EA010058B1

EA010058B1 - Пептиды, модулирующие активацию каспазы

Info

Publication number: EA010058B1
Application number: EA200500606A
Authority: EA
Inventors: Елена Ивановна Дудич; Лидия Николаевна Семенкова; Игорь Вячеславович Дудич; Эдуард Борисович Татулов; Дмитрий Львович Зубов; Тимо Калеви Корпела
Original assignee: Эдуард Борисович Татулов; Елена Ивановна Дудич
Priority date: 2002-10-09
Filing date: 2003-10-07
Publication date: 2008-06-30
Also published as: FI20021798A; JP4446121B2; US7446095B2; EP1558649A1; PT1558649E; DK1558649T3; AU2003271784A1; JP2006518703A; CN1703428A; ES2347234T3; ATE470677T1; CN100551930C; DE60332950D1; WO2004033500A1; EA200500606A1; FI20021798A0; EP1558649B1; US20060280732A1; FI118263B

Abstract

Настоящее изобретение раскрывает структуры небольших молекул, способных к модуляции апоптотической гибели клетки. В частности, структуры относятся к структурам апоптотически активных участков α-фетопротеина (AFP) и альбумина млекопитающих. Пептиды, имитирующие активный участок, содержат две последовательности: Arg-Gly-Asp и Asp-X-X-Asp, X обозначает любую аминокислоту. Данные последовательности необходимы в той же самой молекуле для того, чтобы вызвать широкий диапазон биологической активности. Пептиды можно использовать для того, чтобы подавить апоптотические метаболические пути, ингибируя опосредованную цитохромом С активацию каспазы. Таким образом, пептиды можно использовать для того, чтобы ингибировать эффекты апоптоза, вызванного окислительным стрессом, лекарственными средствами, цитокинами, лигандами Fas, α-фетопротеином, используемым для предотвращения апоптоза в культивирующихся клетках, в органах для трансплантации, при иммунологических аутоиммунных нарушениях и синдроме иммунодефицита, вызванном вирусной инфекцией, или для уменьшения побочных цитотоксических эффектов после химиотерапии и лучевой терапии.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к медицине и механизмам гибели клеток человека и животных. В частности, изобретение относится к пептидам, способным останавливать апоптотическую гибель клетки, вызванную различными факторами. Изобретение описывает пептиды с такими активностями, способы получения и применение указанных пептидов.

Уровень техники изобретения

Апоптоз представляет собой активную форму гибели клеток и принимает участие во множестве процессов нормального развития клетки, а также при злокачественном перерождении клеток. Механизм апоптоза вовлечен в биологические процессы, вызванные действием различных типов лекарственных средств, цитокинов и факторов роста, окислительным стрессом, радиацией, старением, аутоиммунными заболеваниями и иммунным отторжением при трансплантации органов. Недавние исследования апоптоза демонстрируют, что при различных типах апоптоза, обусловленных действием гормонов, цитокинов, отсутствием факторов роста, химиотерапевтическими агентами, ионизирующей радиацией, иммунологическими нарушениями, СПИД, раком и старением, используются общие молекулярные механизмы (Ыада1а (1997), Се11 88, 355-365).

Активация каспазных протеаз по каскадному принципу представляет собой фундаментальный момент в индукции апоптоза. Описаны два различных типа передачи сигналов апоптоза. Начальная фаза зависимого от рецепторов инициирования апоптоза включает в себя активацию соответствующих рецепторов гибели определенными лигандами, такими как ΤΝΡ или РакЬ, которые в настоящее время являются наиболее изученными индукторами апоптоза. После активации рецепторы гибели на поверхности клеток, Рак (СЭ95) или ΤΝΡΚ.1, присоединяются к цитозольным белкам-адаптерам (ΡΑΌΌ, ΜΟΒΤ, В1Р, ΤΚΑΌΌ), которые в свою очередь вводят каспазу-8 для активации каскада интерлейкин-1-в-превращающего фермента 1СЕ и протеазы (каспазы) семейства СЕЭ-3, сопровождающегося активацией СРР32/каспазы-3-подсемейства цистеиновых протеаз, представители которого находятся в цитоплазме клетки в форме латентных предшественников, прокаспаз (Епап, е! а1. (1996), ΝιΙιιιό 380: 723-726). Рецепторнезависимые типы апоптоза обычно включают критически важный вызываемый цитохромом С механизм, для которого необходимо формирование мультимолекулярного комплекса цитохрома С, дАТФ, АраР-1 и прокаспазы-9, который приводит к активации последней посредством аутопротеолиза и гомодимеризации и последующей активации каспазного каскада (Со1еп, е! а1. (1997), ВюсНеш. 1., 326: 1-16).

Агенты, которые влияют на биологический контроль апоптоза таким образом, имеют потенциальное терапевтическое применение в многочисленных клинических приложениях. Большое количество полученных из растений ингибиторов апоптоза используется для скрининга патологических нарушений, которые часто сопровождают химиотерапию, радиационные воздействия, иммунные нарушения или СПИД. Данные добавки обычно содержат углеводы, жир и гидролизаты растительных белков, лектины и фосфолипиды (И8 6004579, Вагг е! а1.). Эффективные регуляторы апоптоза можно было бы применять при лечении больных раком, чтобы контролировать терапию цитокинами, химиотерапию или лучевую терапию. Апоптотические механизмы действуют при различных типах иммунологических нарушений, таких как аутоиммунные заболевания, иммунное отторжение при трансплантации органа или анафилаксия, или при вирусных инфекциях, вызванных вирусом иммунодефицита человека.

