JP2006518703A - カスパーゼ活性化調節ペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
AFPは細胞増殖制御、未熟細胞の分化、活性化免疫細胞の免疫抑制、腫瘍特異的アポトーシス誘導、および他の因子によるアポトーシスシグナルの制御、および、種々の遺伝子発現の制御を含む広範な生物学的活性を示す腫瘍関連胎児性糖タンパク質である。近年、AFPが全細胞系および無細胞系においてカスパーゼ-3の直接または間接的活性化を介して腫瘍選択的アポトーシスを誘導することが示された(Dudichら、1999, J. Eur. Biochem. 266, 750-761)。本発明によれば、そのような効果の活性部位はAFPおよびアルブミンに見出される。活性部位を形成するペプチドを設計し、多くの合成天然または非天然ペプチドをそれらの生物学的活性についてスクリーニングした。
本発明の基本的な態様は、哺乳動物における2つの重要且つ豊富なタンパク質、AFPおよびアルブミンのアポトーシス的に活性な部位を見出したことである。この発見に基づき、哺乳動物細胞における細胞死誘起レセプターを阻害するための一連の分子構造が開発された。試験した分子は、合成が簡単なのでペプチドであったが、合成または天然の化合物に基づく他の分子を設計しても良いことは言うまでもない。また同様に、この分子構造は、他の担体分子、特に非免疫原性の担体分子上に構築することができる。
配列DVDLはアポサイクリン-A中でRGDの直後に位置しており、カスパーゼ-3、-7及び-2のよく知られた切断部位を表している。従って、これはカスパーゼ基質に典型的な構造、DXXD(Thornberry, N.A.ら、(2000) Methods in Enzymology, v.322, pp.100)を有している。アポサイクリン-Aにおいて、この部位はペプチド基質としてカスパーゼ-3の活性部位に結合できるであろう。類似の活性はAFP分子全体にも帰属させられるかも知れないが、この場合、アポトーシス-調節活性を表すために対応する部位の露出が可能となる構造変化が必要であろう(Semenkovaら、(2003) Eur. J. Biochem. 270,印刷中)。
アポサイクリン-A特有の性質はその環状構造であり、このことにより基質配列の多量体提示、および、アポトーシスシグナル伝達に関与する種々の分子との同時的相互作用による総効果の増強が可能となる。
本発明は更に以下の非限定的実施例によって更に説明される。
実施例1.
ペプチド合成
合成機、モデル430A(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)によって、ペプチド合成の通常の方法に従ってペプチドを合成した。環状ペプチドは、直線状ペプチドの水溶液を大気酸素に曝露すると主として自発的に形成され、これをペプチドについて一般的に利用される手法を用いてHPLCによって溶液から精製した。
3.配列253-259番に対応するAFP由来の直線状ペプチド、Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp(253-259)。このモノマーの分子量は674Daである。
4.HSA(ヒト血清アルブミン)由来の環状ペプチド、*Cys-Cys-His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu-Cys*, *CCHGDLLEC* (M.wt:992)
5.HSA由来の環状ペプチド、*Cys-Gly-His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu-Cys*, *CGHGDLLEC* (M.wt:992)。このペプチドではCys252がGlyに置換されている。
6.HSA p26由来の直線状ペプチド、His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu, HGDLLE (M.wt:683)。
蛍光ペプチド基質DEVD-AMCおよびLEHD-AFCはAlexis Biochemicals社(San Diego, USA)から購入した。ウシ心臓チトクロームc(Cyt c)、アデニルヌクレオチド三リン酸(dATP)および他の試薬はSigma Chemical社から購入した。ヒトAFPはDudichら、(1999) Biochemistry, 38:10406-10414に記載されたように、イオン交換、アフィニティーおよびゲルろ過クロマトグラフィーを用いて臍帯血清から単離した。AFPの純度はPAGEおよびRocket電気泳動により、ヒトAFPおよび成人血清タンパク質に対する単一特異的抗体で確認し、99.8%を下回らないことが明らかにされた。
