EA010058B1 - Пептиды, модулирующие активацию каспазы - Google Patents
Пептиды, модулирующие активацию каспазы Download PDFInfo
- Publication number
- EA010058B1 EA010058B1 EA200500606A EA200500606A EA010058B1 EA 010058 B1 EA010058 B1 EA 010058B1 EA 200500606 A EA200500606 A EA 200500606A EA 200500606 A EA200500606 A EA 200500606A EA 010058 B1 EA010058 B1 EA 010058B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- peptide
- peptides
- apoptosis
- amino acid
- peptide according
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 145
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title abstract description 73
- 230000004913 activation Effects 0.000 title abstract description 59
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 title abstract description 52
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 title abstract description 52
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 83
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims abstract description 67
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 30
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 21
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims abstract description 9
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 6
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims abstract description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims abstract description 4
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 claims description 80
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 71
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 25
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 25
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 7
- 101000827785 Homo sapiens Alpha-fetoprotein Proteins 0.000 claims description 4
- 101000848653 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 26 Proteins 0.000 claims description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 4
- 102000046101 human AFP Human genes 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000033065 inborn errors of immunity Diseases 0.000 claims description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 208000028529 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims 2
- 230000003716 rejuvenation Effects 0.000 claims 2
- 230000009759 skin aging Effects 0.000 claims 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 claims 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 claims 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000019581 neuron apoptotic process Effects 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 claims 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 58
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 3
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 abstract description 2
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 abstract 3
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 abstract 1
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 abstract 1
- 206010021460 Immunodeficiency syndromes Diseases 0.000 abstract 1
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 abstract 1
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 abstract 1
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 abstract 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 abstract 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 abstract 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 35
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 31
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 31
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 28
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 26
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 26
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 23
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 18
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 17
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 17
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 101000823051 Homo sapiens Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 102000046783 human APP Human genes 0.000 description 7
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 7
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 6
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 6
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 6
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 102100035904 Caspase-1 Human genes 0.000 description 3
- 108090000426 Caspase-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000009058 Death Domain Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010049207 Death Domain Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 230000021014 regulation of cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000004046 Caspase-2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000552 Caspase-2 Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 206010051141 Myeloblastoma Diseases 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 229940088872 Apoptosis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 1
- 229940124101 Caspase 3 inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108090000567 Caspase 7 Proteins 0.000 description 1
- 102100038902 Caspase-7 Human genes 0.000 description 1
- 102100026548 Caspase-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000004039 Caspase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 1
- 102400000125 Cyclin-dependent kinase 5 activator 1, p25 Human genes 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000007989 Effector Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010089510 Effector Caspases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010073306 Exposure to radiation Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000793880 Homo sapiens Caspase-3 Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010089814 Plant Lectins Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101100261999 Rattus norvegicus Tpsab1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100129592 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) mcp7 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 102000035181 adaptor proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005764 adaptor proteins Proteins 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 108010090535 alpha-albumin Proteins 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 239000000158 apoptosis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000009925 apoptotic mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000006662 intracellular pathway Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000006510 metastatic growth Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000006654 negative regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000002985 oncosuppressive effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000025915 regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение раскрывает структуры небольших молекул, способных к модуляции апоптотической гибели клетки. В частности, структуры относятся к структурам апоптотически активных участков α-фетопротеина (AFP) и альбумина млекопитающих. Пептиды, имитирующие активный участок, содержат две последовательности: Arg-Gly-Asp и Asp-X-X-Asp, X обозначает любую аминокислоту. Данные последовательности необходимы в той же самой молекуле для того, чтобы вызвать широкий диапазон биологической активности. Пептиды можно использовать для того, чтобы подавить апоптотические метаболические пути, ингибируя опосредованную цитохромом С активацию каспазы. Таким образом, пептиды можно использовать для того, чтобы ингибировать эффекты апоптоза, вызванного окислительным стрессом, лекарственными средствами, цитокинами, лигандами Fas, α-фетопротеином, используемым для предотвращения апоптоза в культивирующихся клетках, в органах для трансплантации, при иммунологических аутоиммунных нарушениях и синдроме иммунодефицита, вызванном вирусной инфекцией, или для уменьшения побочных цитотоксических эффектов после химиотерапии и лучевой терапии.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к медицине и механизмам гибели клеток человека и животных. В частности, изобретение относится к пептидам, способным останавливать апоптотическую гибель клетки, вызванную различными факторами. Изобретение описывает пептиды с такими активностями, способы получения и применение указанных пептидов.
Уровень техники изобретения
Апоптоз представляет собой активную форму гибели клеток и принимает участие во множестве процессов нормального развития клетки, а также при злокачественном перерождении клеток. Механизм апоптоза вовлечен в биологические процессы, вызванные действием различных типов лекарственных средств, цитокинов и факторов роста, окислительным стрессом, радиацией, старением, аутоиммунными заболеваниями и иммунным отторжением при трансплантации органов. Недавние исследования апоптоза демонстрируют, что при различных типах апоптоза, обусловленных действием гормонов, цитокинов, отсутствием факторов роста, химиотерапевтическими агентами, ионизирующей радиацией, иммунологическими нарушениями, СПИД, раком и старением, используются общие молекулярные механизмы (Ыада1а (1997), Се11 88, 355-365).
Активация каспазных протеаз по каскадному принципу представляет собой фундаментальный момент в индукции апоптоза. Описаны два различных типа передачи сигналов апоптоза. Начальная фаза зависимого от рецепторов инициирования апоптоза включает в себя активацию соответствующих рецепторов гибели определенными лигандами, такими как ΤΝΡ или РакЬ, которые в настоящее время являются наиболее изученными индукторами апоптоза. После активации рецепторы гибели на поверхности клеток, Рак (СЭ95) или ΤΝΡΚ.1, присоединяются к цитозольным белкам-адаптерам (ΡΑΌΌ, ΜΟΒΤ, В1Р, ΤΚΑΌΌ), которые в свою очередь вводят каспазу-8 для активации каскада интерлейкин-1-в-превращающего фермента 1СЕ и протеазы (каспазы) семейства СЕЭ-3, сопровождающегося активацией СРР32/каспазы-3-подсемейства цистеиновых протеаз, представители которого находятся в цитоплазме клетки в форме латентных предшественников, прокаспаз (Епап, е! а1. (1996), ΝιΙιιιό 380: 723-726). Рецепторнезависимые типы апоптоза обычно включают критически важный вызываемый цитохромом С механизм, для которого необходимо формирование мультимолекулярного комплекса цитохрома С, дАТФ, АраР-1 и прокаспазы-9, который приводит к активации последней посредством аутопротеолиза и гомодимеризации и последующей активации каспазного каскада (Со1еп, е! а1. (1997), ВюсНеш. 1., 326: 1-16).
Агенты, которые влияют на биологический контроль апоптоза таким образом, имеют потенциальное терапевтическое применение в многочисленных клинических приложениях. Большое количество полученных из растений ингибиторов апоптоза используется для скрининга патологических нарушений, которые часто сопровождают химиотерапию, радиационные воздействия, иммунные нарушения или СПИД. Данные добавки обычно содержат углеводы, жир и гидролизаты растительных белков, лектины и фосфолипиды (И8 6004579, Вагг е! а1.). Эффективные регуляторы апоптоза можно было бы применять при лечении больных раком, чтобы контролировать терапию цитокинами, химиотерапию или лучевую терапию. Апоптотические механизмы действуют при различных типах иммунологических нарушений, таких как аутоиммунные заболевания, иммунное отторжение при трансплантации органа или анафилаксия, или при вирусных инфекциях, вызванных вирусом иммунодефицита человека.
Альфа-фетопротеин (АРР) представляет собой ассоциированный с опухолью эмбриональный гликопротеин, демонстрирующий широкий диапазон биологических активностей, охватывающих регуляцию роста клетки, дифференцировку незрелых клеток, иммуносупрессию активированных иммунных клеток, специфичную для опухоли индукцию апоптоза и регуляцию апоптотических сигналов, опосредуемых другими факторами, а также регуляцию экспрессии различных генов (М|/е)е\\ъку (2001), Ехр. Вю1. Меб., ν. 226: 377-408). Многочисленные доказательства регуляции активности роста клеток, включая подавляющую рост опухоли активность, были описаны для различных видов полноразмерной молекулы АРР, ее протеолитических фрагментов или рекомбинантных доменов и синтетических пептидов (ЭибюБ е! а1. (1999), ВюсйешЩгу, 38: 10406-10414; 1асоЬкоп е! а1., Ргос. Ν;·Η1. Асаб. 8с1. И8А (2002), 99: 2211-2215; МасСо11 е! а1. (2001), ВюсНеш. ВюрНук. Ас!а, 1528: 127-134). Поиск расположения функциональных активных участков молекулы АРР, которые ответственны за множество ее активностей, был предпринят различными исследователями. Определение расположения участков связывания арахидоновой кислоты и эстрадиола было успешным (рассмотрено в обзоре М|/е)е\\ъку. (2001) Ехр. Вю1. Меб., ν. 226: 377-408).
