KR100460583B1

KR100460583B1 - 간세포 암의 예방 및 치료 방법

Info

Publication number: KR100460583B1
Application number: KR10-1999-7008375A
Authority: KR
Inventors: 제임스 에스. 에코노모우; 리사 에이치. 버터필드
Original assignee: 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 1997-02-13
Filing date: 1998-02-13
Publication date: 2004-12-08
Also published as: AU6435398A; CN1222536C; EP0979239A4; EP0979239B1; CN1739791A; EP0979239A1; JP2001515347A; US20020031520A1; KR20000071226A; JP2010222379A; DE69836209D1; JP3816959B2; CN1259139A; WO1998035981A1; JP2006188528A

Abstract

본 발명은 알파페토프로테인 분자의 일부 이상에 대한 포유동물의 면역 반응을 발생시킴으로써, 알파페토프로테인 분자의 일부 이상을 표면 상에 갖는, 포유동물의 간세포 암을 포함하는 암을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 알파페토프로텐인의 일부 이상을 포함하거나, 면역 반응을 강화시키기 위해 하나 이상의 아미노산이 천연 아미노산 대신 치환되어 있는 알파페토프로테인 분자의 일부 이상을 포함하는, 간세포 암을 포함하는 암의 예방 또는 치료용으로 사용하기 위해, 알파페토프로테인 분자의 일부 이상에 대한 포유동물의 면역 반응을 발생시키는 조성물에 관한 것이다.

Description

간세포 암의 예방 및 치료 방법 {PREVENTION AND TREATMENT OF HEPATOCELLULAR CANCER}

일차 간암은 세계적으로 암 사망의 주요 병인이다. 간세포암(HCC)은 연간 약 1,200,000명의 환자를 발병시키는 일차 간암의 가장 통상적인 유형이다. 동남 아시아 및 남아프리카와 같은 일부 지역에서, 간세포암은 악성종양의 가장 통상적인 유형 중 하나이다. 질환의 높은 빈도수는 이들 지역에서의 간염의 높은 발병율과 관련되는 것으로 보인다.

간세포암의 치료는 현재 비전이성 질환에 걸린 환자로 제한되고, 간을 이식하거나 이식하지 않으면서 종양을 외과적 절제하는 것을 포함한다. 그러나, 외과적 절제 및 이식은 절제 후의 재발성 때문에 대부분의 종양을 치료하지 못한다. 지금까지, 화학요법적 치료 방법은 거의 비효과적이었다. 지난 20년 동안 간세포암의 치료 분야에서는 상당한 진전이 없었다.

따라서, 간세포암의 효과적인 치료방법이 여전히 요구되고 있다. 치료방법은 이상적으로는, 질환의 가장 높은 발병율을 가진 후진국에서 사용하기에 적합해야 한다. 또한, 이러한 치료방법은 절제할 수 없는 종양을 지닌 환자 및 전이성 질환에 걸린 환자에게 사용하기에 적합해야 한다.

본 발명은 간세포암의 예방 및 치료에 관한 것이다.

도 1은 사람 AFP49 펩티드를 사용하여 생성된 CTL의 상대적 세포독성을 보여주는 막대 그래프이다.

도 2는 펩티드 표적물 및 AFP 표적 둘 모두에 대해 검정된, 정상 HLA A2.1 도우너로부터의 펩티드-펄스화된 PBMC로부터 생성된 CTL의 표준 크롬 방출 검정에 대한 특이적 용해율 대 표적을 보여주는 막대 그래프이다.

도 3은 쥐과동물 AFP cDNA로 면역된 마우스(□)와 면역되지 않은 마우스(■)에 대한, mAFP-포지티브 쥐과동물 종양 세포주인 BWIC3의 종양 접종 후의 일수(day)에 대한 평균 종양 부피의 플롯이다.

도 4는 쥐과동물 AFP cDNA로 면역된 마우스(□)와 면역되지 않은 마우스(●)에 대한, mAFP-생성 쥐과동물 종양 세포주인 EL4(parental)의 종양 접종 후의 일수에 대한 평균 종양 부피의 플롯이다.

도 5는 쥐과동물 AFP cDNA로 면역된 마우스(□)와 면역되지 않은 마우스(●)에 대한, mAFP-생성 쥐과동물 종양 세포주인 EL4(AFP)의 종양 접종 후의 일수에 대한 평균 종양 부피의 플롯이다.

도 6은 마우스 AFP-AdVShuttle 벡터 neo-함유 발현 플라스미드를 사용하여 플라스미드 DNA로 면역된 마우스(●,하부 ■, ◆)와 면역되지 않은 마우스(상부 ■,▼)에 대한, AFP-발현 벡터로 안정하게 트랜스펙션된 FSA C3H 백그라운드 섬유육종 세포 또는 neo-발현 벡터만으로 안정하게 트랜스펙션된 FSA C3H 백그라운드 섬유육종 세포의 종양 접종 후의 일수에 대한 평균 종양 직경의 플롯이다.

도 7은 마우스 AFP 유전자를 합성시키는 플라스미드 벡터로 면역된 마우스(●)와 면역되지 않은 마우스(■)에 대한, BWIC3의 종양 접종 후의 일수에 대한 평균 종양 직경의 플롯이다.

도 8은 마우스 AFP 유전자를 합성시키는 플라스미드 벡터로 면역된 마우스(▲, ◆, ▼)와 면역되지 않은 마우스(●, ■)에 대한, BWIC의 종양 접종 후의 일수에 대한 평균 종양 직경의 플롯이다.

도 9는 다양한 다중 감염도(MOI) (레인 4 내지 7)에서 AdVmAFP로 형질도입된 쥐과동물 DC로부터 단리된 mRNA의 RT-PCR 분석을 다양한 대조군(레인 2, 3, 8 및 9)과 비교한 도면이다.

도 10은 AdVmAFP 형질도입된 수상 세포로 면역된 마우스(■), 다양한 대조 물질로 면역된 마우스(▲, ▼) 및 면역되지 않은 마우스(●)에 대한, mAFP-생성 쥐과동물 종양 세포주인 EL4(AFP)의 종양 접종 후의 일수에 대한 평균 종양 부피의 플롯이다.

도 11은 AdVmAFP 형질도입된 수상 세포로 면역된 마우스(■)와 면역되지 않은 마우스(●)에 대한, mAFP-생성 쥐과동물 종양 세포주인 BWIC3의 종양 접종 후의 일수에 대한 평균 종양 부피의 플롯이다.

발명의 요약

본 발명의 한 양태에 따르면, 사람을 포함하는 포유동물의 간세포암과 같은 암을 예방하거나 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 알파페토프로테인 분자의 아미노산 서열의 적어도 일부에 대해 포유동물에게서 면역반응을 발생시키는 단계를 포함한다.

