FI118263B - Kaspaasiaktiivisuutta säätelevät peptidit - Google Patents
Kaspaasiaktiivisuutta säätelevät peptidit Download PDFInfo
- Publication number
- FI118263B FI118263B FI20021798A FI20021798A FI118263B FI 118263 B FI118263 B FI 118263B FI 20021798 A FI20021798 A FI 20021798A FI 20021798 A FI20021798 A FI 20021798A FI 118263 B FI118263 B FI 118263B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- afp
- peptides
- apoptosis
- peptide
- cell
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 124
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 74
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 58
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 title abstract description 52
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 title abstract description 52
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims abstract description 58
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 16
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 12
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims 2
- 210000003298 dental enamel Anatomy 0.000 claims 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 abstract description 126
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 58
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 abstract description 46
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 abstract description 46
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 abstract description 14
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 8
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 abstract description 8
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 8
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 abstract description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 abstract description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 abstract description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 abstract description 2
- 208000033065 inborn errors of immunity Diseases 0.000 abstract description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 2
- 208000028529 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 abstract description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 2
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 abstract 3
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 abstract 1
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 abstract 1
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 abstract 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 123
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 64
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 58
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 39
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 22
- 101000848653 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 26 Proteins 0.000 description 21
- 102000046101 human AFP Human genes 0.000 description 21
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 19
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 19
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 18
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 18
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 18
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 15
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 13
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 12
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 108010086821 DEVDase Proteins 0.000 description 11
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 9
- 101000827785 Homo sapiens Alpha-fetoprotein Proteins 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 7
- 108010090535 alpha-albumin Proteins 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 6
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 6
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 6
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 5
- 101150064015 FAS gene Proteins 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 108010058883 acetyl-aspartyl-glutamyl-valyl-aspartyl-amino-4-methylcoumarin Proteins 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 3
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 3
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 3
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 3
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 3
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 2
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 2
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 2
- 108010049207 Death Domain Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009058 Death Domain Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102000015212 Fas Ligand Protein Human genes 0.000 description 2
- 108010039471 Fas Ligand Protein Proteins 0.000 description 2
- 101000611023 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Proteins 0.000 description 2
- -1 MORT Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100040403 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Human genes 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 2
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 2
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000021014 regulation of cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 6-[(5S)-5-[[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]methyl]-2-oxo-1,3-oxazolidin-3-yl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C[C@H]1CN(C(O1)=O)C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 229940088872 Apoptosis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010089941 Apoptosomes Proteins 0.000 description 1
- FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N Asp-Cys Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 101150017888 Bcl2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100026548 Caspase-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000004039 Caspase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000802895 Dendroaspis angusticeps Fasciculin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100044298 Drosophila melanogaster fand gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007989 Effector Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010089510 Effector Caspases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100026693 FAS-associated death domain protein Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000793880 Homo sapiens Caspase-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000911074 Homo sapiens FAS-associated death domain protein Proteins 0.000 description 1
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 1
- 101000850748 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor type 1-associated DEATH domain protein Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010021460 Immunodeficiency syndromes Diseases 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- FGNQZXKVAZIMCI-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N FGNQZXKVAZIMCI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 206010051141 Myeloblastoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101100335198 Pneumocystis carinii fol1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 description 1
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 1
- 102100033081 Tumor necrosis factor receptor type 1-associated DEATH domain protein Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 102000035181 adaptor proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005764 adaptor proteins Proteins 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000158 apoptosis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108010008124 aspartyl-glutamyl-valyl-aspartyl-7-amino-4-trifluoromethylcoumarin Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 101150055276 ced-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 108010045325 cyclic arginine-glycine-aspartic acid peptide Proteins 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000019189 interleukin-1 beta production Effects 0.000 description 1
- 230000006662 intracellular pathway Effects 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000006510 metastatic growth Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 102000006255 nuclear receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000000082 organ preservation Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001175 peptic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000025915 regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000006433 tumor necrosis factor production Effects 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
KASPAASIAKTIIVISUUTTA SÄÄTELEVÄT PEPTIDIT 1 1 8 26 3
KEKSINNÖN ALUE
5 Keksintö koskee lääketieteen aluetta ja mekanismeja, joilla ihmisen ja eläinten solut kuolevat säädellysti. Erityisesti keksintö koskee peptidejä jotka kykenevät estämään säädellyn solukuoleman, jota indusoi erilaiset tekijät. Keksintö kuvaa tällaisia peptidejä, niiden valmistusmenetelmiä ja sanottujen peptidien käyttöä.
10 KEKSINNÖN TAUSTA
Säädelty solukuolema eli apoptoosi on aktiivinen muoto solujen kuolemaa, mikä liittyy moniin normaalien solujen kehitysprosesseihin samoin kuin niiden muuntumiseen kasvainsoluiksi. Apoptoosin mekanismi liittyy kiinteästi biologisiin tapahtumiin, joita herättävät mm. erilaiset 15 lääkeaineet, sytokiinit, kasvutekijät, oksidatiivinen stressi, säteily, ikääntyminen, autoimmuunisairaudet ja elinsiirroissa tapahtuva hylkiminen. Apoptoosin viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että eri apoptoosin tyypit käyttävät samaa mekanismia. Hormonit, sytokiinit, kasvutekijöiden inhibitio, kemoterapeuttiset aineet, ionisoiva säteily, immunologiset häiriöt, AI DS ja ikääntyminen vaikuttavat tätä kautta (Nagata, (1997) Cell 88, 355-365).
20
Kaspaasiproteaasien kaskadityyppinen aktivaatio edustaa keskeistä osaa apoptoosin induktiossa (Cohen, et ai. (1997) Biochem. J., 326:1-16). Kaksi eri tyyppistä signaalin siirtoa on kuvattu.
• · · I*·* Alkuvaihe reseptorista riippuvassa apoptoosin liipaisussa sisältää sopivien solukuolemarcseptorien • · » * · * * aktivoinnin spesifisiI lä ligandeilla, kuten TNF tai FaSl, jotka ovat nykyisin tutkituimpia apoptoosin • · • *’ 25 indusoreina (Wallach et ai. (1997). FEBS Letters, 410: 96-106). Aktivoituessaan solukuolemareseptorit Fas (CD95) tai TNFR1 ovat liittyneinä sytosolisiin adapteriproteiincihin • * '· " (FADD, MORT, RIP, TRADD), jotka puolestaan työllistävät kaspaasi-8:n, joka aktivoi • * '*··* interleukiini-l-praa muuntavan ICE/CED-3 perheen proteaasi (kaspaasi) -kaskadin, mitä seuraa CPP32/kaspaasi-3-kysteeiinialaperheen aktivoituminen, jonka jäsenet esiintyvät sytoplasmassa • · · ·♦·· 30 latentteina esiasteina, prokaspaaseina (Enari, et ai. (1996) Nature 380:723-726). Reseptoreista • · » *···* riippumaton apoptoosi sisältää tavallisesti olennaisen sytokromi-c:n kautta indusoituvan !*: mekanismin, joka vaatii tertiäärisen kompleksin sytokromi c, dATP, Apaf-1 ja prokaspaasi-9 ; *: muodostumisen, mikä johtaa jälkimmäisen tekijän autoproteolyysiin ja ja homodimerisoitumiseen, * • · · · • · · • « ··· 2 118263 mitä seuraa kaspaasiketjun aktivoituminen (Liu et.ai. (1996) Cell, 86: 147-157; Pan et. ai., (1998) FEBS Letters, 426:151-154; Slee et ai., (1999) J Cell Biol, 144:281-292).
Aineet, jotka vaikuttavat apoptoosin biologiseen säätelyyn täten omaavat potentiaalisesti 5 terapeuttisia käyttömahdollisuuksia joukossa kliinisiä sovellutuksia. Joukkoa kasviperäisiä apoptoosin inhibiittoreita käytetään selvitettäessä patologisia sairauksia, jotka usein liittyvät kemoterapiaan, säteilyyn, immuunisairauksiin, tai AIDS:iin. Nämä aineet yleensä sisältävät hiilihydraatteja, rasvoja ja kasviproteiinihydrolysaatteja, lektiinejä ja fosfolipidejä (US6004579,
Barr et ai.,). Potentiaalisia apoptoosin säätelijöitä voitaisiin hyödyntää syöpäpotilaiden käsittelyssä 10 kontrolloitaessa sytokiiniterapiaa, kemoterapiaa, tai säteilytysterapiaa. Apoptoosin mekanismit toimivat useissa erilaisissa immunologisissa sairauksissa, kuten autoimmuunikasvaimissa, elinsiirtojen immuunihylkimisessä, tai anafylaksiassa, tai ihmisen immuunikatoviruksen infektioissa.
15 Alfa-fetoprotciini (AFP) on kasvaimiin liittyvä sikiön glykoproteiini, jolla on moninaisia biologisia aktiivisuuksia sisältäen solukasvun säätelyn, epäkypsien solujen erilaistumisen, aktivoitujen immuunisolujen immunosuppression, tuumorispesifisen apoptoosin herättämisen ja toisten tekijöitten kautta tapahtuvien apoptoottisten signaalien säätelyn, samoin kuin erilaisten geeni- ilmennysten säätelyn (Deutsch, (1991) Adv. Cancer Res. ,56:253-312; Mizejewski, (1997) Proc.
20 Soc. Exp. Biol Med., 215: 333-362). Kokonaiselle AFP-molekyylille on esitetty monenlaisia kasvua sääteleviä aktiivisuuksia sisältäen kasvaimia estävän vaikutuksen (Semenkova et ai.,(1997)
Tumor Biology, 18: 261-274; Semeniuk et ai, (1995) Ad. Exper. Med. Biol., 383: 255-269; *1·’ Sonnenschein et ai., (1980) J. Natl Cancer Inst., 64:1141-1146; Soto et ai., (1980) Proc. Naii • · · ’·1 1 Acad. Sei. USA, 77: 2084-2087; Jacobson et ai., (1999) Cancer Research, 50: 415-420).
« · * · : 1· 25 Samanlaisia vaikutuksia on esitetty myös AFP:n proteolyyttisille fragmenteille (Dudich et ai., * ’ (1999) Biochemistry, 38: 10406-10414) tai rekombinanttiosille molekyyliä (Festin et ai., (1999) • · *: Biochim. Biophys. Acta, 1427: 307-314) ja synteettisille peptideille (Mesiin et ai., (2000) Biochim.
