CN1703428A - 调节caspase活化的肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能够调节凋亡性细胞死亡的小分子结构。更具体地，该结构涉及哺乳动物α－胎蛋白(AFP)和白蛋白的凋亡活性位点的结构。模拟活性位点的肽包含两种序列：Arg－Gly－Asp和Asp－X－X－Asp，其中X为任意氨基酸。对导致各种生物活性来说，这些序列需要存在于同一分子中。该肽可以通过抑制细胞色素c介导的caspase活化来阻断凋亡通路。因此，该肽可用于抑制氧胁迫、药物、细胞因子、Fas配体、α－胎蛋白诱导的凋亡效应，用于防止培养的细胞中、器官移植中、免疫性自身免疫病和病毒感染所致免疫缺陷综合征中的凋亡，或用于降低化疗和放疗后的细胞毒副作用。

Description

调节caspase活化的肽
发明领域
本发明涉及药物和人类与动物细胞的死亡机制。具体地说，其涉及能够抑制各种因素所导致的凋亡性细胞死亡的肽。本发明描述了具有这种活性的肽和产生及使用所述肽的方法。
发明背景
凋亡是参与正常细胞发育和恶性肿瘤细胞转化的细胞死亡的有效形式。凋亡机制涉及由各种类型药物、细胞因子和生长因子、氧胁迫、辐射、衰老、自身免疫病和器官移植中的免疫排斥所导致的生物事件。最近对凋亡的研究表明激素、细胞因子、生长因子缺失、化疗药物、离子辐射、免疫性病症、AIDS、癌症和衰老所诱导的各种类型凋亡采用共同的分子机制(Nagata，(1997)Cell 88，355-365)。
caspase蛋白酶的级联活化是凋亡诱导中的基本点(Cohen，et al.(1997)Biochem.J，326：1-16)。描述了两种不同类型的凋亡信号传导。受体依赖的凋亡引发初期包括特异性配体对适当死亡受体的活化，所述特异性配体如TNF或FasL，其是目前研究最多的凋亡诱导剂(Wallach et al.(1997).FEBSLetters，410：96-106)。活化时，细胞表面死亡受体Fas(CD95)或TNFR1与胞质衔接蛋白质(FADD、MORT、RIP、TRADD)结合，募集caspase-8，以活化白介素-1-β-转化酶ICE/CED-3家族蛋白酶(caspase)级联，然后活化半胱氨酸蛋白酶中的CPP32/caspase-3亚家族，其成员以潜伏前体precaspase形式出现在细胞质中(Enari，et al.(1996)Nature 380：723-726)。非受体依赖型的凋亡通常包括非常重要的细胞色素c诱导的机制，其需要形成细胞色素c、dATP、Apaf 1和procaspase-9的三级复合体，通过自我蛋白酶解和同源二聚化导致后者的活化，以及随后的caspase级联活化(Liu et al.(1996)Cell，86：147-157；Pan et.al.，(1998)FEBSLetters，426：151-154；Slee et al.，(1999)J Cell Biol.，144：281-292)。
因此影响对凋亡的生物控制的试剂在各种临床适应症中具有潜在的治疗性用途。已使用各种植物来源的凋亡抑制剂来筛选经常伴随化疗、辐射、免疫性病症或AIDS的病理性病症。这些添加物通常含有碳水化合物、脂肪和植物蛋白水解物、凝集素和磷脂(US6004579，Barr等)。有效的凋亡调节剂可以用来治疗癌症患者，以控制细胞因子治疗、化疗或放疗。凋亡机制在各种类型的免疫性病症中起作用，所述病症如自身免疫性恶性肿瘤、器官移植或过敏反应中的免疫排斥或人免疫缺陷病毒的病毒感染。
α-胎蛋白(AFP)是肿瘤相关的胎儿糖蛋白，其表现出各种生物活性，包括细胞生长调节、未成熟细胞的分化、活化的免疫细胞的免疫抑制、凋亡的肿瘤特异性诱导和对各种因素介导的凋亡信号的调节，以及对各种基因表达的调节(Deutsch，(1991)Adv.Cancer Res.，56：253-312；Mizejewsky，(1997)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，215：333-362)。已经有多项证据报道了下列物质的细胞生长调节活性，包括抑制活性：各物种全长AFP分子(Semenkova et al.，(1997)Tumor Biology，18：261-274；Semeniuk et al，(1995)Ad Exper. Med. Biol.，383：255-269；Sonnenschein et al.，(1980)J Natl Cancer Inst.，64：1141-1146；Soto et al.，(1980)Proc.Natl Acad. Sci USA，77：2084-2087；Jacobson et al.，(1999)Cancer Research，50：415-420)、其蛋白酶解片段(Dudich et al.，(1999)Biochemistry，38：10406-10414)或重组结构域(Festin et al.，(1999)Biochim.Biophys.Acta，1427：307-314)和合成肽(Mesfin et al.，(2000)Biochim.Biophys.Acta，1501：33-43；Mizejewsky，et al.，(1996)Mol. Cell. Endocr.，118：15-23(1996))。各研究者都已开始寻找AFP分子中负责其多种活性的功能性活化位点的定位。已经成功进行了花生四烯酸和雌二醇结合位点的定位(Deutsch，(1991)Adv. Cancer Res.，56：253-312；Mizejewski，(1997)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，215：333-362；Nishi et al.，(1993)TumorBiol.14：234-243)。