면역반응을 발생시키는 단계는 알파페토프로테인 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는 펩티드를 포함하는 하나 이상의 조성물, 또는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 알파페토프로테인 아미노산의 일부 이상을 포함하는 펩티드를 포함하는 하나 이상의 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 면역반응을 발생시키는 단계는 또한 알파페토프로테인 분자에 대한 cDNA 서열의 일부 이상을 포함하는 하나 이상의 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 면역반응을 발생시키는 단계는 알파페토프로테인 cDNA를 발현시키는 재조합 벡터로 형질도입된 면역계 세포를 포함하는 하나 이상의 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 암을 예방하거나 치료하기 위해 사람을 면역시키기 위한 조성물이 제공된다. 조성물은 AFP5, AFP7, AFP13, AFP14, AFP18, AFP22, AFP23, AFP28, AFP38, AFP39, AFP45, AFP49, SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4으로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 및 다른 특징, 양태 및 장점은 하기의 상세한 설명, 첨부한 청구의범위 및 첨부 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 알파페토프로테인 분자의 일부 이상에 대해 포유동물에게서 면역반응을 발생시킴으로써, 알파페토프로테인 분자의 일부 이상을 표면상에 갖는 사람과 같은 포유동물의 간세포암을 포함하는 암을 예방하거나 치료하기 위한 방법이 제공된다. 이 방법은 암에 걸린 포유동물을 면역시키거나 유전적으로 조작하여 암세포의 표면 상에 존재하는 알파페토프로테인 분자의 일부 이상에 대해 면역반응을 발생시키는 것을 포함한다. 그 후, 병에 걸린 포유동물의 면역계는 표면 마아커를 갖는 암세포를 파괴하여, 임상적 암을 예방하거나 확립된 암을 치료하게 된다.

대다수의 사람 간세포 암세포는 대략 출생시까지 태아 간세포에 의해 정상적으로 생성되는 609개 아미노산 잔기 단백질인 사람 알파페토프로테인(hAFP) (SEQ ID NO:2)을 합성시킨다. 간세포 암세포는 알파페토프로테인 분자의 일부 이상을 이들의 표면상에 나타내려는 경향이 있다. 간세포암에서의 알파페토프로테인의 존재는 스크리닝 및 진단을 위한 마아커로서 사용되었다.

알파페토프로테인은 면역계의 발달 동안 정상적으로 존재하기 때문에, 자연적으로, 면역계는 이 단백질에 대해 면역적으로 반응할 수 있는 능력을 보유하지 않는 것으로 가정된다. 본 발명의 한 일면은 포유동물의 면역계가 외인성 단백질로서의 알파페토프로테인에 대해 반응하고, 외인성 세포로서의 알파페토프로테인 분자의 일부 이상을 표면상에 갖는 세포에 대해 반응하도록 만들어질 수 있다는 발견을 포함한다. 따라서, 이러한 면역 반응을 생성시키는 것은 간세포암을 예방하고, 포유동물 면역계로 하여금 간세포 암세포를 파괴하게 하여 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

본원에 기술된 바와 같이, 알파페토프로테인에 대한 면역은 알파페토프로테인 서열의 일부 이상을 기초로 하는 합성 펩티드를 포함하는 알파페토프로테인 서열의 일부 이상을 포함하는 합성 펩티드로 면역시키는 것을 포함하는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있지만, 치환 또는 그 밖의 변형을 가질 수 있는데, 알파페토프로테인에 대한 cDNA 서열의 일부 이상에 의해 면역시킴으로써 알파페토프로테인 분자의 일부 이상을 생성시켜서 적합한 면역계 세포에 제공하는 것, 유전공학처리된 항원 제공 세포를 포유동물 체내로 도입시키는 것, 및 유전자요법용 바이러스 벡터를 사용하여 알파페토프로테인 분자의 일부 이상을 발현시키는 것이 있다. 이러한 면역화의 목적은 알파페토프로테인 펩티드 특이적 T 림프구를 활성화시켜서 이들의 표면 마아커를 갖는 세포에 대해 면역반응을 발생시킴으로써, 바람직하게는 세포독성 T 림프구를 활성화시켜서 간세포 암세포를 파괴시키는 데에 있다.

1) 사람에게서 면역반응을 발생시키는 사람 알파페토프로테인 펩티드의 결정 및 생성

사람 알파페토프로테인 분자의 임의의 부분이 사람에게서 면역반응을 발생시킬 수 있는 지를 결정하기 위해, 전체 사람 알파페토프로테인(hAFP) 분자(SEQ ID NO:2)로부터 유도된 일련의 펩티드(hAFP)를 시험하여, 클래스 I-제한 펩티드로서 이들이 항종양 반응을 발생시킬 수 있고, 세포독성 림프구(CTL)에 대한 표적 분자로서 작용할 수 있는 지를 결정하였다. 잠재적으로, hAFP로부터 유도되는 면역원성 펩티드가 HLA A2.1 클래스 I 결합 그루브(groove)에 대한 이들의 잠재적 합치(conformity)를 기준으로 하여 선택된다. HLA A2.1(세계 보건 기구의 서브타입 명명법으로 HLA A 0201)은 이것이 백인 사이에서 가장 통상적인 대립유전자이고 또한 다른 집단 사이에서도 널리 분포되어 있기 때문에 선택되었다. 결정은 다음과 같이 이루어졌다.

첫번째로, 공지된 컨센서스 서열에 따라 HLA A2.1에 잠재적으로 결합하는 hAFP로부터의 펩티드 서열(SEQ ID NO:2)이 확인되었다. HLA A2.1은 아미노산의 수가 8개 내지 10개인 펩티드, 바람직하게는 9량체인 펩티드와 결합하는 것으로 여겨진다. 펩티드 길이에 따라, 아미노산 이소로이신, 로이신 및 메티오닌은 펩티드 위치 2에서 중요한 앵커 잔기인 것으로 여겨지며, 아미노산 이소로이신, 로이신 및 발린은 펩티드 위치 9 또는 10에서 중요한 앵커 잔기인 것으로 여겨진다.

HLA A2.1 클래스 I 결합 모티프에 합치되는 적합한 펩티드 서열은 hAFP 서열(SEQ ID NO:2)을 스크리닝하고, 하나는 위치 2에 함유하고 다른 하나는 각각 9량체 및 10량체를 갖는 펩티드에 대해 위치 9 또는 10에 함유하는 2개의 강한 결합 "앵커" 잔기를 함유하거나("강한" 펩티드로 지정됨); 단지 하나의 강한 결합 앵커 잔기를 함유하거나("중간" 펩티드로 지정됨); 강한 결합 앵커 잔기를 함유하지 않지만 다른 포지티브 결합 잔기를 지니는("약한" 펩티드로 지정됨) 9량체 및 10량체 펩티드를 동정하기 위해, 더 유니버시티 오브 위스콘신 제네틱스 컴퓨터 그룹 프로그램 "파인드 패턴"(the University of Wisconsin Genetics Computer Group Program "find patterns")를 사용하여 동정되었다. 결합을 파괴하는 것으로 여겨지는 하나 보다 많은 잔기를 함유하는 펩티드 서열은 배제된다.