* · ·
Biophys. Acta, 1501: 33-43; Mizejewsky, et ai., (1996) Mol. Cell. Endocr., 118: 15-23 (1996). AFP- molekyylin funktionaalisesti tärkeiden osien etsintään ovat osallistuneet useat tutkijat.
30 Arakidonihapon ja estradiolin sitoutumiskohtien paikallistaminen on ollut menestyksekäs (Deutsch, (1991) Adv. Cancer Res., 56:253-312; Mizejewski, (1997) Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 215: 333- ;1·1: 362; Nishi et ai., (1993) Tumor Biol. 14:234-243).
• · • · · • · • 1 » 1 · · 1 • # · · • · · • · • · • · · 3 118263
Hiljattain osoitettiin, että AFP toteuttaa sen kasvainten estoa koskevaa aktiivisuuttaan Hipaisemalla kaspaasi-3:n aktivaation riippumattomasti Fas/FasL ja TNF/TNFR signaaleista (Dudich et ai., (1999) Eur. J Biochem. 266: 1-13; Semenkova et ai., (1997) Tumor Biology, 18: 261-274; Dudich et ai. (1998) Tumor Biology, 19:30-40). Monia näyttöjä AFP:n kautta tapahtuvasta kasvainsolujen 5 kasvun estosta on raportoitu viime vuosikymmenellä, mutta AFP:n aktiivista keskusta, mikä aiheuttaa apoptoosisignaalit, ei ole identifioitu.
Ihmisen AFP:n DNA- ja aminohapposekvenssit on julkaistu (Morinaga, etal., 1983 “Primary structures of human alpha-fetoprotein and its iuRNA" Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 80:4604-4608).
10 Synteettisten peptidien, vastaten E2-sitoutumiskohtaa, osoitettiin omaavan kasvaimia estäviä ominaisuuksia (US patentit US5674842; 10/1997 Mizejewsky; US5707963, 07/1998 Mizejewsky).
Useat biologisesti aktiiviset proteiinit jakavat sekvenssihomologiaa AFP:n kanssa (Mizejewski, (1993) BioEssays, 15:427-432; Mizejewski, (1997) Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 215: 333-362). On identifioitu AFP:lle autenttista homologiaa eri apoptoosin signalointiin liittyvien proteiininen 15 kanssa, kuten Bcl2, TNFR1, Fas, jne. (Mizejewski, (2001) Proc. Soc. Exp. Biol. Med). Siitä huolimatta kasvaimia estävää AFP:n aktiivista keskusta ei ole vielä määritetty.
Tripeptidi Arg-Gly-Asp on tärkeä integriiniä sitova kohta, joka on joukossa monia integriiniligandeja. lntegriinit ovat heterodimeerisiä glykoproteiineja, jotka ovat tärkeitä 20 solutukirangan ja solujen välisten vuorovaikutusten prosesseissa ja integriineillä on aktiivinen rooli * soludifferentiaatiossa, immuunitunnistuksessa, kasvainten kehittymisessä ja metastaasien kasvussa. Kontaktipaikka peptidille Arg-Gly-Asp on identifioituintegriinien alayksiköissä (katso Pasqualini, • · ♦ *·[** et ai. “A peptide isolated from phage display libraries is a structural and functional mimic of an |·* * Arg-Gly-Asp-binding site on integrins.” J. Cell Biol. (1995)130: 1189-1196). Synteettisiä • · * " 25 peptideitä sisältäen Arg-Gly-Asp - motiivin on usein käytetty inhiboimaan integriini-Iigandi • · * · · ] [ vuorovaikutuksia (D’Souza et ai. (1988) Science, 242:91-93). On raportoitu siitä, että synteettiset * · · peptidit sisältäen Arg-Gly-Asp - motiivin kykenevät aktivoimaan kaspaasi-3:n suoraan (Bukley, et *···* ai. (1999) Nature, 397: 534-539). AFP sisältää Arg-Gly-Asp (RGD)-sekvenssin ja se on paikannettu domeiniin II asemaan 253-255. Tämän keksinnön mukaisesti sanottu RGD- sekvenssi • · · ··.: 30 on osa AFP:n toiminnallista keskusta, joka vastaa apoptoosiviestinnästä (apoptoosisignalloinnista).
* * · • * • · * · · : · ; Keksintö kuvaa minimiosan AFP:sta, joka kykenee apoptoosiviestintään. Pienet peptidit tai muut pienet hapteemt ovat tärkeitä säätelijöitä käytettäväksi lääkkeinä, koska niitä voidaan syntetisoida .:. in vitro ja ne eivät tuota neutraloivia vasta-aineita. Peptidit sisältäen 6-10 aminohappotähdettä * · · · • * · • · • * • · · 118263 tuotettiin F-MOC kiinteän faasin kemialla. Samanlaisia peptidejä, jotka olivat homologisia ihmisen seerumin albumiinille (HSA) syntetisoitiin myös. Kaikki peptidit testattiin kasvua säätelevien ominaisuuksiensa suhteen kokonaisilla soluilla sekä peptidien kyvyn suhteen indusoida kaspaasiaktivaatio soluttomilla sytosolisilla uutteilla. Lisäksi peptidit testattiin niiden kyvyn 5 suhteen säädellä AFP:n ja anti-Fas sytotoksisten monoklonaalistcn vasta-aineiden CH-11 vaikutuksia kokonaisilla soluilla ja vaikuttaa sytokromi-c-indusoituun kaspaasiaktivaatioon soluttomissa systeemeissä.
KEKSINNÖN TIIVISTELMÄ 10
Keksintö kuvaa pienten molekyylien rakenteita, jotka molekyylit kykenevät säätelemään apoptoottista solukuolemaa. Tarkemmin sanottuna, kyseiset rakenteet ovat sukua imettäväisten alfa-fetoproteiinin (AFP) ja albumiinin rakenteille. Peptidit, jotka matkivat aktiivista keskusta sisältävät kaksi sekvenssiä, Arg-Gly-Asp ja Asp-X-X-Asp, missä X tarkoittaa mitä tahansa 15 aminohappoa. Nämä sekvenssit tarvitaan samassa molekyylissä aiheuttamaan laaja kirjo biologisia aktiivisuuksia. Peptidejä voidaan käyttää estämään apoptoottisia reaktioteitä inhiboimalla sytokromi-c:n kautta tapahtuvaa kaspaasiaktivaatiota. Täten peptidejä voidaan käyttää inhiboimaan apoptoottisia vaikutuksia, joiden alkuperä on oksidatiivinen stressi, lääkkeet, sytokiinit, Fas-ligandit, AFP, jota käytetään estämään apoptoosia soluviljelmissä, elintensiirrot, immunologiset • · • · · • · · 20 autoimmuunisairaudet ja immunodefisienssisyndrooma, jonka on indusoinut virusinfektio, tai • · · * ·*·.. kemoterapiaja säteilylysterapia.
• * • 0 • · ♦ • «»
KUVIEN SELITYKSET
*** 25
Kujva 1 esittää kaavamaisesti biologisesti aktiivisen dimeerisen peptidin (monomeeria kutsutaan ··· tässä aposykliini-A:ksi; *Cys-Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*).
• · · * • · · * · • · *** Kuva 2 esittää AFP:n indusoiman apoptoosin inhibition multimeerisella syklisellä nonapeptidillä, # · · 1 .· 30 apopsykliini-A (*Cys-Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*). U-937 soluja käsiteltiin 15 minuuttia * · · • · eri annoksilla aposykliini-A:ta ja sen jälkeen 3 μΜ puhtaalla ihmisen AFP:lla lisättynä kuhunkin ··· ·*·« ··* ' • · ♦ ·'.·· ··· S 118263 kaivoon mikrotiitterilevyllä. Solujen lisääntyminen osoitettiin [3H]-tymidiinin inkorporaatiolla 24 tunnin inkuboinnin jälkeen.
Kuva 3 esittää multimeerisen nonapeptidin aposykliinin-A:n (*Cys-Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-5 Asp-Cys*) vaikutuksia apoptoosiin, joka indusoitiin U-937 soluihin sytotoksisilla anti-Fas monoklonaalisilla vasta-aineilla CH-11. Soluja käsiteltiin 15 min 500 μΜ aposykliini-A.lla ja sen jälkeen lisättiin erilaisia annoksia sytotoksisia anti-Fas monoklonaalisia vasta-aineita CH-11 (Immunotech Ltd). Solujen lisääntymistä seurattiin [3H]-tymidiinin inkorporaatiolla 16 tunnin inkubaation jälkeen, to
Kuva 4 esittää lineaarisen 6-meeristen peptidien Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp (RGDVLD) ja His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu (HGDLLE) AFP:lla aikaansaatuun kasvun estoon U-937 soluilla. Solut käsiteltiin 15 min eri annoksilla peptidejä ja sen jälkeen 3 μΜ puhdas ihmisen AFP lisättiin kuhunkin mikrotiitterilevyn kuoppaan. Solujen proliferaatio mitattiin [3H]-tymidiinin 15 inkorporaatiolla 24 tunnin inkuboinnin jälkeen.
Kuva 5 esittää monomeerisen syklisen nonapeptidin *Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys* (*CGRGDVLDC*) vaikutuksia AFP:sta johtuvaan kasvun estoon ihmisen mycloblastomasolulinjalla U-937. Soluja käsiteltiin 15 min ajan erilaisilla annoksilla peptidiä ja 20 sen jälkeen 3 μΜ puhdas ihmisen AFP lisättiin. Solujen lisääntymistä seurattiin [3H]-tymidiinin inkorporaatiolla 24 tunnin inkuboinnin jälkeen.
e#."·'· • · · • · · *.* Kuva 6 näyttää, että syklinen nonapeptidi aposyklin-A (*CCRGDVLDC*) lisää ATP-riipuvaista • * · • · · .* pro-kaspaasin-3 aktivaatiota soluttomissa sytosolisissa uutteissa, jotka on indusoitu alhaisilla • · • ·· * . 25 annoksilla endogeenistä Cyt c:ä. Solu-uutteet U-937-soluista inkuboitiin 40 min erilaisilla ♦ · ....
. . annoksilla aposykliini-A:a ja 1 mM dATP:a. Uutteita ilman lisäyksiä pidettiin kontrolleina.
• · ·
Kaspaasi-3 aktivaatio osoitettiin fluorogeenisen substraatin DEVD-AFC hajoamisena.