Альфа-фетопротеин (АРР) представляет собой ассоциированный с опухолью эмбриональный гликопротеин, демонстрирующий широкий диапазон биологических активностей, охватывающих регуляцию роста клетки, дифференцировку незрелых клеток, иммуносупрессию активированных иммунных клеток, специфичную для опухоли индукцию апоптоза и регуляцию апоптотических сигналов, опосредуемых другими факторами, а также регуляцию экспрессии различных генов (М|/е)е\\ъку (2001), Ехр. Вю1. Меб., ν. 226: 377-408). Многочисленные доказательства регуляции активности роста клеток, включая подавляющую рост опухоли активность, были описаны для различных видов полноразмерной молекулы АРР, ее протеолитических фрагментов или рекомбинантных доменов и синтетических пептидов (ЭибюБ е! а1. (1999), ВюсйешЩгу, 38: 10406-10414; 1асоЬкоп е! а1., Ргос. Ν;·Η1. Асаб. 8с1. И8А (2002), 99: 2211-2215; МасСо11 е! а1. (2001), ВюсНеш. ВюрНук. Ас!а, 1528: 127-134). Поиск расположения функциональных активных участков молекулы АРР, которые ответственны за множество ее активностей, был предпринят различными исследователями. Определение расположения участков связывания арахидоновой кислоты и эстрадиола было успешным (рассмотрено в обзоре М|/е)е\\ъку. (2001) Ехр. Вю1. Меб., ν. 226: 377-408).

Недавно было продемонстрировано, что АРР реализует свою онкосуппрессивную активность, инициируя апоптоз посредством активации каспазы-3 и независимо от передачи сигнала Рак/РакЬ и ΤΝΡ/ΤΝΡΒ (Эиб1с11 е! а1., (1999) Еиг. 1. ВюсНеш. 282). За последнее десятилетие описаны многочисленные доказательства супрессии роста опухолевых клеток, опосредованной АРР, но активный участок молекулы АРР, который ответственен за передачу сигнала апоптоза, не был до сих пор идентифицирован.

ДНК и аминокислотные последовательности АРР человека были опубликованы (Могшада, е!. а1.,Рпшагу к1гис!игек оГ 1шшап а1рйа-Ге!орго!еш апб ί!κ тВЛА. Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А, 80: 4604-4608 (1983)). Синтетические пептиды, соответствующие участку связывания Е2, как было показано, обладают

- 1 010058 подавляющей рост опухоли активностью (патенты США И8 5674842; 10/1997 М|/е)е\\'кку; И8 5707963, 07/1998 М|/е)е\\'кку). Множество биологически активных белков имеет гомологичную с АРР последовательность (М|/е)е\\'кку (2001), Εxρ. ΒίοΙ. Мей., ν. 226(5): 377-408). Была идентифицирована достоверная гомология АРР с различными белками, вовлеченными в передачу сигнала апоптоза, такими как Вс12, ΤΝΡΒ1, Рак и др. (М|/е)е\\'кку (2001), Εχρ. ΒίοΙ. Мей., ν. 226(5): 377-408). Β \УО 9835981 А1 (Есопотои, 1. е! а1., 1998) описано использование 66 пептидных последовательностей АРР, которые используют для иммунизации против рака. Один из пептидов, А20, имел последовательность СЯОПУИПСЬ, которая, как случайно оказалось, содержала часть активного участка АРР, обнаруженного в настоящем изобретении. Тем не менее, не было обнаружено никакой специфической активности для пептида ОРСОУШСИ и настоящее изобретение остается первым изобретением, способным определить один из предполагаемых биологически активных участков АРР. Более того, пептиды по настоящему изобретению содержат остаток цистеина, который способен к образованию межцепочечных дисульфидных связей, что приводит к появлению более высокой биологической активности, чем для пептида с последовательностью СНС11)\Т1)С1..

Важный участок связывания интегрина представляет собой трипептид Агд-О1у-Акр, который присутствует у множества лигандов интегрина. Интегрины являются гетеродимерными гликопротеинами, опосредующими взаимодействия цитоплазматического матрикса с клеткой и клетки с клеткой, они играют активную роль в процессах дифференцировки клетки, иммунного распознавания, развития опухоли и метастатического роста. В субъединицах интегрина были идентифицированы области контакта для последовательности Агд-01у-Акр (Ракдиайп!, е! а1. 1. Се11 ΒίοΙ. (1995), 130: 1189-1196). Синтетические пептиды, содержащие мотив Агд-01у-Акр, используются в качестве ингибиторов взаимодействия лигандов с интегрином. Было показано, что синтетические пептиды, содержащие мотив Агд-01у-Акр, способны к непосредственной активации каспазы-3 ^иНеу, е! а1. (1999), №!иге, 397: 534-539). АРР содержит в своей последовательности последовательность Агд-01у-Акр (ΒΟΌ), которая расположена в домене II в положении 253-255. По настоящему изобретению последовательность ЯСЭ является частью функционально активного участка АРР, вовлеченного в передачу сигнала апоптоза.

В настоящем изобретении описана минимальная часть молекулы АРР, которая ответственна за передачу сигнала апоптоза. Небольшие пептиды или другие небольшие гаптены являются важными регуляторами, используемыми в качестве лекарственных средств, поскольку их можно синтезировать ίη νί!το и они не вызывают образование нейтрализующих антител. Пептиды, содержащие от 6 до 10 остатков, были получены при помощи твердофазной химии Р-МОС. Также были синтезированы подобные пептиды, соответствующие гомологичным последовательностям альбумина сыворотки человека (Н8А). Для всех пептидов оценивали их регулирующую активность роста в целых клетках в культуре, и также проверяли их способность непосредственно индуцировать активацию каспазы в бесклеточных цитозольных экстрактах. Дополнительно оценивали способность пептидов модулировать апоптоз, вызванный АРР и цитотоксическими МаЬ СН-11 против Рак в целых клетках, и влиять на индуцированную цитохромом С активацию каспазы в бесклеточных системах.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показано схематическое представление биологически активного димерного пептида (мономер обозначен здесь как апоциклин-А; *Сук-Сук-Агд-61у-Акр-Уа1-Ьеи-Акр-Сук*).