ヒト肝臓癌種細胞HepG2およびヒト単芽球腫細胞株U937はアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した。細胞抽出物は低張抽出バッファー中で細胞を溶解することによって調製した。細胞質ゾルS-100画分を得るため、細胞溶解物を100,000 x gで1時間遠心した。抽出物は直ちに、または後の使用のため-70℃にて凍結した。
無細胞反応は典型的には13-μl反応体積で設計した。アポトーシスは1mM dATP存在下で種々の用量のウシ心臓チトクロームcおよび/または精製ヒトAFPの添加によって誘導した。13-μlスケール反応について、10μlの細胞抽出物(Bradfordアッセイ法によって決定したところ〜2-4mg/ml)に反応バッファー中の1μlのdATP、1μlのCyt cおよび/またはAFP溶液を添加し、必要な試薬の最終濃度とした。ペプチドの活性を評価するため、1mM dATPと共に反応バッファーに溶解したペプチドの種々の用量を細胞抽出物へ添加した。Cyt cおよびAFPのアポトーシス効果を調節するペプチドの能力を決定するため、チトクロームcまたはAFPの10分間前に抽出物にペプチドを添加した。対照サンプルは試薬添加をしない同体積(3μl)のバッファーと共にインキュベーションした。アポトーシスを開始させるため、抽出物を37℃にて40分間インキュベーションした。
カスパーゼ活性化反応終了後、抽出物の少量(5μl)に蛍光基質DEVD-AMC(3mM)を添加し、37℃にて一定時間(0.5〜1時間)インキュベーションした。反応を2.0mlの氷冷0.2mMリン酸ナトリウムバッファー、pH7.5を添加することによって終了させ、Perkin Elmer MPF-44A(λexc=365nm、λem=440nm)で蛍光を測定した。各サンプルについて、蛍光強度を細胞質ゾルタンパク質濃度に関して正規化した。カスパーゼ活性化はサンプルの正規化蛍光強度と対照サンプルについての対応する測定値に対する比として表した。
U937細胞を平底の96穴プレート(Costar)に4x103/ウェルの密度で完全培地中にプレーティングし、2時間インキュベーション後試薬を添加した。次に細胞をPBSに溶解した種々の用量のAFPで24時間処理し、増殖について評価した。細胞傷害性IgM抗-Fas抗体CH-11による細胞の処理を記載されたように行った。U937細胞を50ng/mlのCH-11抗体で18時間処理した。細胞は未処理のまま置くか、または、充分な時間、試薬で処理し、培養の最後の4時間は[3H]-チミジン(1Ci/mmol/ウェル)取り込みに供した。実験データは三つ組の培養における、培地対照に対する[3H]-チミジン取り込みのパーセンテージとして表した。添加物なしで培養した細胞を対照とした。
ペプチドの増殖制御活性を評価するため、種々の用量のペプチドを24時間細胞に添加し、次にその細胞を増殖、細胞生存性およびDNA-断片化について評価した。ペプチドの他の因子によって誘導されるアポトーシスを調節する能力を測定するため、Jurkat細胞をActD無しで20ng/mlのCH-11で、Raji細胞を0.5μg/mlのActDの存在下CH-11で、18時間処理した。TNF-αによるアポトーシス誘導のため、細胞(Jurkat、MCF7またはU937)を25ng/mlのこのサイトカインで24時間処理し、次にこれらの細胞を上述したように増殖または生存性について評価した。内在性増殖因子を除去するため、TNFを添加する前に、HepG2細胞を新鮮な培地で予備洗浄した。
AFP分子中の機能的に重要なアミノ酸を決定するため、ヒトAFP、カスパーゼ-3および-1とのアミノ酸配列相同性を決定し、提唱される活性部位のペプチド類似物の構造を構築した。
