PT1558649E - Péptidos que modulam a activação de caspases - Google Patents
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Description
ΡΕ1558649 - 1 - DESCRIÇÃO "PÉPTIDOS que modulam a activação DE CASPASES"
CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se a medicamentos e mecanismos de morte de células humanas e animais. Em particular, está relacionado com péptidos capazes de inibir morte celular apoptótica induzida por diferentes factores. 0 invento descreve péptidos com tais actividades e métodos de produção e utilização dos referidos péptidos.
ANTECEDENTES DO INVENTO A apoptose é uma forma activa de morte celular que está envolvida em múltiplos processos do radiação de desenvolvimento celular normal bem como em transformações celulares malignas. 0 mecanismo de apoptose está envolvido em eventos biológicos induzidos por vários tipos de fármacos, citocinas e factores de crescimento, stress oxidativo, radiação, envelhecimento, doenças auto-imunes e rejeição imunitária em transplantação de órgãos. Estudos recentes sobre apoptose demonstram que são empregues mecanismos moleculares comuns em vários tipos de apoptose, induzida por hormonas, citocinas, privação de factores de crescimento, agentes quimioterapêuticos, - 2 - ΡΕ1558649 ionização, distúrbios imunológicos, SIDA, cancro e envelhecimento (Nagata, Cell 88: 355-365, 1997). A activação semelhante a uma cascata das proteases caspases representa o ponto fundamental na indução de apoptose (Cohen, et al., Biochem. J. 326: 1-16, 1997). São descritos dois tipos distintos de sinalização de apoptose. A fase inicial de desencadeamento de apoptose dependente de receptores inclui a activação de receptores de morte apropriados através de ligandos específicos, tais como TNF ou FasL, que são actualmente os indutores mais estudos de apoptose (Wallach et al., FEBS Letters 410: 96-106, 1997) . Após activação, receptores de morte da superfície celular, Fas (CD95) ou TNFR1, unem-se a proteínas adaptadoras citosólicas (FADD, MORT, RIP, TRADED), que por sua vez recrutam caspase-8 para activar a cascata de proteases (caspases) da família ICE/CED-3 de enzimas conversoras de interleucina-1-β, seguido de activação da sub-família CPP32/caspase-3 de cisteína-proteases, cujos membros ocorrem no citoplasma celular na forma de precursores latentes, procaspases (Enari, et al., Nature 380: 723-726, 1996). Tipos de apoptose independentes de receptores incluem habitualmente mecanismos criticamente importantes indutíveis pelo citocromo c que requerem a formação de um complexo terciário de citocromo c, dATP, Apaf-1 e procaspase-9, que conduz à activação da última através de autoproteólise e homodimerização, e subsequente activação da cascata de caspases (Liu et al., Cell 86: 147-157, 1996; Pan et al., FEBs Letters 426: 151-154, 1998; ΡΕ1558649 - 3 -
Slee et al., J. Cell Biol. 144: 281-292, 1999).
Agentes que afectem o controlo biológico da apoptose têm assim uma potencial utilidade terapêutica em numerosas aplicações clinicas. Uma variedade de inibidores de apoptose derivados de plantas são empregues para pesquisar distúrbios patológicos que frequentemente acompanham quimioterapia, radiação, distúrbios imunitários ou SIDA. Estes suplementos contêm geralmente hidratos de carbono, gordura e hidrolisados de proteínas vegetais, lectinas e fosfolipidos (US6004579, Barr et al.). Potentes reguladores de apoptose podem ser empregues no tratamento de pacientes de cancro para controlar a terapia de citocinas, quimioterapia ou terapia de radiação. Os mecanismos apoptóticos operam nos vários tipos de distúrbios imunológicos, tais como malignidades auto-imunes, rejeição imunitária em transplantação de órgãos ou anafilaxia, ou infecções virais com virus da imunodeficiência humana. A alfa-fetoproteina (AFP) é uma glicoproteina fetal associada a tumores mostrando uma ampla variedade de actividades biológicas, incluindo regulação do crescimento celular, diferenciação de células imaturas, imuno-supressão de células imunitárias activadas, indução de apoptose especifica de tumores e regulação de sinais apoptóticos mediados por outros factores, bem como regulação da expressão de vários genes (Deutsch, Adv. Câncer Res. 56: 253-312, 1991; Mizejewsky, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 215: - 4 - ΡΕ1558649 333-362, 1997). Múltiplas evidências de actividades reguladoras do crescimento celular, incluindo actividade supressora tumoral, foram relatadas para várias espécies da molécula inteira de AFP (Semenkova et al., Tumor Biology 18: 261-274, 1997; Semeniuk et al., Ad. Exper. Med. Biol. 383: 255-269, 1995; Sonnenschein et al., J. Natl. Câncer Inst. 64: 1141-1146, 1980; Soto et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 2084-2087, 1980; Jacobson et al., Câncer Research 50: 415-420, 1999), seus fragmentos proteolíticos (Dudich et al., Biochemistry 38: 10406-10414, 1999) ou domínios recombinantes (Festin et al., Biochim. Biophys. Acta 1427: 307-314, 1999) e péptidos sintéticos (Mesfin et al., Biochim. Biophys. Acta 1501: 33-43, 2000; Mizejewsky, et al., Mol. Cell. Endocr. 118: 15-23, 1996). A pesquisa da localização de locais activos funcionais da molécula de AFP que são responsáveis pelas suas múltiplas actividades foi efectuada por vários investigadores. A localização dos locais de ligação do ácido araquidónico e estradiol foi bem sucedida (Deutsch, Adv. Câncer Res. 56: 253-312, 1991; Mizejewski, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 215: 333-362, 1997; Nishi et al., Tumor Biol. 14: 234-243, 1993).
Foi recentemente demonstrado que AFP realiza a sua actividade supressora tumoral desencadeando apoptose através da activação da caspase-3 e independentemente da sinalização de Fas/FasL e TNFFMFR (Dudich et al., Eur. J. Biochem. 266: 1-13, 1999; Semenkova et al., Tumor Biology 18: 261-274, 1997; Dudich et al., Tumor Biology 19: 30-40, 1998). Múltiplas evidências da supressão do crescimento de ΡΕ1558649 - 5 - células tumorais mediada por AFP foram relatadas na última década, mas o local activo da molécula de AFP que é responsável pela sinalização de apoptose não foi identificado.
