CN101812448B

CN101812448B - 一种肝癌靶向双重组凋亡蛋白表达序列及应用

Info

Publication number: CN101812448B
Application number: CN2010100397925A
Authority: CN
Inventors: 曹江; 毛晨宇; 陈萍; 王浩浩; 陈喆; 滕理送
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-01-15
Filing date: 2010-01-15
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2030-01-15
Also published as: CN101812448A

Abstract

本发明提供一种肝癌靶向双重组凋亡蛋白表达序列，是一种特异性AFP启动子调控Caspase 3和Granzyme B两个凋亡蛋白表达的DNA序列，具有SEQID No：1所示的核苷酸序列。本发明利用AFP增强子/启动子转录调控元件的靶向调控作用，使外源基因只在AFP阳性的肝癌细胞内表达，从而实现靶向而高效的抗肿瘤效果；构建了重组活化型Caspase-3分子，并将它应用于对靶细胞的促凋亡作用；引入了颗粒酶B，将颗粒酶B与重组活化型Caspase-3融合，介导靶细胞的凋亡。可在制备治疗AFP阳性的肝癌的靶向基因药物中的应用。

Description

一种肝癌靶向双重组凋亡蛋白表达序列及应用

技术领域

本发明属生物技术，涉及基因表达调控，具体地说，涉及一种特异性针对甲胎蛋白阳性肝癌的重组凋亡促进蛋白表达的DNA的设计、制备及其在甲胎蛋白阳性的肝癌细胞内特异表达、其产物可以有效地诱导肝癌细胞凋亡。本发明可用于制备靶向性肿瘤基因治疗药物。

背景技术

复制缺陷型腺病毒是腺病毒载体中最经典的一种形式，它是一类不能在细胞内增殖的腺病毒，仅起到运输载体的作用，能携带外源基因靶向转导入细胞内，通过外源基因的表达产物影响细胞的生长，从而起到基因治疗的作用。根据复制缺陷型腺病毒的作用机理，要想提高它的治疗效果，就必须着重在三个方面进行改进：一是提高腺病毒携带外源基因的能力，二是利用合适的构建策略使病毒对肿瘤细胞具有靶向性，三是选择合适的抗癌基因。

为了提高腺病毒载体携带外源基因的能力，经过数十年的努力，到目前为止，已发展出了不同类型的腺病毒载体，根据病毒基因置换程度可分为第一代、第二代和第三代腺病毒载体。所谓第一代腺病毒载体即复制缺陷型腺病毒，是将外源基因替代病毒复制所必需的E1基因区域，可去除或不去除E3基因区域。这种腺病毒最多可容纳约8.2kb的外源基因，可同时感染静止期和增殖期的细胞，现已广泛应用并成功构建出了一系列载体。第二代腺病毒载体是在第一代的基础上又去除了E2基因区域，可去除或不去除E4区域。这类腺病毒由于E2病毒基因的缺失或突变，减弱了病毒蛋白的表达，并且加入了可以调控基因表达的因子，消除了复制DNA和产生可复制腺病毒的可能性。另外，E4基因编码的产物参与了病毒复制的多个环节，它的去除可影响病毒的复制从而不激发免疫反应。但是，这些改进方式的效果如何，目前仍有争议。为了获得更适合于基因治疗的腺病毒载体，第三代腺病毒载体应运而生。第三代腺病毒又称辅助病毒载体，它去除了所有的编码病毒基因，只保留两端的ITRs和包装信号，在产生有效病毒颗粒过程中需要辅助病毒和合适的互补包装细胞。它不仅继承了前述腺病毒载体的优点，还具有其独特性的优点，如外源DNA的装载容量大大提高，可达37kb；缺失全部的腺病毒蛋白编码序列，感染之后不会有病毒蛋白表达，安全性得到提高；外源基因的表达时相明显延长；血清型是由辅助病毒决定的，采用不同血清型的辅助病毒，可以实现载体血清型转换，因此可以实现反复应用，而无需担心机体所产生的抗腺病毒中和抗体的影响。虽然第三代腺病毒优点明显，其生产过程却是困扰其应用发展的一大因素，生产技术方面仍存在难题，目前还只停留在研究阶段。