これまでに公表されたデータは、種々の起源の(胎児性、または肝癌腫細胞株HepG2の培養培地由来)AFPが、有意な増殖抑制、細胞傷害性および、DNA-断片化(Dudichら、(1998)Tumor Biol. 19:30-40)のようなアポトーシスの古典的な特徴(Dudichら、(1998) Tumor Biol. 19:30-40)によって特徴付けられ、種々の腫瘍細胞の用量依存性増殖抑制およびプログラム細胞死を誘導することができることを示している。アポトーシスシグナル伝達に関与するAFP分子上の活性部位のあり得る位置を決定するため、種々のAFP-由来ペプチドのこの効果を阻害する能力を試験した。図2はAFP-由来ペプチド、アポサイクリン-AがU-937細胞においてAFP-誘導性アポトーシスを完全に抑制することを示している。更に、U-937細胞のアポサイクリン-A(1mM)による15分間の予備処理は培地対照に比べて15%の増殖刺激を誘導した。このことは、アポサイクリン-Aが24時間培養において細胞の自発的アポトーシスも抑制することを意味している。
AFP-特異性を試験するため、アポサイクリン-Aが他の因子によって誘導されるアポトーシスに影響を与えるかどうかを試験した。種々の用量の細胞傷害性IgM抗-Fasモノクローナル抗体CH-11によってU-937細胞にアポトーシスを誘導した。図3は0.5mMアポサイクリン-Aは総効果を約50%抑制することによって、抗-Fas媒介アポトーシスを有意に阻害したことを示している。アポサイクリン-A濃度を1mMまで増加させると抗-Fas-誘導性アポトーシスをより有意に阻害した。種々の型のアポトーシスに関与する細胞内経路がアポトーシス因子の大部分について共通していることが知られている。我々のデータは、アポトーシスのAFPおよびFasの両因子によるアポトーシスシグナル伝達に関与するある共通のレセプターと相互作用することにより、アポサイクリン-AはAFP-依存性およびFas-依存性経路に拮抗することを示している。
a)AFP-由来ペプチド
Cys252がGlyに置換された環状ペプチド*CGRGDVLDC*および6-merペプチドRGDVLDを設計してアポトーシスシグナル伝達に関与する機能的活性部位の配列中の機能的に重要なアミノ酸を決定した。図4は、U-937細胞におけるAFP-媒介アポトーシスに対する*CGRGDVLDC*の影響を明らかにしている。このペプチドはAFP-媒介細胞傷害性を抑制できなかった。同じ結果がRGDVLDについて得られた(図4)。これらのデータは、Cys252は機能的に重要なアミノ酸であり、これをGlyに置換するとAFP分子全体のアポトーシス活性と相互作用するこのペプチドの能力が完全に抑制されることを示している。より短いペプチド、RGDVLDもAFP-媒介アポトーシスを制御することができなかったが、このことはアポトーシス活性部位の形成に環構造が必要であることを示している。
アルブミンはAFPと真の相同性があることが知られている(Morinagaら、Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 80:4604-4608)。アポサイクリン-Aペプチドによってかたどられる、提唱される活性部位領域中の相同性も見出された。HSA配列から以下のペプチドを設計した:環状ペプチド*CCHGDLLEC*、*CGHGDLLEC*(CysからGlyへの単一置換)および直線状6-merペプチドHGDLLE。AFP-誘導性アポトーシスにこれらのペプチドが影響を与える能力について上述したように全細胞系で試験した(表1)。図5は*CCHGDLLEC*は、U-937細胞においてアポサイクリン-AがAFP-媒介アポトーシスを抑制するのと同様な活性を有することを示している。HGDLLEおよび*CGHGDLLEC*はAFPに対する細胞応答に影響を与えなかった。
*環状ペプチド
1)無添加の対照に対する%で示した、U-937細胞増殖に対する1mM用量におけるペプチドの直接的効果。
AFP分子全体と同様に無細胞系においてカスパーゼ活性化を支持するようにアポサイクリン-Aが作用し得るかどうかを決定するため、上述したのと同じ無細胞系であるがAFPの代わりに環状ペプチドアポサイクリン-Aを使用した系を設定した。図8は、無細胞系において最適未満の低用量の内在性チトクロームcおよびdATPの存在下でアポサイクリン-Aがカスパーゼ-3の総活性を相乗的に増強したことを示している。同じ条件下でdATP無添加であるとアポサイクリン-AはDEVD-ase活性を誘導することが出来なかった。「サイレント」無細胞抽出物においてAFP全体について同じ効果が観察された。これらのデータは、我々がアポトーシス-促進活性に関与するAFPおよびアルブミンの活性部位を同定できたことを示している。