Недавно было продемонстрировано, что АРР реализует свою онкосуппрессивную активность, инициируя апоптоз посредством активации каспазы-3 и независимо от передачи сигнала Рак/РакЬ и ΤΝΡ/ΤΝΡΒ (Эиб1с11 е! а1., (1999) Еиг. 1. ВюсНеш. 282). За последнее десятилетие описаны многочисленные доказательства супрессии роста опухолевых клеток, опосредованной АРР, но активный участок молекулы АРР, который ответственен за передачу сигнала апоптоза, не был до сих пор идентифицирован.
ДНК и аминокислотные последовательности АРР человека были опубликованы (Могшада, е!. а1.,Рпшагу к1гис!игек оГ 1шшап а1рйа-Ге!орго!еш апб ί!κ тВЛА. Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А, 80: 4604-4608 (1983)). Синтетические пептиды, соответствующие участку связывания Е2, как было показано, обладают
- 1 010058 подавляющей рост опухоли активностью (патенты США И8 5674842; 10/1997 М|/е)е\\'кку; И8 5707963, 07/1998 М|/е)е\\'кку). Множество биологически активных белков имеет гомологичную с АРР последовательность (М|/е)е\\'кку (2001), Εxρ. ΒίοΙ. Мей., ν. 226(5): 377-408). Была идентифицирована достоверная гомология АРР с различными белками, вовлеченными в передачу сигнала апоптоза, такими как Вс12, ΤΝΡΒ1, Рак и др. (М|/е)е\\'кку (2001), Εχρ. ΒίοΙ. Мей., ν. 226(5): 377-408). Β \УО 9835981 А1 (Есопотои, 1. е! а1., 1998) описано использование 66 пептидных последовательностей АРР, которые используют для иммунизации против рака. Один из пептидов, А20, имел последовательность СЯОПУИПСЬ, которая, как случайно оказалось, содержала часть активного участка АРР, обнаруженного в настоящем изобретении. Тем не менее, не было обнаружено никакой специфической активности для пептида ОРСОУШСИ и настоящее изобретение остается первым изобретением, способным определить один из предполагаемых биологически активных участков АРР. Более того, пептиды по настоящему изобретению содержат остаток цистеина, который способен к образованию межцепочечных дисульфидных связей, что приводит к появлению более высокой биологической активности, чем для пептида с последовательностью СНС11)\Т1)С1..
Важный участок связывания интегрина представляет собой трипептид Агд-О1у-Акр, который присутствует у множества лигандов интегрина. Интегрины являются гетеродимерными гликопротеинами, опосредующими взаимодействия цитоплазматического матрикса с клеткой и клетки с клеткой, они играют активную роль в процессах дифференцировки клетки, иммунного распознавания, развития опухоли и метастатического роста. В субъединицах интегрина были идентифицированы области контакта для последовательности Агд-01у-Акр (Ракдиайп!, е! а1. 1. Се11 ΒίοΙ. (1995), 130: 1189-1196). Синтетические пептиды, содержащие мотив Агд-01у-Акр, используются в качестве ингибиторов взаимодействия лигандов с интегрином. Было показано, что синтетические пептиды, содержащие мотив Агд-01у-Акр, способны к непосредственной активации каспазы-3 ^иНеу, е! а1. (1999), №!иге, 397: 534-539). АРР содержит в своей последовательности последовательность Агд-01у-Акр (ΒΟΌ), которая расположена в домене II в положении 253-255. По настоящему изобретению последовательность ЯСЭ является частью функционально активного участка АРР, вовлеченного в передачу сигнала апоптоза.
В настоящем изобретении описана минимальная часть молекулы АРР, которая ответственна за передачу сигнала апоптоза. Небольшие пептиды или другие небольшие гаптены являются важными регуляторами, используемыми в качестве лекарственных средств, поскольку их можно синтезировать ίη νί!το и они не вызывают образование нейтрализующих антител. Пептиды, содержащие от 6 до 10 остатков, были получены при помощи твердофазной химии Р-МОС. Также были синтезированы подобные пептиды, соответствующие гомологичным последовательностям альбумина сыворотки человека (Н8А). Для всех пептидов оценивали их регулирующую активность роста в целых клетках в культуре, и также проверяли их способность непосредственно индуцировать активацию каспазы в бесклеточных цитозольных экстрактах. Дополнительно оценивали способность пептидов модулировать апоптоз, вызванный АРР и цитотоксическими МаЬ СН-11 против Рак в целых клетках, и влиять на индуцированную цитохромом С активацию каспазы в бесклеточных системах.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показано схематическое представление биологически активного димерного пептида (мономер обозначен здесь как апоциклин-А; *Сук-Сук-Агд-61у-Акр-Уа1-Ьеи-Акр-Сук*).
На фиг. 2 показано ингибирование мультимерным циклическим 9-членным пептидом апоциклиномА (*Сук-Сук-Агд-61у-Акр-Уа1-Ьеи-Акр-Сук*) вызванного АРР апоптоза. Клетки И-937 обрабатывали в лунках планшета для микротитрования в течение 15 мин различными дозами апоциклина-А, и после этого 3 мкм очищенного АРР человека добавляли к каждой лунке. Пролиферацию клеток оценивали при помощи анализа с введением [3Н]-тимидина через 24 ч инкубации.
На фиг. 3 показано влияние цикличного 9-членного пептида апоциклина-А (*Сук-Сук-Агд-С1у-АкрУа1-Ьеи-Акр-Сук*) на апоптоз, вызванный в клетках И-937 цитотоксическими моноклональными антителами СН-11 против Рак. Клетки в течение 15 мин обрабатывали апоциклином-А в концентрации 500 мкМ и после этого в каждую лунку добавляли различные дозы цитотоксических МаЬ СН-11 против Рак (1ттипо!есй Ь!й). Пролиферацию клеток оценивали при помощи анализа с введением [3Н]-тимидина через 16 ч инкубации.
На фиг. 4 показано влияние линейных 6-членных пептидов Агд-61у-Акр-Уа1-Ьеи-Акр (РСОУБП) и Н1к-61у-Акр-Ьеи-Ьеи-61и (НбПЬЬЕ) на опосредованное АРР подавление роста клеток И-937. Клетки в течение 15 мин обрабатывали различными дозами пептидов и после этого в каждую лунку добавляли 3 мкМ очищенного АРР человека. Пролиферацию клеток оценивали при помощи анализа с введением [3Н]-тимидина через 24 ч инкубации.
На фиг. 5 показано влияние цикличного мономерного 9-членного пептида *Сук-С1у-Агд-С1у-АкрУа1-Ьеи-Акр-Сук* (*ССРСОУРПС*) на опосредованное АРР подавление роста клеточной линии миелобластомы человека И-937. Клетки в течение 15 мин обрабатывали различными дозами пептида и после этого в каждую лунку добавляли 3 мкМ очищенного АРР-человека. Пролиферацию клеток оценивали при помощи анализа с введением [3Н]-тимидина через 24 ч инкубации.
- 2 010058
На фиг. 6 показано, что цикличный 9-членный пептид апоциклин-А (*ССЯСПУЬПС*) увеличивает в бесклеточных цитозольных экстрактах дАТФ-зависимую активацию прокаспазы-3, вызванную низкими дозами эндогенного Су!-С. Клеточные экстракты из клеток И937 инкубировали в течение 40 мин с различными дозами апоциклина-А и 1 мМ дАТФ. Экстракты, инкубированные без добавок, были взяты в качестве контроля. Активацию каспазы-3 анализировали по расщеплению флуорогенного субстрата ΌΕνθ-АРС.
На фиг. 7 показано синергическое усиление с помощью АРР человека опосредованной цитохромом С активации каспазы в бесклеточной системе:
(A) АРР вызывает активацию каспазы-3 в бесклеточных цитозольных экстрактах в присутствии дАТФ. Аликвоты полученного из НерС2 цитозольного экстракта (25 мкг белка) обрабатывали АРР (7 мкМ) в течение различных временных интервалов или в качестве контроля с такой же дозой Н8А в присутствии дАТФ (1 мМ) и затем оценивали активность по протеолизу субстрата ΌΕνΟ;
(B) Синергическое повышение опосредованной АРР активации каспазы-3 в присутствии субоптимальной дозы экзогенного цитохрома С в цитозольном экстракте клеток НерС2. Аликвоты полученного из НерС2 цитозольного экстракта (25 мкг белка) в течение различных временных интервалов обрабатывали АРР (10 мкМ), цитохромом С (0,2 мкМ) или комбинацией таких же доз обоих соединений в присутствии дАТФ (1 мМ) и затем оценивали активность по протеолизу субстрата ΌΕνΟ;
(C) АРР по-разному воздействует на активацию каспазы-3 в бесклеточных цитозольных экстрактах, вызываемую различными дозами цитохрома С. Аликвоты цитозольного экстракта из 8100 (25 мкг белка) в течение 30 мин обрабатывали АРР (10 мкМ) и различными дозами цитохрома С в присутствии дАТФ (1 мМ) и затем оценивали активность по протеолизу субстрата ΌΕνΟ. Показано среднее значение ± стандартное отклонение для четырех групп данных.