스크리닝 연구에 의해 HLA A2.1 클래스 I 결합 모티프에 잠재적으로 합치되는 총 72개의 펩티드 서열이 동정되었지만, 이들 서열 중 6개는 이들의 높은 소수성으로 인해 합성시키기 어렵기 때문에 추가의 연구로부터 배제되었다. 나머지 66개의 펩티드 서열은 당업자들에게 공지된 기술에 따라 키론 미메토프스(Chiron Mimetopes)(오스트레일리아, 빅토리아)에 의한 시험을 위해 합성되었다. 이들은 10개의 "강한" 펩티드 서열, 43개의 "중간" 펩티드 서열 및 13개의 "약한" 펩티드 서열을 포함하였다. 하기의 표 I에는, 좌측으로부터 우측으로, 펩티드와 관련하여, 펩티드 지정 번호, 펩티드 서열에 의해 표시되는 hAFP 서열(SEQ ID NO:2)의 잔기 및 각각의 66개의 펩티드 서열에 대해 펩티드가 포함하는 아미노산 서열이 기재되어 있다. 펩티드 지정 번호는 키론으로부터의 펩티드의 수령 순서를 기준으로 한 것이며, 따라서 hAFP 분자의 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)에 대해 비순차적이다.

표 I

사람 AFP 펩티드 서열

66개의 펩티드를 각각, HLA A2.1에 농도 의존 방식으로 결합하여, 하기와 같이 T2 세포 안정화 검정에서 HLA A2.1을 안정화시키는 능력에 대해 시험하였다. 각각의 펩티드를 전날 밤에 실온에서 인큐베이팅시켜서 세포 표면 MHC 클라스 I 분자 발현을 증가시킨 TAP1 및 TAP2가 결실된 T2와 밤새 인큐베이팅시켰다. 각각의 펩티드를 펩티드 농도 범위, 즉 0.1μM 내지 100μM에 걸쳐 HLA A2.1 분자와 결합하는 능력에 대해 시험하였다. T2 세포주에서, 8량체 내지 10량체 펩티드로 채워진 MHC 분자만이 세포 표면 상에서 안정하다. HLA A2.1의 안정성은 항-HLA A2 항체 BB7.2(ATCC) 및 염소 안티마우스-FTTC로 T2 세포를 염색시킨 후에 유량 세포 계산에 의해 검정하였다. 결합을 위한 포지티브 대조군으로서, FLU 매트릭스 펩티드(FLU 매트릭스 1 단백질의 잔기 58-66, GILGFVFTL) 및 MART-1 펩티드(MART-1의 잔기 27-35, AAGIGILTV, 전체 단백질에 대한 젠뱅크(GenBank) 수탁 번호 U06452)를 사용하였다. FLU 매트릭스 펩티드는 0.5μM의 농도에서 T2 세포 상의 A2.1 분자를 일관되게 안정화시켰다.

표 II에는, 66개의 hAFP 펩티드 중 22개의 목록이 기재되어 있다. 칼럼 1은 펩티드 지정 번호를 기재하고 있고, 칼럼 2는 펩티드 서열에 의해 표현되는 hAFP 서열(SEQ ID NO:2)의 잔기를 확인하는 것이며, 칼럼 3은 서열 내의 앵커 잔기의 수를 확인하는 것이다.

표 II의 칼럼 4는 T2 세포 상의 HLA 2.1과 결합하는 데에 필요한 펩티드의 최소 농도를 기재하고 있다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, 10개의 "강한" 펩티드 서열 중 6개, 및 43개의 "중간" 펩티드 서열 중 7개가 HLA 2.1에 대한 결합 능력을 나타내었다. 또한, 13개의 "약한" 펩티드 서열 중 어느 것도 HLA 2.1에 대한 결합 능력을 나타내지 못했다.

또한, 66개의 펩티드를 각각, EBV 림포블라스토이드 세포 오프-키네틱스(off-kinetics) 검정으로 시간의 경과에 따라 클라스 I 분자로부터의 이들의 해리 속도에 대해 시험하였는데, 그 이유는 클라스 I 분자에 결합된 펩티드의 오프-키네틱스, 즉 해리 속도가 펩티드의 면역원성의 상당한 전조가 되는 것으로 밝혀졌기 때문이다. 예를 들어, 바이러스 펩티드 HPV 16 E7, EBV LMP2, FLU M1 및 HIV pol.과 같은 비-자체결합성 펩티드의 경우에, 가장 느린 오프-키네틱스를 나타내는 가장 강한 결합 펩티드가 가장 면역원성인 것으로 밝혀졌다. 또한, gp100, MART-1과 같은 흑색종 항원으로부터의 면역원성 에피토프인 많은 공지된 자체-단백질은 가용성 클래스 I 재구성 검정에 의해 하나의 앵커 잔기 및 덜 안정한 결합 친화성을 갖지만, 오프-키네틱스가 매우 느린 것으로 밝혀졌다. [참조: Bakker, A.B., et al., Analogues of CTL epitopeswith improved MHC class-I binding capacity elicit anti-melanoma CTL recognizing the wild-type epitope, Int J Cancer, 1997. 70(3): p. 302-1; and van der Burg, S.H., et al., Do epitopes derived from autoantigens display low affinity for MHC class I? (letter), Immunol Today, 1997. 1982: p. 97-98; 각각의 문헌은 참고문헌으로서 본원에 전체 내용이 편입되어 있음].

표 II

사람 AFP 펩티드 서열 및 결합 특징

EBV 림포블라스토이드 세포 오프-키네틱스 검정은 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[van der Burg, S.H., et al., Immunogenicity of peptides bound to MHC class I molecules depends on the MHC-peptide complex stability. J. Immunology, 1996. 156(9): p. 3308-3314]에 기술된 바와 같이 수행되었다. 간략하게, 약한 pH 3.2 산 완충제 중에서 HLA A2.1 EBV 림포블라스토이드 세포로부터 표면 클래스 I 펩티드 및 β2 마이크로글로불린이 스트립핑(stripping)되어, MHC 분자를 불안정하게 만든다. 각각의 펩티드는 β2 마이크로글로불린의 존재하에서 1시간 동안 200μM으로 과량으로 스트립핑된 세포 상으로 즉시 펄스화되었다. 그 후, 과량의 결합되지 않은 펩티드는 세척되고, 세포는 37℃에서 0, 2, 4 및 6시간 동안 인큐베이팅되었다. 세포는 각각의 시점의 종료시에 세척되고, HLA A2에 대해 BB7.2 항체로 염색되었다. 펩티드-클래스 I 복합체는 평균 형광 세기가 스트립핑되지만 펩티드로 펄스화되지 않은 세포 보다 1.5배 이상 증가하는 경우에 안정한 것으로 간주되었다.

T2 세포 안정화 검정과 EBV 림포블라스토이드 세포 오프-키네틱스 검정 둘 모두는 각각의 펩티드에 대해 2회 이상 수행되었다. 표 II에서, 칼럼 5는 EBV 림포블라스토이드 세포상에서의 펩티드 안정성의 시간을 나타낸다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, 강한 펩티드 중 3개(AFP5, AFP14 및 AFP22), 43개의 중간 펩티드 중 12개(AFP49를 포함함) 및 약한 펩티드 중 1개만이 느린 오프-키네틱스의 수준을 나타내었다. T2 세포 안정화 검정과 EBV 림포블라스토이드 세포 오프-키네틱스 검정 둘 모두를 고려해 볼때, 이들 검정 둘 모두에서 가장 양호한 결과를 제공하는 펩티드 서열 중 7개는 AFP5, AFP7, AFP13, AFP14, AFP28, AFP38 및 AFP45임을 알 수 있다.