На фиг. 2 показано ингибирование мультимерным циклическим 9-членным пептидом апоциклиномА (*Сук-Сук-Агд-61у-Акр-Уа1-Ьеи-Акр-Сук*) вызванного АРР апоптоза. Клетки И-937 обрабатывали в лунках планшета для микротитрования в течение 15 мин различными дозами апоциклина-А, и после этого 3 мкм очищенного АРР человека добавляли к каждой лунке. Пролиферацию клеток оценивали при помощи анализа с введением [³Н]-тимидина через 24 ч инкубации.

На фиг. 3 показано влияние цикличного 9-членного пептида апоциклина-А (*Сук-Сук-Агд-С1у-АкрУа1-Ьеи-Акр-Сук*) на апоптоз, вызванный в клетках И-937 цитотоксическими моноклональными антителами СН-11 против Рак. Клетки в течение 15 мин обрабатывали апоциклином-А в концентрации 500 мкМ и после этого в каждую лунку добавляли различные дозы цитотоксических МаЬ СН-11 против Рак (1ттипо!есй Ь!й). Пролиферацию клеток оценивали при помощи анализа с введением [³Н]-тимидина через 16 ч инкубации.

На фиг. 4 показано влияние линейных 6-членных пептидов Агд-61у-Акр-Уа1-Ьеи-Акр (РСОУБП) и Н1к-61у-Акр-Ьеи-Ьеи-61и (НбПЬЬЕ) на опосредованное АРР подавление роста клеток И-937. Клетки в течение 15 мин обрабатывали различными дозами пептидов и после этого в каждую лунку добавляли 3 мкМ очищенного АРР человека. Пролиферацию клеток оценивали при помощи анализа с введением [³Н]-тимидина через 24 ч инкубации.

На фиг. 5 показано влияние цикличного мономерного 9-членного пептида *Сук-С1у-Агд-С1у-АкрУа1-Ьеи-Акр-Сук* (*ССРСОУРПС*) на опосредованное АРР подавление роста клеточной линии миелобластомы человека И-937. Клетки в течение 15 мин обрабатывали различными дозами пептида и после этого в каждую лунку добавляли 3 мкМ очищенного АРР-человека. Пролиферацию клеток оценивали при помощи анализа с введением [³Н]-тимидина через 24 ч инкубации.

- 2 010058

На фиг. 6 показано, что цикличный 9-членный пептид апоциклин-А (*ССЯСПУЬПС*) увеличивает в бесклеточных цитозольных экстрактах дАТФ-зависимую активацию прокаспазы-3, вызванную низкими дозами эндогенного Су!-С. Клеточные экстракты из клеток И937 инкубировали в течение 40 мин с различными дозами апоциклина-А и 1 мМ дАТФ. Экстракты, инкубированные без добавок, были взяты в качестве контроля. Активацию каспазы-3 анализировали по расщеплению флуорогенного субстрата ΌΕνθ-АРС.

На фиг. 7 показано синергическое усиление с помощью АРР человека опосредованной цитохромом С активации каспазы в бесклеточной системе:

(A) АРР вызывает активацию каспазы-3 в бесклеточных цитозольных экстрактах в присутствии дАТФ. Аликвоты полученного из НерС2 цитозольного экстракта (25 мкг белка) обрабатывали АРР (7 мкМ) в течение различных временных интервалов или в качестве контроля с такой же дозой Н8А в присутствии дАТФ (1 мМ) и затем оценивали активность по протеолизу субстрата ΌΕνΟ;

(B) Синергическое повышение опосредованной АРР активации каспазы-3 в присутствии субоптимальной дозы экзогенного цитохрома С в цитозольном экстракте клеток НерС2. Аликвоты полученного из НерС2 цитозольного экстракта (25 мкг белка) в течение различных временных интервалов обрабатывали АРР (10 мкМ), цитохромом С (0,2 мкМ) или комбинацией таких же доз обоих соединений в присутствии дАТФ (1 мМ) и затем оценивали активность по протеолизу субстрата ΌΕνΟ;

(C) АРР по-разному воздействует на активацию каспазы-3 в бесклеточных цитозольных экстрактах, вызываемую различными дозами цитохрома С. Аликвоты цитозольного экстракта из 8100 (25 мкг белка) в течение 30 мин обрабатывали АРР (10 мкМ) и различными дозами цитохрома С в присутствии дАТФ (1 мМ) и затем оценивали активность по протеолизу субстрата ΌΕνΟ. Показано среднее значение ± стандартное отклонение для четырех групп данных.

На фиг. 8 показаны эффекты пептидов апоциклина-А *ССК.6ПУЪПС*, ССВСЭУРПС.

^^ΟΌΕΕΕ^, ВСЭУЕП и НСЭРЕ-Ε на дАТФ-зависимую активацию каспазы, вызванную Су!-С, в бесклеточных цитозольных экстрактах клеток НерС2 при высокой дозе (165 нМ) эндогенного цитохрома С (А) и низкой дозе (110 нМ) эндогенного цитохрома С (В). Пептиды в высокой концентрации 750 мкМ добавляли к клеточному экстракту за 15 мин до добавления цитохрома С. За активацией каспазы следили по расщеплению специфичного для каспазы-3 флуорогенного субстрата ΌΕνθ-АМС.