如何对腺病毒载体进行改造使其对肿瘤细胞具有靶向性？目前的策略主要包括靶向性导入和靶向性转录两个方面。通过改造病毒衣壳蛋白或利用双功能连接物增加腺病毒感染肿瘤细胞的能力，使病毒靶向导入到细胞内；也可以利用组织或肿瘤特异性基因的启动子或增强子等调控序列(hTERT、COX2、PSA等包括组织特异性启动子(AFP启动子用于肝癌、PSA启动子用于前列腺癌、CEA启动子用于肠癌和广谱的肿瘤特异性启动子hTERT启动子)，均取得了一定效果。为增强腺病毒杀伤肿瘤细胞的能力，必须将外源的抗癌基因导入到肿瘤细胞内。常用的抗癌基因包括肿瘤抑制基因(p53，Rb，LFIRE，LPTL，Cyld，PTEN，MnSOD等)、细胞凋亡诱导基因(TRAIL，Smac，IL-24，Caspase-3等)、免疫调节因子(GM-CSF，IL-2，IL-12，CD40L，MIP-3a等)、血管生成抑制因子(K5，PEDF，SFLK1，sFlt-1，VEGF，内皮抑素等)和自杀基因(tk，cd等)。这些外源基因的表达产物能够通过各种途径影响肿瘤细胞正常的新陈代谢，最终导致细胞死亡。

在本专利中，改造后的甲胎蛋白(a-fetoprotein，AFP)启动子被引入到腺病毒载体中。在非病理状态下，AFP在正常组织中是不表达的，只在胎儿肝中特异性激活，而在肝癌细胞和组织中，AFP往往被活化而呈高表达的状态，临床上人血清中AFP水平已经用来指导肝癌的早期诊断、判断疗效和预后。因此，AFP启动子作为一种肿瘤选择性启动子，是比较适合用来调控外源基因在肝癌细胞内特异性表达的。鉴于AFP在不同细胞和组织内的表达水平的差异，有研究者仔细分析了AFP增强子的序列，通过比较AFP基因上游不同长度的序列调控下游基因的转录水平，发现存在于-4.1kb至-3.3kb一段长约821bp的序列对下游基因的转录有较强的增强作用，再进一步分析这段序列的结构，发现它包含domain A(-4120至-3756)、domain B(-3492至-3300)和间隔部分(-3755至-3493)三个部分，通过比较domain A(365bp)、domainB(192bp)、间隔部分(263bp)及全长(821bp)四种序列对下游基因表达的增强效率，发现同时包含domain A、domain B和间隔部分这种全长结构的增强效率是最高的。因此，本专利采用了这段长821bp的序列作为AFP增强子，同时与AFP启动子连接，构成了AFP增强子/启动子转录调控元件，用来调控腺病毒载体中外源基因的表达。同时，本专利引入了热门的具有较强促凋亡作用的双重凋亡蛋白Caspase-3和Granzyme B作为载入基因克隆入腺病毒载体的AFP启动子后。现在一般认为caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用，caspase-3基因转染昆虫Sf9细胞后引起细胞凋亡，这个过程可以被BCL-2阻断；在发生凋亡的细胞提取液中去除caspase-3后，这些提取液就失去了诱导细胞凋亡的能力；再加入纯化的caspase-3它就又恢复了致凋亡的功能。颗粒酶是外源性的丝氨酸蛋白酶，来自细胞毒淋巴细胞(CTLs)和自然杀伤细胞(NK)释放的细胞浆颗粒。这些颗粒含有颗粒酶原及其它蛋白酶原，包括穿孔蛋白。由于CTL细胞与靶细胞结合(经靶细胞表面的CTL受体和MHC分子的抗原结合)，颗粒的内容物释放，颗粒酶进入了靶细胞，穿孔蛋白进入了靶细胞通过在细胞膜的聚合形成了靶细胞膜的小孔，使细胞膜穿孔，最后穿孔蛋白使颗粒酶的膜穿孔引起颗粒酶的释放。在细胞浆内，颗粒酶B能通过三种不同的途径激起细胞的死亡，首先激起caspases的链锁反应，引起靶细胞DNA降解活动，然后裂解。

发明内容

本发明的目的是提供一种肝癌靶向双重组凋亡蛋白表达序列，是一种人工核酸分子，是一种特异性AFP启动子调控Caspase 3和Granzyme B两个凋亡蛋白表达的DNA序列，具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，其中第7位至第827位为人AFP基因转录起始点上游第-4113位至第-3292位，该区域含有多个转录增强因子和肝细胞核因子结合位点；第831位至第1012位为人AFP基因转录起始点上游第-182位至第-1位，该区域含有AFP的基本启动子功能；从第1位至第1012位的1012bp片段组成重组的AFP阳性细胞表达调控序列；第1019位至第2175位为重组人Caspase 3，第2176至3125位为重组人Granzyme B；第3126位至第3474位为牛生长激素基因多聚腺苷酸信号区，为基因表达提供转录终止信号。