하기의 표 III의 칼럼 1에 기재된 펩티드는 플레반스키(Plebanski) 등의 문헌[Induction of peptide-specific primary cytotoxic T lymphocyte responses from human peripheral blood. Eur J.Immunol. 1995. 25(6): p. 1783-7]에 기술된 방법에 의해 생체외에서 펩티드 특이적 CTL을 발생시키기 위해 사용되었고, CTL은 A2.1-포지티브, AFP-포지티브 간세포 암세포를 용해시키는 능력에 대해 시험되었다. 용해는 펩티드가 사람 AFP의 천연 처리된 면역원성 에피토프이고 잠재적으로 표적 항원임을 시사하는 것이다. HLA A2.1 도우너 및 세포주는 BB7.2(HLA A2) 항체(ATCC)로 스크리닝되고, 당업자들에게 공지된 기술에 따라 PCR 및 유씨엘에이 티슈 타이핑 래버러토리(UCLA Tissue Typing Laboratory)에 의한 직접 서열 분석에 의해 확인되고 서브타입화된다.

표 III

사람 AFP 펩티드 세포독성

간략하게, 펩티드 특이적 CTL은 하기와 같이 표 III AFP 펩티드에 기재된 펩티드에 대해 발생되었다. 정상 A2.1 도우너로부터의 2x10⁷개의 말초혈 단핵세포 (PBMC)가 피콜(Ficoll) 구배에 의해 정제되었다. 이들 PBMC는 37℃에서 90분 동안 1㎖의 혈청 비함유 배지 중에서 50㎍/㎖ 펩티드로 펄스화되었다. 그 후, 세포는 1회 세정되고, RPMI/10% 자가 혈청 중의 IL-7(10ng/㎖) 및 KLH(4.5㎍/㎖)을 사용하여 0일째에 웰 1개당 10% 자가 혈청 RPMI 배지 1.5㎖ 중에 3x10⁶PBMC로 24-웰 플레이트에 정위되었다. CTL은, 비부착성 세포를 분리해내어 이들을 새로운 펩티드 펄스화되고 세척되고 방사선조사된 PBMC에 1:1의 PBMC:CTL 비로 첨가함으로써 약하게 재자극되었다. IL-2는 10 단위/㎖로 약하게 2회 첨가되었다.

배양 3주 후에, 추정되는 hAFP 펩티드 발생된 CTL은 표준 4시간⁵¹Cr 방출 검정으로 세포독성에 대해 시험되었다. CTL은 CTL을 발생시키기 위해 사용되는 특정 hAFP 펩티드로 펄스화된 T2 세포에 대한 펩티드 특이적 사멸에 대해 시험되고, 대조군으로서의 FLU 매트릭스 펩티드 또는 MART-1 펩티드로 펄스화된 T2 세포와 비교되었다. 비특이적 NK 사멸은 NK 민감성 표적 K562로 평가되었다. CTL은 또한 HLA A2.1-포지티브, AFP-포지티브 사람 간세포 암세포주인 HepG2에 대해 시험되었다.

표 III에는, 포지티브 펩티드 세포독성 결과를 제공하는 정상 도우너로부터 CTL을 발생시키기 위해 사용되는 12개의 AFP 펩티드 서열에 대한 시험의 세포독성 결과가 기재되어 있다. 칼럼 2는 벌크(bulk) 림프구 배양물의 CD4/CD8 표현형을 나타낸다. 칼럼 3 및 4는 각각 이펙터(CTL) 대 표적 비(E:T)와 함께 펩티드 펄스화된 T2 세포와 HepG2 표적에 대한 세포독성 수준을 나타낸다.

표 III으로부터 알 수 있는 바와 같이, 펩티드 AFP22, AFP39, AFP45 및 AFP49는 AFP+, HLA A2.1+HepG2 세포의 고수준의 특이적 사멸을 나타내었다. AFP22 및 AFP49는 4개의 아미노산 중첩, 즉 hAFP(SEQ ID NO:2)의 잔기 547-550을 가짐을 알 수 있다. 또한, AFP22는 AFP23과 2개의 아미노산 중첩, 즉 SEQ ID NO:2의 잔기 555-556을 가지며, 이는 최저의 HepG2 사멸을 나타내었다.

AFP49를 사용하여 발생된 CTL은 재시험되었고, HepG2 세포독성은 유지되었다. 또한, 새로운 AFP49 펩티드 발생된 CTL 배양물이 2개의 상이한 정상 HLA A2.1 도우너를 사용하여 제조되었다. 추가의 표적이 사용되어 AFP49를 사용하여 관찰되는 세포독성이 AFP 항원 특이적이고 클라스 I 제한되는 지를 확인하였다.

도 1에는, 이들 시험의 대표적 데이터가 도시되어 있다. 첫번째로, 관찰되는 세포독성이 클라스 I 제한되는 지를 확인하기 위해, 항-β2 마이크로글로불린 항체를 사용하여 HepG2 세포상에서의 CTL-T 세포 수용체 상호작용을 차단시켰다. 그 결과, HepG2 용해율이 상당히 감소되었다. 그 다음, 비특이적 NK/LAK 사멸을 제거하기 위해, 40배 과량의 비표지된(차가운) K562 세포가 첨가되었다. 그 결과, HepG2 용해율은 상당히 감소되지 않았다. 또한, γIFN(50 단위/㎖)과 밤새 인큐베이팅시킴으로써, MHC 클래스 I 발현이 HepG2 세포상에서 상향조절되었다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, MHC 클라스 I 발현 상향조절은 HepG2 용해율을 증가시켰다. 또한, AFP+, HLA A2.1-네가티브 간세포 암세포주인 Hep3B, 즉 클래스 I-미스매치된 간세포 암세포주가 표적으로서 사용되었다. AFP49 CTL은 이들 Hep3B 표적을 매우 저수준으로 용해시켰다. 이러한 소량의 관찰된 Hep3B 용해는, 차가운 K562 세포가 첨가되는 경우에 HepG2의 특이적 사멸이 보유되는 것과는 대조적으로, 과량의 차가운 K562를 첨가함으로써 제거되었다.

도 2에는, 펩티드 표적과 AFP 표적 둘 모두에 대해 검정된 정상 HLA A2.1 도우너로부터의 펩티드-펄스화된 PBMC로부터 발생되는 CTL의 표준 크롬 방출 검정에 대한 % 특이적 용해율 대 표적의 막대 그래프가 도시되어 있다. CTL의 펩티드 특이성을 확인하기 위해, 각각의 배양물은 CTL 배양물이 제조되는 특이적 펩티드로 펄스화된 T2 세포(가장 좌측의 막대)에 대해 시험되었고, 대조군으로서의 상이한 HLA A2.1 결합 펩티드로 펄스화된 T2 세포(좌측으로부터 두 번째 그룹의 막대)와 비교되었다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, 대조군 AFP49 펩티드 배양물, AFP49V9 펩티드 배양물, AFP5 펩티드 배양물 및 대조 FLU 매트릭스 펩티드 배양물은 모두, 특이적 펩티드로 펄스화된 T2 세포의 용해에 의해 펩티드 특이성을 나타내었지만, 상이한 펩티드로 펄스화된 T2 세포에 대해서는 특이성을 나타내지 않았다.