На фиг. 9 показано, что мультимерный 9-членный пептид апоциклин-А (*ССРСЭУЕПС*) отменяет опосредованную цитохромом С/АРР активацию каспазы-3 в бесклеточной системе. Аликвоты полученных из НерС2 цитозольных экстрактов предварительно обрабатывали в течение 15 мин апоциклином-А в концентрации 750 мкМ и затем обрабатывали в течение 40 мин 10 мкМ АРР и/или 110 нМ (А) или 80 нМ (В) цитохрома С в присутствии 1 мМ дАТФ. За активацией каспазы следили по расщеплению специфичного для каспазы-3 флуорогенного субстрата ΌΕνθ-АМС.

Подробное описание изобретения

Предмет изобретения относится к пептидам, и в частности к искусственным синтетическим мультимерным циклическим пептидам, способным к регуляции апоптотической гибели клетки. Более конкретно, оно относится к оригинальной аминокислотной последовательности молекулы α-фетопротеина человека (АРР) или альбумина человека, ответственной за регуляцию апоптоза в клетках опухоли.

АРР представляет собой ассоциированный с опухолью эмбриональный гликопротеин, демонстрирующий широкий диапазон биологических активностей, охватывающих регуляцию роста клетки, дифференцировку незрелых клеток, иммуносупрессию активированных иммунных клеток, специфичную индукцию апоптоза в опухоли и регуляцию апоптотических сигналов, опосредуемых другими факторами, регуляцию экспрессии генов. Недавно было показано, что АРР может вызывать избирательный апоптоз опухолей посредством прямой или непрямой активации каспазы-3 в клетках и в бесклеточной системе (ЭпФсН е! а1., 1999, 1. Ειπ. Вюсйеш. 266, 750-761; 8ешепкоуа е! а1. (2003), 1. Ειπ. Вюсйеш. 270: 276282). По настоящему изобретению активный участок таких эффектов обнаружили в АРР, а также в альбумине. Были смоделированы пептиды, формирующие активный центр, и проведен скрининг биологической активности большого количества синтетических природных и неприродных пептидов.

Пептиды по настоящему изобретению можно использовать для ингибирования различных типов клеточной гибели, которая зависит от активации опосредованного цитохромом С каспазного каскада, например апоптоза, вызываемого окислительным стрессом, лекарственными средствами, цитокинами, лигандом Раз, α-фетопротеином. Пептиды можно использовать для предотвращения апоптоза в культурах клеток, для увеличения сохранности органов для трансплантации, для предотвращения иммунологических аутоиммунных нарушений и синдрома иммунодефицита, вызванного вирусной инфекцией, побочных цитотоксических эффектов после химиотерапии и лучевой терапии. Также представлены аминокислотные последовательности пептидов и способы создания и использования пептидов. Самыми активными структурами пептидов являются искусственные синтетические пептиды, имеющие жесткую молекулярную структуру, подобную

- 3 010058

В настоящем изобретении предпринята попытка определить активный участок молекулы АРР, ответственный за инициацию апоптоза в раковых клетках, используя теоретические и экспериментальные подходы. Была предложена гипотеза, что активный пептид, моделирующий активный участок, мог бы непосредственно вызывать апоптоз в целых клетках и инициировать активацию каспазы-3 в бесклеточной системе или мог бы модулировать апоптотические сигналы, вызванные АРР и/или другими апоптотическими факторами, такими как антитела против Раз или цитохром С. Удивительно, что синтетический цикличный пептид *Суз-Суз-Агд-О1у-Азр-Уа1-Реи-Азр-Суз* (обозначаемый здесь как апоциклин-А), созданный по образцу части молекулы АРР, имеющий достоверную гомологию с некоторыми каспазами, как оказалось, был биологически активным. Ряд замен в последовательности аминокислот апоциклина-А был предпринят для идентификации функционально важных аминокислот. Также синтезировали большое количество пептидов, родственных с апоциклином-А. Все пептиды проверяли на их способность влиять на выживание опухолевых клеток в культуре и влиять на активацию каспазы в бесклеточных цитозольных лизатах. Следующая стадия проверки пептидов была предпринята для исследования способности пептидов влиять на апоптоз, вызванный АРР, антителами против Раз в целых клетках и модулировать активацию каспазы, опосредованную Су1-С, в бесклеточной системе.

Продемонстрировали, что 9-членный пептид апоциклин-А, соответствующий последовательности АРР 251-259, полностью останавливал опосредованный АРР апоптоз в клетках опухоли ίπ νίΐΓΟ и значительно модулировал опосредованную Су1-С и АРР активацию каспазы в бесклеточных цитозольных экстрактах. Более определенно, в бесклеточной системе, апоциклин-А значительно увеличивал активацию каспазы, опосредованную низкой дозой цитохрома С и уменьшал эффекты, вызванные высокой дозой цитохрома С.

Более короткий 6-членный пептид р25 частично сохранил данную активность в бесклеточной системе, но не в целых клетках. Также продемонстрировано, что полученные из АРР пептиды проявили взаимный антагонизм в регулировании опосредованной Су1-С активации каспазы в клеточных экстрактах. Было показано, что 9-членный пептид апоциклин-А умеренно усиливал опосредованные низкой дозой Су1-С эффекты и значительно ингибировал активацию каспазы, инициированную высокими дозами экзогенного или эндогенного цитохрома С. Такие данные показывают, что полученный из АРР 9-членный пептид апоциклин-А является минимальной частью АРР, которая ответственна за специфическое связывание с неизвестными цитозольными молекулами, вовлеченными в передачу сигналов апоптоза. Описанная структура данного пептида и его искусственная природа подразумевает, что он может быть активным компонентом нового лекарственного средства, которое препятствует действию различных апоптотических факторов ίπ νίΐΐΌ и ίπ νίνο. Применение данного пептида охватывает предотвращение апоптоза в культивируемых клетках, способы предотвращения иммунологического отторжения аллогенных трансплантатов и аутоиммунных реакций, способы, позволяющие избежать гепатологического септического шока, и апоптоз, вызванный терапией цитокинами и т.д.