本发明的另一个目的是提供该DNA序列在制备治疗AFP阳性的肝癌的靶向基因药物中的应用。该DNA序列在导入AFP阳性的肿瘤细胞后，可以在细胞中表达重组的促进细胞凋亡的Caspase 3和Granzyme B，有效地诱导肝癌细胞凋亡。所述DNA序列可用于构建靶向性基因治疗药物的载体，该DNA序列中的重组AFP表达调控元件可用于调控其它基因的表达、重组的Caspase 3和Granzyme B序列可以用于其它表达载体达到诱导相应细胞凋亡目的。

本发明同现有技术相比具有以下优点及效果：

利用本发明提供的表达元件可以制备的基因治疗药物，其特点在于以肝癌细胞特异性表达的胚胎性抗原AFP为肿瘤细胞特异性表达调控手段、以重组的活化型细胞凋亡相关蛋白Caspase 3和Granzyme B两个蛋白为目的基因，有效地诱导AFP阳性的肝癌细胞的凋亡。

本申请中，利用AFP增强子/启动子转录调控元件的靶向调控作用，使外源基因只在AFP阳性的肝癌细胞内表达，从而实现靶向而高效的抗肿瘤效果；构建了重组活化型Caspase-3分子，并将它应用于对靶细胞的促凋亡作用；引入了颗粒酶B，将颗粒酶B与重组活化型Caspase-3融合，介导靶细胞的凋亡。

附图说明

图1为载体构建示意图。

图2为病毒体外细胞杀伤试验。

图3为Ad5-reCASP3GB的体内抗瘤活性。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1：人甲胎蛋白增强子和启动子的克隆及转录调控元件的构建

自新鲜的正常人血中抽提基因组DNA，利用特征性引物应用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术扩增人甲胎蛋白增强子和启动子，从而构建包含了AFP增强子和启动子的转录调控元件。

AFP增强子的上下游引物序列分别为：

Seq No.2 5’-AGA TCT CAG ATT GAA TTA TTT GCC TGT CA-3’

Seq No.3 5’-GGA TCC TAG GAA GTT TTC GCA ATA ATA C-3’

AFP启动子的上下游引物序列分别为：

Seq No.4 5’-GGA TCC AAA TCA TGC TGA AAT TCT TTT ATA CTC-3’

Seq No.5 5’-AGA TCT GCC CCA AAG AGC TCT GTG T-3’。

以Seq No.2和Seq No.3为引物从基因组中扩增AFP增强子，PCR扩增条件是预变性95℃5min，接着(95℃30s，52℃30s，72℃30s)扩增30个循环，最后72℃延伸10min，回收821bp片断，此即为AFP增强子片断；以SeqNo.4和Seq No.5为引物从基因组中扩增AFP启动子，PCR扩增条件是预变性95℃5min，接着(95℃30s，52℃30s，72℃30s)扩增30个循环，最后72℃延伸10min，回收180bp片断，此即为AFP启动子片断；最后，以Seq No.2和Seq No.5为引物，以上述扩增片断为模板，扩增包含了AFP增强子和启动子的转录调控元件。其序列结果见附件序列.

经与Genbank标准序列NT_006216.14比对，结果表明该转录调控元件序列正确。

实施例2：重组活化Caspase-3基因的构建、Granzyme B基因的克隆及腺病毒穿梭质粒的构建(引物序列详见附件)

以P1(Seq No.6)和P2(Seq No.7)以及P1(Seq No.6)和P7(Seq No.12)为引物，从pcDNA4/HisMax

A vector中扩增SP163序列，此序列可增强所调控基因的蛋白表达水平；以P3(SEQ NO.8)和P4(SEQ NO.9)为引物，从人基因组DNA中扩增Caspase-3小亚基单位；以P5(SEQ NO.10)和P6(SEQ NO.11)为引物，从人基因组DNA中扩增Caspase-3大亚基单位；以P8(SEQ NO.13)和P9(SEQ NO.14)为引物，从人基因组DNA中扩增Granzyme B基因序列。通过连接反应，将所扩增的基因片断与AFP转录调控元件及Poly A尾连接，构建成完成的表达框。构建过程示意参见图1，通过酶切连接反应，将上述的三种表达框分别插入到腺病毒穿梭质粒pDC312中，从而成功构建了由AFP增强子/启动子调控，且分别含有人重组活化Caspase-3基因序列和Granzyme B基因序列、人重组活化Caspase-3基因序列或Granzyme B基因序列的重组腺病毒穿梭质粒载体。利用AdMax^TM System腺病毒包装试剂盒，将腺病毒穿梭质粒与骨架质粒同源重组，从而成功获得三种复制缺陷型腺病毒，分别命名为Ad5-reCASP3GB、Ad5-reCASP3和Ad5-GB。