도 2와 관련하여, 이들 펩티드 특이적 CTL 배양물은 각각 AdVhAFP 또는 대조 AdVRR5로 형질도입된 M202(HLA A2.1+/AFP-) 흑색종 세포의 사멸에 대해 시험되었다. AFP 펩티드 AFP5 및 AFP49 뿐만 아니라 AFP49의 위치 9에서 단일 아미노산 치환을 갖는 펩티드 AFP49L9, SEQ ID NO:3(GVALQTMKL) 및 AFP49V9, SEQ ID NO:4(GVALQTMKV)는 대조 RR5로 형질도입된 M202 세포의 사멸 보다 AdVhAFP로 형질도입된 M202 세포의 상당히 더 많은 사멸을 나타낸다. FLU 펩티드 특이적 CTL 배양물은 유사한 백그라운드 수준의 세포독성을 나타내면서 M202/AdVhAFP와 M202/RR5 둘 모두를 사멸시켰다.

M202 세포는 현재 HLA A2.1 제한된 면역지배적 MART-1 펩티드를 정확하게 프로세싱하고 제공하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 이들은 AdVhAEP로 형질도입시키기 위한 이상적 세포주이고, AFP로부터의 정확한 HLA A2.1 제한된 에피토프가 프로세싱되어 표면상에 제공될 것으로 예측된다. 따라서, 상기 실험은 AFP5, AFP49, AFP49L9, SEQ ID NO:3 및 AFP49V9, SEQ ID NO:4이 AFP+ 종양을 사멸시키기 위해 CTL을 표적화하는 데에 사용될 수 있는 천연 프로세싱되어 제공된 펩티드임을 입증하였다. 또한, AFP49L9, SEQ ID NO:3, 및 AFP49V9, SEQ ID NO:4로부터 알 수 있는 바와 같이, 펩티드-특이적 CTL 배양물은 AFP49 펩티드-특이적 CTL 배양물 보다 M202/AdVhAFP를 훨씬 더 효과적으로 사멸시키며, 따라서, AFP49L9, SEQ ID NO:3, 및 AFP49V9, SEQ ID NO:4는 AFP+ 세포에 대한 면역 반응을 표적화시키기 위한 개선된 펩티드이다.

상기 설명으로부터 인지될 수 있는 바와 같이, 본 발명은 암세포가 표면 마아커로서 알파페토프로테인 분자의 일부 이상을 지니는, 사람을 포함하는 포유동물의 암을 예방하거나 치료하는 것을 포함한다. 예방 또는 치료는 알파페토프로테인 분자의 일부 이상에 대한 치환 또는 변형에 의해 생성시킨 알파페토프로테인 분자 또는 펩티드의 일부 이상을 포함하는 펩티드를 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여함으로써 달성된다. 이러한 펩티드로는 AFP5, AFP7, AFP13, AFP14, AFP18, AFP22, AFP23, AFP28, AFP38, AFP39, AFP45, AFP49, AFP49L9, SEQ ID NO:3, 및 AFP49V9, SEQ ID NO:4이 있다.

2) 간세포 암세포를 포함하는, 알파페토프로테인을 표면 상에 함유하는 세포에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 알파페토프로테인 cDNA를 사용하는 포유동물의 면역

포유동물을 알파페토프로테인 cDNA로 면역시키면, 간세포 암세포를 포함하는, 알파페토프로테인을 표면 상에 함유하는 종양 세포에 의한 접종(challenge)에 대해 부분적으로 또는 완전히 보호성인 면역 반응이 발생한다. 이 효과는 다음과 같이 입증되었다:

사람 알파페토프로테인 cDNA를 하기와 같이 생성시켰다. 첫번째로, 사람 알파페토프로테인 cDNA를 트리졸(Trizol) 방법[Life Technologies, Gaithersburg, MD] 및 RNAzolB 방법[TelTest, Friendswood, TX]에 의해 Hep3B 세포(ATCC로부터 입수)로부터 제조한 전체 RNA로부터 PCR 기술에 의해 생성시켰다. 전체 RNA 중 약 1㎍을 공지된 서열을 기초로 하여 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) RT-PCR 킷 및 AFP-특이적 프라이머를 사용하는 RT-PCR 반응에 사용하였다. 5' 프라이머는 5' GCA ACC ATG AAG TGG GT이었다. 3' 프라이머는 5' AAC TCC CAA AGC AGC ACG AGT이었다. 프라이머는 프라이머 내로 혼입된 제한 엔도누클레아제 부위 XbaI를 지니고 PCR 후에 효소 분해를 촉진시키는 6개의 염기(CTC TCT)로 종결되면서 전체 코딩 영역(ATG 내지 정지 코돈)을 포함한다. 프라이머 서열을 오페론 테크놀로지스(Operon Technologies)에 의해 50nM 규모로 합성하고, 정제하지 않았다.

이로부터 생성된 사람 알파페토프로테인 PCR cDNA 생성물을 아가로오스 겔 상에서 분석하여 그 크기를 체크하였다. 정확한 크기의 생성물을 키아겐(Qiagen) PCR-퀵 클린-업(PCR-quick clean-up) 칼럼에서 정제하고, 절단 부위가 프라이머 내로 설계되어 있는 XbaI 효소로 절단시키고, 당업자들에게 공지된 기술에 따라 pRcCMV(사람) 또는 pCR3.1(쥐과동물) 포유동물 발현 벡터[캘리포니아, 칼스바드에 소재하는 인비트로겐(Invitrogen)] 내로의 클로닝 반응에 사용하였다. 포지티브 플라스미드를 미티프레프(miniprep) 분석에 의해 확인하였다. 이들 포지티브 플라스미드를 맥시프레핑시키고(maxiprepped), 분취량을 UCLA에서 DNA 서열화 코아 장치에 의해 서열화시켜서 삽입물의 서열 동일성을 확인하였다. 서열 데이터는 하나의 가닥만을 위한 것이며, AFP 삽입물의 동일성을 확인해주었다. 따라서, 클로닝된 사람 AFP cDNA는 사람 AFP의 공지 서열과 동일하였다 (젠뱅크 수탁 번호 J00077, J00076, V01514, 염기 48-1877, SEQ ID NO:1).

쥐과동물 AFP cDNA(mAFP cDNA)를 사람 AFP cDNA를 클로닝시키기 위해 사용된 상기 기술된 방법에 상응하는 방법을 사용하지만, 마우스-특이적 프라이머를 사용하여 클로닝시켰다. 5' 쥐과동물 특이적 프라이머는 5' GCC ATG AAG TGG ATC ACA이다. 3' 쥐과동물 특이적 프라이머는 TTA AAC GCC CAA AGC ATC A이다. 전체 RNA를 단리시키기 위해 사용되는 마우스 AFP-포지티브 세포주는 Hepa16이다. 본원에 기술된 모든 안정한 트랜스펙턴트 및 근내 주입 실험을 신호-서열을 함유하는 cDNA 클론을 사용하여 수행하였다.

그 다음, mAFP cDNA를 진핵세포 발현 벡터 VR1012[캘리포니아, 샌 디에고에 소재하는 바이칼, 인코포레이티드(Viacal, Inc.)] 내에 넣었다. VR1012 발현 벡터는 향상된 발현을 위한 인트론, 생체내 발현을 위한 BGH 종결 및 폴리 A 서열을 포함하는, 강한 구성적 CMV 즉시형 초기 프로모터/인핸서를 함유한다.

C57BL/6 마우스에 3주일 동안 1주일에 한번씩 mAFP cDNA 또는 대조군으로서의 식염수를 함유하는 100㎍ VR1012를 근내 주입에 의해 투여하였다. 최종 주입 1주일 후에, VR1012 mAFP cDNA로 면역시킨 마우스와 면역되지 않은 대조군 마우스를, 유전적동계 마우스에서 점차적으로 성장하는 종양의 단일 세포 현탁액으로부터 수득한 4x10⁶개의 생존성 BWIC3 간세포 암세포로 접종하였다. BWIC3는 mAFP-포지티브 쥐과동물 세포주이다.

도 3을 참조하면, 면역된 동물(□)은 대조 동물(■)과 비교하여 지연된 종양 성장 또는 완전한 보호를 나타냄을 알 수 있다. 이러한 결과는 수 회 반복되었다. 상응하는 실험에서, MART-1 흑색종 항원을 발현시키는 플라스미드 벡터의 근내 주입은 BWIC3 간세포 암세포 접종으로부터 동물을 보호하지 못하였다 (도시되지 않음).

또 다른 실험군에서, 대용 쥐과동물 간세포 암세포주를, EL4(H-2^b) 림프종을 mAFP cDNA로 안정하게 트랜스펙션시킴으로써 구성하였다. 종양 세포주 EL4(mAFP)는 모(parental) EL4 세포주와 동일한 생체내 성장 키네틱스를 갖는다. RT-PCR을 사용하면, EL4(mAFP) 종양 세포주는 BWIC3 간세포 암세포주와 같이 1% 이하의 AFP의 수준을 생성시키는 것으로 보인다.

C57BL/6 마우스에게 3주일 동안 1주일에 한번씩 mAFP cDNA 또는 대조군으로서의 식염을 함유하는 100㎍ VR1012를 근내 주입시켰다. 최종 주입 1주일 후에, VR1012 mAFP cDNA로 면역시킨 마우스와 면역되지 않은 대조 마우스 둘 모두를 7.5x10⁵개의 생존성 EL4(parental) 또는 EL4(mAFP) 세포로 접종하였다.

도 4를 참조하면, 면역된 동물(□)과 대조 동물(●)이 EL4(parental) 세포로 접종된 경우 차이를 나타내지 않음을 알 수 있다 (p=0.07, 스튜던트 T 시험). 그러나, 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 면역된 동물(□)은 EL4(mAFP) 세포로 접종된 경우 대조 동물(●)과 비교하여 부분적 보호를 나타내었다 (p=0.07, 스튜던트 T 시험).

추가의 일련의 실험에서, 암포페토프로테인을 표면상에 함유하는 세포에 의한 접종에 대한 보호를, 대용물로서의 안정하게 트랜스펙션된 마우스 섬유육종 세포주를 사용하여 입증하였다. 먼저, 안정하게 트랜스펙션된 마우스 섬유육종 세포주를 제조업자의 지시에 따라 DOTAP 리포펙션 방법(뵈링거 만하임)을 사용하거나, CaPO₄침전법(당업자들에게 널리 공지된 기술에 따라)을 사용하여 생성시켰다. 요약하면, DOTAP 리포펙션 방법은 전날 밤에 밤새 부착시킨 6-웰 플레이트에서 웰 1개당 1x10⁵개 세포를 사용하였다. 2.5ug 플라스미드(쥐과동물 AFP pCR3.1)를 25㎕의 20mM Hepes 및 50㎕ Hepes 중의 15㎕ 지질 중에서 15분 동안 실온에서 혼합시켰다. 이것을 1㎖의 배양 배지(10% 우태아 혈청 및 항생물질을 함유하는 RPMI1640) 내로 희석시키고, 웰 내의 세포에 첨가하였다. 4 내지 6시간 후에, 용액을 2㎖의 새로운 배양 배지로 교체하였다. 48 내지 72시간 후에, G418(제네티신)@ 500㎍/㎖를 사용하여 선택을 개시하였다 (전체 농축물, 75% 활성). 선택 2 내지 3주 후, 임의의 잠재적 트랜스펙턴트를 마우스 AFP RNA, 네오-RNA의 발현을 위해 RT-PCR에 의해 시험하고, 쥐과동물 APRT 유전자 발현으로 반(半)정량화시켰다.

포유동물에서 종양 생성을 방지하는 데에 있어서의 AFP 면역의 효능은 하기와 같이 입증된다. 마우스 AFP-pCR3.1 플라스미드 및 마우스 AFP-AdVShuttle 벡터 플라스미드(pAC CMVpLpA)를 당업자들에게 공지된 기술에 따라 제조하고, 마우스 AFP-바이칼 벡터 VR1-1012를 구성하였다. 쥐과동물 섬유육종 세포주 FSA, NFSA, MCAK 및 SVEC를 상기와 같이 mAFP PCR3.1로 안정하게 트랜스펙션시켰다.

C3H 마우스를 키아겐 플라스미드 프레프 킷(50㎕ PBS 중의 50㎍ 플라스미드)을 사용하여 엔도톡신 없이 제조한 마우스 AFP-AdVShuttle 벡터 neo-함유 발현 플라스미드를 사용하여 플라스미드 DNA를 3주 동안 매주 근내 주입함으로써 면역시켰다. 그 후, C3H 마우스를, AFP-발현 벡터로 안정하게 트랜스펙션된 FSA C3H 백그라운드 섬유육종 세포 또는 neo-발현 벡터만으로 안정하게 트랜스펙션된 FSA C3H 백그라운드 섬유육종 세포로 접종하여, AFP 항-자가 항원 반응이 발생될 수 있는 지 또는 네오마이신을 발현하는 안정한 트랜스펙션을 사용하면 AFP 반응을 마스킹(masking)하는 항-neo(비-자가 항원)가 발생되는 지를 결정하였다. 종양 세포를 생체내에서 계대배양시키고, 단일 세포 현탁액을 종양 접종을 위해 사용하였다.

도 6을 참조하면, 종양 접종 후 18일째까지, AFP-발현 벡터로 안정하게 트랜스펙션된 FSA C3H 백그라운드 섬유육종 세포로 접종된 면역된 CH3 마우스(하부 ■) 중 하나만이 임의의 종양 성장(3mm x 3mm 종양)를 나타내는 반면, AFP-발현 벡터로 안정하게 트랜스펙션된 FSA C3H 백그라운드 섬유육종 세포로 접종된 나머지 4마리의 면역된 CH3 마우스(●)는 종양 성장의 징후를 나타내지 않았다. 대조적으로, AFP-발현 벡터로 안정하게 트랜스펙션된 FSA C3H 백그라운드 섬유육종 세포로 접종된 5마리의 면역되지 않은 CH3 마우스(상부 ■) 중 2마리가 임의의 종양 성장(평균 6.83 mm²)을 나타내었다. FSA 모 종양 세포 및 네오-벡터-FSA 세포는 면역된 C3H 마우스(◆)와 면역되지 않은 C3H 마우스(▼) 둘 모두에서 유사하게 성장하였다. 상기 프로토콜을 반복하였으며, 유사한 결과를 얻었다 (데이터는 도시되지 않음).