最近表明，AFP通过引发凋亡发挥其肿瘤抑制活性，所述凋亡通过caspase-3的活化，不依赖于Fas/FasL和TNF/TNFR信号传导(Dudich et al.，(1999)Eur.J Biochem.266：1-13；Semenkova et al.，(1997)Tumor Biology，18：261-274；Dudich et al.(1998)Tumor Biology，19：30-40)。近10年来，已经报道了AFP介导的肿瘤细胞生长抑制的多项证据，但是尚未鉴定到AFP分子中负责凋亡信号传导的活性位点。
已经报道了人AFP的DNA和氨基酸序列(Morinaga，et.al.，″Primary structures ofhuman alpha-fetoprotein and its mRNA″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：4604-4608(1983))。与E2结合位点相对应的合成肽表现出具有肿瘤抑制活性(US专利US5674842；10/1997 Mizejewsky；US5707963，07/1998 Mizejewsky)。各种生物活性蛋白质都具有和AFP同源的序列(Mizejewsky，(1993)BioEssays，15：427-432；Mizejewsky，(1997)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，215：333-362)。已经鉴定到了AFP和参与凋亡信号传导的各种蛋白质如Bcl2、TNFR1、Fas等的可靠同源性(Mizejewsky，(2001)Proc.Soc.Exp.Biol.Med)。WO 9835981 Al(Economou，J等，1998)描述了使用66种AFP肽序列对于免疫癌症是有用的。其中一种肽A20是CRGDVLDCL，本发明发现其正好包括AFP活性位点的一部分。但是，没有发现CRGDVLDCL的特殊效应，本发明仍然第一个鉴定到AFP中的一个假定生物活性位点。另外，本发明的肽包括一个额外的半胱氨酸残基，其能够形成链内二硫键，比CRGDVLDCL产生明显更高的生物活性。
一个重要的整合素结合位点是三肽Arg-Gly-Asp，其存在于各种整合素配体中。整合素是介导细胞-基质和细胞-细胞相互作用的异源二聚化糖蛋白，在细胞分化、免疫识别、肿瘤形成和转移性病灶的生长过程中具有作用。已经在整合素亚基中鉴定到了Arg-Gly-Asp序列的接触部分(参见Pasqualini，et al.″A peptide isolated from phagedisplay libraries is a structural and functional mimic of an Arg-Gly-Asp-binding site onintegrins.″J Cell Biol.(1995)130：1189-1196)。将含Arg-Gly-Asp基序的合成肽用作整合素-配体相互作用的抑制剂(D′Souza et al.(1988)Science，242：91-93)。已经报道含Arg-Gly-Asp基序的合成肽能够指导caspase-3活化(Bukley，et al.(1999)Nature，397：534-539)。AFP在其分子中含有Arg-Gly-Asp(RGD)序列，该序列位于结构域II中的第253-255位。根据本发明，RGD序列是参与凋亡信号传导的AFP功能活性位点的一部分。
本发明描述了AFP分子中负责凋亡信号传导的最小部分。小肽或其他小半抗原是用作药物的重要调控因子，因为它们能够在体外合成，且它们不产生中和性抗体。借助F-MOC固相化学，产生了含6-10个残基的肽。还合成了与人白蛋白(HAS)同源序列相对应的类似肽。在培养中的完整细胞中评价所有肽的生长调节活性，还测试了其直接诱导无细胞胞质提取物中caspase活化的能力。另外，还分析了这些肽调节完整细胞中AFP和抗-Fas细胞毒性Mab CH-11诱导的凋亡的能力，和影响无细胞体系中细胞色素c诱导的caspase活化的能力。
附图说明
图1所示为生物活性二聚化肽的示意图(单体为apocyclin-A；*Cys-Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*)。
图2说明多聚环9-肽apocyclin-A(*Cys-Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*)对AFP诱导的凋亡的抑制。微滴定孔中的U-937细胞用各种剂量的apocyclin-A处理15分钟，然后向每个孔中加入3μM的纯人AFP。24h孵育后，通过[3H]-胸苷掺入分析法评价细胞增殖。
图3说明多聚环9-肽apocyclin-A(*Cys-Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*)对U-937细胞中细胞毒性抗Fas单克隆抗体CH-11诱导的凋亡的影响。细胞用500μM的apocyclin-A处理15分钟，然后向每个孔中加入各剂量的细胞毒性抗Fas MabCH-11(Immunotech Ltd)。16h孵育后，通过[3H]-胸苷掺入分析法评价细胞增殖。