* * • · ··* # Kuva 7 osoittaa synergistisen sytokromin-c kautta tapahtuvan kaspaasiaktivaation lisääntymisen ··· *”* 30 soluttomilla systeemeillä ihmisen AFP:lla. (A) AFP indusoi kaspaasi-3:n aktivaation soluttomissa • *···* sytosolisissa uutteissa dATP:n läsnäollessa. Näytteitä HepG2-peräisin olevista sytosolisista ·* · • *.* uutteista (25 pg proteiinia) käsiteltiin eri aikoja AFP:lla (7 μΜ) tai kontrolliksi sama annos HSA.a ·** *...* dATP:n (1 mM) läsnä ollessa ja sitten määritettiin DEVDaasiaktiivisuus. (B) Kaspaasi-3 aktivaation synergistinen lisääntyminen AFP.lla alaoptimaalisen ulkoisen sytokromi c:n läsnä ···♦ • · · • · * · ·*· 6 118263 ollessa HepG2 solujen sytosolisessa uutteessa. Näytteitä HepG2-soluista peräisin olevista sytosolisista uutteista (25 pg proteiinia) käsiteltiin eri aikoja AFP:lla (10 μΜ), sytokromi c:lla (0,2 μΜ) tai samojen annoksien kombinaatioilla kummastakin yhdisteestä dATP:n (1 mM) läsnä ollessa ja sitten mitattiin DEVDaasiaktiivisuus. (C) AFP vaikuttaa eri tavoin kaspaasi-3:n aktivaatioon 5 soluvapailla sytosolisilla uutteilla eri sytokromi-c:n induktioannoksilla. Näytteitä S100 sytosolisista uutteista (25 μg proteiinia) käsiteltiin 30 min AFP:lla (10 μΜ) ja eri annoksilla sytokromi c:ä dATP:n (1 mM) läsnäolllessa ja sitten määritettiin DEVDaasiaktiivisuus. Keskiarvo ± SD neljälle määritykselle on esitetty, 10 Kuva 8 näyttää peptidien aposykliini-A *CCRGDVLDC*, CGRGDVLDC, *CCHGDLLEC*, RGDVLD ja HGDLLE vaikutuksia dATP-riippuvalle Cyt c-indusoidulle kaspaasiaktivaatiolle soluttomilla sytosolisilla uutteilla (HepG2 soluista) korkeilla annoksilla (165 nM) endogeenistä sytokromi c:ä (A) ja alhaisilla annoksilla (110 nM) endogeenistä sytokromi c:ä (B). Peptidejä väkevyytenä 750 μΜ lisättiin 15 min ennen sytokromi c:n lisäystä. Kaspaasien aktivaatiota 15 monitoroitiin kaspaasi-3- spesifisen fluorogeenisen substraatin DEVD-AMC avulla.
Kuva 9 näyttää, että syklinen multimeerinen nonapeptidi aposykliini-A (*CCRGDVLDC*) poistaa sytokromi-c /AFP aikaansaadun kaspaasi-3:n aktivaation soluttomissa systeemeissä. Näytteet
HepG2-peräisistä sytosolisista uutteista esikäsiteltiin 15 min 750 μΜ:5ίη aposykliini -A:a ja sitten 20 käsiteltiin 40 min 10μΜ AFP:lla ja/tai 110 nM (A) tai 80 nM (B) sytokromi c:ä 1 mM dATP:n läsnäollessa. Kaspaasien aktivaatiota monitoroitiin kaspaasi-3-spesifisen fluorogeenisen substraatin . . DEVD-AMC avulla.
• · · • · · • · • * · • · ·
* KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS
• « » · <· 25 • · . . Keksinnön kohde on peptidit ja erityisesti keinotekoiset synteettiset multimeeriset sykliset peptidit, t ·« 1..* jotka kykenevät säätelemään ohjelmoitua solukuolemaa. Tarkemmin sanottuna keksintö koskee • · • * erityisiä aminohapposekvenssejä ihmisen alfa-fetoproteiinimolekyylissä (AFP) tai albumiinissa, . jotka sekvenssit ovat vastuussa kasvainsolujen apoptoosin säätelystä.
··· *::: 30 « « **’ AFP on kasvaimiin liittyvä sikiökauden glykoproteiini, jolla on laaja kirjo biologisia aktiivisuuksia • · # : .* sisältäen solun kasvun säätelyn, kantasolujen erilaistumisen, aktivoitujen immuunisolujen • · · ·...* immunosupression, kasvainspesifisen apoptoosin induktion ja muiden tekijöiden aiheuttamien • ^ ··· apoptoottisten signaalien säätelyn, mitkä tekijät säätelevät geenin ilmennystä. Hiljattain osoitettiin, • · * · • · « • · • · • » · 7 118263 että AFP voi indusoida kasvaimille selektiivisen apoptoosin suoralla tai epäsuoralla kaspaasi-3:n aktivaatiolla kokonaisilla soluilla ja soluttomilla uutteilla (Dudich et ai., (1999 J.Eur.Biochem. 266, 750-761). Sellaisten aktiivisuuksien lähde AFPissa ja albumiinissa löydettiin tässä keksinnössä. Peptidit, jotka muodostavat aktiivisen keskuksen mallinnettiin ja suuri joukko synteettisiä 5 luonnollisia ja ei-luonnollisia peptideitä seulotiin biologisten aktiivisuuksiensa suhteen.
Tämän keksinnön mukaisia peptideitä voidaan käyttää inhiboimaan eri tyyppisiä solukuolemia, jotka riippuvat sytokromi-c -riippuvasta kaspaasikaskadin aktivoitumisesta, esimerkiksi oksidatiivisen stressin, lääkkeiden, sytokiinien, Fas-ligandin ja alfa-fetoproteiinin avulla. Peptideitä 10 voidaan käyttää estämään viljeltyjen solujen kuolemista, lisäämään elinten säilymistä elinsiirroissa, estämään immunologisia autoimmuunisairauksia ja immunodefisienssisyndroomaa, joka johtuu virusinfektiosta, sytotoksisista vaikutuksista kemoterapiassa ja sätcilytysterapiassa. Keksinnössä kuvataan myös peptidisekvenssejä ja menetelmiä tuottaa ja käyttää näitä peptidejä. Kaikkein aktiivisimpia peptidirakenteita ovat ei-luonnolliset synteettiset peptidit, joilla on jäykkä 15 molekulaarinen rakenne kuten on esitetty alla: r~s -'h [ s 5 i
*CjCRGDVLDC1 CjCHGDLLEC C<j:R(H)GDL(V)LE(D)C
*CCRGDVLDC2 jDCHGDLLtjC jXR(H)GDL(V)LE(D)(j 20 Tämän keksinnön perusta oli pyrkimys määrittää AFP-molekyylin aktiivinen keskus, mikä • · · *·’·1 hipaisee kasvainsolujen apoptoosin. Keksinnössä on käytetty teoreettisia ja kokeellisia menetelmiä * 2 1 * · *·2 1 yhdessä. Tehtiin hypoteesi siitä, että aktiivista keskusta matkiva peptide voi suoraan indusoida • · ! 2’ 25 apoptoosin kokonaisilla soluilla ja hipaista kaspaasi-3:n aktivaation soluttomissa systeemeissä tai * ‘ säädellä apoptoottisia signaaleita, jotka ovat peräisin AFP:sta ja/tai muista tekijöistä kuten anti-Fas *. " tai sytokromi-c. Yllättäen synteettinen syklinen peptidi 1Cys-Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys2
Mt (kutsutaan jäljempänä aposykliini-A:ksi), matkien osaa AFP-molekyylistä ja jakaen autenttisen homologian useiden kaspaasien kanssa, ilmeni olevan biologisesti aktiivinen. Sarja vaihdoksia ja 30 niiden yhdistelmiä tehtiin aikomuksella identifioida tärkeät funktionaaliset aminohapot.
* « ·
Syntetisoitiin myös laaja sarja peptidejä, jotka muistuttivat aposykliini-A:a. Kaikki peptidit ·1·2. testattiin suhteessa niiden kykyyn vaikuttaa kasvainsolujen elämään ja vaikuttaa soluvapailla • · .3j uutteilla kaspaasiaktivaatioon. Seuraava vaihe peptidin testauksessa oli tutkia peptidien vaikutus • · · *. apoptoosiin, jota aiheuttivat AFP ja anti-Fas kokonaisilla soluilla ja peptidien kyky säädellä Cyt c - • 1 1 * « 1 » · · 1 2 » 1 • · 3 • · · * 118263 peräistä kaspaasiaktivaatiota soluttomissa uutteissa. Osoitimme, että 9-meerinen peptidi aposykliini-A vastaten AFP:n sekvenssiä 251-259, kokonaan poistaa AFP-keskeisen apoptoosin kasvainsoluista in vitro ja merkittävästi säätelee Cyt-c ja AFP peräistä kaspaasiaktivaatiota soluttomissa uutteissa. Tarkemmin sanottuna, soluttomissa systeemeissä aposykliini-A 5 merkittävästi lisäsi alhaisilla annoksilla sytokromi-c-keskeistä kaspaasiaktivaatiota ja alensi korkeilla annoksilla sytokromi c- indusoimia vaikutuksia.
Lyhyempi 6-meerincn peptidi p25 osittain säilytti tämän aktiivisuuden soluttomilla uutteilla, mutta ei kokonaisilla soluilla. Osoiteltiin myös, että AFP:sta johdetut peptidit osoittivat keskinäistä 10 antagonismia kaspaasiaktivaation säätelyssä Cyt-c- keskeisessä systeemissä solu-uutteilla.
Havaittiin, että nonapeptidi aposykliini-A tehosti kohtuullisesti alhaisen annoksen Cyt-c- keskeistä vaikutusta ja merkittävästi inhiboi kaspaasiaktivaatiota, jonka hipaisee korkeat annokset joko endogeenista tai eksogeenista sytokromi-c:ä. Nämä tulokset osoittavat, että AFP:sta johdettu nonapeptidi aposykliini-A on minimiosa AFP:a, joka on vastuussa tuntemattomien sytosolisten 15 molekyylien spesifisestä sitomisesta, jotka tuntemattomat molekyylit sisältyvät apoptoosisignaaliin. Tämän peptidin tietty rakenne ja sen keinotekoinen luonne viittaavat siihen, että se voi olla aktiivinen komponentti uudessa lääkkeessä, joka estää erilaisten apoptoottisten tekijöiden vaikutuksia in vivo ja in vitro. Tämän peptidin sovellutukset sisältävät apotoosin säätelyn soluviljelmissä, menetelmät estää allogeenisten siirrännäisten immunologisen hylkimisreaktion ja 20 autoimmuunireaktiot, menetelmät välttää maksaan liittyvät septisen shokin ja sytokiinien aiheuttaman apoptoosin jne.