На фиг. 8 показаны эффекты пептидов апоциклина-А *ССК.6ПУЪПС*, ССВСЭУРПС.
^^ΟΌΕΕΕ^, ВСЭУЕП и НСЭРЕ-Ε на дАТФ-зависимую активацию каспазы, вызванную Су!-С, в бесклеточных цитозольных экстрактах клеток НерС2 при высокой дозе (165 нМ) эндогенного цитохрома С (А) и низкой дозе (110 нМ) эндогенного цитохрома С (В). Пептиды в высокой концентрации 750 мкМ добавляли к клеточному экстракту за 15 мин до добавления цитохрома С. За активацией каспазы следили по расщеплению специфичного для каспазы-3 флуорогенного субстрата ΌΕνθ-АМС.
На фиг. 9 показано, что мультимерный 9-членный пептид апоциклин-А (*ССРСЭУЕПС*) отменяет опосредованную цитохромом С/АРР активацию каспазы-3 в бесклеточной системе. Аликвоты полученных из НерС2 цитозольных экстрактов предварительно обрабатывали в течение 15 мин апоциклином-А в концентрации 750 мкМ и затем обрабатывали в течение 40 мин 10 мкМ АРР и/или 110 нМ (А) или 80 нМ (В) цитохрома С в присутствии 1 мМ дАТФ. За активацией каспазы следили по расщеплению специфичного для каспазы-3 флуорогенного субстрата ΌΕνθ-АМС.
Подробное описание изобретения
Предмет изобретения относится к пептидам, и в частности к искусственным синтетическим мультимерным циклическим пептидам, способным к регуляции апоптотической гибели клетки. Более конкретно, оно относится к оригинальной аминокислотной последовательности молекулы α-фетопротеина человека (АРР) или альбумина человека, ответственной за регуляцию апоптоза в клетках опухоли.
АРР представляет собой ассоциированный с опухолью эмбриональный гликопротеин, демонстрирующий широкий диапазон биологических активностей, охватывающих регуляцию роста клетки, дифференцировку незрелых клеток, иммуносупрессию активированных иммунных клеток, специфичную индукцию апоптоза в опухоли и регуляцию апоптотических сигналов, опосредуемых другими факторами, регуляцию экспрессии генов. Недавно было показано, что АРР может вызывать избирательный апоптоз опухолей посредством прямой или непрямой активации каспазы-3 в клетках и в бесклеточной системе (ЭпФсН е! а1., 1999, 1. Ειπ. Вюсйеш. 266, 750-761; 8ешепкоуа е! а1. (2003), 1. Ειπ. Вюсйеш. 270: 276282). По настоящему изобретению активный участок таких эффектов обнаружили в АРР, а также в альбумине. Были смоделированы пептиды, формирующие активный центр, и проведен скрининг биологической активности большого количества синтетических природных и неприродных пептидов.
Пептиды по настоящему изобретению можно использовать для ингибирования различных типов клеточной гибели, которая зависит от активации опосредованного цитохромом С каспазного каскада, например апоптоза, вызываемого окислительным стрессом, лекарственными средствами, цитокинами, лигандом Раз, α-фетопротеином. Пептиды можно использовать для предотвращения апоптоза в культурах клеток, для увеличения сохранности органов для трансплантации, для предотвращения иммунологических аутоиммунных нарушений и синдрома иммунодефицита, вызванного вирусной инфекцией, побочных цитотоксических эффектов после химиотерапии и лучевой терапии. Также представлены аминокислотные последовательности пептидов и способы создания и использования пептидов. Самыми активными структурами пептидов являются искусственные синтетические пептиды, имеющие жесткую молекулярную структуру, подобную
- 3 010058
В настоящем изобретении предпринята попытка определить активный участок молекулы АРР, ответственный за инициацию апоптоза в раковых клетках, используя теоретические и экспериментальные подходы. Была предложена гипотеза, что активный пептид, моделирующий активный участок, мог бы непосредственно вызывать апоптоз в целых клетках и инициировать активацию каспазы-3 в бесклеточной системе или мог бы модулировать апоптотические сигналы, вызванные АРР и/или другими апоптотическими факторами, такими как антитела против Раз или цитохром С. Удивительно, что синтетический цикличный пептид *Суз-Суз-Агд-О1у-Азр-Уа1-Реи-Азр-Суз* (обозначаемый здесь как апоциклин-А), созданный по образцу части молекулы АРР, имеющий достоверную гомологию с некоторыми каспазами, как оказалось, был биологически активным. Ряд замен в последовательности аминокислот апоциклина-А был предпринят для идентификации функционально важных аминокислот. Также синтезировали большое количество пептидов, родственных с апоциклином-А. Все пептиды проверяли на их способность влиять на выживание опухолевых клеток в культуре и влиять на активацию каспазы в бесклеточных цитозольных лизатах. Следующая стадия проверки пептидов была предпринята для исследования способности пептидов влиять на апоптоз, вызванный АРР, антителами против Раз в целых клетках и модулировать активацию каспазы, опосредованную Су1-С, в бесклеточной системе.
Продемонстрировали, что 9-членный пептид апоциклин-А, соответствующий последовательности АРР 251-259, полностью останавливал опосредованный АРР апоптоз в клетках опухоли ίπ νίΐΓΟ и значительно модулировал опосредованную Су1-С и АРР активацию каспазы в бесклеточных цитозольных экстрактах. Более определенно, в бесклеточной системе, апоциклин-А значительно увеличивал активацию каспазы, опосредованную низкой дозой цитохрома С и уменьшал эффекты, вызванные высокой дозой цитохрома С.
Более короткий 6-членный пептид р25 частично сохранил данную активность в бесклеточной системе, но не в целых клетках. Также продемонстрировано, что полученные из АРР пептиды проявили взаимный антагонизм в регулировании опосредованной Су1-С активации каспазы в клеточных экстрактах. Было показано, что 9-членный пептид апоциклин-А умеренно усиливал опосредованные низкой дозой Су1-С эффекты и значительно ингибировал активацию каспазы, инициированную высокими дозами экзогенного или эндогенного цитохрома С. Такие данные показывают, что полученный из АРР 9-членный пептид апоциклин-А является минимальной частью АРР, которая ответственна за специфическое связывание с неизвестными цитозольными молекулами, вовлеченными в передачу сигналов апоптоза. Описанная структура данного пептида и его искусственная природа подразумевает, что он может быть активным компонентом нового лекарственного средства, которое препятствует действию различных апоптотических факторов ίπ νίΐΐΌ и ίπ νίνο. Применение данного пептида охватывает предотвращение апоптоза в культивируемых клетках, способы предотвращения иммунологического отторжения аллогенных трансплантатов и аутоиммунных реакций, способы, позволяющие избежать гепатологического септического шока, и апоптоз, вызванный терапией цитокинами и т.д.
Сокращения для аминокислот, используемые здесь, приведены в следующей таблице.
| А1а | А | Аланин |
| Азр | ϋ | Аспарагиновая кислота |
| С1и | Е | Глутамин |
| Агд | В | Аргинин |
| Суз | С | Цистеин |
| Уа1 | V | Валин |
| Ьеи | Ь | Лейцин |
| С1у | С | Глицин |
| Хаа | X | Любая аминокислота |
Для того чтобы обнаружить минимальную часть молекулы АРР, которая ответственна за апоптоз, сигнальные пептиды, содержащие от 6 до 10 остатков, были получены посредством твердофазной химии Р-МОС. Также синтезировали подобные пептиды, соответствующие гомологичной последовательности альбумина сыворотки человека (Н8А). Для всех пептидов оценивали их регулирующую рост активность в целых клетках в культуре и также проверяли их способность непосредственно влиять на активацию каспазы в бесклеточных цитозольных экстрактах. Дополнительно пептиды оценивали на их способность
- 4 010058 модулировать апоптоз, вызванный ЛЕР и цитотоксическими МаЬ СН-11 против Еа§ в целых клетках, и также влиять на вызванную Су1-С активацию каспазы в бесклеточной системе. Искусственный цикличный пептид *ССЕСЭУБПС* (звездочки обозначают возможную дисульфидную связь), содержащий мотив Агд-С1у-А§р (ΚΟΌ), соответствующий последовательности 251-259 α-фетопротеина человека (АЕР), гомологичный цикличный пептид с заменой Су§252 на С1у *ССЕСЭУБПС* и линейный пептид К.СПУБП, соответствующий остаткам 253-258, были получены посредством твердофазной химии Е-МОС. Гомологичные цикличные пептиды из последовательности альбумина сыворотки человека *ССНСПББЕС*, *ССНСПББЕС* и линейный пептид НСЭББЕ также синтезировали и использовали в качестве функциональных контролей. Необходимо признать, что пептиды, содержащие только последовательность РСЭ. значительно отличаются от пептидов по настоящему изобретению.