Сокращения для аминокислот, используемые здесь, приведены в следующей таблице.

А1а	А	Аланин
Азр	ϋ	Аспарагиновая кислота
С1и	Е	Глутамин
Агд	В	Аргинин
Суз	С	Цистеин
Уа1	V	Валин
Ьеи	Ь	Лейцин
С1у	С	Глицин
Хаа	X	Любая аминокислота

Для того чтобы обнаружить минимальную часть молекулы АРР, которая ответственна за апоптоз, сигнальные пептиды, содержащие от 6 до 10 остатков, были получены посредством твердофазной химии Р-МОС. Также синтезировали подобные пептиды, соответствующие гомологичной последовательности альбумина сыворотки человека (Н8А). Для всех пептидов оценивали их регулирующую рост активность в целых клетках в культуре и также проверяли их способность непосредственно влиять на активацию каспазы в бесклеточных цитозольных экстрактах. Дополнительно пептиды оценивали на их способность

- 4 010058 модулировать апоптоз, вызванный ЛЕР и цитотоксическими МаЬ СН-11 против Еа§ в целых клетках, и также влиять на вызванную Су1-С активацию каспазы в бесклеточной системе. Искусственный цикличный пептид *ССЕСЭУБПС* (звездочки обозначают возможную дисульфидную связь), содержащий мотив Агд-С1у-А§р (ΚΟΌ), соответствующий последовательности 251-259 α-фетопротеина человека (АЕР), гомологичный цикличный пептид с заменой Су§₂₅₂ на С1у *ССЕСЭУБПС* и линейный пептид К.СПУБП, соответствующий остаткам 253-258, были получены посредством твердофазной химии Е-МОС. Гомологичные цикличные пептиды из последовательности альбумина сыворотки человека *ССНСПББЕС*, *ССНСПББЕС* и линейный пептид НСЭББЕ также синтезировали и использовали в качестве функциональных контролей. Необходимо признать, что пептиды, содержащие только последовательность РСЭ. значительно отличаются от пептидов по настоящему изобретению.

Мультимерный цикличный пептид, содержащий ΚΟΌ, из АЕР *ССЕСОУБПС* (здесь апоциклинА) способен остановить апоптоз в клетках опухоли ίη νίΐτο. Было продемонстрировано, что апоциклин-А полностью останавливал вызванный АЕР апоптоз в клетках миелобластомы человека И937 и значительно ингибировал опосредованную антителами против Еа§ гибель клетки. Кроме того, была оценена способность полученных из АЕР пептидов апоциклина-А и линейного 6-членного пептида ЕСОУБП влиять на активацию каспазы, вызванную Су1-С и АЕР в бесклеточной системе. Было обнаружено, что апоциклин-А заметно увеличивал дАТФ-зависимую активацию каспазы, вызванную низкими дозами эндогенного или экзогенного Су1-С, и фактически полностью останавливал активацию каспазы, вызванную высокими апоптотически активными дозами Су1-С. Также продемонстрировали, что апоциклин-А останавливал вызванную АЕР активацию каспазы-3, зависимую от Су1-С/дАТФ, в бесклеточных цитозольных экстрактах клеток НерС2. Линейный, полученный из АЕР 6-членный пептид ЕСОУБП не показал никакой регулирующей апоптоз активности в целых клетках, но был способен останавливать опосредованную Су1-С/АЕР активацию каспазы в бесклеточной системе.

Хорошо известным и обычно используемым подходом для того, чтобы заблокировать определенные функциональные участки биологически активных белков, таких как рецепторы, является использование соответствующих блокирующих антител против них. Такие антитела создают на своих ЕаЬ-фрагментах структуры, которые точно соответствуют рецепторному участку. С другой стороны, можно создать антиидиотипические антитела, чтобы они соответствовали первичным ЕаЬ-фрагментам. Следовательно, антиидиотипическое антитело имеет сходство с активным центром рецептора. Согласно настоящему изобретению АЕР и альбумин содержат специальный активный участок, который соответствует рецепторам, инициирующим цикл гибели клетки, и блокирует их. Следовательно, определенная часть АЕР/альбумина, обнаруженного в настоящем изобретении, имеет структуру, блокирующую участок инициации. Следовательно, антиидиотипическое антитело против активного участка АЕР и/или альбумина содержит значительную структурную информацию о молекуле, способной заблокировать рецептор гибели клетки. Такую 3-Ό структуру можно выявить обычной рентгеновской кристаллографией и/или молекулярным компьютерным моделированием по данным о последовательности.

Основная суть настоящего изобретения заключается в том, что был обнаружен апоптотически активный участок в двух важных и присутствующих в большом количестве белках млекопитающих, т.е. в АЕР и альбумине. На основе данных результатов был разработан ряд молекулярных структур для блокирования инициирующего гибель клеток рецептора в клетках млекопитающих. Исследуемые молекулы представляли собой пептиды для облегчения их синтеза, но понятно, что можно создать другие молекулы, основанные на синтетических или природных соединениях. Одинаково хорошо можно конструировать молекулярные структуры на основе других, особенно на неиммунногенных, молекулах-носителях.

Главным практическим результатом настоящего изобретения является цикличный пептид из АЕР, *ССЕСЭУЕПС* (апоциклин-А), который содержит два функциональных активных участка: ЕСЭ и ΌνΕΌ. Обе последовательности непосредственно вовлечены в регуляцию активности каспазы и апоптоз. Содержащие ЕСЭ белки или пептиды, как известно, вовлечены во взаимодействие с молекулами интегринов и могут использоваться для ингибирования внутриклеточных контактов, влияя таким образом на пролиферацию клеток и апоптоз. Апоциклин-А отличается от других содержащих ЕСЭ пептидов мультимерным представлением данного участка в циклической форме. Это позволяет увеличить общий эффект при мультимерном представлении последовательности ЕСЭ.