As sequências de ADN e de aminoácidos da AFP humana foram relatadas (Morinaga, et al.r "Primary structures of human alpha-fetoprotein and its mRNA" Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 4604-4608, 1983). Mostrou-se que péptidos sintéticos, correspondendo ao local de ligação a E2, possuem actividade supressora de tumores (patentes US US5674842; 10/1997 Mizejewsky; US5707963, 07/1998 Mizejewsky). Uma variedade de proteínas biologicamente activas partilha uma homologia de sequência com AFP (Mizejewsky, BioEssays 15: 427-432, 1993; Mizejewsky, Proc. Soc. Exp. Biol. Mend. 215: 333-362, 1997). Foi identificada homologia autêntica de AFP com várias proteínas, envolvidas em sinalização de apoptose, tal como Bcl2, TNFR1, Fas, etc. (Mizejewsky, (2001) Proc. Soc. Exp. Biol. Med.) . WO 9835981 AI (Economou, J. et al., 1998) descreve que a utilização de 66 sequências peptídicas de AFP é útil para imunização contra o cancro. Um dos péptidos, A20, era CRGDVLDCL, o que por acaso inclui acidentalmente uma parte do local activo de AFP, verificado pelo presente invento. No entanto, não foram verificados quaisquer efeitos especiais pelo péptido CRGDVLDCL e o presente invento continua a ser o primeiro capaz de identificar um dos putativos locais biologicamente activos de AFP. Para além disso, os péptidos do presente invento incluem um resíduo de cisteína adicional que - 6 - PE 1558649 permite a formação de ligações dissulfureto inter-cadeias e produz uma actividade biológica significativamente maior que a sequência CRGDVLDCL.
Um importante local de ligação à integrina é um tripéptido Arg-Gly-Asp, que está presente numa variedade de ligandos da integrina. As integrinas são glicoproteinas heterodiméricas que medeiam interacções célula-matriz e célula-célula e têm um papel activo nos processos de diferenciação celular, reconhecimento imunitário, desenvolvimento tumoral e crescimento de metástases. Regiões de contacto para a sequência Arg-Gly-Asp foram identificadas nas subunidades de integrina (ver Pasqualini, et al., "A peptide isolated from phage display libraries is a structural and functional mimic of an Arg-Gly-Asp-binding site on integrins" J. Cell Biol. 130: 1189-1196, 1995). Péptidos sintéticos contendo o motivo Arg-Gly-Asp são utilizados como inibidores de interacções integrina-ligando (D'Souza et al., Science 242: 91-93, 1988). Foi relatado que péptidos sintéticos contendo o motivo Arg-Gly-Asp são capazes de dirigir a activação da caspase-3 (Bukley, et al., Nature 397: 534-539, 1999). AFP contém a sequência Arg-Gly-Asp (RGD) na sua sequência que se localiza no domínio II na posição 253-255. De acordo com o presente invento, a sequência ROD é uma parte do local funcionalmente activo de AFP envolvido na sinalização de apoptose. O presente invento descreve a parte mínima da ΡΕ1558649 - 7 - molécula de AFP que é responsável pela sinalização de apoptose. Péptidos pequenos ou outros haptenos pequenos são importantes reguladores a utilizar como fármacos porque podem ser sintetizados in vitro e não produzem anticorpos neutralizantes. Péptidos contendo 6 a 10 resíduos foram produzidos com a ajuda da química de fase sólida F-MOC. Todos os péptidos foram avaliados quanto à sua actividade reguladora do crescimento em células inteiras em cultura e foram também testados quanto à sua capacidade para induzirem directamente a activação de caspases em extractos citosólicos sem células. Adicionalmente, os péptidos foram avaliados quanto à sua capacidade para modular apoptose induzida por AFP e mAbs anti-Fas citotóxicos CH-11 em células inteiras e para afectar a activação de caspases induzida pelo citocromo c em sistemas sem células.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 mostra a apresentação esquemática de um péptido dimérico biologicamente activo (o monómero aqui designado como apociclina-A; *Cys-Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*) A Fig. 2 mostra a inibição de apoptose induzida por AFP através do péptido cíclico multimérico 9-mero apociclina-A (*Cys-Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*). Células U-937 em poços de microtitulação foram tratadas durante 15 min com várias doses de apociclina-A e a partir dai foram adicionados a cada poço 3 μΜ de AFP humana pura. - 8 - ΡΕ1558649 A proliferação celular foi avaliada através de ensaio de incorporação de [3H]-timidina após 24 h de incubação. A Fig. 3 mostra o efeito do péptido ciclico multimérico 9-mero apociclina-A (*Cys-Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*) na apoptose induzida em células U-937 através de anticorpos monoclonais anti-Fas citotóxicos CH-11. As células foram tratadas durante 15 min com apociclina-A 500 μΜ e a partir dai foram adicionadas a cada poço várias doses de mAbs anti-Fas citotóxicos CH-11 (Immunotech Ltd). A proliferação celular foi avaliada através do ensaio de incorporação de [3H]-timidina após 16 h de incubação. A Fig. 4 mostra efeitos dos péptidos lineares 6-meros Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp (RGDVLD) e His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu (HGDLLE) na supressão do crescimento mediado por AFP de células U-937. As células foram tratadas durante 15 min com várias doses dos péptidos e a partir dai foram adicionados a cada poço 3 μΜ de AFP humana pura. A proliferação celular foi avaliada através do ensaio de incorporação de [3H]-timidina após 24 h de incubação. A Fig. 5 mostra o efeito do péptido monomérico ciclico 9-mero *Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys* (*CGRGDVLDC*) na supressão de crescimento mediado por AFP da linha celular de mieloblastoma humano U-937. As células foram tratadas durante 15 min com várias doses do péptido e a partir foram adicionados a cada poço 3 μΜ de AFP humana pura. A proliferação celular foi avaliada através do ensaio - 9 - ΡΕ1558649 de incorporação de [3H]-timidina após 24 h de incubação. A Fig. 6 mostra que o péptido ciclico 9-mero apociclina-A (*CCRGDVLDC*) aumenta a activação da pro-caspase-3 dependente de ATP em extractos