• · • · · *.·.1 Käytettyjen aminohappojen lyhenteet on esitetty alla olevassa taulukossa: • · · • · · a a a • · • · : ·· 25 *·2· Ala__A__Alaniini_ j\· Asp__D__Asparagiinhappo_ I..' Glu E Glutamiini • # -——— -————.......
Arg__R__Arginiini_
Cys__C__Kysteiini . Vai V Väliini • Φ · ---- I - ----------
Leu__L__Lcusiini ;3: Gly__G__Glysiini "1 Xaa X Mikä tahansa aminohappo • · ~ 1--- ~ —1—1 • 1 1 • · • · * · 1 · · *·2 2 • · · • a 3 • a • a 1 5 118263;
Jotta voitaisiin löytää minimiosa AFP molekyylistä, mikä on vastuussa peptidien apoptoosisignaalista, syntetisoitiin 6:sta 10:een aminohappotähdettä sisältäviä peptideitä F-MOC kiinteän faasin kemialla. Samanlaisia peptidejä, jotka olivat homologisia ihmisen seerumin albumiinille (HSA) syntetisoitiin myös. Kaikki peptidit arvioitiin niiden kyvyn perusteella säädellä 5 kasvua kokonaisilla soluilla viljelyssä ja kyvyssä suoraan vaikuttaa kaspaasiaktivaatioon soluttomilla uutteilla. Lisäksi peptidit testattiin niiden kyvyn suhteen säädellä AFP:n ja anti-Fas:in sytotoksisen monoklonaalisen vasta-aineen CH-11 indusoimaa apoptoosia vastaan soluttomilla uutteilla. Keinotekoinen syklinen peptidi *CCRGDVLDC* (tähti viittaa kykyyn muodostaa mahdollinen disulfidisidos) sisältäen Arg-Gly-Asp (RGD) -motiivi ihmisen AFP:n sekvenssin io paikassa 251-259, korvaamalla Cys252 Gly:llä (*CGRGDVLDC*) ja lineaarinen peptidi RGDVLD vastaten tähteitä 253-259 syntetisoitiin F-MOC kiinteän faasin kemialla. Homologiset sykliset peptidisekvenssit ihmisen seerumin albumiinista *CCHGDLLEC*, *CGHGDLLEC* ja lineaarinen peptidi HGDLLE syntetisoitiin myös ja käytettiin toiminnallisina kontrolleina. On huomioitava, että peptidit sisältäen vain sekvenssin RGD eroavat merkittävästi tässä keksinnössä esitetyistä 15 peptideistä.
Multimeerinen syklinen RGD:n sisältävä peptide AFP;sta *CCRGDVLDC* (aposykliini-A) kykenee poistamaan apoptoosin kasvainsoluista in vitro. Osoitettiin, että aposykliini-A poisti täydellisesti AFP:n indusoiman apoptoosin ihmisen myeloblastoma L/937 soluilla ja merkittävästi 20 inhiboi anti-Fas keskeistä solukuolemaa. Lisäksi testattiin AFP:sta johdettujen peptidien aposykliini-A ja 6-meerinen peptidi RGDVLD kykyä vaikuttaa Cyt-c ja AFP:n indusoimaan kaspaasiaktivaatioon soluttomilla systeemeillä. Havaittiin, että aposykliini-A merkittävästi lisäsi • · · *·*.* dATP:sta riippuvaa kaspaasiaktivaatiota, jonka aiheutti alhaiset annokset endogeenista tai * · · '** * eksogeenista Cyt-c:ä ja käytännössä kokonaan estivät korkeiden apoptoottisten Cyt-c annosten • · • · ί ** 25 indusoiman kaspaasiaktivaation. Osoitettiin myös, että aposykliini-A poisti AFP:n indusoiman * * Cyt- c/dATP-riippuvan kaspaasi-3:n aktivaation HepG2 solujen soluttomilla uutteilla. Lineaarinen * · *. *: AFP:sta johdettu 6-meerinen peptidi RGDVLD ei osoittanut apoptoosia sääteleviä vaikutuksia • · · kokonaisilla soluilla mutta kykeni poistamaan Cyt-c/AFP keskeisen kaspaasiaktivaatio soiuttomissa systeemeissä.
··· • 30 • · · ',,,· On hyvin tunnettua, että tavallisesti käytetyt menetelmät saada aikaan vasta-aineita tiettyjä biologisesti aktiivisten proteiinien aktiivisia kohtia vastaan, kuten reseptoreita vastaan, tekevät ko.
• * proteiinit biologisesti inaktiivisiksi. Sellaiset vasta-aineet kehittävät Fab-yksiköilleen rakenteen, • * · *, joka täsmälleen sopii reseptorin aktiiviseen kohtaan. Toisaalta voidaan tehdä anti-idiotyyppisiä • · · • · · · • · · • · * · » · · d 4 118263 vasta-aineita ensin tehdyille Fab-yksiköille. Anti-idiotyyppiset vasta-aineet muistuttavat siksi reseptorin aktiivista kohtaa (avain molekyylien vuorovaikutusten “avain-lukko mallissa”). Keksinnön mukaisesti AFP ja albumiini sisältävät erityisen aktiivisen keskuksen, joka sopii reseptorin aktiiviseen keskukseen ja Hipaisee solukuoleman syklin ja sulkee aktiivisen keskuksen.
5 Siksi tietyllä osalla AFP:a /albumiinia on rakenne, joka sulkee ja Hipaisee aktiivisen keskuksen reseptorissa. Anti-idiotyyppinen vasta-aine AFP:n ja/tai albumiinin aktiiviselle keskukselle sisältää siksi olennaisen rakenteellisen tiedon molekyylistä, joka kykenee sulkemaan solukuolemareseptorin. Sellainen 3-D rakenne voidaan paljastaa käyttäen tavanomaista X-sädekristallografiaa tai molekyylimallitusta sekvenssitiedosta.
10 Tämän keksinnön perustana on se, että apoptoottisesti aktiivinen keskus löydettiin ja paikallistettiin kahdessa tärkeässä ja runsaasti esiintyvässä proteiinissa imettäväisillä, nimittäin AFP ja albumiini. Tähän löytöön perustuen kehitettiin sarja molekyyylirakenteita solukuoleman liipaisemiseksi imettäväisten soluilla. Testatut molekyylit olivat peptidejä johtuen niiden helposta synteesistä, 15 mutta on huomioitava, että myös toisia molekyylejä, perustuen synteettisiin tai luonnon yhdisteisiin, voidaan kehittää. Yhtä hyvin voidaan konstruoida molekyylirakenteita toisten, erityisesti ei-immunogeenisten kantajamolekyylien päälle. Keksintöä kuvataan edelleen seuraavassa ei-rajoittavien esimerkkien avulla.
20 ESIMERKKI 1
Peptidisynteesi :Y: Bioaktiivisia peptidejä kuvataan alla olevin esimerkein. Peptidit muistuttavat sekvenssiä, joka on * · :*·’· saatu ihmisen AFPista ja ihmisen seerumin albumiinista (HSA). Peptidit syntetisoitiin 25 syntetisaattorilla Model 430A (Applied Biosystcms, Foster City, CA, USA) peptidisynteesissä ·;··· käytettyjen yleisten menetelmien mukaisesti. Sykliset peptidit muodostuvat spontaanisti ;\j lineaarisista peptideistä vesiliuoksissa kun ne annetaan alttiiksi ilmakehän hapelle ja puhdistetaan • · HPLC:lla tavoin, jotka tunnetaan peptidien valmistuksen kemiasta.
* * · 30 1. Syklinen multimeerinen nonapeptidi vastaten aminohapposekvenssiä 251-259 ihmisen AFPissa • · · · *Cys-*Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*, *CCRGDVLDC* (tähdet ilmaiset potentiaalisen • · * disulfidisidoksen), jota kutsutaan aposykliini-A:ksi. Toinen kysteiini, Cys252, kykenee • · · • * muodostamaan S-S sidoksen kahden viereisen syklisen monomeeripeptidin kanssa. Syklisen • · *;* monomeeripeptidin molekyylipaino oli 983 Da. Aposykliini-A peptidi muodostuu kahdesta tai • · · * *··· • · · • · • « ··· " 1 1 8263 useammasta (vähemmän kuin 5) rengasmaisesta nonapeptidistä vastaten sekvenssiä 1Cys-1Cys-
Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys1.
j-S·· S—j I S — f· -S
*C|2RGDVLDC1 C :HGDLLEC CC|,R(H)GDL(V)LE(D)C
5 1CCRGDVLDC1 jXEIGDLLE<p <pCR(H)GDL(V)LE(D)C | 2. Syklinen monomeerinen peptidi 1Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys1 (tähdet viittaaavat potentiaalisen disulfidisidoksen paikkaan) vastaten aminohapposekvenssiä 251-259 ihmisen 10 AFP:ssa lisättynä yhdellä Gly:n substituutiolla Cys252:lla, jotta vältettäisiin polymerisaatio monomeerien S-S sidosten muodostumisen kautta. Monomeerisen syklisen nonapeptidin molekyylipaino oli 937 Da.
3. Lineaarinen peptide AFP:n rakenteesta vastaten sekvenssiä 253-259, Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp 15 (253-259). Molekyylipaino monomeeriselle sykliselle peptidille oli 674 Da.
4. Syklinen peptidi HSA:sta (ihmisen seerumin albumiini) 1Cys-Cys-His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu-Cys1, 1CCHGDLLEC1 (molekyylipaino 992).
20 5. Syklinen peptide HSA:sta 1Cys-Gly-His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu-Cys1, CGFIGDLLEC
(molekyylipaino 946). Tässä peptidissä Cys252 on substituoitu Gly:llä.
ί#ί#ί 6. Lineaarinen peptide HSArsta p26: His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu, HGDLLE (molekyylipaino 683).