Последовательность ЭУБП расположена в апоциклине-А сразу же после ЕСЭ и представляет собой хорошо известный участок расщепления для каспазы-3, -7 и -2. Следовательно, она имеет структуру, типичную для субстратов каспаз, ΌΧΧΌ (Сагаа-СаКо М., е1 а1. (1998), 1. Βίο1. Сйет. 32608-13). В апоциклине-А данный участок может связываться с активным центром каспазы-3 в качестве пептидного субстрата. Похожую активность можно также приписать полной молекуле АЕР, но для этого будут необходимы конформационные изменения, позволяющие открыть для контакта соответствующий участок для проявления модулирующей апоптоз активности (5>етепкота е1 а1. (2003), Еиг. 1. Вюсйет. 270, 276-282).

Способность апоциклина-А ингибировать активность каспазы-3 в бесклеточной системе можно объяснить наличием подобной субстрату аминокислотной последовательности, которая способна связаться и заблокировать активные центры соответствующих каспаз. Кроме того, участок ЭУБЭ апоциклина-А мог бы избирательно способствовать высвобождению каспазы-3 из апоптосомного комплекса,

- 5 010058 нарушая взаимодействие между ΧΙΑΡ и процессированной каспазой-3 на подобие типичного тетрапептидного ингибитора каспазы-3 ЭЕМО-сИо (Вга!!оп, 8.В., е! а1. (2001), ЕМВО 1. 5, 998).

Уникальная природа апоциклина-Α заключается в его цикличной структуре, которая позволяет осуществить мультимерное представление последовательности субстрата и увеличивает общий эффект посредством одновременного взаимодействия с различными молекулами, вовлеченными в передачу сигнала апоптоза.

Далее изобретение проиллюстрировано ниже неограничивающими примерами.

Пример 1. Синтез пептидов.

Пептиды синтезировали на синтезаторе Мобе1 43 0Α; Аррйеб Вюзуз!ешз, Еоз1ег Сйу, СА, И8А согласно обычным способам пептидного синтеза. Цикличные пептиды сначала получали самопроизвольным образом из линейных пептидов в водных растворах, подвергаемых воздействию атмосферного кислорода, и очищали из раствора при помощи ВЭЖХ по общепринятой процедуре, используемой для пептидов.

1. Цикличный мультимерный 9-членный пептид, соответствующий аминокислотной последовательности 251-259 ΑΕΡ человека *Суз-*Суз-Аг§-П1у-Азр-Уа1-Ееи-Азр-Суз*, *ССКСЭУЕПС* (звездочки обозначают возможную дисульфидную связь), который будет обозначаться здесь как апоциклин-А. Второй цистеин Суз252 способен к образованию 8-8 связи между двумя соседними цикличными мономерными пептидами. Молекулярная масса мономерного цикличного пептида составляла 983 Да. Пептид апоциклин-А состоит из двух или более (менее чем 5) кольцеподобных 9-членных пептидных структур, соответствующих последовательности *Суз-*Суз-Аг§-П1у-Азр-Уа1-Ееи-Азр-Суз*

ССНООЬЬЕС (__8_ &

2. Цикличный мономерный пептид *Суз-П1у-Аг§-П1у-Азр-Уа1-Ееи-Азр-Суз* (звездочки обозначают возможную дисульфидную связь), соответствующий аминокислотной последовательности 251-259 ΑΕΡ человека с одной аминокислотной заменой Суз252 на С1у для того, чтобы избежать мультимеризации пептидов при образовании 8-8 связей между мономерами. Молекулярная масса мономерного цикличного 9-членного пептида составляла 937 Да.

3. Линейный пептид из ΑΕΡ, соответствующий последовательности 253-259, Аг§-П1у-Азр-Уа1-ЕеиАзр (253-259). Молекулярная масса мономерного пептида составляла 674 Да.

4. Цикличный пептид из Н8А (альбумина сыворотки человека) *Суз-Суз-Н1з-П1у-Азр-Ееи-Ееи-П1иСуз*, *ССНСПЕЕЕС* (М. м.: 992);

5. Цикличный пептид из Н8А *Суз-П1у-Н1з-П1у-Азр-Ееи-Ееи-П1и-Суз*, ССИСЭкЕЕС (М. м.: 946). В данном пептиде Суз252 заменен на С1у.

6. Линейный пептид р26 из Н8А: Н1з-П1у-Азр-Ееи-Ееи-П1и, ИСЭДЕЕ (М. м.: 683).

Реагенты.

Флуорогенные пептидные субстраты ЭЕУП-АМС и БЕНО-АЕС получали из А1ех13 Вюсйеш1са1з (8ап О1ецо, И8А). Цитохром С сердца быка (Су1-С), аденилнуклеотидтрифосфат (дАТФ) и другие реактивы получали из 81§ша Сйеш1са1 Со. АЕР человека выделяли из пуповинной сыворотки, используя ионообменную, аффинную хроматографию и хроматографию гель-фильтрацией, как описано у ОиФсй е! а1. (1999), Вюсйеш1з1гу, 38: 10406-10414. Чистоту АЕР устанавливали посредством РАПЕ и Коске!электрофореза с использованием моноспецифичных антител против АЕР человека и зрелых белков сыворотки и было показано, что она составляла не менее 99,8%.

Приготовление бесклеточного экстракта.