Мультимерный цикличный пептид, содержащий ΚΟΌ, из АЕР *ССЕСОУБПС* (здесь апоциклинА) способен остановить апоптоз в клетках опухоли ίη νίΐτο. Было продемонстрировано, что апоциклин-А полностью останавливал вызванный АЕР апоптоз в клетках миелобластомы человека И937 и значительно ингибировал опосредованную антителами против Еа§ гибель клетки. Кроме того, была оценена способность полученных из АЕР пептидов апоциклина-А и линейного 6-членного пептида ЕСОУБП влиять на активацию каспазы, вызванную Су1-С и АЕР в бесклеточной системе. Было обнаружено, что апоциклин-А заметно увеличивал дАТФ-зависимую активацию каспазы, вызванную низкими дозами эндогенного или экзогенного Су1-С, и фактически полностью останавливал активацию каспазы, вызванную высокими апоптотически активными дозами Су1-С. Также продемонстрировали, что апоциклин-А останавливал вызванную АЕР активацию каспазы-3, зависимую от Су1-С/дАТФ, в бесклеточных цитозольных экстрактах клеток НерС2. Линейный, полученный из АЕР 6-членный пептид ЕСОУБП не показал никакой регулирующей апоптоз активности в целых клетках, но был способен останавливать опосредованную Су1-С/АЕР активацию каспазы в бесклеточной системе.
Хорошо известным и обычно используемым подходом для того, чтобы заблокировать определенные функциональные участки биологически активных белков, таких как рецепторы, является использование соответствующих блокирующих антител против них. Такие антитела создают на своих ЕаЬ-фрагментах структуры, которые точно соответствуют рецепторному участку. С другой стороны, можно создать антиидиотипические антитела, чтобы они соответствовали первичным ЕаЬ-фрагментам. Следовательно, антиидиотипическое антитело имеет сходство с активным центром рецептора. Согласно настоящему изобретению АЕР и альбумин содержат специальный активный участок, который соответствует рецепторам, инициирующим цикл гибели клетки, и блокирует их. Следовательно, определенная часть АЕР/альбумина, обнаруженного в настоящем изобретении, имеет структуру, блокирующую участок инициации. Следовательно, антиидиотипическое антитело против активного участка АЕР и/или альбумина содержит значительную структурную информацию о молекуле, способной заблокировать рецептор гибели клетки. Такую 3-Ό структуру можно выявить обычной рентгеновской кристаллографией и/или молекулярным компьютерным моделированием по данным о последовательности.
Основная суть настоящего изобретения заключается в том, что был обнаружен апоптотически активный участок в двух важных и присутствующих в большом количестве белках млекопитающих, т.е. в АЕР и альбумине. На основе данных результатов был разработан ряд молекулярных структур для блокирования инициирующего гибель клеток рецептора в клетках млекопитающих. Исследуемые молекулы представляли собой пептиды для облегчения их синтеза, но понятно, что можно создать другие молекулы, основанные на синтетических или природных соединениях. Одинаково хорошо можно конструировать молекулярные структуры на основе других, особенно на неиммунногенных, молекулах-носителях.
Главным практическим результатом настоящего изобретения является цикличный пептид из АЕР, *ССЕСЭУЕПС* (апоциклин-А), который содержит два функциональных активных участка: ЕСЭ и ΌνΕΌ. Обе последовательности непосредственно вовлечены в регуляцию активности каспазы и апоптоз. Содержащие ЕСЭ белки или пептиды, как известно, вовлечены во взаимодействие с молекулами интегринов и могут использоваться для ингибирования внутриклеточных контактов, влияя таким образом на пролиферацию клеток и апоптоз. Апоциклин-А отличается от других содержащих ЕСЭ пептидов мультимерным представлением данного участка в циклической форме. Это позволяет увеличить общий эффект при мультимерном представлении последовательности ЕСЭ.
Последовательность ЭУБП расположена в апоциклине-А сразу же после ЕСЭ и представляет собой хорошо известный участок расщепления для каспазы-3, -7 и -2. Следовательно, она имеет структуру, типичную для субстратов каспаз, ΌΧΧΌ (Сагаа-СаКо М., е1 а1. (1998), 1. Βίο1. Сйет. 32608-13). В апоциклине-А данный участок может связываться с активным центром каспазы-3 в качестве пептидного субстрата. Похожую активность можно также приписать полной молекуле АЕР, но для этого будут необходимы конформационные изменения, позволяющие открыть для контакта соответствующий участок для проявления модулирующей апоптоз активности (5>етепкота е1 а1. (2003), Еиг. 1. Вюсйет. 270, 276-282).
Способность апоциклина-А ингибировать активность каспазы-3 в бесклеточной системе можно объяснить наличием подобной субстрату аминокислотной последовательности, которая способна связаться и заблокировать активные центры соответствующих каспаз. Кроме того, участок ЭУБЭ апоциклина-А мог бы избирательно способствовать высвобождению каспазы-3 из апоптосомного комплекса,
- 5 010058 нарушая взаимодействие между ΧΙΑΡ и процессированной каспазой-3 на подобие типичного тетрапептидного ингибитора каспазы-3 ЭЕМО-сИо (Вга!!оп, 8.В., е! а1. (2001), ЕМВО 1. 5, 998).
Уникальная природа апоциклина-Α заключается в его цикличной структуре, которая позволяет осуществить мультимерное представление последовательности субстрата и увеличивает общий эффект посредством одновременного взаимодействия с различными молекулами, вовлеченными в передачу сигнала апоптоза.
Далее изобретение проиллюстрировано ниже неограничивающими примерами.
Пример 1. Синтез пептидов.
Пептиды синтезировали на синтезаторе Мобе1 43 0Α; Аррйеб Вюзуз!ешз, Еоз1ег Сйу, СА, И8А согласно обычным способам пептидного синтеза. Цикличные пептиды сначала получали самопроизвольным образом из линейных пептидов в водных растворах, подвергаемых воздействию атмосферного кислорода, и очищали из раствора при помощи ВЭЖХ по общепринятой процедуре, используемой для пептидов.
1. Цикличный мультимерный 9-членный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности 251-259 ΑΕΡ человека *Суз-*Суз-Аг§-П1у-Азр-Уа1-Ееи-Азр-Суз*, *ССКСЭУЕПС* (звездочки обозначают возможную дисульфидную связь), который будет обозначаться здесь как апоциклин-А. Второй цистеин Суз252 способен к образованию 8-8 связи между двумя соседними цикличными мономерными пептидами. Молекулярная масса мономерного цикличного пептида составляла 983 Да. Пептид апоциклин-А состоит из двух или более (менее чем 5) кольцеподобных 9-членных пептидных структур, соответствующих последовательности *Суз-*Суз-Аг§-П1у-Азр-Уа1-Ееи-Азр-Суз*
ССНООЬЬЕС (__8_ &
2. Цикличный мономерный пептид *Суз-П1у-Аг§-П1у-Азр-Уа1-Ееи-Азр-Суз* (звездочки обозначают возможную дисульфидную связь), соответствующий аминокислотной последовательности 251-259 ΑΕΡ человека с одной аминокислотной заменой Суз252 на С1у для того, чтобы избежать мультимеризации пептидов при образовании 8-8 связей между мономерами. Молекулярная масса мономерного цикличного 9-членного пептида составляла 937 Да.
3. Линейный пептид из ΑΕΡ, соответствующий последовательности 253-259, Аг§-П1у-Азр-Уа1-ЕеиАзр (253-259). Молекулярная масса мономерного пептида составляла 674 Да.
4. Цикличный пептид из Н8А (альбумина сыворотки человека) *Суз-Суз-Н1з-П1у-Азр-Ееи-Ееи-П1иСуз*, *ССНСПЕЕЕС* (М. м.: 992);
5. Цикличный пептид из Н8А *Суз-П1у-Н1з-П1у-Азр-Ееи-Ееи-П1и-Суз*, ССИСЭкЕЕС (М. м.: 946). В данном пептиде Суз252 заменен на С1у.
6. Линейный пептид р26 из Н8А: Н1з-П1у-Азр-Ееи-Ееи-П1и, ИСЭДЕЕ (М. м.: 683).
Реагенты.