제 2 실험을 잭슨 랩스(Jackson Labs)[바아 하아버 메인(Bar Harbor Maine)]으로부터의 C57L/J("leaden") 마우스를 사용하여 수행하였다. 이들 마우스를 네오마이신을 함유하지 않은 바이칼로부터의 플라스미드 벡터(VR1012)로 면역시켜서, 따라서, 마우스 AFP 유전자만을 합성시켰다. C57L/J 마우스를 쥐과동물 유전적동계 종양 세포주인 ATCC로부터의 BWIC3로 접종하였다. 이들 BWIC3 세포는 상기 기술된 바와 같이 생성된 안정하게 트랜스펙션된 쥐과동물 섬유육종 세포 보다 훨씬 더 고수준의 마우스 AFP를 합성시킨다.

C57L/J 마우스를 mAFP-바이칼 벡터를 사용하여 상기 기술된 바와 같이 면역시키고, 마우스 1마리당 1x10⁶개의 BWIC3 세포의 종양 접종을 피하적으로 수행하였다. 도 7을 참조하면, 종양 접종 후 14일째에, 면역되지 않은 C57L/J 마우스(■)가 면역된 C57L/J 마우스(●)에서의 종양 보다 평균 2배 더 큰 종양을 갖는다는 것을 알 수 있다.

제 3 실험에서, 추가의 C57L/J 마우스를 마우스 AFP 유전자만을 합성시키는 플라스미드 벡터(VR1012)로 면역시키고, 상기 기술된 바와 같이 1x10⁶개의 BWIC3 세포로 접종하였다. 도 8을 참조하면, 접종 후 17일째까지, 모든 5마리의 면역되지 않은 마우스(●, ■)가 직경이 평균 11.4mm²인 종양을 가짐을 알 수 있다. 대조적으로, mAFP-바이칼로 면역된 5마리의 마우스 중 3마리(▲)는 평균 9mm²의 종양을 갖고, 한 마리의 면역된 마우스(◆)는 작은 3mm²의 종양을 가지며, 한마리의 마우스(▼)는 종양을 나타내지 않았다.

따라서, 상기 설명으로 인지될 수 있는 바와 같이, 본 발명은 사람을 포함하는 포유동물의 암을 예방하거나 치료하는 것을 포함하며, 여기에서 암세포는 표면 마아커로서의 알파페토프로테인 분자의 일부 이상을 갖는다. 예방 및 치료는 알파페토프로테인 cDNA의 일부 이상을 포함하는 조성물을 포유 동물 체내에 투여하여 알파페토프로테인 분자의 일부 이상에 대한 면역 반응을 발생시킴으로써 수행된다.

3) 간세포 암세포를 포함하는, 알파페토프로테인을 표면 상에 갖는 세포에 대해 유전공학처리된 수상 세포를 사용하여 포유동물을 면역시키는 방법

쥐과동물 AFP(AdVmAFP) 알파페토프로테인 cDNA를 발현시키는 재조합 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 수상 세포로 포유동물을 면역시키면, 간세포 암세포에 의한 접종에 대해 부분적으로 또는 완전히 보호성인 면역 반응이 발생된다.

먼저, 쥐과동물 AFP(AdVmAFP)를 발현시키는 재조합 아데노바이러스를 당업자들에게 공지된 기술에 따라 구성하였다 [참조예 : Ribas, A., L. H. Butterfield, W. H. McBride, S. M. Jilani, L. A. Bui, C. M. Vollmer, R. Lau, V. B. Hu, A. Y. Chen, J. A. Glaspy, and J. S. Economou. 1997. Genetic immunization for the melanoma antigen MART-1/Melan-A using recombinant adenovirus-transduced murine dendritic cells. Cancer Res 57:2865; and Tolozan, E. M., K. Hunt, S. Swisher, W. McBride, R. Lau, S. Pang, K. Rhoades, T. Drake, A. Belldegrun, J. G;aspy, and J. S. Economou, 1996. In vivo cancer gene therapy with a recombinant interleukin-2 adenovirus vector. Cancer Gene Ther 3:11; 전체 내용이 본원에 참고문헌으로 인용됨]. 수상 세포를 당업자들에게 공지된 기술에 따라 GM-CSF 및 IL-4 중에서 7일 동안 분화된 C57BL/6 골수로부터 생성시켰다 [참조예 : Ribas, A., L. H. Butterfield, W. H. McBride, S. M. Jilani, L. A. Buli, C. M. Vollmer, R. Lau, V. B. Dissette, B. Hu, A. Y. Chen, J. A. Glaspy, and J. S. Economou. 1997. Genetic immunization for the melanoma antigen MART-1/Melan using recombinant adenovirus-transduced murine dendritic cells. Cancer Res 57:2865; and Inaba, K., M. Steinman. 1992. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med 176:1693; 이들 문헌은 본원에 참고문헌으로 인용되어 있음].

도 9에는, 다양한 다중 감염도(MOI)에서 AdVmAFP로 형질도입된 쥐과동물 DC로부터 단리된 mRNA의 RT-PCR 분석이 도시되어 있다. 좌측으로부터 우측으로 읽어갈 때, 레인 1은 겔 크기 표준을 나타내며; 레인 2는 네가티브 대조군으로 사용된 mAFP 네거티브 세포에 대한 결과를 나타내며; 레인 3은 네가티브 대조군으로 사용된 쥐과동물 수상 세포에 대한 결과를 나타내며; 레인 4 내지 7은 각각 10, 100, 1000 및 5000의 MOI에서 AdVmAFP로 형질도입된 쥐과동물 수상 세포에 대한 결과를 나타내며; 레인 8은 포지티브 대조군으로 사용된 BWIC3 세포에 대한 결과를 나타내며(약 1.9kb의 맨위의 라인); 레인 9는 PCR 오염에 대한 no-주형 대조군으로서의 재증류수(DDW)에 대한 결과를 나타낸다. 상기에서 알 수 있는 바와 같이, 쥐과동물 AFT(AdVmAFP)를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터는 수상 세포를 성공적으로 형질도입시켰다.

다음으로, 100 MOI에서 AdVmAFP, RR5(엠프티(empty) E1-결실된 아데노바이러스)로 형질도입시킨 5×10⁵수상 세포 또는 비처리된 수상 세포를 2주동안 주마다 1회 정맥 주입함으로써 다섯 마리의 C57BL/6 마우스로 구성된 3개 그룹을 준비하였다. 이들 3개의 마우스 그룹과 대조군으로서의 주입되지 않은 하나의 마우스 그룹에게 최종 주입 후 1주일째에 7.5×10⁵개의 EL4(AFP)로 접종하였다. 결과는 도 10에 도시하였다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, RRS(▲), 처리되지 않은 수상 세포(▼) 및 대조군 마우스(●) 중 어느 것도 종양 접종에 대한 보호를 나타내지 않았다. 대조적으로, 100의 MOI에서 AdvmAFP로 형질도입된 5x10⁵개의 수상 세포가 주입된 마우스는 종양 접종에 대해 부분적 보호를 나타내었다.