P1(Seq No.6)：5’-AGA TCT GGC TAA CTA GAG AAC CCA-3’

P2(Seq No.7)：5’-CCA CTG TCT GTC TCA ATC ATG GTT TCG GAG GCC GTC CGG-3’

P3(SEQ NO.8)：5’-CCG GAC GGC CTC CGAAAC CAT GAT TGA GAC AGA CAG TGG-3’

P4(SEQ NO.9)：5’-GGA TCC CCC ATC AAC TTC ATC GTG ATA AAA ATA GAG TTC-3’

P5(SEQ NO.10)：5’-AGATCT CCC ATG GAG AAC ACT GAAAAC TCA G-3′

P6(SEQ NO.11)：5’-GGA TCC GTC ATC ATC AAC ACC TCA GTC T-3′

P7(Seq No.12)：5’-GCC TCA TGT CCC CCG ATG ATC ATG GTT TCG GAG GCC GTC CGG-3’

P8(SEQ NO.13)：5’-CCG GAC GGC CTC CGA AAC CAT GAT CAT CGG GGG ACA TGA GGC-3’

P9(SEQ NO.14)：5’-GGA TCC TTA GTA GCG TTT CAT GGT TT-3′

实施例3腺病毒Ad5-reCASP3GB、Ad5-reCASP3和Ad5-GB对肝癌细胞和非肝癌细胞的杀伤效果

取对数生长期的肝癌细胞Hep3B、HepG2、SMMC7721和非肝癌细胞Bcap37，按2×10³细胞/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时使其贴壁。用培养基稀释腺病毒至适当浓度，将Ad5-reCASP3GB、Ad5-reCASP3和Ad5-GB和Ad5-GFP以MOI为200pfu/cell、100pfu/cell、50pfu/cell、10pfu/cell、1pfu/cell和0pfu/cell感染细胞。在病毒感染4天后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20ul，37℃继续培养4hr，中止培养。弃去培养上清液，每孔加入DMSO 200ul，振荡10min，使结晶物充分溶解。选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔OD值。计算存活率：细胞存活率＝(病毒作用组OD值/病毒未作用组OD值)×100％。本试验每组设立5复孔，重复3遍。其结果参见图2。其中，图2A为Ad5-reCASP3GB、Ad5-reCASP3Ad5-GB和Ad5-GFP作用于Hep3B；图2B为Ad5-reCASP3GB、Ad5-reCASP3Ad5-GB和Ad5-GFP作用于HepG2；图2C为Ad5-reCASP3GB、Ad5-reCASP3Ad5-GB和Ad5-GFP作用于SMMC7721；图2D为Ad5-reCASP3GB、Ad5-reCASP3Ad5-GB和Ad5-GFP作用于Bcap37。

由图2可知，复制缺陷型腺病毒Ad5-reCASP3GB、Ad5-reCASP3、Ad5-GB对多种AFP阳性的肝癌细胞(Hep3B、HepG2、SMMC7721)均有强大的杀伤效果，在MOI为10pfu/cell时就能有效地抑制肿瘤细胞的生长，但对AFP阴性的乳腺癌细胞(Bcap37)却无杀伤效果，在MOI为200pfu/cell时，细胞存活率仍在90％以上；Ad5-GFP不论对AFP阳性的肝癌细胞和AFP阴性的乳腺癌细胞均无杀伤效果。

实施例4：复制缺陷型腺病毒Ad5-reCASP3GB的体内抗瘤活性

收集对数生长期的肝癌细胞株Hep3B细胞在BALB/c-nu裸鼠(六周龄，雄性)右背部皮下植瘤(浓度为2.5×10⁷/ml，200ul/只)。取瘤体直径长至4～5mm的成瘤裸鼠24只随机分为三组：Ad5-reCASP3GB治疗组(8只)、Ad5-GFP治疗组(8只)和PBS对照组(8只)。以瘤内注射的方式对各组分别进行处理，在首次病毒注射前记录瘤体初始大小，以首次治疗时间记为第1天，分别在第1天、第4天、第7天注射2×10⁸pfu/100ul/只的病毒量，PBS对照组在相同时间点注射100ul/只的PBS。在首次病毒注射后，每3天或4天测量瘤体大小一次，共8次。瘤体体积计算公式：V＝(a×b²)/2，a：瘤体长径(mm)b：瘤体短径(mm)。其结果见图3所示。