Флуорогенные пептидные субстраты ЭЕУП-АМС и БЕНО-АЕС получали из А1ех13 Вюсйеш1са1з (8ап О1ецо, И8А). Цитохром С сердца быка (Су1-С), аденилнуклеотидтрифосфат (дАТФ) и другие реактивы получали из 81§ша Сйеш1са1 Со. АЕР человека выделяли из пуповинной сыворотки, используя ионообменную, аффинную хроматографию и хроматографию гель-фильтрацией, как описано у ОиФсй е! а1. (1999), Вюсйеш1з1гу, 38: 10406-10414. Чистоту АЕР устанавливали посредством РАПЕ и Коске!электрофореза с использованием моноспецифичных антител против АЕР человека и зрелых белков сыворотки и было показано, что она составляла не менее 99,8%.
Приготовление бесклеточного экстракта.
Клетки гепатокарциномы человека НерС2 и клеточную линию монобластомы человека И937 получали из американской коллекции типовых культур. Клеточные экстракты готовили, лизируя клетки в гипотоническом буфере для экстракции. Для того чтобы получить цитозольную фракцию 8-100, клеточный лизат центрифугировали в течение 1 ч при 100000хд. Экстракты либо использовали сразу же, либо замораживали при -70°С для использования позднее.
Бесклеточные реакции.
Бесклеточные реакции, как правило, проводили в реакционных объемах 13 мкл. Апоптоз вызывали введением различных доз цитохрома С из сердца быка и/или очищенного АЕР человека в присутствии 1 мМ дАТФ. Для реакций емкостью 13 мкл, 10 мкл экстракта клеток (~2-4 мг/мл, как определили анализом по Брэдфорду) дополняли 1 мкл дАТФ, 1 мкл Су!-С и/или раствором АЕР в реакционном буфере для того, чтобы получить необходимую конечную концентрацию реагентов. Для оценки активности пептидов различные дозы пептидов, растворенных в реакционном буфере вместе с 1 мМ дАТФ, добавляли к клеточному экстракту. Для того чтобы определить способность пептидов модулировать апоптотические эффекты Су!-С и АЕР, пептиды добавляли к экстракту за 10 мин до добавления цитохрома С или АЕР. Контрольные образцы инкубировали с равным объемом буфера (3 мкл) без добавления реагентов. Для
- 6 010058 того чтобы инициировать апоптоз, экстракты инкубировали при 37°С в течение 40 мин.
Определение активности каспазы.
В конце реакции активации каспазы аликвоты экстракта (5 мкл) дополняли флуорогенным субстратом ΌΕνθ-АМС (3 мМ) и затем инкубировали в течение определенных интервалов времени (0,5-1 ч) при 37°С. Реакции прекращали разбавлением, добавляя 2,0 мл охлажденного на льду 0,2 мМ натрийфосфатного буфера, рН 7,5, за которым следовало измерение флуоресценции на флуориметре Регкт Е1тег МРР-44А (/ехс=365 нм и /_ет=440 нм). Интенсивность флуоресценции для каждого образца нормализовали по отношению к концентрации цитозольных белков. Активацию каспазы представляли как отношение нормализованной интенсивности флуоресценции образца к соответствующему значению, измеренному с контрольным образцом.
Индукция апоптоза.
Клетки И937, 4х103 клеток/лунку, помещали в плоскодонный 96-луночный планшет (Сок1аг) в полной среде и инкубировали в течение 2 ч перед добавлением реагентов. Затем клетки обрабатывали в течение 24 ч различными дозами АВР, растворенного в РВ8, и затем оценивали пролиферацию. Обработку клеток цитотоксическими антителами 1дМ СН-11 против Рак проводили, как описано ранее. Клетки И937 обрабатывали антителами СН-11 в концентрации 50 нг/мл в течение 18 ч. Клетки оставляли без обработки или обрабатывали реагентами в течение соответствующих интервалов времени и в течение последних 4 ч культивирования подвергали их воздействию [3Н]-тимидина (1 Ки/ммоль/лунку). Экспериментальные данные выражали как процент включения [3Н]-тимидина в культурах клеток в трех повторах относительно контроля среды. В качестве контроля были взяты клетки, культивированные без дополнений.
Анализ активности пептидов.
Для анализа регулирующей рост активности пептидов, различные дозы пептидов добавляли к клеткам в течение 24 ч, и затем анализировали пролиферацию клеток, жизнеспособность клеток и фрагментацию ДНК. Для того чтобы определить способность пептидов модулировать апоптоз, вызванный другими факторами, клетки 1шка1 обрабатывали антителами СН-11 в концентрации 20 нг/мл без Ас1Э. клетки Кар обрабатывали СН-11 в присутствии 0,5 мкг/мл Ас1Э в течение 18 ч. Для индукции апоптоза ΤΝΡ-α клетки (1шка1, МСР7 или И937) обрабатывали в течение 24 ч цитокинами в концентрации 25 нг/мл и затем анализировали пролиферацию или жизнеспособность, как описано выше. Клетки НерО2 предварительно отмывали перед добавлением ΤΝΡ свежеприготовленной средой для того, чтобы удалить эндогенные факторы роста.
Пример 2. Идентификация специфичного для каспазы-3 содержащего ΚΟΌ активного участка АРР человека, ответственного за передачу сигнала апоптоза.
Для того чтобы определить функционально важные аминокислоты в молекуле АРР, авторы изобретения определили аминокислотную гомологию последовательности АРР человека и каспазы-3 и -1 и сконструировали структуру пептидного аналога предполагаемого активного участка. Изучали наложение следующих последовательностей:
сазр-2 ОЫКРКМЕТЮАСКЙРЕТРКОТ ♦ · · · · сазр-1 КРКРКУ11ЮАСКСР5 РСУУИ сазр-3 ТВКРКЬПЮАСВСТЕЪРСС!
НиАЕР УЬРУАЕУНЕНССКСТУЪРС10Р5ЕК1М5Г1С300РТЬ5ЫК1ТЕССКЬТТЕЕК60С11НАЕ 299 * · *’···· * ··· ·····«**: ··· ·· ·
Н5А УТРЬТКУНТЕССНСРЬЪЕСАРРНАРЬАКУ1СЕМ0Р5133КЬКЕССЕКРЬЪЕКЗНС1АЕУЕ 294
Из сравнения наложения последовательностей видно, что АРР имеет определенную гомологию с ферментативным активным центром каспазы 1 и 3. Ферментативно активные участки каспазы 1 и 2 содержат мотив ΚΟΌ, который расположен перед каталитически активным остатком Сук. Эффекторные каспазы 3 и 7 имеют в данном месте мотив КОТ, но положение остатков Сук полностью совпадает в молекуле АРР и в сакр-3 и сакр-7. Принимая во внимание, что АРР имеет межцепочечную дисульфидную связь между Сук252 и Сук259 (Моппада, е1. а1. (1983), Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А, 80: 4604-4608), авторы изобретения предложили гипотезу о расположении подобного каспазе активного участка молекулы АРР где-то между остатками Сук251-Сук259. Необходимо отметить, что сакр-3, -7 и -8 также имеют мотивы КОИ, но они расположены в других каталитически активных положениях (Вик1еу, е1 а1. (1999), №1иге, 397: 534-539). Свободный цистеин Суы258 в составе структуры пептида несомненно мог бы образовать межцепочечные дисульфидные связи между двумя соседними пептидами (фиг. 1). Для того чтобы доказать наличие функционально важных аминокислот в петле Сук251-Сук259 в молекуле АРР, авторы изобретения сконструировали структуру пептидного аналога предполагаемого активного участка. В качестве контроля также синтезировали гомологичные пептиды из Н8А.
- 7 010058
Пример 3. Цикличный пептид из ЛЕР апоциклин-А останавливает вызванный АЕР апоптоз в клетках И937.
Ранее опубликованные данные демонстрируют, что АЕР различного происхождения (эмбриональный или полученный из среды культивирования клеточной линии гепатомы НсрС2) может вызывать зависимое от дозы подавление роста и программируемую гибель клеток в различных опухолевых клеточных линиях, характеризующуюся классическими признаками апоптоза, такими как значительное подавление роста, цитотоксичность и фрагментация ДНК (ЭшПсй е! а1. (1999), 1. Еиг. Вюсйет. 266, 750-761). Для того чтобы определить возможное расположение активного участка в молекуле АЕР, который ответственнен за передачу сигнала апоптоза, авторы изобретения проверили способность различных пептидов, полученных из АЕР, блокировать данный эффект. На фиг. 2 демонстрируется, что полученный из АЕР пептид апоциклин-А полностью останавливает вызванный АЕР апоптоз в клетках И-937. Более того, предварительная обработка в течение 15 мин клеток И-937 апоциклином-А (1 мМ) вызывала 15% стимуляцию пролиферации относительно контроля среды. Это означает, что апоциклин-А также останавливает самопроизвольный апоптоз клеток во время 24-часового культивирования.
Пример 4. Апоциклин-А значительно ингибирует апоптоз, вызванный антителами против Еаз в клетках И-937.
