド、またはアミノ酸(グリシンなど)、抗酸化剤、キレート剤(EDTAまたはグルタチオンなど)、補助剤(例えば、水酸化アルミニウム)、ならびに保存剤を含み得る。本開示の組成物は、一態様では、静脈内投与向けに製剤化される。
本開示の医薬組成物は、医薬的または生理学的に許容可能な1つ以上の担体、希釈剤、または医薬品添加物と組み合わせて、本明細書に記載のTFP発現細胞(例えば、複数のTFP発現細胞)を含み得る。そのような組成物は、緩衝剤(中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、及び同様のものなど)、糖質(グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトールなど)、タンパク質、ポリペプチド、またはアミノ酸(グリシンなど)、抗酸化剤、キレート剤(EDTAまたはグルタチオンなど)、補助剤(例えば、水酸化アルミニウム)、ならびに保存剤を含み得る。本開示の組成物は、一態様では、静脈内投与向けに製剤化される。
本開示の医薬組成物は、治療(または予防)すべき疾患に適した様式で投与され得る。適切な用量は、臨床試験によって決定され得るが、投与量及び投与頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の型及び重症度などの要因によって決定されることになる。
一実施形態では、医薬組成物は、混入物を実質的に含まず、例えば、混入物が検出可能なレベルで存在しないものであり、存在しないこうした混入物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能なレンチウイルス(RCL)、p24、VSV−G核酸、HIVgag、残留する抗CD3/抗CD28コートビーズ、マウス抗体、プールされたヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培地成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌、及び真菌からなる群から選択される。一実施形態では、細菌は、Alcaligenes faecalis、Candida albicans、Escherichia coli、Haemophilus influenza、Neisseria meningitides、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus、Streptococcus pneumonia、及びA群のStreptococcus pyogenesからなる群から選択される少なくとも1つである。
「免疫学的に有効な量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」、または「治療量」が示される場合、本開示の組成物の正確な投与量は、患者(対象)の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、及び状態の個々の差異を考慮して医師によって決定され得る。本明細書に記載のT細胞を含む医薬組成物は、104〜109個細胞/体重kg、場合によっては105〜106個細胞/体重kg(そうした範囲内のすべての整数値を含む)の用量で投与され得ると、一般には述べることができる。T細胞組成物は、こうした用量で複数回投与されることもあり得る。細胞は、免疫療法で一般に知られる注入手法を使用することによって投与され得る(例えば、Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319:1676,1988を参照のこと)。
ある特定の態様では、活性化T細胞を対象に投与した後、血液を再度採取し(またはアフェレーシスを実施し)、本開示に従ってそこからT細胞を活性化し、こうして活性化及び増殖させたT細胞を患者に再注入することが望ましくあり得る。このプロセスは、数週間ごとに複数回実施され得る。ある特定の態様では、10cc〜400ccの採取血液からT細胞が活性化され得る。ある特定の態様では、20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、または100ccの採取血液からT細胞が活性化される。
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、植え込み、または移植を含めて、任意の簡便な様式で実施され得る。患者への本明細書に記載の組成物の投与は、経動脈的なもの、皮下へのもの、皮内へのもの、腫瘍内へのもの、節内へのもの、髄内へのもの、筋肉内へのもの、静脈内(i.v.)注射によるもの、または腹腔内へのものであり得る。一態様では、本開示のT細胞組成物は、皮内注射または皮下注射によって患者に投与される。一態様では、本開示のT細胞組成物は、i.v.注射によって投与される。T細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接的に注射され得る。
特定の態様例では、対象は、白血球アフェレーシスを受ける可能性があり、エクスビボで白血球が収集、濃縮、または枯渇されて目的細胞(例えば、T細胞)が選択及び/または単離される。こうした単離T細胞は、当該技術分野で知られる方法によって増殖され、本開示のTFPコンストラクトの1つ以上が導入され得るように処理され、それによって本開示のTFP発現T細胞が創出され得る。次に、それを必要とする対象は、高用量化学療法での標準的な治療を受けた後、末梢血幹細胞移植を受け得る。ある特定の態様では、移植後または移植と同時に、増殖した本開示のTFP T細胞が対象に注入される。追加の態様では、増殖した細胞は、手術の前または後に投与される。
患者に施されるべき上記の治療の用量は、治療されている状態の正確な性質及び治療のレシピエントによって変わることになる。ヒトへの投与のための用量調整は、当該技術分野で認められた慣例に従って実施され得る。アレムツズマブの用量は、例えば、一般に、成人患者については1〜約100mgの範囲とされ、通常、1〜30日の期間、毎日投与されることになる。1日の用量は、1日当たり1〜10mgが好ましいが、場合によっては、1日当たり最大で40mgまで用量が増やされ得る(米国特許第6,120,766号に記載されている)。
一実施形態では、TFPがT細胞に導入され(例えば、インビトロ転写を使用して行われる)、対象(例えば、ヒト)に対して、本開示のTFP T細胞が最初に投与され、この本開示のTFP T細胞の1回以上の後続投与が行われ、この1回以上の後続投与は、前の投与から15日が経過するまでに行われ、例えば、前の投与から14日後、13日後、12日後、11日後、10日後、9日後、8日後、7日後、6日後、5日後、4日後、3日後、または2日後に行われる。一実施形態では、本開示のTFP T細胞は、1週間当たり複数回、対象(例えば、ヒト)に投与され、例えば、本開示のTFP T細胞は、1週間当たり2回、3回、または4回、投与される。一実施形態では、TFP T細胞は、1週間当たり複数回(例えば、1週間当たり2回、3回、または4回投与)(本明細書ではサイクルとも称される)対象(例えば、ヒト対象)に投与され、次の1週間はTFP T細胞が投与されることはなく、その後、対象に対して、TFP T細胞の1回以上の追加投与(例えば、1週間に複数回のTFP T細胞の投与)が行われる。別の実施形態では、TFP T細胞が複数回サイクルで対象(例えば、ヒト対象)に投与され、各サイクルの間の期間は、10日未満、9日未満、8日未満、7日未満、6日未満、5日未満、4日未満、または3日未満である。一実施形態では、TFP T細胞は、1週間当たり3回の投与となるように1日おきに投与される。一実施形態では、本開示のTFP T細胞の投与期間は、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、少なくとも8週間、またはそれを超える期間である。
一態様では、TAA TFP T細胞は、レンチウイルスウイルスベクター(レンチウイルスなど)を使用して生成される。こうして生成したTFP−T細胞は、安定的にTFPを発現することになる。
一態様では、TFP T細胞では、形質導入から4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、TFPベクターによる発現が一過性に生じる。TFPの一過性発現は、RNA TFPベクターの送達によって生じ得る。一態様では、TFP RNAによるT細胞への形質導入は、電気穿孔によって行われる。
一過性発現TFP T細胞を使用して治療されている患者(具体的にはマウスscFv含有TFP T細胞で治療されている患者)で生じ得る可能性のある問題は、複数回の治療後に生じるアナフィラキシーである。
この理論によって拘束されないが、そのようなアナフィラキシー応答は、抗TFP液性応答(すなわち、抗IgEアイソタイプを有する抗TFP抗体によるもの)が生じている患者によって誘発され得ると考えられる。患者の抗体産生細胞では、抗原曝露が10〜14日間中断されると、IgGアイソタイプ(アナフィラキシーを誘発しない)からIgEアイソタイプへのクラススイッチが生じると考えられる。
一過性TFP治療の過程で抗TFP抗体応答(RNA形質導入によって生じるものなど)が患者に生じるリスクが高いのであれば、TFP T細胞の注入中断期間が10〜14日を超えないようにすべきである。
サイトカイン放出
サイトカイン放出症候群は、いくつかの疾患または感染症の合併症として生じる全身性の炎症応答症候群の一形態であり、いくつかのモノクローナル抗体薬ならびに養子T細胞療法の有害作用でもある。TFP T細胞は、CAR−T細胞と比較して良好な死滅活性を示し得る。対象に投与されたTFP T細胞は、対象に投与されたCAR−T細胞と比較して良好な死滅活性を示し得る。このことは、CAR−T細胞に勝るTFP T細胞の利点の1つであり得る。TFP T細胞で生じるサイトカイン放出は、CAR−T細胞と比較して少なくあり得る。TFP T細胞が投与された対象で生じるサイトカイン放出は、CAR−T細胞が投与された対象と比較して少なくあり得る。このことは、CAR−T細胞療法に勝るTFP T細胞療法の利点の1つであり得る。TFP T細胞は、CAR−T細胞と比較して同様または良好な死滅活性を示し得、TFP T細胞で生じるサイトカイン放出は、CAR−T細胞と比較して少なくあり得る。対象に投与されたTFP T細胞は、対象に投与されたCAR−T細胞と比較して同様または良好な死滅活性を示し得、この対象で生じるサイトカイン放出は、CAR−T細胞が投与された対象と比較して少なくあり得る。このことは、CAR−T細胞療法に勝るTFP T細胞療法の利点の1つであり得る。
サイトカイン放出症候群は、いくつかの疾患または感染症の合併症として生じる全身性の炎症応答症候群の一形態であり、いくつかのモノクローナル抗体薬ならびに養子T細胞療法の有害作用でもある。TFP T細胞は、CAR−T細胞と比較して良好な死滅活性を示し得る。対象に投与されたTFP T細胞は、対象に投与されたCAR−T細胞と比較して良好な死滅活性を示し得る。このことは、CAR−T細胞に勝るTFP T細胞の利点の1つであり得る。TFP T細胞で生じるサイトカイン放出は、CAR−T細胞と比較して少なくあり得る。TFP T細胞が投与された対象で生じるサイトカイン放出は、CAR−T細胞が投与された対象と比較して少なくあり得る。このことは、CAR−T細胞療法に勝るTFP T細胞療法の利点の1つであり得る。TFP T細胞は、CAR−T細胞と比較して同様または良好な死滅活性を示し得、TFP T細胞で生じるサイトカイン放出は、CAR−T細胞と比較して少なくあり得る。対象に投与されたTFP T細胞は、対象に投与されたCAR−T細胞と比較して同様または良好な死滅活性を示し得、この対象で生じるサイトカイン放出は、CAR−T細胞が投与された対象と比較して少なくあり得る。このことは、CAR−T細胞療法に勝るTFP T細胞療法の利点の1つであり得る。
場合によっては、TFP T細胞を用いる治療で生じるサイトカイン放出は、CAR−T細胞を用いる治療で生じるサイトカイン放出と比較して少ない。いくつかの実施形態では、TFP T細胞を用いる治療で生じるサイトカイン放出は、CAR−T細胞を用いる治療で生じるサイトカイン放出と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%少ない。TFP T細胞を用いるT細胞治療では、CAR−T細胞と比較して、さまざまなサイトカインの放出が少なくあり得る。いくつかの実施形態では、サイトカインは、IL−2、IFN−γ、IL−4、TNF−α、IL−6、IL−13、IL−5、IL−10、sCD137、GM−CSF、MIP−1α、MIP−1β、またはそれらの組み合わせである。場合によっては、TFP T細胞を用いる治療では、CAR−T細胞を用いる治療と比較して、パーフォリン、グランザイムA、グランザイムB、またはそれらの組み合わせの放出が少ない。いくつかの実施形態では、TFP T細胞を用いる治療で放出されるパーフォリン、グランザイムA、またはグランザイムBは、CAR−T細胞を用いる治療と比較して、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、または少なくとも60%少ない。
いくつかの実施形態では、所与のサイトカインについて、同じヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインを含むCAR−T細胞で治療された哺乳類の所与のサイトカインの量と比較して、治療後に放出される所与のサイトカインの量は少なくとも10%少ない。いくつかの実施形態では、所与のサイトカインは、IL−2、IFN−γ、IL−4、TNF−α、IL−6、IL−13、IL−5、IL−10、sCD137、GM−CSF、MIP−1α、MIP−1β、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される1つ以上のサイトカインを含む。
TFP T細胞は、CAR−T細胞と比較して同様または良好な腫瘍細胞死滅活性を示し得る。いくつかの実施形態では、哺乳類における腫瘍増殖が抑制され、その結果、TFPを発現するT細胞で治療された哺乳類と、TFPを発現しないT細胞で治療された哺乳類とが、少なくとも8日間の治療の前に同じ腫瘍サイズを有した場合、当該治療の後に、腫瘍のサイズは、TFPを発現しないT細胞で治療された哺乳類における腫瘍のサイズの最大でも10%、最大でも20%、最大でも30%、最大でも40%、最大でも50%、または最大でも60%である。いくつかの実施形態では、哺乳類における腫瘍増殖は、完全に抑制される。いくつかの実施形態では、哺乳類における腫瘍増殖は、少なくとも20日間、少なくとも30日間、少なくとも40日間、少なくとも50日間、少なくとも60日間、少なくとも70日間、少なくとも80日間、少なくとも90日間、少なくとも100日間、またはそれを超える期間、完全に抑制される。いくつかの実施形態では、TFPで形質導入されたT細胞の集団は、同じヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインを含むCAR−T細胞と比較して同様の量の腫瘍細胞を死滅させる。
TFP T細胞は、TFPを発現しない細胞と比較して異なる遺伝子発現プロファイルを示し得る。場合によっては、TFP T細胞は、CAR−T細胞と比較して同様の遺伝子発現プロファイルを示し得る。いくつかの他の場合では、TFP T細胞は、CAR−T細胞と比較して異なる遺伝子発現プロファイルを示し得る。いくつかの実施形態では、TFPで形質導入されたT細胞の集団は、同じヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインを含むCAR−T細胞と比較して異なる遺伝子発現プロファイルを有する。いくつかの実施形態では、TFPで形質導入されたT細胞における遺伝子の発現レベルは、同じヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインを含むCAR−T細胞における当該遺伝子の発現レベルと比較して異なる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、抗原提示、TCRシグナル伝達、ホメオスタシス、代謝、ケモカインシグナル伝達、サイトカインシグナル伝達、toll様受容体シグナル伝達、MMP及び接着分子シグナル伝達、またはTNFR関連シグナル伝達において機能を有するものである。
本開示は、下記の実験例を参照することによってさらに詳細に説明される。こうした例は、例示のみを目的として提供されており、別段の指定がない限り、限定を意図するものではない。したがって、本開示は、下記の例に限定されるものとしていかなる様式においても解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示内容の結果として明らかとなるいずれか及びすべての変更を包含すると解釈されるべきものである。さらに説明が与えられずとも、当業者なら、前述の説明及び下記の例示的な例を参照すれば、本開示の化合物を調製及び利用し、請求される方法を実施することができると考えられる。下記の実用例は、本開示のさまざまな態様を具体的に挙げるものであり、本開示の残りの部分を限定するものであるとは、いかなる様式においても解釈されない。
実施例1:TFPコンストラクト
短鎖リンカー(SL):AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号2)または長鎖リンカー(LL):AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号3)をコードするDNA配列によってCD3 DNA断片またはTCR DNA断片に連結された抗TAA VHHドメイン(またはSDドメイン)DNA断片をXbaI部位及びEcoR1部位でp510ベクター((System Biosciences(SBI))にクローニングすることによって抗TAA TFPコンストラクトが操作生成され得る。他のベクター(例えば、pLRPOベクター)も使用され得る。
短鎖リンカー(SL):AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号2)または長鎖リンカー(LL):AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE(配列番号3)をコードするDNA配列によってCD3 DNA断片またはTCR DNA断片に連結された抗TAA VHHドメイン(またはSDドメイン)DNA断片をXbaI部位及びEcoR1部位でp510ベクター((System Biosciences(SBI))にクローニングすることによって抗TAA TFPコンストラクトが操作生成され得る。他のベクター(例えば、pLRPOベクター)も使用され得る。
生成される抗TAA TFPコンストラクトの例としては、p510_抗TAA_LL_TCRα(抗TAA VHH−長鎖リンカー−ヒト全長T細胞受容体α鎖)、p510_TAA_LL_TCRαC(抗TAA VHH−長鎖リンカー−ヒトT細胞受容体α定常ドメイン鎖)、p510_抗TAA_LL_TCRβ(抗TAA VHH−長鎖リンカー−ヒト全長T細胞受容体β鎖)、p510_抗TAA_LL_TCRβC(抗TAA VHH−長鎖リンカー−ヒトT細胞受容体β定常ドメイン鎖)、p510_抗TAA_LL_CD3γ(抗TAA VHH−長鎖リンカー−ヒトCD3γ鎖)、p510_抗TAA_LL_CD3δ(抗TAA VHH−長鎖リンカー−ヒトCD3δ鎖)、p510_抗TAA_LL_CD3ε(抗TAA VHH−長鎖リンカー−ヒトCD3ε鎖)、p510_抗TAA_SL_TCRβ(抗TAA VHH−短鎖リンカー−ヒト全長T細胞受容体β鎖)、p510_抗TAA_SL_CD3γ(抗TAA VHH−短鎖リンカー−ヒトCD3γ鎖)、p510_抗TAA_SL_CD3δ(抗TAA VHH−短鎖リンカー−ヒトCD3δ鎖)、p510_抗TAA_SL_CD3ε(抗TAA VHH−短鎖リンカー−ヒトCD3ε鎖)が挙げられる。
本明細書で使用される抗MUC16は、ヒトMUC16特異的scFv(例えば、4H11)であり得る。
対応する抗MUC16 A CARコンストラクト、抗IL13Ra2 A CARコンストラクト、または抗MSLN A CARコンストラクト(p510_抗TAA_28ζ)の例は、抗TAA、部分的CD28細胞外ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD28細胞内ドメイン、及びCD3ゼータをコードする合成DNAをXbaI部位及びEcoR1部位でp510ベクターにクローニングすることによって生成され得る。
さまざまな他のベクターを使用しても融合タンパク質コンストラクトが生成され得る。
実施例2:抗体配列
抗体配列の生成
scFvの生成
ヒト抗TAA IgGまたはヒト化抗TAA IgGを使用することで、TFPコンストラクトのためのscFv配列が生成され得る。ヒトVLドメイン及びヒトVHドメインまたはヒト化VLドメイン及びヒト化VHドメインをコードするDNA配列を得ることができ、Homo sapiensに由来する細胞での発現についてコンストラクトのコドンを任意選択で最適化することができる。scFv中でのVLドメイン及びVHドメインの配置順序は変更され(すなわち、VL−VH配向またはVH−VL配向)、これらの可変ドメインが、「G4S」または「G4S」サブユニットの3つのコピーである(G4S)3によって連結されることでscFvドメインが創出される。抗TAA scFvプラスミドコンストラクトは、Flag、His、または他の親和性タグを任意選択で有し得、HEK293または他の適切なヒト細胞株もしくは哺乳類細胞株へと電気穿孔によって導入され、精製され得る。検証アッセイには、FACSによる結合解析、Proteonを使用する動力学的解析、及びMUC16発現細胞、IL13Rα2発現細胞、またはMSLN発現細胞の染色が含まれる。
抗体配列の生成
scFvの生成
ヒト抗TAA IgGまたはヒト化抗TAA IgGを使用することで、TFPコンストラクトのためのscFv配列が生成され得る。ヒトVLドメイン及びヒトVHドメインまたはヒト化VLドメイン及びヒト化VHドメインをコードするDNA配列を得ることができ、Homo sapiensに由来する細胞での発現についてコンストラクトのコドンを任意選択で最適化することができる。scFv中でのVLドメイン及びVHドメインの配置順序は変更され(すなわち、VL−VH配向またはVH−VL配向)、これらの可変ドメインが、「G4S」または「G4S」サブユニットの3つのコピーである(G4S)3によって連結されることでscFvドメインが創出される。抗TAA scFvプラスミドコンストラクトは、Flag、His、または他の親和性タグを任意選択で有し得、HEK293または他の適切なヒト細胞株もしくは哺乳類細胞株へと電気穿孔によって導入され、精製され得る。検証アッセイには、FACSによる結合解析、Proteonを使用する動力学的解析、及びMUC16発現細胞、IL13Rα2発現細胞、またはMSLN発現細胞の染色が含まれる。
VLドメイン、VHドメイン、及びCDRを含む抗MUC16結合ドメイン、抗IL13Rα2結合ドメイン、または抗MSLN結合ドメインで、本明細書に記載の組成物及び方法で使用され得るものの例は、いくつかの刊行物に記載のもの及び/または商業的な供給源から得られるものであり得る。例えば、3A5及び11D10を含めて、ある特定の抗MUC16抗体は、WO2007/001851に開示されており、当該文献の内容は、参照によって組み込まれる。3A5モノクローナル抗体は、MUC16ポリペプチドの複数部位に結合するものであり、OVCAR−3でのスキャッチャード解析によるその結合親和性は433pMである。VLドメイン及びVHドメイン、CDR、ならびにそれらをコードするヌクレオチド配列の例は、それぞれ下記のモノクローナル抗体のものであり得る:GTX10029、GTX21107、MA5−124525、MA5−11579、25450002、ABIN1584127、ABIN93655、112889、120204、LS−C356195、LS−B6756、TA801241、TA801279、V3494、V3648、666902、666904、HPA065600、AMAb91056。