• · · • · · 25 Reagessit *:2: Fluorogeeninen substraatti DEVD-AMC ja LEHD-AFC olivat Alexis Biochemicalsdta (San Diego, USA). Naudan sydämen sytochromi-c (Cyt c), adenyylinukleotiditrifosfaatti (dATP) ja muut :3: reagenssit saatiin Sigma Chemical Co:lta. Ihmisen AFP eristettiin napaverestä käyttäen ··· ioninvaidinta, affiniteetti ja geelikromatografioita kuten kuvattu aiemmin (Dudich et ai., (1999) ··· 30 Biochemistry, 38: 10406-10414). AFP:n puhtaus osoitettiin PAGE: 11a ja Rocket elektroforeesilla • M· ·3· käyttäen monospesifisiä vasta-aineita ihmisen AFP:a ja aikuisen seerumin proteiineja ja AFP:n • · · osoitettiin olevan vähintään 99,8 %:sti puhdasta.
· • · • · · • » • · ··· • •I « «··1' 1 · » · 2 • · 3 • 1 · 1 1 8263 12
Solu-uutteiden valmistus
HepG2, ihmisen hepatokarsinomasolut ja monoblastomasolulinja U-937 olivat peräisin “American Type Culture Collection”:sta. Solu-uutteet valmistettiin lysoimalla soluja hypotonisessa uutospuskurissa. Sytosolisen S-100-fraktion saamiseksi, solulysaatti sentrifugoitiin 1 h 5 100.000xg:llä. Uutteita käytettiin joko välittömästi tai pakastuksen jälkeen (-70°C).
Soluvapaat reaktiot
Soluttomat reaktiot tehtiin tyypillisesti 13-μ1:η reaktiotilavuudessa. Apotoosi indusoitiin lisäämällä eri annoksia naudan sydämen sytokromi-c:ä/ja/tai puhdasta ihmisen AFP:a sekä 1 mM dATP. 10 Reaktioille 13-μ1:η skaalassa, 10 μΐ solu-uutetta (-2-4 mg/ml, mitattuna Bradfordm menetelmällä), täydennettiin 1 p.l:lla dATP:a, 1 μ!:11a Cyt c:a ja/tai AFP liuosta reaktiopuskurissa, niin että saatiin lopullinen reagenssien väkevyys. Peptidien aktiivisuuden määrittämiseksi, eri annoksia reaktiopuskuriin liuotettuja peptideitä yhdessä 1 mM dATP:n kanssa, lisättiin solu-uutteisiin. Jotta voitiin määrittää peptidin kyky säädellä Cyt c:n ja AFP:n apoptoottista aktiivisuutta, peptidejä 15 lisättiin uutteisiin 10 min ennen Cyt c;ä tai AFP:a. Kontrollinäytteitä inkuboitiin samassa puskurin tilavuudessa (3 μΐ) ilman reagenssien lisäystä. Apotoosin aloittamiseksi, uutteita inkuboitiin 37°C:ssa 40 min.
Kaspaasin aktiivisuuden mittaus 20 Kaspaasiaktivaatioreaktion lopuksi solu-uutenäytteiden (5 μΐ) joukkoon pantiin fluorogeenista substraattia DEVD-AMC (3 mM) ja sitten inkuboitiin tiettyjä aikavälejä (0,5-1 h) 37 °C:ssa. Reaktiot lopetettiin laimentamalla lisäämällä 2,0 ml jääkylmää 0,2 mM natriumfosfaattipuskuria, • 1 · pH 7,5 ja fluoresenssi niitattiin Perkin Elmer MPF-44A (λοχο = 365 nm ja λεΓΤ1 = 440 nm) * 2 · fluorometrilla. Kullekin näytteelle fluoresenssin intensiteetti normalisoitiin ottaen huomioon * 1 2 25 sytosolinen proteiiniväkevyys. Kaspaasiaktivaatio esitettiin suhteena näytteen normalisoidun • · . . fluoresenssi-intensiteetin ja vastaavalla tavoin mitatun kontrollinäytteen välillä.
• ·» • · Φ · · • · * 1 • · ·
Apotoosin induktio 30 U-937 soluja annosteltiin tiheydeksi 4 χ 103 solua/kaivo litteäpohjaisiin 96-kaivon levyille * 2 1 *...2 (Costar) täydellisessä mediumissa ja inkuboitiin 2 h ennen reagcnssilisäystä. Sitten soluja ·1·’: käsiteltiin 24 h erilaisilla annoksilla AFP:a liuotettuna PBS:aan ja mitattiin jakaantuminen. Solujen • · ·3; käsittely sytotoksisella IgM-luokan anti-Fas vasta-aineella CH-11 suoritettiin kuten on edellä • · · kuvattu. U-937 soluja käsiteltiin 50 ng/ml:!Ia CH-11 vasta-aineita 18 h. Solut käsiteltiin tai jätettiin » · · · · · • · 2 • · 3 • · · ι3 1 1 8263 käsittelemättä reagensseilla riittävin aikavälein ja viimeiseksi 4 h:ksi ne asetettiin alttiiksi [3II]-tymidiinille (1 Ci/mmol/kaivo). Kokeelliset tulokset esitettiin prosentuaalisena [3H]-tymidiinin inkorporaationa kolmoiskasvatuksissa ja tulokset oli suhteutettuina mediumikontrolliin. Solut, joihin ei ollut lisätty reagensseja toimivat kontrolleina.
5 '
Peptidiaktiivisuuden määritys _
Peptidien säätelyaktiivisuuden mittaamiseksi erilaisia annoksia peptidejä lisättiin soluihin 24 h:ksi ja sitten solujen lisääntyminen, solujen elinkyky ja DNA-fragmentaatio mitattiin. Muiden 10 tekijöiden vaikutuksia peptidien kykyyn säädellä apoptoosia tutkittiin. Jurkat soluja käsiteltiin 20 ng/ml CH-11 vasta-aineita ilman ActD:a. Raji soluja käsiteltiin CH-11 :lla ja 0,5 ng/ml:lla ActD:a 18 h. Apoptoosin indusoimiseksi TNF-a:lla, soluja (Jurkat, MCF7 tai U-937) käsiteltiin 24 h 25 ng/ml väkevyydellä sytokiinia ja sitten mitattiin solujen lisääntyminen tai elinkyky, kuten kuvattu edellä. HcpG2 soluja esipestiin ennen TNF:n lisäystä tuoreella mediumilla endogeenisten 15 kasvutekijöiden poistamiseksi.
ESIMERKKI 2
Kaspaasi-3- spesifisen, RGD;ä sisältävän, apoptoottisen aktiivisen kohdan identifiointi AFP.lla Funktionaalisesti tärkeiden aminohappojen määrittämiseksi AFP molekyylissä, määritettiin 20 aminohappohomologiaa ihmisen AFP:n ja kaspaasien-3 ja -1 välillä ja konstruoitiin peptidianalogicn rakenteita ehdotetulle aktiiviselle kohdalle. Seuraavia sekvenssejä vertailtiin: casp-2 qnkpkmffiqacrgdetdrgv * * 25 casp-i kdkpkviiiqacrgdspgww • *-··— • · ί ί ; ; i
• *.· casp-3 TGKPKLFIIQACRGTELDCGI
• ***‘: HuAFP VLDVAHVHEHCCRGDVLDCLQDGEKIMSYICSQQDTLSNKITECCKLTTLERGQCIIHAE 299 : 30 : : . : : . : : : *. " HSA VTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVE 294 • · * • · • · • · · , Vertailusta nähdään, että AFP:lla on tietty homologia entsyymin aktiivisten kohtien kanssa • · · 1 2 t* 35 kaspaaseilla 1 ja 3. Entsymaattisesti aktiivisten kaspaasien 1 ja 2 kohdat sisältävät RGD motiivin, • m * · 2 mikä lokalisoituu ennen katalyyttisesti aktiivista Cys tähdettä. Efektorikaspaasit 3 ja 7 omaavat • · · ; tällä paikalla RGT motiivin, mutta Cys tähteiden kohdat täsmäävät AFP molekyylissä ja • · · kaspaaseissa 3 ja 7. Ottaen huomioon, että AFP:lla on ketjun sisäinen disulfidisidos Cys2j2 ja « ··· Cys259 välillä (Morinaga, et. ai,, (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:4604-4608), teimme • · · · • · · • · * · • · · 14 1 1 8263 hypoteesin, että kaspaasin kaltainen aktiivinen keskus on AFP molekyylissä jossain tähteiden Cys25i-Cys259 välillä. On huomattava, että kaspaaseilla-3, -7, ja -8 on myös RGD motiivi, mutta ne ovat lokalisoituneet muualle kuin katalyyttisesti aktiiviseen asemaan (Bukley, et ai. (1999) Nature, 397: 534-539). Vapaat kysteiinit Cys25« peptidirakenteessa ilmeisesti voivat muodostaa ketjun 5 sisäisiä disulfidisidoksia viereisten peptidien välillä (Kuva l). Funktionaalisesti tärkeiden aminohappojen esiintymisen osoittamiseksi silmukassa Cys25i-Cys259 AFP-molekyylissä, konstruoimme peptidianalogien rakenteita ehdotetulle aktiiviselle kohdalle. Kontrolliksi valmistettiin analogisia peptideitä myös HSA:sta.
10 ESIMERKKI 3
Syklinen peptidi aposykliini A poistaa AFP:n indusoiman apoptoosin U-937 soluilla Ennen julkaistut tulokset osoittavat, että AFP useista eri lähteistä (sikiöstä tai hepatomasolulinjasta HepG2) voi indusoida annoksesta riippuvan kasvun eston ja ohjelmoidun solukuoleman eri lailla kasvainsolulinjoilla. Niitä karakterisoi klassisen apoptoosin piirteet, kuten merkittävä kasvun 15 heikentyminen, sytotoksisuus ja DNA:n fragmentoituminen (Dudich et ai., (1998) Tumor 5/o/.19:30-40). AFP;n aktiivisen keskuksen paikallistamiseksi, joka keskus on vastuussa apoptoosin signaloinnista, testattiin erilaisten AFP:sta johdettujen peptidien kykyä estää tätä vaikutusta. Kuva 2 osoittaa, että AFP:sta johdettu peptide aposykliini-A täydellisesti estää AFP:n indusoiman U-937 solujen apoptoosin. Lisäksi aposykliini-A:lla (1 mM) 15 min esikäsitellyt U-937 20 soluihin indusoitui 15 % solukasvun lisäys suhteessa mediumikontrolliin. Tämä tarkoittaa sitä, että aposykliini-A poistaa myös spontaania solujen apoptoosia 24 tunnin kasvatuksen aikana.