Для проверки специфичности к АЕР, авторы изобретения проверили, может ли апоциклин-А влиять на апоптоз, вызванный другими факторами. Апоптоз в клетках И-937 вызывали различными дозами цитотоксических моноклональных антител 1дМ СН-11 против Еаз. На фиг. 3 продемонстрировано, что 0,5 мМ апоциклин-А значительно ингибирует опосредованный антителами против Еаз апоптоз, отменяя приблизительно 50% общего эффекта. Увеличение концентрации апоциклина-А до 1 мМ вызывало более значительное ингибирование вызванного антителами против Еаз апоптоза. Известно, что внутриклеточные пути метаболизма, вовлеченные в различные типы апоптоза, являются общими для большинства апоптотических факторов. Данные авторов изобретения указывают на то, что апоциклин-А нейтрализует действие зависимых от АЕР и Еаз метаболических путей передачи сигнала апоптоза, взаимодействуя с определенным рецептором, который вовлечен двумя факторами в передачу сигнала апоптоза.
Пример 5. Определение функционально важных аминокислот в активном участке молекулы АЕР.
a) Полученные из АЕР пептиды.
Цикличный пептид *СОКЮОУБПС* с заменой Суз252 на О1у и 6-членный пептид ЕСЭУЕП сконструировали для того, чтобы определить функционально важные аминокислоты в последовательности функционально важного активного участка, который ответственен за передачу сигнала апоптоза. На фиг. 4 продемонстрировано влияние ЮбВОПУБИС* на апоптоз, опосредованный АЕР в клетках И-937. Данный пептид не отменяет опосредованную АЕР цитотоксичность. Точно такие же результаты получили для КСОУИИ (фиг. 4). Эти данные указывают на то, что Суз252 является функционально важной аминокислотой, и его замена на О1у полностью аннулирует способность пептида взаимодействовать с апоптотической активностью полной молекулы АЕР. Более короткий пептид ЕСОУБП также не способен регулировать опосредованный АЕР апоптоз, показывая необходимость цикличной структуры для образования апоптотического активного участка.
b) Полученные из Н8А пептиды.
Альбумин, как известно, имеет достоверную гомологию с АЕР (Мопиада, е! а1. Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 80: 4604-4608). Также была обнаружена гомология в области предполагаемого активного участка, который моделировали пептидом апоциклином-А. Авторы изобретения сконструировали следующие пептиды из последовательности Н8А: цикличные пептиды *ССНОИББЕС*, *СОНОИББЕС* (с единичной заменой Суз на О1у) и линейный 6-членный пептид НООББЕ. Авторы изобретения также проверили способность данных пептидов влиять на вызванный АЕР апоптоз в целых клетках подобно тому, как описано выше (табл. 1). На фиг. 5 продемонстрировано, что *ССНОИББЕС* имеет схожую с апоциклином-А активность останавливать опосредованный АЕР апоптоз в клетках И-937. НОИББЕ и *СОНОИББЕС* не влияли на ответ клеток на АЕР.
- 8 010058
Таблица 1
Влияние полученных из АРР и Н8А пептидов на рост клеток и вызванный АРР апоптоз в клетках И-937
| Происхож- дение | Последова- тельность | 11 Влияние на рост клеток (% от контроля) | Способность влиять на апоптоз, вызванный АЕР |
| АЕР | *ССРСШУЬОС* | + 12 | Полная остановка |
| (апоцикли | |||
| н-А) | |||
| АЕР | СОКССУЬОС | -12 | Отсутствие эффекта |
| АГР | КСОУЬЭ | + 10 | Отсутствие эффекта |
| НЗА | *ССНООЬЬЕС* | + 18 | Полная остановка |
| НЗА | НСЭЬЬЕ | +20 | Отсутствие эффекта |
* Цикличные пептиды.
^Непосредственное влияние петпида при дозе 1 мМ на пролиферацию клеток и-937 (в %) от контроля без добавок.
Пример 6. Апоциклин-А действует совместно с низкими субоптимальными дозами эндогенного цитохрома С для того, чтобы вызвать активацию каспазы в бесклеточной системе.
Для того чтобы определить может ли апоциклин-А действовать подобно целой молекуле АРР для обеспечения активации каспазы в бесклеточной системе, авторы изобретения создали такую же бесклеточную систему, как описано выше, но вместо АРР использовали цикличный пептид апоциклин-А. На фиг. 8 продемонстрировано, что апоциклин-А синергично увеличивает общую активность каспазы-3 в бесклеточной системе в присутствии низких субоптимальных доз эндогенного цитохрома С и дАТФ. Без добавления дАТФ апоциклин-А был не способен вызывать протеолитическую активность в отношении ЭРУЭ в тех же самых экспериментальных условиях. Такой же эффект наблюдали для полной молекулы АРР в молчащих бесклеточных экстрактах. Эти данные показывают, что авторам изобретения удалось идентифицировать активные участки АРР и альбумина, ответственные за их стимулирующую апоптоз активность.
Пример 7. АРР действует синергично с низкими субоптимальными дозами цитохрома С и дАТФ при активации каспазы-3 в цитозольных клеточных экстрактах.
Авторы изобретения далее проверяли способность АРР вызывать активацию каспазы в бесклеточной системе. Добавление АРР в цитозольный экстракт 8-100 инициировало зависимую от дАТФ индукцию специфичной для каспазы-3 протеолитической активности в отношении ΏΕνϋ, которая постепенно увеличивалась в течение по крайней мере 2 ч (фиг. 7А). В качестве контроля равное количество альбумина сыворотки человека (Н8А) добавляли в такую же бесклеточную систему и показали отсутствие его влияния на уровень ΠΕνϋ-протеолизной активности. Низкая степень ΠΕνϋ-протеолизной активности также была вызвана одним дАТФ и происходила, очевидно, вследствие наличия небольшого количества эндогенного СуЕС в препаратах. При отсутствии дАТФ АРР совсем не вызывает никакой активации каспазы. Для того чтобы определить, может ли АРР непосредственно вызывать активацию каспазы в цитозольных экстрактах клеток или для этого необходимо присутствие низкого уровня СуЕС, авторы изобретения исследовали ΠΕνϋ-протеолизную активность после добавления экзогенного СуЕС в молчащий цитозольный экстракт с неподдающимся определению уровнем эндогенного цитохрома С. На фиг. 7В показано, что никакой ΠΕνϋ-протеолизной активности не выявлено в данном типе цитозольного лизата после 2 ч обработки в присутствии дАТФ и низкой субоптимальной дозы СуЕС. Тем не менее, добавление АРР (7 мкМ) в эту же самую реакционную систему инициировало процесс активации каспазы, которая постепенно увеличивалась зависимым от времени образом (фиг. 7В).
Пример 8. Отмена апоциклином-А опосредованной СуЕС/АРР активации каспазы в бесклеточной системе.
На фиг. 8 показано, что эффекты апоциклина-А на активацию каспазы-3 опосредованы различными дозами цитохрома С и АРР. Высокая доза пептида (750 мкМ) значительно (50-70%) ингибировала активацию каспазы, вызванной высокими дозами эндогенного цитохрома С (фиг. 8А). Комбинированная обработка цитозольной фракции цитохромом С/АРР приводила к значительному повышению общей ΠΕνϋ-протеолизной активности (фиг. 8А и В). Добавление апоциклина-А ингибировало опосредованную СуЕС/АРР активацию каспазы на 60-80%. Эти данные указывают на то, что апоциклин-А действует в бесклеточной системе обратным образом по сравнению с целой молекулой АРР, отменяя общий эффект активации каспазы, вызванный одним только СуЕС или в комбинации с АРР. Следовательно, апоциклин-А представляет собой последовательность молекулы АРР, которая ответственна за его апоптотическую активность и за взаимодействие с членами апоптосомного комплекса.
- 9 010058
Пример 9. Влияние полученных из АРР и полученных из Н8А пептидов на от дАТФ-зависимую опосредованную Су!-С активацию каспазы в бесклеточных цитозольных экстрактах.