图4说明线性6-肽Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp(RGDVLD)和His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu(HGDLLE)对AFP介导的U-937细胞生长抑制的影响。细胞用各剂量的肽处理15分钟，然后向每个孔中加入3μM的纯人AFP。24h孵育后，通过[3H]-胸苷掺入分析法评价细胞增殖。
图5说明环单体9-肽*Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*(*CGRGDVLDC*)对AFP介导的人成髓细胞瘤细胞系U-937的生长抑制的影响。细胞用各剂量的肽处理15分钟，然后向每个孔中加入3μM的纯人AFP。24h孵育后，通过[3H]-胸苷掺入分析法评价细胞增殖。
图6说明环9-肽apocyclin-A(*CCRGDVLDC*)增强无细胞胞质提取物中由低剂量内源性Cyt c诱导的ATP依赖性pro-caspase-3活化。U937细胞的细胞提取物与各剂量的apocyclin-A与1 mM dATP一起孵育40分钟。无添加物的提取物作为对照。通过切割荧光底物DEVD-AFC来评价Caspase-3的活化。
图7说明人AFP对无细胞体系中细胞色素c介导的caspase活化的协同增强。(A)AFP在dATP的存在下诱导无细胞胞质提取物中caspase-3的活化。各份HepG2来源的胞质提取物(25μg蛋白质)在dATP(1mM)的存在下，用AFP(7μM)处理不同的时间间隔，或用相同剂量的HAS处理作为对照，然后分析DEVDase活性。(B)在亚最佳(suboptimal)剂量的外源性细胞色素c的存在下，HepG2细胞的胞质提取物中AFP介导的caspase-3活化的协同增强。各份HepG2来源的胞质提取物(25μg蛋白质)在dATP(1mM)的存在下，用AFP(10μM)、细胞色素c(0.2μM)或相同剂量的两种化合物的组合处理不同的时间间隔，然后分析DEVDase活性。(C)AFP差异性影响无细胞胞质提取物中由各剂量细胞色素c诱导的caspase-3的活化。各份S100胞质提取物(25μg蛋白质)在dATP(1mM)的存在下，用AFP(7μM)处理30分钟，然后分析DEVDase活性。示出了四个实验的平均值±SD。
图8说明高剂量(165nM)内源性细胞色素c(A)和低剂量(110nM)内源性细胞色素c(B)条件下，肽apocyclin-A*CCRGDVLDC*、CGRGDVLDC、*CCHGDLLEC*、RGDVLD和HGDLLE对HepG2细胞的无细胞胞质提取物中dATP依赖性Cyt c诱导的caspase活化的影响。加入细胞色素c之前15分钟，向细胞提取物中加入浓度为750μM的肽。通过切割caspase-3特异性的荧光底物DEVD-AMC来监测Caspase活化。
图9说明环化多聚9-肽apocyclin-A(*CCRGDVLDC*)消除细胞色素c/AFP介导的无细胞体系中的caspase-3活化。各份HepG2来源的胞质提取物用750μM的apocyclin-A预处理15分钟，然后在1mM dATP的存在下，用10μMAFP和/或110nM(A)或80nM(B)细胞色素c处理40分钟。通过切割caspase-3特异性的荧光底物DEVD-AMC来监测Caspase活化。
发明内容
本发明的主题是提供能够调节凋亡性细胞死亡的肽，具体是人工合成的多聚环肽。更具体地，其涉及人α-胎蛋白(AFP)或白蛋白分子上负责调节肿瘤细胞凋亡的原始氨基酸序列。
AFP是肿瘤相关的胎儿糖蛋白，其表现出各种生物活性，包括细胞生长调节、未成熟细胞的分化、活化的免疫细胞的免疫抑制、凋亡的肿瘤特异性诱导和对各种因素多介导的凋亡信号的调节，以及对各种基因表达的调节。最近表明AFP可以通过直接或间接活化完整细胞和无细胞体系中的caspase-3来诱导肿瘤选择性凋亡(Dudichet al.，1999，J Eur.Biochem.266，750-761)。根据本发明，在AFP和白蛋白中发现了具有这种效应的活性位点。模拟了形成活性位点的肽，筛选了大量合成的天然和非天然肽的生物活性。
根据本发明的肽可以用于抑制依赖于细胞色素c介导的caspase级联活化的各种类型细胞死亡，例如，由氧胁迫、药物、细胞因子、Fas配体、α-胎蛋白诱导的凋亡。所述肽可用于防止培养细胞中的凋亡，增加器官移植的器官保持(preservation)，预防免疫性自身免疫病症和病毒感染所诱导的免疫缺陷综合征、化疗和放疗后的细胞毒副作用。还提供了肽的氨基酸序列，以及生产和使用所述肽的方法。最有效的肽结构是具有刚性分子形式的合成肽，如：