由上图可见，复制缺陷型腺病毒Ad5-reCASP3GB在裸鼠体内有很好的抗瘤活性，与对照组(PBS组)和Ad5-GFP治疗组相比，Ad5-miRNA5G治疗组的瘤体生长被得到了显著地抑制(P＜0.01)。

本发明涉及的序列

<160>14

<210>1

<211>3474

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>一种肝癌靶向双重组凋亡蛋白表达序列及应用

<400>1

agatctcaga ttgaattatt tgcctgtcat acagctaata attgaccata agacaattag 60

atttaaatta gttttgaatc tttctaatac caaagttcag tttactgttc catgttgctt 120

ctgagtggct tcacagactt atgaaaaagt aaacggaatc agaattacat caatgcaaaa 180

gcattgctgt gaactctgta cttaggacta aactttgagc aataacacat atagattgag 240

gattgtttgc tgttagtata caaactctgg ttcaaagctc ctctttattg cttgtcttgg 300

aaaatttgct gttcttcatg gtttctcttt tcactgctat ctatttttct caaccactca 360

catggctaca ataactgtct gcaagcttat gattcccaaa tatctatctc tagcctcaat 420

cttgttccag aagataaaaa gtagtattca aatgcacatc aacgtctcca cttggagggc 480

ttaaagacgt ttcaacatac aaaccgggga gttttgcctg gaatgtttcc taaaatgtgt 540

cctgtagcac atagggtcct cttgttcctt aaaatctaat tacttttagc ccagtgctca 600

tcccacctat ggggagatga gagtgaaaag ggagcctgat taataattac actaagtcaa 660

taggcataga gccaggactg tttgggtaaa ctggtcactt tatcttaaac taaatatatc 720

caaaactgaa catgtactta gttactaagt ctttgacttt atctcattca taccactcag 780

ctttatccag gccacttatt tgacagtatt attgcgaaaa cttcctagga tctgccccaa 840

agagctctgt gtccttgaac ataaaataca aataaccgct atgctgttaa ttattggcaa 900

atgtcccatt ttcaacctaa ggaaatacca taaagtaaca gatataccaa caaaaggtta 960

ctagttaaca ggcattgcct gaaaagagta taaaagaatt tcagcatgat ttggatctag 1020

atctggctaa ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaattaatac gactcactat 1080