我々は更に無細胞系においてAFPがカスパーゼ活性を誘導する能力について試験した。AFPをS100細胞質ゾル抽出物に添加すると、dATP-依存性のカスパーゼ-3-特異的DEVDaseの誘導が引き起こされ、これは少なくとも2時間の間漸増した(図7A)。対照として、等価量のヒト血清アルブミン(HSA)を同じ無細胞系に添加したが、DEVDase活性のレベルに何の影響も示さなかった。低いDEVDase活性がdATP単独によって生じたが、これは明らかに調製物中にある少量の内在性cyt-cの存在によるものであった。dATP非存在下では、AFPは全くカスパーゼ活性化を誘導しなかった。AFPは細胞質ゾル細胞抽出物において直接にカスパーゼ活性化を誘導することができるのか、cyt-cの基底レベルの存在を必要とするのかを決定するために、内在性チトクロームcを検出できるレベルで含まない「サイレント」細胞質ゾル抽出物に外来性cyt-cを添加後、DEVDase切断活性を調べた。図7Bは、このタイプの細胞質ゾル溶解物においては、dATPおよび最適未満の低用量cyt-cの存在下における処理2時間後でさえDEVDase活性は検出されなかったことを示している。しかしながら、同じ反応系にAFP(7μM)を添加すると、カスパーゼ活性化過程が引き起こされ、時間依存性様式で漸増した(図7B)。
図8は、アポサイクリン-Aのカスパーゼ-3活性化に対する効果は種々の用量のチトクロームcおよびAFPによって媒介されたことを示している。高用量のペプチド(750μM)は高用量の内在性チトクロームcによって誘導されたカスパーゼ活性化を有意に(50〜70%)阻害した(図8A)。細胞質ゾル画分のチトクロームc/AFPによる併用処理によってDEVDase総活性の有意な増強が生じた(図8AおよびB)。アポサイクリン-A添加によりCyt c/AFP-媒介カスパーゼ活性化が60〜80%阻害された。これらのデータは、cyt c単独またはAFPとの組合せによって誘導される全体的なカスパーゼ活性化効果を抑制することにより、アポサイクリン-Aは無細胞系においてAFP分子全体に対して反対に作用することを示している。従って、アポサイクリン-Aは、アポトーシス活性に関与しアポトソーム集合体の構成員との相互作用に関与するAFP分子上の配列を提示している。
無細胞系において外来性チトクロームcによって誘導されるカスパーゼ活性化に対する種々のペプチドの影響能を試験するため、HepG2細胞の細胞質ゾル細胞抽出物を使用した。細胞抽出物の少量を750μMのペプチドで15分間予備処理し、その後種々の用量のチトクロームcを反応混合物に導入してカスパーゼ活性化を誘導した。対照抽出物はペプチドおよびチトクロームc無しにdATPとインキュベーションしたが、カスパーゼ活性を全く示さなかった。図9Aから、AFP由来のペプチド、9-merペプチドアポサイクリン-Aおよび6-merペプチドRGDVLD、およびHSA由来の6-merペプチドHGDLLEが高用量のチトクロームc-媒介カスパーゼ活性化を有意に阻害したことが分かる。一方、単一アミノ酸置換を有する環状モノマー9-merペプチド*CGRGDVLDC*、およびHSA由来の多量体環状ペプチド*CCHGDLLEC*は、全細胞系または無細胞系のいずれにおいてもアポトーシスを阻害する活性を示さなかった。従って、もっとも能力の高いペプチドアポサイクリン-AがAFPの活性部を模倣しており、アポトーシスシグナル伝達に関与する。低用量チトクロームc-誘導カスパーゼ活性化について全く異なる効果が得られた。図9Bは、アポサイクリン-Aは低用量チトクロームc-誘導カスパーゼ活性化において完全長AFP分子と同じ刺激を生じさせたことを示している。ペププチド、*CGRGDVLDC*および*CCHGDLLEC*は低用量チトクロームc活性に何ら影響を与えなかったが、ペプチドRGDVLDおよびHGDLLEはチトクロームc-誘導カスパーゼ活性化を有意に抑制することが明らかになった。
表2は無細胞細胞質ゾル抽出物におけるペプチドの活性を特徴付ける実験データをまとめたものである。