本发明着手使用理论和实验方法来确定AFP分子中负责引发肿瘤细胞凋亡的活性位点。假设：模拟活性位点的活性肽可以直接在完整的细胞中诱导凋亡，在无细胞体系中引发caspase-3活化，或调节凋亡信号，如AFP和或其他凋亡因子如抗Fas抗体或细胞色素c诱导的凋亡信号。令人惊奇的是，合成环肽*Cys-Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*(这里称作apocyclin-A)模拟了AFP分子的一部分，与几种caspase具有可靠的同源性，似乎具有生物活性。apocyclin-A中氨基酸的一系列分解和置换是为了鉴定功能上重要的氨基酸。还合成了apocyclin-A相关的许多肽。测试了所有肽影响培养物中肿瘤细胞存活的能力和影响无细胞胞质裂解物中caspase活化的能力。下一步肽测试是为了研究肽影响完整细胞中AFP、抗Fas抗体诱导的凋亡的能力，和调节无细胞体系中Cyt c介导的caspase活化的能力。结果表明对应于AFP序列251-259的9-肽apocyclin-A完全消除了体外肿瘤细胞中AFP介导的凋亡，明显调节了无细胞胞质提取物中Cyt-c和AFP介导的caspase活化。更具体地，在无细胞体系中，apocyclin-A明显增强低剂量细胞色素c介导的caspase活化，降低高剂量细胞色素c诱导的效应。
较短的6-肽p25在无细胞体系中部分保留这种活性，但是在完整细胞中没有这种活性。还表明，AFP来源的肽在调节细胞提取物中Cyt c介导的caspase活化方面表现出相互拮抗。观察到：9-肽apocyclin-A中度支持低剂量Cyt c介导的效应，显著抑制高剂量外源性或内源性细胞色素c引发的caspase活化。这些数据表明AFP-来源的9-肽apocyclin-A是AFP中负责同参与凋亡信号传导的未知胞质分子特异性结合的最小部分。所限定的该肽结构和其人工特征说明其可以是能够在体外和体内用作各种凋亡因子的药物的活性组分。这种肽的应用包括防止培养细胞中的凋亡，预防同种异体移植的免疫排斥和自身免疫反应的方法，避免肝脏脓毒性休克和细胞因子治疗等诱导的凋亡的方法。
本文所用的氨基酸的缩写如下表所示：
Ala  A 丙氨酸
Asp  D 天冬氨酸
Glu  E 谷氨酰胺
Arg  R 精氨酸
Cys  C 半胱氨酸
Val  V 缬氨酸
Leu  L 亮氨酸
Gly  G 甘氨酸
Xaa  X 任意氨基酸
为了寻找AFP分子中负责凋亡信号传导的最小部分，通过F-MOC固相化学生成了含6-10个残基的肽。还合成了与人血清白蛋白(HAS)的同源序列相对应的类似肽。评价所有的肽在培养物完整细胞中的生长调节活性，还测试了它们直接影响无细胞胞质提取物中caspase活化的能力。另外，测试了肽调节完整细胞中AFP和抗Fas细胞毒性Mabs CH-11诱导的凋亡的能力，和影响无细胞体系中cyt c诱导的caspase活化的能力。通过F-MOC固相化学生成了含对应于人α-胎蛋白中251-259序列的Arg-Gly-Asp(RGD)的人工环肽*CCRGDVLDC*(星号表示潜在的二硫键)、Cys252替换为Gly的同源性环肽*CGRGDVLDC*和对应于残基253-258的线性肽RGDVLD。还合成了来自人血清白蛋白的同源性环肽*CCHGDLLEC*、*CGHGDLLEC*和线性肽HGDLLE，用作功能性对照。还认识到仅含序列RCD的肽明显不同于本发明中的肽。
来自AFP*CCRGDVLDC*(本文为apocyclin-A)的含RGD的多聚环肽能够消除体外肿瘤细胞中的凋亡。结果表明，apocyclin-A完全消除人成髓细胞瘤U937细胞中AFP诱导的凋亡，显著抑制抗Fas抗体介导的细胞死亡。还评价了AFP来源的肽apocyclin-A和线性6-肽RGDVLD影响无细胞体系中Cyt c和AFP诱导的caspase活化的能力。结果发现apocyclin-A显著增强低剂量内源性或外源性Cyt c诱导的dATP依赖性caspase活化，实际上完全消除高凋亡活性剂量的Cyt c诱导的caspase活化。还表明apocyclin-A消除HepG2细胞的无细胞胞质提取物中AFP诱导的Cyt c/dATP依赖的caspase-3活化。线性AFP-来源的6-肽RGDVLD在完整细胞中不表现出凋亡调节活性，但是能够消除无细胞体系中Cyt c/AFP介导的caspase活化。
产生抗生物活性蛋白质如受体的特定功能性位点的抗体以阻断它们的方法是公知和常用的方法。这种抗体产生恰好与受体位点相配合(fit)的Fab单位结构。另一方面，可以制备抗个体基因型(anti-idiotypic)抗体，以与第一次制备的Fab单位相配合。因此抗个体基因型抗体与受体的活性位点类似。根据本发明，AFP和白蛋白含有特异的活性位点，其与引发细胞死亡周期的受体配合，阻断它们。因此，在本发明中发现，AFP/白蛋白的特定部分具有阻断引发位点的结构。因此，针对AFP和/或白蛋白活性位点的抗个体基因型抗体含有能阻断细胞死亡受体之分子的必要结构信息。通过常规的X射线结晶和/或从序列数据的计算机模拟可以显示出这种3-D结构。
本发明的基本实施方案是发现了哺乳动物中两个重要且丰富的蛋白质，即AFP和白蛋白中的凋亡活性位点。根据这一发现，形成了一系列分子结构以阻断哺乳动物细胞中的细胞死亡引发受体。受试分子是肽，因为它们易于合成，但可以理解的是，可以在合成的或天然的化合物基础上设计其他分子。同样，也可以在其他分子，尤其是非免疫原性的载体分子上构建分子结构。
本发明的主要实际结果是来自AFP的环肽*CCRGDVLDC*(apocyclin-A)，其含有两个功能性活性位点：RGD和DVLD。两种序列都直接参与caspase活性和凋亡的调节。含RGD的蛋白质或肽已知参与同整合素分子的相互作用，可以用于抑制影响细胞增殖和凋亡的分子内接触。apocyclin-A和含RGD的其他肽的不同在于环化形式的该位点的多聚化表象。这能够通过RGD序列的多聚化表象增强总体效应。