ヒトIL13Rα2ポリペプチド標準配列は、UniProt受入番号Q14627である。ヒトMUC16ポリペプチド、ヒトIL13Rα2ポリペプチド、またはヒトMSLNポリペプチド、及びその断片またはドメインに特異的に結合する能力を有する抗体ポリペプチドが提供される。抗TAA抗体は、さまざまな技術を使用して生成され得る(例えば、Nicholson et al,1997を参照のこと)。マウス抗TAA抗体が出発材料として使用される場合、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)治療(すなわち、TFP.TAAコンストラクトで形質導入されたT細胞を用いる治療)を受ける対象においてマウス特異的残基がヒト抗マウス抗原(HAMA)応答を誘導し得る臨床状況については、マウス抗TAA抗体をヒト化することが望まれる。ヒト化は、マウス抗TAA抗体に由来するCDR領域を適切なヒト生殖系列アクセプターフレームワークに移植することによって達成され、その際、CDR領域及び/またはフレームワーク領域に対する他の改変が任意選択で含められる。本明細書で提供される抗体及び抗体断片の残基付番は、Kabatに従う(Kabat E.A.et al,1991、Chothia et al,1987)。
単一ドメイン結合物質
ラクダ及び他の単一ドメイン抗体を使用しても、抗MUC16 TFPコンストラクト、抗IL13Rα2 TFPコンストラクト、抗MSLN TFPコンストラクト、または他の抗腫瘍抗原TFPコンストラクトが生成され得る。VHHドメインは、さまざまなTCRサブユニットとの融合に使用され得る。いくつかの実施形態では、単一ドメイン(例えば、VHH)結合物質(表4に示されるものなど)が使用される(例えば、配列番号15、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、配列番号40、配列番号44、配列番号48、配列番号51、配列番号56、配列番号61、配列番号66、配列番号71、配列番号76、配列番号97、または配列番号98を非限定的な例として参照のこと)。抗TAA単一ドメイン抗体の調製については、実施例3及び実施例5にさらに記載される。
ラクダ及び他の単一ドメイン抗体を使用しても、抗MUC16 TFPコンストラクト、抗IL13Rα2 TFPコンストラクト、抗MSLN TFPコンストラクト、または他の抗腫瘍抗原TFPコンストラクトが生成され得る。VHHドメインは、さまざまなTCRサブユニットとの融合に使用され得る。いくつかの実施形態では、単一ドメイン(例えば、VHH)結合物質(表4に示されるものなど)が使用される(例えば、配列番号15、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、配列番号40、配列番号44、配列番号48、配列番号51、配列番号56、配列番号61、配列番号66、配列番号71、配列番号76、配列番号97、または配列番号98を非限定的な例として参照のこと)。抗TAA単一ドメイン抗体の調製については、実施例3及び実施例5にさらに記載される。
TCRサブユニットの供給源
ヒトT細胞受容体(TCR)複合体のサブユニットはすべて、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。ヒトTCR複合体は、CD3−イプシロンポリペプチド、CD3−ガンマポリペプチド、CD3−デルタポリペプチド、CD3−ゼータポリペプチド、TCRアルファ鎖ポリペプチド、及びTCRベータ鎖ポリペプチドを含む。ヒトCD3−イプシロンポリペプチド標準配列は、Uniprot受入番号P07766である。ヒトCD3−ガンマポリペプチド標準配列は、Uniprot受入番号P09693である。ヒトCD3−デルタポリペプチド標準配列は、Uniprot受入番号P043234である。ヒトCD3−ゼータポリペプチド標準配列は、Uniprot受入番号P20963である。ヒトTCRアルファ鎖標準配列は、Uniprot受入番号Q6ISU1である。ヒトTCRベータ鎖C領域標準配列は、Uniprot受入番号P01850であり、ヒトTCRベータ鎖V領域配列は、P04435である。
ヒトT細胞受容体(TCR)複合体のサブユニットはすべて、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。ヒトTCR複合体は、CD3−イプシロンポリペプチド、CD3−ガンマポリペプチド、CD3−デルタポリペプチド、CD3−ゼータポリペプチド、TCRアルファ鎖ポリペプチド、及びTCRベータ鎖ポリペプチドを含む。ヒトCD3−イプシロンポリペプチド標準配列は、Uniprot受入番号P07766である。ヒトCD3−ガンマポリペプチド標準配列は、Uniprot受入番号P09693である。ヒトCD3−デルタポリペプチド標準配列は、Uniprot受入番号P043234である。ヒトCD3−ゼータポリペプチド標準配列は、Uniprot受入番号P20963である。ヒトTCRアルファ鎖標準配列は、Uniprot受入番号Q6ISU1である。ヒトTCRベータ鎖C領域標準配列は、Uniprot受入番号P01850であり、ヒトTCRベータ鎖V領域配列は、P04435である。
ヒトCD3−イプシロンポリペプチド標準配列は下記の配列である:
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI(配列番号4)。
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI(配列番号4)。
ヒトCD3−ガンマポリペプチド標準配列は下記の配列である:
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN(配列番号5)。
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN(配列番号5)。
ヒトCD3−デルタポリペプチド標準配列は下記の配列である:
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNKS(配列番号6)。
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNKS(配列番号6)。
ヒトCD3−ゼータポリペプチド標準配列は下記の配列である:
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(配列番号7)。
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(配列番号7)。
ヒトTCRアルファ鎖標準配列は下記の配列である:
MAGTWLLLLLALGCPALPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWGEGSYLSSYPTCPAQAWCSRSALRAPSSSLGAFFAGDLPPPLQAGAA(配列番号8)。
MAGTWLLLLLALGCPALPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWGEGSYLSSYPTCPAQAWCSRSALRAPSSSLGAFFAGDLPPPLQAGAA(配列番号8)。
ヒトTCRアルファ鎖C領域標準配列は下記の配列である:
PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(配列番号9)。
PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(配列番号9)。
ヒトTCRアルファ鎖V領域CTL−L17標準配列は下記の配列である:
MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAAKGAGTASKLTFGTGTRLQVTL(配列番号10)。
MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAAKGAGTASKLTFGTGTRLQVTL(配列番号10)。
ヒトTCRベータ鎖C領域標準配列は下記の配列である:
EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(配列番号11)。
EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(配列番号11)。
ヒトTCRベータ鎖V領域CTL−L17標準配列は下記の配列である:
MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHNITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLAGLNQPQHFGDGTRLSIL(配列番号12)。
MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHNITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLAGLNQPQHFGDGTRLSIL(配列番号12)。
ヒトTCRベータ鎖V領域YT35標準配列は下記の配列である:
MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSFSTCSANYGYTFGSGTRLTVV(配列番号13)。
MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSFSTCSANYGYTFGSGTRLTVV(配列番号13)。
TCRドメイン及びscFvからのTFPの生成
MUC16 scFv、IL13Rα2 scFv、またはMSLN scFvは、リンカー配列(G4S、(G4S)2(G4S)3、または(G4S)4など)を使用してCD3−イプシロンまたは他のTCRサブユニットと組換えで連結され得る。さまざまなリンカー及びscFv構成が利用され得る。TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖は、全長ポリペプチドまたはその定常ドメインのみのものとしてTFPの生成に使用され得る。TFPの調製には、TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖の任意の可変配列を使用することが可能であり得る。
MUC16 scFv、IL13Rα2 scFv、またはMSLN scFvは、リンカー配列(G4S、(G4S)2(G4S)3、または(G4S)4など)を使用してCD3−イプシロンまたは他のTCRサブユニットと組換えで連結され得る。さまざまなリンカー及びscFv構成が利用され得る。TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖は、全長ポリペプチドまたはその定常ドメインのみのものとしてTFPの生成に使用され得る。TFPの調製には、TCRアルファ鎖及びTCRベータ鎖の任意の可変配列を使用することが可能であり得る。
TFP発現ベクター
プロモーター(サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー−プロモーター)、分泌を可能にするためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター(ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子)、エピソームの複製及び原核生物での複製を可能にするエレメント(例えば、SV40起源のもの及びColE1のものまたは当該技術分野で知られる他のもの)、ならびに選択を可能にするエレメント(アンピシリン耐性遺伝子及びzeocinマーカー)を含む発現ベクターが提供される。
プロモーター(サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー−プロモーター)、分泌を可能にするためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター(ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子)、エピソームの複製及び原核生物での複製を可能にするエレメント(例えば、SV40起源のもの及びColE1のものまたは当該技術分野で知られる他のもの)、ならびに選択を可能にするエレメント(アンピシリン耐性遺伝子及びzeocinマーカー)を含む発現ベクターが提供される。
TFPをコードする核酸コンストラクトは、レンチウイルス発現ベクターにクローニングされ、TAA+標的細胞(「TAA」は、例えば、MUC16、IL13Ra2、またはMSLNである)に応じたTFP.TAA形質導入T細胞(「TAA.TFP」または「TAA.TFP T細胞」または「TFP.TAA」または「TFP.TAA T細胞」)のエフェクターT細胞応答の量及び質に基づいて発現の検証が行われ得る。エフェクターT細胞応答には、限定されないが、細胞増殖、増殖、倍加、サイトカイン産生、及び標的細胞溶解または細胞溶解活性(すなわち、脱顆粒)が含まれる。
抗TAA TFPレンチウイルス導入ベクターを使用することで、VSV−Gシュードタイプ化レンチウイルス粒子にパッケージングされるゲノム物質が生成され得る。レンチウイルス導入ベクターDNAは、Lipofectamine(登録商標)試薬と共にVSV−Gの3つのパッケージング要素(gag/pol、及びrev)と混合されて、まとめて一緒にHEK−293(胎児腎臓、ATCC(登録商標)CRL−1573(商標))細胞にトランスフェクションされる。24時間後及び48時間後に培地が回収され、ろ過され、超遠心分離法によって濃縮される。得られたウイルス調製物は−80℃で保管される。形質導入単位数は、Sup−T1(T細胞リンパ芽球性リンパ腫、ATCC(登録商標)CRL−1942(商標))細胞での力価測定によって決定され得る。新鮮なナイーブT細胞を活性化させ(例えば、抗CD3抗CD28ビーズで24時間活性化させる)、その後に適切な数の形質導入単位を添加して所望のパーセントの形質導入T細胞を得ることによって再指向化TFP T細胞が生成される。こうした改変T細胞は、休ませられ、後の分析に向けて凍結保存されるサイズになるまで増殖させられることになる。細胞の数及びサイズは、Coulter Multisizer(商標)IIIを使用して測定される。凍結保存前に、形質導入された(細胞表面上にTFPを発現する)細胞のパーセント及びその発現の相対蛍光強度がフローサイトメトリー分析によって決定されることになる。TFPの相対発現レベルは、ヒストグラムプロットから、その相対蛍光強度と形質導入パーセントを比較することによって調べられ得る。
いくつかの実施形態では、複数のウイルスベクターを用いてT細胞の形質導入が行われることによって複数のTFPが導入される。
ヒト化TFP再指向化T細胞の細胞溶解活性、増殖能力、及びサイトカイン分泌の評価
TFP T細胞の機能的な能力(細胞表面に発現するTFPを産生する能力、及び標的腫瘍細胞を死滅させ、増殖し、サイトカインを分泌する能力)は、当該技術分野で知られるアッセイを使用して決定され得る。
TFP T細胞の機能的な能力(細胞表面に発現するTFPを産生する能力、及び標的腫瘍細胞を死滅させ、増殖し、サイトカインを分泌する能力)は、当該技術分野で知られるアッセイを使用して決定され得る。
ヒト末梢血単核球(PBMC(例えば、T細胞(CD4+リンパ球及びCD8+リンパ球)を得るための負の選択によってナイーブT細胞が得られることになる正常なアフェレーシスドナーに由来する血液))が、ヒトインターロイキン−2(IL−2)で処理された後、抗CD3×抗CD28ビーズで活性化され(例えば、37℃、5%CO2下、10%RPMI中で活性化される)、その後、TFPコードレンチウイルスベクターでの形質導入に供されることになる。フローサイトメトリーアッセイを使用して細胞表面上のTFPの存在が確認されることになり、この確認は、抗FLAG抗体または抗マウス可変ドメイン抗体などによって行われる。サイトカイン(例えば、IFN−γ)産生は、ELISAまたは他のアッセイを使用して測定されることになる。
実施例3:抗IL13Rα2ナノボディの生成
ライブラリーの構築
免疫化
0日目、7日目、14日目、21日目、28日目、及び35日目にラマの皮下注射を行い、各注射時には、ヒトIgG1のFcドメインと融合した組換えヒトIL13Rα2(hIL13Rα2−Fc)(R&D Systems)を約150μg注射した。GERBU adjuvant P(GERBU Biotechnik GmbH)をアジュバントとして使用した。40日目に、リンパ球調製用に血液約100mlをラマから収集し、抗凝固処理した。
ライブラリーの構築
免疫化
0日目、7日目、14日目、21日目、28日目、及び35日目にラマの皮下注射を行い、各注射時には、ヒトIgG1のFcドメインと融合した組換えヒトIL13Rα2(hIL13Rα2−Fc)(R&D Systems)を約150μg注射した。GERBU adjuvant P(GERBU Biotechnik GmbH)をアジュバントとして使用した。40日目に、リンパ球調製用に血液約100mlをラマから収集し、抗凝固処理した。
VHHライブラリーの構築
抗原特異的ナノボディの存在をスクリーニングするために、ラマリンパ球からVHHライブラリーを構築した。この目的を達成するために、末梢血リンパ球から得られた全RNAを、オリゴ(dT)プライマーを用いる第1鎖cDNA合成のためのテンプレートとして使用した。このcDNAを使用してPCRによってVHHコード配列を増幅し、PstI及びNotIで消化し、ファージミドベクターpMECSのPstI部位及びNotI部位にクローニングした。こうして得られたVHHライブラリーをCore94と命名した。このライブラリーは、約7×108個の独立した形質転換体からなり、これらの形質転換体の100%が、正しい挿入サイズのベクターを保有するものである。
抗原特異的ナノボディの存在をスクリーニングするために、ラマリンパ球からVHHライブラリーを構築した。この目的を達成するために、末梢血リンパ球から得られた全RNAを、オリゴ(dT)プライマーを用いる第1鎖cDNA合成のためのテンプレートとして使用した。このcDNAを使用してPCRによってVHHコード配列を増幅し、PstI及びNotIで消化し、ファージミドベクターpMECSのPstI部位及びNotI部位にクローニングした。こうして得られたVHHライブラリーをCore94と命名した。このライブラリーは、約7×108個の独立した形質転換体からなり、これらの形質転換体の100%が、正しい挿入サイズのベクターを保有するものである。
ヒトIL13Rα2特異的ナノボディの単離
hIL13Rα2抗原でコートされた固相(100mMのNaHCO3(pH8.2)中100μg/ml)に対してCore94ライブラリーのパニングを3ラウンド行った:第Xa因子によってhIL13Rα2−Fc抗原からFcを除去した。ウェル上にコートされた抗原上に残存するあらゆるヒトIgG1 Fcに対するファージの結合、及びあらゆる混入第Xa因子に対するファージの結合を、組換えヒトIgG1Fc(R&D Systems、カタログ番号110−HG)及び第Xa因子(各最終濃度1μM)によって競合させて除去した。抗原でコートされたウェルから溶出したファージミド粒子の数と、陰性対象ウェル(コートされておらず、ブロッキングされたウェル)から溶出したファージミド粒子の数と、を比較することによってパニングの各ラウンド後に抗原特異的ファージの濃縮を評価した。こうした実験から、ファージ集団中の抗原特異的ファージが、1回目のラウンド後、2回目のラウンド後、及び3回目のラウンド後に、それぞれ約7倍、約200倍、及び約1000倍に濃縮されたことが示唆された。全部で190個のコロニー(2ラウンド目から95個、及び3ラウンド目から95個)を無作為に選択し、そのペリプラズム抽出物における抗原特異的ナノボディの存在についてELISA(可溶性ナノボディを含む未精製のペリプラズム抽出物を使用するELISA)によって分析した。ELISAスクリーニングについては、パニングに使用した抗原と同じ抗原を使用し、ブロッキングされた非コートウェル、ならびに組換えヒトIgG1 Fcと第Xa因子との混合物でコートされたウェルを陰性対象として使用して実施した。組換えヒトIgG1 Fc/Xaでコートされたウェルでは、二次抗体(抗マウス抗体)によってわずかなバックグラウンドシグナル(405nmでのOD約0.3)が生じ、これによって5つのクローンがFcに交差反応性を有するものとして分類された。これら190個のコロニーのうち、このアッセイにおいてhIL13Rα2に陽性であるが、hIgG1 Fc/第Xa因子混合物には陰性と判定されたコロニーは141個であった。hIL13Rα2に陽性であるが、hIgG1 Fc/第Xa因子混合物には陰性のこれら141個のコロニーの配列データに基づいて54個の異なる全長ナノボディが識別され、これらの全長ナノボディは、16個の異なるCDR3群(B細胞系譜)に属するものであった。同じCDR3群(同じB細胞系譜)に属するナノボディは非常に類似しており、それらのアミノ酸配列は、そうしたナノボディが、体細胞超変異に起因して生じたクローン的に関連するB細胞に由来するものであるか、あるいは同じB細胞に由来するが、ライブラリー構築中にRTエラー及び/またはPCRエラーに起因して多様化したものであることを示唆している。同じCDR3群に属するナノボディは、同じエピトープを認識するが、それらの他の特徴(例えば、親和性、効力、安定性、発現収量など)は異なり得る。Hisタグ付きヒトIL13Rα1(Acro Biosystems、カタログ番号IL1−H5224)に対するヒトIL13Rα2特異的ナノボディの結合もELISAによって試験した。こうしたELISA実験から、IL13Rα2特異的ナノボディはいずれもヒトIL13Rα1には結合しないことが明らかとなった。こうしたパニングに由来するクローンは、その名称にTIGというコードを有する。
hIL13Rα2抗原でコートされた固相(100mMのNaHCO3(pH8.2)中100μg/ml)に対してCore94ライブラリーのパニングを3ラウンド行った:第Xa因子によってhIL13Rα2−Fc抗原からFcを除去した。ウェル上にコートされた抗原上に残存するあらゆるヒトIgG1 Fcに対するファージの結合、及びあらゆる混入第Xa因子に対するファージの結合を、組換えヒトIgG1Fc(R&D Systems、カタログ番号110−HG)及び第Xa因子(各最終濃度1μM)によって競合させて除去した。抗原でコートされたウェルから溶出したファージミド粒子の数と、陰性対象ウェル(コートされておらず、ブロッキングされたウェル)から溶出したファージミド粒子の数と、を比較することによってパニングの各ラウンド後に抗原特異的ファージの濃縮を評価した。こうした実験から、ファージ集団中の抗原特異的ファージが、1回目のラウンド後、2回目のラウンド後、及び3回目のラウンド後に、それぞれ約7倍、約200倍、及び約1000倍に濃縮されたことが示唆された。全部で190個のコロニー(2ラウンド目から95個、及び3ラウンド目から95個)を無作為に選択し、そのペリプラズム抽出物における抗原特異的ナノボディの存在についてELISA(可溶性ナノボディを含む未精製のペリプラズム抽出物を使用するELISA)によって分析した。ELISAスクリーニングについては、パニングに使用した抗原と同じ抗原を使用し、ブロッキングされた非コートウェル、ならびに組換えヒトIgG1 Fcと第Xa因子との混合物でコートされたウェルを陰性対象として使用して実施した。組換えヒトIgG1 Fc/Xaでコートされたウェルでは、二次抗体(抗マウス抗体)によってわずかなバックグラウンドシグナル(405nmでのOD約0.3)が生じ、これによって5つのクローンがFcに交差反応性を有するものとして分類された。これら190個のコロニーのうち、このアッセイにおいてhIL13Rα2に陽性であるが、hIgG1 Fc/第Xa因子混合物には陰性と判定されたコロニーは141個であった。hIL13Rα2に陽性であるが、hIgG1 Fc/第Xa因子混合物には陰性のこれら141個のコロニーの配列データに基づいて54個の異なる全長ナノボディが識別され、これらの全長ナノボディは、16個の異なるCDR3群(B細胞系譜)に属するものであった。同じCDR3群(同じB細胞系譜)に属するナノボディは非常に類似しており、それらのアミノ酸配列は、そうしたナノボディが、体細胞超変異に起因して生じたクローン的に関連するB細胞に由来するものであるか、あるいは同じB細胞に由来するが、ライブラリー構築中にRTエラー及び/またはPCRエラーに起因して多様化したものであることを示唆している。同じCDR3群に属するナノボディは、同じエピトープを認識するが、それらの他の特徴(例えば、親和性、効力、安定性、発現収量など)は異なり得る。Hisタグ付きヒトIL13Rα1(Acro Biosystems、カタログ番号IL1−H5224)に対するヒトIL13Rα2特異的ナノボディの結合もELISAによって試験した。こうしたELISA実験から、IL13Rα2特異的ナノボディはいずれもヒトIL13Rα1には結合しないことが明らかとなった。こうしたパニングに由来するクローンは、その名称にTIGというコードを有する。
hIL13Rα2特異的ナノボディのフローサイトメトリー分析
ナノボディ及び細胞