Для того чтобы проверить способность различных пептидов влиять на активацию каспазы, вызванную экзогенным цитохромом-С в бесклеточной системе, авторы изобретения использовали цитозольные клеточные экстракты клеток НерС2. Аликвоты клеточных экстрактов предварительно обрабатывали пептидами в концентрации 750 мкМ в течение 15 мин и после этого вводили в реакционную смесь различные дозы цитохрома-С, чтобы вызвать активацию каспазы. Экстракты для контроля инкубировали с дАТФ без пептидов и цитохрома-С, но они не проявляли никакой каспазной активности. На фиг. 9 А видно, что пептиды из АРР, 9-членный пептид апоциклин-А и 6-членный пептид Κ(.ιΙ)νΐ.[), а также и 6-членный пептид из Н8А, I Ι(.ιΙ)Ι.Ι.Ε, вызывали значительное ингибирование опосредованной высокими дозами цитохрома-С активации каспазы. С другой стороны, цикличный мономерный 9-членный пептид с единичной аминокислотной заменой *(''(.ιΚ(.ι[)νΐ,[)('’*, а также и цикличный мультимерный пептид из Н8А *СС1 КЮЕЕЕС*, не показали никакой ингибирующей апоптоз активности ни в целых клетках, ни в бесклеточной системе. Следовательно, самый эффективный пептид апоциклин-А действительно воспроизводит активный участок АРР, который ответственен за передачу сигналов апоптоза. Определенно отличающийся эффект получили для активации каспазы, вызванной низкой дозой цитохрома С. На фиг. 9В показано, что апоциклин-А приводит к такой же стимуляции, как и полноразмерная молекула АРР, при вызванной низкой дозой цитохрома С активации каспазы. Пептиды *С(ЖЮ\;1.[)С* и *СС1 КЮЕЕЕС* не влияли на активность при низкой дозе цитохрома С, но пептиды К(Ю\'1.1) и IКЮЕЕЕ демонстрировали значительную отмену вызванной цитохромом С активации каспазы.
В табл. 2 просуммированы экспериментальные данные, характеризующие активность пептидов в бесклеточных цитозольных экстрактах.
Таблица 2
Модуляция различными пептидами опосредованной Су!-С активности ΏΕνΏ-азы в бесклеточной системе
Последовательность
Влияние на
Способность
Влияние на вызванную влиять на вызванную высокой вызванную АРР низкой дозой дозой Суб-С зависимую от
Суб-С активацию
Суб-С активацию активацию каспазы каспазы каспазы
30% стимуляция
Отсутствие
Отсутствие
Отсутствие
НСЦШЕ
Целый АЕР *Цикличный пептид.
кта 'мена •мена твие
Отсутствие
Пример 10. Получение антиидиотипических антител против биологически активного участка АРР.
Для иммунизации, объединения клеток и получения асцитной жидкости использовали мышей ВАЬВ/С. Двадцать мышей иммунизировали эмульсией высоко очищенного АРР человека (40 мкг) в полном адъюванте Фрейнда. Мышей стимулировали с интервалом в 2 недели тем же самым количеством АРР, эмульгированного в неполном адъюванте Фрейнда. Мышей с самым высоким ответом против АРР человека отбирали и внутривенно вводили им в хвосты 80 мкг АРР в 100 мкл раствора АРР, содержащего 50 мкл неполного адъюванта Фрейнда. Через три дня готовили клетки селезенки и смешивали с клетками миеломы мыши N8-1, после чего следовала обработка РЕО в среде КС, содержащей РС8. Объединенные клетки выращивали в среде НАТ, содержащей РС8, после чего следовало культивирование в среде НТ. Гибридомы проверяли на их способность производить антитела при помощи анализа ТК-Р1А, вовлекая поликлональное антитело кролика в качестве иммобилизированного захватывающего антитела
- 10 010058 и меченное европием антитело против человека в качестве антитела для мониторинга (для технических деталей и реактивов, см. публикацию Реигауцоп, Н. апй Когре1а, Т. с1 а1. Сйп.Сйет. 1993, 39, р. 847-848). Среди клонов, продуцирующих антитела, клоны, которые не были чувствительны к введению пептида *ССЯСПУЬПС* и его циклических форм, отбрасывали. Клоны, показывающие хороший ответ, выращивали до достаточного количества для того, чтобы можно было ввести их мышам для получения асцитной жидкости. Подготавливали асцитную жидкость и выделяли из нее моноклональные антитела против ЛЕР. Очищенные антитела подвергали протеолизу для того, чтобы получить ЕаЬ-фрагменты из выбранных клонов общеизвестными способами (для знакомства с методиками см. статью Мигопе1х апй Когре1а,
1. СНгота1одг. 2003, 790, рр. 53-66). С ЕаЬ-фрагментами производили ту же процедуру, что и для АЕР, как описанно выше, для того чтобы получить моноспецифичные антитела против ЕаЬ-фрагментов. С данными антиидиотипическими антителами против активного участка АЕР проводили скрининг клонов на их чувствительность к пептидам активного участка АЕР.
Антиидиотипическое антитело против активного участка альбумина человека в положении по последовательности 246-254 можно было бы сделать, по существу, теми же самыми методиками, что и против АЕР, описанными выше.
Claims (20)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Пептид, представляющий собой фрагмент белка, который распознается антиидиотипическим антителом против апоптотически активного участка α-фетопротеина человека, соответствующего аминокислотной последовательности 251-259 данного белка, или антиидиотипическим антителом против альбумина человека к последовательности 246-254 альбумина человека.
- 2. Пептид, соответствующий активному центру α-фетопротеина или альбумина человека, имеющий аминокислотную последовательность ΟΟΡΟΌνΕΌΟ,Χ,,Υ. или ССНОПЕЬЕСпХт¥, в которой X обозначает любую гидрофобную аминокислоту и Υ обозначает любую гидрофильную аминокислоту, индекс п равен 0, 1, 2 или 3 и индекс т равен 0, 1, 2 или 3.
- 3. Пептид по п.2, где пептид дополнительно содержит на Ν-конце 0, 1, 2 или 3 фланкирующих остатка цистеина и 0, 1, 2 или 3 фланкирующих остатка цистеина на С-конце.
- 4. Пептид по п.2, имеющий полимеризованную или цикличную структуру, где циклизование или полимеризация осуществляется посредством химического взаимодействия аминокислотных остатков цистеина или других аминокислотных остатков, способных образовывать межмолекулярные сшивки.
- 5. Пептид по любому из пп.2-4, отличающийся одновременным наличием последовательностей ΚΟΌ и ΌΧΧΌ в одной и той же молекуле, в которой X обозначает любой гидрофобный аминокислотный остаток и К, О и Ό обозначают Агд, О1у и Акр соответственно.
- 6. Пептид по п.5, в котором Ό в последовательности ΚΟΌ является общим с последовательностью ΌΧΧΌ.
- 7. Пептид по любому из пп.2-6, где любой из X обозначает независимо V, Ь или и Υ обозначает Ό, Е или О.
- 8. Пептид по п.2, включающий последовательность 0*0*ΚΟΌνΕΌΟ*, представленный в линейной, полимеризованной или цикличной форме, где аминокислотные остатки, отмеченные звездочкой, обозначают места образования возможных дисульфидных связей.
- 9. Пептид по п.2, включающий последовательность С*С*НОПЕЬЕС*, представленный в линейной, полимеризованной или цикличной форме, где аминокислотные остатки, отмеченные звездочкой, обозначают места образования возможных дисульфидных связей.
- 10. Применение пептида по любому из пп.1-9 для подавления апоптотических регуляторных метаболических путей в клетках животных и человека.
- 11. Применение пептида по любому из пп.1-9 для увеличения сохранности органов или клеток при их трансплантации.
- 12. Применение пептида по любому из пп.1-9 для предотвращения возникновения аутоиммунных нарушений и синдрома иммунодефицита, вызванного вирусной инфекцией.
- 13. Применение пептида по любому из пп.1-9 для снижения цитотоксических эффектов после химио- и лучевой терапии.
- 14. Применение пептида по любому из пп.1-9 для ингибирования апоптоза нейронных клеток, неспецифичного вызванного лекарственными средствами апоптоза или опосредованного окислительным стрессом апоптоза.
- 15. Применение пептида по любому из пп.1-9 для предотвращения апоптоза культивируемых клеток, в том числе стволовых клеток костного мозга, мезинхимальных стволовых клеток, эмбриональных стволовых клеток, получаемых для научных, медицинских или технических целей.
- 16. Косметическая композиция для омоложения кожи и профилактики старения кожи, содержащая пептид по любому из пп.1-9, приемлемые в косметологии носители и наполнители и, необязательно, производные витаминов А, Е, Д, антиоксиданты, стероидные гормоны, изофлавиноиды растительного происхождения.- 11 010058
- 17. Применение косметической композиции по п.16 для омоложения кожи и профилактики старения кожи, в том числе вызванного ультрафиолетовым облучением и профилактики солнечной радиации, путем нанесения указанной композиции на кожу индивидуума.
- 18. Антиидиотипическое антитело или фрагмент антиидиотипического антитела, имеющий паратоп с молекулярной структурой, обеспечивающей распознавание апоптотически активного участка α-фетопротеина человека или альбумина сыворотки человека, состоящего из аминокислотных остатков 251-259 последовательности α-фетопротеина или аминокислотных остатков 246-254 альбумина.
- 19. Пептид, имеющий эпитоп или участок связывания с антителами или их фрагментами, определенными в п.18.