citosólicos sem células induzida por baixas doses de Cit c endógeno. Os extractos celulares de células U937 foram incubados durante 40 min com várias doses de apociclina-A e 1 mM de dATP. Os extractos incubados sem adições foram tomados como controlo. A activação da caspase-3 foi avaliada através de clivagem do substrato fluorogénico DEVD-AFC. A Fig. 7 mostra o aumento sinergistico da activação de caspases mediada pelo citocromo C num sistema sem células com AFP humana. (A) AFP induz a activação de caspase-3 em extractos citosólicos sem células na presença de dATP. Aliquotas de extracto citosólico derivado de HepG2 (25 yg de proteína) foram tratadas durante vários intervalos de tempo com AFP (7 μΜ) ou como controlo com a mesma dose de HSA na presença de dATP (1 mM) e depois ensaiadas quanto à actividade de DEVDase. (B) Aumento sinergistico da activação de caspase-3 mediada por AFP na presença da dose subóptima de citocromo c exógeno em extractos citosólicos de células HepG2. Aliquotas do extracto citosólico derivado de HepG2 (25 yg de proteína) foram tratadas durante vários intervalos de tempo com AFP (10 yM) , citocromo c (0,2 yM) ou com uma combinação das mesmas doses de ambos os compostos na presença de dATP (1 mM) e depois ensaiadas quanto à actividade de DEVDase. (C) - 10 - ΡΕ1558649 AFP afecta diferentemente a activação de caspase-3 em extractos citosólicos sem células induzida por várias doses de citocromo c. Alíquotas de extracto citosólico S100 (25 yg de proteína) foram tratadas durante 30 min com AFP (10 μΜ) e várias doses de citocromo c na presença de dATP (1 mM) e depois ensaiou-se quanto à actividade de DEVDase. É mostrada a média ± DP de quatro determinações. A Fig. 8 mostra os efeitos dos péptidos apociclina-A *CCRGDVLDC*, CGRGDVLDC, *CCHGDLLEC*, RGDVLD e HGDLLE na activação de caspases induzida por Cit c dependente de dATP em extractos citosólicos sem células de células HepG2 a dose elevada (165 nM) de citocromo c endógeno (A) e dose baixa (110 nM) de citocromo c endógeno (B) . Os péptidos na concentração de 750 μΜ foram adicionados aos extractos celulares 15 min antes da adição de citocromo c. A activação de caspases foi monitorizada através da clivagem do substrato fluorogénico DEVD-AMC específico da caspase-3. A Fig. 9 mostra que o péptido multimérico cíclico 9-mero apociclina-A (*CCRGDVLDC*) abole a activação de caspase-3 mediada por citocromo c/AFP num sistema sem células. Alíquotas de extracto citosólico derivado de HepG2 foram pré-tratadas durante 15 min com 750 μΜ de apociclina-A e depois tratadas durante 40 min com 10 μΜ de AFP e/ou 110 nM (A) ou 80 nM (B) de citocromo c na presença de 1 mM de dATP. A activação da caspase foi monitorizada através de clivagem do substrato fluorogénico DEVD-AMC específico da - 11 - ΡΕ1558649 caspase-3.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O objecto do invento proporciona péptidos, de acordo com as reivindicações 1-4, capazes de regulação da morte celular apoptótica. Mais especificamente, refere-se à sequência de aminoácidos original na molécula de alfa-fetoproteína (AFP) humana responsável pela regulação de apoptose em células tumorais. A AFP é uma glicoproteina fetal associada a tumores mostrando uma ampla variedade de actividades biológicas, incluindo regulação do crescimento celular, diferenciação de células imaturas, supressão imunitária de células imunitárias activadas, indução de apoptose especifica de tumores e regulação de sinais apoptóticos mediados por outros factores, regulação da expressão génica. Recentemente foi mostrado que a AFP pode induzir apoptose selectiva de tumores através de activação directa ou indirecta de caspase-3 em células inteiras e num sistema sem células (Dudich et al., J. Eur. Biochem. 266: 750-761, 1999). De acordo com o presente invento, o local activo de tais efeitos foi verificado em AFP. Os péptidos formando os locais activos foram modelados e foi pesquisado um grande número de péptidos sintéticos naturais e não naturais quanto às suas actividades biológicas.
Os péptidos de acordo com o presente invento - 12 - ΡΕ1558649 podem ser utilizados para inibição de vários tipos de morte celular que são dependentes da activação da cascata de caspases mediada pelo citocromo c, por exemplo, apoptose induzida por stress oxidativo, fármacos, citocinas, ligando Fas, alfa-fetoproteina. Os péptidos podem ser utilizados para prevenir apoptose em células em cultura, para aumentar a conservação de órgãos para transplantação de órgãos, para prevenir distúrbios imunológicos auto-imunes e síndroma de imunodeficiência induzido por infecção virai, efeitos citotóxicos secundários após quimioterapia e terapia de radiação. São também proporcionadas sequências de aminoácidos dos péptidos e métodos de produção e utilização dos péptidos. As estruturas mais activas dos péptidos são péptidos sintéticos não naturais possuindo uma forma molecular rígida tal como: *CCRGDVLDC* *CCRGDVLDC*
CJSHGDLLEC í :CR(H)GDL(V)LE(D)C ^CHGDLLEjC tpCR(H)GDL(V)LEQD)Cj
Os presentes inventos foram efectuados para determinar o local activo da molécula de AFP responsável por desencadear apoptose em células tumorais através da utilização de abordagens teóricas e experimentais. Foi feita uma hipótese do péptido activo, modelando o local activo, poder induzir directamente apoptose em células inteiras e desencadear a activação de caspase-3 num sistema sem células ou poder modular sinais apoptóticos, induzidos - 13 - ΡΕ1558649 por AFP e/ou outros factores apoptóticos, tais como anti-Fas ou citocromo-c. Surpreendentemente, um péptido cíclico sintético *Cys-Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys* (aqui designado como apociclina-A) , que deu em modelo uma parte da molécula de AFP, partilhando uma homologia autêntica com várias caspases, pareceu ser biologicamente activo. Pretendia-se uma série de análises sintácticas e substituições de aminoácidos na sequência de apociclina-A para identificar os aminoácidos funcionalmente importantes. Foi também sintetizado um grande número de péptidos relacionados com apociclina-A. Todos os péptidos foram testados quanto à sua capacidade para afectar a sobrevivência de células tumorais em cultura e para afectar a activação de caspases em lisados citosólicos sem células. 0 passo seguinte dos testes dos péptidos foi estudar a capacidade dos péptidos para afectar a apoptose induzida por AFP, anti-Fas em células inteiras e para modular a activação de caspases mediada por Cit c num sistema sem células. Foi demonstrado que o péptido 9-mero apociclina-A correspondendo à sequência de AFP 251-259 abolia completamente a apoptose mediada por AFP em células tumorais in vitro e modula significativamente a activação de caspases mediada por Cit-c e AFP em extractos citosólicos sem células. Mais especificamente, num sistema sem células, a apociclina-A aumentou significativamente a activação de caspases mediada pelo citocromo c a dose baixa e diminuiu os efeitos induzidos pelo citocromo c a dose elevada. - 14 - ΡΕ1558649
Um péptido mais curto β-mero p25 manteve parcialmente esta actividade num sistema sem células, mas não em células inteiras. Foi também demonstrado que os péptidos derivados de AFP apresentavam antagonismo mútuo na regulação da activação de caspases mediada por Cit c em extractos celulares. Observou-se que o péptido 9-mero apociclina-A suportava moderadamente os efeitos mediados por Cit c a dose baixa e inibia significativamente a activação de caspases desencadeada por doses elevadas de citocromo c exógeno ou endógeno. Estes dados mostram que o péptido 9-mero derivado de AFP apociclina-A é a parte minima de AFP que é responsável pela ligação especifica com moléculas citosólicas desconhecidas envolvidas na sinalização de apoptose. A estrutura definida deste péptido e a sua natureza artificial implicam que pode ser o componente activo de um novo fármaco que se opõe à acção de vários factores apoptóticos in vitro e in vivo. As aplicações deste péptido incluem prevenção de apoptose em células em cultura, métodos para prevenir rejeição imunológica de transplantes alogénicos e reacções auto-imunes, métodos para evitar choque séptico hepatológico e apoptose induzida por terapia de citocinas, etc.
As abreviaturas para os aminoácidos tal como aqui utilizadas são dadas na seguinte tabela:
Ala A Alanina Asp D Ácido aspártico Glu E Glutamina - 15 - ΡΕ1558649
Arg R Arginina Cys C Cisteína Vai V Valina Leu L Leucina Gly G Glicina Xaa X Qualquer aminoácido
Para descobrir a parte mínima da molécula de AFP que é responsável pela apoptose, foram produzidos péptidos de sinalização contendo de 6 a 10 resíduos através de química de fase sólida F-MOC. Foram também sintetizados péptidos semelhantes correspondentes à sequência homóloga da albumina do soro humano (HSA) . Todos os péptidos foram avaliados quanto à sua actividade reguladora do crescimento em células inteiras em cultura e também testadas quanto à sua capacidade para afectar directamente a activação de caspases em extractos citosólicos sem células. Adicionalmente, os péptidos foram ensaiados quanto à sua capacidade para modular apoptose induzida por AFP e mAbs citotóxicos anti-Fas CH-11 em células inteiras e também afectar a activação de caspases induzida por cit c em sistema sem células. O péptido cíclico artificial *CCRGDVLDC* (os asteriscos denotam uma potencial ligação dissulfureto) contendo o motivo Arg-Gly-Asp (ROD) correspondendo à sequência 251-259 da α-fetoproteína (AFP) humana, o péptido cíclico homólogo com substituição de Cys252 para Gly *CGRGDVLDC* e o péptido linear RGDVLD correspondendo aos resíduos 253-258 foram produzidos através de química de fase sólida F-MOC. Os péptidos - 16 - ΡΕ1558649 cíclicos homólogos da sequência da albumina do soro humano *CCHGDLLEC*, *CGHGDLLEC* e o péptido linear HGDLLE foram também sintetizados e utilizados como controlos funcionais. Deve reconhecer-se que péptidos contendo apenas a sequência RCD diferem drasticamente dos do presente invento. 0 péptido cíclico multimérico contendo RGD de AFP *CCRGDVLDC* (aqui apociclina-A) é capaz de abolir apoptose em células tumorais ín vitro. Foi demonstrado que a apociclina-A cancelou completamente a apoptose induzida por AFP em células U937 de mieloblastoma humano e que inibe significativamente a morte celular mediada por anti-Fas. Mais, foi avaliada a capacidade dos péptidos apociclina-A derivados de AFP e do péptido 6-mero linear RGDVLD para afectar a activação de caspases induzida por Cit c e AFP num sistema sem células. Verificou-se que a apociclina-A aumentava notavelmente a activação de caspases dependente de dATP induzida por doses baixas de Cit c endógeno ou exógeno e praticamente aboliu completamente a activação de caspases induzida por doses elevadas apoptoticamente activas de Cit c. Foi também demonstrado que a apociclina-A cancelava a activação de caspase-3 induzida por AFP dependente de Cit c/dATP em extractos citosólicos sem células de células HepG2. 0 péptido 6-mero linear derivado de AFP RGDVLD não revelou qualquer actividade reguladora de apoptose nas células inteiras, mas foi capaz de abolir a activação de caspases mediada por Cit c/AFP num sistema sem células. - 17 - PE 1558649 É bem conhecida e é a abordagem habitualmente empregue criar anticorpos contra certos locais funcionais de proteínas biologicamente activas como receptores para as bloquear. Tais anticorpos criam nas suas unidades Fab estruturas que se ajustam exactamente no local do receptor. Por outro lado, podem ser produzidos anticorpos anti-idiotípicos para se ajustarem às unidades Fab preparadas antes. 0 anticorpo anti-idiotípico parece-se portanto com o local activo do receptor. De acordo com o presente invento, AFP e albumina contêm um local activo especial, que se ajusta aos receptores que desencadeiam o ciclo de morte celular, e bloqueia-os. Portanto, uma certa parte de AFP/albumina, verificada no presente invento, tem a estrutura que bloqueia o local desencadeador. 0 anticorpo anti-idiotípico contra o local activo da AFP e/ou albumina contém portanto a informação estrutural essencial da molécula capaz de bloquear o receptor de morte celular. Tal estrutura 3D pode ser revelada através de cristalografia de raios X de rotina e/ou através de modelação molecular computacional a partir dos dados de uma sequência. A concretização básica do presente invento é que foi verificado o local apoptoticamente activo em duas proteínas importantes e abundantes em mamíferos, nomeadamente AFP e albumina. Com base nesta descoberta, foi desenvolvida uma série de estruturas moleculares para bloquear o receptor desencadeador de morte celular em células de mamífero. As moléculas testadas foram péptidos devido à sua fácil síntese mas entende-se que possam ser ΡΕ1558649 - 18 - desenhadas sintéticos moleculares especialmente imunogénicas. outras moléculas baseadas em compostos ou naturais. Igualmente, as estruturas podem ser construídas noutras moléculas, em moléculas transportadoras não 0 principal resultado prático do presente invento é o péptido cíclico de AFP, *CCRGDVLDC* (apociclina-A), que contém dois locais activos funcionais: RGD e DVLD. Ambas as sequências estão directamente envolvidas na regulação da actividade das caspases e apoptose. Sabe-se que as proteínas ou péptidos contendo RGD estão envolvidos na interacção com moléculas de integrina e podem ser empregues para inibição de contactos intracelulares afectando assim a proliferação celular e a apoptose. A apociclina-A difere de outros péptidos contendo RGD pela representação multimérica deste local na forma cíclica. Isto permite aumentar o efeito total através de apresentação multimérica da sequência RGD. A sequência DVLD localiza-se na apociclina-A imediatamente após RGD e representa o local de clivagem bem conhecido para a caspase-3, 7 e 2. Portanto, possui uma estrutura típica para substratos de caspases, DXXD (Thomberry, N.A., et al., (2000) Methods in Enzymology, v. 322, pág. 100). Na apociclina-A, este local pode ligar-se ao local activo da caspase-3 como um substrato peptídico. A actividade semelhante pode ser atribuída também à molécula de AFP inteira, mas isto requererá alteração conformacional - 19 - ΡΕ1558649 permitindo a exposição do local correspondente para revelar actividade moduladora de apoptose (Semenkova et al., (2003) Eur. J. Biochem. 270, no prelo). A capacidade da apociclina-A para inibir a actividade da caspase-3 num sistema sem células pode ser explicada pela presença da sequência de aminoácidos semelhante ao substrato, que é capaz de se ligar e bloquear os locais activos das caspases correspondentes. Adicionalmente, o local DVLD da apociclina-A pode facilitar selectivamente a libertação de caspase-3 a partir do complexo apoptossoma através da destruição de uma interacção entre XIAP e a caspase-3 processada semelhantemente ao inibidor tetrapeptídico típico da caspase-3 DEVD-cho (Bratton, S.B., et al., EMBO J. 5: 998, 2001). A natureza única da apociclina-A é a sua estrutura cíclica, que permite a apresentação multimérica da sequência do substrato e o aumento do efeito total através da interacção simultânea com diferentes moléculas envolvidas na sinalização de apoptose. O invento é ilustrado mais abaixo através dos exemplos não limitantes. 20 - PE1558649 EXEMPLO 1 Síntese peptídica
Os péptidos foram sintetizados com um sintetizador Modelo 430A; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA, de acordo com os métodos habituais de sinteses peptidicas. Os péptidos ciclicos formam-se primariamente espontaneamente a partir de péptidos lineares em soluções aquosas sujeitas a oxigénio atmosférico e foram purificados a partir da solução através de HPLC com procedimentos vulgares utilizados para péptidos. 1. Péptido 9-mero multimérico cíclico correspondendo à sequência de aminoácidos 251-259 da AFP humana *Cys-*Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*, *CCRGDVLDC* (os asteriscos denotam uma potencial ligação dissulfureto), que serão aqui designados como apociclina-A. A segunda cisteina, Cys252, é capaz de formar a ligação S-S entre dois péptidos monoméricos cíclicos adjacentes. O peso molecular do péptido cíclico monomérico foi de 983 Da. O péptido apociclina-A é composto por duas ou mais (menos de 5) estruturas peptidicas 9-mero semelhantes a anel correspondendo à sequência *Cys-*Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*.
T ♦CCRGDVLDC*
21 - ΡΕ1558649 2. Péptido monomérico cíclico *Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys* (os asteriscos denotam uma potencial ligação dissulfureto), correspondendo à sequência de aminoácidos 251-259 da AFP humana com uma única substituição de aminoácidos de Cys252 por Gly para evitar a multimerização do péptido através da formação das ligações dissulfureto S-S entre os monómeros. 0 peso molecular do péptido 9-mero cíclico monomérico foi de 937 Da. 3. Péptido linear de AFP correspondendo à sequência 253-259, Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp (253-259), o peso molecular do péptido cíclico monomérico foi de 674 Da. 4. Péptido cíclico de HSA (albumina do soro humano) *Cys-Cys-His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu-Cys*, *CCHGDLLEC* (PM: 992); 5. Péptido cíclico de HSA *Cys-Gly-His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu-Cys*, CGHGDLLEC (PM: 946). Neste péptido Cys252 é substituído por Gly. 6. Péptido linear de HSA p26: His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu, HGDLLE (PM: 683).
Reagentes
Os substratos peptídicos fluorogénicos DEVD-AMC e LEHD-AFC eram de Alexis Biochemicals (San Diego, USA) . Citocromo c (Cit c) de coração bovino, adenosina-trifosfato 22 - ΡΕ1558649 (dATP) e outros reagentes foram obtidos em Sigma Chemical Co. A AFP humana foi isolada do soro do cordão utilizando cromatografia de permuta iónica, afinidade e filtração em gel tal como descrito em (Dudich et al., Biochemistry 38: 10406-10414, 1999). A pureza da AFP foi estabelecida através de electroforese PAGE e Rocket com anticorpos monoespecificos contra AFP humana e proteínas do soro de adulto e mostrou-se ser não inferior a 99,8%.
Preparação de extractos sem células Células HepG2, de hepatocarcinoma humano e a linha celular de monoblastoma humano U937 eram originárias de American Type Culture Collection. Os extractos celulares foram preparados através de lise das células num tampão de extracção hipotónico. Para obter a fracção citosólica S-100, o lisado celular foi centrifugado durante lha 100000 xg. Os extractos foram utilizados imediatamente ou congelados a -70°C para utilização posterior.
Reacções sem células
As reacções sem células foram tipicamente montadas em volumes reaccionais de 13 μΐ. A apoptose foi induzida através da adição de várias doses de citocromo c de coração bovino e/ou AFP humana purificada na presença de dATP 1 mM. Para reacções à escala de 13 μΐ, 10 μΐ de extracto celular (~2-4 mg/ml, determinado através de ensaio de Bradford) foram suplementados com 1 μΐ de dATP, 1 μΐ de 23 - ΡΕ1558649 solução de Cit c e/ou AFP em tampão reaccional para receber a concentração final de reagentes necessária. Para avaliar a actividade dos péptidos, foram adicionadas aos extractos celulares várias doses de péptidos dissolvidos no tampão reaccional juntamente com dATP 1 mM. Para determinar a capacidade dos péptidos para modularem efeitos apoptóticos de Cit c e AFP, os péptidos foram adicionados aos extractos 10 min antes do citocromo c ou AFP. As amostras de controlo foram incubadas com um volume igual do tampão (3 μΐ) sem adição de reagentes. Para iniciar a apoptose, os extractos foram incubados a 37°C durante 40 min.
Determinação da actividade de caspases
No final da reacção de activação de caspases, aliquotas dos extractos (5 μΐ) foram suplementadas com substrato fluorogénico DEVD-AMC (3 mM) e depois incubadas durante intervalos de tempo definidos (0,5-1 h) a 37°C. As reacções foram terminadas através de diluição com adição de 2,0 ml de tampão de fosfato de sódio gelado 0,2 mM, pH 7,5, seguido de uma medição da fluorescência com um fluorómetro Perkin Elmer MPF-44A (Xexc=365 nm e Xem=440 nm) . Para cada amostra, a intensidade da fluorescência foi normalizada em relação à concentração de proteina citosólica. A activação de caspases foi apresentada como a razão entre a intensidade de fluorescência normalizada da amostra e o valor correspondente com uma amostra de controlo. 24 - ΡΕ1558649
Indução de apoptose Células U937 foram plaqueadas a uma densidade de 4χ103 células/poço em placas de 96 poços de fundo raso (Costar) no meio completo e incubadas durante 2 h antes da adição dos reagentes. Depois as células foram tratadas durante 24 h com várias doses de AFP dissolvida em PBS e depois avaliadas quanto à proliferação. 0 tratamento das células com anticorpo IgM citotóxico anti-Fas CH-11 foi efectuado tal como descrito. As células U937 foram tratadas com 50 ng/ml de anticorpos CH-11 durante 18 h. As células foram deixadas sem tratamento ou foram tratadas com reagentes durante intervalos de tempo adequados e durante as últimas 4 h de cultura foram sujeitas à sua incorporação de [3H]-timidina (11 Ci/mmol/poço). Os dados experimentais foram expressos como a percentagem de incorporação de [3H]-timidina em culturas em triplicado relativamente ao controlo de meio. As células, cultivadas sem adições, foram tomadas como controlo.
Ensaio para actividade dos péptidos
Para avaliar a actividade reguladora do crescimento dos péptidos, foram adicionadas às células várias doses dos péptidos durante 24 h e depois as células foram avaliadas quanto à proliferação, viabilidade celular e fragmentação de ADN. Para determinar a capacidade dos péptidos para modular apoptose induzida por outros factores, células de Jurkat foram tratadas com 20 ng/ml de 25 - ΡΕ1558649 anticorpos CH-11 sem ActD, células de Raji foram tratadas com CH-11 na presença de 0,5 pg/ml de ActD durante 18 h. Para indução de apoptose com TNF-cx, as células (Jurkat, MCF7 ou U937) foram tratadas durante 24 h com 25 ng/ml da citocina e foram depois avaliadas quanto à proliferação ou viabilidade tal como descrito acima. Células HepG2 foram pré-lavadas antes da adição de TNF com meio fresco para remover os factores de crescimento endógenos. EXEMPLO 2 Identificação do local activo contendo RGD específico da caspase-3 em AFP humana responsável pela sinalização de apoptose
Para determinar os aminoácidos funcionalmente importantes na molécula de AFP determinámos a homologia de aminoácidos da sequência da AFP humana e das caspases-3 e 1 e construímos as estruturas de análogos peptídicos do local activo proposto. As seguintes sequências foram estudadas alinhadas:
casp-2 OHKPKMFFIOACRGDETDRGV casp-1 KDKPKVII IQftCBGDSPGWW casp-3 TGKPKLFIIQACRBTELDCGI 299 294
HuAFP VLDVAHVHEHCCRGDVLDCLQDGEKIMSYICSQQDTLSNKITECCKLTTLERGQCIIHAE HSA VTDLTKVHTEÇÇHGDLLEÇADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVE
Observa-se a partir do alinhamento que a AFP tem uma certa homologia com os locais activos enzimáticos das caspases 1 e 3. Os locais enzimaticamente activos das - 26 - PE1558649 caspases 1 e 2 contêm o motivo RGD que se localiza antes do residuo Cys cataliticamente activo. As caspases efectoras 3 e 7 têm neste local o motivo RGT, mas as posições dos residuos Cys coincidem exactamente na molécula AFP e na casp-3 e casp-7. Tendo em conta que a AFP tem uma ligação dissulfureto intercadeias entre Cys252 e Cys259 (Morinaga, et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 80: 4604-4608, 1983), colocámos a hipótese de localização do local activo semelhante a caspase na molécula de AFP algures entre os residuos Cys25i-Cys259 . Tem de se mencionar que as casp-3, 7 e 8 também têm motivos RGD, mas estes localizam-se em posições que não as cataliticamente activas (Bukley, et al.r Nature 397: 534-539, 1999). As cisternas livres Cys258 no teor da estrutura peptídica podem evidentemente formar ligações dissulfureto intercadeias entre dois péptidos adjacentes (Fig. 1). Para provar a existência de aminoácidos funcionalmente importantes na volta Cys25i_Cys259 na molécula de AFP, construímos as estruturas de análogos peptidicos do local activo proposto. Para controlo, foram também sintetizados péptidos homólogos de HSA. EXEMPLO 3 O péptido cíclico de AFP apociclina-A cancela apoptose induzida por AFP em células U937
Os dados publicados anteriormente demonstram que AFP de diferentes origens (embrionária ou derivada do meio de cultura da linha celular de hepatoma HepG2) pode induzir supressão do crescimento dependente da dose e morte celular programada em várias linhas celulares tumorais, 27 - ΡΕ1558649 caracterizada por características clássicas de apoptose, tais como significativa supressão do crescimento, citotoxicidade e fragmentação do ADN (Dudich et al., Tumor
Biol. 19: 30-40, 1998). Para determinar a possível localização do local activo na molécula de AFP que é responsável pela sinalização de apoptose testámos a capacidade de vários péptidos derivados de AFP para bloquear este efeito. A Fig. 2 demonstra que o péptido derivado de AFP apociclina-A abole completamente apoptose induzida por AFP em células U-937. Para além disso, pré-tratamento de 15 min de células U-937 com apociclina-A (1 mM) induziu uma estimulação de 15% da proliferação relativamente ao controlo de meio. Isso significa que a apociclina-A abole também a apoptose espontânea das células durante uma cultura de 24 h. EXEMPLO 4 Apociclina A inibe significativamente apoptose induzida por anti-Fas em células U-937
Para testar a especificidade de AFP, testámos se a apociclina-A podia afectar a apoptose induzida por outros factores. A apoptose foi induzida em células U-937 através de várias doses de anticorpos monoclonais IgM citotóxicos anti-Fas CH-11. A Fig. 3 demonstra que apociclina-A 0,5 mM inibia significativamente apoptose mediada por anti-Fas abolindo cerca de 50% do efeito total. O aumento da concentração de apociclina-A até 1 mM induziu uma inibição mais significativa da apoptose induzida por anti-Fas. Sabe-se que as vias intracelulares envolvidas em vários tipos de - 28 - ΡΕ1558649 dos factores a apociclina-A de sinalização certo receptor para sinalizar apoptose são comuns para a maioria apoptóticos. Os nossos dados indicaram que contraria as vias dependentes de AFP e Fas de apoptose através da interacção com um comum que é envolvido por ambos os factores apoptose.
EXEMPLO 5 Determinação dos aminoácidos funcionalmente importantes no local activo da molécula de AFP: a) Péptidos derivados de AFP 0 péptido cíclico *CGRGDVLDC* com a substituição de Cys252 para Gly e o péptido 6-mero RGDVLD foram desenhados para determinar aminoácidos funcionalmente importantes na sequência do local activo funcional que é responsável pela sinalização de apoptose. A Fig 4 demonstra o efeito de *CGRGDVLDC* na apoptose mediada por AFP em células U-937. Este péptido não conseguiu abolir a citotoxicidade mediada por AFP. Os mesmos resultados foram obtidos para RGDVLD (Fig. 4). Estes dados indicam que Cys252 é um aminoácido funcionalmente importante e a sua substituição para Gly abole completamente a capacidade do péptido para interagir com a actividade apoptótica da molécula de AFP inteira. 0 péptido mais curto, RGDVLD, foi também incapaz de regular a apoptose mediada por AFP, mostrando a necessidade da estrutura cíclica para a formação do local activo apoptótico. - 29 - ΡΕ1558649
b) Péptidos derivados de HSA
Sabe-se que a albumina partilha homologia autêntica com AFP (Morinaga, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 4604-4608). Verificou-se também uma homologia na região do local activo proposto que foi modelado pelo péptido apociclina-A. Desenhámos os seguintes péptidos a partir da sequência de HSA: péptidos cíclicos *CCHGDLLEC*, *CGHGDLLEC* (com uma única substituição de Cys para Gly) e o péptido 6-mero linear HGDLLE. Testámos também a capacidade destes péptidos para afectar apoptose induzida por AFP em células inteiras semelhantemente tal como descrito acima (Tabela 1) . A Fig. 5 demonstra que *CCHGDLLEC* tem uma actividade semelhante à da apociclina-A a abolir apoptose mediada por AFP em células U-937. HGDLLE e *CGHGDLLEC* não afectaram a resposta celular a AFP.
Tabela 1. Efeitos dos péptidos derivados de AFP e derivados de HSA no crescimento celular e na apoptose induzida por AFP em células U-937
Origem Sequência i)Efeito no crescimento celular (% do controlo) Capacidade para afectar apoptose induzida por AFP AFP *CCRGDVLDC* + 12 Completa abolição (apociclina-A) AFP CGRGDVLDC -12 Sem efeito AFP RGDVLD + 10 Sem efeito HSA *CCHGDLLEC + 18 Completa abolição 30 - PE1558649 HSA * HGDLLE + 20 Sem efeito * Péptidos ciclicos 1) 1 Efeito directo dos péptidos na dose 1 mM na proliferação de células U-937 em % do controlo sem adições. EXEMPLO 6 A apociclina-A sinergiza com doses baixas subóptimas de citocromo c endógeno para induzir a activação de caspases num sistema sem células
Para determinar se a apociclina-A pode operar semelhantemente à molécula AFP inteira para suportar a activação de caspases num sistema sem células, estabelecemos o mesmo sistema sem células, tal como descrito acima, mas em vez de AFP foi utilizado o péptido ciclico apociclina-A. A Fig. 8 demonstra que a apociclina-A aumentou sinergisticamente a actividade total da caspase-3 num sistema sem células na presença das doses subóptimas de citocromo c endógeno e dATP. Sem adição de dATP a apociclina-A foi incapaz de induzir actividade de DEVD-ase nas mesmas condições experimentais. O mesmo efeito foi observado para a AFP inteira nos extractos sem células "silenciosos". Estes dados mostram que fomos capazes de identificar o local activo de AFP e da albumina responsável pela sua actividade promotora de apoptose. EXEMPLO 7 AFP sinergiza com doses subóptimas de citocromo c e dATP para induzir a activação da caspase-3 em extractos celulares citosólicos - 31 - ΡΕ1558649
Testámos mais a capacidade de AFP para induzir actividade de caspases num sistema sem células. A adição de AFP ao extracto citosólico S100 desencadeou a indução dependente de dATP da actividade de DEVDase específica da caspase-3, que progressivamente aumentou durante pelo menos 2 h (Fig. 7A) . Como controlo, foi adicionada a quantidade equivalente de albumina do soro humano (HSA) no mesmo sistema sem células e não mostrou qualquer efeito ao nivel da actividade de DEVDase. Um grau baixo de actividade de DEVDase foi também causado por apenas dATP e foi evidentemente devido à presença de uma pequena quantidade de cit-c endógeno nas preparações. Na ausência de dATP, AFP não induziu qualquer activação de caspases. Para determinar se a AFP pode induzir directamente activação de caspases em extractos celulares citosólicos, ou requer a presença de um nível basal de cit-c, examinámos a actividade de clivagem por DEVDase após adição de cit-c exógeno aos extractos citosólicos "silenciosos" com um nível indetectável de citocromo c endógeno. A Fig. 7B mostra que não foi detectada qualquer actividade de DEVDase neste tipo de lisados citosólicos mesmo após duas horas de tratamento na presença de dATP e dose baixa subóptima de cit-c. No entanto, a adição de AFP (7 μΜ) no mesmo sistema de reacção desencadeou o processo de activação de caspases, que aumentou progressivamente de um modo dependente do tempo (Fig. 7B) .
EXEMPLO 8 Abolição da activação de caspases mediada por Cit c/AFP num sistema sem células através de apociclina-A - 32 - ΡΕ1558649 A Fig. 8 mostra que os efeitos da apociclina-A na activação da caspase-3 foram mediados por várias doses de citocromo c e AFP. Uma dose elevada do péptido (750 μΜ) inibiu significativamente (50-70%) a activação de caspases induzida por doses elevadas de citocromo c endógeno (Fig. 8A). O tratamento combinado da fracção citosólica com citocromo c/AFP resultou num aumento significativo da actividade de DEVDase total (Fig 8, A e B) . A adição de apociclina-A inibiu a activação de caspases mediada por Cit c/AFP em 60-80%. Estes dados indicam que a apociclina-A opera num sistema sem células de um modo oposto ao da molécula de AFP inteira, através de abolição do efeito total de activação de caspases induzido pelo cit c sozinho ou em composição com AFP. Portanto, a apociclina-A representa a sequência na molécula de AFP que é responsável pela sua actividade apoptótica e pela interacção com os membros da montagem do apoptossoma. EXEMPLO 9 Efeitos dos péptidos derivados de AFP e derivados de HSA na activação de caspases mediada por Cit c dependente de dATP em extractos citosólicos sem células
Para testar a capacidade de vários péptidos para afectar a activação de caspases induzida por citocromo c exógeno num sistema sem células, utilizámos extractos celulares citosólicos de células HepG2. Alíquotas de extractos celulares foram pré-tratadas com 750 μΜ de péptidos durante 15 min e a partir dai foram introduzidas várias doses de citocromo c na mistura reaccional para ΡΕ1558649 - 33 - induzir a activação de caspases. Os extractos de controlo foram incubados com dATP sem péptidos e citocromo c mas não revelaram qualquer actividade de caspases. Observa-se a partir da Fig. 9A que os péptidos de AFP, o péptido 9-mero apociclina-A e o péptido β-mero RGDVLD bem como o péptido 6-mero de HSA, HGDLLE, induziram uma inibição significativa da activação de caspases mediada por dose elevada de citocromo c. Por outro lado, o péptido 9-mero monomérico ciclico com uma única substituição de aminoácidos *CGRGDVLDC*, bem como o péptido multimérico ciclico de HSA *CCHGDLLEC*, não mostraram actividade de inibição de apoptose em células inteiras nem num sistema sem células. Assim, o péptido mais potente apociclina-A imita o local activo de AFP, que é responsável pela sinalização de apoptose. Um efeito distintamente diferente foi obtido para a activação de caspases induzida por dose baixa de citocromo c. A Fig. 9B mostra que a apociclina-A produziu a mesma estimulação que a molécula de AFP inteira na activação de caspases induzida por dose baixa de citocromo c. Os péptidos *CGRGDVLDC* e *CCHGDLLEC* não tiveram efeito na actividade do citocromo c a dose baixa, mas os péptidos RGDVLD e HGDLLE demonstraram uma abolição significativa da activação de caspases induzida por citocromo c. A Tabela 2 resume os dados experimentais que caracterizam a actividade dos péptidos em extractos citosólicos sem células.
Tabela 2. Modulação da actividade de DEVDase mediada por - 34 - PE1558649
Cit c através de vários péptidos num sistema sem células
Sequência Efeito na activação de caspases induzida por dose elevada de Cit c Capacidade para afectar a activação de caspases induzida por AFP e dependente de Cit c Efeito na activação de caspases induzida por dose baixa de Cit c *CCRGDVLDC* 50-80% de 70-80% de 30% de abolição abolição estimulação CGRGDVLDC sem efeito sem efeito sem efeito RGDVLD 80% de abolição sem efeito 30-50% de abolição *CCHGDLLEC* sem efeito sem efeito sem efeito HGDLLE 90% de abolição sem efeito 70% de abolição AFP inteira 80% de abolição - 50% de estimulação * Péptidos cíclicos
Lisboa, 8 de Setembro de 2010
Claims (4)
- ΡΕ1558649 - 1 - REIVINDICAÇÕES 1. Péptido correspondendo ao local apoptoticamente activo da alfa-fetoproteína humana localizada nos resíduos de aminoácidos 251-259 da referida proteína, possuindo a sequência de aminoácidos C*C*RGDVLDC*, em que os resíduos do asterisco denotam locais de possíveis liqações dissulfureto.
- 2. Péptido de acordo com a reivindicação 1 possuindo uma estrutura linear.
- 3. Péptido de acordo com a reivindicação 1 possuindo uma estrutura polimerizada ou cíclica.
- 4. Utilização do péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 para preparação de uma preparação para prevenção in vitro de apoptose de células cultivadas preparadas para fins científicos ou técnicos. Lisboa, 8 de Setembro de 2010
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