序列DVLD位于apocyclin-A中的RGD之后，是caspase-3、-7和-2的公知切割位点。因此，它具有caspase底物的典型结构DXXD(Thornberry，N.A.，et al.，(2000)Methods in Enzymology，v.322，pp.100)。在apocyclin-A中，该位点可以作为肽底物与caspase-3的活性位点结合。类似活性也可以赋予整个AFP分子，但是这将需要构象改变，使暴露相应位点，以显示凋亡调节活性(Semenkova et al.，(2003)Eur.J.Biochem.270，in press)。
可以通过底物样氨基酸序列的存在来解释apocyclin-A抑制无细胞体系中caspase-3活性的能力，所述底物样氨基酸序列能够结合并阻断相应caspase的活性位点。另外，apocyclin-A的DVLD位点类似于典型四肽caspase-3抑制剂DEVD-cho，可以通过破坏XIAP和加工的caspase-3之间的相互作用，选择性地促进caspase-3从凋亡体(apoptosome)复合物中的释放(Bratton，S.B.，et al.，(2001)EMBO J5，998)。
apocyclin-A的独特特征是其环状结构，该环状结构产生底物序列的多聚表象，通过同时与参与凋亡信号传导的不同分子相互作用增强总体效应。
通过非限制性的实施例进一步说明本发明。
实施例1
肽合成
根据肽合成的常用方法，使用430A型合成仪；Applied Biosystems，Foster City，CA，USA来合成肽。环肽主要从暴露于大气氧的水溶液中的线性肽自发形成，通过HPLC、使用肽的常用程序来纯化。
1.对应于人AFP中251-259氨基酸序列的环多聚9-肽*Cys-*Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*，*CCRGDVLDC*(星号表示潜在的二硫键)，本文称作apocyclin-A。第二个半胱氨酸，Cys252，能够在两个邻近的环单体肽之间形成S-S键。单体环肽的分子量为983Da。apocyclin-A肽由两个或多个(少于5个)环状的、对应于序列*Cys-*Cys-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*的9-肽结构组成。
Figure A20038010116500131
2.环状单体肽*Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp-Cys*(星号表示潜在的二硫键)对应于人AFP中的251-259氨基酸，具有Cys252向Gly的单一氨基酸替换，以避免单体间形成S-S键所致的肽多聚化。单体环状9-肽的分子量是937Da。
3.来自AFP、对应于序列253-259的线性肽，Arg-Gly-Asp-Val-Leu-Asp(253-259)，单体环肽的分子量为674Da。
4.来自HAS(人血清白蛋白)的环肽，*Cys-Cys-His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu-Cys*，*CCHGDLLEC*(M.wt：992)；
5.来自HAS的环肽，*Cys-Gly-His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu-Cys*，*CGHGDLLEC*(M.wt：946)。在该肽中，Cys252为Gly所取代。
6.来自HAS的线性肽，p26：His-Gly-Asp-Leu-Leu-Glu，HGDLLE(M.wt：683)。
试剂
荧光肽底物DEVD-AMC和LEHD-AFC来自Alexis Biochemicals(San Diego，USA)。牛心脏细胞色素c(Cyt c)、三磷酸腺苷(dATP)和其他试剂都来自SigmaChemical Co.。人AFP如文献所述通过离子交换、亲和与凝胶过滤层析分离自cord血清(Dudich et al.，(1999)Biochemistry，38：10406-10414)。用抗人AFP和成人血清蛋白的单特异性抗体通过PAGE和Rochet电泳确定AFP纯度，结果表明不低于99.8％。
制备无细胞提取物
人肝癌细胞HepG2和人成单核细胞瘤细胞系U937来源于美国典型培养物收藏中心(American Type Culture Collection)。通过在低渗提取缓冲液中裂解细胞来制备细胞提取物。为了获得胞质S-100级分，将细胞裂解物以100,000×g离心1h。提取物直接使用，或冻于-70℃备用。
无细胞反应
无细胞反应通常在13-μl的反应体积中进行。通过加入各剂量的牛心脏细胞色素c和/或纯化的人AFP，在1mM dATP的存在下诱导凋亡。对于13-μl规模的反应，10μl细胞提取物(～2-4mg/ml，通过Bradford分析测定)加入1μl dATP、1μl Cyt c和/或反应缓冲液中的AFP溶液，以接受必要终浓度的试剂。为了评价肽的活性，向细胞提取物中加入各剂量的溶解于反应缓冲液的肽和1mM dATP。为了测定肽调节Cyt c和AFP的凋亡效应的能力，在加入Cyt c和AFP之前10分钟加入肽。对照样品与等体积的不含试剂添加物的缓冲液(3μl)一起孵育。为了引发凋亡，将提取物于37℃孵育40分钟。
测定caspase活性