上記の最初のELISAスクリーニングを行うために実施した方法と同じ方法で、各抗hIL13Rα2 Nbを得るためのペリプラズム抽出物を調製した。各細胞株(U251_Luc_Mch及びA431_Luc)に由来する細胞を解凍し、洗浄し、数を数えた。各Nbクローンから得られたペリプラズム抽出物を約2×105個の細胞と共にインキュベートした。洗浄後、マウス抗HAタグ抗体と抗マウス−PEとの混合物と共に細胞をインキュベートした。洗浄をもう一回行った後、生死判定染色剤としてToproを各試料に添加し、細胞をフローサイトメーターで分析した。Mab(PE結合型抗IL13Rα2クローン47)(+Topro)を陽性対象として使用した。無関係のNb(BCII10−細菌βラクタマーゼ特異的)を含む試料、すべての検出Mabを含む試料、二次抗マウス−PE Mabを単独で含む試料、及び細胞を単独で含む試料(Topro含有及びTopro非含有)を各細胞株に対する陰性対象とした。
ナノボディ及び細胞
上記の最初のELISAスクリーニングを行うために実施した方法と同じ方法で、各抗hIL13Rα2 Nbを得るためのペリプラズム抽出物を調製した。各細胞株(U251_Luc_Mch及びA431_Luc)に由来する細胞を解凍し、洗浄し、数を数えた。各Nbクローンから得られたペリプラズム抽出物を約2×105個の細胞と共にインキュベートした。洗浄後、マウス抗HAタグ抗体と抗マウス−PEとの混合物と共に細胞をインキュベートした。洗浄をもう一回行った後、生死判定染色剤としてToproを各試料に添加し、細胞をフローサイトメーターで分析した。Mab(PE結合型抗IL13Rα2クローン47)(+Topro)を陽性対象として使用した。無関係のNb(BCII10−細菌βラクタマーゼ特異的)を含む試料、すべての検出Mabを含む試料、二次抗マウス−PE Mabを単独で含む試料、及び細胞を単独で含む試料(Topro含有及びTopro非含有)を各細胞株に対する陰性対象とした。
抗体のヒト化
2つのクローンをヒト化用に選択した。図1は、クローン1及びクローン2の配列アライメントを示し、この配列アライメントには、各クローンの親(非ヒト化)配列及び10個のヒト化バリアントが含まれる。各ヒト化ナノボディの分析はOctetによって行い、この分析では、各ヒト化ナノボディをNi−NTAセンサー上に500nMで固定化し、抗原(IL13Rα2−Fc)の3倍希釈系列(125nM、41.66nM、及び13.86nM)を用いた。実験手順の図面は、図2に示される。図1に示されるヒト化バリアントのそれぞれについてのocted測定値のまとめは、表1(クローン1)及び表2(クローン2)に示される。
2つのクローンをヒト化用に選択した。図1は、クローン1及びクローン2の配列アライメントを示し、この配列アライメントには、各クローンの親(非ヒト化)配列及び10個のヒト化バリアントが含まれる。各ヒト化ナノボディの分析はOctetによって行い、この分析では、各ヒト化ナノボディをNi−NTAセンサー上に500nMで固定化し、抗原(IL13Rα2−Fc)の3倍希釈系列(125nM、41.66nM、及び13.86nM)を用いた。実験手順の図面は、図2に示される。図1に示されるヒト化バリアントのそれぞれについてのocted測定値のまとめは、表1(クローン1)及び表2(クローン2)に示される。
各クローンにつき2つのヒト化配列を追加試験用に選択し、これら2つのヒト化配列は、それぞれ配列番号19〜28及び配列番号35〜43に対応する。
実施例4:抗IL13Rα2ナノボディのインビトロでの活性
実施例3に記載のヒト化sdAbをpLRPO骨格で発現させ、CD3εTFPに組み込んだ。対応するIL13Rα2−TFP T細胞の活性をIL−13発現細胞株(U87)及びIL13Rα2陰性細胞株(A431)で試験した。クローン1 TFP T細胞及びクローン2 TFP T細胞は共に、U87細胞では腫瘍細胞溶解を誘導したが、A431細胞では腫瘍細胞溶解を誘導しなかった(図3A)。
実施例3に記載のヒト化sdAbをpLRPO骨格で発現させ、CD3εTFPに組み込んだ。対応するIL13Rα2−TFP T細胞の活性をIL−13発現細胞株(U87)及びIL13Rα2陰性細胞株(A431)で試験した。クローン1 TFP T細胞及びクローン2 TFP T細胞は共に、U87細胞では腫瘍細胞溶解を誘導したが、A431細胞では腫瘍細胞溶解を誘導しなかった(図3A)。
同じTFP T細胞について、IFNγ及びIL−2の産生を誘導する能力を試験した。図3Bに示されるように、これらのTFP T細胞は、IL13Rα2陰性細胞(A431)ではIFNγまたはIL−2を誘導しなかったが、クローン1 TFP T細胞及びクローン2 TFP T細胞は、3000pg/mlを超えるIFNγ応答、及び約100pg/mlのIL−2低産生を誘発した。U251神経膠芽腫細胞においてこの実験を繰り返したところ、同様の結果が得られた。
実施例5:ヒトMUC16ペプチド:NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPに特異的なナノボディの生成及び同定
材料及び方法
VHHの形質転換、再クローニング、及び発現
組換えpMECS GGを用いる非サプレッサー株(例えば WK6)の形質転換
pMECS GGベクターにクローニングされたナノボディ遺伝子は、PelBシグナル配列をN末端に含み、HAタグ及びHis6タグをC末端に含む(PelBリーダー−ナノボディ−HA−His6)。PelBリーダー配列は、ナノボディをE.coliのペリプラズム間隙へと導き、HAタグ及びHis6タグは、ナノボディの精製及び検出に使用され得る(例えば、ELISA、ウエスタンブロットなどで使用される)。
材料及び方法
VHHの形質転換、再クローニング、及び発現
組換えpMECS GGを用いる非サプレッサー株(例えば WK6)の形質転換
pMECS GGベクターにクローニングされたナノボディ遺伝子は、PelBシグナル配列をN末端に含み、HAタグ及びHis6タグをC末端に含む(PelBリーダー−ナノボディ−HA−His6)。PelBリーダー配列は、ナノボディをE.coliのペリプラズム間隙へと導き、HAタグ及びHis6タグは、ナノボディの精製及び検出に使用され得る(例えば、ELISA、ウエスタンブロットなどで使用される)。
pMECS GGベクターでは、His6タグの下流にアンバー終止コドン(TAG)が存在し、このアンバー終止コドンの下流にM13ファージの遺伝子IIIが存在する。サプレッサーE.coli株(例えばTG1)では、アンバー終止コドンはグルタミンとして読まれ、それ故に、ナノボディは、パニングを行うためのファージコート上でのナノボディのディスプレイを可能にするファージのタンパク質IIIとの融合タンパク質として発現する。非サプレッサーE.coli株(例えば、WK6)では、アンバー終止コドンは終止コドンとして読まれ、それ故に、得られるナノボディは、タンパク質IIIと融合していない。
pMECS GGベクターにクローニングされたナノボディを発現させ、精製するためには、単に、目的ナノボディの遺伝子を含むpMECS GGを調製し、このプラスミドを用いて非サプレッサー株(例えば、WK6)の形質転換を行うのみである。得られるクローンのナノボディの配列がMP057プライマー(5’−TTATGCTTCCGGCTCGTATG−3’)を使用して検証されることでクローンの独自性が検証される。ELISAまたは任意の他の適切なアッセイによって抗原結合能力が再試験される。この時点で、ナノボディ遺伝子を含む組換えpMECS GGベクターを含む非サプレッサー株(例えば、WK6)をナノボディの発現及び精製に使用することができる。
pMECS GGからpHEN6cベクターへのナノボディ遺伝子の再クローニング
プライマー配列:
−プライマーA6E(5’ GAT GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGR GGA GG 3’)。
プライマー配列:
−プライマーA6E(5’ GAT GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGR GGA GG 3’)。
−プライマーPMCF(5’ CTA GTG CGG CCG CTG AGG AGA CGG TGA CCT GGG T 3’)。
−ユニバーサルリバースプライマー(5’ TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C 3’)。
−ユニバーサルフォワードプライマー(5 CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3’)。
テンプレートとしてのナノボディ遺伝子を保有する組換えpMECS GGを含むE.coli、ならびにプライマーA6E及びプライマーPMCFを使用するPCR(PCRサイクル回数は約30であり、各サイクルは、94℃30秒、55℃30秒、及び72℃45秒からなり、PCRの終了時点で72℃10分の伸長反応が行われる)によってナノボディ遺伝子が増幅される。約400bpの断片が増幅される。次に、PCR産物は精製され(例えば、Qiagenから供給されるQiaqQuick PCR精製キットによって精製される)、PstIで一晩消化される。
PCR産物は精製され、BstEIIで一晩消化される(またはFermentasから供給されるEco91Iで消化される)。PCR産物は上記のように精製され、pHEN6cベクターはPstIで3時間消化される。消化されたベクターは上記のように精製された後、BstEIIで2〜3時間消化される。消化されたベクターは、1%のアガロースゲルで泳動され、ゲルからベクターのバンドが切り出され、精製される(例えば、Qiagenから供給されるQiaQuickゲル抽出キットによって精製される)。PCR産物とベクターとがライゲーションされる。このライゲーション反応物を用いてエレクトロコンピテントWK6細胞の形質転換が行われる。LB/寒天/アンピシリン(100μg/ml)/グルコース(1〜2%)プレートを使用して形質転換体が選択される。
ナノボディの発現及び精製:
新たに形質転換されたWK6コロニーは、10〜20mlのLB+アンピシリン(100μg/ml)+グルコース(1%)への植菌に使用され、200〜250rpmで振とうしながら37℃で一晩インキュベートされる。この前培養物が、330mlのTB培地(100μg/mlのアンピシリン、2mMのMgCl2、及び0.1%のグルコースが添加されたもの)に1ml添加され、OD600が0.6〜0.9に達するまで振とう(200〜250rpm)しながら37℃で増殖される。最終濃度が1mMとなるようにIPTGを添加することによってナノボディの発現が誘導され、培養物のインキュベートが、振とうしながら28℃で一晩行われる(約16〜18時間行われ、理想的には一晩の誘導後のOD600は25〜30であるべきである)。
培養物は、8000rpmで8分間遠心分離され、1リットルの培養物から得られるペレットが12mlのTESに再懸濁され、氷上で1時間振とうされる。使用される12mlのTESのそれぞれにつき18mlのTES/4が添加され、さらに1時間(振とうしながら)氷上でさらにインキュベートされた後、4℃、8000rpmで30分間遠心分離される。ペリプラズム間隙から抽出されたタンパク質は上清に含まれる。
新たに形質転換されたWK6コロニーは、10〜20mlのLB+アンピシリン(100μg/ml)+グルコース(1%)への植菌に使用され、200〜250rpmで振とうしながら37℃で一晩インキュベートされる。この前培養物が、330mlのTB培地(100μg/mlのアンピシリン、2mMのMgCl2、及び0.1%のグルコースが添加されたもの)に1ml添加され、OD600が0.6〜0.9に達するまで振とう(200〜250rpm)しながら37℃で増殖される。最終濃度が1mMとなるようにIPTGを添加することによってナノボディの発現が誘導され、培養物のインキュベートが、振とうしながら28℃で一晩行われる(約16〜18時間行われ、理想的には一晩の誘導後のOD600は25〜30であるべきである)。
培養物は、8000rpmで8分間遠心分離され、1リットルの培養物から得られるペレットが12mlのTESに再懸濁され、氷上で1時間振とうされる。使用される12mlのTESのそれぞれにつき18mlのTES/4が添加され、さらに1時間(振とうしながら)氷上でさらにインキュベートされた後、4℃、8000rpmで30分間遠心分離される。ペリプラズム間隙から抽出されたタンパク質は上清に含まれる。
IMACによる精製:
His−selectがPBSで平衡化される:1リットルの培養物から得られるペリプラズム抽出物につき、1mlの樹脂(約2mlのHis−select溶液)が50mlのfalconチューブに添加され、最終体積が50mlとなるようにPBSが添加され、混合された後、2000rpmで2分間遠心分離され、上清が廃棄される。樹脂がPBSで2回洗浄された後、ペリプラズム抽出物が添加され、穏やかに振とうしながら室温で30分〜1時間インキュベートされる(インキュベート時間を長くすると非特異的な結合が生じ得る)。
底にフィルターを備えたPD−10カラム(GE healthcare、カタログ番号17−0435−01)に試料がロードされ、50〜100mlのPBS(使用樹脂1ml当たり50〜100mlのPBS)で洗浄される。溶出は3回実施され(それぞれの溶出時には使用樹脂1ml当たり1mlのPBS/0.5Mイミダゾールが使用される)、PBSに対する透析(カットオフ3500ダルトン)が4℃で一晩行われることでイミダゾールが除去される。
His−selectがPBSで平衡化される:1リットルの培養物から得られるペリプラズム抽出物につき、1mlの樹脂(約2mlのHis−select溶液)が50mlのfalconチューブに添加され、最終体積が50mlとなるようにPBSが添加され、混合された後、2000rpmで2分間遠心分離され、上清が廃棄される。樹脂がPBSで2回洗浄された後、ペリプラズム抽出物が添加され、穏やかに振とうしながら室温で30分〜1時間インキュベートされる(インキュベート時間を長くすると非特異的な結合が生じ得る)。
底にフィルターを備えたPD−10カラム(GE healthcare、カタログ番号17−0435−01)に試料がロードされ、50〜100mlのPBS(使用樹脂1ml当たり50〜100mlのPBS)で洗浄される。溶出は3回実施され(それぞれの溶出時には使用樹脂1ml当たり1mlのPBS/0.5Mイミダゾールが使用される)、PBSに対する透析(カットオフ3500ダルトン)が4℃で一晩行われることでイミダゾールが除去される。
この時点で、溶出試料のOD280を測定することによってタンパク質の量が推定され得る。各クローンの吸光係数は、Expasyプロテオミクスサーバーにおいて一次構造解析の下でprotParamツールによって決定され得る。ナノボディの追加精製は、さまざまな方法によって達成され得る。例えば、Superdex75 16/60へのロードに適した体積(最大4ml)が得られるまで4℃、2000rpmで遠心分離することによって試料が濃縮され得る(Vivaspin(カットオフ5000MW)、Vivascience)。次に、PBSで平衡化されたSuperdex 75 16/60カラムに濃縮試料がロードされる。ピーク画分がプールされ、定量化のために試料のOD280が測定される。約1mg/mlの濃度で一定分量が−20℃で保存される。
免疫化
C末端がKLHに結合したヒトMUC16ペプチド(hMUC16)(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP−C−KLH)及び/またはC末端がビオチン化されたヒトMUC16ペプチド(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP−C−ビオチン)及び/またはN末端がビオチン化されたヒトMUC16ペプチド(ビオチン−NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP)を、0日目、7日目、14日目、21日目、28日目、及び35日目にラマに皮下注射した。ビオチン化ペプチドについては、中和のためのアビジンと注射前に混合した。GERBU adjuvant P(GERBU Biotechnik GmbH)をアジュバントとして使用した。40日目に、リンパ球調製用に血液約100mlをラマから収集し、抗凝固処理した。
C末端がKLHに結合したヒトMUC16ペプチド(hMUC16)(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP−C−KLH)及び/またはC末端がビオチン化されたヒトMUC16ペプチド(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP−C−ビオチン)及び/またはN末端がビオチン化されたヒトMUC16ペプチド(ビオチン−NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP)を、0日目、7日目、14日目、21日目、28日目、及び35日目にラマに皮下注射した。ビオチン化ペプチドについては、中和のためのアビジンと注射前に混合した。GERBU adjuvant P(GERBU Biotechnik GmbH)をアジュバントとして使用した。40日目に、リンパ球調製用に血液約100mlをラマから収集し、抗凝固処理した。
VHHライブラリーの構築
抗原特異的ナノボディの存在をスクリーニングするために、ラマリンパ球からVHHライブラリーを構築した。この目的を達成するために、末梢血リンパ球から得られた全RNAを、オリゴ(dT)プライマーを用いる第1鎖cDNA合成のためのテンプレートとして使用した。このcDNAを使用してPCRによってVHHコード配列を増幅し、SAPIで消化し、ファージミドベクターpMECS−GGのSAPI部位にクローニングした。こうして得られたVHHライブラリーをCore93GGと命名した。このライブラリーは、約108個の独立した形質転換体からなり、これらの形質転換体の約87%が、正しい挿入サイズのベクターを保有するものである。
抗原特異的ナノボディの存在をスクリーニングするために、ラマリンパ球からVHHライブラリーを構築した。この目的を達成するために、末梢血リンパ球から得られた全RNAを、オリゴ(dT)プライマーを用いる第1鎖cDNA合成のためのテンプレートとして使用した。このcDNAを使用してPCRによってVHHコード配列を増幅し、SAPIで消化し、ファージミドベクターpMECS−GGのSAPI部位にクローニングした。こうして得られたVHHライブラリーをCore93GGと命名した。このライブラリーは、約108個の独立した形質転換体からなり、これらの形質転換体の約87%が、正しい挿入サイズのベクターを保有するものである。
ヒトMUC16ペプチド特異的ナノボディの単離
C末端またはN末端のいずれかがビオチン化されたhMUC16ペプチドNFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP(bio−hMUC16)に対してCore93GGライブラリーのパニングを4ラウンド行った。ストレプトアビジンでコートされたプレートとbio−hMUC16ペプチドとを相互作用させた後、ライブラリー由来のファージをプレートに添加した。抗原でコートされたウェルから溶出したファージミド粒子の数と、陰性対象ウェル(ストレプトアビジンでコートされており、ブロッキングされているが、ペプチドを含まないウェル)から溶出したファージミド粒子の数と、を比較することによってパニングの各ラウンド後に抗原特異的ファージの濃縮を評価した。こうした実験から、ファージ集団中の抗原特異的ファージが、2回目のラウンド後に約2倍に濃縮されたことが示唆された。1回目のラウンド後、3回目のラウンド後、及び4回目のラウンド後には濃縮は観測されなかった。全部で380個のコロニー(3ラウンド目から190個、4ラウンド目から190個)を無作為に選択し、そのペリプラズム抽出物における抗原特異的ナノボディの存在についてELISA(可溶性ナノボディを含む未精製のペリプラズム抽出物を使用するELISA)によって分析した。ELISAスクリーニングについては、パニングに使用したペプチドと同じペプチドを使用し、ストレプトアビジンでコートされたブロッキング済のペプチド無添加ウェルを陰性対象として使用して実施した。このアッセイでは、これら380個のコロニーのうち、34個のコロニーが陽性判定された。陽性コロニーの配列データに基づいて6つの異なる全長ナノボディが識別され、これらの全長ナノボディは、2つの異なるCDR3群(B細胞系譜)に属するものであった(Excelファイルを参照のこと)。同じCDR3群(同じB細胞系譜)に属するナノボディは非常に類似しており、それらのアミノ酸配列は、そうしたナノボディが、体細胞超変異に起因して生じたクローン的に関連するB細胞に由来するものであるか、あるいは同じB細胞に由来するが、ライブラリー構築中にRTエラー及び/またはPCRエラーに起因して多様化したものであることを示唆している。同じCDR3群に属するナノボディは、同じエピトープを認識するが、それらの他の特徴(例えば、親和性、効力、安定性、発現収量など)は異なり得る。こうしたパニングに由来するクローンは、その名称にMUというコードを有する。
C末端またはN末端のいずれかがビオチン化されたhMUC16ペプチドNFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP(bio−hMUC16)に対してCore93GGライブラリーのパニングを4ラウンド行った。ストレプトアビジンでコートされたプレートとbio−hMUC16ペプチドとを相互作用させた後、ライブラリー由来のファージをプレートに添加した。抗原でコートされたウェルから溶出したファージミド粒子の数と、陰性対象ウェル(ストレプトアビジンでコートされており、ブロッキングされているが、ペプチドを含まないウェル)から溶出したファージミド粒子の数と、を比較することによってパニングの各ラウンド後に抗原特異的ファージの濃縮を評価した。こうした実験から、ファージ集団中の抗原特異的ファージが、2回目のラウンド後に約2倍に濃縮されたことが示唆された。1回目のラウンド後、3回目のラウンド後、及び4回目のラウンド後には濃縮は観測されなかった。全部で380個のコロニー(3ラウンド目から190個、4ラウンド目から190個)を無作為に選択し、そのペリプラズム抽出物における抗原特異的ナノボディの存在についてELISA(可溶性ナノボディを含む未精製のペリプラズム抽出物を使用するELISA)によって分析した。ELISAスクリーニングについては、パニングに使用したペプチドと同じペプチドを使用し、ストレプトアビジンでコートされたブロッキング済のペプチド無添加ウェルを陰性対象として使用して実施した。このアッセイでは、これら380個のコロニーのうち、34個のコロニーが陽性判定された。陽性コロニーの配列データに基づいて6つの異なる全長ナノボディが識別され、これらの全長ナノボディは、2つの異なるCDR3群(B細胞系譜)に属するものであった(Excelファイルを参照のこと)。同じCDR3群(同じB細胞系譜)に属するナノボディは非常に類似しており、それらのアミノ酸配列は、そうしたナノボディが、体細胞超変異に起因して生じたクローン的に関連するB細胞に由来するものであるか、あるいは同じB細胞に由来するが、ライブラリー構築中にRTエラー及び/またはPCRエラーに起因して多様化したものであることを示唆している。同じCDR3群に属するナノボディは、同じエピトープを認識するが、それらの他の特徴(例えば、親和性、効力、安定性、発現収量など)は異なり得る。こうしたパニングに由来するクローンは、その名称にMUというコードを有する。
hMUC16ペプチド特異的ナノボディのフローサイトメトリー分析
ナノボディ及び細胞
上記の最初のELISAスクリーニングを行うために実施した方法と同じ方法で、各抗hMUC16−ペプチドNbを得るためのペリプラズム抽出物を調製した。各細胞株(SKOV3 Muc16 Luc、OVCAR3 Muc16 Luc、Expi−293、及びJurkat)に由来する細胞を解凍し、洗浄し、数を数えた。各Nbクローンから得られたペリプラズム抽出物を約2×105個の細胞と共にインキュベートした。洗浄後、マウス抗HAタグ抗体と抗マウス−PEとの混合物と共に細胞をインキュベートした。洗浄をもう一回行った後、生死判定染色剤としてToproを各試料に添加し、細胞をフローサイトメーターで分析した。SKOV3 Muc16 Luc細胞及びOVCAR3 Muc16 Luc細胞に対してMab(ヒト抗Muc16−4h11(+抗ヒトIgG−PE+Topro))を陽性対象として使用した。無関係のNb(BCII10−細菌βラクタマーゼ特異的)を含む試料、すべての検出Mabを含む試料、二次抗マウス−PE Mabを単独で含む試料、及び細胞を単独で含む試料(Topro含有及びTopro非含有)を各細胞株に対する陰性対象として使用した。
ナノボディ及び細胞
上記の最初のELISAスクリーニングを行うために実施した方法と同じ方法で、各抗hMUC16−ペプチドNbを得るためのペリプラズム抽出物を調製した。各細胞株(SKOV3 Muc16 Luc、OVCAR3 Muc16 Luc、Expi−293、及びJurkat)に由来する細胞を解凍し、洗浄し、数を数えた。各Nbクローンから得られたペリプラズム抽出物を約2×105個の細胞と共にインキュベートした。洗浄後、マウス抗HAタグ抗体と抗マウス−PEとの混合物と共に細胞をインキュベートした。洗浄をもう一回行った後、生死判定染色剤としてToproを各試料に添加し、細胞をフローサイトメーターで分析した。SKOV3 Muc16 Luc細胞及びOVCAR3 Muc16 Luc細胞に対してMab(ヒト抗Muc16−4h11(+抗ヒトIgG−PE+Topro))を陽性対象として使用した。無関係のNb(BCII10−細菌βラクタマーゼ特異的)を含む試料、すべての検出Mabを含む試料、二次抗マウス−PE Mabを単独で含む試料、及び細胞を単独で含む試料(Topro含有及びTopro非含有)を各細胞株に対する陰性対象として使用した。
実施例6:hMUC16標的に対する抗MUC16 sdAbのスクリーニング
実施例5において得られたVHH結合物質のスクリーニングは、NTAバイオセンサー(ニッケルカラム、方法の概要を示す図面については図5Aを参照のこと)を使用して実施される。Hisタグ付きMUC16 sdAb(3.25μg/ml)がカラムに結合された後、MUC16ペプチドが200nM、100nM、50nM、25nM、6.25nM、1.56nM、及び0nMの濃度でカラムを通過する。緩衝液:Tween(登録商標)20を0.02%含む30℃の1×Corning(登録商標)Cellgro(登録商標)PBS pH7.4(カタログ番号21−040−CM)。センサー:Pall Forte Bio Dip & Read(カタログ18−5102)。
実施例5において得られたVHH結合物質のスクリーニングは、NTAバイオセンサー(ニッケルカラム、方法の概要を示す図面については図5Aを参照のこと)を使用して実施される。Hisタグ付きMUC16 sdAb(3.25μg/ml)がカラムに結合された後、MUC16ペプチドが200nM、100nM、50nM、25nM、6.25nM、1.56nM、及び0nMの濃度でカラムを通過する。緩衝液:Tween(登録商標)20を0.02%含む30℃の1×Corning(登録商標)Cellgro(登録商標)PBS pH7.4(カタログ番号21−040−CM)。センサー:Pall Forte Bio Dip & Read(カタログ18−5102)。
MUC16標的に対する2つのクローン(R3Mu4ラマsdAb及びR3Mu4ヒト化sdAb(図1C)、ならびにR3Mu29ラマsdAb及びR3Mu29ヒト化sdAb(図1D))の飽和結合から、親αMuc16 sdAb及びヒト化αMuc16 sdAbバリアントが、6〜94nMの範囲のKD値を伴ってMUC16細胞外ドメイン(「MUC16細胞外」)ペプチドに対して高親和性結合を示すことが実証されている。ヒト化バリアントによって示された親和性は、それらのそれぞれの親ラマクローンと比較するといくらか失われている。表3にまとめが示される。
実施例7:4H11ツール結合物質と比較して行う抗MUC16結合物質のエピトープビニング
MUC16親R3Mu4 sdAb及びMUC16親R3Mu29 sdAbが、4H11 scFv−Fcツール結合物質(4H11ハイブリドーマ由来)と比較してエピトープが同じまたは異なるものにビン分類されるかどうかを決定するためにサンドイッチアッセイを使用した(図6Aを参照のこと)。
MUC16親R3Mu4 sdAb及びMUC16親R3Mu29 sdAbが、4H11 scFv−Fcツール結合物質(4H11ハイブリドーマ由来)と比較してエピトープが同じまたは異なるものにビン分類されるかどうかを決定するためにサンドイッチアッセイを使用した(図6Aを参照のこと)。
図6Bに示されるように、MUC16 sdAb(親(ラマ)R3Mu4及び親(ラマ)R3Mu29)では4H11ツール結合物質曝露後に結合が生じており、このことは、これらの親sdAbが、4H11 scFv−Fcツール結合物質と比較して、MUC16ペプチドの異なるエピトープを認識するものであり、MUC16ペプチドのエピトープが異なるものにビン分類されることを実証している。抗原(MUC16ペプチド)を用いない陰性対象では結合が生じていないことから、非特異的な結合が生じている可能性は完全に排除されている。図6Cには、これらの親ラマ抗体(R3Mu4及びR3Mu29)の結合エピトープを示す図が示される。
実施例8:MUC16−TFP発現T細胞を用いる前臨床試験
MUC16−TFP発現T細胞を前臨床インビトロ試験において評価した(図7)。細胞結合型のC末端MUC16形態を過剰発現するように形質導入されたSKOV3−MUC16Cterm卵巣癌細胞がMUC16−TFP発現T細胞によって用量依存的な様式で特異的に死滅した一方で、MUC16陰性の親SKOV3細胞はMUC16−TFP発現T細胞介在性の死滅を受けることなく残った。同様に、細胞結合形態のMUC16を過剰発現するOVCAR3−MUC16−Cterm細胞は、MUC16−TFP発現T細胞によって排除された。MUC16の発現レベルが低い親OVCAR3細胞は、TFP−T細胞:標的細胞比が最大のときにのみ死滅しており、このことは、腫瘍細胞が用量依存的に溶解することを明確に示している。同様に、TFP−T細胞は、標的細胞上にMUC16が存在するときにのみサイトカインを放出した。図8は、MUC16を高レベルで発現する卵巣細胞株及びMUC16を低レベルで発現する卵巣細胞株を使用する細胞アッセイにおけるMUC16−TFPの効力を示す実験データ例を示す。こうした試験では、腫瘍細胞表面上のMUC16のレベルに応じてMUC16−TFPが死滅を優先的に引き起こす能力を有することが観測された。より明確には、MUC16を高発現する腫瘍細胞をMUC16−TFPが用量依存的な様式で死滅させることが観測された一方で、MUC16を低発現する細胞をMUC16−TFPが死滅させることは、こうしたアッセイで使用した用量レベルでは観測されなかった。
MUC16−TFP発現T細胞を前臨床インビトロ試験において評価した(図7)。細胞結合型のC末端MUC16形態を過剰発現するように形質導入されたSKOV3−MUC16Cterm卵巣癌細胞がMUC16−TFP発現T細胞によって用量依存的な様式で特異的に死滅した一方で、MUC16陰性の親SKOV3細胞はMUC16−TFP発現T細胞介在性の死滅を受けることなく残った。同様に、細胞結合形態のMUC16を過剰発現するOVCAR3−MUC16−Cterm細胞は、MUC16−TFP発現T細胞によって排除された。MUC16の発現レベルが低い親OVCAR3細胞は、TFP−T細胞:標的細胞比が最大のときにのみ死滅しており、このことは、腫瘍細胞が用量依存的に溶解することを明確に示している。同様に、TFP−T細胞は、標的細胞上にMUC16が存在するときにのみサイトカインを放出した。図8は、MUC16を高レベルで発現する卵巣細胞株及びMUC16を低レベルで発現する卵巣細胞株を使用する細胞アッセイにおけるMUC16−TFPの効力を示す実験データ例を示す。こうした試験では、腫瘍細胞表面上のMUC16のレベルに応じてMUC16−TFPが死滅を優先的に引き起こす能力を有することが観測された。より明確には、MUC16を高発現する腫瘍細胞をMUC16−TFPが用量依存的な様式で死滅させることが観測された一方で、MUC16を低発現する細胞をMUC16−TFPが死滅させることは、こうしたアッセイで使用した用量レベルでは観測されなかった。
実施例9.フローサイトメトリーベースのMUC16細胞外コピー数の定量化
細胞結合型のC末端MUC16形態(MUC16細胞外)に特異的な抗体4H11を、米国特許第9,169,328号に従って生成させた後、PEと結合させた。抗体当たりの平均PE分子数は約1と推定された。卵巣癌細胞株(OVCAR3及びSKOV3)、またはMUC16細胞外を安定的に過剰発現する派生体(OVCAR3−MUC16細胞外細胞及びSKOV3−MUC16細胞外細胞)を、試料当たり2μgの4H11−PE Abを用いて染色した。製造者の説明に従ってQuantibrite Beads PE Fluorescence Quantitationキット(BD Bioscience)によって細胞表面MUC16細胞外のコピー数を推定した。4H11−PE抗体で染色した腫瘍細胞をQuantibriteビーズと一緒にFortessa(登録商標)X−20で分析した。細胞ならびにビーズについて蛍光強度の幾何学的中央値(gMFI)を計算した。ビーズストックは、ビーズ当たりのPE分子数が異なるように製造された4つの集団(高、中、低、無)を含む。各ビーズセットについて、測定したMFIに対するビーズ当たりの所与のPE分子コピー数に基づいて標準曲線を作成した。次に、ビーズを用いて作成した標準曲線に基づいて腫瘍細胞上のMUC16細胞外のコピー数を推定した。OVCAR3細胞、OVCAR3−MUC16細胞外細胞、SKOV3細胞、及びSKOV3−MUC16細胞外細胞上のMUC16細胞外のコピー数を、それぞれ726、3616、39、及び2351と決定した(図9B)。
細胞結合型のC末端MUC16形態(MUC16細胞外)に特異的な抗体4H11を、米国特許第9,169,328号に従って生成させた後、PEと結合させた。抗体当たりの平均PE分子数は約1と推定された。卵巣癌細胞株(OVCAR3及びSKOV3)、またはMUC16細胞外を安定的に過剰発現する派生体(OVCAR3−MUC16細胞外細胞及びSKOV3−MUC16細胞外細胞)を、試料当たり2μgの4H11−PE Abを用いて染色した。製造者の説明に従ってQuantibrite Beads PE Fluorescence Quantitationキット(BD Bioscience)によって細胞表面MUC16細胞外のコピー数を推定した。4H11−PE抗体で染色した腫瘍細胞をQuantibriteビーズと一緒にFortessa(登録商標)X−20で分析した。細胞ならびにビーズについて蛍光強度の幾何学的中央値(gMFI)を計算した。ビーズストックは、ビーズ当たりのPE分子数が異なるように製造された4つの集団(高、中、低、無)を含む。各ビーズセットについて、測定したMFIに対するビーズ当たりの所与のPE分子コピー数に基づいて標準曲線を作成した。次に、ビーズを用いて作成した標準曲線に基づいて腫瘍細胞上のMUC16細胞外のコピー数を推定した。OVCAR3細胞、OVCAR3−MUC16細胞外細胞、SKOV3細胞、及びSKOV3−MUC16細胞外細胞上のMUC16細胞外のコピー数を、それぞれ726、3616、39、及び2351と決定した(図9B)。
実施例10.MUC16−TFP T細胞によるMUC16細胞外特異的な腫瘍細胞溶解
MUC16−TFP T細胞によるMUC16細胞外特異的な腫瘍細胞溶解をインビトロ細胞傷害性アッセイによって評価した。MUC16細胞外を発現する腫瘍細胞株、またはMUC16細胞外を発現しない腫瘍細胞株に対して、レポーターとしてホタルルシフェラーゼを発現するように、安定的な形質導入を行った。24時間の共培養後、共培養した細胞のルシフェラーゼ活性を、残存する生存腫瘍細胞の代替指標としてBright−Glo(商標)Luciferase Assay System(Promega、カタログ番号E2610)を用いて決定した。次に、下記の式を用いて腫瘍細胞の死滅パーセントを計算した:腫瘍細胞溶解%=100%×[1−RLU(腫瘍細胞+T細胞)/RLU(腫瘍細胞)]。
MUC16−TFP T細胞によるMUC16細胞外特異的な腫瘍細胞溶解をインビトロ細胞傷害性アッセイによって評価した。MUC16細胞外を発現する腫瘍細胞株、またはMUC16細胞外を発現しない腫瘍細胞株に対して、レポーターとしてホタルルシフェラーゼを発現するように、安定的な形質導入を行った。24時間の共培養後、共培養した細胞のルシフェラーゼ活性を、残存する生存腫瘍細胞の代替指標としてBright−Glo(商標)Luciferase Assay System(Promega、カタログ番号E2610)を用いて決定した。次に、下記の式を用いて腫瘍細胞の死滅パーセントを計算した:腫瘍細胞溶解%=100%×[1−RLU(腫瘍細胞+T細胞)/RLU(腫瘍細胞)]。
MUC16−TFP発現T細胞によってSKOV3−MUC16細胞外細胞が特異的に死滅した(図10A)一方で、親SKOV3細胞は、MUC16−TFP発現T細胞介在性の死滅を受けることなく残った(図10B)。同様に、細胞結合形態のMUC16を過剰発現するOVCAR3−MUC16細胞外細胞は、MUC16−TFP発現T細胞によって排除された(図10C)。MUC16細胞外の発現レベルが低い親OVCAR3細胞の死滅は部分的なものにすぎなかった(図10D)。
実施例11.MUC16−TFP T細胞によるMUC16細胞外特異的なサイトカイン産生
MUC16細胞外を発現するさまざまな腫瘍細胞、またはMUC16細胞外を発現しないさまざまな腫瘍細胞と、MUC16−TFP T細胞と、の共培養物から収集した上清について、MUC16−TFP T細胞によるMUC16細胞外特異的なサイトカイン産生を決定した。この上清におけるヒトのIFN−γ及びIL−2のレベルを、MAGPIX Luminex(登録商標)xMAP Technology(EMD Millipore)を使用して分析し、この分析では、2プレックスキット(Millipore、カタログ番号HCYTOMAG−60K)を用いた。
MUC16細胞外を発現するさまざまな腫瘍細胞、またはMUC16細胞外を発現しないさまざまな腫瘍細胞と、MUC16−TFP T細胞と、の共培養物から収集した上清について、MUC16−TFP T細胞によるMUC16細胞外特異的なサイトカイン産生を決定した。この上清におけるヒトのIFN−γ及びIL−2のレベルを、MAGPIX Luminex(登録商標)xMAP Technology(EMD Millipore)を使用して分析し、この分析では、2プレックスキット(Millipore、カタログ番号HCYTOMAG−60K)を用いた。
MUC16−TFP発現T細胞は、抗原特異的な様式で炎症促進性サイトカインを分泌した。MUC16−TFP発現T細胞は、SKOV3−MUC16細胞外細胞と共培養されるとIFN−γ及びIL−2を分泌し(それぞれ図11A及び図11E)、またはOVCAR3−MUC16細胞外細胞と共培養されるとIFN−γ及びIL−2を分泌したが(それぞれ図11C及び図11G)、SKOV3細胞との共培養ではIFN−γ及びIL−2を分泌せず(それぞれ図11B及び図11F)、またはOVCAR3細胞との共培養ではIFN−γ及びIL−2を分泌しなかった(それぞれ図11D及び図11H)。
実施例12.MUC16−TFP発現T細胞のMUC16細胞外特異的な増殖
T細胞追跡シグナルの希釈(CellTrace(商標)のシグナル強度の減少)をフローサイトメトリー分析によって監視することによってMUC16−TFP T細胞がMUC16細胞外特異的に増殖するかを決定した。MUC16−TFP発現T細胞をCellTrace(商標)Far Red Proliferationキット(カタログ番号C34564ThermoFisher)で標識した後、SKOV3細胞またはSKOV3−MUC16細胞外細胞と1:1の比で3日間共培養した。CellTrace Far Red Proliferationキットで標識したMUC16−TFP発現T細胞を、培地単独、またはプレートに1μg/mLで結合させた抗CD3抗体(クローンOKT−3、カタログ番号14−0037−82、Invitrogen)で3日間刺激することも行った。MUC16−TFP発現T細胞はMUC16細胞外特異的に増殖することが示され、このことは、SKOV3−MUC16細胞外細胞との共培養時にはCellTracerシグナルが減少するが、SKOV3細胞との共培養時にはこの減少が生じないことによって実証された(図12)。
T細胞追跡シグナルの希釈(CellTrace(商標)のシグナル強度の減少)をフローサイトメトリー分析によって監視することによってMUC16−TFP T細胞がMUC16細胞外特異的に増殖するかを決定した。MUC16−TFP発現T細胞をCellTrace(商標)Far Red Proliferationキット(カタログ番号C34564ThermoFisher)で標識した後、SKOV3細胞またはSKOV3−MUC16細胞外細胞と1:1の比で3日間共培養した。CellTrace Far Red Proliferationキットで標識したMUC16−TFP発現T細胞を、培地単独、またはプレートに1μg/mLで結合させた抗CD3抗体(クローンOKT−3、カタログ番号14−0037−82、Invitrogen)で3日間刺激することも行った。MUC16−TFP発現T細胞はMUC16細胞外特異的に増殖することが示され、このことは、SKOV3−MUC16細胞外細胞との共培養時にはCellTracerシグナルが減少するが、SKOV3細胞との共培養時にはこの減少が生じないことによって実証された(図12)。
実施例13.MUC16−TFP T細胞のインビボでの活性
ヒト卵巣癌細胞株(SKOV3−MUC16細胞外細胞及びOVCAR3−MUC16細胞外細胞)のNSGマウス異種移植モデルにおいてMUC16−TFP発現T細胞を評価した。6週齢の雌性NSG(NOD.Cg−PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ、The Jackson Laboratory、ストック番号005557)マウスの腹腔内にSKOV3−MUC16細胞外細胞(5×105個細胞/マウス)もしくはOVCAR3−MUC16細胞外細胞(5×106個細胞/マウス)を接種するか、または当該マウスの皮下にSKOV3−MUC16細胞外細胞(5×106個細胞/マウス、Matrigel(登録商標)との1:1混合物)を接種した。腹腔内モデルについては、PBSで希釈した0.2mlのルシフェリン基質(VWR)(150mg/kg)を腹腔内注射して生物発光画像化法(BLI)によって腫瘍量を決定した。皮下モデルの腫瘍量は、腫瘍体積としてノギスで測定した。腫瘍モデルが確立された時点で(腹腔内モデル:BLIシグナル>108;皮下モデル:腫瘍体積>75mm3)、MUC16−TFP発現T細胞(MUC16 TFP1及びMUC16 TFP2)もしくは非形質導入T細胞(NT)をマウス当たり107個のT細胞用量で静脈内注射するか、または媒体(PBS)を静脈内注射した。
ヒト卵巣癌細胞株(SKOV3−MUC16細胞外細胞及びOVCAR3−MUC16細胞外細胞)のNSGマウス異種移植モデルにおいてMUC16−TFP発現T細胞を評価した。6週齢の雌性NSG(NOD.Cg−PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ、The Jackson Laboratory、ストック番号005557)マウスの腹腔内にSKOV3−MUC16細胞外細胞(5×105個細胞/マウス)もしくはOVCAR3−MUC16細胞外細胞(5×106個細胞/マウス)を接種するか、または当該マウスの皮下にSKOV3−MUC16細胞外細胞(5×106個細胞/マウス、Matrigel(登録商標)との1:1混合物)を接種した。腹腔内モデルについては、PBSで希釈した0.2mlのルシフェリン基質(VWR)(150mg/kg)を腹腔内注射して生物発光画像化法(BLI)によって腫瘍量を決定した。皮下モデルの腫瘍量は、腫瘍体積としてノギスで測定した。腫瘍モデルが確立された時点で(腹腔内モデル:BLIシグナル>108;皮下モデル:腫瘍体積>75mm3)、MUC16−TFP発現T細胞(MUC16 TFP1及びMUC16 TFP2)もしくは非形質導入T細胞(NT)をマウス当たり107個のT細胞用量で静脈内注射するか、または媒体(PBS)を静脈内注射した。
SKOV3−MUC16細胞外細胞及びOVCAR3−MUC16細胞外細胞の腹腔内モデル及び皮下モデルにわたってMUC16 TFP発現T細胞のインビボでの有効性が観測された。SKOV3−MUC16細胞外細胞の腹腔内モデルでは、0日目(T細胞の注射日)のベースラインレベルと比較するとMUC16 TFP1が腫瘍量を有意に低減することが示された(図13A)。この結果と一致して、MUC16 TFP1は、NT T細胞と比較してSKOV3−MUC16細胞外細胞の皮下モデルにおいて腫瘍増殖を有意に遅延させた(図13B)。OVCAR3−MUC16細胞外細胞の腹腔内モデルでは、MUC16 TFP1及びMUC16 TFP2は共に、マウスから腫瘍を完全に消失させた(図13C)。
実施例14:抗MUC16単一ドメイン抗体Fc融合タンパク質を使用する正常ヒト組織の免疫組織化学染色
この試験の目的は、正常ヒト組織のMUC16発現に関する情報を得ることとした。
この試験の目的は、正常ヒト組織のMUC16発現に関する情報を得ることとした。
HRP結合型抗マウスFc二次抗体を使用して検出するためのマウスFc領域と遺伝子的に融合した抗MUC16単一ドメイン抗体を用いて対照材料及びFFPE切片を染色した。2人のドナーから得られたヒト卵巣腫瘍のFFPE切片を陽性対象とした。陰性対象は、ヒト心臓のFFPE切片とした。試験した組織の一団には、下記のものが含まれる:1人のドナーごとから得られる血液細胞、小脳または大脳皮質、胃腸管(食道、小腸、胃、結腸(入手可能な場合))、脾臓、腎臓(糸球体、尿細管)、肝臓、リンパ節、皮膚、胎盤、精巣、及び扁桃腺。
結果:異なるドナーから得られた2つのヒト卵巣癌組織を陽性対象として使用し、これらのヒト卵巣癌組織は、新生物性の細胞膜及び細胞質については、1〜3+(低頻度〜高頻度)及び1〜4+(低頻度〜高頻度)の範囲の異なる強度で染色された。正常組織については、1)ヒト胃上皮、胃壁(細胞質、細胞質顆粒)− 1〜2+(低頻度〜高頻度)、ならびに2)ヒト扁桃腺上皮表面、扁桃陰窩(膜、細胞質、及び他の構成要素)− 1〜3+(超低頻度〜低頻度)、の2つを除けば、すべてがMUC16染色に陰性であった。
こうしたデータは、MUC16の発現が正常ヒト組織では限られたものであり、ある特定の腫瘍でMUC16の発現が上昇することを実証している。これによって、MUC16が、MUC16陽性悪性腫瘍のがん治療のための魅力的な標的となっている。MUC16特異的単一ドメイン抗体は、抗原陽性組織に結合し、それを染色することが可能であった。
実施例15:臨床試験
再発疾患または難治性疾患を伴って切除不能の卵巣癌を有する患者が、MUC16 TFP発現T細胞の臨床試験に参加することになる。最初の試験では、MUC16 TFP発現T細胞の安全性プロファイル、ならびに細胞動態及び薬力学アウトカムについて調査されることになる。そうした結果の知見からさらなる試験の用量が選択されることになり、次に、この用量が、切除不能の卵巣癌を有する患者のより大きなコホートに投与されてMUC16 TFP発現T細胞の有効性プロファイルが定義されることになる。
再発疾患または難治性疾患を伴って切除不能の卵巣癌を有する患者が、MUC16 TFP発現T細胞の臨床試験に参加することになる。最初の試験では、MUC16 TFP発現T細胞の安全性プロファイル、ならびに細胞動態及び薬力学アウトカムについて調査されることになる。そうした結果の知見からさらなる試験の用量が選択されることになり、次に、この用量が、切除不能の卵巣癌を有する患者のより大きなコホートに投与されてMUC16 TFP発現T細胞の有効性プロファイルが定義されることになる。
実施例16:抗MSLN TFP T細胞は、MSLNを高発現する腫瘍細胞を優先的に死滅させる。
MSLN高発現腫瘍(MSTO−MSLN高(表面MSLNのコピー数11006))に対するMSLN−TFP T細胞の死滅誘発能力と、MSLN低発現腫瘍(MSTO−MSLN低(表面MSLNのコピー数198))に対するMSLN−TFP T細胞の死滅誘発能力と、の差異を、MSTO−MSLN高腫瘍またはMSTO−MSLN低腫瘍のいずれかを有するNSGマウスにおいて調べた。
MSLN高発現腫瘍(MSTO−MSLN高(表面MSLNのコピー数11006))に対するMSLN−TFP T細胞の死滅誘発能力と、MSLN低発現腫瘍(MSTO−MSLN低(表面MSLNのコピー数198))に対するMSLN−TFP T細胞の死滅誘発能力と、の差異を、MSTO−MSLN高腫瘍またはMSTO−MSLN低腫瘍のいずれかを有するNSGマウスにおいて調べた。
MSTO−MSLN高細胞及びMSTO−MSLN低細胞を1×106個細胞/100μLの濃度で滅菌PBS(pH7.4)に再浮遊させた。次に、このPBS細胞浮遊液を氷冷Matrigel(登録商標)と1:1で混合し、最終注射体積をマウス当たり200μLとした。滅菌PBS/Matrigel(登録商標)における腫瘍細胞浮遊液200μLをすべての動物の背側及び腹側部に皮下投与によって注射した。1週間に2回、ノギスで腫瘍体積を測定することによって腫瘍増殖を監視した。腫瘍モデルが確立された時点で(腫瘍注射から14日後)(平均腫瘍体積は約300mm3に達していた)、担腫瘍マウスに対して、非形質導入T細胞(NT、T細胞総数1×107)またはMSLN−TFP T細胞(T細胞総数1×107)を静脈内注射した。
