TWI805792B - 抗腫瘤劑及其評估方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種顯示顯著優異之抗腫瘤效果且副作用較少之新穎癌症治療方法。
本發明提供一種抗腫瘤劑，其特徵在於將表位4連結肽與免疫檢查點分子調節劑併用投予。又，藉由提供一種共表現源自SART2之人腫瘤抗原表位肽及人HLA-A24之細胞，能夠評估對人之抗腫瘤效果。
Description
本發明係關於一種癌症化學療法，其使用連結4個對HLA-A限制性具有CTL誘導能力之肽而成之CTL表位4連結肽、及免疫檢查點分子調節劑。本發明又係關於一種共表現源自SART2之人腫瘤抗原表位肽及人HLA-A24之細胞，其能夠良好地用於評估本發明之癌症化學療法之效果。
癌症肽疫苗療法長時間以來係期待作為癌症新治療法之治療法。然而，自從1990年能夠鑑定人腫瘤抗原中之表位肽以來，雖然全世界都在實施癌症肽疫苗臨床研究，但現狀為治療成績非常有限(非專利文獻1)。
於癌症肽疫苗療法中，表位特異性細胞毒殺性T淋巴細胞(CTL)之細胞受體(TCR)識別癌細胞表面呈現抗原肽之主要組織相容性基因複合體(MHC)，CTL毒殺癌細胞，藉此發揮效果。人之MHC稱為人白血球抗原(HLA)，已知HLA之類型顯示出高度之多型性。因此，正實施以特定之HLA型為對象之癌症肽疫苗之開發。然而，成為癌症疫苗之對象之HLA型有限定，存在具有非對象之HLA型之患者無法受惠於癌症肽疫苗之問題。進而，治療開始前需要HLA型檢查，成為延緩治療開始時期，增大患
者負擔之原因之一。根據以上，期望開發、研究出一種無需HLA型檢查、能夠適合所有癌症患者之癌症肽疫苗。
為了解決該課題，報告有一種CTL表位4連結肽，其係連結對HLA-A2、HLA-A24、HLA-A26或HLA-A3超型之任1種或複數種HLA型表現出CTL誘導能力之各種CTL表位肽而成(專利文獻1)。
又，近年來，逐漸明確與免疫細胞之抑制/活化相關之分子機制。T細胞中之免疫應答被由TCR產生之訊息與輔助訊息控制。輔助訊息存在分別將經由TCR之訊息調節成正與負之costimulation訊息與coinhibition訊息，控制T細胞之免疫反應。癌細胞藉由利用該機制，抑制抗原特異性T細胞之活化，從而誘導T細胞之免疫疲勞狀態。近年來，認為藉由強化costimulation或阻止coinhibition訊息來增強癌症患者之體內之抗腫瘤免疫應答、控制腫瘤之免疫逃避對癌症治療有效，且提出了各種以costimulatory分子或coinhibitory分子為靶之癌症免疫療法(非專利文獻2)。例如，納武單抗作為藉由阻礙PD-1與其配體(PD-L1及PD-L2)結合而使T細胞活化之免疫檢查點分子調節劑用於治療惡性黑色素瘤等(非專利文獻2、非專利文獻3)。
然而，未揭示過藉由組合CTL表位4連結肽與此種免疫檢查點分子調節劑而產生之對抗腫瘤效果之增強效果。
[專利文獻1]國際公開第2015/060235號公報
[非專利文獻1]Nature Med., 10(9): 909-15(2004)
[非專利文獻2]Nat. Rev. Cancer., 12(4): 252-64(2012)
[非專利文獻3]N. Engl. J. Med., 366(26): 2443-54(2012)
本發明之課題在於提供一種新穎癌症治療方法，其藉由將CTL表位4連結肽與免疫檢查點分子調節劑併用投予，從而顯示顯著優異之抗腫瘤效果，且副作用較少。又，課題在於提供一種共表現源自SART2之人腫瘤抗原表位肽及人HLA-A24之細胞，其能夠良好地用於評估抗腫瘤劑對人之效果。
於是，本發明者將CTL表位4連結肽及作為免疫檢查點分子調節劑之抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體併用投予，研究抗腫瘤效果，結果發現，與單獨使用藥劑相比，能夠不發生嚴重之副作用而顯著增強抗腫瘤效果。進而，建立了共表現源自SART2之人腫瘤抗原表位肽及人HLA-A24之細胞，確立了能夠評估人腫瘤抗原表位肽對該細胞之抗腫瘤效果之方法。
即，本發明提供以下之發明。
[1]一種抗腫瘤劑，其特徵在於：其用於與免疫檢查點分子調節劑併用，且含有包含經由連接子連結之4個CTL表位肽之表位4連結肽作為有效成分，該表位4連結肽係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、及選自由序列編號1所表示之表位肽(PEP1)、序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號7所表示之表位肽(PEP7)、序列編號8所表示之表位肽(PEP8)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、序列編號10所表示之表位肽(PEP10)、序列編號13所表示之表位肽(PEP13)、序列編號15所表示之表位肽(PEP15)、序列編號17所表示之表位肽(PEP17)及序列編號18所表示之表位肽(PEP18)所組成之群中之3個表位肽經由連接子分別連結而成，且可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列者，其具有選自以下(1)~(3)之任一特徵：(1)C末端為PEP2(其中，於N末端經由連接子自N末端側依序相鄰地包含PEP7及PEP8者除外)；(2)C末端為PEP4；(3)C末端為PEP10。
[2]如[1]所記載之抗腫瘤劑，其中上述表位4連結肽所包含之表位肽由PEP5、PEP6、PEP9、及選自由PEP2、PEP4及PEP10所組成之群中之1個表位肽
構成，且上述表位4連結肽之C末端為PEP2、PEP4或PEP10。
[3]如[1]或[2]所記載之抗腫瘤劑，其中表位4連結肽包含選自以下之序列：‧PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4；‧PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP2；或‧PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP10；再者，式中「(L)」表示連接子。
[4]如[1]至[3]中任一項所記載之抗腫瘤劑，其中連接子為胺基酸連接子。
[5]如[4]記載之抗腫瘤劑，其中胺基酸連接子為連結2個精胺酸而成之精胺酸二聚物、或連結3個精胺酸而成之精胺酸三聚物。
[6]如[1]至[5]中任一項所記載之抗腫瘤劑，其中包含親水性胺基酸之肽序列連結於N末端，且包含連結3個精胺酸而成之精胺酸三聚物、或連結4個精胺酸而成之精胺酸四聚物。
[7]如[1]至[6]中任一項所記載之抗腫瘤劑，其中表位4連結肽為序列編號24、序列編號25、或序列編號26。
[8]如[1]至[7]中任一項所記載之抗腫瘤劑，其中免疫檢查點分子調節劑為選自由PD-1路徑拮抗劑、ICOS路徑促效劑、CTLA-4路徑拮抗劑及CD28路徑促效劑所組成之群中之至少1種。
[9]如[1]至[7]中任一項所記載之抗腫瘤劑，其中免疫檢查點分子調節劑為選自由PD-1路徑拮抗劑及CTLA-4路徑拮抗劑所組成之群中之至少1種。
[10]如[1]至[7]中任一項所記載之抗腫瘤劑，其中免疫檢查點分子調
節劑為PD-1路徑拮抗劑。
[11]如[8]至[10]中任一項所記載之抗腫瘤劑，其中PD-1路徑拮抗劑為選自由抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體及抗PD-L2抗體所組成之群中之至少1種。
[12]如[8]至[10]中任一項所記載之抗腫瘤劑，其中PD-1路徑拮抗劑為選自由抗PD-1抗體及抗PD-L1抗體所組成之群中之至少1種。
[13]如[11]或[12]記載之抗腫瘤劑，其中抗PD-1抗體為納武單抗或帕博利珠單抗，抗PD-L1抗體為阿特珠單抗、度伐魯單抗或阿維魯單抗。
[14]如[8]或[9]所記載之抗腫瘤劑，其中CTLA-4路徑拮抗劑為抗CTLA-4抗體。
[15]如[14]所記載之抗腫瘤劑，其中抗CTLA-4抗體為伊匹木單抗或曲美木單抗。
[16]一種抗腫瘤劑，其用於治療被投予免疫檢查點分子調節劑之癌症患者，且含有表位4連結肽作為有效成分，該表位4連結肽係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、及選自由序列編號1所表示之表位肽(PEP1)、序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號7所表示之表位肽(PEP7)、序列編號8所表示之表位肽(PEP8)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、序列編號10所表示之表位肽(PEP10)、序列編號13所表示之表位肽(PEP13)、序列編號15所表示之表位肽(PEP15)、序列編號17所表示之表位肽(PEP17)及序列編號18所表示之表位肽(PEP18)所組成之群中之3個表位肽
經由連接子分別連結而成，且可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列者，其具有選自以下(1)~(3)之任一特徵：(1)C末端為PEP2(其中，於N末端經由連接子自N末端側依序相鄰地包含PEP7及PEP8者除外)；(2)C末端為PEP4；(3)C末端為PEP10。
[17]一種抗腫瘤劑，其用於治療被投予表位4連結肽之癌症患者，且包含免疫檢查點分子調節劑，該表位4連結肽係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、及選自由序列編號1所表示之表位肽(PEP1)、序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號7所表示之表位肽(PEP7)、序列編號8所表示之表位肽(PEP8)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、序列編號10所表示之表位肽(PEP10)、序列編號13所表示之表位肽(PEP13)、序列編號15所表示之表位肽(PEP15)、序列編號17所表示之表位肽(PEP17)及序列編號18所表示之表位肽(PEP18)所組成之群中之3個表位肽經由連接子分別連結而成，且可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列者，其具有選自以下(1)~(3)之任一特徵：(1)C末端為PEP2(其中，於N末端經由連接子自N末端側依序相鄰地包含PEP7及PEP8者除外)；(2)C末端為PEP4；(3)C末端為PEP10；且
該免疫檢查點分子調節劑為選自由PD-1路徑拮抗劑、ICOS路徑促效劑、CTLA-4路徑拮抗劑及CD28路徑促效劑所組成之群中之至少1種。
[18]一種組合製劑，其係將表位4連結肽與免疫檢查點分子調節劑組合而成者，該表位4連結肽係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、及選自由序列編號1所表示之表位肽(PEP1)、序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號7所表示之表位肽(PEP7)、序列編號8所表示之表位肽(PEP8)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、序列編號10所表示之表位肽(PEP10)、序列編號13所表示之表位肽(PEP13)、序列編號15所表示之表位肽(PEP15)、序列編號17所表示之表位肽(PEP17)及序列編號18所表示之表位肽(PEP18)所組成之群中之3個表位肽經由連接子分別連結而成，且可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列者，其具有選自以下(1)~(3)之任一特徵：(1)C末端為PEP2(其中，於N末端經由連接子自N末端側依序相鄰地包含PEP7及PEP8者除外)；(2)C末端為PEP4；(3)C末端為PEP10。
[19]一種抗腫瘤效果增強劑，其以表位4連結肽作為有效成分，用於增強免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤效果，該表位4連結肽係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、及
選自由序列編號1所表示之表位肽(PEP1)、序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號7所表示之表位肽(PEP7)、序列編號8所表示之表位肽(PEP8)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、序列編號10所表示之表位肽(PEP10)、序列編號13所表示之表位肽(PEP13)、序列編號15所表示之表位肽(PEP15)、序列編號17所表示之表位肽(PEP17)及序列編號18所表示之表位肽(PEP18)所組成之群中之3個表位肽經由連接子分別連結而成，且可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列者，其具有選自以下(1)~(3)之任一特徵：(1)C末端為PEP2(其中，於N末端經由連接子自N末端側依序相鄰地包含PEP7及PEP8者除外)；(2)C末端為PEP4；(3)C末端為PEP10。
[20]一種抗腫瘤劑，其特徵在於含有包含經由連接子連結之4個CTL表位肽之表位4連結肽、及免疫檢查點分子調節劑作為有效成分，該表位4連結肽係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、及選自由序列編號1所表示之表位肽(PEP1)、序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號7所表示之表位肽(PEP7)、序列編號8所表示之表位肽(PEP8)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、序列編號10所表示之表位肽(PEP10)、序列編號13所表示之表位肽(PEP13)、序列編號15所表示之表位肽(PEP15)、序列編號17所表示之表位肽(PEP17)及序列編號18所表
示之表位肽(PEP18)所組成之群中之3個表位肽經由連接子分別連結而成，且可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列者，其具有選自以下(1)~(3)之任一特徵：(1)C末端為PEP2(其中，於N末端經由連接子自N末端側依序相鄰地包含PEP7及PEP8者除外)；(2)C末端為PEP4；(3)C末端為PEP10。
[21]一種套組製劑，其特徵在於：其係包含表位4連結肽及使用說明書者，該使用說明書中記載有對癌症患者併用投予表位4連結肽及免疫檢查點分子調節劑，該表位4連結肽係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、及選自由序列編號1所表示之表位肽(PEP1)、序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號7所表示之表位肽(PEP7)、序列編號8所表示之表位肽(PEP8)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、序列編號10所表示之表位肽(PEP10)、序列編號13所表示之表位肽(PEP13)、序列編號15所表示之表位肽(PEP15)、序列編號17所表示之表位肽(PEP17)及序列編號18所表示之表位肽(PEP18)所組成之群中之3個表位肽經由連接子分別連結而成，且可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列者，其具有選自以下(1)~(3)之任一特徵：(1)C末端為PEP2(其中，於N末端經由連接子自N末端側依序相鄰地包含PEP7及PEP8者除外)；