在caspase活化反应结束时，各份提取物(5μl)添加荧光底物DEVD-AMC(3mM)，然后于37℃孵育一定的时间间隔(0.5-1h)。通过加入2.0ml的冰冷的、0.2mMpH7.5磷酸钠缓冲液稀释来终止反应，然后用Perkin Elmer MPF-44A(λexc＝365nm；λem＝440nm)荧光仪测定荧光。对于每个样品，荧光强度根据胞质蛋白质浓度进行校正。caspase活化表示为校正的样品荧光强度和对照样品测定的相应值之间的比例。
诱导凋亡
U937细胞以4×103细胞/孔的密度铺到平底96孔板(Costar)的完全培养基中，在试剂加入之前孵育2h。然后将细胞用溶解于PBS的各剂量AFP处理24h，然后评价增殖。如所描述的用细胞毒性IgM抗Fas抗体CH-11对细胞进行处理。U937细胞用50μg/ml的CH-11抗体处理18h。然后，细胞不经处理或用试剂处理足够的时间间隔，最后4h的培养物进行[3H]-胸苷(1Ci/mmol/孔)掺入分析。实验数据表示为三次重复的培养物中[3H]-胸苷掺入占培养基对照的[3H]-胸苷掺入的百分比。不加添加物培养的细胞作为对照。
分析肽活性
为了评价肽的生长调节活性，各剂量的肽加入到细胞中24h，然后评价细胞的增殖、细胞存活力和DNA片段化。为了测定肽调节其他因子诱导的凋亡的能力，Jurkat细胞用20ng/ml的CH-11抗体处理，不加ActD；Ragi细胞用经20ng/ml CH-11抗体而处理的Jurkat细胞中的CH-11处理，不加ActD；Raji细胞在0.5μg/ml ActD的存在下用CH-11处理18h。为了用TNF-α诱导凋亡，细胞(Jurkat、MCF7或U937)用25ng/ml的细胞因子处理24h，然后如上所述评价增殖或存活力。HepG2细胞在加入TNF之前预先用新鲜的培养基洗涤，以除去内源性的生长因子。
实施例2 鉴定人AFP中负责凋亡信号传导的含RGD的caspase-3特异性活性位点
为了测定AFP分子中功能上重要的氨基酸，我们测定了人AFP和caspase-3与caspase-1的序列的氨基酸同源性，构建了假定活性位点的肽类似物。比对研究下列序列：
casp-2 QNKPKMFFI QACRGDETDRGV
                :::::
casp-1 KDKPKVIII QACRGDSPGVVW
                :::::
casp-3 TGKPKLFII QACRGTELDCGI
                  :::. :::
HuAFP  VLDVAHVHEH CCRGDVLDCLQDGEKIMSYICSQQDTLSNKITECCKLTTLERGQCIIHAE    299
       : :.  ::  :: ::.: :  :   .  ::: .::..: :. :::    ::.  ::   :
HSA    VTDLTKVHTE CCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVE    294
从比对可以看出，AFP和caspase-1与caspase-3的酶活性位点具有一定的同源性。caspase-1与caspase-2的酶活性位点含有RGD基序，其位于具有催化活性的Cys残基之前。效应caspase-3与caspase-7在该位置上具有TGT基序，而Cys残基的位置恰好与AFP分子和casp-3、casp-7一致。考虑到AFP在Cys252和Cys259之间具有链内二硫键(Morinaga，et al.，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：4604-4608)，我们假设：AFP分钟上caspase样活性位点位于残基Cys252-Cys259之间的某位置。必须提到的是，casp-3、-7和-8也具有RGD基序，但是它们定位于催化活性位置之外(Bukley，et al.，(1999)Nature，397：534-539)。肽结构中所含的游离半胱氨酸Cys258明显能够在两个相邻的肽之间形成链间二硫键(图1)。为了证明AFP分子的Cys252-Cys259环中功能上重要的氨基酸的存在，我们构建了假定活性位点的肽类似物结构。为了进行对照，还合成了来自HAS的同源肽。
实施例3 来自AFP apocyclin-A的环肽消除U937细胞中AFP诱导的凋亡
之前发表的数据表明不同来源的AFP(胚胎或来源于肝瘤细胞系HepG2的培养物培养基)可以诱导各种肿瘤细胞系的生长抑制和剂量依赖性的程序性细胞死亡，其特征在于典型的凋亡特征，如明显的生长抑制、细胞毒性和DNA片段化(Dudich et al.，(1998)Tumor Biol.19：30-40)。为了确定AFP分子上负责凋亡信号传导的活性位点的可能定位，我们测试了各AFP来源的肽阻断这种效应的能力。图2说明AFP来源的肽apocyclin-A完全消除U-937细胞中AFP诱导的凋亡。另外，与培养基对照相比，用apocyclin-A(1mM)对U-937细胞进行15-分钟的预处理诱导15％的增殖刺激。这意味着24小时培养过程中apocyclin-A还消除细胞的自发性凋亡。
实施例4 apocyclin-A显著抑制U-937细胞中抗Fas抗体诱导的凋亡
为了测试AFP特异性，我们测试了apocyclin-A是否影响其他因子影响的凋亡。通过各剂量的细胞毒性IgM抗Fas单克隆抗体CH-11诱导U-937细胞的凋亡。图3说明0.5mM的apocyclin-A通过消除约50％的总效应而显著抑制抗Fas抗体介导的凋亡。apocyclin-A的浓度增加至1mM，更显著地抑制抗Fas诱导的凋亡。已知参与各种类型凋亡的细胞内通路对于多数凋亡性因子来说都是通用的。我们的数据表明apocyclin-A对抗AFP依赖的和Fas依赖的凋亡信号传导通路，这是通过与两种因子引发凋亡中所涉及的某种通用受体相互作用实现的。