NT T細胞で処理したマウスと比較して、MSLN−TFP T細胞はMSLN高発現腫瘍の増殖を劇的に制御した(図14A)。一方、MSLN低発現腫瘍を有するマウスをMSLN−TFP T細胞で処理して観測された抗腫瘍応答は限定されたものであった(図14B)。1匹の動物では腫瘍の退縮が観測されたが、MSLN−TFP T細胞で処理したその他の9匹のマウスでは、NT T細胞を投与した動物と比較して腫瘍進行速度が遅い(n=2)、または同様(n=6)であった(図14B)。
注記
本発明の好ましい実施形態が本明細書に明示及び説明されているが、そのような実施形態は例として提供されるものにすぎないことが当業者には明らかであろう。この時点で、当業者なら本発明から逸脱することなく多数の変形、変更、及び置き換えを想到するであろう。本発明を実施する上では、本明細書に記載の本発明の実施形態に対するさまざまな代替形態を利用できると理解されたい。添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義するものであり、それによって、この特許請求の範囲に含まれる方法及び構造、ならびにその均等物が包含されることが意図される。
本発明の好ましい実施形態が本明細書に明示及び説明されているが、そのような実施形態は例として提供されるものにすぎないことが当業者には明らかであろう。この時点で、当業者なら本発明から逸脱することなく多数の変形、変更、及び置き換えを想到するであろう。本発明を実施する上では、本明細書に記載の本発明の実施形態に対するさまざまな代替形態を利用できると理解されたい。添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義するものであり、それによって、この特許請求の範囲に含まれる方法及び構造、ならびにその均等物が包含されることが意図される。
Claims (291)
- (I)ヒト対象に由来するT細胞であって、前記T細胞が、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子を含み、前記TFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、
(ii)TCR膜貫通ドメイン、及び
(iii)TCR細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン
を含むTCRサブユニットと、
(b)抗MUC16結合ドメインを含む抗原結合ドメインと、
を含む、
前記T細胞、ならびに
(II)医薬的に許容可能な担体
を含む医薬組成物であって、
前記TCRサブユニットと前記抗MUC16結合ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記TFPが、前記T細胞に発現すると、TCRと機能的に相互作用する、前記医薬組成物。 - 前記抗MUC16結合ドメインをコードする配列が、リンカーをコードする配列によって、前記TCR細胞外ドメインをコードする配列に連結される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記リンカーが、(G4S)nを含み、Gが、グリシンであり、Sが、セリンであり、nが、1〜4の整数である、請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記抗MUC16結合ドメインが、
(i)重鎖(HC)CDR1配列(GRTVSSLF、GRAVSSLF、またはGDSLDGYV)と、
(ii)HC CDR2配列(ISRYSLYTまたはISGDGSMR)と、
(iii)HC CDR3配列(ASKLEYTSNDYDSまたはAADPPTWDY)と、
を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。 - 前記抗MUC16結合ドメインが、配列番号15、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、または配列番号40の配列との配列同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、血清を実質的に含まない、請求項1〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合ドメインが、scFvである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合ドメインが、単一ドメイン抗体である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記単一ドメイン抗体が、VHドメインである、請求項8に記載の医薬組成物。
- コードされる前記抗MUC16結合ドメインが、抗MUC16結合ドメインを含み、前記T細胞の細胞傷害活性が、(a)前記抗MUC16結合ドメイン、(b)CD28細胞外ドメインの少なくとも一部、(c)CD28膜貫通ドメイン、(d)CD28細胞内ドメインの少なくとも一部、及び(e)CD3ゼータ細胞内ドメインを含み、前記抗MUC16結合ドメインが、前記CD28細胞外ドメインの少なくとも一部に機能可能なように連結されたキメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸を含むCD8+T細胞またはCD4+T細胞と比較して、高いか、またはより効率的である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- コードされるTFP分子が、前記T細胞に発現すると、内在性のTCR複合体、少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチド、またはそれらの組み合わせと機能的に相互作用する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記T細胞が、初代T細胞である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記T細胞が、ヒトCD4+T細胞である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記T細胞が、ヒトCD8+T細胞である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記T細胞が、PD−1及びBTLAからなる群から選択される抑制分子の少なくとも一部を含む第1のポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、前記抑制分子の少なくとも一部が、正のシグナルを生成する、細胞内シグナル伝達ドメイン由来の第2のポリペプチドと結び付けられる、請求項1〜14のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記第2のポリペプチドが、CD28、CD27、ICOS、CD3ζ、41−BB、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、LFA−1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、及びB7−H3からなる群から選択されるタンパク質に由来する共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項15に記載の医薬組成物。
- 前記T細胞によるIL−2またはIFNγの産生が、前記TFPを含まないT細胞と比較して、前記抗MUC16結合ドメインと特異的に相互作用する抗原を発現する細胞の存在下で増加する、請求項1〜16のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記細胞が、ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞の集団であり、前記集団の個々のT細胞が、少なくとも2つのTFP分子を含むか、または前記集団の少なくとも2種類のT細胞が、少なくとも2つのTFP分子を集合的に含み、前記少なくとも2つのTFP分子が、抗MUC16結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記少なくとも2つのTFP分子の少なくとも1つが、内在性のTCR複合体、少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチド、またはそれらの組み合わせと機能的に相互作用する、請求項1〜17のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記TCRサブユニットが、CD3イプシロンのみに由来する、請求項1〜18のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記TCRサブユニットが、CD3ガンマのみに由来する、請求項1〜18のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記TCRサブユニットが、CD3デルタのみに由来する、請求項1〜18のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記TCRサブユニットの前記TCR細胞外ドメイン、前記TCR膜貫通ドメイン、及び前記TCR細胞内ドメインが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロン、CD3ガンマ、またはCD3デルタに由来する、請求項1〜18のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記TCRサブユニットの前記TCR細胞外ドメイン、前記TCR膜貫通ドメイン、及び前記TCR細胞内ドメインが、TCR複合体の単一のサブユニットに由来し、前記単一のサブユニットが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロン、CD3ガンマ、またはCD3デルタである、請求項1〜18のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記T細胞が、前記TFPを含まないT細胞と比較して、前記抗MUC16結合ドメインと特異的に相互作用する抗原を発現する細胞に対して、増強された細胞傷害性を示す、請求項1〜23のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法であって、前記方法が、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子で形質導入されたT細胞の集団を有効量で前記哺乳類に投与することを含み、前記TFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)TCR細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン
を含むTCRサブユニットと、
(b)抗MUC16結合ドメインである抗原結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記TCRサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記TFPが、T細胞に発現するとTCRに組み込まれ、
同じ抗体ドメインを含むCAR−T細胞で治療された哺乳類のサイトカインのレベルと比較して、治療後に放出される前記サイトカインのレベルが低い、前記方法。 - 前記抗体ドメインが、配列番号15、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、または配列番号40に示される配列との配列同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%であるVHHドメインである、請求項25に記載の方法。
- 前記細胞が、自家T細胞である、請求項25または請求項26に記載の方法。
- 前記細胞が、同種異系T細胞である、請求項25または請求項26に記載の方法。
- 前記哺乳類が、ヒトである、請求項25〜28のいずれか1項に記載の方法。
- MUC16の発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、前記方法が、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子で形質導入されたT細胞の集団を有効量で前記哺乳類に投与することを含み、前記TFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)TCR細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン
を含むTCRサブユニットと、
(b)抗MUC16結合ドメインである抗原結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記TCRサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記TFPが、T細胞に発現するとTCRに組み込まれ、
同じ抗体ドメインを含むCAR−T細胞で治療された哺乳類のサイトカインのレベルと比較して、治療後に放出される前記サイトカインのレベルが低い、前記方法。 - 前記抗体ドメインが、配列番号15、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、または配列番号40に示される配列との配列同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%であるVHHドメインである、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞が、自家T細胞である、請求項30または請求項31に記載の方法。
- 前記細胞が、同種異系T細胞である、請求項30または請求項31に記載の方法。
- 前記TFPの前記TCRサブユニットが、TCR膜貫通ドメインをさらに含む、請求項25〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TCR細胞外ドメイン、前記TCR膜貫通ドメイン、及び前記TCR細胞内ドメインが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロン、CD3ガンマ、またはCD3デルタに由来する、請求項34に記載の方法。
- 前記TCRサブユニットの前記TCR細胞外ドメイン、前記TCR膜貫通ドメイン、及び前記TCR細胞内ドメインが、TCR複合体の単一のサブユニットに由来し、前記単一のサブユニットが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロン、CD3ガンマ、またはCD3デルタである、請求項34に記載の方法。
- 前記TCR細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3イプシロンまたはCD3ガンマに由来する、請求項25〜36のいずれか1項に記載の方法。
- MUC16の発現と関連する前記疾患が、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、及びMUC16の発現と関連する非がん関連徴候からなる群から選択される、請求項30〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記疾患が、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、肝癌、膵癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿管癌、腎癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、胸腺癌、胆管癌、胃癌、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるがんである、請求項30〜38のいずれか1項に記載の方法。
- 前記疾患が、中皮腫、漿液性乳頭状卵巣腺癌、卵巣明細胞癌、混合型ミュラー管卵巣癌、類内膜粘液性卵巣癌、膵臓腺癌、膵管腺癌、子宮体部漿液性腺癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳腺癌、MUC16の発現と関連する疾患、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるがんである、請求項30〜38のいずれか1項に記載の方法。
- TFP分子を発現する前記細胞が、TFP分子を発現する細胞の有効性を高める薬剤と組み合わせて投与される、請求項30〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 所与のサイトカインについて、前記同じ抗体ドメインを含むCAR−T細胞で治療された哺乳類の前記所与のサイトカインの量と比較して、治療後に放出される前記所与のサイトカインの量が少なくとも10%少ない、請求項25〜41のいずれか1項に記載の方法。
- 前記所与のサイトカインが、IL−2、IFN−γ、IL−4、TNF−α、IL−6、IL−13、IL−5、IL−10、sCD137、GM−CSF、MIP−1α、MIP−1β、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される1つ以上のサイトカインを含む、請求項42に記載の方法。
- 前記哺乳類における腫瘍増殖が抑制され、その結果、前記TFPを発現するT細胞で治療された前記哺乳類と、前記TFPを発現しないT細胞で治療された前記哺乳類とが、少なくとも8日間の治療の前に同じ腫瘍サイズを有した場合、前記治療の後に、前記腫瘍のサイズが、前記TFPを発現しない前記T細胞で治療された前記哺乳類における腫瘍のサイズの最大でも10%、最大でも20%、最大でも30%、最大でも40%、最大でも50%、または最大でも60%である、請求項25〜43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記哺乳類における前記腫瘍増殖が完全に抑制される、請求項44に記載の方法。
- 前記哺乳類における前記腫瘍増殖が、少なくとも20日間、少なくとも30日間、少なくとも40日間、少なくとも50日間、少なくとも60日間、少なくとも70日間、少なくとも80日間、少なくとも90日間、少なくとも100日間、またはそれを超える期間、完全に抑制される、請求項45に記載の方法。
- 前記TFPで形質導入された前記T細胞の集団が、前記同じ抗体ドメインを含む前記CAR−T細胞と比較して同様の量の腫瘍細胞を死滅させる、請求項25〜46のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TFPで形質導入された前記T細胞の集団が、前記同じ抗体ドメインを含む前記CAR−T細胞と比較して異なる遺伝子発現プロファイルを有する、請求項25〜47のいずれか1項に記載の方法。
- 遺伝子の発現レベルが、前記同じ抗体ドメインを含む前記CAR−T細胞における前記遺伝子の発現レベルと比較して、前記TFPで形質導入された前記T細胞では異なる、請求項48に記載の方法。
- 前記遺伝子が、抗原提示、TCRシグナル伝達、ホメオスタシス、代謝、ケモカインシグナル伝達、サイトカインシグナル伝達、toll様受容体シグナル伝達、MMP及び接着分子シグナル伝達、またはTNFR関連シグナル伝達において機能を有する、請求項49に記載の方法。
- T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)CD3イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン
を含むTCRサブユニットと、
(b)抗MUC16結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記TCRサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記TFPが、T細胞に発現するとTCRに組み込まれる、前記組換え核酸分子。 - T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)CD3ガンマの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン、
を含むTCRサブユニットと、
(b)抗MUC16結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記TCRサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記TFPが、T細胞に発現するとTCRに組み込まれる、前記組換え核酸分子。 - T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)CD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン
を含むTCRサブユニットと、
(b)抗MUC16結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記TCRサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記TFPが、T細胞に発現するとTCRに組み込まれる、前記組換え核酸分子。 - T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)TCRアルファ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン
を含むTCRサブユニットと、
(b)抗MUC16結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記TCRサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記TFPが、T細胞に発現するとTCRに組み込まれる、前記組換え核酸分子。 - T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)TCRベータ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン
を含むTCRサブユニットと、
(b)抗MUC16結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記TCRサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記TFPが、T細胞に発現するとTCRに組み込まれる、前記組換え核酸分子。 - 前記抗体ドメインが、ヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインである、請求項51〜55のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- コードされる抗原結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCR細胞外ドメインに連結される、請求項51〜56のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- コードされる前記リンカー配列が、(G4S)n(n=1〜4)を含む、請求項57に記載の組換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、TCR細胞外ドメインを含む、請求項51〜58のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、TCR膜貫通ドメインを含む、請求項51〜59のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、TCR細胞内ドメインを含む、請求項51〜60のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、(i)TCR細胞外ドメインと、(ii)TCR膜貫通ドメインと、(iii)TCR細胞内ドメインと、を含み、(i)、(ii)、及び(iii)のうちの少なくとも2つが、同じTCRサブユニットに由来する、請求項51〜61のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、CD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれに対する少なくとも1つの改変を有するアミノ酸配列、から選択される刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインを含む、請求項51〜62のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、4−1BBの機能性シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ゼータの機能性シグナル伝達ドメイン、あるいはそれに対する少なくとも1つの改変を有するアミノ酸配列、から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む、請求項51〜63のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記抗体ドメインが、抗体断片を含む、請求項51〜64のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記抗体ドメインが、scFvまたはVHドメインを含む、請求項51〜65のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- (i)重鎖(HC)CDR1配列(GRTVSSLF、GRAVSSLF、またはGDSLDGYV)と、
(ii)HC CDR2配列(ISRYSLYTまたはISGDGSMR)と、
(iii)HC CDR3配列(ASKLEYTSNDYDSまたはAADPPTWDY)と、
をコードする、請求項51〜66のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。 - 配列番号15、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、または配列番号40に示される配列との配列同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である重鎖可変ドメインをコードする、請求項51〜67のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記TFPが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及び1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、TCRサブユニットの細胞外ドメインを含む、請求項51〜68のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- コードされる前記TFPが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及び1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、請求項51〜69のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- コードされる前記TFPが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRゼータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、その機能性断片、及び1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、請求項51〜70のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む、請求項51〜71のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記共刺激ドメインが、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM−1、LFA−1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、及び4−1BB(CD137)、ならびにそれに対する1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能性シグナル伝達ドメインである、請求項72に記載の組換え核酸分子。
- 前記それに対する1〜20個の改変が、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の改変、または前記TFPに対するリガンド結合に応じてリン酸化されるアミノ酸の改変を含む、請求項51〜73のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 単離された核酸分子が、mRNAである、請求項51〜74のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記TFPが、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、TCRゼータ鎖、Fcイプシロン受容体1鎖、Fcイプシロン受容体2鎖、Fcガンマ受容体1鎖、Fcガンマ受容体2a鎖、Fcガンマ受容体2b1鎖、Fcガンマ受容体2b2鎖、Fcガンマ受容体3a鎖、Fcガンマ受容体3b鎖、Fcベータ受容体1鎖、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、その機能性断片、及びそれに対する1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)またはその一部を含む、TCRサブユニットのITAMを含む、請求項51〜75のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記ITAMによって、CD3ガンマ、CD3デルタ、またはCD3イプシロンのITAMが交換される、請求項76に記載の組換え核酸分子。
- 前記ITAMが、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択され、前記ITAMによって、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択される異なるITAMが交換される、請求項76に記載の組換え核酸分子。
- 前記核酸が、ヌクレオチド類似体を含む、請求項51〜78のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記ヌクレオチド類似体が、2’−O−メチル修飾を受けたもの、2’−O−メトキシエチル(2’−O−MOE)修飾を受けたもの、2’−O−アミノプロピル修飾を受けたもの、2’−デオキシ修飾を受けたもの、T−デオキシ−2’−フルオロ修飾を受けたもの、2’−O−アミノプロピル(2’−O−AP)修飾を受けたもの、2’−O−ジメチルアミノエチル(2’−O−DMAOE)修飾を受けたもの、2’−O−ジメチルアミノプロピル(2’−O−DMAP)修飾を受けたもの、T−O−ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’−O−DMAEOE)修飾を受けたもの、2’−O−N−メチルアセトアミド(2’−O−NMA)修飾を受けたもの、ロックド核酸(LNA)、エチレン核酸(ENA)、ペプチド核酸(PNA)、1’,5’−アンヒドロヘキシトール核酸(HNA)、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び2’−フルオロN3−P5’−ホスホロアミダイトからなる群から選択される、請求項79に記載の組換え核酸分子。
- リーダー配列をさらに含む、請求項51〜80のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 請求項51〜81のいずれか1項に記載の組換え核酸分子によってコードされる、組換えポリペプチド分子。
- 抗MUC16結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、組換えTFP分子。
- 抗MUC16結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む組換えTFP分子であって、前記TFP分子が、内在性のTCR複合体及び/または少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する、前記組換えTFP分子。
- 抗MUC16結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む組換えTFP分子であって、前記TFP分子が、内在性のTCR複合体に機能的に組み込まれる能力を有する、前記組換えTFP分子。
- 抗MUC16結合ドメインを含む抗体または抗体断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、請求項83に記載の組換えTFP分子。
- 前記抗MUC16結合ドメインが、scFv、VHH、またはVHドメインである、請求項83〜86のいずれか1項に記載の組換えTFP分子。
- 前記抗MUC16結合ドメインが、配列番号15、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、もしくは配列番号40のアミノ酸配列との同一性が95〜100%である重鎖、その機能性断片、または1〜30個の改変を有するそのアミノ酸配列を含む、請求項83〜87のいずれか1項に記載の組換えTFP分子。
- TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及び1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCR細胞外ドメインを含む、請求項83〜88のいずれか1項に記載の組換えTFP分子。
- 前記抗MUC16結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCR細胞外ドメインに連結される、請求項83〜89のいずれか1項に記載の組換えTFP分子。
- 前記リンカー領域が、(G4S)n(n=1〜4)を含む、請求項90に記載の組換えTFP分子。
- 請求項83〜91のいずれか1項に記載のTFPをコードする配列を含む、核酸。
- 前記核酸が、DNA及びRNAからなる群から選択される、請求項92に記載の核酸。
- 前記核酸が、mRNAである、請求項92または請求項93に記載の核酸。
- 前記核酸が、ヌクレオチド類似体を含む、請求項92〜94のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記ヌクレオチド類似体が、2’−O−メチル修飾を受けたもの、2’−O−メトキシエチル(2’−O−MOE)修飾を受けたもの、2’−O−アミノプロピル修飾を受けたもの、2’−デオキシ修飾を受けたもの、T−デオキシ−2’−フルオロ修飾を受けたもの、2’−O−アミノプロピル(2’−O−AP)修飾を受けたもの、2’−O−ジメチルアミノエチル(2’−O−DMAOE)修飾を受けたもの、2’−O−ジメチルアミノプロピル(2’−O−DMAP)修飾を受けたもの、T−O−ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’−O−DMAEOE)修飾を受けたもの、2’−O−N−メチルアセトアミド(2’−O−NMA)修飾を受けたもの、ロックド核酸(LNA)、エチレン核酸(ENA)、ペプチド核酸(PNA)、1’,5’−アンヒドロヘキシトール核酸(HNA)、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び2’−フルオロN3−P5’−ホスホロアミダイトからなる群から選択される、請求項95に記載の核酸。
- プロモーターをさらに含む、請求項92〜96のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記核酸が、インビトロで転写された核酸である、請求項92〜97のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記核酸が、ポリ(A)尾部をコードする配列をさらに含む、請求項92〜98のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記核酸が、3’UTR配列をさらに含む、請求項92〜99のいずれか1項に記載の核酸。
- 請求項83〜100のいずれか1項に記載のTFPをコードする核酸分子を含む、ベクター。
- 前記ベクターが、DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項101に記載のベクター。
- プロモーターをさらに含む、請求項101または請求項102に記載のベクター。
- 前記ベクターが、インビトロで転写されるベクターである、請求項101〜103のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記ベクター中の核酸配列が、ポリ(A)尾部をさらに含む、請求項101〜104のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記ベクター中の核酸配列が、3’UTRをさらに含む、請求項101〜105のいずれか1項に記載のベクター。
- 請求項51〜81のいずれか1項に記載の組換え核酸分子、請求項82に記載のポリペプチド分子、請求項83〜91のいずれか1項に記載のTFP分子、請求項92〜100のいずれか1項に記載の核酸、請求項101〜106のいずれか1項に記載のベクターを含む、細胞。
- 前記細胞が、ヒトT細胞である、請求項107に記載の細胞。
- 前記T細胞が、CD8+T細胞またはCD4+T細胞である、請求項108に記載の細胞。
- 正のシグナルを生成する、細胞内シグナル伝達ドメイン由来の第2のポリペプチドと結び付いた、抑制分子の少なくとも一部を含む第1のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む、請求項107〜109のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記抑制分子が、PD1の少なくとも一部を含む第1のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第2のポリペプチドと、を含む、請求項110に記載の細胞。
- 少なくとも2つのTFP分子を含むヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞であって、前記TFP分子が、抗MUC16結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記TFP分子が、前記ヒトCD8+T細胞または前記ヒトCD4+T細胞の中、特定位置、及び/または表面上の内在性のTCR複合体及び/または少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する、前記ヒトCD8+T細胞または前記ヒトCD4+T細胞。
- i)抗MUC16結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子と、
ii)少なくとも1つの内在性のTCRサブユニットまたは内在性のTCR複合体と、
を含む、タンパク質複合体。 - 前記TCRが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、請求項113に記載のタンパク質複合体。
- 前記抗MUC16結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCR細胞外ドメインに連結される、請求項113または請求項114に記載のタンパク質複合体。
- 前記リンカー領域が、(G4S)n(n=1〜4)を含む、請求項115に記載のタンパク質複合体。
- (a)請求項51〜81のいずれか1項に記載の組換え核酸分子によってコードされるTFPと、
(b)少なくとも1つの内在性のTCRサブユニットまたは内在性のTCR複合体と、
を含む、タンパク質複合体。 - i)抗MUC16結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子と、
ii)少なくとも1つの内在性のTCRサブユニットまたは内在性のTCR複合体と、
を含む、タンパク質複合体。 - 前記TCRが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、請求項118に記載のタンパク質複合体。
- 前記抗MUC16結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCR細胞外ドメインに連結される、請求項118または請求項119に記載のタンパク質複合体。
- 前記リンカー領域が、(G4S)n(n=1〜4)を含む、請求項120に記載のタンパク質複合体。
- 請求項113〜121のいずれか1項に記載のタンパク質複合体当たり少なくとも2つの異なるTFPタンパク質を含む、ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞。
- 請求項51〜81のいずれか1項に記載の単離された核酸分子によってコードされる少なくとも2つの異なるTFP分子を含む、ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞。
- ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞の集団であって、前記集団の前記T細胞が、少なくとも2つのTFP分子を個々または集合的に含み、前記TFP分子が、抗MUC16結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記TFP分子が、前記ヒトCD8+T細胞または前記ヒトCD4+T細胞の中、特定位置、及び/または表面上の内在性のTCR複合体及び/または少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する、前記集団。
- ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞の集団であって、前記集団の前記T細胞が、請求項51〜81のいずれか1項に記載の組換え核酸分子によってコードされる少なくとも2つのTFP分子を個々または集合的に含む、前記集団。
- 細胞を調製する方法であって、前記方法が、請求項51〜81のいずれか1項に記載の組換え核酸分子、請求項92〜100のいずれか1項に記載の核酸、または請求項101〜106のいずれか1項に記載のベクターでT細胞の形質導入を行うことを含む、前記方法。
- RNAで操作された細胞の集団を生成させる方法であって、前記方法が、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを細胞に導入することを含み、前記RNAが、請求項83〜91のいずれか1項に記載のTFP分子をコードする核酸を含む、前記方法。
- 哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法であって、前記方法が、請求項51〜81のいずれか1項に記載の組換え核酸分子、請求項82に記載のポリペプチド分子、請求項82に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項83〜91のいずれか1項に記載のTFP分子、請求項92〜100のいずれか1項に記載の核酸、請求項101〜106のいずれか1項に記載のベクター、または請求項107〜112及び請求項122〜126のいずれか1項に記載の細胞、を有効量で前記哺乳類に投与することを含む、前記方法。
- 前記細胞が、自家T細胞である、請求項128に記載の方法。
- 前記細胞が、同種異系T細胞である、請求項128に記載の方法。
- 前記哺乳類が、ヒトである、請求項128〜130のいずれか1項に記載の方法。
- MUC16の発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、前記方法が、請求項51〜81のいずれか1項に記載の単離された核酸分子、請求項82に記載のポリペプチド分子、請求項82に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項83〜91のいずれか1項に記載のTFP分子、請求項92〜100のいずれか1項に記載の核酸、請求項101〜106のいずれか1項に記載のベクター、または請求項107〜112及び請求項122〜125のいずれか1項に記載の細胞、を有効量で前記哺乳類に投与することを含む、前記方法。
- MUC16の発現と関連する前記疾患が、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、前白血病、MUC16の発現と関連する非がん関連徴候からなる群から選択される、請求項132に記載の方法。
- 前記疾患が、膵癌、卵巣癌、乳癌、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項132に記載の方法。
- TFP分子を発現する前記細胞が、TFP分子を発現する細胞の有効性を高める薬剤と組み合わせて投与される、請求項132に記載の方法。
- 前記哺乳類において放出されるサイトカインが、抗MUC16キメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞が有効量で投与された哺乳類と比較して少ない、請求項132〜135のいずれか1項に記載の方法。
- TFP分子を発現する前記細胞が、TFP分子を発現する細胞の投与と関連する1つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される、請求項132〜136のいずれか1項に記載の方法。
- TFP分子を発現する前記細胞が、MUC16と関連する前記疾患を治療する薬剤と組み合わせて投与される、請求項132〜137のいずれか1項に記載の方法。
- 薬剤として使用するための、請求項51〜81のいずれか1項に記載の組換え核酸分子、請求項82に記載のポリペプチド分子、請求項82に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項83〜91のいずれか1項に記載の組換えTFP、請求項92〜100のいずれか1項に記載の核酸、請求項101〜106のいずれか1項に記載のベクター、請求項113〜121のいずれか1項に記載の複合体、または請求項107〜112及び請求項122〜125のいずれか1項に記載の細胞。
- MUC16の発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、前記方法が、請求項51〜81のいずれか1項に記載の組換え核酸分子、請求項82に記載のポリペプチド分子、請求項82に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項83〜91のいずれか1項に記載の組換えTFP分子、請求項92〜100のいずれか1項に記載の核酸、請求項101〜106のいずれか1項に記載のベクター、または請求項107〜112及び請求項122〜125のいずれか1項に記載の細胞、を有効量で前記哺乳類に投与することを含み、前記哺乳類において放出されるサイトカインが、抗MUC16キメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞が有効量で投与された哺乳類と比較して少ない、前記方法。
- (I)ヒト対象に由来するT細胞であって、前記T細胞が、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子を含み、前記TFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、
(ii)TCR膜貫通ドメイン、及び
(iii)細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン
を含むTCRサブユニットと、
(b)抗IL13Rα2結合ドメインを含む抗原結合ドメインと、
を含む、
前記T細胞、ならびに
(II)医薬的に許容可能な担体
を含む医薬組成物であって、
前記TCRサブユニットと前記抗IL13Rα2結合ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記TFPが、前記T細胞に発現すると、TCRと機能的に相互作用する、前記医薬組成物。 - 前記TCRサブユニットの前記TCR細胞外ドメイン、前記TCR膜貫通ドメイン、及び前記TCR細胞内ドメインが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロン、CD3デルタ、またはCD3ガンマに由来する、請求項141に記載の医薬組成物。
- 前記TCRサブユニットの前記TCR細胞外ドメイン、前記TCR膜貫通ドメイン、及び前記TCR細胞内ドメインが、TCR複合体の単一のサブユニットに由来し、前記単一のサブユニットが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロン、CD3ガンマ、またはCD3デルタである、請求項141に記載の医薬組成物。
- 前記T細胞が、前記TFPを含まないT細胞と比較して、前記抗IL13Rα2結合ドメインと特異的に相互作用する抗原を発現する細胞に対して、増強された細胞傷害性を示す、請求項141〜143のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗IL13Rα2結合ドメインをコードする配列が、リンカーをコードする配列によって、前記TCR細胞外ドメインをコードする配列に連結される、請求項141〜144のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記リンカーが、(G4S)nを含み、Gが、グリシンであり、Sが、セリンであり、nが、1〜4の整数である、請求項145に記載の医薬組成物。
- 前記抗IL13Rα2結合ドメインが、
(i)重鎖(HC)CDR1配列(GFTSDYYIまたはGFASDDYI)と、
(ii)HC CDR2配列(ISSKYANTまたはISSRYANT)と、
(iii)HC CDR3配列(AADTRRYTCPDIATMHRNFDSまたはAMDSRRVTCPEISTMHRNFDS)と、
を含む、請求項141〜146のいずれか1項に記載の医薬組成物。 - 前記抗IL13Rα2結合ドメインが、配列番号51、配列番号56、配列番号61、配列番号66、配列番号71、または配列番号76の配列との配列同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である配列を含む、請求項141〜147のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記配列同一性が、BLASTアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長6、BLOSUM62行列、存在ペナルティ11、及び伸長ペナルティ1が使用される、請求項148に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、血清を実質的に含まない、請求項141〜148のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合ドメインが、scFvである、請求項141〜150のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗原結合ドメインが、単一ドメイン抗体である、請求項141〜150のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記単一ドメイン抗体が、VHドメインである、請求項152に記載の医薬組成物。
- 前記コードされる抗IL13Rα2結合ドメインが、抗IL13Rα2結合ドメインを含み、前記T細胞の細胞傷害活性が、(a)前記抗IL13Rα2結合ドメイン、(b)CD28細胞外ドメインの少なくとも一部、(c)CD28膜貫通ドメイン、(d)CD28細胞内ドメインの少なくとも一部、及び(e)CD3ゼータ細胞内ドメインを含み、前記抗IL13Rα2結合ドメインが、前記CD28細胞外ドメインの少なくとも一部に機能可能なように連結されたキメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸を含むCD8+T細胞またはCD4+T細胞と比較して、高いか、またはより効率的である、請求項141〜153のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記コードされるTFP分子が、前記T細胞に発現すると、内在性のTCR複合体、少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチド、またはそれらの組み合わせと機能的に相互作用する、請求項141〜154のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記T細胞が、初代T細胞である、請求項141〜155のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記T細胞が、ヒトCD4+T細胞である、請求項141〜156のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記T細胞が、ヒトCD8+T細胞である、請求項141〜156のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記T細胞が、PD−1及びBTLAからなる群から選択される抑制分子の少なくとも一部を含む第1のポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、前記抑制分子の少なくとも一部が、正のシグナルを生成する、細胞内シグナル伝達ドメイン由来の第2のポリペプチドと結び付けられる、請求項141〜158のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記第2のポリペプチドが、CD28、CD27、ICOS、CD3ζ、41−BB、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、LFA−1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、及びB7−H3からなる群から選択されるタンパク質に由来する共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項159に記載の医薬組成物。
- 前記T細胞によるIL−2またはIFNγの産生が、前記TFPを含まないT細胞と比較して、前記抗IL13Rα2結合ドメインと特異的に相互作用する抗原を発現する細胞の存在下で増加する、請求項141〜160のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記細胞が、ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞の集団であり、前記集団の個々のT細胞が、少なくとも2つのTFP分子を含むか、または前記集団の少なくとも2種類のT細胞が、少なくとも2つのTFP分子を集合的に含み、前記少なくとも2つのTFP分子が、抗IL13Rα2結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記少なくとも2つのTFP分子の少なくとも1つが、内在性のTCR複合体、少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチド、またはそれらの組み合わせと機能的に相互作用する、請求項141〜161のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記TCRサブユニットが、CD3イプシロンのみに由来する、請求項141〜162のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記TCRサブユニットが、CD3ガンマのみに由来する、請求項141〜162のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記TCRサブユニットが、CD3デルタのみに由来する、請求項141〜162のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法であって、前記方法が、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子で形質導入されたT細胞の集団を有効量で前記哺乳類に投与することを含み、前記TFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)TCR細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン
を含むTCRサブユニットと、
(b)抗IL13Rα2結合ドメインである抗原結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記TCRサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記TFPが、T細胞に発現するとTCRに組み込まれ、
同じ抗体ドメインを含むCAR−T細胞で治療された哺乳類のサイトカインのレベルと比較して、治療後に放出される前記サイトカインのレベルが低い、前記方法。 - 前記抗体ドメインが、配列番号51、配列番号56、配列番号61、配列番号66、配列番号71、または配列番号76に示される配列との配列同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%であるVHHドメインである、請求項166に記載の方法。
- 前記配列同一性が、BLASTアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長6、BLOSUM62行列、存在ペナルティ11、及び伸長ペナルティ1が使用される、請求項167に記載の方法。
- 前記細胞が、自家T細胞である、請求項166〜168のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、同種異系T細胞である、請求項166〜168のいずれか1項に記載の方法。
- 前記哺乳類が、ヒトである、請求項166〜170のいずれか1項に記載の方法。
- IL13Rα2の発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、前記方法が、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子で形質導入されたT細胞の集団を有効量で前記哺乳類に投与することを含み、前記TFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)TCR細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン
を含むTCRサブユニットと、
(b)抗IL13Rα2結合ドメインである抗原結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記TCRサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記TFPが、T細胞に発現するとTCRに組み込まれ、
同じ抗体ドメインを含むCAR−T細胞で治療された哺乳類のサイトカインのレベルと比較して、治療後に放出される前記サイトカインのレベルが低い、前記方法。 - 前記抗体ドメインが、配列番号51、配列番号56、配列番号61、配列番号66、配列番号71、または配列番号76に示される配列との配列同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%であるVHHドメインである、請求項172に記載の方法。
- 前記配列同一性が、BLASTアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長6、BLOSUM62行列、存在ペナルティ11、及び伸長ペナルティ1が使用される、請求項173に記載の方法。
- 前記細胞が、自家T細胞である、請求項172〜174のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、同種異系T細胞である、請求項172〜174のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TFPの前記TCRサブユニットが、TCR膜貫通ドメインをさらに含む、請求項166〜176のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TCR細胞外ドメイン、前記TCR膜貫通ドメイン、及び前記TCR細胞内ドメインが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロン、CD3ガンマ、またはCD3デルタに由来する、請求項177に記載の方法。
- 前記TCRサブユニットの前記TCR細胞外ドメイン、前記TCR膜貫通ドメイン、及び前記TCR細胞内ドメインが、TCR複合体の単一のサブユニットに由来し、前記単一のサブユニットが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロン、CD3ガンマ、またはCD3デルタである、請求項177に記載の方法。
- 前記TCR細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3イプシロンまたはCD3ガンマに由来する、請求項166〜179のいずれか1項に記載の方法。
- IL13Rα2の発現と関連する前記疾患が、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、及びIL13Rα2の発現と関連する非がん関連徴候からなる群から選択される、請求項172〜180のいずれか1項に記載の方法。
- 前記疾患が、神経膠芽腫、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、肝癌、膵癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿管癌、腎癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、胸腺癌、胆管癌、胃癌、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるがんである、請求項172〜181のいずれか1項に記載の方法。
- 前記疾患が、神経膠芽腫、中皮腫、漿液性乳頭状卵巣腺癌、卵巣明細胞癌、混合型ミュラー管卵巣癌、類内膜粘液性卵巣癌、膵臓腺癌、膵管腺癌、子宮体部漿液性腺癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳腺癌、IL13Rα2の発現と関連する疾患、及びそれらの任意の組み合わせ、からなる群から選択されるがんである、請求項172〜181のいずれか1項に記載の方法。
- TFP分子を発現する前記細胞が、TFP分子を発現する細胞の有効性を高める薬剤と組み合わせて投与される、請求項166〜183のいずれか1項に記載の方法。
- 所与のサイトカインについて、前記同じ抗体ドメインを含むCAR−T細胞で治療された哺乳類の前記所与のサイトカインの量と比較して、治療後に放出される前記所与のサイトカインの量が少なくとも10%少ない、請求項166〜184のいずれか1項に記載の方法。
- 前記所与のサイトカインが、IL−2、IFN−γ、IL−4、TNF−α、IL−6、IL−13、IL−5、IL−10、sCD137、GM−CSF、MIP−1α、MIP−1β、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される1つ以上のサイトカインを含む、請求項185に記載の方法。
- 前記哺乳類における腫瘍増殖が抑制され、その結果、前記TFPを発現するT細胞で治療された前記哺乳類と、前記TFPを発現しないT細胞で治療された哺乳類とが、少なくとも8日間の治療の前に同じ腫瘍サイズを有した場合、前記治療の後に、前記腫瘍のサイズが、前記TFPを発現しない前記T細胞で治療された前記哺乳類における腫瘍のサイズの最大でも10%、最大でも20%、最大でも30%、最大でも40%、最大でも50%、または最大でも60%である、請求項166〜186のいずれか1項に記載の方法。
- 前記哺乳類における前記腫瘍増殖が完全に抑制される、請求項187に記載の方法。
- 前記哺乳類における前記腫瘍増殖が、少なくとも20日間、少なくとも30日間、少なくとも40日間、少なくとも50日間、少なくとも60日間、少なくとも70日間、少なくとも80日間、少なくとも90日間、少なくとも100日間、またはそれを超える期間、完全に抑制される、請求項188に記載の方法。
- 前記TFPで形質導入された前記T細胞の集団が、前記同じ抗体ドメインを含む前記CAR−T細胞と比較して同様の量の腫瘍細胞を死滅させる、請求項166〜189のいずれか1項に記載の方法。
- 前記TFPで形質導入された前記T細胞の集団が、前記同じ抗体ドメインを含む前記CAR−T細胞と比較して異なる遺伝子発現プロファイルを有する、請求項166〜190のいずれか1項に記載の方法。
- 遺伝子の発現レベルが、前記同じ抗体ドメインを含む前記CAR−T細胞における前記遺伝子の発現レベルと比較して、前記TFPで形質導入された前記T細胞では異なる、請求項191に記載の方法。
- 前記遺伝子が、抗原提示、TCRシグナル伝達、ホメオスタシス、代謝、ケモカインシグナル伝達、サイトカインシグナル伝達、toll様受容体シグナル伝達、MMP及び接着分子シグナル伝達、またはTNFR関連シグナル伝達において機能を有する、請求項192に記載の方法。
- T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)CD3イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン
を含むTCRサブユニットと、
(b)抗IL13Rα2結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記TCRサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記TFPが、T細胞に発現するとTCRに組み込まれる、前記組換え核酸分子。 - T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)CD3ガンマの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン、
を含むTCRサブユニットと、
(b)抗IL13Rα2結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記TCRサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記TFPが、T細胞に発現するとTCRに組み込まれる、前記組換え核酸分子。 - T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)CD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン
を含むTCRサブユニットと、
(b)抗IL13Rα2結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記TCRサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記TFPが、T細胞に発現するとTCRに組み込まれる、前記組換え核酸分子。 - T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)TCRアルファの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン
を含むTCRサブユニットと、
(b)抗IL13Rα2結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記TCRサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記TFPが、T細胞に発現するとTCRに組み込まれる、前記組換え核酸分子。 - T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子であって、前記TFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)TCRベータの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン
を含むTCRサブユニットと、
(b)抗IL13Rα2結合ドメインを含む抗体ドメインと、
を含み、
前記TCRサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、
前記TFPが、T細胞に発現するとTCRに組み込まれる、前記組換え核酸分子。 - 前記抗体ドメインが、ヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインである、請求項194〜198のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記コードされる抗原結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCR細胞外ドメインに連結される、請求項194〜199のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記コードされるリンカー配列が、(G4S)n(n=1〜4)を含む、請求項200に記載の組換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、TCR細胞外ドメインを含む、請求項194〜201のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、TCR膜貫通ドメインを含む、請求項194〜202のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、TCR細胞内ドメインを含む、請求項194〜203のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、(i)TCR細胞外ドメインと、(ii)TCR膜貫通ドメインと、(iii)TCR細胞内ドメインと、を含み、(i)、(ii)、及び(iii)のうちの少なくとも2つが、同じTCRサブユニットに由来する、請求項194〜204のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、CD3イプシロン、CD3ガンマ、もしくはCD3デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれに対する少なくとも1つの改変を有するアミノ酸配列、から選択される刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメインを含む、請求項194〜205のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記TCRサブユニットが、4−1BBの機能性シグナル伝達ドメイン及び/またはCD3ゼータの機能性シグナル伝達ドメイン、あるいはそれに対する少なくとも1つの改変を有するアミノ酸配列、から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む、請求項194〜206のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記抗体ドメインが、抗体断片を含む、請求項194〜207のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記抗体ドメインが、scFvまたはVHドメインを含む、請求項194〜208のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- (i)重鎖(HC)CDR1配列(GFTSDYYIまたはGFASDDYI)と、
(ii)HC CDR2配列(ISSKYANTまたはISSRYANT)と、
(iii)HC CDR3配列(AADTRRYTCPDIATMHRNFDSまたはAMDSRRVTCPEISTMHRNFDS)と、
をコードする請求項194〜209のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。 - 配列番号51、配列番号56、配列番号61、配列番号66、配列番号71、または配列番号76に示される配列との配列同一性が少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である重鎖可変ドメインをコードする、請求項194〜210のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記配列同一性が、BLASTアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長6、BLOSUM62行列、存在ペナルティ11、及び伸長ペナルティ1が使用される、請求項211に記載の組換え核酸分子。