:Y: ESIMERKKI 4 • « • ♦· : : : Aposykliinin-A inhiboi merkittävästi anti-Fas-indusoitua apoptoosia U-937 solidin]alla t 1 2.» 25 AFP-spesifisyyden testaamiseksi, tutkittiin jos aposykliini-A voi vaikuttaa apoptoosiin, joka johtuu *:··: eräistä muista tekijöistä. Apoptoosi indusoitiin U-937 soluihin eri annoksilla sytotoksista IgM anti- ;Yi Fas monoklonaalista vasta-ainetta CH-11. Kuva 3 osoittaa, että 0,5 mM aposykliini-A inhiboi merkittävästi anti-Fas-keskeistä apoptoosia poistamalla noin 50% kokonaisvaikutuksesta.
• ·
Aposykliini-A:n väkevyyden lisäys 1 mM:ksi saakka indusoi merkittävämmän anti-Fas apoptoosin ··· 30 vaikutuksen. On tunnettua, että solun sisäiset reaktiotiet liittyen eri apoptoosin tyyppeihin ovat ;3: yhteisiä useimmille apoptoottisille tekijöille. Tuloksemme viittaavat siihen, että aposykliini-A
vastavaikuttaa AFP- ja Fas-riippuviin apoptoosin signallointiteihin vuorovaikutuksella tiettyjen • · yhteisten reseptorien kautta.
• 1 • · · · · 2 • 1 · · 3 * · ·1· 15 ESIMERKKI 5 1 1 8263
Funktionaalisesti tärkeiden aminohappojen määrittäminen AFP:n aktiivisessa keskuksessa a) AFP-johdetut peptidit
Syklinen peptidi 1CGRGDVLDC1 Cys252:n substituutiolla Gly:llä ja 6-meerinen peptide 5 RGDVLD valmistettiin funktionaalisesti tärkeiden aminohappojen apoptoottisesti tärkeiden aminohappojen määrittämiseksi. Kuva 4 osoittaa 1CGRGDVLDC1 ;n vaikutuksen U-937 soluilla AFP-keskeiseen apoptoosiin. Tämä peptidi ei kyennyt poistamaan AFP:n sytotoksisuutta. Samanlaiset tulokset saatiin peptidillä RGDVLD (Kuva 4). Tämä data viittaa siihen, että Cys252 on funktionaalisesti tärkeä aminohappoja sen substituutio Gly:llä täydellisesti poistaa peptidin kyvyn 10 vuorovaikuttaa koko AFP:n apoptoottiseen aktiivisuuteen. Lyhyempi peptidi, RGDVLD, oli myös kykenemätön säätelemään AFP-keskeistä apoptoosia osoittaen syklisen rakenteen välttämättömyyden apoptoottisen aktiivisen keskuksen muodostumiselle.
b) HSA-johdetutpeptidit 15 Albumiinin tunnetaan jakavan AFP:n kanssa autenttisen homologian (Morinaga , et ai., Proc. Natl Acad. Sei.USA, 80:4604-4608). Havaittiin myös homologia aposykliini-A:a matkivan ehdotetun AFP:n aktiivisen alueen kanssa. Valmistettiin seuraavat peptidit HSA sekvenssistä: sykliset peptidit *CCHGDLLEC1, 1CGHGDLLEC1 (sekä rakenne, missä Cys oli muutettu Gly:ksi) ja lineaarinen 6-meerinen peptidi HGDLLE. Testasimme näiden peptidien kykyä vaikuttaa AFP:n indusoimaan 20 apoptoosiin kokonaisilla soluilla, kuten on kuvattu yllä (Taulukko 1). Kuva 5 osoittaa, että *CCHGDLLEC1 :11a on samanlainen aktiivisuus poistaa AFP-keskeinen apoptoottinen aktiivisuus U-937 soluilla. HGDLLE ja 1CGHGDLLEC1 eivät vaikuttaneet solujen vasteeseen AFP:lle.
• · • 1 1 • · · • 1
Taulukko 1. AFP- ja HSA-johdettujen peptidien vaikutukset solujen kasvuun ja AFP:n .1 25 indusoimaan apoptoosiin U-937 soluilla.__ • 1·· Alkuperä Sekvenssi 'Vaikutus Kyky vaikuttaa AFP:n solukasvuun (% indusoimaan apoptoosiin . . -___ kontrollista) _ ·,1·1 AFP 1CCRGDVLDC1 +12 Täydellinen (aposykliini.A) _____________ ' AFP_ CGRGDVLDC -12___Ei vaikutusta_ AFP_ RGDVLD +10__Ei vaikutusta HSA__1CCHGDLLEC1 +18_ täydellinen_ ‘"I 1 HSA | HGDLLE +20 Ei vaikutusta * syklinen peptidi suora peptidien vaikutus annoksena 1 mM U-937 soluilla solujen lisääntymiseen verrattuna l ,1 kontrolliin ilman lisäyksiä.
• · · • · • 1 • · · \ 30 ··· 1 1 1 ··· • 1 ESIMERKKI 6 118263
Aposykliinin-A vahvistaa kaspaasiaklivaatiota alaoptimaalisilla endogeenisen sytokromi-c:n annoksilla
Jotta voitaisi määrittää, jos aposykliini-A toimii samalla tavoin kuin koko AFP-molekyyli S vahvistaen kaspaasiaktivaatiota soluttomilla systeemeillä, valmistettiin samanlainen systeemi, joka c on kuvattu edellä, mutta AFP:n sijasta käytettiin syklistä aposykliini-A:a. Kuva 8 osoittaa, että aposykliini-A lisää synergistisesti totaalista kaspaasi-3 aktiivisuutta soluttomissa systeemeissä alhaisten alaoptimaalisten endogeenisten sytokromi-c:n väkevyyksien ja dATP:n läsnä ollessa.
Ilman dATP:n lisäystä aposykliini-A oli kykenemätön indusoimaan DEVD-aasiaktiivisuutta 10 samanlaisissa kokeellisissa olosuhteissa. Sama vaikutus havaittiin kokonaisella AFP:lla ’’hiljaisilla” soluvapailla uutteilla. Tämä data osoittaa, että pystyimme paikantamaan AFP:n ja albumiinin aktiiviset keskukset, jotka ovat vastuussa niiden apoptoosia edistävästä aktiivisuudesta.
ESIMERKKI 7 15 AF vahvistaa kaspaasi-i-aktivaatiota alaoptimaalisilla annoksilla sytokromi-c:ä ja dATP. a
Olemme testanneet edelleen AFP:n kykyä indusoida kaspaasiaktiivisuutta soluttomilla uutteilla.
AFP:n lisäys S100 sytosolisiin uutteisiin Hipaisi dATP-riippuvan kaspaasi-3-spesifisen DEVDaasiaktiivisuuden, joka nousi lisääntyen ainakin 2 tuntia (Kuva 7 A). Kontrolliksi lisättiin ekvivalenttinen määrä ihmisen seerumin albumiinia samaan soluvapaaseen uutteeseen ja 20 osoittautui, että ei esiintynyt DEVDaasiaktiivisuutta. Alhainen DEVDaasiaktiivisuuden tason aiheutti myös dATP yksinään ja se oli ilmeisesti syytä pienestä endogeenisen sytokromi-c:n määrästä preparaateissa. Kun dATP:a ei ollut läsnä, AFP ei indusoinut kaspaasiaktiivisuutta . , lainkaan. Jotta saataisiin määritetyksi, jos AFP voi suoraan indusoida kaspaasiaktivaation • · · sytosolisissa uutteissa, tai jos se vaatii sytokromi-c:n perustason läsnäolon, tutkimme DEVDaasin • 1 1 25 pilkkoutumisaktiivisuutta ulkoisen sytokromi-c:n lisäyksen jälkeen “hiljennettyihin” sytosolisiin • 1 * # uutteisiin, missä ei voitu osoittaa endogeenista sytokromi-c:ä. Kuva 7B osoittaa että, * DEVDaasiaktiivisuutta ei voitu mitata tämän tyyppisissä sytosolisissa lysaateissa jopa kahden * 1 1 *· ]· tunnin käsittelyn jälkeen dATP:n läsnä ollessa ja alhaisen suboptimaalisen sytokromi-c:n kanssa.
• · *** Kuitenkin AFP:n lisäys (7 μΜ) samaan reaktiosysteemiin Hipaisi enenevästi nousevan 30 kaspaasiaktivaatioprosessin ajasta riippuvalla tavalla (Kuva 7B). : • · · ···· • · · 1 • · *···· * · · • · · • · • · • · · • « • · ··· · · *··· • · • · • · · ESIMERKKI 8 118263
Soluttomassa systeemissä aposykliini-A :n aiheuttama sylokromi-c/AFP-vaikulleinen kaspaasiaktivaation poisto
Kuva 8 osoittaa, että aposykliini-A:n vaikutukset kaspaasi-3:n aktivaatioon johtuvat eri annoksista 5 sytokromi-c:ä ja AFP:a. Korkeat annokset peptidiä (750 μΜ) merkittävästi (50-70%) inhiboivat kaspaasiaktivaatiota, mitä indusoi korkeat annokset sytokromi-c:ä (Kuva 8A). Yhdistetty käsittely sytosolisessa fraktiossa sytokromi- c/AFP:a aiheutti merkittävän lisäyksen kokonais-DEVDaasiaktiivisuudessa (Kuva 8, A ja B). Aposykliini-A:n lisäys inhiboi sytokromi-c/AFP-keskeistä kaspaasiaktivaatiota 60-80%: 11a. Tämä osoittaa, että aposykliini-A toimii soluttomassa 10 uutteessa kokonaiselle AFP:lle vastaisella tavalla poistamalla kokonaiskaspaasiaktivaation vaikutuksen, minkä on indusoinut sytokromi-c yksin tai yhdessä AFP:n kanssa. Siksi aposykliini-A edustaa sitä sekvenssiä AFP-molekyylissä, joka vastaa sen apoptoottisesta aktiivisuudesta ja vuorovaikutuksista apoptosomikompleksissa.