实施例5  确定AFP分子的活性位点中功能上重要的氨基酸
a)AFP来源的肽
设计了Cys252替换为Gly的环肽*CGRGDVLDC*和6-肽RGDVLD，以确定功能性活性位点序列中负责凋亡信号传导的功能上重要的氨基酸。图4说明*CGRGDVLDC*对U937-细胞中AFP介导的凋亡的影响。该肽不能消除AFP介导的细胞毒性。对于RGDVLD也获得的相同的结果(图4)。这些数据表明Cys252是功能上重要的氨基酸，其替换为Gly完全取消了该肽与整个AFP分子的凋亡活性相互作用的能力。较短的肽RGDVLD也不能调节AFP介导的凋亡，说明了环肽结构对于形成凋亡活性位点的必要性。
B)HAS来源的肽
已知白蛋白和AFP具有可靠的同源性(Morinaga，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：4604-4608)。还发现了假定活性位点区域中类型肽apocyclin-A的同源物。我们从HAS序列设计了下列肽：环肽*CCHGDLLEC*、*CGHGDLLEC*(Cys向Gly的单一替换)和线性6-肽HGDLLE。同样如上所述，我们也测试了这些肽影响完整细胞中AFP诱导的凋亡的能力(表1)。图5说明*CCHGDLLEC*具有类似apocyclin-A的活性，消除U-937细胞中AFP介导的凋亡。HGDLLE和*CGHGDLLEC*不影响细胞对AFP的应答。
表1.AFP来源的和HAS来源肽对U-937细胞的细胞生长和AFP诱导的凋亡的影响
来源  序列 1)对细胞生长的影响(占对照的％) 影响AFP诱导的凋亡的能力
AFP(apocyclin-A)  *CCRGDVLDC* +12 完全消除
AFP  CGRGDVLDC -12 无影响
AFP  RGDVLD +10 无影响
HAS  *CCHGDLLEC* +18 完全消除
HSA  HGDLLE +20 无影响
*环肽
1)剂量1mM的肽对U-937细胞增殖的直接效应，以占不具有添加物的对照的％表示。
实施例6 apocyclin-A与低亚最佳剂量内源性细胞色素c协同诱导无细胞体系中的caspase活化
为了确定apocyclin-A是否与AFP分子作用类似，支持无细胞体系中的caspase活化，我们建立了如上所述相同无细胞体系，只是不用AFP，而使用环肽apocyclin-A。图8说明在低亚剂量内源性细胞色素c和dATP的存在下，apocyclin-A协同增强无细胞体系中的总caspase-3活性。不加入dATP，apocyclin-A不能在相同的实验条件下诱导DEVD-ase活性。在“沉默(silent)”无细胞体系中，对完整的AFP也观察到了相同的效应。这些数据表明我们能够鉴定到AFP和白蛋白中负责其凋亡促进活性的活性位点。
实施例7 apocyclin-A与低亚最佳剂量内源性细胞色素c和dATP协同诱导胞质细胞提取物中的caspase-3活化
我们还测试了AFP诱导无细胞体系中caspase活性的能力。向S100胞质提取物中加入AFP引发dATP依赖的caspase-3特异性的DEVDase活性的诱导，DEVDase活性逐渐增加至少2h(图7A)。作为对照，将等量的人血清白蛋白(HAS)加入到相同的无细胞体系中，其在DEVDase活性水平上没有影响。单独的dATP也能导致低程度的DEVDase活性，明显是由于制剂中小量内源性Cyt c的存在。在不存在dATP的条件下，AFP根本不诱导任何的caspase活化。为了测定AFP是否直接诱导胞质细胞提取物中的caspase活性，或它是否需要基础水平的cyt-c的存在，在向具有不可检测水平的内源性细胞色素c的“沉默”胞质提取物中加入外源性cyt-c之后，我们验证了DEVDase活性。图7B说明在这种类型的胞质裂解物中检测不到DEVDase活性，即使在dATP和低亚最佳剂量的cyt-c的存在下处理2小时后也是如此。但是，在相同的反应体系中加入AFP(7μM)引发caspase的活化过程，以时间依赖性的方式逐渐增加。
实施例8 apocyclin-A取消无细胞体系中Cyt c/dATP介导的caspase活化
图8说明apocyclin-A对caspase-3活化的影响由各剂量的细胞色素c和AFP介导。高剂量的肽(750μM)显著(50-70％)抑制高剂量内源性细胞色素c所诱导的caspase活化(图8A)。用细胞色素c/AFP联合处理胞质级分导致总DEVDase活性的显著增强(图8，A和B)。apocyclin-A的加入抑制Cyt c/AFP介导的caspase活化的60-80％。这些数据说明apocyclin-A通过消除cyt c单独或与AFP组合诱导的总caspase活化，在无细胞体系中以与完整AFP分子相反的方式起作用。因此，apocyclin-A是AFP分子上负责其凋亡活性和凋亡体组装体成员相互作用的序列。
实施例9 AFP来源的肽或HAS来源的肽对无细胞胞质提取物中dATP依赖性Cyt c介导的caspase活化的影响