(2)C末端為PEP4；(3)C末端為PEP10。
[22]一種細胞，其導入有編碼源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之多核苷酸及編碼人HLA-A24之α1及α2區之多核苷酸。
[23]一種細胞，其導入有選自以下(a)~(e)之多核苷酸：(a)編碼包含序列編號5所表示之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(b)編碼包含序列編號5所表示之胺基酸序列中置換、缺失、或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(c)編碼包含與序列編號5所表示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(d)包含序列編號29所表示之鹼基序列的多核苷酸；(e)包含與序列編號29所表示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列的多核苷酸；及選自以下(f)~(j)之多核苷酸：(f)編碼包含序列編號30所表示之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(g)編碼包含序列編號30所表示之胺基酸序列中置換、缺失、或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(h)編碼包含與序列編號30所表示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(i)包含序列編號31所表示之鹼基序列的多核苷酸；(j)包含與序列編號31所表示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列的多核苷酸。
[24]一種細胞，其導入有選自以下(k)~(o)之多核苷酸：
(k)編碼包含序列編號32所表示之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(l)編碼包含序列編號32所表示之胺基酸序列中置換、缺失、或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(m)編碼包含與序列編號32所表示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(n)包含序列編號33所表示之鹼基序列的多核苷酸；(o)包含與序列編號33所表示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列的多核苷酸；及選自以下(p)~(t)之多核苷酸：(p)編碼包含序列編號34所表示之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(q)編碼包含序列編號34所表示之胺基酸序列中置換、缺失、或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(r)編碼包含與序列編號34所表示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(s)包含序列編號35所表示之鹼基序列的多核苷酸；(t)包含與序列編號35所表示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列的多核苷酸。
[25]如[22]至[24]中任一項所記載之細胞，其用於評估源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之抗腫瘤效果。
[26]如[22]至[24]中任一項所記載之細胞，其用於評估表位4連結肽及/或免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤效果，該表位4連結肽係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、及
選自由序列編號1所表示之表位肽(PEP1)、序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號7所表示之表位肽(PEP7)、序列編號8所表示之表位肽(PEP8)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、序列編號10所表示之表位肽(PEP10)、序列編號13所表示之表位肽(PEP13)、序列編號15所表示之表位肽(PEP15)、序列編號17所表示之表位肽(PEP17)及序列編號18所表示之表位肽(PEP18)所組成之群中之3個表位肽經由連接子分別連結而成，且可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列者，其具有選自以下(1)~(3)之任一特徵：(1)C末端為PEP2(其中，於N末端經由連接子自N末端側依序相鄰地包含PEP7及PEP8者除外)；(2)C末端為PEP4；(3)C末端為PEP10。
[27]一種用於評估源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之抗腫瘤效果之方法，其使用如[22]至[24]中任一項所記載之細胞，且包括以下(I)及(II)之步驟：(I)對敲入人HLA-A24基因之非免疫缺陷非人動物投予源自SART2之人腫瘤抗原表位肽的步驟；及(II)將如[22]至[24]中任一項所記載之細胞移植進敲入人HLA-A24基因之非免疫缺陷非人動物的步驟。
[28]一種用於評估表位4連結肽及/或免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤效果之方法，其使用如[22]至[24]中任一項所記載之細胞，且包括以下(I)及(II)之步驟：
(I)對敲入人HLA-A24基因之非免疫缺陷非人動物投予表位4連結肽及/或免疫檢查點分子調節劑的步驟；及(II)將如[22]至[24]中任一項所記載之細胞移植進敲入人HLA-A24基因之非免疫缺陷非人動物的步驟；該表位4連結肽係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、及選自由序列編號1所表示之表位肽(PEP1)、序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號7所表示之表位肽(PEP7)、序列編號8所表示之表位肽(PEP8)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、序列編號10所表示之表位肽(PEP10)、序列編號13所表示之表位肽(PEP13)、序列編號15所表示之表位肽(PEP15)、序列編號17所表示之表位肽(PEP17)及序列編號18所表示之表位肽(PEP18)所組成之群中之3個表位肽經由連接子分別連結而成，且可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列者，其具有選自以下(1)~(3)之任一特徵：(1)C末端為PEP2(其中，於N末端經由連接子自N末端側依序相鄰地包含PEP7及PEP8者除外)；(2)C末端為PEP4；(3)C末端為PEP10。
[29]一種用於腫瘤之預防及/或治療之醫藥組合物，其含有包含經由連接子連結之4個CTL表位肽之表位4連結肽、免疫檢查點分子調節劑、及藥學上容許之載體，
該表位4連結肽係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、及選自由序列編號1所表示之表位肽(PEP1)、序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號7所表示之表位肽(PEP7)、序列編號8所表示之表位肽(PEP8)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、序列編號10所表示之表位肽(PEP10)、序列編號13所表示之表位肽(PEP13)、序列編號15所表示之表位肽(PEP15)、序列編號17所表示之表位肽(PEP17)及序列編號18所表示之表位肽(PEP18)所組成之群中之3個表位肽經由連接子分別連結而成，且可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列者，其具有選自以下(1)~(3)之任一特徵：(1)C末端為PEP2(其中，於N末端經由連接子自N末端側依序相鄰地包含PEP7及PEP8者除外)；(2)C末端為PEP4；(3)C末端為PEP10。
[30]一種與免疫檢查點分子調節劑組合而預防及/或治療腫瘤之方法，其包括對患者投予預防及/或治療上有效之量之包含經由連接子連結之4個CTL表位肽之表位4連結肽的步驟，且該表位4連結肽係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、及選自由序列編號1所表示之表位肽(PEP1)、序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號7所表示之表位肽(PEP7)、序列編號8所表示之表位肽(PEP8)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、序列編號10所表示之表位
肽(PEP10)、序列編號13所表示之表位肽(PEP13)、序列編號15所表示之表位肽(PEP15)、序列編號17所表示之表位肽(PEP17)及序列編號18所表示之表位肽(PEP18)所組成之群中之3個表位肽經由連接子分別連結而成，且可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列者，其具有選自以下(1)~(3)之任一特徵：(1)C末端為PEP2(其中，於N末端經由連接子自N末端側依序相鄰地包含PEP7及PEP8者除外)；(2)C末端為PEP4；(3)C末端為PEP10。
[31]如[30]所記載之方法，其中於上述免疫檢查點分子調節劑之投予前、與上述免疫檢查點分子調節劑之投予同時、或上述免疫檢查點分子調節劑之投予後，對患者投予上述表位4連結肽。
[32]如[30]所記載之方法，其用於增強上述免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤效果。
[33]一種表位4連結肽，其用於與免疫檢查點分子調節劑併用而用來預防及/或治療腫瘤，包含經由連接子連結之4個CTL表位肽，該表位4連結肽係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、選自由序列編號1所表示之表位肽(PEP1)、序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號7所表示之表位肽(PEP7)、序列編號8所表示之表位肽(PEP8)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、序列編號10所表示之表位肽(PEP10)、序列編號13所表示之表位肽(PEP13)、序列編號15所表示之
表位肽(PEP15)、序列編號17所表示之表位肽(PEP17)及序列編號18所表示之表位肽(PEP18)所組成之群中之3個表位肽經由連接子分別連結而成，且可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列者，其具有選自以下(1)~(3)之任一特徵：(1)C末端為PEP2(其中，於N末端經由連接子自N末端側依序相鄰地包含PEP7及PEP8者除外)；(2)C末端為PEP4；(3)C末端為PEP10；並且於免疫檢查點分子調節劑之投予前、與免疫檢查點分子調節劑之投予同時、或免疫檢查點分子調節劑之投予後進行投予。
[34]如[33]所記載之表位4連結肽，其中表位4連結肽為序列編號24、序列編號25、或序列編號26。
[35]如[33]或[34]中任一項所記載之表位4連結肽，其中免疫檢查點分子調節劑為PD-1路徑拮抗劑。
[36]如[33]至[35]中任一項所記載之表位4連結肽，其中PD-1路徑拮抗劑為選自由抗PD-1抗體及抗PD-L1抗體所組成之群中之至少1種。
[37]如[33]至[36]中任一項所記載之表位4連結肽，其中抗PD-1抗體為納武單抗或帕博利珠單抗，抗PD-L1抗體為阿特珠單抗、度伐魯單抗或阿維魯單抗。
[38]如上述表位4連結肽，其用於增強上述免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤效果。
[39]一種表位4連結肽及免疫檢查點分子調節劑，其用於預防及/或治療患者之腫瘤之方法，係同時或分別地對患者投予，該表位4連結肽包含
經由連接子而連結之4個CTL表位肽，且係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、及選自由序列編號1所表示之表位肽(PEP1)、序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號7所表示之表位肽(PEP7)、序列編號8所表示之表位肽(PEP8)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、序列編號10所表示之表位肽(PEP10)、序列編號13所表示之表位肽(PEP13)、序列編號15所表示之表位肽(PEP15)、序列編號17所表示之表位肽(PEP17)及序列編號18所表示之表位肽(PEP18)所組成之群中之3個表位肽經由連接子分別連結而成，且可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列者，其具有選自以下(1)~(3)之任一特徵：(1)C末端為PEP2(其中，於N末端經由連接子自N末端側依序相鄰地包含PEP7及PEP8者除外)；(2)C末端為PEP4；(3)C末端為PEP10。
本發明進而亦係關於以下之態樣。
‧一種上述所表示之表位4連結肽之用途，其用於增強免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤效果。
‧一種上述所表示之表位4連結肽之用途，其用於製造免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤效果增強劑。
‧一種製品，其作為用於在預防及/或治療腫瘤時同時地、逐次地、或空出間隔地使用之組合製劑，包含上述所表示之表位4連結肽、及免疫
檢查點分子調節劑。
本說明書包含成為本案之優先權之基礎之日本專利申請編號2018-124894號之揭示內容。
根據本發明之抗腫瘤劑，能夠進行抑制副作用之發生並且發揮較高之抗腫瘤效果(特別是腫瘤縮小效果、腫瘤生長延緩效果(延續壽命效果))的癌症治療。進而，能夠使癌症患者長期存活。
圖1表示CTL表位4連結肽TPV07之HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相層析法)之層析圖。
圖2表示CTL表位4連結肽TPV08之HPLC之層析圖。
圖3表示CTL表位4連結肽TPV07之質譜。
圖4表示CTL表位4連結肽TPV08之質譜。
圖5a表示將EL4.A24/SART293-101細胞株移植進小鼠之情形之腫瘤體積變化。b表示將B16F10.A24/SART293-101細胞株移植進小鼠之情形之腫瘤體積變化。