BALB/cAマウスを免疫、細胞融合および腹水液の作製に使用した。20匹のマウスをそれぞれフロイントの完全アジュバントで乳化した高度に精製したヒトAFP(40□g)で免疫した。マウスは2週間の間隔をおいて同じ量のフロイントの不完全アジュバント中に乳化したAFPでブーストした。ヒトAFPに対して最も高度に応答したマウスを選抜し、50□l中のフロイントの不完全アジュバントを含む100□lのAFP溶液中の80□gのAFPをマウスの尾に静脈注射した。3日後に脾臓細胞を調製し、マウスミエローマNS-1細胞と混合し、FCSを含むKC培地中でPEG処理した。FCSを含むHAT培地中で融合細胞を増殖させ、続いてHT培地で培養した。ウサギモノクローナル抗体を固定化捕獲抗体として用い、Eu-標識抗-ヒト抗体を監視抗体として用いるTR-FIAアッセイによりハイブリドーマを抗体産生について試験した(技術的詳細及び試薬については、Peuravuori, HとKorpera, T.ら、Clin. Chem. 1993, 39, pp.847-848を参照されたし)。抗体産生クローンの中で、ペプチド*CCRGDVLDC*およびその環状形態の添加に感受性でないクローンを排除した。良好な応答を示すクローンを腹水生成のためにマウスに導入するに充分になるまで増殖させた。腹水を調製し、抗-AFPモノクローナル抗体をそこから精製した。精製抗体をタンパク質分解にかけ、一般に知られた方法(技術に関しては、MuronetzとKorpela、J. Chromatogr. 2003, 790, pp.53-56を参照せよ)により、選択したクローンから純粋なFab断片を得た。Fabタンパク質を上述したようなAFPと同様な処理にかけ、Fab断片に対する単一特異性抗体を得た。AFP活性部位に対するこれらの抗-イディオタイプ抗体を、AFPの活性部位ペプチドに対する感受性によりこれらのクローンからスクリーニングした。ヒトアルブミンの配列位置246-254における活性部位に対する抗-イディオタイプ抗体もAFPに対して上述したのと本質的に同じ技術を用いて作製することが出来る。
Claims (16)
- ヒトα-フェトプロテインのアミノ酸残基251-259番、またはヒト血清アルブミンの残基246-254番に位置する、アポトーシス活性部位に対する抗イディオタイプ抗体の認識部位の分子構造。
- 一般式CCRGDVLDnXmYまたはCCHGDLLEnXmY(式中Xは疎水性アミノ酸、Yは親水性アミノ酸、nは1、2または3、mは1、2または3を表す)を有する、請求項1記載のα-フェトプロテインまたはアルブミンの活性部位のペプチド構造。
- N-末端に0、1または3個の隣接システイン残基を有し、C-末端に0、1または3個の隣接システイン残基を有する、請求項1または2記載の直線状ペプチド構造。
- 重合した、または環化した、請求項3記載のペプチド構造。
- 同一分子中にRGDおよびDXXD(Xは疎水性アミノ酸残基、R、GおよびDはそれぞれArg、GlyおよびAspを表す)配列が存在する、請求項1〜4のいずれか1項記載のペプチド構造。
- 配列RGD中のDが配列DXXDと共通である、請求項5記載のヘキサペプチド。
- Xが、V、L、Wまたはそれらの組合せであり、YがD、EまたはGである、請求項2記載のペプチド配列。
- C*C*RGDVLDC*(式中、アステリスク残基は可能なジスルフィド結合の位置を表す)の、直線状、重合化、または環化構造。
- C*C*HGDLLEC*(式中、アステリスク残基は可能なジスフィド結合の位置を表す)の構造を有する、請求項1〜3のいずれか1項記載の直線状、重合化、または環化ペプチド。
- ヒトおよび動物細胞においてアポトーシス制御経路を抑制するための、請求項2〜9のいずれか1項記載のペプチドの使用。
- 移植部における器官または細胞の維持性を増大させるための、請求項2〜9のいずれか1項記載のペプチドの使用。
- 自己免疫疾患またはウイルス感染により誘導される免疫不全症候群の防止のための、請求項2〜9のいずれか1項記載のペプチドの使用。
- 化学療法または放射線療法後の細胞傷害性効果を低減するための、請求項2〜9のいずれか1項記載のペプチドの使用。
- 神経細胞アポトーシス、非特異的な薬剤-誘導性アポトーシス、または酸化的ストレス-媒介アポトーシスの抑制のための、請求項2〜9のいずれか1項記載のペプチドの使用。
- 科学的または技術的目的で調製される培養細胞のアポトーシスを防止するための、請求項2〜9のいずれか1項記載のペプチドの使用。
- 抗イディオタイプ抗体のFab断片の分子認識部位に対して調製された抗体に結合することのできる構造を特徴とする、請求項1記載の分子構造。
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