Клетки гепатокарциномы человека НерС2 и клеточную линию монобластомы человека И937 получали из американской коллекции типовых культур. Клеточные экстракты готовили, лизируя клетки в гипотоническом буфере для экстракции. Для того чтобы получить цитозольную фракцию 8-100, клеточный лизат центрифугировали в течение 1 ч при 100000хд. Экстракты либо использовали сразу же, либо замораживали при -70°С для использования позднее.

Бесклеточные реакции.

Бесклеточные реакции, как правило, проводили в реакционных объемах 13 мкл. Апоптоз вызывали введением различных доз цитохрома С из сердца быка и/или очищенного АЕР человека в присутствии 1 мМ дАТФ. Для реакций емкостью 13 мкл, 10 мкл экстракта клеток (~2-4 мг/мл, как определили анализом по Брэдфорду) дополняли 1 мкл дАТФ, 1 мкл Су!-С и/или раствором АЕР в реакционном буфере для того, чтобы получить необходимую конечную концентрацию реагентов. Для оценки активности пептидов различные дозы пептидов, растворенных в реакционном буфере вместе с 1 мМ дАТФ, добавляли к клеточному экстракту. Для того чтобы определить способность пептидов модулировать апоптотические эффекты Су!-С и АЕР, пептиды добавляли к экстракту за 10 мин до добавления цитохрома С или АЕР. Контрольные образцы инкубировали с равным объемом буфера (3 мкл) без добавления реагентов. Для

- 6 010058 того чтобы инициировать апоптоз, экстракты инкубировали при 37°С в течение 40 мин.

Определение активности каспазы.

В конце реакции активации каспазы аликвоты экстракта (5 мкл) дополняли флуорогенным субстратом ΌΕνθ-АМС (3 мМ) и затем инкубировали в течение определенных интервалов времени (0,5-1 ч) при 37°С. Реакции прекращали разбавлением, добавляя 2,0 мл охлажденного на льду 0,2 мМ натрийфосфатного буфера, рН 7,5, за которым следовало измерение флуоресценции на флуориметре Регкт Е1тег МРР-44А (/_ехс=365 нм и /__ет=440 нм). Интенсивность флуоресценции для каждого образца нормализовали по отношению к концентрации цитозольных белков. Активацию каспазы представляли как отношение нормализованной интенсивности флуоресценции образца к соответствующему значению, измеренному с контрольным образцом.

Индукция апоптоза.

Клетки И937, 4х10³ клеток/лунку, помещали в плоскодонный 96-луночный планшет (Сок1аг) в полной среде и инкубировали в течение 2 ч перед добавлением реагентов. Затем клетки обрабатывали в течение 24 ч различными дозами АВР, растворенного в РВ8, и затем оценивали пролиферацию. Обработку клеток цитотоксическими антителами 1дМ СН-11 против Рак проводили, как описано ранее. Клетки И937 обрабатывали антителами СН-11 в концентрации 50 нг/мл в течение 18 ч. Клетки оставляли без обработки или обрабатывали реагентами в течение соответствующих интервалов времени и в течение последних 4 ч культивирования подвергали их воздействию [³Н]-тимидина (1 Ки/ммоль/лунку). Экспериментальные данные выражали как процент включения [³Н]-тимидина в культурах клеток в трех повторах относительно контроля среды. В качестве контроля были взяты клетки, культивированные без дополнений.

Анализ активности пептидов.

Для анализа регулирующей рост активности пептидов, различные дозы пептидов добавляли к клеткам в течение 24 ч, и затем анализировали пролиферацию клеток, жизнеспособность клеток и фрагментацию ДНК. Для того чтобы определить способность пептидов модулировать апоптоз, вызванный другими факторами, клетки 1шка1 обрабатывали антителами СН-11 в концентрации 20 нг/мл без Ас1Э. клетки Кар обрабатывали СН-11 в присутствии 0,5 мкг/мл Ас1Э в течение 18 ч. Для индукции апоптоза ΤΝΡ-α клетки (1шка1, МСР7 или И937) обрабатывали в течение 24 ч цитокинами в концентрации 25 нг/мл и затем анализировали пролиферацию или жизнеспособность, как описано выше. Клетки НерО2 предварительно отмывали перед добавлением ΤΝΡ свежеприготовленной средой для того, чтобы удалить эндогенные факторы роста.

Пример 2. Идентификация специфичного для каспазы-3 содержащего ΚΟΌ активного участка АРР человека, ответственного за передачу сигнала апоптоза.

Для того чтобы определить функционально важные аминокислоты в молекуле АРР, авторы изобретения определили аминокислотную гомологию последовательности АРР человека и каспазы-3 и -1 и сконструировали структуру пептидного аналога предполагаемого активного участка. Изучали наложение следующих последовательностей:

сазр-2 ОЫКРКМЕТЮАСКЙРЕТРКОТ ♦ · · · · сазр-1 КРКРКУ11ЮАСКСР5 РСУУИ сазр-3 ТВКРКЬПЮАСВСТЕЪРСС!