圖6表示移植有B16F10.A24/SART293-101細胞株之小鼠模型中之TPV06+抗小鼠PD-1抗體對腫瘤生長之併用效果。
圖7表示移植有B16F10.A24/SART293-101細胞株之小鼠模型中之TPV06+抗小鼠PD-L1抗體對腫瘤生長之併用效果。
圖8表示移植有B16F10.A24/SART293-101細胞株之小鼠模型中之TPV07+抗小鼠PD-1抗體對腫瘤生長之併用效果。
圖9表示移植有B16F10.A24/SART293-101細胞株之小鼠模型中之TPV08+抗小鼠PD-1抗體對腫瘤生長之併用效果。
本發明係關於一種以將表位4連結肽及免疫檢查點分子調節劑(例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體)進行併用投予為特徵之抗腫瘤劑、抗腫瘤效果增強劑、套組製劑及該等劑之用途、腫瘤治療方法、以及抗腫瘤效果增強方法。
本發明中，CTL表位4連結肽(本說明書中也記載為表位4連結肽)意指將從源自同一及/或不同腫瘤抗原分子之CTL表位肽選擇之4個肽經由連接子直鏈狀地連結而作為1分子的肽。
作為源自腫瘤抗原分子之CTL表位肽，已知以下者。
KLVERLGAA(序列編號1，本說明書中記載為「PEP1」，例如國際公開第2001/011044號)；ASLDSDPWV(序列編號2，本說明書中記載為「PEP2」，例如國際公開第2002/010369號)；ALVEFEDVL(序列編號3，本說明書中記載為「PEP3」，例如國際公開第2002/010369號)；LLQAEAPRL(序列編號4，本說明書中記載為「PEP4」，例如國際公
開第2000/12701號)；DYSARWNEI(序列編號5，本說明書中記載為「PEP5」，例如日本專利特開平11-318455號)；VYDYNCHVDL(序列編號6，本說明書中記載為「PEP6」，例如國際公開第2000/12701號)；LYAWEPSFL(序列編號7，本說明書中記載為「PEP7」，例如日本專利特開2003-000270號)；DYLRSVLEDF(序列編號8，本說明書中記載為「PEP8」，例如國際公開第2001/011044號)；QIRPIFSNR(序列編號9，本說明書中記載為「PEP9」，例如國際公開第2008/007711號)；ILEQSGEWWK(序列編號10，本說明書中記載為「PEP10」，例如國際公開第2009/022652號)；VIQNLERGYR(序列編號11，本說明書中記載為「PEP11」，例如國際公開第2009/022652號)；KLKHYGPGWV(序列編號12，本說明書中記載為「PEP12」，例如國際公開第1999/067288號)；RLQEWCSVI(序列編號13，本說明書中記載為「PEP13」，例如國際公開第2002/010369號)；ILGELREKV(序列編號14，本說明書中記載為「PEP14」，例如國際公開第2002/010369號；DYVREHKDNI(序列編號15，本說明書中記載為「PEP15」，例如國際公開第2005/071075號)；
HYTNASDGL(序列編號16，本說明書中記載為「PEP16」，例如國際公開第2001/011044號)；NYSVRYRPGL(序列編號17，本說明書中記載為「PEP17」，例如日本專利特開2003-000270號)；RYLTQETNKV(序列編號18，本說明書中記載為「PEP18」，例如國際公開第2005/116056號)
於下述之表1中記載成為CTL表位肽PEP1~PEP18之來源之蛋白質之資訊。報告有該等蛋白質於腫瘤組織中高表現。
本發明之CTL表位4連結肽係自上述CTL表位肽中之特定之13種(序
列編號1所表示之肽「PEP1」、序列編號2所表示之肽「PEP2」、序列編號4所表示之肽「PEP4」、序列編號5所表示之肽「PEP5」、序列編號6所表示之肽「PEP6」、序列編號7所表示之肽「PEP7」、序列編號8所表示之肽「PEP8」、序列編號9所表示之肽「PEP9」、序列編號10所表示之肽「PEP10」、序列編號13所表示之肽「PEP13」、序列編號15所表示之肽「PEP15」、序列編號17所表示之肽「PEP17」及序列編號18所表示之肽「PEP18」)中選擇之4種CTL表位肽經由連接子直鏈狀地連結而成之肽，可誘導及/或活化3個以上各CTL表位肽特異性之CTL。再者，亦可不直接評估CTL表位肽特異性之誘導，而藉由利用免疫蛋白酶體之切斷實驗(國際公開第2015/060235號等)判斷該表位肽特異性之CTL誘導之有無。
於本發明中，表位4連結肽係序列編號5所表示之肽「PEP5」、及選自由序列編號1所表示之肽「PEP1」、序列編號2所表示之肽「PEP2」、序列編號4所表示之肽「PEP4」、序列編號6所表示之肽「PEP6」、序列編號7所表示之肽「PEP7」、序列編號8所表示之肽「PEP8」、序列編號9所表示之肽「PEP9」、序列編號10所表示之肽「PEP10」、序列編號13所表示之肽「PEP13」、序列編號15所表示之肽「PEP15」、序列編號17所表示之肽「PEP17」及序列編號18所表示之肽「PEP18」所組成之群中之3個肽、經由連接子分別連結而成的肽。
於本發明中，具有PEP1、PEP2、PEP4、PEP5、PEP6、PEP7、
PEP8、PEP9、PEP10、PEP13、PEP15、PEP17、及PEP18之各胺基酸序列中置換、插入、缺失、及/或附加一個或複數個胺基酸而成之胺基酸序列，且具有與原先之肽同等或其以上之CTL誘導能力及/或免疫球蛋白產生誘導能力的肽亦能夠用作「CTL表位肽」。此處，「複數個」為2~3個、較佳為2個。作為此種肽，例如可列舉經具有與原先之胺基酸類似之特性之胺基酸置換之(即藉由保守性胺基酸置換而獲得之)肽。
是否為「具有與原先之肽同等或其以上之CTL誘導能力及/或免疫球蛋白產生誘導能力之肽」例如可依據國際公開第2015/060235號說明書所記載之方法進行評估。於使用上述方法進行評估之情形時，CTL誘導能力係於孔中添加源自預先被投予具有置換、插入、缺失、及/或附加一個或複數個胺基酸而成之胺基酸序列之試驗肽之小鼠的細胞、源自同系小鼠之抗原呈現細胞及試驗肽，將IFN-γ產生細胞之數作為指標，若獲得之△值之判定結果(陽性(10≦△<100)、中陽性(100≦△<200)、強陽性(200≦△))同等或為其以上，則可判斷係具有與原先之肽同等或其以上之CTL誘導能力之肽。於該情形時，若原先之肽為「陽性」，且具有置換、插入、缺失、及/或附加一個或複數個胺基酸而成之胺基酸序列之肽亦為「陽性」，則判斷係同等。又，免疫球蛋白產生誘導能力係將被投予試驗肽之小鼠血清中之CTL表位特異性IgG抗體效價作為指標，若獲得之IgG抗體效價之增加(倍數)之測定結果(2<倍數<10、10≦倍數<100、100≦倍數)同等或為其以上，則可判斷係具有同等或其以上之免疫球蛋白產生誘導能力之肽。於該情形時，若原先之肽之測定結果為「2<倍數<10」之範圍內，且具有置換、插入、缺失、及/或附加一個或複數個胺基酸而成
之胺基酸序列之肽之測定結果亦為「2<倍數<10」之範圍內，則判斷係同等。
於本發明中，連接子只要將CTL表位4連結肽投予至活體時能夠被切斷而將連結之CTL表位肽分離成單個即可，例如可列舉酯鍵、醚鍵、醯胺鍵、糖鏈連接子、聚乙二醇連接子、胺基酸連接子等。作為用作胺基酸連接子之胺基酸序列，可例示：精胺酸二聚物(RR)、精胺酸三聚物(RRR)、精胺酸四聚物(RRRR)、離胺酸二聚物(KK)、離胺酸三聚物(KKK)、離胺酸四聚物(KKKK)、甘胺酸二聚物(GG)、甘胺酸三聚物(GGG)、甘胺酸四聚物(GGGG)、甘胺酸五聚物(GGGGG)、甘胺酸六聚物(GGGGGG)、丙胺酸-丙胺酸-酪胺酸(AAY)、異白胺酸-白胺酸-丙胺酸(ILA)、精胺酸-纈胺酸-離胺酸-精胺酸(RVKR)等，較佳為精胺酸二聚物(RR)或精胺酸三聚物(RRR)，更佳為精胺酸二聚物(RR)。表位連結肽所使用之連接子於該領域中為已知，業者可適當選擇使用。
於本發明之表位4連結肽中，所選擇之CTL表位肽及其連結順序可將以特定之組合及特定之連結順序合成之表位4連結肽投予至表現人HLA-A之轉基因小鼠，於體內評估各CTL表位肽特異性之CTL誘導之有無而決定。於體內評估各CTL表位肽特異性之CTL誘導之有無之方法例如可依據國際公開第2015/060235號說明書所記載之方法進行評估。選擇之CTL表位肽及其連結順序可使用該方法對至少3種以上、較佳為4種CTL表位肽決定可見各CTL表位肽特異性之CTL之誘導之CTL表位肽及其連結順序。
本發明之表位4連結肽較佳為具有選自以下(1)~(3)之任一特徵：(1)C末端為PEP2(其中，於N末端經由連接子自N末端側依序相鄰地包含PEP7及PEP8者除外)；(2)C末端為PEP4；(3)C末端為PEP10。
因此，較佳為本發明之表位4連結肽係序列編號5所表示之肽「PEP5」、及選自由序列編號1所表示之肽「PEP1」、序列編號2所表示之肽「PEP2」、序列編號4所表示之肽「PEP4」、序列編號6所表示之肽「PEP6」、序列編號7所表示之肽「PEP7」、序列編號8所表示之肽「PEP8」、序列編號9所表示之肽「PEP9」、序列編號10所表示之肽「PEP10」、序列編號13所表示之肽「PEP13」、序列編號15所表示之肽「PEP15」、序列編號17所表示之肽「PEP17」及序列編號18所表示之肽「PEP18」所組成之群中之3個肽經由連接子分別連結而成，且具有選自以下(1)~(3)之任一特徵：(1)C末端為PEP2(其中，於N末端經由連接子自N末端側依序相鄰地包含PEP7及PEP8者除外)；(2)C末端為PEP4；(3)C末端為PEP10。
更佳為本發明之表位4連結肽係序列編號5所表示之肽「PEP5」、序列編號6所表示之肽「PEP6」及序列編號9所表示之肽「PEP9」、以及
選自由序列編號2所表示之肽「PEP2」、序列編號4所表示之肽「PEP4」及序列編號10所表示之肽「PEP10」組成之群中之1個肽經由連接子分別連結而成，且C末端為PEP2、PEP4、或PEP10。
更佳為本發明之表位4連結肽係包含從以下選擇之序列之肽：‧PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4；‧PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4；‧PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4；‧PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4；‧PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4；‧PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4；‧PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP2；或‧PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP10。
再者，式中「(L)」表示連接子。
更佳為本發明之表位4連結肽係包含從以下選擇之序列之肽：‧PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4；‧PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP2；或‧PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP10。
再者，式中「(L)」表示連接子。
更佳為本發明之表位4連結肽係連接子為精胺酸二聚物之從以下選擇之序列所表示之肽：
‧PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4(序列編號24，本說明書中記載為TPV06)；‧PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP2(序列編號25，本說明書中記載為TPV07)；或‧PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP10(序列編號26，本說明書中記載為TPV08)；更佳為本發明之表位4連結肽係序列編號24所表示之肽TPV06。
於本發明之態樣之一中，表位4連結肽較佳為選自以下之表2所示之序列編號19~28中之序列所表示之肽。
更佳為表位4連結肽係選自上述表2中列舉者中之以下之肽：‧TPV01(序列編號19)；‧TPV02(序列編號20)；‧TPV03(序列編號21)；
‧TPV04(序列編號22)；‧TPV05(序列編號23)；或‧TPV06(序列編號24)。
又，於本發明中，表位4連結肽可使用2種以上，例如可將2種、3種、4種或其以上之表位4連結肽單獨地、或混合使用，較佳為將3種表位4連結肽混合使用。於使用2種以上表位4連結肽之情形，只要至少含有1種本發明之表位4連結肽即可，剩餘之1種以上可為本發明之表位4連結肽，亦可為例如國際公開第2015/060235號所記載之表位4連結肽。較佳為使用序列編號24所表示之肽與1種以上之國際公開第2015/060235號所記載之CTL表位4連結肽，更佳為使用序列編號24所表示之肽與2種國際公開第2015/060235號所記載之表位4連結肽，進而更佳為將序列編號24所表示之肽、序列編號44所表示之肽(TPV011：PEP15-RR-PEP18-RR-PEP1-RR-PEP10)及序列編號45所表示之肽(TPV012：RRRR-PEP7-RR-PEP13-RR-PEP8-RR-PEP2)這3種混合使用。
本發明之CTL表位4連結肽可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列。該肽序列可附加於CTL表位4連結肽之N末端及/或C末端，較佳為附加於N末端。該肽序列可選擇包含選自由精胺酸、組胺酸、離胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、絲胺酸、天冬醯胺、麩醯胺、天冬胺酸、及麩胺酸所組成之群中之1~15個、較佳為2~10個、進而較佳為3~5個親水性胺基酸者。例如，作為該肽序列，可利用精胺酸三聚物(RRR)或精胺酸四聚物(RRRR)，作為附加有此種肽序列之CTL表位4連結肽，可例示RRR-TPV06、RRRR-
TPV06、TPV06-RRR、TPV06-RRRR、RRR-TPV07、RRRR-TPV07、TPV07-RRR、TPV07-RRRR、RRR-TPV08、RRRR-TPV08、TPV08-RRR、TPV08-RRRR、KKK-TPV06、KKKK-TPV06、TPV06-KKK、TPV06-KKKK、KKK-TPV07、KKKK-TPV07、TPV07-KKK、TPV07-KKKK、KKK-TPV08、KKKK-TPV08、TPV08-KKK、TPV08-KKKK、HHH-TPV06、HHHH-TPV06、TPV06-HHH、TPV06-HHHH、HHH-TPV07、HHHH-TPV07、TPV07-HHH、TPV07-HHHH、HHH-TPV08、HHHH-TPV08、TPV08-HHH、TPV08-HHHH、RRKK-TPV06、RKRK-TPV06、RHRH-TPV06、RRHH-TPV06、KKHH-TPV06、KHKH-TPV06等，較佳為RRR-TPV06、RRRR-TPV06、RRR-TPV07、RRRR-TPV07、RRR-TPV08、RRRR-TPV08、KKK-TPV06、KKKK-TPV06、KKK-TPV07、KKKK-TPV07、KKK-TPV08、KKKK-TPV08、HHH-TPV06、HHHH-TPV06、HHH-TPV07、HHHH-TPV07、HHH-TPV08、HHHH-TPV08、RRKK-TPV06、RKRK-TPV06、RHRH-TPV06、RRHH-TPV06、KKHH-TPV06、KHKH-TPV06，進而較佳為RRR-TPV06(TPV09)、RRRR-TPV06(TPV10)、RRR-TPV07、RRRR-TPV07、RRR-TPV08、RRRR-TPV08，最佳為RRR-TPV06(TPV09)、RRRR-TPV06(TPV10)。