为了测试各种肽影响无细胞体系中外源性细胞色素c诱导的caspase活化的能力，我们使用了HepG2细胞的胞质细胞提取物。将各份细胞提取物用750μM的肽预处理15分钟，然后向反应混合物中引入各剂量的细胞色素c，以诱导caspase活化。对照提取物和dATP孵育，不加肽和细胞色素c，但是它不表现出任何的caspase活性。从图9A可见，来自AFP的肽，9-肽apocyclin-A和6-肽RGDVLD和来自HAS的6-肽HGDLLE诱导对高剂量细胞色素c介导的caspase活化的显著抑制。另一方面，具有单一氨基酸替换的环状单体9-mer肽*CGRGDVLDC*和来自HAS的环状单体肽*CCHGDLLEC*在完整细胞或无细胞体系中都不表现出抑制凋亡的活性。因此，最有效的肽apocyclin-A模拟AFP的活性为点，负责凋亡信号传导。对低剂量细胞色素c诱导的caspase活化获得了明显不同的效果。图9B说明在第剂量细胞色素c诱导的caspase活化方面，apocyclin-A产生与全长AFP分子的相同刺激。肽*CGRGDVLDC*和*CCHGDLLEC*对低剂量细胞色素c活性没有影响，但是RGDVLD和HGDLLE表现出显著消除细胞色素c诱导的caspase活化。
表2概括了表征无细胞胞质提取物中肽活性的实验数据。
序列 对高剂量Cyt c诱导的caspase活化的影响 影响AFP诱导的Cytc依赖性caspase的能力 对低剂量Cyt c诱导的caspase活化的影响
*CCRGDVLDC*  50％-80％消除 70％-80％消除 30％消除
CGRGDVLDC  无影响 无影响 无影响
RGDVLD  80％消除 无影响 30％-50％消除
*CCHGDLLEC*  无影响 无影响 无影响
HGDLLE  90％消除 无影响 70％消除
完整AFP  80％消除 - 50％消除
*环肽
实施例10  制备针对AFP生物活性位点的抗个体基因型抗体
BALB/cA小鼠用于免疫、细胞融合和产生腹水液体。20只小鼠每只免疫高度纯化的、用完全弗氏佐剂乳化的人AFP(40μg)。以2周的间隔用相同量的不完全弗氏佐剂中乳化的AFP对小鼠加强免疫。选择对人AFP具有最高应答性的小鼠，向其尾部静脉注射含50μl弗氏不完全佐剂的100μlAFP溶液中的80μg AFP。3天后，制备脾细胞，与小鼠骨髓瘤NS-1细胞混合，然后在含FCS的KC培养基中用PEG处理，融合细胞生长在含FCS的HAT培养基中，然后在HT培养基中培养。用兔多克隆抗体作为固化捕获抗体，Eu标记的抗人抗体作为监测抗体进行TR-FIA分析，测试杂交瘤产生抗体的能力(对于技术细节和试剂，参见论文Peuravuori，H and Korpela，T.et al.，Clin.Chem.1993，39，pp.847-848)。在产生抗体的克隆中，弃除对肽*CCRGDVLDC*和其环状形式的加入不敏感的那些克隆。表现出良好应答性的克隆生长至足够导入以在小鼠中产生腹水液体。制备腹水液体，从中纯化抗AFP单克隆抗体。通过常见的公知方法对纯化的抗体进行蛋白酶解，以从选定的克隆获得纯的Fab片段(对于技术，参见Muronetz and Korpela，J. Chromatogr.2003，790，pp.53-66)。如上所述对Fab蛋白进行与AFP类似的加工，以获得抗Fab片段的单特异性抗体。通过对AFP活性位点肽的敏感性，从克隆中筛选出那些针对AFP活性位点的抗个体基因型抗体。可以基本通过上述抗AFP的相同技术，制备针对人白蛋白中序列位置246-254处的活性位点的抗个体基因型抗体。

Claims (16)

1.抗个体基因型抗体的识别位点的分子结构，所述抗个体基因型抗体的识别位点针对人α-胎蛋白或人血清白蛋白中的凋亡活性位点，所述凋亡活性位点位于所述人α-胎蛋白中氨基酸残基251-259处，或人血清白蛋白中氨基酸残基246-254处。
2.根据权利要求1的人α-胎蛋白或白蛋白的活性位点的肽结构，其具有通式CCRGDVLDnXmY或CCHGDLLEnXmY，其中X是任意疏水性氨基酸，Y是任意亲水性氨基酸，指数n是1、2或3，指数m是1、2或3。
3.根据权利要求1或2的线性肽结构，在肽的N端具有0、1或3个旁侧半胱氨酸残基，和在肽的C端具有0、1、2或3个旁侧半胱氨酸残基。
4.权利要求3的多聚或环化的肽结构。
5.根据权利要求1-4之一的肽结构，其特征在于相同分子中同时存在RGD和DXXD序列，其中X指任意疏水性氨基酸残基，R、G和D分别指Arg、Gly和Asp。
6.根据权利要求5的七肽，其中序列RGD中的D是序列DXXD共用的。
7.根据权利要求2的肽序列，其中通式中的X指V、L或W，或其任意组合，Y指D、E或G。
8.C*C*RGDVLDC*的线性、聚合或环化结构，其中星号残基表示可能的二硫键的位置。
9.根据权利要求1-3之一的线性、聚合或环化肽，结构为C*C*HGDLLEC*，其中星号氨基酸残基表示可能的二硫键的位置。
10.权利要求2-9之一的肽用于阻断人和动物细胞中凋亡调节通路的用途。
11.权利要求2-9之一的肽用于增加器官或细胞移植中器官或细胞保持的用途。
12.权利要求2-9之一的肽用于预防自身免疫病和病毒感染所致免疫缺陷综合征的用途。
13.权利要求2-9之一的肽用于降低化疗或放疗后细胞毒效应的用途。
14.权利要求2-9之一的肽用于抑制神经元细胞凋亡、非特异性药物诱导的凋亡或氧胁迫介导的凋亡的用途。
15.权利要求2-9之一的肽用于防止为科研或技术目的而制备的培养细胞凋亡的用途。
16.根据权利要求1的任意分子结构，所述结构的特征在于其结合到针对所述抗个体基因型抗体中Fab片段的分子识别位点而制备的抗体中的能力。
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