agggagaccc aagctggcta gcgtttaaac ttaagcttag cgcagaggct tggggcagcc 1140

gagcggcagc caggccccgg cccgggcctc ggttccagaa gggagaggag cccgccaagg 1200

cgcgcaagag agcgggctgc ctcgcagtcc gagccggaga gggagcgcga gccgcgccgg 1260

ccccggacgg cctccgaaac catgattgag acagacagtg gtgttgatga tgacatggcg 1320

tgtcataaaa taccagtgga ggccgacttc ttgtatgcat actccacagc acctggttat 1380

tattcttggc gaaattcaaa ggatggctcc tggttcatcc agtcgctttg tgccatgctg 1440

aaacagtatg ccgacaagct tgaatttatg cacattctta cccgggttaa ccgaaaggtg 1500

gcaacagaat ttgagtcctt ttcctttgac gctacttttc atgcaaagaa acagattcca 1560

tgtattgttt ccatgctcac aaaagaactc tatttttatc acgatgaagt tgatggggga 1620

tctcccatgg agaacactga aaactcagtg gattcaaaat ccattaaaaa tttggaacca 1680

aagatcatac atggaagcga atcaatggac tctggaatat ccctggacaa cagttataaa 1740

atggattatc ctgagatggg tttatgtata ataattaata ataagaattt tcataaaagc 1800

actggaatga catctcggtc tggtacagat gtcgatgcag caaacctcag ggaaacattc 1860

agaaacttga aatatgaagt caggaataaa aatgatctta cacgtgaaga aattgtggaa 1920

ttgatgcgtg atgtttctaa agaagatcac agcaaaagga gcagttttgt ttgtgtgctt 1980

ctgagccatg gtgaagaagg aataattttt ggaacaaatg gacctgttga cctgaaaaaa 2040

ataacaaact ttttcagagg ggatcgttgt agaagtctaa ctggaaaacc caaacttttc 2100

attattcagg cctgccgtgg tacagaactg gactgtggca ttgagacaga cagtggtgtt 2160

gatgatgacg gatctggcta actagagaac ccactgctta ctggcttatc gaaattaata 2220

cgactcacta tagggagacc caagctggct agcgtttaaa cttaagctta gcgcagaggc 2280

ttggggcagc cgagcggcag ccaggccccg gcccgggcct cggttccaga agggagagga 2340

gcccgccaag gcgcgcaaga gagcgggctg cctcgcagtc cgagccggag agggagcgcg 2400

agccgcgccg gccccggacg gcctccgaaa ccatgatcat cgggggacat gaggccaagc 2460

cccactcccg cccctacatg gcttatctta tgatctggga tcagaagtct ctgaagaggt 2520

gcggtggctt cctgatacaa gacgacttcg tgctgacagc tgctcactgt tggggaagct 2580

ccataaatgt caccttgggg gcccacaata tcaaagaaca ggagccgacc cagcagttta 2640

tccctgtgaa aagacccatc ccccatccag cctataatcc taagaacttc tccaacgaca 2700

tcatgctact gcagctggag agaaaggcca agcggaccag agctgtgcag cccctcaggc 2760

tacctagcaa caaggcccag gtgaagccag ggcagacatg cagtgtggcc ggctgggggc 2820

agacggcccc cctgggaaaa cactcacaca cactacaaga ggtgaagatg acagtgcagg 2880

aagatcgaaa gtgcgaatct gacttacgcc attattacga cagtaccatt gagttgtgcg 2940

tgggggaccc agagattaaa aagacttcct ttaaggggga ctctggaggc cctcttgtgt 3000

gtaacaaggt ggcccagggc attgtctcct atggacgaaa caatggcatg cctccacgag 3060

cctgcaccaa agtctcaagc tttgtacact ggataaagaa aaccatgaaa cgctactaag 3120

gatccggatc cactagtcca gtgtggtgga attctgcaga tatccagcac agtggcggcc 3180

gctcgagtct agagggcccg tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg 3240

ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc 3300

cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc 3360

tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag 3420

gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca gctg 3474

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增AFP增强子DNA序列的上游引物

<400>2

AGATCTCAGA TTGAATTATT TGCCTGTCA 29

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增AFP增强子DNA序列的下游引物

<400>3

GGATCCTAGG AAGTTTTCGC AATAATAC 28

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增AFP启动子DNA序列的上游引物

<400>4

GGATCCAAAT CATGCTGAAA TTCTTTTATA CTC 33

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增AFP启动子DNA序列的下游引物

<400>5

AGATCTGCCC CAAAGAGCTC TGTGT 25

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增SP163序列的上游引物P1

<400>6

AGATCTGGCT AACTAGAGAA CCCA 24

<210>7

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增SP163序列的下游引物P2

<400>7

CCACTGTCTG TCTCAATCAT GGTTTCGGAG GCCGTCCGG 39

<210>8

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增Caspase-3小亚基单位DNA序列的上游引物P3

<400>8

CCGGACGGCC TCCGAAACCA TGATTGAGAC AGACAGTGG 39

<210>9

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增Caspase-3小亚基单位DNA序列的下游引物P4

<400>9

GGATCCCCCA TCAACTTCAT CGTGATAAAA ATAGAGTTC 39

<210>10

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增Caspase-3大亚基单位DNA序列的上游引物P5

<400>10

AGATCTCCCA TGGAGAACAC TGAAAACTCAG 31

<210>11

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增Caspase-3大亚基单位DNA序列的下游引物P6

<400>11

GGATCCGTCA TCATCAACAC CTCAGTCT 28

<210>12

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增SP163序列的下游引物P7

<400>12

GCCTCATGTC CCCCGATGAT CATGGTTTCG GAGGCCGTCC GG 42

<210>13

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增Granzyme B基因DNA序列的上游引物P8

<400>13

CCGGACGGCC TCCGAAACCA TGATCATCGG GGGACATGAG GC 42

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增Granzyme B基因DNA序列的下游引物P9

<400>14

GGATCCTTAG TAGCGTTTTCA TGGTTT 26

Claims

1.一种肝癌靶向双重组凋亡蛋白表达序列，是一种特异性AFP启动子调控Caspase 3和Granzyme B两个凋亡蛋白表达的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.权利要求1所述的一种肝癌靶向双重组凋亡蛋白表达序列在制备治疗AFP阳性的肝癌的靶向基因药物中的应用。