또한, 100 MOI에서 AdVmAFP로 형질도입시킨 5×10⁵수상 세포를 2주동안 주당 정맥내 주입함으로써 다섯마리의 마우스로 구성된 또 다른 그룹을 준비하였다. 형질도입시킨 수상 세포의 최종 주입 후 1주일째에, 4×10⁶BWIC3 종양 세포에 의한 접종에 대한 상기 그룹의 반응을 유사하지만 주입되지 않은 대조 마우스 그룹의 반응과 비교하였다. 상기 시험의 결과를 도 11에 도시하였다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, 면역된 마우스(■)는 대조군 마우스(●)와 비교하여, 종양 접종에 대해 현저한 보호를 나타내었으며, 이는 이는 형질도입된 수상 세포에 의한 처리의 효능을 입증하는 것이다.

따라서, 본 명세서로부터 인지되는 바와 같이, 본 발명은 사람을 포함하는 포유동물의 암을 예방하거나 치료하는 방법을 포함하며, 여기에서 암세포는 표면 마아커로서 알파페토프로테인의 일부 이상을 함유한다. 예방 또는 치료는 알파페토프로테인 cDNA를 발현시키는 재조합 벡터로 형질도입된 수상 세포와 같은 면역계 세포를 포함하는 조성물을 포유동물 체내에 투여함으로써 달성된다.

포유동물의 간세포암의 치료

본 발명의 한 양태에 따라, 알파페토프로테인의 일부 이상에 대해 사람의 면역 반응을 발생시킴으로써 사람의 간세포암을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 본원에 기술된 방법 중의 하나 또는 상응하는 방법과 유사한 방법으로 사람을 면역시키거나, 알파페토프로테인에 대한 면역 반응을 발생시키도록 사람을 유전적으로 조작하는 것을 포함한다. 바람직한 양태에서, 간세포암에 걸린 사람을 AFP5, AFP7, AFP13, AFP14, AFP18, AFP22, AFP23, AFP28, AFP38, AFP39, AFP45 또는 AFP49와 같은 사람 알파페토프로테인 분자의 일부 이상에 대한 면역 반응을 발생시키도록 면역된다. 상기 면역은 사람의 면역계가 알파페토프로테인 분자의 부분을 표면에 갖는 간세포 암세포를 공격하도록 해준다.

본 발명은 바람직한 특정 양태와 관련하여 상당히 상세하게 설명되었지만, 그 밖의 양태도 가능하다. 따라서, 첨부된 청구의범위의 사상 및 범위는 본원에 포함된 바람직한 양태의 설명으로 제한되지 않아야 한다.

서열 목록

(1) 일반적 사항

(i) 출원인: 이코노모우, 제임스 에스.; 버터필드, 리사 에이치.

(ii) 발명의 명칭: 간세포 암의 예방 및 치료 방법

(iii) 서열의 수: 4

(iv) 연락처:

(A) 수신인: 쉘돈 & 맥

(B) 스트리트: 225 에스. 레이크 애비뉴, 나인쓰 플로어

(C) 도시: 파사도나

(D) 주: 캘리포니아

(E) 우편 번호: 91101

(v) 컴퓨터 판독 형태:

(A) 매체 유형: 디스켓, 3.50 인치, 1.44 Mb 용량

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종

(C) 작업 시스템: Windows 95

(D)소프트웨어: WordPerfect for Window version 8.0

(vi) 현재 출원 상황:

(A) 출원 번호: PCT/US98/02753

(B) 출원일: 1998년 2월 13일

(C) 분류: 미지정

(viii) 변리사/대리인 상황

(A) 성명: 파라, 데이비드 에이.

(B) 등록 번호: 38,134

(C) 참고/서류 번호: 11969-1PCT

(ix) 통신처

(A) 전화: (626) 796-4000

(B) 팩스: (626) 795-6321

(2) 서열 번호 1에 대한 사항:

(i) 서열의 특성:

(A) 서열의 길이: 2032

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2 본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: cDNA

(ix) 서열 설명: 서열 번호 1:

(2) 서열 번호 2에 대한 사항:

(i) 서열의 특성:

(A) 서열의 길이: 609

(B) 서열의 타입: 아미노산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: 펩티드

(ix) 서열 설명: 서열 번호 2:

(2) 서열 번호 3에 대한 사항:

(i) 서열의 특성:

(A) 서열의 길이: 9

(B) 서열의 타입: 아미노산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: 펩티드

(ix) 서열 설명: 서열 번호 3:

(2) 서열 번호 4에 대한 사항:

(i) 서열의 특성:

(A) 서열의 길이: 9

(B) 서열의 타입: 아미노산

(C) 쇄의 수: 1 본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: 펩티드

(ix) 서열 설명: 서열 번호 4:

Claims

암세포에 대해 알파페토프로테인 펩티드 특이적 T 림프구를 활성화시키는 것을 포함하는 면역 반응을 생성시키기에 충분한 알파페토프로테인 분자의 아미노산 서열의 일부 또는 이의 변형체를 포함하며, 알파페토프로테인 분자의 아미노산 서열의 일부가 SEQ ID NO:2의 잔기 1-9, SEQ ID NO:2의 잔기 12-20, SEQ ID NO:2의 잔기 158-166, SEQ ID NO:2의 잔기 178-186, SEQ ID NO:2의 잔기 235-243, SEQ ID NO:2의 잔기 287-295, SEQ ID NO:2의 잔기 404-412, SEQ ID NO:2의 잔기 441-450, SEQ ID NO:2의 잔기 492-500, SEQ ID NO:2의 잔기 542-550, SEQ ID NO:2의 잔기 547-556 및 SEQ ID NO:2의 잔기 555-563으로 구성된 군으로부터 선택되고, 변형체가 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4인, 포유동물의 암을 예방하거나 치료하기 위한 약제 조성물.
제 1항에 있어서, 알파페토프로테인 펩티드 특이적 T 림프구가 세포독성 T 림프구임을 특징으로 하는 약제 조성물.
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제 1항에 있어서, 암이 간세포암임을 특징으로 하는 약제 조성물.
제 1항에 있어서, 포유동물이 인간임을 특징으로 하는 약제 조성물.
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암세포에 대해 알파페토프로테인 펩티드 특이적 T 림프구를 활성화시키는 것을 포함하는 면역 반응을 생성시키기에 충분한 알파페토프로테인 분자의 아미노산 서열의 일부 또는 이의 변형체를 코드화하는 폴리누클레오티드를 포함하며, 알파페토프로테인 분자의 아미노산 서열의 일부가 SEQ ID NO:2의 잔기 1-9, SEQ ID NO:2의 잔기 12-20, SEQ ID NO:2의 잔기 158-166, SEQ ID NO:2의 잔기 178-186, SEQ ID NO:2의 잔기 235-243, SEQ ID NO:2의 잔기 287-295, SEQ ID NO:2의 잔기 404-412, SEQ ID NO:2의 잔기 441-450, SEQ ID NO:2의 잔기 492-500, SEQ ID NO:2의 잔기 542-550, SEQ ID NO:2의 잔기 547-556 및 SEQ ID NO:2의 잔기 555-563으로 구성된 군으로부터 선택되고, 변형체가 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4인, 포유동물의 암을 예방하거나 치료하기 위한 약제 조성물.
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제 11항에 있어서, 폴리누클레오티드가 발현 벡터에 함유됨을 특징으로 하는 약제 조성물.
제 1항에 열거된 알파페토프로테인 분자의 일부 또는 이의 변형체를 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 수상 세포를 포함하는, 포유동물의 암을 치료하거나 예방하기 위한 약제학적 조성물.
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