已知附加有包含親水性胺基酸之該肽序列之肽提高向水性溶劑之溶解度(Peptides：38,302-311(2012)、日本專利特開2006-188507)。藉由向本發明之CTL表位4連結肽附加該肽序列，能夠提高CTL表位4連結肽向水性溶劑之溶解度。
本發明之「可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列之表位4連結肽」較佳為可於N末端具有包含親水性胺基酸之肽序列之CTL表位4連結肽，更佳為可於N末端具有包含選自由精胺酸、組胺酸及離胺酸所組成之群中之3~5個親水性胺基酸之肽序列的CTL表位4連結肽，更佳為可於N末端具有精胺酸三聚物(RRR)或精胺酸四聚物(RRRR)之CTL表位4連結肽，更佳為不具有包含親水性胺基酸之肽序列之CTL表位4連結肽。
再者，本發明之CTL表位4連結肽例如可依據國際公開第2015/060235號說明書所記載之方法合成。
本發明中之免疫檢查點分子調節劑具有作用於免疫檢查點分子而誘導癌症患者之體內之抗腫瘤免疫應答，控制腫瘤之免疫逃避的作用。
因此，可使用以免疫檢查點分子作為靶之物質作為免疫檢查點分子調節劑。作為免疫檢查點分子，例如可列舉B7家族(B7-1、B7-2、PD-L1、PD-L2等)、CD28家族(CTLA-4、PD-1等)、TNF超級家族(4-1BBL、OX40L等)、TNF受體超級家族(4-1BB、OX40等)分子，該等大致分類為刺激性之共刺激分子即costimulatory分子、及抑制性之共刺激分子即coinhibitory分子。
作為本發明中可良好地使用之免疫檢查點分子調節劑，可列舉促進costimulatory分子之功能之物質、或抑制coinhibitory分子之功能之物質。更具體而言，作為免疫檢查點分子調節劑，例如可列舉PD-1路徑拮
抗劑、ICOS路徑促效劑、CTLA-4路徑拮抗劑、CD28路徑促效劑、BTLA路徑拮抗劑、4-1BB路徑促效劑等。
於本發明中，免疫檢查點分子調節劑較佳為選自由PD-1路徑拮抗劑、ICOS路徑促效劑、CTLA-4路徑拮抗劑及CD28路徑促效劑所組成之群中之至少1種，更佳為選自由PD-1路徑拮抗劑、CTLA-4路徑拮抗劑及CD28路徑促效劑所組成之群中之至少1種，更佳為選自由PD-1路徑拮抗劑及CTLA-4路徑拮抗劑所組成之群中之至少1種，就抑制副作用之觀點而言，進而更佳為PD-1路徑拮抗劑。
PD-1路徑拮抗劑係阻礙由在T細胞上表現之PD-1或其配體PD-L1或PD-L2所產生之免疫抑制訊息者，可列舉抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、PD-1細胞外域、PD-L1細胞外域、PD-L2細胞外域、PD-1-Ig(PD-1細胞外域與免疫球蛋白(Ig)之FC區之融合蛋白)、PD-L1-Ig、PD-L2-Ig、PD-1 siRNA、PD-L1 siRNA、PD-L2 siRNA等。作為PD-1路徑拮抗劑，較佳為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、或抗PD-L2抗體，更佳為抗PD-1抗體、或抗PD-L1抗體。其中，尤佳為抗PD-1抗體。
又，CTLA-4路徑拮抗劑係阻礙由在T細胞上表現之CTLA-4或其配體B7-1(CD80)或B7-2(CD86)所產生之免疫抑制訊息者，可列舉抗CTLA-4抗體、CTLA-4細胞外域、CTLA-4-Ig、抗B7-1(CD80)抗體、或抗B7-2(CD86)抗體、CTLA-4 siRNA等。作為CTLA-4路徑拮抗劑，較佳為抗CTLA-4抗體、CTLA-4細胞外域、CTLA-4-Ig、抗B7-1(CD80)抗體、或
抗B7-2(CD86)抗體，更佳為抗CTLA-4抗體、或CTLA-4-Ig。其中，尤佳為抗CTLA-4抗體。
該等抗體可列舉免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgY等)、Fab片段、F(ab')2片段、單鏈抗體片段(scFv)、單域抗體、雙抗體等(Nat.Rev.Immunol.,6：343-357,2006)，該等可列舉人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、小鼠抗體、美洲駝抗體、雞抗體等單株抗體或多株抗體。
較佳為人源化IgG單株抗體或人IgG單株抗體。
作為本發明中之抗PD-1抗體，可列舉納武單抗、帕博利珠單抗、Cemiplimab或Spartalizumab等，較佳為納武單抗或帕博利珠單抗。
作為本發明中之抗PD-L1抗體，可列舉阿特珠單抗、度伐魯單抗或阿維魯單抗等，較佳為阿特珠單抗、度伐魯單抗或阿維魯單抗。
作為本發明中之抗CTLA-4抗體，可列舉伊匹木單抗或曲美木單抗等，較佳為伊匹木單抗。
作為本發明中之CTLA-4-Ig，可列舉阿巴西普等，較佳為阿巴西普。
該等抗體可藉由通常公知之抗體製作方法製造。
又，抗PD-1抗體係作為納武單抗或帕博利珠單抗、抗PD-L1抗體係作為阿特珠單抗、度伐魯單抗或阿維魯單抗、抗CTLA-4抗體係作為伊匹木單抗或曲美木單抗、CTLA-4-Ig係作為阿巴西普已經銷售、或預計銷售，亦可使用該市售品。
本發明中，於使用2種以上之免疫檢查點分子調節劑之情形時，例如可將抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體併用地使用，亦可使用可結合於PD-1及CTLA-4雙方之雙特異性抗體。作為雙特異性抗體，例如可列舉XmAb20717(PD-1×CTLA-4)。
關於本發明中使用之表位4連結肽對人之推薦劑量，於單獨投予之情形時，表位4連結肽每1種為3~9mg/body/day之範圍。於本發明中，作為表位4連結肽於投予日中每1天之投予量，就由表位4連結肽產生之免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤效果之增強效果之觀點而言，較佳為單獨投予表位4連結肽之情形時之推薦劑量之50~200%，更佳為80~120%，尤佳為100%。
因此，於對人之推薦劑量為3mg/body/day之情形時，投予量較佳為表位4連結肽每1種為1.5~6mg/body/day，更佳為2.4~3.6mg/body/day，尤佳為3mg/body/day。又，於對人之推薦劑量為9mg/body/day之情形時，投予量較佳為表位4連結肽每1種為4.5~18mg/body/day，更佳為7.2~10.8mg/body/day，尤佳為9mg/body/day。
於本發明中，作為免疫檢查點分子調節劑於投予日之每1天之投予量，就由表位4連結肽產生之免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤效果之增強作用之觀點而言，較佳為單獨投予免疫檢查點分子調節劑之情形時之推薦劑量之50~100%，更佳為100%。
具體而言，由於單獨投予納武單抗之情形之推薦劑量係日本批准之投予量1次2mg/kg(體重)或1次3mg/kg(體重)，故而本發明中之納武單抗於投予日之每1天之投予量較佳為1次1~3mg/kg(體重)，更佳為1次2mg/kg(體重)或1次3mg/kg(體重)。
由於單獨投予帕博利珠單抗之情形之推薦劑量係日本批准之投予量1次2mg/kg(體重)或1次200mg，故而本發明中之帕博利珠單抗於投予日之每1天之投予量較佳為1次1~2mg/kg(體重)或1次100~200mg，更佳為1次2mg/kg(體重)或1次200mg。
由於單獨投予阿特珠單抗之情形之推薦劑量係日本批准之投予量1次1200mg，故而本發明中之阿特珠單抗於投予日之每1天之投予量較佳為1次600~1200mg，更佳為1次1200mg。
由於單獨投予阿維魯單抗或度伐魯單抗之情形之推薦劑量係美國批准之投予量1次10mg/kg(體重)，故而本發明中之阿維魯單抗或度伐魯單抗於投予日之每1天之投予量較佳為1次5~10mg/kg(體重)，更佳為1次10mg/kg(體重)。
由於單獨投予伊匹木單抗之情形之推薦劑量係日本批准之投予量1次3mg/kg(體重)，故而本發明中之伊匹木單抗於投予日之每1天之投予量較佳為1次1.5~3mg/kg(體重)，更佳為1次3mg/kg(體重)。
再者，本發明中「推薦劑量」可為由臨床試驗等決定之不發生嚴重之副作用而能夠安全地使用之範圍內獲得最大治療效果的投予量。具體而言，可列舉由日本獨立行政法人醫藥品醫療機器綜合機構(PMDA：Pharmaceuticals and Medical Devices Agency)、美國食品醫藥品局(FDA：Food and Drug Administration)、歐州醫藥品局(EMA：European Medicines Agency)等公共機構或團體批准/推薦/建議且記載於隨附文件/IF文件(interview form)/治療指南等中之投予量，較佳為由PMDA、FDA或EMA之任一公共機關批准之投予量。
本發明之抗腫瘤劑之投予排程可根據癌症種類或病期等而適當選擇。
於表位4連結肽之情形時，較佳為如下投予排程：將在1週內投予1次之步驟重複3次(在第1天、第8天、第15天1天1次)，將共計21天設為1週期。又，第3週期以後較佳為如下投予排程：在第1天投予，在20天內停藥，將共計21天設為1週期(3週內投予1次之方法)。
於納武單抗之情形時，較佳為以2週或3週間隔進行投予之投予排程。
於帕博利珠單抗、阿特珠單抗或伊匹木單抗之情形時，較佳為以3週間隔進行投予之投予排程。
於阿維魯單抗或度伐魯單抗之情形時，較佳為以2週間隔進行投予之投予排程。
本發明之抗腫瘤劑之1天之投予次數可根據癌症種類或病期等而適當選擇。
於表位4連結肽、納武單抗、帕博利珠單抗、阿特珠單抗、阿維魯單抗或伊匹木單抗之情形時，較佳為1天1次。
本發明之表位4連結肽及免疫檢查點分子調節劑之投予順序可根據癌症種類或病期等適當選擇，可先投予其中一個，亦可同時投予。此處，於不同時投予兩劑之情形時，兩劑之投予間隔只要可發揮抗腫瘤效果之增強效果即可，可適當選擇，較佳為1~21天，更佳為1~14天，尤佳為1~7天。本發明之表位4連結肽及免疫檢查點分子調節劑之投予順序較佳為先投予表位4連結肽。
本發明中成為對象之腫瘤只要為發揮抗腫瘤效果之增強效果之範圍內，則無特別限制，較佳為表位4連結肽發揮抗腫瘤效果之腫瘤，更佳為Lck、WHSC2、SART2、SART3、MRP3、UBE2V、EGFR、或PTHrP陽性之惡性腫瘤，更佳為SART2陽性之惡性腫瘤。
作為成為本發明之對象之癌，具體而言，可列舉：腦腫瘤、頭頸癌、消化系統癌(食道癌、胃癌、十二指腸癌、肝臟癌、膽道癌(膽囊/膽管癌等)、胰腺癌、小腸癌、大腸癌(結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌等)、消化道間質腫瘤等)、肺癌(非小細胞肺癌、小細胞肺癌)、乳癌、卵巢癌、子宮癌(子宮頸癌、子宮體癌等)、腎癌、尿路上皮癌(膀胱癌、腎盂癌、尿道癌)、前列腺癌、皮膚癌、原發不明癌等。再者，此處，癌不僅包括
原發病灶，亦包括轉移至其他臟器(肝臟等)之癌。其中，就抗腫瘤效果之觀點而言，較佳為頭頸癌、消化系統癌、肺癌、腎癌、尿路上皮癌、皮膚癌，更佳為消化系統癌、肺癌、尿路上皮癌、皮膚癌，尤佳為肺癌、尿路上皮癌。又，本發明之抗腫瘤劑亦可用於為了外科地摘除腫瘤後防止復發而進行之術後輔助化學療法，或為了外科地摘除腫瘤而事先進行之術前輔助化學療法。
本發明中，表位4連結肽、及免疫檢查點分子調節劑可基於各有效成分之投予形態或投予排程，將各有效成分分成複數種劑形製劑化，亦可統一成一種劑形製劑化(即作為複合劑進行製劑化)。又，可將各製劑集中至適於併用之1個包裝來製造銷售，又，亦可將各製劑分成單獨之包裝來製造銷售。
作為本發明之抗腫瘤劑之投予形態，並無特別限制，可根據治療目的適當選擇，具體而言，可例示：經口劑(錠劑、包衣錠劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑、液劑等)、注射劑、栓劑、貼附劑、軟膏劑等。
作為表位4連結肽、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體及抗CTLA-4抗體之投予形態，可列舉上述投予形態，較佳為注射劑。
本發明中之抗腫瘤劑可對表位4連結肽或免疫檢查點分子調節劑均根據其投予形態，使用藥學上容許之載體，藉由通常公知之方法而製備。作為該載體，可例示通常之藥劑所通用之各種載體，例如賦形劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、稀釋劑、增溶劑、懸浮劑、等張劑、pH值調整劑、緩
衝劑、穩定劑、著色劑、矯味劑、矯臭劑等。
本發明又係關於一種抗腫瘤效果增強劑，其用於增強免疫檢查點分子調節劑對癌症患者之抗腫瘤效果，包含表位4連結肽作為有效成分。該抗腫瘤效果增強劑具有上述抗腫瘤劑之製劑形態。
本發明又係關於一種抗腫瘤劑，其用於治療被投予免疫檢查點分子調節劑之癌症患者，且包含表位4連結肽。該抗腫瘤劑具有上述之製劑形態。
本發明又係關於一種抗腫瘤劑，其用於治療被投予表位4連結肽之癌症患者，且包含免疫檢查點分子調節劑。該抗腫瘤劑具有上述之製劑形態。
「治療」包括為了於外科地摘除腫瘤後防止復發而進行之術後輔助化學療法、為了外科地摘除腫瘤而事先進行之術前輔助化學療法。
本發明又係關於一種包含表位4連結肽之抗腫瘤劑，其特徵在於針對癌症患者與免疫檢查點分子調節劑併用。該抗腫瘤劑具有上述之製劑形態。
本發明又係關於一種包含免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤劑，其特徵在於針對癌症患者與表位4連結肽併用。該抗腫瘤劑具有上述之製劑形態。
本發明又係關於一種套組製劑，其包括：包含表位4連結肽之抗腫瘤劑、記載有對癌症患者併用投予表位4連結肽與免疫檢查點分子調節劑之使用說明書。
此處，「使用說明書」只要為記載有上述投予量者即可，較佳為推薦上述投予量，不管有無法律約束力均可。具體而言，可例示隨附文件、手冊等。又，包含使用說明書之套組製劑可於套組製劑之包裝上印刷/隨附有使用說明書，亦可於套組製劑之包裝中與抗腫瘤劑一起內封有使用說明書。
另一方面，本發明者等人之小組確立了於非人動物中表現源自人或非人之β2微球蛋白、HLA I類之α1及α2區、以及源自人或非人之MHC I類之α3區連結而成之人工嵌合基因的技術，成功製作了表現HLA I類之非人動物(國際公開第2015/056774號)。
藉由使用上述非人動物，能夠於非人動物中再現人之免疫應答。即，上述非人動物中之抗原呈現細胞由於表現HLA I類之α1及α2區，故而能夠呈現可與其結合之人腫瘤抗原表位肽。
本發明者進而發現：藉由使人HLA-A24與源自SART2之人腫瘤抗原表位肽共表現，能夠評估由投予表位4連結肽所產生之CTL誘導之效果。例如，藉由使人HLA-A24與源自SART2之人腫瘤抗原表位肽對源自小鼠腫瘤之培養細胞共表現，並移植進上述非人動物，能夠使呈現源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之腫瘤生長。
即，本發明提供一種細胞，其導入有編碼源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之多核苷酸、及編碼人HLA-A24之尤其是α1及α2區之多核苷酸。此處，源自SART2之人腫瘤抗原表位肽較佳為包含PEP5，因此，較佳為向該細胞導入編碼PEP5之多核苷酸。
本發明者成功地使共表現HLA-A24與PEP5之腫瘤於上述非人動物中存活，並證實可藉由該體系而評估本發明之抗腫瘤劑等。
因此，本發明係關於一種細胞(以下，亦稱為「本發明之細胞」)，其導入有編碼源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之多核苷酸及編碼人HLA-A24之α1及α2區之多核苷酸。
如上文所記載，SART2係報告於腫瘤組織中高表現之蛋白質之1種。作為於樹狀細胞等抗原呈現細胞中，可與HLA-A24型之HLA分子結合而呈現之源自SART2之人腫瘤抗原表位肽，可列舉上述PEP5。將肽PEP5之胺基酸序列表示於序列編號5，將編碼肽PEP5之多核苷酸序列表示於序列編號29。
本說明書中，「編碼源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之多核苷酸」較佳為選自以下(a)~(e)之多核苷酸：(a)編碼包含序列編號5所表示之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(b)編碼包含序列編號5所表示之胺基酸序列中置換、缺失、或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；
(c)編碼包含與序列編號5所表示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(d)包含序列編號29所表示之鹼基序列的多核苷酸；(e)包含與序列編號29所表示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列的多核苷酸；更佳為選自以下(a)~(e)之多核苷酸：(a)編碼包含序列編號5所表示之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(b)編碼包含序列編號5所表示之胺基酸序列中置換、缺失、或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列之多肽的多核苷酸(其中，胺基酸之附加僅限於向N末端側之附加)；(c)編碼包含與序列編號5所表示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(d)包含序列編號29所表示之鹼基序列的多核苷酸；(e)包含與序列編號29所表示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列的多核苷酸；更佳為選自上述(a)或(d)之多核苷酸。
於本說明書中，「包含序列編號5所表示之胺基酸序列之多肽」可為附加有訊息序列之序列。較佳為「包含序列編號5所表示之胺基酸序列之多肽」係於序列編號5所表示之胺基酸序列之N末端側附加作為訊息序列之10~30個胺基酸而成之多肽，更佳為附加作為訊息序列之15~25個胺基酸而成之多肽，更佳為包含序列編號32所表示之胺基酸序列之多肽。
同樣地，於本說明書中，「包含序列編號5所表示之胺基酸序列中置換、缺失、或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列之多肽」可為附加有訊息序列之序列。較佳為於序列編號5所表示之胺基酸序列中置換、缺失、或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列之N末端側附加作為訊息序列之10~30個胺基酸而成的多肽，更佳為附加作為訊息序列之15~25個胺基酸而成的多肽，更佳為包含序列編號32所表示之胺基酸序列之多肽。
同樣地，於本說明書中，「包含與序列編號5所表示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列之多肽」可為附加有訊息序列之序列。較佳為於與序列編號5所表示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列之N末端側附加作為訊息序列之10~30個胺基酸而成的多肽，更佳為附加作為訊息序列之15~25個胺基酸而成的多肽，更佳為包含序列編號32所表示之胺基酸序列之多肽。
同樣地，於本說明書中，「包含序列編號29所表示之鹼基序列的多核苷酸」可為附加有編碼訊息序列之鹼基序列之序列。較佳為於序列編號29所表示之鹼基序列之5'末端側附加編碼訊息序列之30~90個鹼基而成的多核苷酸，更佳為附加編碼訊息序列之45~75個鹼基而成的多核苷酸，更佳為包含序列編號33所表示之鹼基序列的多核苷酸。
同樣地，於本說明書中，「包含與序列編號29所表示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列的多核苷酸」可為附加有編碼訊息序列之鹼
基序列之序列。較佳為於與序列編號29所表示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列之5'末端側附加編碼訊息序列之30~90個鹼基而成的多核苷酸，更佳為附加編碼訊息序列之45~75個鹼基而成的多核苷酸，更佳為包含序列編號33所表示之鹼基序列的多核苷酸。
於本發明之態樣之一中，「編碼源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之多核苷酸」較佳為選自以下(k)~(o)之多核苷酸：(k)編碼包含序列編號32所表示之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(l)編碼包含序列編號32所表示之胺基酸序列中置換、缺失、或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(m)編碼包含與序列編號32所表示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(n)包含序列編號33所表示之鹼基序列的多核苷酸；(o)包含與序列編號33所表示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列的多核苷酸；更佳為選自以下(k)~(o)之多核苷酸：(k)編碼包含序列編號32所表示之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(l)編碼包含序列編號32所表示之胺基酸序列中置換、缺失、或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列之多肽的多核苷酸(其中，胺基酸之附加僅限於向N末端側之附加)；(m)編碼包含與序列編號32所表示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(n)包含序列編號33所表示之鹼基序列的多核苷酸；
(o)包含與序列編號33所表示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列的多核苷酸；更佳為選自上述(k)或(n)之多核苷酸。
再者，「源自SART2之人腫瘤抗原表位肽」較佳為能夠識別序列編號5所表示之胺基酸序列特異性之CTL。
此處，「能夠識別序列編號5所表示之胺基酸序列特異性之CTL」例如可藉由使用本發明之細胞與序列編號5所表示之胺基酸序列特異性之CTL的51Cr釋放分析、ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，酵素結合免疫吸附分析)法(例如IFN-γ之測定)或ELISPOT(enzyme-linked immune absorbent spot，酵素結合免疫吸附斑)分析(例如IFN-γ之測定)而確認。
於本說明書中，「編碼人HLA-A24之α1及α2區之多核苷酸」較佳為選自以下(f)~(j)之多核苷酸：(f)編碼包含序列編號30所表示之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(g)編碼包含序列編號30所表示之胺基酸序列中置換、缺失、或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(h)編碼包含與序列編號30所表示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(i)包含序列編號31所表示之鹼基序列的多核苷酸；(j)包含與序列編號31所表示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列的多核苷酸；
更佳為選自上述(f)或(i)之多核苷酸。
於本說明書中，「包含序列編號30所表示之胺基酸序列之多肽」較佳為於序列編號30所表示之胺基酸序列之N末端側附加β2微球蛋白、於C末端側附加MHC I類之α3區而成的多肽，更佳為包含序列編號34所表示之胺基酸序列之多肽。
於本說明書中，「包含序列編號30所表示之胺基酸序列中置換、缺失、或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列之多肽」較佳為於序列編號30所表示之胺基酸序列中置換、缺失、或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列之N末端側附加β2微球蛋白、於C末端側附加MHC I類之α3區而成的多肽，更佳為包含序列編號34所表示之胺基酸序列之多肽。
於本說明書中，「包含與序列編號30所表示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列之多肽」較佳為於與序列編號30所表示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列之N末端側附加β2微球蛋白、於C末端側附加MHC I類之α3區而成的多肽，更佳為包含序列編號34所表示之胺基酸序列之多肽。
於本說明書中，「包含序列編號31所表示之鹼基序列的多核苷酸」較佳為於序列編號31所表示之鹼基序列之5'末端側附加編碼β2微球蛋白之鹼基序列、於3'末端側附加編碼MHC I類之α3區之鹼基序列而成的多核苷酸，更佳為包含序列編號35所表示之鹼基序列的多核苷酸。
於本說明書中，「包含與序列編號31所表示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列的多核苷酸」較佳為於與序列編號31所表示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列之5'末端側附加編碼β2微球蛋白之鹼基序列、於3'末端側附加編碼MHC I類之α3區之鹼基序列而成的多核苷酸，更佳為包含序列編號35所表示之鹼基序列的多核苷酸。
於本說明書中，「β2微球蛋白」係指構成MHC I類分子之β鏈之蛋白質。於本說明書中，「β2微球蛋白」可源自人或非人(小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、豬、牛、羊等)之任一者，較佳為人β2微球蛋白(於本說明書中亦記載為「hβ2M」)。
於本說明書中，「人β2微球蛋白」係選自以下(i)~(iii)之多核苷酸：(i)編碼包含序列編號36所表示之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(ii)編碼包含序列編號36所表示之胺基酸序列中置換、缺失、或附加1個或數個胺基酸而成，且藉由與MHC I類之α鏈形成複合體而具有該MHC I類特異性之抗原呈現能力之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(iii)編碼包含與序列編號36所表示之胺基酸序列具有90%以上之同一性，且藉由與MHC I類之α鏈形成複合體而具有該MHC I類特異性之抗原呈現能力之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；較佳為(i)所表示之多核苷酸。
於本說明書中，「MHC I類之α3區」係指參與和在CTL表面表現之輔
助受體CD8分子之結合的α3區及存在於其C末端側之膜貫通區及細胞內區。於本說明書中，「MHC I類之α3區」可源自人或非人(小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、豬、牛、羊等)之任一者，較佳為小鼠MHC I類之α3區(於本說明書中亦記載為「mα3」)。
於本說明書中，「小鼠MHC I類之α3區」係選自以下(iv)~(vi)之多核苷酸：(iv)編碼包含序列編號37所表示之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(v)編碼包含序列編號37所表示之胺基酸序列中置換、缺失、或附加1個或數個胺基酸而成且具有CD8分子結合能力之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(vi)編碼包含與序列編號37所表示之胺基酸序列具有90%以上之同一性且具有CD8分子結合能力之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；較佳為(iv)所表示之多核苷酸。
於本發明之態樣之一中，於本說明書中，「編碼人HLA-A24之α1及α2區之多核苷酸」較佳為選自以下(p)~(t)之多核苷酸：(p)編碼包含序列編號34所表示之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(q)編碼包含序列編號34所表示之胺基酸序列中置換、缺失、或附加1個或數個胺基酸而成之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(r)編碼包含與序列編號34所表示之胺基酸序列具有90%以上之同一性之胺基酸序列之多肽的多核苷酸；(s)包含序列編號35所表示之鹼基序列的多核苷酸；
(t)包含與序列編號35所表示之鹼基序列具有90%以上之同一性之鹼基序列的多核苷酸；更佳為選自上述(p)或(s)之多核苷酸。
再者，「編碼人HLA-A24之α1及α2區之多核苷酸」較佳為被編碼之α1及α2區可將包含序列編號5所表示之胺基酸序列之多肽作為抗原呈現；較佳為可將包含序列編號5所表示之胺基酸序列之多肽作為抗原呈現，且具有CD8分子結合能力；較佳為可將包含序列編號5所表示之胺基酸序列之多肽作為抗原呈現，且具有CD8分子結合能力，進而藉由β2微球蛋白與MHC I類之α鏈形成複合體而具有該MHC I類特異性之抗原呈現能力。
是否具有該等功能例如可藉由使用本發明之細胞與序列編號5所表示之胺基酸序列特異性之CTL的51Cr釋放分析、ELISA法(例如IFN-γ之測定)或ELISPOT分析(例如IFN-γ之測定)而確認。
用於建立本發明之細胞之宿主細胞較佳為源自動物之細胞株，且於移植進動物之情形時能夠形成腫瘤。更佳為宿主細胞係源自小鼠之細胞株，且於移植進小鼠之情形時能夠形成腫瘤。藉由宿主細胞而形成之腫瘤並無限定，若採用例如黑色素瘤或淋巴瘤等實體腫瘤，則由於容易進行腫瘤之生長及消退等之評估，故而較佳。作為宿主細胞，較佳為B16F10細胞。
用於向用以建立本發明之細胞的宿主細胞導入編碼源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之多核苷酸及編碼人HLA-A24之α1及α2區之多核苷酸的
載體只要為能夠於宿主中複製者，則無特別限定，可根據導入之宿主之種類、導入方法等而適當選擇。例如可列舉質體DNA載體、病毒載體。作為質體DNA載體，例如可列舉pCMV6(Origene)、piggyBac轉位子載體(PiggyBac Transposon Vector)(System Biosciences)、pCAG(FUJIFILM Wako Pure Chemical)、pcDNA3.1(Thermo Fisher Scientific)。又，作為病毒載體，例如可列舉pMX(Cell Biolabs)、pLVSIN(TAKARA BIO)、pAAV(TAKARA BIO)、pAdenoX(Clontech Laboratories)。
於使用該載體使宿主轉形時，可使用脂轉染法、電穿孔法等進行。所獲得之轉形體使用可同化之包含碳源、氮源、金屬鹽、維生素等之培養基，於適當之條件下培養即可。
確認細胞是否為導入有編碼源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之多核苷酸及編碼人HLA-A24之α1及α2區之多核苷酸的細胞例如可使用編碼人腫瘤抗原表位肽之多核苷酸或多肽及編碼人HLA-A24之α1及α2區之多核苷酸或多肽之表現之檢測方法，以其表現作為指標進行確認。
關於編碼源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之多核苷酸之表現之檢測方法，例如可將與包含編碼PEP5之多核苷酸之序列編號29或序列編號33所表示之多核苷酸、或包含與序列編號29或序列編號33所表示之多核苷酸互補之鹼基序列之多核苷酸特異性地雜交的多肽用作引子，使用北方墨點法、南方墨點法、RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，反轉錄酶-聚合酶鏈反應)法、即時PCR法、數位PCR法、DNA
微陣列法、原位(in situ)雜交法、序列分析法等通常慣用之檢測法。
關於編碼人HLA-A24之α1及α2區之多核苷酸之表現之檢測方法，例如可將與包含編碼HLA-A24之α1及α2區之胺基酸序列之多核苷酸之序列編號31或序列編號35所表示之多核苷酸、或包含與序列編號31或序列編號35所表示之多核苷酸互補之鹼基序列的多核苷酸特異性地雜交的多核苷酸用作引子，使用上述通常慣用之檢測法。
該引子係作為與序列編號29或序列編號33所表示之多核苷酸、或包含與序列編號29或序列編號33所表示之多核苷酸互補之鹼基序列之多核苷酸特異性地雜交的多核苷酸，可由通常公知之方法製作。又，作為與序列編號31或序列編號35所表示之多核苷酸、或包含與序列編號31或序列編號35所表示之多核苷酸互補之鹼基序列的多核苷酸特異性地雜交的多核苷酸，可由通常公知之方法製作。該引子之鹼基數為10~50個鹼基，較佳為10~40個鹼基，更佳為10~30個鹼基。
又，該引子只要與序列編號29或序列編號33所表示之多核苷酸或包含與序列編號29或序列編號33所表示之多核苷酸互補之鹼基序列的多核苷酸、或序列編號31或序列編號35所表示之多核苷酸或包含與序列編號31或序列編號35所表示之多核苷酸互補之鹼基序列的多核苷酸特異性地雜交即可，無需完全互補。該引子係與對應之鹼基序列相比具有70%以上、較佳為80%以上、更佳為90%以上、更佳為95%以上、更佳為98%以上之同一性之多核苷酸，最佳為完全互補之多核苷酸。
編碼源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之多核苷酸之表現之檢測方法所使用之引子較佳為序列編號42及序列編號43所表示之引子組。
編碼源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之多肽之表現之檢測方法例如可利用：使用與序列編號5所表示之多肽特異性地結合之抗體之ELISA法、西方墨點法、流動式細胞測量法或免疫組織化學染色法等通常慣用之檢測方法。較佳為流動式細胞測量法。與序列編號5所表示之多肽特異性地結合之抗體可使用市售品、或藉由通常公知之方法製作。
編碼人HLA-A24之α1及α2區之多肽之表現之檢測方法例如可利用：使用與包含HLA-A24之α1及α2區之序列編號30或序列編號34所表示之多肽特異性地結合之抗體的ELISA法、西方墨點法、流動式細胞測量法或免疫組織化學染色法等通常慣用之檢測方法。較佳為流動式細胞測量法。與序列編號30或序列編號34所表示之多肽特異性地結合之抗體可使用市售品、或利用通常公知之方法製作。作為市售品之抗體，例如可列舉抗人HLA-A、B、C抗體(殖株：W6/32、Biolegend)、抗HLA-A24(人)mAb(殖株：22E1、MBL)、抗HLA A抗體(殖株：EP1395Y、Abcam)，較佳為抗人HLA-A、B、C抗體(殖株：W6/32、Biolegend)。再者，該等抗體只要為例如抗人HLA-A、B、C抗體(殖株：W6/32、Biolegend)即可，利用PE(phycoerythrin，藻紅素)而標記化之PE抗人HLA-A、B、C抗體(殖株：W6/32、Biolegend)或利用FITC(fluorescein isothiocyanate，異硫氰酸螢光素)而標記化之FITC抗人HLA-A、B、C抗體(殖株：
W6/32、Biolegend)等標記化體亦包含於抗人HLA-A、B、C抗體(Clone：W6/32、Biolegend)。
本發明之細胞為了能夠進行體內之評估，較佳為於移植進非免疫缺陷非人動物時，於非免疫缺陷非人動物內形成腫瘤，且不自然消退。用以確認該細胞不自然消退之方法例如可藉由在人HLA-A24基因敲入小鼠(國際公開第2015/056774號)之皮下移植本發明之細胞並測定腫瘤徑而確認。較佳為本發明之細胞於移植進非免疫缺陷非人動物時，至少移植後20天以上腫瘤徑不會消退(腫瘤徑增加)。又，若於體內試驗之期間中，不投予藥劑之群(對照群)中可確認移植之細胞不消退(腫瘤徑增加)，則即便不自然消退之期間未達20天，亦包含於本發明之細胞。
於本發明中，非免疫缺陷非人動物之「非免疫缺陷」係指具有動物原本之免疫能力或經改變之免疫能力，因此不包括裸小鼠等免疫缺陷動物。又，「非人動物」只要為具有β2微球蛋白基因座，可導入外來基因之動物，則無特別限定，較佳為嚙齒類，更佳為小鼠或大鼠，就飼養及操作上之方面而言，尤佳為小鼠。
本發明又係關於一種用於評估源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之抗腫瘤效果之本發明之細胞。
本發明又係關於一種用於評估表位4連結肽及/或免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤效果之本發明之細胞。
本發明又係關於一種使用本發明之細胞之用於評估源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之抗腫瘤效果的方法。該方法較佳為使用移植有本發明之細胞之敲入人HLA-A24基因之非免疫缺陷非人動物來進行。此處，敲入人HLA-A24基因之非免疫缺陷非人動物只要為具有人HLA-A24之α1及α2區之非免疫缺陷非人動物即可，較佳為國際公開第2015/056774號所揭示之人HLA-A24基因敲入小鼠(B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai小鼠)。
於該方法中，移植之本發明之細胞之數量可適當選擇，於使用人HLA-A24基因敲入小鼠(B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai小鼠)之情形時，較佳為1×105~1×107個細胞/body，更佳為1×105~5×105個細胞/body，更佳為5×105個細胞/body。又，該方法中之源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之每1次之投予量可適當選擇，於使用人HLA-A24基因敲入小鼠(B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai小鼠)之情形時，較佳為10~1000μg/body，更佳為100~1000μg/body，更佳為300μg/body。
使用本發明之細胞之源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之抗腫瘤效果之評估可藉由包括以下步驟之方法來進行。
即，該方法可藉由包括如下步驟之方法來進行：(I)對敲入人HLA-A24基因之非陷非人動物投予源自SART2之人腫瘤抗原表位肽的步驟；及(II)將本發明之細胞移植進敲入人HLA-A24基因之非免疫缺陷非人動
物的步驟。
較佳為該方法係包括以下(I)及(II)之步驟之方法。
(I)對人HLA-A24基因敲入小鼠投予源自SART2之人腫瘤抗原表位肽的步驟；及(II)將本發明之細胞移植進人HLA-A24基因敲入小鼠的步驟。
更佳為該方法係包括以下(I)及(II)之步驟之方法。
(I)對人HLA-A24基因敲入小鼠投予2次以上源自SART2之人腫瘤抗原表位肽的步驟；及(II)於上述步驟(I)之後，將本發明之細胞移植進人HLA-A24基因敲入小鼠的步驟。
更佳為該方法係包括以下(I)及(II)之步驟之方法。
(I)對人HLA-A24基因敲入小鼠投予3次以上源自SART2之人腫瘤抗原表位肽的步驟；及(II)於上述步驟(I)之後，將本發明之細胞移植進人HLA-A24基因敲入小鼠的步驟。
本發明又係關於一種使用本發明之細胞之用於評估表位4連結肽及/或免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤效果的方法。該方法較佳為使用移植有本發明之細胞之敲入人HLA-A24基因之非免疫缺陷非人動物來進行。此處，敲入人HLA-A24基因之非免疫缺陷非人動物只要為具有人HLA-A24
之α1及α2區之非免疫缺陷非人動物即可，較佳為國際公開第2015/056774號所揭示之人HLA-A24基因敲入小鼠(B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai小鼠)。
於該方法中，移植之本發明之細胞之數量可適當選擇，於使用人HLA-A24基因敲入小鼠(B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai小鼠)之情形時，較佳為1×105~1×107個細胞/body，更佳為1×105~5×105個細胞/body，更佳為5×105個細胞/body。又，該方法中之每1種表位4連結肽之每1次之投予量可適當選擇，於使用人HLA-A24基因敲入小鼠(B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai小鼠)之情形時，較佳為10~1000μg/body，更佳為100~1000μg/body，更佳為300μg/body。又，該方法中之免疫檢查點分子調節劑之每1次之投予量可適當選擇，於使用人HLA-A24基因敲入小鼠(B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai小鼠)之情形時，較佳為10~1000μg/body，更佳為30~500μg/body，更佳為50~200μg/body。
使用本發明之細胞之用於評估表位4連結肽及/或免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤效果的方法可包括以下步驟。
即，該方法可藉由包括如下步驟之方法來進行：(I)對敲入人HLA-A24基因之非免疫缺陷非人動物投予表位4連結肽及/或免疫檢查點分子調節劑的步驟；及(II)將本發明之細胞移植進敲入人HLA-A24基因之非免疫缺陷非人動物的步驟。
較佳為該方法係包括以下(I)及(II)之步驟之方法。
(I)對人HLA-A24基因敲入小鼠投予表位4連結肽及/或免疫檢查點分子調節劑的步驟；及(II)將本發明之細胞移植進人HLA-A24基因敲入小鼠的步驟。
更佳為該方法係包括以下(I)及(II)之步驟之方法。
(I)對人HLA-A24基因敲入小鼠投予2次以上表位4連結肽的步驟；及(II)於上述步驟(I)之後，將本發明之細胞移植進人HLA-A24基因敲入小鼠的步驟。
更佳為該方法係包括以下(I)~(III)之步驟之方法。
(I)對人HLA-A24基因敲入小鼠投予3次以上表位4連結肽的步驟；(II)於上述步驟(I)之後，將本發明之細胞移植進人HLA-A24基因敲入小鼠的步驟；及(III)於上述步驟(I)之後，對人HLA-A24基因敲入小鼠投予免疫檢查點分子調節劑的步驟。
於本發明之方法中，表位4連結肽之抗腫瘤效果之評估可藉由包括以下步驟之方法來進行。
即，該方法可藉由包括以下步驟之方法來進行：(I)對敲入人HLA-A24基因之非免疫缺陷非人動物投予表位4連結肽的步驟；及
(II)將本發明之細胞移植進敲入人HLA-A24基因之非免疫缺陷非人動物的步驟。
較佳為該方法係包括以下(I)及(II)之步驟之方法。
(I)對人HLA-A24基因敲入小鼠投予表位4連結肽的步驟；及(II)將本發明之細胞移植進人HLA-A24基因敲入小鼠的步驟。
更佳為該方法係包括以下(I)及(II)之步驟之方法。
(I)對人HLA-A24基因敲入小鼠投予2次以上表位4連結肽的步驟；及(II)於上述步驟(I)之後，將本發明之細胞移植進人HLA-A24基因敲入小鼠的步驟。
更佳為該方法係包括以下(I)及(II)之步驟之方法。
(I)對人HLA-A24基因敲入小鼠投予3次以上表位4連結肽的步驟；及(II)於上述步驟(I)之後，將本發明之細胞移植進人HLA-A24基因敲入小鼠的步驟。
於本發明中，免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤效果之評估可藉由包括以下步驟之方法來進行。
即，該方法可藉由包括以下步驟之方法來進行：(I)對敲入人HLA-A24基因之非免疫缺陷非人動物投予免疫檢查點分子調節劑的步驟；及
(II)將本發明之細胞移植進敲入人HLA-A24基因之非免疫缺陷非人動物的步驟。
較佳為該方法係包括以下(I)及(II)之步驟之方法。
(I)對人HLA-A24基因敲入小鼠投予免疫檢查點分子調節劑的步驟；及(II)將本發明之細胞移植進人HLA-A24基因敲入小鼠的步驟。
更佳為該方法係包括以下(I)及(II)之步驟之方法。
(I)對人HLA-A24基因敲入小鼠投予免疫檢查點分子調節劑的步驟；及(II)與上述步驟(I)同一天將本發明之細胞移植進人HLA-A24基因敲入小鼠的步驟。
又，於本發明中，表位4連結肽及免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤效果之評估可藉由包括以下步驟之方法來進行。
即，該方法可藉由包括以下步驟之方式來進行：(I)對敲入人HLA-A24基因之非免疫缺陷非人動物投予表位4連結肽及免疫檢查點分子調節劑的步驟；及(II)將本發明之細胞移植進敲入人HLA-A24基因之非免疫缺陷非人動物的步驟。
較佳為該方法係包括以下(I)及(II)之步驟之方法。
(I)對人HLA-A24基因敲入小鼠投予表位4連結肽及免疫檢查點分子
調節劑的步驟；及(II)將本發明之細胞移植進人HLA-A24基因敲入小鼠的步驟。
更佳為該方法係包括以下(I)及(II)之步驟之方法。
(I)對人HLA-A24基因敲入小鼠投予2次以上表位4連結肽的步驟；及(II)於上述步驟(I)之後，將本發明之細胞移植進人HLA-A24基因敲入小鼠的步驟。
更佳為該方法係包括以下(I)~(III)之步驟之方法。
(I)對人HLA-A24基因敲入小鼠投予3次以上表位4連結肽的步驟；(II)於上述步驟(I)之後，將本發明之細胞移植進人HLA-A24基因敲入小鼠的步驟；及(III)於上述步驟(I)之後，對人HLA-A24基因敲入小鼠投予免疫檢查點分子調節劑的步驟。
上述本發明之方法可於上述步驟之後包括評估表位4連結肽及/或免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤效果的步驟。抗腫瘤效果例如可將藉由移植之細胞而於動物中生長之腫瘤之生長抑制、腫瘤之消退及消失、存活率之增大等作為指標進行評估。
「源自SART2之人腫瘤抗原表位肽之抗腫瘤效果」及「表位4連結肽之抗腫瘤效果」之評估例如可藉由使用人HLA-A24基因敲入小鼠，將源自SART2之人腫瘤抗原表位肽或表位4連結肽向小鼠皮下投予3次後，將
本發明之細胞移植進小鼠皮下並測定腫瘤徑，從而確認是否顯示抗腫瘤效果。
「免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤效果」之評估例如可藉由使用人HLA-A24基因敲入小鼠，與本發明之細胞之移植同一天將免疫檢查點分子調節劑向小鼠靜脈內或腹腔內投予並測定腫瘤徑，從而確認是否顯示抗腫瘤效果。
其次列舉實施例對本發明進而詳細地進行說明，但本發明並不受該等實施例任何限定，可在本發明之技術思想內由具有該領域之常識者實現多種變化。
再者，為了更容易理解本發明，於下述表3中表示本說明書中提及之序列編號29~43之說明。
使用自動肽合成機Prelude(Protein Technologies，Inc.)，藉由利用9-茀基甲基-氧基羰基(Fmoc)法之固相肽合成法合成表位4連結肽TPV07及TPV08。即，使α-胺基經Fmoc基、側鏈官能基經一般之保護基保護之胺基酸藉由1-(均三甲苯-2-磺醯基)-3-硝基-1,2,4-三唑/N-甲基咪唑/二氯甲烷條件與Wang-ChemMatrix樹脂縮合，完成C末端胺基酸向樹脂之擔載。於其中注入脫保護液(20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺(DMF))去除Fmoc基後，藉由1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-5-氯-1H-苯并-三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HCTU)/N-甲基嗎啉(NMM)/DMF條件縮合α-胺基經Fmoc基、側鏈官能基經一般之保護基保護之胺基酸，合成二肽。藉由反覆進行藉由脫保護液之Fmoc基之脫保護及藉由HCTU/NMM/DMF條件之胺基酸之縮合操作，從而合成了具有目標序列之肽。保護肽樹脂之合成結束後，將脫保護溶液
(2.5%三異丙基矽烷、2.5%水、2.5%1,2-乙二硫醇、92.5%三氟乙酸)添加至保護肽樹脂，反應4小時，藉此去除肽側鏈保護基，並且自樹脂切下游離肽。過濾去除樹脂，將獲得之濾液添加至冷醚，藉此將肽作為沈澱回收。將獲得之各種合成肽藉由Proteonavi管柱(SHISEIDO)，溶劑系統使用0.1% TFA(trifluoroacetic acid，三氟乙酸)水溶液及乙腈進行純化。最終純化肽係藉由CAPCELL PAK UG120管柱(SHISEIDO)及HPLC系統(HITACHI)確認純度。又，藉由ESI-MS(electrospray ionization-mass spectrometry，電噴灑游離-質譜法)系統(Synapt HDMS、WATERS)確認分子量，於冷凍乾燥後在陰涼處保存，並供於以下所示之實施例。
將TPV07及TPV08之藉由質譜(MS)分析而測得之分子量示於表4。進而，將TPV07及TPV08之HPLC之層析圖及MS示於圖1~圖4。
TPV01~TPV06、TPV09及TPV10例如亦可依據國際公開第2015/060235號說明書所記載之方法合成，亦可依據與上述所示之TPV07及TPV08相同之方法合成。任一種肽均獲得純度90%以上者。
利用國際公開第2015/056774號之實施例8所記載之方法來製作B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai小鼠。該小鼠可表現將人β2微球蛋白、HLA-A24之α1及α2區、及小鼠MHC I類之α3區連結地包含之人工嵌合蛋白。
自獲得之小鼠摘除脾臟，利用載玻片碾碎脾臟後，使用BD Pharm Lyse(BD Bioscience)進行溶血，藉此製備單細胞懸浮液。自獲得之單細胞懸浮液使用RNAeasy套組(Qiagen)萃取RNA。即，對1×106個細胞添加RLT緩衝液350μL後，添加至QIAshredder旋轉管柱(Qiagen)進行離心(15000rpm 2分鐘)，回收流出物。向回收之RNA溶液中添加70%乙醇水溶液350μL後，添加至RNeasy迷你管柱，進行離心(10000rpm 15秒)。進而，將管柱利用RW1緩衝液350μL進行洗淨後，藉由無RNase之DNase套裝(RNase-Free DNase set)(Qiagen)進行DNase處理。將管柱藉由RW1緩衝液350μL進行洗淨後，依據RNeasy迷你套組(RNeasy Mini Kit)之操作說明進行RNA之純化。純化後，添加無RNase之H2O(RNase Free H2O)30μL，回收總RNA。
自總RNA使用用於RT-PCR之Superscript III第一鏈合成系統(Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR)(Thermo Ficher Scientific)合成cDNA。即，將總RNA 2μg懸浮於8μL之純化水中，添加寡聚(dT)20 1μL、10mM dNTP 1μL後，於65℃下孵育5分鐘。於冰上冷卻2分鐘後，添加10×RT緩衝液2μL、25mM MgCl2 1μL、0.1M DTT 2μL、RNaseOUT(40U/μL)1μL、SuperScript III RT 1μL加以混和。於50℃下孵育50分鐘後，於85℃下處理5分鐘，使反應停止。
將合成之cDNA作為模板，使用引子1(TCAAGCTTAACTAGCATGGCCGTCATGGC：序列編號38)作為同義引子，使用引子2(TTAAACCTCGAGTGCTCACGCTTTACAATCTCGGAGAGA：序列編號39)作為反義引子，藉由KOD-Plus-ver.2(東洋紡)進行PCR(94℃下2分鐘→將94℃下30秒、55℃下30秒、68℃下2分鐘進行30個循環→68℃下2分鐘→4℃)，獲得具有序列編號35所表示之序列的編碼上述人工嵌合蛋白之多核苷酸。使用InFusion HD選殖套組(InFusion HD Cloning Kit)(Clontech Laboratories)將經擴增之多核苷酸插入至PiggyBac轉位子載體(System Biosciences)，藉此獲得具有序列編號35之質體載體A。
其次，為了獲得編碼PEP5之多核苷酸，將上述所獲得之具有序列編號35之質體載體A作為模板，使用引子3(CTCAAATTTCATTCCAGCGGGCACTGTAGTCTGCCCAGGTCTGGGT：序列編號40)作為反義引子，使用引子4(GCAGACTACAGTGCCCGCTGGAATGAAATTTGAGCACTCGAGGTTTAA：序列編號41)作為同義引子，藉由PrimeSTAR GXL DNA聚合物酶(PrimeSTAR GXL DNA Polymerase)(TAKARA BIO)進行PCR(將98℃下10秒、55℃下15秒、68℃下6分鐘進行25個循環→68℃下3分鐘→4℃)。其結果，獲得在PiggyBac轉位子載體內具有包含編碼訊息序列及PEP5之鹼基序列之序列編號33所表示之鹼基序列的質體載體B。
使用附帶PLUS試劑之Lipofectamine LTX試劑(Lipofectamine LTX
Reagent with PLUS Reagent)(Thermo Fisher Scientific)將上述製作之質體載體A及B與超級PiggyBac轉位酶表現載體(Super PiggyBac Transposase Expression Vector)(System Biosciences)一起向小鼠黑色素瘤細胞株B16F10(美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC))進行基因導入。基因導入後，使用限界稀釋法獲得單一殖株之細胞。
又，使用細胞株細胞核轉染套組L(Cell line Nucleofector Kit L)(Lonza)及細胞核轉染裝置(Nucleofector Device)(Lonza)，將上述製作之質體載體A、B、及超級PiggyBac轉位酶表現載體(System Biosciences)向小鼠淋巴瘤細胞株EL4(ATCC)進行基因導入。基因導入後，使用限界稀釋法獲取單一殖株之細胞。
回收獲取之單一殖株之細胞，使用RNAeasy套組(Qiagen)萃取RNA。即，對5×105個細胞添加RLT緩衝液350μL後，添加至QIAshredder旋轉管柱(Qiagen)進行離心(15000rpm 2分鐘)，並回收流出物。向回收之RNA溶液中添加70%乙醇水溶液350μL後，添加至RNeasy迷你管柱，進行離心(10000rpm 15秒)。進而將管柱利用RW1緩衝液350μL洗淨後，利用無RNase之DNase套裝(Qiagen)進行DNase處理。將管柱利用RW1緩衝液350μL洗淨後，依據RNeasy迷你套組之操作說明進行RNA之純化。純化後，添加無RNase之H2O 30μL，回收總RNA。
自獲得之RNA使用SuperScript VILO cDNA合成套組(SuperScript
VILO cDNA Synthesis Kit)(Thermo Ficher Scientific)合成cDNA。即，將總RNA 2μg懸浮於14μL之經DPEC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理之水中，混合5X VILO反應混合液(VILO Reaction Mix)4μL、10×SuperScript酵素混合液(SuperScript Enzyme Mix)2μL。於25℃下進行10分鐘孵育、於42℃下進行60分鐘孵育，並於85℃下進行5分鐘處理，使反應停止。
為了確認獲取之單一殖株之細胞中之編碼PEP5之多核苷酸之表現，將合成之cDNA作為模板，使用引子5(ATGGCCGTCATGGC：序列編號42)作為同義引子，使用引子6(TCAAATTTCATTCCAGCG：序列編號43)作為反義引子，藉由KOD-Plus-ver.2(東洋紡)進行PCR(94℃下2分鐘→將98℃下10秒、55℃下30秒、68℃下30秒進行30個循環→68℃下1分鐘→4℃)，藉由瓊脂糖凝膠電泳確認序列編號33所表示之多核苷酸序列之擴增。於未進行基因導入之B16F10及EL4細胞中，無法確認到具有序列編號33所表示之序列之多核苷酸之擴增，與此相對，於獲取之單一殖株中，可確認到具有序列編號33所表示之序列之多核苷酸之擴增，因此，確認藉由導入質體載體B而獲取PEP5表現細胞。
為了分析獲取之單一殖株之細胞中之HLA分子之表現，對細胞利用PE抗人HLA-A、B、C抗體(殖株：W6/32、Biolegend)進行染色。染色後，藉由BD FACSVerse(BD Biosciences)進行分析。其結果，未進行基因導入之B16F10及EL4細胞中，未確認到由抗體之染色產生之螢光強度之上升，與此相對，於獲取之單一殖株中，可確認到由抗體染色產生之螢
光強度之上升，確認藉由導入質體載體A而獲取HLA-A24表現細胞。
即，確認獲取之細胞係表現HLA-A24並且亦表現PEP5之細胞(B16F10.A24/SART293-101細胞及EL4.A24/SART293-101細胞)。
使用包含10% FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)之達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(Sigma-Aldrich)來培養實施例2中所獲得之B16F10.A24/SART293-101細胞株及EL4.A24/SART293-101細胞株。於繼代時，於37℃、5%CO2培養箱中，1週2次以1：25~1：40之比率進行繼代。
於9~11週齡之B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai小鼠右側腹部之皮下分別以1×105個細胞/0.1mL移植B16F10.A24/SART293-101細胞株及EL4.A24/SART293-101細胞株。
移植後第7天起，使用數位卡尺，測定腫瘤之長徑及短徑，藉由以下之式算出腫瘤體積(TV)。
TV(mm3)=長徑(mm)×短徑(mm)×短徑(mm)/2
將結果示於圖5。
如圖5a所示，於移植EL4.A24/SART293-101細胞株之情形時，雖然也有暫時確認到存活(生長)之小鼠，但至第13天，於所有小鼠(5隻)均確認到自然消退。另一方面，如圖5b所示，於移植B16F10.A24/SART293-101細
胞株之情形時，於移植之所有小鼠(10隻)均確認到即便移植後經過20天亦不自然消退，作為腫瘤存活。即，可確認到僅B16F10.A24/SART293-101細胞株能夠用於體內試驗。
將8週齡之B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai小鼠隨機分配至各群，每群15隻。將實施分群之日設為Day0。
將表位4連結肽TPV06溶解於蒸餾水(大塚製藥工場)中，製備6mg/mL之肽溶液，填充於B Braun Injekt注射器(B.Braun Aesculap)中。於另一注射器中填充等量之Montanide ISA 51 VG(SEPPIC)後，將兩注射器用連接器連接，將肽溶液與Montanide ISA 51 VG充分混合，藉此製備乳液。又，作為介質對照，製備混合蒸餾水與等量之Montanide ISA 51 VG而成之乳液。將該等向B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai小鼠之尾根部周邊之皮下1週1次、計3次每次投予100μL(Day0、7、14)。
抗小鼠PD-1抗體(anti-mPD-1 Ab)係將GoInVivo純化抗小鼠CD279(GoInVivo Purified anti-mouse CD279)(PD-1)(殖株：RMP-1-14、Biolegend)於投予前以成為1mg/mL之方式使用D-PBS(FUJIFILM Wako Pure Chemical)進行製備。自乳液之最終投予起1週後(Day21)，將抗小鼠PD-1抗體以100μg/body進行腹腔內投予。
B16F10.A24/SART293-101細胞株係使用包含10% FBS之達爾伯克改
良伊格爾培養基(Sigma-Aldrich)進行培養。B16F10.A24/SART293-101係於37℃、5%CO2培養箱中1週2次以1：25~1：40之比率進行繼代。
與抗小鼠PD-1抗體之投予後同一天(Day21)，將使用D-PBS(FUJIFILM Wako Pure Chemical)製備之細胞懸浮液向小鼠右側腹部之皮下分別移植5×105個細胞/0.1mL。
自B16F10.A24/SART293-101細胞株移植後第7天，使用數位卡尺測量腫瘤之長徑及短徑，藉由以下之式算出腫瘤體積(TV)。
TV(mm3)=長徑(mm)×短徑(mm)×短徑(mm)/2
細胞移植後之腫瘤體積變化如圖6所示，若與對照群比較，則TPV06及抗小鼠PD-1抗體均於單獨時具有腫瘤生長抑制效果，但若將該等併用，則更顯著地抑制腫瘤生長。
將細胞移植後第18天之結果示於下述表5。表中之TV之值表示各群之平均值。再者，相對腫瘤體積變化率(T/C)係根據TV藉由以下之式算出。
T/C(%)=(各藥劑投予群之平均TV)/(對照群之平均TV)×100
又，使用動物用電子天平測定體重，根據於實施分群之Day0測定之體重(BW0)及細胞移植後第18天之體重(BW)，藉由以下之式算出體重變化率(BWC)。
體重變化率BWC(%)=(BW-BW0)/BW0×100
又，藉由以下之式算出細胞移植後第57天無腫瘤之(Tumor Free之)小鼠之比率。
無腫瘤(%)=(各群之無腫瘤之小鼠之數量)/(各群之試驗所使用之小鼠之數量)×100
於細胞移植後第18天，TPV06群或抗小鼠PD-1抗體之單獨投予群及TPV06+抗小鼠PD-1抗體之併用投予群與對照群相比，TV為低值，顯示抗腫瘤效果。進而，TPV06+抗小鼠PD-1抗體之併用投予群與TPV06群或抗小鼠PD-1抗體群之單獨藥劑群相比，TV值為低值，顯示更強之抗腫瘤效果。進而，細胞移植後第57天，TPV06+抗小鼠PD-1抗體之併用投予群中，53.3%之小鼠無腫瘤。進而，TPV06+抗小鼠PD-1抗體之併用投予群與單獨藥劑投予群相比，於細胞移植後第57天，可確認到存活率提昇。
又，併用投予群之平均體重變化率與TPV06或抗小鼠PD-1抗體之單獨藥劑群相比，顯示不伴隨毒性之增強。
將9週齡之B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai小鼠隨機分配至各群，每群15隻。將實施分群之日設為Day0。
使用抗小鼠PD-L1抗體代替抗小鼠PD-1抗體，除此以外與實施例4同樣地進行。抗小鼠PD-L1抗體(anti-mPD-L1 Ab)係將GoInVivo純化抗小鼠CD274(B7-H1、PD-L1)(殖株：10F.9G2、Biolegend)於投予前以成為1mg/mL之方式使用D-PBS(FUJIFILM Wako Pure Chemical)進行製備。自乳液之最終投予起1週後(Day21)，將抗小鼠PD-L1抗體以200μg/body進行腹腔內投予。
細胞移植後之腫瘤體積變化如圖7所示，若與對照群相比，則雖然TPV06於單獨時具有腫瘤生長抑制效果，但抗小鼠PD-L1抗體未確認到效果。然而，若將TPV06與抗小鼠PD-L1抗體併用，則更顯著地抑制腫瘤生長。
將細胞移植後第18天之腫瘤體積、相對腫瘤體積變化率及體重變化率(BWC)、細胞移植後第57天之無腫瘤之小鼠之比率示於下述表6。
於細胞移植後第18天，TPV06群之單獨投予群及TPV06+抗小鼠PD-L1抗體之併用投予群與對照群相比，TV為低值，顯示抗腫瘤效果。進而，TPV06+抗小鼠PD-L1抗體之併用投予群與TPV06群及抗小鼠PD-L1抗體群之單獨藥劑群相比，TV值為低值，顯示更強之抗腫瘤效果。進而，於細胞移植後第57天，TPV06+抗小鼠PD-L1抗體之併用投予群中，66.7%之小鼠無腫瘤。進而，TPV06+抗小鼠PD-L1抗體之併用投予群與單獨藥劑投予群相比，於細胞移植後第57天，可確認到存活率。
又，併用投予群之平均體重變化率與TPV06或抗小鼠PD-L1抗體之單獨藥劑群相比，顯示不伴隨毒性之增強。
將9週齡之B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai小鼠隨機分配至各群，每群15隻。將實施分群之日設為Day0。
使用TPV07或TPV08代替TPV06作為表位4連結肽，除此以外與實施例4同樣地進行。再者，TPV07及TPV08係與TPV06同樣地，使用蒸餾水(大塚製藥工場)製備成6mg/mL後，與等量之Montanide ISA 51 VG(SEPPIC)混合，製備成乳液進行投予，於本實施例中，不包含抗小鼠PD-1抗體單獨投予群。
將細胞移植後之腫瘤體積變化示於圖8、圖9，將細胞移植後第18之腫瘤體積、相對腫瘤體積變化率及體重變化率(BWC)、細胞移植後第56
天之無腫瘤之小鼠之比率示於表7。
如圖8及圖9所示，若與對照群相比，則雖然TPV07及TPV08均於單獨時具有較高之腫瘤生長抑制效果，但若將該等與抗小鼠PD-1抗體併用，則更顯著地抑制腫瘤生長。
又，如表7所示，於細胞移植後第18天，TPV07投予群或TPV08投予群之單獨投予及TPV07+抗小鼠PD-1抗體或TPV08+抗小鼠PD-1抗體之併用投予群與對照群相比，TV為低值，顯示抗腫瘤效果。進而，TPV07+抗小鼠PD-1抗體之併用投予群與TPV07之單獨藥劑群相比，TV值為低值，顯示更強之抗腫瘤效果。同樣地，TPV08+抗小鼠PD-1抗體之併用投予群與TPV08之單獨藥劑群相比，TV值為低值，顯示更強之抗腫瘤效果。進而，於細胞移植後第56天，TPV07+抗小鼠PD-1抗體之併用投予群中，80.0%之小鼠無腫瘤，TPV08+抗小鼠PD-1抗體之併用投予群中，40.0%之小鼠無腫瘤。進而，TPV07+抗小鼠PD-1抗體及TPV08+抗小鼠PD-1抗體之併用投予群與單獨藥劑投予群相比，於細胞移植後第56天，可確認到存活率提昇。
又，併用投予群之平均體重變化率與TPV07及TPV08之單獨藥劑群相比，顯示不伴隨毒性之增強。
將9週齡之B2mtm2(HLA-A24/H-2Db/B2M)Tai小鼠隨機分配至各群，每群15隻。將實施分群之日設為Day0。
使用混合有TPV06與其他2種表位4連結肽(TPV011及TPV012)共計3種之表位4連結肽代替TPV06，除此以外，實施與實施例4相同之試驗。
即，實施對照群、混合有3種之表位4連結肽(TPV06、TPV011及TPV012)群、抗小鼠PD-1抗體群及混合有3種之表位4連結肽(TPV06、TPV011及TPV012)+抗小鼠PD-1抗體之併用投予群之試驗。
再者，混合有3種之表位4連結肽(TPV06、TPV011及TPV012)係以TPV06、TPV011及TPV012分別成為6mg/mL(即以肽總量計成為18mg/mL)之方式使用蒸餾水(大塚製藥工場)進行製備，與等量之Montanide ISA 51 VG(SEPPIC)進行混合，製備成乳液進行投予。
其結果，混合有3種之表位4連結肽(TPV06、TPV011及TPV012)+抗小鼠PD-1抗體之併用投予群與混合有3種之表位4連結肽(TPV06、TPV011及TPV012)群或抗小鼠PD-1抗體之單獨投予群相比，於細胞移植後第56天，可確認到存活率提昇。
又，併用投予群之平均體重變化率與單獨藥劑群相比，顯示不伴隨毒性之增強。
本說明書中引用之所有刊物、專利及專利申請案係藉由直接引用而併入本說明書中。
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<223> 引子1
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<223> 引子2
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<212> PRT
<213> 人工
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<223> 合成肽
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Claims (16)
- 一種抗腫瘤劑，其特徵在於：其用於與免疫檢查點分子調節劑併用，且含有包含經由連接子連結之4個CTL表位肽之1種以上之表位4連結肽，該1種以上之表位4連結肽中之1種係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、及選自由序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)及序列編號10所表示之表位肽(PEP10)所組成之群中之1個表位肽經由連接子分別連結而成，於N末端可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列，且C末端為PEP2、PEP4或PEP10的表位4連結肽，該免疫檢查點分子調節劑為選自由抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體及抗PD-L2抗體所組成之群中之至少1種的PD-1路徑拮抗劑，該連接子為連結2個精胺酸而成之精胺酸二聚物，該包含親水性胺基酸之肽序列包含連結3個精胺酸而成之精胺酸三聚物、或連結4個精胺酸而成之精胺酸四聚物。
- 如請求項1之抗腫瘤劑，其含有包含選自以下之序列之表位4連結肽：‧PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4；‧PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP2；或 ‧PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP10；再者，式中「(L)」表示精胺酸二聚物。
- 如請求項1之抗腫瘤劑，其含有序列編號24、序列編號25、或序列編號26所表示之表位4連結肽。
- 如請求項1之抗腫瘤劑，其中PD-1路徑拮抗劑為選自由抗PD-1抗體及抗PD-L1抗體所組成之群中之至少1種。
- 如請求項1之抗腫瘤劑，其中抗PD-1抗體為納武單抗或帕博利珠單抗，抗PD-L1抗體為阿特珠單抗、度伐魯單抗或阿維魯單抗。
- 如請求項3之抗腫瘤劑，其含有序列編號24所表示之表位4連結肽，更進而含有序列編號44所表示之表位4連結肽、及序列編號45所表示之表位4連結肽。
- 一種抗腫瘤劑，其用於治療被投予免疫檢查點分子調節劑之癌症患者，且含有1種以上之表位4連結肽，該1種以上之表位4連結肽中之1種係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、及選自由序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位 肽(PEP4)及序列編號10所表示之表位肽(PEP10)所組成之群中之1個表位肽經由連接子分別連結而成，於N末端可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列，且C末端為PEP2、PEP4或PEP10的表位4連結肽，該免疫檢查點分子調節劑為選自由抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體及抗PD-L2抗體所組成之群中之至少1種的PD-1路徑拮抗劑，該連接子為連結2個精胺酸而成之精胺酸二聚物，該包含親水性胺基酸之肽序列包含連結3個精胺酸而成之精胺酸三聚物、或連結4個精胺酸而成之精胺酸四聚物。
- 如請求項7之抗腫瘤劑，其含有序列編號24所表示之表位4連結肽，更進而含有序列編號44所表示之表位4連結肽、及序列編號45所表示之表位4連結肽。
- 一種組合製劑，其係將1種以上之表位4連結肽與免疫檢查點分子調節劑組合而成者，該1種以上之表位4連結肽中之1種係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、及選自由序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)及序列編號10所表示之表位肽(PEP10)所組成之群中之1個表位肽經由連接子分別連結而成，於N末端可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列，且C末端為PEP2、PEP4或PEP10的表位4連結肽， 該免疫檢查點分子調節劑為選自由抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體及抗PD-L2抗體所組成之群中之至少1種的PD-1路徑拮抗劑，該連接子為連結2個精胺酸而成之精胺酸二聚物，該包含親水性胺基酸之肽序列包含連結3個精胺酸而成之精胺酸三聚物、或連結4個精胺酸而成之精胺酸四聚物。
- 如請求項9之組合製劑，其含有序列編號24所表示之表位4連結肽，更進而含有序列編號44所表示之表位4連結肽、及序列編號45所表示之表位4連結肽。
- 一種抗腫瘤效果增強劑，其含有1種以上之表位4連結肽，用於增強免疫檢查點分子調節劑之抗腫瘤效果，該1種以上之表位4連結肽中之1種係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、及選自由序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)及序列編號10所表示之表位肽(PEP10)所組成之群中之1個表位肽經由連接子分別連結而成，於N末端可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列，且C末端為PEP2、PEP4或PEP10的表位4連結肽，該免疫檢查點分子調節劑為選自由抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體及抗PD-L2抗體所組成之群中之至少1種的PD-1路徑拮抗劑，該連接子為連結2個精胺酸而成之精胺酸二聚物， 該包含親水性胺基酸之肽序列包含連結3個精胺酸而成之精胺酸三聚物、或連結4個精胺酸而成之精胺酸四聚物。
- 如請求項11之抗腫瘤效果增強劑，其含有序列編號24所表示之表位4連結肽，更進而含有序列編號44所表示之表位4連結肽、及序列編號45所表示之表位4連結肽。
- 一種抗腫瘤劑，其特徵在於含有包含經由連接子連結之4個CTL表位肽之1種以上之表位4連結肽、及免疫檢查點分子調節劑，該1種以上之表位4連結肽中之1種係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、及選自由序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)及序列編號10所表示之表位肽(PEP10)所組成之群中之1個表位肽經由連接子分別連結而成，於N末端可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列，且C末端為PEP2、PEP4或PEP10的表位4連結肽，該免疫檢查點分子調節劑為選自由抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體及抗PD-L2抗體所組成之群中之至少1種的PD-1路徑拮抗劑，該連接子為連結2個精胺酸而成之精胺酸二聚物，該包含親水性胺基酸之肽序列包含連結3個精胺酸而成之精胺酸三聚物、或連結4個精胺酸而成之精胺酸四聚物。
- 如請求項13之抗腫瘤劑，其含有序列編號24所表示之表位4連結肽，更進而含有序列編號44所表示之表位4連結肽、及序列編號45所表示之表位4連結肽。
- 一種套組製劑，其特徵在於：其係包含1種以上之表位4連結肽及使用說明書者，該使用說明書中記載有對癌症患者併用投予表位4連結肽及免疫檢查點分子調節劑，該1種以上之表位4連結肽中之1種係序列編號5所表示之表位肽(PEP5)、序列編號6所表示之表位肽(PEP6)、序列編號9所表示之表位肽(PEP9)、及選自由序列編號2所表示之表位肽(PEP2)、序列編號4所表示之表位肽(PEP4)及序列編號10所表示之表位肽(PEP10)所組成之群中之1個表位肽經由連接子分別連結而成，於N末端可進而具有包含親水性胺基酸之肽序列，且C末端為PEP2、PEP4或PEP10的表位4連結肽，該免疫檢查點分子調節劑為選自由抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體及抗PD-L2抗體所組成之群中之至少1種的PD-1路徑拮抗劑，該連接子為連結2個精胺酸而成之精胺酸二聚物，該包含親水性胺基酸之肽序列包含連結3個精胺酸而成之精胺酸三聚物、或連結4個精胺酸而成之精胺酸四聚物。
- 如請求項15之套組製劑，其含有序列編號24所表示之表位4連結肽，更進而含有序列編號44所表示之表位4連結肽、及序列編號45所表示之表位4連結肽。
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