15 ESIMERKKI 9 AFP-johdettujent ja HAS-johdelujen peptidien dATP-riipuvainen sytokromi-c-keskeinen kaspaasiaktivaatio soluttomilla uutteilla
Jotta voitiin testata erilaisten peptidien kykyä vaikuttaa eksogeenisen sytokromi-c:n kaspaasiaktivaatioon soluttomassa uutteessa, käytettiin soluttomia uutteita HepG2 soluista.
20 Näytteitä solu-uutteista esikäsiteltiin 750 μΜ peptideillä 15 min ja tämän jälkeen eri annoksia sytokromi-c:ä lisättiin reaktioseokseen kaspaasiaktivaation indusoimiseksi. KontrolMuutteita inkuboitiin dATP:n kanssa ilman peptidejä ja sytokromi-c:ä mutta ne eivät osoittaneet mitään m·'· kaspaasiaktiivisuutta. Kuva 9 näyttää, että AFP:sta johdetut peptidit, nonapeptidi aposyklin-A ja 6- i » · meerinen peptide RGDVLD yhtä hyvin kuin 6-meerinen peptide HSA:sta, FIGDLLE indusoi * · · ,'.m 25 merkittävän inhibition korkean sytokromi-c-annoksen kaspaasiaktivaatiossa. Toisaalta syklinen • · · nonameerinen peptide yksittäisellä aminohapposubstituutiolla 1CGRGDVLDC1, yhtä hyvin kuin * · . . syklinen multimeerinen peptidi HSA:sta, 1CCHGDLLEC1, eivät osoittaneet mitään inhibitorista * · · • · 1 !..1 aktiivisuutta apoptoosille kokonaisilla soluilla eikä soluttomissa systeemeissä. Täten kaikkein • · • · ·" voimakkain peptide aposykliini-A matkii AFP:n aktiivista keskusta, mikä vastaa apoptoosin , 30 signaloinnista. Täysin erilaisia vaikutuksia saatiin alhaisilla annoksilla sytokromi-c:n indusoimassa
Ml *“1 kaspaasiaktivaatiossa. Kuva 9B osoittaa, että aposyklini-A tuotti saman vaikutuksen kuin täyspitkä • « • « "1 AFP molekyyli alhaisen sytokromi-c:n indusoimassa kaspaasiaktivaatiossa. Peptideillä • · · • 1.· 1CGRGDVLDC1 ja 1CCHGDLLEC1 ei ollut mitään vaikutusta alhaisen annoksen sytokromi-c • · · • · * · 1 • 1 · • · · ·1·· ··· • · · · 118263 aktiivisuudella, mutta peptidit RGDVLD ja HGDLLE osoittivat merkittävän vähenemisen sytokromi-c:n indusoimassa kaspaasiaktivaatiossa.
Taulukko 2 kokoaa yhteen kokeelliset tulokset, mitkä luonnehtivat peptidien aktiivisuutta soluttomilla uutteilla.
5
Taulukko 2. Sytokromi-c-riippuvaisen DEVDaasi aktiivisuuden säätely erilaisilla peptideillä soluttomissa systeemeissä.
Sekvenssi Korkean annoksen Kyky vaikuttaa AFP- Vaikutus alhaisen Cyt c-
Cyt c-indusoima indusoituun Cyt c- annoksen indusoimaan kaspaasiaktivaatio riippuvaan kaspaasiaktiivisuuteen _ ___kaspaasiaktivaatioon__ *CCRGDVLDC* 50-80% 70-80% väheneminen 30% lisäys __väheneminen___ CGRGDVLDC Ei vaikutusta__Ei vaikutusta__Ei vaikutusta _ RGDVLD__80% väheneminen Ei vaikutusta__30-50% väheneminen_ *CCHGDLLEC* Ei vaikutusta__Ei vaikutusta__Ei vaikutusta_ HGDLLE__90% väheneminen Ei vaikutusta__70% väheneminen_ kokonainen AFP 80% väheneminen__-__50% lisäys _ * syklisset peptidit l° 15 • · • · · • « » • · • · · ··· • · · ·· • * 20 • · • ♦ e • · · • · ··· · » · ·«« ··· • · · · ··· ·' *! 25 • · · • · · • · • · · • · • · ...
··· ,~ 1 » * · » • · · • · • · • · · 19 118263
KIRJALLISUUS
• Aussel et ai., “Interaction of retinoids and bilirubin with the binding of arachidonic acid to 5 human alpha-fetoprotein.” Biochemical and Biophysycal Research Communications, 119: 1122-1127(1994).
• Bennett et al., “Similarity between natural and recombinant human alpha-fetoprotein as inhibitors of estrogen-dependent breast cancer growth.” Breast Cancer Research and Treatment, 45: 169-179(1997).
10 · Bennet et al., “α-Fetoprotein derived from a human hepatoma prevents growth of estrogen- dependent human breast cancer xenografts.” Clinical Cancer Research, 4: 2877-2884 (1998).
• Chen et al. “Regulation and activities of alpha-fetoprotein.” Critical Reviewes of Eukaryotic Gene Expression, 7: 11-41(1997).
15 · Deutsch, “Chemistry and biology of α-fetoprotein.” Advances of Cancer Research, 56:253- 312(1991).
• Dudich et al. “Growth-regulative activity of alpha-fetoprotein for different types of tumor and normal cells.” Tumor Biology, 19:30-40 (1998).
• Dudich et al., “α-Fetoprotein causes apoptosis in tumor cells via a pathway independent of 20 CD95, TNFR1 and TNFR2 through activation of caspase-3-like proteases.” European : : Journal Biochemistry 266: 1-13 (1999).
• · : *·· · Dudich et al., “Isolation and structural and functional characterization of two stable peptic fragments of human alpha-fetoprotein.” Biochemistry, 38: 10406-10414 (1999).
• · • · · '· '· · Festin et al., “The recombinant third domain of human alpha-fetoprotein retains the * · *·*·* 25 antiestrotrophic activity found in the full-length molecule.” Biochimica et Biophysica Acta , ,.. 1427:307-314(1999).
• · • ·· .··*. · Jacobson et al., “Inhibition of estrogen-dependent breast cancer growth by a reaction • · * · · . *. product of α-fetoprotein and estradiol.” Cancer Research, 50: 415-420 (1999).
• · · • · · .···, · Liu et al. “Induction of apoptotic program in cell-free extracts: Requirement for dATP and • 9 30 cytochrom c.” Cell, 86: 147-157 (1996).
• · • · .1*^ · Mesfin et al., “Alpha-fetoprotein-derived antiestrotrophic octapaptide.” Biochimica et • 9
Biophysica Acta, 1501:33-43 (2000).
20 118263 • Mizejewski, “α-Fetoprotein as a biologic response modifier: Relevance to domain and subdomain structure.”Proceedings of Society for Experimental Biology and Medicine, 215: 333-362(1997).
5 · Mizejewsky, et al., “Alpha-fetoprotein derived synthetic peptides: assay of an estrogen modifying regulatory segment.” Molecular and Cellular Endocrinology, 118: 15-23 (1996).
• Mizejewski, “An apparent dimerization motif in the third domain of alpha-fetoprotein: molecular mimicry of the steroid/thyroid nuclear receptor superfamily.” BioEssays, 15:427-432(1993).
10 · Morinaga , et al., “Primary structures of human alpha-fetoprotein and its mRNA” Proc.
Natl. Acad. Sci.USA, 80:4604-4608 (Aug. 1983).
• Nishi et.al. “Localization of the estrogen binding site of alpha-fetoprotein in the chimeric human-rat proteins.” Proceedings of the Natlional Academy of Scieces of the Uniteds States of America, 88: 3102-3105 (1991).
15 · Nishi et al., “Purification of human, dog and rabbit α-fetoprotein by immunoadsorbents of sepharose coupled with anti-human α-fetoprotein.” Biochimica et Biophysicaa Acta, 278: 293-298 (1972).
• Pan et. al., “Activation of caspases triggered by cytochrom c in vitro.” FEBS Letters, 426:151-154(1998).
: V: 20 · Semenkova et al., “Induction of apoptosis in human hepatoma cells by alpha-fetoprotein.” ! : : Tumor Biology, 18: 261-274 (1997).
• · : ** · Semeniuk et al, “Evidence that immunosuppression is an intrinsic property of the alpha- ’ * fetoprotein molecule.” Advances of Experimental Medicine and Biology, 383: 255-269 • · (1995).
* · · • · **’ 25 · Slee et al., “Ordering the cytochrom c-initiated caspase cascade: hierarchical activiation of .. caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-3-dependent manner.” Journal of Cell
Biology, 144: 281-292(1999).
• · * * * ' . · Sonnenschein et al., “Inhibition of growth of transplantable rat mammary tumors. Probable • · · *!!/ role of α-fetoprotein.” Journal of the National Cancer Institute, 64:1141-1146 • · * · · 30 · Soto et al., “Control of growth of estrogen-sensitive cells: Role for a-fetoprotein.”
Proceedings of the National Academy of Scieces of the Uniteds States of America, 77: : ’* 2084-2087(1980).
21 118263 • Yamashita et al. “Evidence that alpha-fetoprotein suppress the immunological function in transgenic mice.” Biochemical and Biophysical Research Communications, 201:1154-1159 (1994).
5 · Wang et al.? “Downregulation of phorbol 12-myristate 13-acetate-induced tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1 beta production and gene expression in human monocytic cells by human alpha-fetoprotein.” Hepatology, 22:921-928 (1995).
• · • · · * · · * * • » · * ♦ · • « · ·· ♦ · ···'.· • · • * • * * * ·♦ • · • ·· ♦ ···.·' • · • · · .
• · « · ♦ «· * • · · ♦ · • » ··· • « • « · • · · ···· ·*· • · • * ♦ ' • · • « »*· 1 · • · · • • *
Claims (4)
1. En cyklisk eller linear peptidstruktur, som kan avhälla den reglerade celldöden kännetecknatavatt den har den allmänna formeln CCRGDVLDXY, i vilken formeln X är en hydrofobisk aminosyra och Y är en hydrofil aminosyra. • # * · · 1 . *.1.1
2. En peptidkedja engligt patentkrav 1, i vilken formel X är aminosyror V, L eller * · · · · *. 1 W och Y är aminosyror D, E, eller G. • · ϊ 2
3. En lineär, polymeriserad eller cyklisk struktur av peptid C1C1RGDVLDC1, i * ’ vilken struktur den märkta aminosyran anmäler den möjliga platsen för en * 1 f · · '1 1! disulfidbindning. * · 1 • 1 *···1
4. Användningen av peptider engligt patentkraven 1-3 för vetenskapliga och tekniska avsikter för att hindra celldöden i kultiverade celler. ·· * · • ·· • · · • ♦ • · • · » • · * · · *·· ♦ ·· · • · ♦ • · • 1 • · · · . · • · · · · • · <?·. · 2
Priority Applications (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20021798A FI118263B (fi) | 2002-10-09 | 2002-10-09 | Kaspaasiaktiivisuutta säätelevät peptidit |
| US10/530,779 US7446095B2 (en) | 2002-10-09 | 2003-10-07 | Peptides modulating caspase activation |
| PCT/FI2003/000735 WO2004033500A1 (en) | 2002-10-09 | 2003-10-07 | Peptides modulating caspase activation |
| JP2004542524A JP4446121B2 (ja) | 2002-10-09 | 2003-10-07 | カスパーゼ活性化調節ペプチド |
| AT03753618T ATE470677T1 (de) | 2002-10-09 | 2003-10-07 | Peptid zur modulation der caspase-aktivierung |
| PT03753618T PT1558649E (pt) | 2002-10-09 | 2003-10-07 | Péptidos que modulam a activação de caspases |
| EP03753618A EP1558649B1 (en) | 2002-10-09 | 2003-10-07 | Peptid modulating caspase activation |
| DK03753618.2T DK1558649T3 (da) | 2002-10-09 | 2003-10-07 | Peptid til modulering af caspaseaktivering |
| AU2003271784A AU2003271784A1 (en) | 2002-10-09 | 2003-10-07 | Peptides modulating caspase activation |
| DE60332950T DE60332950D1 (de) | 2002-10-09 | 2003-10-07 | Peptid zur modulation der caspase-aktivierung |
| ES03753618T ES2347234T3 (es) | 2002-10-09 | 2003-10-07 | Peptido modulador de la activacion de caspasa. |
| EA200500606A EA010058B1 (ru) | 2002-10-09 | 2003-10-07 | Пептиды, модулирующие активацию каспазы |
| CNB2003801011658A CN100551930C (zh) | 2002-10-09 | 2003-10-07 | 调节caspase活化的肽 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20021798A FI118263B (fi) | 2002-10-09 | 2002-10-09 | Kaspaasiaktiivisuutta säätelevät peptidit |
| FI20021798 | 2002-10-09 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI20021798A0 FI20021798A0 (fi) | 2002-10-09 |
| FI20021798A FI20021798A (fi) | 2004-04-10 |
| FI118263B true FI118263B (fi) | 2007-09-14 |
Family
ID=8564726
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI20021798A FI118263B (fi) | 2002-10-09 | 2002-10-09 | Kaspaasiaktiivisuutta säätelevät peptidit |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7446095B2 (fi) |
| EP (1) | EP1558649B1 (fi) |
| JP (1) | JP4446121B2 (fi) |
| CN (1) | CN100551930C (fi) |
| AT (1) | ATE470677T1 (fi) |
| AU (1) | AU2003271784A1 (fi) |
| DE (1) | DE60332950D1 (fi) |
| DK (1) | DK1558649T3 (fi) |
| EA (1) | EA010058B1 (fi) |
| ES (1) | ES2347234T3 (fi) |
| FI (1) | FI118263B (fi) |
| PT (1) | PT1558649E (fi) |
| WO (1) | WO2004033500A1 (fi) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102481369A (zh) * | 2009-06-16 | 2012-05-30 | 东海大学 | 抗革兰氏阴性菌剂 |
| CN101812448B (zh) * | 2010-01-15 | 2011-12-07 | 浙江大学 | 一种肝癌靶向双重组凋亡蛋白表达序列及应用 |
| CN102060913B (zh) * | 2010-11-30 | 2012-09-05 | 暨南大学 | 一种与人血清白蛋白结合的七肽与应用 |
| JP6493692B2 (ja) | 2013-03-15 | 2019-04-10 | セルジーン コーポレイション | 修飾されたｔリンパ球 |
| CN108186666B (zh) * | 2018-01-29 | 2020-02-21 | 西北大学 | 一种dna纳米带在抗细胞凋亡上的应用及其制备方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1226551B (it) * | 1988-07-29 | 1991-01-24 | Sclavo Spa | Peptide sintetico immunologicamente attivo capace di indurre la produzione di anticorpi con elevata specificita' verso l'alfa- fetoproteina e loro impiego in campo diagnostico |
| JPH10513347A (ja) * | 1995-01-24 | 1998-12-22 | ロバート エイ． マルギタ | 組換え型ヒトα−フェトプロテインおよびその利用 |
| AU6887096A (en) * | 1996-09-11 | 1998-04-02 | Patrick T. Prendergast | Immune direction therapy |
| WO1998035981A1 (en) * | 1997-02-13 | 1998-08-20 | The Regents Of The University Of California | Prevention and treatment of hepatocellular cancer |
| AU7104500A (en) * | 1999-09-02 | 2001-03-26 | Atlantic Biopharmaceuticals, Inc. | Use of rafp to inhibit or prevent apoptosis |
| WO2003007978A1 (en) * | 2001-06-02 | 2003-01-30 | Clf Medical Technology Acceleration Program, Inc. | Alpha-fetoprotein peptides and uses thereof |
-
2002
- 2002-10-09 FI FI20021798A patent/FI118263B/fi active IP Right Grant
-
2003
- 2003-10-07 WO PCT/FI2003/000735 patent/WO2004033500A1/en active Application Filing
- 2003-10-07 AU AU2003271784A patent/AU2003271784A1/en not_active Abandoned
- 2003-10-07 AT AT03753618T patent/ATE470677T1/de active
- 2003-10-07 DK DK03753618.2T patent/DK1558649T3/da active
- 2003-10-07 EA EA200500606A patent/EA010058B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-10-07 DE DE60332950T patent/DE60332950D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-07 PT PT03753618T patent/PT1558649E/pt unknown
- 2003-10-07 ES ES03753618T patent/ES2347234T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-07 JP JP2004542524A patent/JP4446121B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-10-07 US US10/530,779 patent/US7446095B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-10-07 CN CNB2003801011658A patent/CN100551930C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-10-07 EP EP03753618A patent/EP1558649B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1558649B1 (en) | 2010-06-09 |
| EA200500606A1 (ru) | 2006-06-30 |
| US7446095B2 (en) | 2008-11-04 |
| DK1558649T3 (da) | 2010-10-11 |
| US20060280732A1 (en) | 2006-12-14 |
| FI20021798A0 (fi) | 2002-10-09 |
| EA010058B1 (ru) | 2008-06-30 |
| ES2347234T3 (es) | 2010-10-27 |
| FI20021798A (fi) | 2004-04-10 |
| CN1703428A (zh) | 2005-11-30 |
| EP1558649A1 (en) | 2005-08-03 |
| AU2003271784A1 (en) | 2004-05-04 |
| JP4446121B2 (ja) | 2010-04-07 |
| WO2004033500A1 (en) | 2004-04-22 |
| DE60332950D1 (de) | 2010-07-22 |
| CN100551930C (zh) | 2009-10-21 |
| ATE470677T1 (de) | 2010-06-15 |
| JP2006518703A (ja) | 2006-08-17 |
| PT1558649E (pt) | 2010-09-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2020294337C1 (en) | Inhibition of cytokine-induced SH2 protein in NK cells | |
| Anderson et al. | A monoclonal antibody reactive with a 15-kDa cytoplasmic granule-associated protein defines a subpopulation of CD8+ T lymphocytes. | |
| KR101826460B1 (ko) | 위장암 및 위암을 비롯한 여러가지 종양에 대한 신규한 면역 요법 | |
| Lowin et al. | Comparison of Fas (Apo-1/CD95)-and perforin-mediated cytotoxicity in primary T lymphocytes | |
| Slawin et al. | Dietary fenretinide, a synthetic retinoid, decreases the tumor incidence and the tumor mass of ras+ myc-induced carcinomas in the mouse prostate reconstitution model system | |
| CA2436281A1 (en) | Chimeric molecules containing a module able to target specific cells and a module regulating the apoptogenic function of the permeability transition pore complex (ptpc) | |
| JPWO2009025117A1 (ja) | Ｃｄｃａ１ペプチド及びこれを含む薬剤 | |
| Hameed et al. | Immunohistochemical identification of cytotoxic lymphocytes using human perforin monoclonal antibody. | |
| US7119071B2 (en) | Amino terminal substance P compositions and methods for using the same | |
| US20090118197A1 (en) | Immune-Modulating Peptide | |
| FI118263B (fi) | Kaspaasiaktiivisuutta säätelevät peptidit | |
| Sharova | Immune proteasomes and immunity | |
| JP2009261412A (ja) | 白血球活性化ペプチド | |
| KR102017973B1 (ko) | 항-b형 간염 바이러스 x 단백질 폴리펩티드 약제 | |
| Assa-Kunik et al. | Alterations in the expression of MHC class I glycoproteins by B16BL6 melanoma cells modulate insulin receptor-regulated signal transduction and augments resistance to apoptosis | |
| KR20010043088A (ko) | 신규인 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코드화하는 ｃＤＮＡ및 그 용도 | |
| US20100215583A1 (en) | Cell nucleus-entering compositions | |
| Wankowicz-Kalinska et al. | Accumulation of low-avidity anti-melanocortin receptor 1 (anti-MC1R) CD8+ T cells in the lesional skin of a patient with melanoma-related depigmentation | |
| Meng et al. | Identification of an HLA-DPB1* 0501 restricted Melan-A/MART-1 epitope recognized by CD4+ T lymphocytes: prevalence for immunotherapy in Asian populations | |
| WO2022171032A1 (zh) | Ras G13D突变体表位肽及识别Ras G13D突变体的T细胞受体 | |
| JP2006516899A6 (ja) | 白血球活性化ペプチド | |
| KobayashiSJ et al. | The Pmel17/Silver locus protein | |
| KR20110123491A (ko) | 프로테아좀 저해제 및 쥐알파12/쥐알파13 단백질 기능의 하향 조절제를 포함하는 의약 조성물 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 118263 Country of ref document: FI |