- 前記TFPが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及び1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、TCRサブユニットの細胞外ドメインを含む、請求項194〜212のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記コードされるTFPが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及び1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、請求項194〜213のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記コードされるTFPが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRベータ鎖、TCRゼータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、その機能性断片、及び1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、請求項194〜214のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む、請求項194〜215のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記共刺激ドメインが、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM−1、LFA−1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、及び4−1BB(CD137)、ならびにそれに対する1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能性シグナル伝達ドメインである、請求項216に記載の組換え核酸分子。
- 前記それに対する1〜20個の改変が、細胞シグナル伝達を媒介するアミノ酸の改変、または前記TFPに対するリガンド結合に応じてリン酸化されるアミノ酸の改変を含む、請求項194〜217のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記単離された核酸分子が、mRNAである、請求項194〜218のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記TFPが、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、TCRゼータ鎖、Fcイプシロン受容体1鎖、Fcイプシロン受容体2鎖、Fcガンマ受容体1鎖、Fcガンマ受容体2a鎖、Fcガンマ受容体2b1鎖、Fcガンマ受容体2b2鎖、Fcガンマ受容体3a鎖、Fcガンマ受容体3b鎖、Fcベータ受容体1鎖、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、その機能性断片、及びそれに対する1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)またはその一部を含む、TCRサブユニットのITAMを含む、請求項194〜219のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記ITAMによって、CD3ガンマ、CD3デルタ、またはCD3イプシロンのITAMが交換される、請求項220に記載の組換え核酸分子。
- 前記ITAMが、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択され、前記ITAMによって、CD3ゼータTCRサブユニット、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択される異なるITAMが交換される、請求項221に記載の組換え核酸分子。
- 前記核酸が、ヌクレオチド類似体を含む、請求項194〜222のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 前記ヌクレオチド類似体が、2’−O−メチル修飾を受けたもの、2’−O−メトキシエチル(2’−O−MOE)修飾を受けたもの、2’−O−アミノプロピル修飾を受けたもの、2’−デオキシ修飾を受けたもの、T−デオキシ−2’−フルオロ修飾を受けたもの、2’−O−アミノプロピル(2’−O−AP)修飾を受けたもの、2’−O−ジメチルアミノエチル(2’−O−DMAOE)修飾を受けたもの、2’−O−ジメチルアミノプロピル(2’−O−DMAP)修飾を受けたもの、T−O−ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’−O−DMAEOE)修飾を受けたもの、2’−O−N−メチルアセトアミド(2’−O−NMA)修飾を受けたもの、ロックド核酸(LNA)、エチレン核酸(ENA)、ペプチド核酸(PNA)、1’,5’−アンヒドロヘキシトール核酸(HNA)、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び2’−フルオロN3−P5’−ホスホロアミダイトからなる群から選択される、請求項223に記載の組換え核酸分子。
- リーダー配列をさらに含む、請求項194〜224のいずれか1項に記載の組換え核酸分子。
- 請求項194〜225のいずれか1項に記載の組換え核酸分子によってコードされる、組換えポリペプチド分子。
- 抗IL13Rα2結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、組換えTFP分子。
- 抗IL13Rα2結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む組換えTFP分子であって、前記TFP分子が、内在性のTCR複合体及び/または少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する、前記組換えTFP分子。
- 抗IL13Rα2結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む組換えTFP分子であって、前記TFP分子が、内在性のTCR複合体に機能的に組み込まれる能力を有する、前記組換えTFP分子。
- 抗IL13Rα2結合ドメインを含む抗体または抗体断片、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、請求項227に記載の組換えTFP分子。
- 前記抗IL13Rα2結合ドメインが、scFv、VHH、またはVHドメインである、請求項227〜230のいずれか1項に記載の組換えTFP分子。
- 前記抗IL13Rα2結合ドメインが、配列番号51、配列番号56、配列番号61、配列番号66、配列番号71、もしくは配列番号76のアミノ酸配列との同一性が95〜100%である重鎖、その機能性断片、または1〜30個の改変を有するそのアミノ酸配列を含む、請求項227〜231のいずれか1項に記載の組換えTFP分子。
- 前記配列同一性が、BLASTアルゴリズムを使用して決定され、その際、文字列長6、BLOSUM62行列、存在ペナルティ11、及び伸長ペナルティ1が使用される、請求項232に記載の組換えTFP分子。
- TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、CD3デルタTCRサブユニット、その機能性断片、及び1〜20個の改変を有するそのアミノ酸配列、からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むTCR細胞外ドメインを含む、請求項227〜233のいずれか1項に記載の組換えTFP分子。
- 前記抗IL13Rα2結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCR細胞外ドメインに連結される、請求項227〜234のいずれか1項に記載の組換えTFP分子。
- 前記リンカー領域が、(G4S)n(n=1〜4)を含む、請求項235に記載の組換えTFP分子。
- 請求項227〜236のいずれか1項に記載のTFPをコードする配列を含む、核酸。
- 前記核酸が、DNA及びRNAからなる群から選択される、請求項237に記載の核酸。
- 前記核酸が、mRNAである、請求項237または請求項238に記載の核酸。
- 前記核酸が、ヌクレオチド類似体を含む、請求項237〜239のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記ヌクレオチド類似体が、2’−O−メチル修飾を受けたもの、2’−O−メトキシエチル(2’−O−MOE)修飾を受けたもの、2’−O−アミノプロピル修飾を受けたもの、2’−デオキシ修飾を受けたもの、T−デオキシ−2’−フルオロ修飾を受けたもの、2’−O−アミノプロピル(2’−O−AP)修飾を受けたもの、2’−O−ジメチルアミノエチル(2’−O−DMAOE)修飾を受けたもの、2’−O−ジメチルアミノプロピル(2’−O−DMAP)修飾を受けたもの、T−O−ジメチルアミノエチルオキシエチル(2’−O−DMAEOE)修飾を受けたもの、2’−O−N−メチルアセトアミド(2’−O−NMA)修飾を受けたもの、ロックド核酸(LNA)、エチレン核酸(ENA)、ペプチド核酸(PNA)、1’,5’−アンヒドロヘキシトール核酸(HNA)、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び2’−フルオロN3−P5’−ホスホロアミダイトからなる群から選択される、請求項240に記載の核酸。
- プロモーターをさらに含む、請求項237〜241のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記核酸が、インビトロで転写された核酸である、請求項237〜242のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記核酸が、ポリ(A)尾部をコードする配列をさらに含む、請求項237〜243のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記核酸が、3’UTR配列をさらに含む、請求項237〜244のいずれか1項に記載の核酸。
- 請求項227〜236のいずれか1項に記載のTFPをコードする核酸分子を含む、ベクター。
- 前記ベクターが、DNA、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項246に記載のベクター。
- プロモーターをさらに含む、請求項246または請求項247に記載のベクター。
- 前記ベクターが、インビトロで転写されるベクターである、請求項246〜248のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記ベクター中の核酸配列が、ポリ(A)尾部をさらに含む、請求項246〜249のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記ベクター中の核酸配列が、3’UTRをさらに含む、請求項246〜250のいずれか1項に記載のベクター。
- 請求項194〜225のいずれか1項に記載の組換え核酸分子、請求項226に記載のポリペプチド分子、請求項227〜236のいずれか1項に記載のTFP分子、請求項237〜245のいずれか1項に記載の核酸、請求項246〜251のいずれか1項に記載のベクターを含む、細胞。
- 前記細胞が、ヒトT細胞である、請求項252に記載の細胞。
- 前記ヒトT細胞が、CD8+T細胞またはCD4+T細胞である、請求項253に記載の細胞。
- 正のシグナルを生成する、細胞内シグナル伝達ドメイン由来の第2のポリペプチドと結び付いた、抑制分子の少なくとも一部を含む第1のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む、請求項252〜254のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記抑制分子が、PD1の少なくとも一部を含む第1のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第2のポリペプチドと、を含む、請求項255に記載の細胞。
- 少なくとも2つのTFP分子を含むヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞であって、前記TFP分子が、抗IL13Rα2結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記TFP分子が、前記ヒトCD8+T細胞または前記ヒトCD4+T細胞の中、特定位置、及び/または表面上の内在性のTCR複合体及び/または少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する、前記ヒトCD8+T細胞または前記ヒトCD4+T細胞。
- i)抗IL13Rα2結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子と、
ii)少なくとも1つの内在性のTCRサブユニットまたは内在性のTCR複合体と、
を含む、タンパク質複合体。 - 前記TCRが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、請求項258に記載のタンパク質複合体。
- 前記抗IL13Rα2結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCR細胞外ドメインに連結される、請求項258または請求項259に記載のタンパク質複合体。
- 前記リンカー領域が、(G4S)n(n=1〜4)を含む、請求項260に記載のタンパク質複合体。
- (a)請求項194〜225のいずれか1項に記載の組換え核酸分子によってコードされるTFPと、
(b)少なくとも1つの内在性のTCRサブユニットまたは内在性のTCR複合体と、
を含む、タンパク質複合体。 - iii)抗IL13Rα2結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むTFP分子と、
iv)少なくとも1つの内在性のTCRサブユニットまたは内在性のTCR複合体と、
を含む、タンパク質複合体。 - 前記TCRが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、CD3イプシロンTCRサブユニット、CD3ガンマTCRサブユニット、及びCD3デルタTCRサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、請求項263に記載のタンパク質複合体。
- 前記抗IL13Rα2結合ドメインが、リンカー配列によって前記TCR細胞外ドメインに連結される、請求項263または請求項264に記載のタンパク質複合体。
- 前記リンカー領域が、(G4S)n(n=1〜4)を含む、請求項265に記載のタンパク質複合体。
- 請求項258〜266のいずれか1項に記載のタンパク質複合体当たり少なくとも2つの異なるTFPタンパク質を含む、ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞。
- 請求項194〜225のいずれか1項に記載の組換え核酸分子によってコードされる少なくとも2つの異なるTFP分子を含む、ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞。
- ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞の集団であって、前記集団の前記T細胞が、少なくとも2つのTFP分子を個々または集合的に含み、前記TFP分子が、抗IL13Rα2結合ドメイン、TCR細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記TFP分子が、前記ヒトCD8+T細胞または前記ヒトCD4+T細胞の中、特定位置、及び/または表面上の内在性のTCR複合体及び/または少なくとも1つの内在性のTCRポリペプチドと機能的に相互作用する能力を有する、前記集団。
- ヒトCD8+T細胞またはヒトCD4+T細胞の集団であって、前記集団の前記T細胞が、請求項194〜225のいずれか1項に記載の組換え核酸分子によってコードされる少なくとも2つのTFP分子を個々または集合的に含む、前記集団。
- 細胞を調製する方法であって、前記方法が、請求項194〜225のいずれか1項に記載の組換え核酸分子、請求項237〜245のいずれか1項に記載の核酸、または請求項246〜251のいずれか1項に記載のベクターでT細胞の形質導入を行うことを含む、前記方法。
- RNAで操作された細胞の集団を生成させる方法であって、前記方法が、インビトロで転写されたRNAまたは合成RNAを細胞に導入することを含み、前記RNAが、請求項227〜236のいずれか1項に記載の組換えTFP分子をコードする核酸を含む、前記方法。
- 哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法であって、前記方法が、請求項194〜225のいずれか1項に記載の組換え核酸分子、請求項226に記載のポリペプチド分子、請求項226に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項227〜236のいずれか1項に記載の組換えTFP分子、請求項237〜245のいずれか1項に記載の核酸、請求項246〜251のいずれか1項に記載のベクター、または請求項252〜257及び請求項267〜270のいずれか1項に記載の細胞、を有効量で前記哺乳類に投与することを含む、前記方法。
- 前記細胞が、自家T細胞である、請求項273に記載の方法。
- 前記細胞が、同種異系T細胞である、請求項273に記載の方法。
- 前記哺乳類が、ヒトである、請求項273〜275のいずれか1項に記載の方法。
- IL13Rα2の発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、前記方法が、請求項194〜225のいずれか1項に記載の単離された核酸分子、請求項226に記載のポリペプチド分子、請求項226に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項227〜236のいずれか1項に記載の組換えTFP分子、請求項237〜245のいずれか1項に記載の核酸、請求項246〜251のいずれか1項に記載のベクター、または請求項252〜257及び請求項267〜270のいずれか1項に記載の細胞、を有効量で前記哺乳類に投与することを含む、前記方法。
- IL13Rα2の発現と関連する前記疾患が、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、骨髄異形成、骨髄異形成症候群、前白血病、IL13Rα2の発現と関連する非がん関連徴候からなる群から選択される、請求項277に記載の方法。
- 前記疾患が、膵癌、卵巣癌、乳癌、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項277に記載の方法。
- TFP分子を発現する前記細胞が、TFP分子を発現する細胞の有効性を高める薬剤と組み合わせて投与される、請求項277に記載の方法。
- 前記哺乳類において放出されるサイトカインが、抗IL13Rα2キメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞が有効量で投与された哺乳類と比較して少ない、請求項277〜280のいずれか1項に記載の方法。
- TFP分子を発現する前記細胞が、TFP分子を発現する細胞の投与と関連する1つ以上の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される、請求項277〜281のいずれか1項に記載の方法。
- TFP分子を発現する前記細胞が、IL13Rα2と関連する前記疾患を治療する薬剤と組み合わせて投与される、請求項277〜282のいずれか1項に記載の方法。
- 薬剤として使用するための、請求項194〜225のいずれか1項に記載の組換え核酸分子、請求項226に記載のポリペプチド分子、請求項226に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項227〜236のいずれか1項に記載の組換えTFP、請求項237〜245のいずれか1項に記載の核酸、請求項246〜251のいずれか1項に記載のベクター、請求項258〜266のいずれか1項に記載の複合体、または請求項252〜257及び請求項267〜270のいずれか1項に記載の細胞。
- IL13Rα2の発現と関連する疾患を有する哺乳類を治療する方法であって、前記方法が、請求項194〜225のいずれか1項に記載の組換え核酸分子、請求項226に記載のポリペプチド分子、請求項226に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項227〜236のいずれか1項に記載の組換えTFP分子、請求項237〜245のいずれか1項に記載の核酸、請求項246〜251のいずれか1項に記載のベクター、または請求項252〜257及び請求項267〜270のいずれか1項に記載の細胞、を有効量で前記哺乳類に投与することを含み、前記哺乳類において放出されるサイトカインが、抗IL13Rα2キメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞が有効量で投与された哺乳類と比較して少ない、前記方法。
- IL13Rα2を発現する細胞を含む固形腫瘍を有する哺乳類を治療する方法であって、前記方法が、請求項194〜225のいずれか1項に記載の組換え核酸分子、請求項226に記載のポリペプチド分子、請求項226に記載のポリペプチド分子を発現する細胞、請求項227〜236のいずれか1項に記載の組換えTFP分子、請求項237〜245のいずれか1項に記載の核酸、請求項246〜251のいずれか1項に記載のベクター、または請求項252〜257及び請求項267〜270のいずれか1項に記載の細胞、を有効量で前記哺乳類に投与することを含み、前記腫瘍の体積が低減されるか、または前記腫瘍の増殖が抑制される、前記方法。
- 哺乳類に抗腫瘍免疫を与える方法であって、前記方法が、T細胞受容体(TCR)融合タンパク質(TFP)をコードする組換え核酸分子で形質導入されたT細胞の集団を有効量で前記哺乳類に投与することを含み、前記TFPが、
(a)(i)TCR細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
(ii)細胞内シグナル伝達ドメインに由来する刺激ドメインを含むTCR細胞内ドメイン
を含むTCRサブユニットと、
(b)抗メソテリン結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒト抗体ドメインまたはヒト化抗体ドメインと、
を含み、
前記TCRサブユニットと前記抗体ドメインとが、機能可能なように連結され、前記TFPが、T細胞に発現するとTCRに組み込まれ、前記T細胞の集団が、メソテリンを低発現する腫瘍細胞と比較して、メソテリンを高発現する腫瘍細胞を優先的に死滅させる、前記方法。 - 前記TCRサブユニットが、TCR膜貫通ドメインをさらに含む、請求項287に記載の方法。
- 前記TCR細胞外ドメイン、前記TCR膜貫通ドメイン、及び前記TCR細胞内ドメインが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロン、CD3ガンマ、またはCD3デルタに由来する、請求項287または請求項288に記載の方法。
- 前記TCRサブユニットの前記TCR細胞外ドメイン、前記TCR膜貫通ドメイン、及び前記TCR細胞内ドメインが、TCR複合体の単一のサブユニットに由来し、前記単一のサブユニットが、TCRアルファ鎖、TCRベータ鎖、TCRガンマ鎖、TCRデルタ鎖、CD3イプシロン、CD3ガンマ、またはCD3デルタである、請求項287または288に記載の方法。
- 前記TCR細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3イプシロンまたはCD3ガンマに由来する、請求項287〜290のいずれか1項に記載の方法。
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