- 20. Белок, содержащий в своей структуре аминокислотную последовательность пептида, определенного в п.19.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20021798A FI118263B (fi) | 2002-10-09 | 2002-10-09 | Kaspaasiaktiivisuutta säätelevät peptidit |
| PCT/FI2003/000735 WO2004033500A1 (en) | 2002-10-09 | 2003-10-07 | Peptides modulating caspase activation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200500606A1 EA200500606A1 (ru) | 2006-06-30 |
| EA010058B1 true EA010058B1 (ru) | 2008-06-30 |
Family
ID=8564726
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200500606A EA010058B1 (ru) | 2002-10-09 | 2003-10-07 | Пептиды, модулирующие активацию каспазы |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7446095B2 (ru) |
| EP (1) | EP1558649B1 (ru) |
| JP (1) | JP4446121B2 (ru) |
| CN (1) | CN100551930C (ru) |
| AT (1) | ATE470677T1 (ru) |
| AU (1) | AU2003271784A1 (ru) |
| DE (1) | DE60332950D1 (ru) |
| DK (1) | DK1558649T3 (ru) |
| EA (1) | EA010058B1 (ru) |
| ES (1) | ES2347234T3 (ru) |
| FI (1) | FI118263B (ru) |
| PT (1) | PT1558649E (ru) |
| WO (1) | WO2004033500A1 (ru) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2444105A4 (en) * | 2009-06-16 | 2013-08-21 | Univ Tokai | GRAM NEGATIVE ANTI-BACTERIAL AGENT |
| CN101812448B (zh) * | 2010-01-15 | 2011-12-07 | 浙江大学 | 一种肝癌靶向双重组凋亡蛋白表达序列及应用 |
| CN102060913B (zh) * | 2010-11-30 | 2012-09-05 | 暨南大学 | 一种与人血清白蛋白结合的七肽与应用 |
| US10238690B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-03-26 | Celgene Corporation | Modified T lymphocytes comprising an inducible caspase and methods of apoptosis |
| CN108186666B (zh) * | 2018-01-29 | 2020-02-21 | 西北大学 | 一种dna纳米带在抗细胞凋亡上的应用及其制备方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0353814A2 (en) * | 1988-07-29 | 1990-02-07 | SCLAVO S.p.A. | Synthetic peptide endowed with immunological activity, capable of inducing the production of antibodies with a high specificity towards alpha-fetoprotein, and their use in the diagnostic field |
| WO1996022787A1 (en) * | 1995-01-24 | 1996-08-01 | Murgita Robert A | Recombinant human alpha-fetoprotein and uses thereof |
| WO1998010787A2 (en) * | 1996-09-11 | 1998-03-19 | Prendergast Patrick T | Pharmaceutical compositions for the treatment of immune disorders |
| WO1998035981A1 (en) * | 1997-02-13 | 1998-08-20 | The Regents Of The University Of California | Prevention and treatment of hepatocellular cancer |
| WO2001015709A1 (en) * | 1999-09-02 | 2001-03-08 | Atlantic Biopharmaceuticals, Inc. | USE OF rAFP TO INHIBIT OR PREVENT APOPTOSIS |
| WO2003007978A1 (en) * | 2001-06-02 | 2003-01-30 | Clf Medical Technology Acceleration Program, Inc. | Alpha-fetoprotein peptides and uses thereof |
-
2002
- 2002-10-09 FI FI20021798A patent/FI118263B/fi active IP Right Grant
-
2003
- 2003-10-07 AU AU2003271784A patent/AU2003271784A1/en not_active Abandoned
- 2003-10-07 AT AT03753618T patent/ATE470677T1/de active
- 2003-10-07 ES ES03753618T patent/ES2347234T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-07 PT PT03753618T patent/PT1558649E/pt unknown
- 2003-10-07 JP JP2004542524A patent/JP4446121B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-10-07 EP EP03753618A patent/EP1558649B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-07 EA EA200500606A patent/EA010058B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-10-07 US US10/530,779 patent/US7446095B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-10-07 DE DE60332950T patent/DE60332950D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-07 CN CNB2003801011658A patent/CN100551930C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-10-07 DK DK03753618.2T patent/DK1558649T3/da active
- 2003-10-07 WO PCT/FI2003/000735 patent/WO2004033500A1/en active Application Filing
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0353814A2 (en) * | 1988-07-29 | 1990-02-07 | SCLAVO S.p.A. | Synthetic peptide endowed with immunological activity, capable of inducing the production of antibodies with a high specificity towards alpha-fetoprotein, and their use in the diagnostic field |
| WO1996022787A1 (en) * | 1995-01-24 | 1996-08-01 | Murgita Robert A | Recombinant human alpha-fetoprotein and uses thereof |
| WO1998010787A2 (en) * | 1996-09-11 | 1998-03-19 | Prendergast Patrick T | Pharmaceutical compositions for the treatment of immune disorders |
| WO1998035981A1 (en) * | 1997-02-13 | 1998-08-20 | The Regents Of The University Of California | Prevention and treatment of hepatocellular cancer |
| WO2001015709A1 (en) * | 1999-09-02 | 2001-03-08 | Atlantic Biopharmaceuticals, Inc. | USE OF rAFP TO INHIBIT OR PREVENT APOPTOSIS |
| WO2003007978A1 (en) * | 2001-06-02 | 2003-01-30 | Clf Medical Technology Acceleration Program, Inc. | Alpha-fetoprotein peptides and uses thereof |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Cell Biology and Toxicology, Volume 16, 2000, C.D. Anuradha et al., "RGD peptide-induced apoptosis in human leukemia HL-60 cells requires caspate-3 activation", paes 275-283, page 276 * |
| The Journal of Immunology, Volume 166, 2001, Lisa H. Butterfield et al., "T Cell Responses to HLA-A *0201-Restricted Peptides Derived from Human alpha Fetoprotein", pages 5300-5308, Table I * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI118263B (fi) | 2007-09-14 |
| DK1558649T3 (da) | 2010-10-11 |
| ES2347234T3 (es) | 2010-10-27 |
| CN1703428A (zh) | 2005-11-30 |
| CN100551930C (zh) | 2009-10-21 |
| WO2004033500A1 (en) | 2004-04-22 |
| US7446095B2 (en) | 2008-11-04 |
| PT1558649E (pt) | 2010-09-14 |
| ATE470677T1 (de) | 2010-06-15 |
| AU2003271784A1 (en) | 2004-05-04 |
| FI20021798A (fi) | 2004-04-10 |
| JP2006518703A (ja) | 2006-08-17 |
| EP1558649A1 (en) | 2005-08-03 |
| EP1558649B1 (en) | 2010-06-09 |
| EA200500606A1 (ru) | 2006-06-30 |
| US20060280732A1 (en) | 2006-12-14 |
| DE60332950D1 (de) | 2010-07-22 |
| JP4446121B2 (ja) | 2010-04-07 |
| FI20021798A0 (fi) | 2002-10-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kobayashi et al. | The Pmel 17/silver locus protein. Characterization and investigation of its melanogenic function. | |
| CN102458468B (zh) | 抗-cd100抗体和其使用方法 | |
| US8053556B2 (en) | Glypican-3 (GPC3)-derived tumor rejection antigenic peptides useful for HLA-A2-positive patients and pharmaceutical comprising the same | |
| Polans et al. | Recoverin, but not visinin, is an autoantigen in the human retina identified with a cancer-associated retinopathy. | |
| AU768002B2 (en) | Immunotherapeutic composition and method for the treatment of prostate cancer | |
| JP5230420B2 (ja) | Ｃｄ４結合ペプチドおよび放射線による治療 | |
| CN101827936B (zh) | Cdh3肽以及含有cdh3肽的药剂 | |
| US20150183843A1 (en) | Glycoproteins having lipid mobilising properties and therapeutic applications thereof | |
| EP0896615B1 (en) | Peptide from soluble form of acetylcholinesterase, active as a calcium channel modulator | |
| KR20220142975A (ko) | 조절 t 세포 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체 | |
| WO2000026342A1 (en) | Method of interfering with cell proliferation | |
| EA010058B1 (ru) | Пептиды, модулирующие активацию каспазы | |
| CN113939305A (zh) | 用于治疗癌症的与免疫检查点抑制剂组合的肽 | |
| Becker et al. | Induction of plasminogen activator synthesis by antibodies. | |
| US11021541B2 (en) | Method of inhibiting the gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor by administering a GHR-106 monoclonal antibody | |
| GIRARD et al. | Hyaluronectin: detection with monoclonal antibodies in human tumors | |
| JP4503287B2 (ja) | 星状細胞及び星状細胞性腫瘍細胞の増殖を阻害する方法と、ニューロンの生存を高める方法、並びにその使用 | |
| WO2023026881A1 (ja) | 抗ｐｄ－１シグナルペプチド抗体とその利用 | |
| Chamani et al. | Evaluation of molecular-level changes of Programmed cell Death Ligand-1 after radiotherapy in a BALB/c CT26 colorectal mouse tumor model | |
| CN114945385A (zh) | 痴呆症的预防或治疗剂 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC1A | Registration of transfer to a eurasian application by force of assignment | ||
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): KZ MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |