JP5114403B2 - Ｈｌａ−ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者に対する癌ワクチン療法に有用なｓａｒｔ３由来ペプチド - Google Patents
Ｈｌａ−ａ３スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者に対する癌ワクチン療法に有用なｓａｒｔ３由来ペプチド Download PDFInfo
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Description
本発明は、HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者の処置または予防に有用なSART3由来ペプチドに関する。
前立腺癌は老年期男性に多い癌である（非特許文献１）。前立腺癌にはアンドロゲン除去療法が一過性に奏功するが、ホルモン抵抗性または骨転移性前立腺癌として再発した場合に有効な治療法はない。このような患者にとって特異的免疫療法は有望な選択肢となりうる。なぜなら前立腺癌反応性細胞傷害性T細胞は特異的に転移を探し出すことができるからである。これまで、前立腺癌患者に対する特異的免疫療法に利用可能な癌抗原ペプチドは多く同定されている（非特許文献２）。しかしながら、HLA-A2および-A24アレルの頻度が世界的に高いことから、従来の癌抗原ペプチドはHLA-A2または-A24アレルが陽性の患者に対するものがほとんどであった（非特許文献３）。
HLAクラスIアレルには、その構造的相同性およびペプチド結合モチーフ解析に基づき、HLA-A2、-A3、-B7および-B44スーパータイプアレルが提唱されている(非特許文献４)。それらのうちHLA-A3スーパータイプアレルは、コーカサス人の38%、中国人の53%、日本人の46%および北米アフリカ系アメリカ人およびヒスパニックの43%に見られる（非特許文献４）。それにもかかわらず、HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者の治療に使用できる癌抗原ペプチドは限られている（非特許文献５−７）
Greenlee RT, Murray T, Bolden S, Wingo PA. Cancer statistics, 2000. CA Cancer J Clin 2000;50:7-33. Renkvist N, Castelli C, Robbins PF, Parmiani G.A listing of human tumor antigens recognized by T cells. Cancer Immunol Immunother 2001;50:3-15. Imanishi T, Akazawa T, Kimura A. Allele and haplotype frequencies for HLA and complement loci in various ethnic groups. In Tsuji K, Aizawa M, Sasazuki T. editors. HLA 1991.Vol.1 Oxford: Oxford Scientific Publications;1992.1065-1220p. Sette A, Sidney J. Ninemajor HLA class I supertypes account for the vast preponderance of HLA-A and B polymorphism. Immunogenetics 1999;50:201-212. Wang RF, Johnston SL, Southwood S, Sette A, Rosenberg SA. Recognition of an antigenic peptide derived from tyrosinase-related protein-2 by CTL in the context of HLA-A31 and A33. J Immunol 1998;160:890-897. Takedatsu H, Shichijo S, Katagiri K, Sawamizu H, Sata M, Itoh K. Identification of peptide vaccine candidates sharing among HLA-A3+, -A11+, -A31+, and -A33+ cancer patients. Clin Cancer Res 2004;10:1112-1120. Matsueda S, Takedatsu H, Yao A, Tanaka M, Noguchi M, Itoh K, Harada M. Identification of peptide vaccine candidates for prostate cancer patients with HLA-A3 supertype alleles. Clin Cancer Res. 2005;11:6933-6943.
Greenlee RT, Murray T, Bolden S, Wingo PA. Cancer statistics, 2000. CA Cancer J Clin 2000;50:7-33. Renkvist N, Castelli C, Robbins PF, Parmiani G.A listing of human tumor antigens recognized by T cells. Cancer Immunol Immunother 2001;50:3-15. Imanishi T, Akazawa T, Kimura A. Allele and haplotype frequencies for HLA and complement loci in various ethnic groups. In Tsuji K, Aizawa M, Sasazuki T. editors. HLA 1991.Vol.1 Oxford: Oxford Scientific Publications;1992.1065-1220p. Sette A, Sidney J. Ninemajor HLA class I supertypes account for the vast preponderance of HLA-A and B polymorphism. Immunogenetics 1999;50:201-212. Wang RF, Johnston SL, Southwood S, Sette A, Rosenberg SA. Recognition of an antigenic peptide derived from tyrosinase-related protein-2 by CTL in the context of HLA-A31 and A33. J Immunol 1998;160:890-897. Takedatsu H, Shichijo S, Katagiri K, Sawamizu H, Sata M, Itoh K. Identification of peptide vaccine candidates sharing among HLA-A3+, -A11+, -A31+, and -A33+ cancer patients. Clin Cancer Res 2004;10:1112-1120. Matsueda S, Takedatsu H, Yao A, Tanaka M, Noguchi M, Itoh K, Harada M. Identification of peptide vaccine candidates for prostate cancer patients with HLA-A3 supertype alleles. Clin Cancer Res. 2005;11:6933-6943.
本発明は、HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者に対する癌ワクチン療法に有用な癌抗原ペプチドを提供することを目的とする。
本発明は、SART3由来ペプチドであって、HLA-A3スーパータイプアレル分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されるペプチドを提供する。具体的には、本発明は、配列番号１６または２０に示すアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１６または２０に示すアミノ酸配列において１または２個のアミノ酸の置換、欠失および／または付加が導入されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１６または２０に示すアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等の性質を有するその誘導体を提供する。
本発明はまた、本発明のペプチドまたは誘導体をコードする核酸分子および該核酸分子を含むベクターを提供する。
本発明はまた、本発明のペプチド、誘導体、またはベクターを含む、前立腺癌を処置または予防するための医薬組成物、特に癌ワクチンである該医薬組成物、を提供する。
さらに、本発明は、HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者より採取された末梢血単核細胞を本発明のペプチドまたは誘導体と接触させることを含む、前立腺癌反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。
本発明はまた、HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者に由来する抗原提示能を有する細胞に、本発明のペプチドまたは誘導体を取り込ませること、または本発明のベクターを導入することを含む、SART3由来ペプチドまたはその誘導体とHLA-A3スーパータイプアレル分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製する方法を提供する。
本発明により、HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者に対するペプチド基盤免疫療法、特に癌ワクチン療法の選択肢が広がった。本発明は、これまでに癌ワクチン候補ペプチドが多数同定されているHLA-A2またはHLA-A24分子が陰性の前立腺癌患者の治療に特に有用である。
本発明のペプチドは、癌抗原として同定されたSART3のアミノ酸配列の一部よりなるペプチドである。SART3のアミノ酸配列は、GenebankにAB020880にて開示されている。
「HLA-A3スーパータイプアレル分子に結合できる」とは、ペプチドがHLA-A3スーパータイプアレル分子と複合体を形成し細胞表面に提示されうることを意味する。一般にHLA分子に結合するペプチドのアミノ酸配列にはHLAの型に依存する規則性がある。その規則性にしたがうアミノ酸配列を結合モチーフと呼ぶ。HLA-A3スーパータイプアレル分子には、HLA-A11、-A31、-A33、-A0301および−A6801分子が含まれ、これらは結合モチーフを共有する（Sette, A., and Sidney, J. Ninemajor, Immunogenetics, 50:201-212, 1999.）。HLA-A3スーパータイプアレル分子に対する結合モチーフを有するペプチドは、Bioinformatics and Molecular Analysis Section（NIH, Bethesda, MD）等のコンピューター解析により決定することができる。
本発明において、ペプチドが「細胞性免疫に認識される」とは、そのペプチドがペプチド特異的CTLを誘導する能力を有することを意味する。ペプチド特異的CTL誘導能は、例えば、末梢血単核細胞（PBMC）をペプチドで刺激し、そのペプチド刺激PBMCが対応ペプチドをパルスした抗原提示細胞に反応してサイトカイン（例えばIFN-γ）を産生するかをELISA法等により測定して調べることができる。また、51Cr放出測定法等により、誘導されたCTLの細胞傷害活性を確認することができる。CTLによる認識性を考慮すると、本発明のペプチドのアミノ酸残基数は８〜１４個の範囲内であることが好ましく、より好ましくは８〜１１個、特に好ましくは９または１０個である。
ペプチドが「液性免疫に認識される」とは、そのペプチドに特異的なIgGが生体内に存在すること、つまりはペプチド特異的IgGが血漿から検出されることを意味する。細胞性免疫と液性免疫の両方に認識されるペプチドは、免疫原性が高くCTL誘導能に優れると期待されるため、本発明のペプチドとして好ましい。血漿中の特異的IgGは、常套的なELISA法等によって測定することができる。
本発明のペプチドとして特に好ましいのは、配列番号１６または２０に示すアミノ酸配列からなるペプチドである。
本発明における配列番号１６または２０に示すアミノ酸配列からなるペプチドの誘導体は、配列番号１６または２０に示すアミノ酸配列において１または２個のアミノ酸の置換、欠失および／または付加が導入されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１６または２０に示すアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等の性質を有する。「配列番号１６または２０に示すアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等の性質を有する」とは、HLA-A3スーパータイプアレル分子に結合でき、かつ細胞性免疫に認識されることを意味する。機能的に同等の性質を有するか否かは、前述の方法に従い調べることができる。
アミノ酸の置換は、ペプチドの性質を変化させない観点から、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノおよび芳香族アミノ酸等）の間で行うことが好ましい。アミノ酸の欠失および付加は、誘導体のアミノ酸残基数が８〜１１個となるように行うことが好ましい。
また、アミノ酸の置換、欠失および／または付加は、HLA分子結合モチーフ上許容されるものが好ましい。すなわち、アミノ酸の置換、欠失および／または付加は、ペプチド誘導体のC末端アミノ酸がリシンまたはアルギニンとなるように行うことが好ましい。例えば、配列番号１６または２０のC末端アミノ酸をアルギニンに保存したまま他のアミノ酸の置換、欠失および／または付加を行うか、そのC末端アミノ酸をリシンに置換するか、あるいはそのC末端アミノ酸をリシンに置換しさらに他のアミノ酸の置換、欠失および／または付加を行う。なかでも、配列番号１６または２０に示すアミノ酸配列のC末端アミノ酸をリシンで置換したアミノ酸配列からなる誘導体が本発明に特に好適である。
本発明のペプチドおよび誘導体を構成するアミノ酸は、天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログであってよく、アミノ酸アナログとしては、アミノ酸のN-アシル化物、O-アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等が挙げられる。本発明のペプチドおよび誘導体は、機能を著しく損なわない限りにおいてその構成アミノ酸またはカルボキシル基などが修飾されていてもよい。修飾は、N末端や遊離のアミノ基にホルミル基、アセチル基、t-ブトキシカルボニル基等を結合するものや、C末端や遊離のカルボキシル基にメチル基、エチル基、t-ブチル基、ベンジル基等を結合するものが挙げられる。
本発明のペプチドおよび誘導体は、通常のペプチド合成により製造することができる。そのような方法として、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York，1966； The Proteins, Vol2, Academic Press Inc.,New York, 1976；ペプチド合成、丸善（株）、1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）、1985；医薬品の開発続 第十四巻・ペプチド合成、広川書店、1991）などに記載されている方法が挙げられる。
本発明のペプチドおよび誘導体は、本発明のペプチドまたは誘導体のアミノ酸配列を含むポリペプチドが細胞内で断片化されて生じ、HLA分子との複合体として提供される場合もある。そのような態様で本発明のペプチドまたは誘導体を利用することもまた、本発明の範囲内である。本発明のペプチドまたは誘導体を提供できる限り、ポリペプチドのアミノ酸残基数およびアミノ酸配列は任意である。
本発明のペプチドおよび誘導体は、HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌細胞を傷害するCTLを効率的に誘導し増殖させることができる。即ち本発明のペプチドおよび誘導体は、前立腺癌反応性CTLを誘導するため、および前立腺癌に対する医薬組成物を製造するためなどに使用することができ、前立腺癌の処置または予防において有用である。
本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドまたは誘導体を１または２種類以上含有し、その含有ペプチドまたは誘導体に特異的な前立腺癌反応性CTLを誘導することにより治療効果を発揮する。本発明の医薬組成物は、癌ワクチンとして使用することができる。癌患者のCTLは相異なる癌抗原ペプチドを認識する細胞の集合なので、複数種類のペプチドおよび／または誘導体を組み合わせて使用するとさらに効果的である。本発明のペプチド以外の癌抗原ペプチドと組み合わせても良い。本発明の医薬組成物は、免疫応答が効果的に成立するように、従来からワクチン投与に用いられることが知られているアジュバントとともに投与することもできる。また、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状製剤、リピッドを結合させた製剤などにしてもよい。
投与方法は、例えば皮内投与または皮下投与などである。投与量は、疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常医薬組成物中の本発明のペプチドまたは誘導体の量として0.0001ｍｇ〜1000ｍｇ、好ましくは0.0001ｍｇ〜100ｍｇ、より好ましくは0.001ｍｇ〜10ｍｇである。これを数日、数週または数ヶ月に１回、１〜３年間継続して投与することが好ましい。
本発明の核酸分子は、本発明のペプチドまたは誘導体を提供できるものである。本発明の核酸分子を含むベクターを抗原提示細胞に導入し発現させると、本発明のペプチドまたは誘導体が産生され、HLA分子と複合体を形成して細胞表面に提示される。この抗原提示細胞はペプチド特異的前立腺癌反応性CTLを効率的に増殖させることができる。
本発明のベクターは、患者に投与して患者体内で本発明のペプチドまたは誘導体を発現させるために使用できる。また、本発明のベクターを体外で適当な細胞、例えば患者由来の樹状細胞に導入した後に、その細胞を患者体内に戻しても良い。これらの方法は当業界において周知である（Hrouda D, Dalgleish AG. Gene therapy for prostate cancer. Gene Ther 3: 845-52, 1996）。
本発明のベクターとしては、各種プラスミドおよびウィルスベクター、例えばアデノウィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等が挙げられる（Liu M, Acres B, Balloul JM, Bizouarne N, Paul S, Slos P, Squiban P. Gene-based vaccines and immunotherapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A 101 Suppl, 14567-71, 2004）。ベクターの調製方法は当業界にて周知である（Molecular Cloning: A laboraroy manual, 2nd edn. New York, Cold Spring Harbor Laboratory）。
本発明のベクターを前立腺癌を処置または予防するための医薬組成物として患者に投与する場合、その投与量は、疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により変化するが、DNA含量として0.1μg〜100mg、好ましくは1μg〜50mgである。投与方法には、静脈注射、皮下投与、皮内投与等が挙げられる。
本発明のCTL誘導方法は、HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌細胞を傷害するCTLを提供するものである。本発明において「前立腺癌反応性」とは、前立腺癌細胞上の癌抗原ペプチドとHLA分子との複合体を認識し、その細胞を傷害しうる性質を有することを意味する。CTLの誘導は、例えば、HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者から採取されたPBMCを、in vitroで本発明のペプチドまたは誘導体の存在下培養することにより行う。本発明の方法により誘導されるCTLは、養子免疫療法、すなわちPBMCを採取した患者体内に誘導したCTLを戻して癌細胞を傷害する癌治療法に有用である。つまり本発明の方法により誘導されるCTLは、前立腺癌を処置または予防するための医薬として使用可能である。
本発明のCTL誘導キットは、前記CTL誘導方法を実施するために用いられる。本発明のキットは、本発明のペプチドまたは誘導体を１または２種類以上含み、さらに適当な緩衝液や培地などを含んでもよい。
本発明の抗原提示細胞調製方法は、HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌細胞を傷害するCTLを誘導するための抗原提示細胞を提供するものである。抗原提示細胞の調製は、例えば、HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者由来の抗原提示能を有する細胞に本発明のペプチドまたは誘導体をパルスして取り込ませるか、あるいはそのような細胞に本発明のベクターを周知の方法により導入し発現させることにより行う。抗原提示能を有する細胞は例えば樹状細胞であり、患者より採取されたPBMCから培養プレート接着細胞を分離し、IL-4およびGM-CSFの存在下で約１週間培養することにより調製することができる。本発明の方法により調製された抗原提示細胞は、その細胞表面に提示するペプチドまたは誘導体とHLA分子との複合体を特異的に認識するCTLを誘導することができ、患者に投与されると患者体内で前立腺癌反応性CTLの誘導を促進することができる。つまり本発明の方法により調製される抗原提示細胞は、前立腺癌を処置または予防するための医薬として使用可能である。
本発明の抗原提示細胞調製キットは、前記抗原提示細胞調製方法を行うために用いられる。本発明のキットは、本発明のペプチドまたは誘導体を１または２種類以上含み、さらに適当な緩衝液や培地などを含むこともできる。
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれら実施例により制限されるものではない。
1. 方法
1.1 患者
HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者および健常人（HD)より事前の文書による承諾を得てPBMCを採取した。患者には、HLA-A11陽性、-A31陽性、および-A33陽性患者が含まれた。HLA-A3陽性または-A68.1陽性患者は日本人においては極めて頻度が低いため（1.6％および0.5％）（Aizawa M. The Proceedings of the 3rd Asia-Oceania Histocompaatibility Workshop Conference, pp. 1090-1103. Oxford: Oxford University Press, 1986.）、それら由来のPBMCは入手できなかった。PBMCを採取した患者はいずれもHIV非感染であった。末梢血20mlを採取し、フィコール・コンレイ比重遠心法によりPBMCを調製した。試料は全て実験で使用するまで低温にて保存した。PBMC上のHLA-A11、-A31および-A33分子の発現は、以下の抗体を用いてフローサイトメトリーにより確認した：抗HLA-A11モノクローナル抗体（ｍAb）(Cat＃ 0284HA; One Lambda Inc., Canoga, CA, USA)；抗HLA-A31 mAb (Cat＃ 0273HA; One Lambda)；抗HLA-A33 mAb (Cat＃ 0612HA; One Lambda)；およびFITC結合抗マウスイムノグロブリンG (IgG) mAb。なお、本試験開始に当たっては、久留米大学の医療に関する倫理委員会の承認を得て行った。
1.1 患者
HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者および健常人（HD)より事前の文書による承諾を得てPBMCを採取した。患者には、HLA-A11陽性、-A31陽性、および-A33陽性患者が含まれた。HLA-A3陽性または-A68.1陽性患者は日本人においては極めて頻度が低いため（1.6％および0.5％）（Aizawa M. The Proceedings of the 3rd Asia-Oceania Histocompaatibility Workshop Conference, pp. 1090-1103. Oxford: Oxford University Press, 1986.）、それら由来のPBMCは入手できなかった。PBMCを採取した患者はいずれもHIV非感染であった。末梢血20mlを採取し、フィコール・コンレイ比重遠心法によりPBMCを調製した。試料は全て実験で使用するまで低温にて保存した。PBMC上のHLA-A11、-A31および-A33分子の発現は、以下の抗体を用いてフローサイトメトリーにより確認した：抗HLA-A11モノクローナル抗体（ｍAb）(Cat＃ 0284HA; One Lambda Inc., Canoga, CA, USA)；抗HLA-A31 mAb (Cat＃ 0273HA; One Lambda)；抗HLA-A33 mAb (Cat＃ 0612HA; One Lambda)；およびFITC結合抗マウスイムノグロブリンG (IgG) mAb。なお、本試験開始に当たっては、久留米大学の医療に関する倫理委員会の承認を得て行った。
1.2 ペプチド特異的IgGの検出
血漿中のSART3由来ペプチド特異的IgGのレベルは、Luminex（商標）法により既報のように測定した（Komatsu N, Shichijo S, Nakagawa M, Itoh K., Scand J Clin Invest 2004;64:1-11.）。詳細には、希釈血清（100μL）を、SART3由来ペプチドをコートしたカラーコードビーズ（Luminex Corp (Austin, TX, USA)（5μl）と、96ウェルフィルタープレート（MABVN1250, Millipore Corp., Bedford, MA, USA）においてプレートシェーカー上にて室温で2時間インキュベートした。2時間後、プレートをT-PBSにて洗浄し、ビオチン化ヤギ抗ヒトIgG（BA-3080(VECTOR LAB, CA, USA)（100μl）と1時間室温で反応させた。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン標識PE（100μL）（S-866,Invitrogen Detection Technologies, Eugene, Oregon, USA）を加え、30分間室温で反応させた。結合したビーズを4回洗浄し、続いてTween-PBS（100μl）を各ウェルに添加した。50μlの試料をLuminex（商標）法による測定に用いた。SART3由来ペプチドに対するIgGの特異性を確認するため、試料血清を対応SART3由来ペプチドまたは対照のHIV由来ペプチドをコートしたプレートにおいて培養した。その後、得られた上清の対応SART3由来ペプチドに特異的なIgGのレベルをLuminex（商標）法により測定した。
血漿中のSART3由来ペプチド特異的IgGのレベルは、Luminex（商標）法により既報のように測定した（Komatsu N, Shichijo S, Nakagawa M, Itoh K., Scand J Clin Invest 2004;64:1-11.）。詳細には、希釈血清（100μL）を、SART3由来ペプチドをコートしたカラーコードビーズ（Luminex Corp (Austin, TX, USA)（5μl）と、96ウェルフィルタープレート（MABVN1250, Millipore Corp., Bedford, MA, USA）においてプレートシェーカー上にて室温で2時間インキュベートした。2時間後、プレートをT-PBSにて洗浄し、ビオチン化ヤギ抗ヒトIgG（BA-3080(VECTOR LAB, CA, USA)（100μl）と1時間室温で反応させた。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン標識PE（100μL）（S-866,Invitrogen Detection Technologies, Eugene, Oregon, USA）を加え、30分間室温で反応させた。結合したビーズを4回洗浄し、続いてTween-PBS（100μl）を各ウェルに添加した。50μlの試料をLuminex（商標）法による測定に用いた。SART3由来ペプチドに対するIgGの特異性を確認するため、試料血清を対応SART3由来ペプチドまたは対照のHIV由来ペプチドをコートしたプレートにおいて培養した。その後、得られた上清の対応SART3由来ペプチドに特異的なIgGのレベルをLuminex（商標）法により測定した。
1.3 細胞株およびフローサイトメトリー
C1R-A11、-A31および-A33は、それぞれHLA-A1101、-A3101および-A3303遺伝子を安定に発現するC1R亜細胞株である。これら亜細胞株上のHLA-A11、-A31および-A33分子の発現は以前に報告している（Takedatsu H, Shichijo S, Katagiri K, Sawamizu H, Sata M, Itoh K., Clin Cancer Res 2004;10:1112-1120.）。PC3、PC-93、およびLNCaPは、前立腺癌細胞株であり、KE4は食道癌細胞株である。HLA-A11、-A31および-A33分子をそれぞれ発現するLNCaP亜細胞株を製造するため、HLA-A1101、-A3101または-A3303プラスミドｃDNAを真核細胞発現ベクターであるpCR3.1（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）に挿入し、ジーン・パルサー（Bio RAD, Richmond, CA, USA）を用いてエレクトロポレーションを行った。LNCaP-A11、-A31および-A33が、それぞれHLA-A1101、-A3101および-A3303遺伝子を安定に発現する亜細胞株である（図１）。これら細胞株は全て10％FCS含有RPMI 1640（Invitrogen）で培養した。
C1R-A11、-A31および-A33は、それぞれHLA-A1101、-A3101および-A3303遺伝子を安定に発現するC1R亜細胞株である。これら亜細胞株上のHLA-A11、-A31および-A33分子の発現は以前に報告している（Takedatsu H, Shichijo S, Katagiri K, Sawamizu H, Sata M, Itoh K., Clin Cancer Res 2004;10:1112-1120.）。PC3、PC-93、およびLNCaPは、前立腺癌細胞株であり、KE4は食道癌細胞株である。HLA-A11、-A31および-A33分子をそれぞれ発現するLNCaP亜細胞株を製造するため、HLA-A1101、-A3101または-A3303プラスミドｃDNAを真核細胞発現ベクターであるpCR3.1（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）に挿入し、ジーン・パルサー（Bio RAD, Richmond, CA, USA）を用いてエレクトロポレーションを行った。LNCaP-A11、-A31および-A33が、それぞれHLA-A1101、-A3101および-A3303遺伝子を安定に発現する亜細胞株である（図１）。これら細胞株は全て10％FCS含有RPMI 1640（Invitrogen）で培養した。
1.4 RT-PCR
癌細胞株の全RNAは、RNAzol（商標）B (Tel-Test Inc., Friendswood, TX, USA)を用いて単離した。cDNAを、SuperScript（商標）Preamplification System for First-Strand cDNA Synthesis (Invitrogen)を用いて調製し、以下のプライマーを用いて増幅した：SART3：5’-AAGTACGCCAACATGTGGC-3’（センス、配列番号３４)、5’-CTCTGCTCATTGACACGAGC-3’（アンチセンス、配列番号３５））；βアクチン：5’-CTTCGCGGGCGATGC-3’（センス、配列番号３６）、5’-CGTACATGGCTGGGGTGTTG-3’（アンチセンス、配列番号３７)。PCRは、TaqDNAポリメラーゼを用いて、DNAサーマルサイクラー (iCycler, Bio-Rad laboratories, Hercules, CA, USA)において95℃1分、60℃1分、72℃1分、30サイクルにて行った。PCR産物は、2%アガロースゲルにおける電気泳動により分離した。
癌細胞株の全RNAは、RNAzol（商標）B (Tel-Test Inc., Friendswood, TX, USA)を用いて単離した。cDNAを、SuperScript（商標）Preamplification System for First-Strand cDNA Synthesis (Invitrogen)を用いて調製し、以下のプライマーを用いて増幅した：SART3：5’-AAGTACGCCAACATGTGGC-3’（センス、配列番号３４)、5’-CTCTGCTCATTGACACGAGC-3’（アンチセンス、配列番号３５））；βアクチン：5’-CTTCGCGGGCGATGC-3’（センス、配列番号３６）、5’-CGTACATGGCTGGGGTGTTG-3’（アンチセンス、配列番号３７)。PCRは、TaqDNAポリメラーゼを用いて、DNAサーマルサイクラー (iCycler, Bio-Rad laboratories, Hercules, CA, USA)において95℃1分、60℃1分、72℃1分、30サイクルにて行った。PCR産物は、2%アガロースゲルにおける電気泳動により分離した。
1.5 ペプチド
表１に示すSART3由来ペプチドはすべて、HLA-A3スーパータイプアレル分子に対する結合モチーフに基づき調製した（Parker KC, Bednarek MA, Coligan JE., J Immunol 1994;152:163-175.）。インフルエンザ (Flu) ウイルス由来ペプチド、エプスタイン・バー・ウイルス (EBV) 由来ペプチド、チロシナーゼ関連タンパク2 (TRP2)由来ペプチド、およびHIV由来ペプチドを、HLA-A3スーパータイプアレルに対する結合のコントロールとして使用した。ペプチドは全てBiologica Co.（Nagoya, Japan）より購入し、ジメチルスルホキシドを用いて10μg/mlの用量で溶解した。
表１に示すSART3由来ペプチドはすべて、HLA-A3スーパータイプアレル分子に対する結合モチーフに基づき調製した（Parker KC, Bednarek MA, Coligan JE., J Immunol 1994;152:163-175.）。インフルエンザ (Flu) ウイルス由来ペプチド、エプスタイン・バー・ウイルス (EBV) 由来ペプチド、チロシナーゼ関連タンパク2 (TRP2)由来ペプチド、およびHIV由来ペプチドを、HLA-A3スーパータイプアレルに対する結合のコントロールとして使用した。ペプチドは全てBiologica Co.（Nagoya, Japan）より購入し、ジメチルスルホキシドを用いて10μg/mlの用量で溶解した。
1.6 PBMCからのペプチド特異的CTLの誘導
ペプチド反応性CTLは既報の方法に一部変更を加えて検出した（Hida N, Maeda Y, Katagiri K, Takasu H, Harada M, Itoh K., Cancer Immunol Immunother 2002;51:219-28.）。U底96ウェルマイクロカルチャープレート（Nunc, Roskilde, Denmark）において培養液200μl中で、PBMC（1 x 105 細胞/ウェル）を各ペプチド（10μl/ml）と4ウェル一組にてインキュベートした。本培養液は45% RPMI 1640、45% AIM-V培地（Gibco-BRL, Gaithersburg, MD）、10% FCS、100 U/ml インターロイキン-2（IL-2）および0.1mM MEM 非必須アミノ酸溶液（Gibco-BRL）より構成された。3または4日毎に培養液の半分を除去して対応ペプチド（20μg/ml）およびIL-2（100 U/ml）を含む新しい培養液と交換した。培養15日目に、培養細胞を4つのウェルに分けた。2つのウェルは対応ペプチドをパルスしたC1R-A11、-A31または-A33細胞について使用し、他の2つのウェルはHIVペプチドをパルスしたC1R-A11、-A31または-A33細胞と培養した。18時間インキュベートした後上清を回収し、IFN-γのレベルを酵素結合免疫測定法（ELISA）により測定した。ペプチド反応性CTLの誘導は、両側スチューデントt検定によりp＜0.05であり、かつHIVペプチドをパルスした細胞と比較して対応ペプチドをパルスした細胞に応答して100 pg/mlを超えるインターフェロン（IFN）-γが産生された場合に陽性と判断した。
ペプチド反応性CTLは既報の方法に一部変更を加えて検出した（Hida N, Maeda Y, Katagiri K, Takasu H, Harada M, Itoh K., Cancer Immunol Immunother 2002;51:219-28.）。U底96ウェルマイクロカルチャープレート（Nunc, Roskilde, Denmark）において培養液200μl中で、PBMC（1 x 105 細胞/ウェル）を各ペプチド（10μl/ml）と4ウェル一組にてインキュベートした。本培養液は45% RPMI 1640、45% AIM-V培地（Gibco-BRL, Gaithersburg, MD）、10% FCS、100 U/ml インターロイキン-2（IL-2）および0.1mM MEM 非必須アミノ酸溶液（Gibco-BRL）より構成された。3または4日毎に培養液の半分を除去して対応ペプチド（20μg/ml）およびIL-2（100 U/ml）を含む新しい培養液と交換した。培養15日目に、培養細胞を4つのウェルに分けた。2つのウェルは対応ペプチドをパルスしたC1R-A11、-A31または-A33細胞について使用し、他の2つのウェルはHIVペプチドをパルスしたC1R-A11、-A31または-A33細胞と培養した。18時間インキュベートした後上清を回収し、IFN-γのレベルを酵素結合免疫測定法（ELISA）により測定した。ペプチド反応性CTLの誘導は、両側スチューデントt検定によりp＜0.05であり、かつHIVペプチドをパルスした細胞と比較して対応ペプチドをパルスした細胞に応答して100 pg/mlを超えるインターフェロン（IFN）-γが産生された場合に陽性と判断した。
1.7 細胞傷害活性の測定
LNCaP、LNCaP-A11、LNCaP-A31またはLNCaP-A33に対するペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性は、標準的6時間51Cr放出測定法により測定した。フィトヘマグルチニン（PHA）活性化T細胞を陰性対照細胞として使用した。丸底96ウェルプレートにおいて各ウェルにつき2000個の51Cr標識細胞を、示したエフェクター細胞／標的細胞の比率でエフェクター細胞とともに培養した。特異的51Cr放出は、以下の式により計算した：特異的溶解（％）＝（被験試料の放出−自然放出）/（最大放出−自然放出）。エフェクター細胞なしで51Cr標識細胞をインキュベートした場合の上清中の51Cr量が自然放出であり、51Cr標識細胞を1% Triton X（Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan）とインキュベートした場合の上清中の51Cr量が最大放出である。
LNCaP、LNCaP-A11、LNCaP-A31またはLNCaP-A33に対するペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性は、標準的6時間51Cr放出測定法により測定した。フィトヘマグルチニン（PHA）活性化T細胞を陰性対照細胞として使用した。丸底96ウェルプレートにおいて各ウェルにつき2000個の51Cr標識細胞を、示したエフェクター細胞／標的細胞の比率でエフェクター細胞とともに培養した。特異的51Cr放出は、以下の式により計算した：特異的溶解（％）＝（被験試料の放出−自然放出）/（最大放出−自然放出）。エフェクター細胞なしで51Cr標識細胞をインキュベートした場合の上清中の51Cr量が自然放出であり、51Cr標識細胞を1% Triton X（Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan）とインキュベートした場合の上清中の51Cr量が最大放出である。
1.8 コールド標的細胞阻害実験
ペプチド反応性CTLの特異性は、コールド標的細胞による阻害実験により確認した。実験直前に、CD8陽性T細胞を CD8 Positive Isolation Kit （Dynal, Oslo, Norway）により単離した。詳細には、精製したCD8陽性T細胞（2 x 104 細胞／ウェル）を、丸底96ウェルプレートにおいて、コールド標的細胞（4 x 104 細胞）の存在下、51Cr標識標的細胞（2 x 103 細胞/ウェル）とともに培養した。対応SART3ペプチドまたHIVペプチドのいずれかで事前にパルスしたC1R-A11、-A31および-A33をコールド標的細胞として使用した。
ペプチド反応性CTLの特異性は、コールド標的細胞による阻害実験により確認した。実験直前に、CD8陽性T細胞を CD8 Positive Isolation Kit （Dynal, Oslo, Norway）により単離した。詳細には、精製したCD8陽性T細胞（2 x 104 細胞／ウェル）を、丸底96ウェルプレートにおいて、コールド標的細胞（4 x 104 細胞）の存在下、51Cr標識標的細胞（2 x 103 細胞/ウェル）とともに培養した。対応SART3ペプチドまたHIVペプチドのいずれかで事前にパルスしたC1R-A11、-A31および-A33をコールド標的細胞として使用した。
1.9 統計
データの統計学的有意差は、両側スチューデントt検定により決定した。0.05未満のP値を統計学的に有意であると判断した。
データの統計学的有意差は、両側スチューデントt検定により決定した。0.05未満のP値を統計学的に有意であると判断した。
2. 結果
2.1 前立腺癌患者血漿中のSART3由来ペプチド反応性IgGの測定
はじめに、HLA-A3スーパータイプアレルに対する結合モチーフに基づき、29個のSART-3由来ペプチドを調製した（表１）。HLA-A3およびHLA-A68分子もHLA-A3スーパータイプアレルに属するが（Sette A, Sidney J., Immunogenetics 1999;50:201-212.）、それらは日本人では極めて稀なことから、HLA-A11、-A31、および-A33分子に対する結合能を優先的に検討した。本研究の目的は、HLA-A3スーパータイプ陽性前立腺癌患者において癌反応性CTLを誘導する能力を有するペプチドを同定することであるが、本発明者らは以前、CTL誘導ペプチドに反応するIgGが各種の癌の患者の血漿中から検出されることを観察している（Nakatsura T, Senju S, Ito M, Nishimura Y, Itoh K., Eur J Immunol 2002;32:826-836.; Ohkouchi S, Yamada A, Imai N, Mine t, Harada K, Shichijo S, Maeda Y, Saijo Y, Nukiwa T, Itoh K., Tissue Antigens 2002;59:259-272.）。さらに、前立腺癌患者から得られるPBMC数が限られることから、そのPBMCからペプチド特異的CTLを誘導する能力について個々のペプチドを試験するには、29個のペプチドは数が多すぎた。したがってまず、これらペプチド候補を前立腺癌患者のIgGに認識される能力に基づきスクリーニングした。
2.1 前立腺癌患者血漿中のSART3由来ペプチド反応性IgGの測定
はじめに、HLA-A3スーパータイプアレルに対する結合モチーフに基づき、29個のSART-3由来ペプチドを調製した（表１）。HLA-A3およびHLA-A68分子もHLA-A3スーパータイプアレルに属するが（Sette A, Sidney J., Immunogenetics 1999;50:201-212.）、それらは日本人では極めて稀なことから、HLA-A11、-A31、および-A33分子に対する結合能を優先的に検討した。本研究の目的は、HLA-A3スーパータイプ陽性前立腺癌患者において癌反応性CTLを誘導する能力を有するペプチドを同定することであるが、本発明者らは以前、CTL誘導ペプチドに反応するIgGが各種の癌の患者の血漿中から検出されることを観察している（Nakatsura T, Senju S, Ito M, Nishimura Y, Itoh K., Eur J Immunol 2002;32:826-836.; Ohkouchi S, Yamada A, Imai N, Mine t, Harada K, Shichijo S, Maeda Y, Saijo Y, Nukiwa T, Itoh K., Tissue Antigens 2002;59:259-272.）。さらに、前立腺癌患者から得られるPBMC数が限られることから、そのPBMCからペプチド特異的CTLを誘導する能力について個々のペプチドを試験するには、29個のペプチドは数が多すぎた。したがってまず、これらペプチド候補を前立腺癌患者のIgGに認識される能力に基づきスクリーニングした。
その結果、SART3 243-252（配列番号６）、SART3 511-519（配列番号１６）、SART3 734-742（配列番号２０）、SART3 831-839（配列番号２３）、またはSART3 910-918（配列番号２７）ペプチドに反応するIgGが、20人の前立腺癌患者のうちそれぞれ、5、7、13、5、および5人の血漿で検出された（表２）。これら5種類のSART3由来ペプチドに反応するIgGは、20人のHDのうちそれぞれ、2、2、8、1、および4人の血漿においても検出された（データ非提示）。これら5種類に対するSART3由来ペプチド反応性IgGは、HDよりも前立腺癌患者の血漿において検出頻度が高かった。他の24個のSART3由来ペプチドに反応するIgGは、これら5種類のSART3由来ペプチドに反応するIgGと比較して、前立腺癌患者およびHDの血漿において観察される頻度が低かった（データ非提示）。
2.2 前立腺癌患者PBMCからのペプチド特異的CTLの誘導
次に、癌患者由来のIgGに高頻度に認識されるこれら5種類のペプチドが、HLA-A11、-A31、または-A33陽性前立腺癌患者のPBMCからペプチド特異的CTLを誘導できるかについて調べた。In vitroにおいて、各SART3由来ペプチドまたは対照ペプチドにてPBMCを刺激し、刺激後の細胞が対応ペプチドをパルスしたC1R-A11、C1R-A31、またはC1R-A33細胞に応答してIFN-γを産生するかを調べた。
次に、癌患者由来のIgGに高頻度に認識されるこれら5種類のペプチドが、HLA-A11、-A31、または-A33陽性前立腺癌患者のPBMCからペプチド特異的CTLを誘導できるかについて調べた。In vitroにおいて、各SART3由来ペプチドまたは対照ペプチドにてPBMCを刺激し、刺激後の細胞が対応ペプチドをパルスしたC1R-A11、C1R-A31、またはC1R-A33細胞に応答してIFN-γを産生するかを調べた。
15人のHLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者(各アレルにつき5人)の代表的結果を表３に示す。ペプチド特異的CTLの誘導は、p＜0.05で、かつ対照のHIVペプチドによるIFN-γ産生との差が100 pg/mlを超える場合に成功と判断した。その結果、SART3 243-252（配列番号６）、SART3 511-519（配列番号１６）、SART3 734-742（配列番号２０）、SART3 831-839（配列番号２３）、およびSART3 910-918（配列番号２７）ペプチドにより、15人のHLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者のうちそれぞれ、0、11、6、3、および5人のPBMCから対応ペプチド反応性CTLが誘導された。これら5種類のSART3由来ペプチドはまた、15人のHLA-A3スーパータイプアレル陽性HDのうちそれぞれ、1、6、3、1、および3人のPBMCからペプチド反応性CTLを誘導した（データ非提示）。
この結果は、これら5種類のSART3由来ペプチドのうちSART3 511-519（配列番号１６）およびSART3 734-742（配列番号２０）ペプチドが特に、HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者のPBMCにおいてペプチド特異的CTLを誘導するためのペプチドとして好適であることを示す。
2.3 HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者のPBMCからの前立腺癌反応性CTLの誘導
次に、SART3 511-519（配列番号１６）およびSART3 734-742（配列番号２０）ペプチドによるin vitro刺激により誘導されるCTLが前立腺癌細胞に対して細胞傷害活性を示すかについて調べた。細胞傷害活性試験に先立ち、前立腺癌細胞株におけるSART3遺伝子の発現をRT-PCRに基づく方法により調べた（図１Ａ）。SART3 mRNAの発現は、KE4食道癌細胞株（腫瘍浸潤T細胞によりSART3が同定された細胞（Yang D, Nakao M, Shichijo S, Sasatomi T, Takasu H, Matsumoto H, Mori K, Hayanshi A, Yamana H, Shirouzu K, Itoh K., Cancer Res 1999;59:4056-4063.））においてはっきりと検出された。前立腺癌細胞株であるPC3、PC93、およびLNCaPもまたSART3 mRNAを発現していた。さらに、HLA-A3スーパータイプアレル拘束性細胞傷害活性能を明らかにするため、HLA-A11、-A31、および-A33分子のそれぞれを発現するLNCaPトランスフェクタントを作成した（図１Ｂ）。
次に、SART3 511-519（配列番号１６）およびSART3 734-742（配列番号２０）ペプチドによるin vitro刺激により誘導されるCTLが前立腺癌細胞に対して細胞傷害活性を示すかについて調べた。細胞傷害活性試験に先立ち、前立腺癌細胞株におけるSART3遺伝子の発現をRT-PCRに基づく方法により調べた（図１Ａ）。SART3 mRNAの発現は、KE4食道癌細胞株（腫瘍浸潤T細胞によりSART3が同定された細胞（Yang D, Nakao M, Shichijo S, Sasatomi T, Takasu H, Matsumoto H, Mori K, Hayanshi A, Yamana H, Shirouzu K, Itoh K., Cancer Res 1999;59:4056-4063.））においてはっきりと検出された。前立腺癌細胞株であるPC3、PC93、およびLNCaPもまたSART3 mRNAを発現していた。さらに、HLA-A3スーパータイプアレル拘束性細胞傷害活性能を明らかにするため、HLA-A11、-A31、および-A33分子のそれぞれを発現するLNCaPトランスフェクタントを作成した（図１Ｂ）。
In vitroにおいてHLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者由来のPBMCをSART3 511-519およびSART3 734-742 ペプチドのいずれかにて刺激し、それにより誘導されたペプチド反応性CTLがLNCaPトランスフェクタントに対して細胞傷害活性を示すことができるかを調べた（図２Ａ、図２Ｂ）。In vitroでSART3 511-519（配列番号１６）およびSART3 734-742（配列番号２０）のそれぞれにて刺激したHLA-A11陽性患者 (Pt. 1、2、5、および17) 由来のPBMCは、LNCaP細胞およびHLA-A11陽性幼弱化T細胞に対してよりもLNCaP-A11細胞に対して高いレベルの細胞傷害活性を示した。同様に、これらペプチドは、HLA-A31陽性患者およびHLA-A33陽性患者のPBMCからLNCaPトランスフェクタント反応性CTLを誘導する能力を有していた。つまり、これらペプチド反応性CTLは、LNCaP-A31細胞およびLNCaP-A33細胞に対してLNCaP細胞または幼弱化T細胞に対してよりも高いレベルの細胞傷害活性を示した。
これらの結果は、In vitroにおいてSART3 511-519（配列番号１６）またはSART3 734-742（配列番号２０）ペプチドにて刺激されたPBMCは、前立腺癌細胞に対してHLA-A11、-A31、または-A33拘束性に細胞傷害活性を発揮することを示す。
2.4 ペプチド特異的CD8陽性T細胞に依存する前立腺癌細胞に対する細胞傷害活性
さらに、ペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性に関与する細胞のタイプの同定を試みた。精製したCD8陽性T細胞を以下の実験に使用した。
さらに、ペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性に関与する細胞のタイプの同定を試みた。精製したCD8陽性T細胞を以下の実験に使用した。
図３Ａおよび図３Ｂに示すように、SART3 511-519（配列番号１６）およびSART3 734-742（配列番号２０）ペプチドで刺激したHLA-A11、HLA-A31、およびHLA-A33陽性患者由来のPBMCの、LNCaP-A11、LNCaP-A31、およびLNCaP-A33に対する細胞傷害活性は、対応ペプチドをパルスした非標識のC1R-A11、C1R-A31、およびC1R-A33細胞の添加によって有意に抑制されたが、HIV ペプチドをパルスした非標識のC1R-A11、C1R-A31、およびC1R-A33細胞によっては抑制されなかった。
このコールド阻害実験の結果は、ペプチド刺激PBMCのLNCaPトランスフェクタントに対する細胞傷害活性がペプチド特異的CD8陽性T細胞による可能性が高いこと示す。
3. まとめ
以上の結果は、本発明のSART3由来ペプチドがHLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者において前立腺癌反応性CTLを誘導でき、特異的免疫療法、特に癌ワクチン療法に有用であることを示す。
以上の結果は、本発明のSART3由来ペプチドがHLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者において前立腺癌反応性CTLを誘導でき、特異的免疫療法、特に癌ワクチン療法に有用であることを示す。
Claims (5)
- 配列番号１６または２０に示すアミノ酸配列からなるペプチド。
- 配列番号１６または２０に示すアミノ酸配列からなるペプチドを含む医薬組成物。
- 配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるペプチドを含み、HLA-A31またはHLA-A33陽性癌患者のためのものである、請求項２記載の医薬組成物。
- 配列番号２０に示すアミノ酸配列からなるペプチドを含み、HLA-A11またはHLA-A33陽性癌患者のためのものである、請求項２記載の医薬組成物。
- 医薬組成物が癌ワクチンである、請求項２〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
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