НиАЕР УЬРУАЕУНЕНССКСТУЪРС10Р5ЕК1М5Г1С300РТЬ5ЫК1ТЕССКЬТТЕЕК60С11НАЕ 299 * · *’···· * ··· ·····«**: ··· ·· ·

Н5А УТРЬТКУНТЕССНСРЬЪЕСАРРНАРЬАКУ1СЕМ0Р5133КЬКЕССЕКРЬЪЕКЗНС1АЕУЕ 294

Из сравнения наложения последовательностей видно, что АРР имеет определенную гомологию с ферментативным активным центром каспазы 1 и 3. Ферментативно активные участки каспазы 1 и 2 содержат мотив ΚΟΌ, который расположен перед каталитически активным остатком Сук. Эффекторные каспазы 3 и 7 имеют в данном месте мотив КОТ, но положение остатков Сук полностью совпадает в молекуле АРР и в сакр-3 и сакр-7. Принимая во внимание, что АРР имеет межцепочечную дисульфидную связь между Сук₂₅₂ и Сук₂₅₉ (Моппада, е1. а1. (1983), Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А, 80: 4604-4608), авторы изобретения предложили гипотезу о расположении подобного каспазе активного участка молекулы АРР где-то между остатками Сук₂₅1-Сук₂₅₉. Необходимо отметить, что сакр-3, -7 и -8 также имеют мотивы КОИ, но они расположены в других каталитически активных положениях (Вик1еу, е1 а1. (1999), №1иге, 397: 534-539). Свободный цистеин Суы₂₅₈ в составе структуры пептида несомненно мог бы образовать межцепочечные дисульфидные связи между двумя соседними пептидами (фиг. 1). Для того чтобы доказать наличие функционально важных аминокислот в петле Сук₂₅₁-Сук₂₅₉ в молекуле АРР, авторы изобретения сконструировали структуру пептидного аналога предполагаемого активного участка. В качестве контроля также синтезировали гомологичные пептиды из Н8А.

- 7 010058

Пример 3. Цикличный пептид из ЛЕР апоциклин-А останавливает вызванный АЕР апоптоз в клетках И937.

Ранее опубликованные данные демонстрируют, что АЕР различного происхождения (эмбриональный или полученный из среды культивирования клеточной линии гепатомы НсрС2) может вызывать зависимое от дозы подавление роста и программируемую гибель клеток в различных опухолевых клеточных линиях, характеризующуюся классическими признаками апоптоза, такими как значительное подавление роста, цитотоксичность и фрагментация ДНК (ЭшПсй е! а1. (1999), 1. Еиг. Вюсйет. 266, 750-761). Для того чтобы определить возможное расположение активного участка в молекуле АЕР, который ответственнен за передачу сигнала апоптоза, авторы изобретения проверили способность различных пептидов, полученных из АЕР, блокировать данный эффект. На фиг. 2 демонстрируется, что полученный из АЕР пептид апоциклин-А полностью останавливает вызванный АЕР апоптоз в клетках И-937. Более того, предварительная обработка в течение 15 мин клеток И-937 апоциклином-А (1 мМ) вызывала 15% стимуляцию пролиферации относительно контроля среды. Это означает, что апоциклин-А также останавливает самопроизвольный апоптоз клеток во время 24-часового культивирования.

Пример 4. Апоциклин-А значительно ингибирует апоптоз, вызванный антителами против Еаз в клетках И-937.

Для проверки специфичности к АЕР, авторы изобретения проверили, может ли апоциклин-А влиять на апоптоз, вызванный другими факторами. Апоптоз в клетках И-937 вызывали различными дозами цитотоксических моноклональных антител 1дМ СН-11 против Еаз. На фиг. 3 продемонстрировано, что 0,5 мМ апоциклин-А значительно ингибирует опосредованный антителами против Еаз апоптоз, отменяя приблизительно 50% общего эффекта. Увеличение концентрации апоциклина-А до 1 мМ вызывало более значительное ингибирование вызванного антителами против Еаз апоптоза. Известно, что внутриклеточные пути метаболизма, вовлеченные в различные типы апоптоза, являются общими для большинства апоптотических факторов. Данные авторов изобретения указывают на то, что апоциклин-А нейтрализует действие зависимых от АЕР и Еаз метаболических путей передачи сигнала апоптоза, взаимодействуя с определенным рецептором, который вовлечен двумя факторами в передачу сигнала апоптоза.

Пример 5. Определение функционально важных аминокислот в активном участке молекулы АЕР.

a) Полученные из АЕР пептиды.

Цикличный пептид *СОКЮОУБПС* с заменой Суз₂₅₂ на О1у и 6-членный пептид ЕСЭУЕП сконструировали для того, чтобы определить функционально важные аминокислоты в последовательности функционально важного активного участка, который ответственен за передачу сигнала апоптоза. На фиг. 4 продемонстрировано влияние ЮбВОПУБИС* на апоптоз, опосредованный АЕР в клетках И-937. Данный пептид не отменяет опосредованную АЕР цитотоксичность. Точно такие же результаты получили для КСОУИИ (фиг. 4). Эти данные указывают на то, что Суз₂₅₂ является функционально важной аминокислотой, и его замена на О1у полностью аннулирует способность пептида взаимодействовать с апоптотической активностью полной молекулы АЕР. Более короткий пептид ЕСОУБП также не способен регулировать опосредованный АЕР апоптоз, показывая необходимость цикличной структуры для образования апоптотического активного участка.

b) Полученные из Н8А пептиды.

Альбумин, как известно, имеет достоверную гомологию с АЕР (Мопиада, е! а1. Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 80: 4604-4608). Также была обнаружена гомология в области предполагаемого активного участка, который моделировали пептидом апоциклином-А. Авторы изобретения сконструировали следующие пептиды из последовательности Н8А: цикличные пептиды *ССНОИББЕС*, *СОНОИББЕС* (с единичной заменой Суз на О1у) и линейный 6-членный пептид НООББЕ. Авторы изобретения также проверили способность данных пептидов влиять на вызванный АЕР апоптоз в целых клетках подобно тому, как описано выше (табл. 1). На фиг. 5 продемонстрировано, что *ССНОИББЕС* имеет схожую с апоциклином-А активность останавливать опосредованный АЕР апоптоз в клетках И-937. НОИББЕ и *СОНОИББЕС* не влияли на ответ клеток на АЕР.

- 8 010058

Таблица 1

Влияние полученных из АРР и Н8А пептидов на рост клеток и вызванный АРР апоптоз в клетках И-937

Происхож- дение	Последова- тельность	¹¹ Влияние на рост клеток (% от контроля)	Способность влиять на апоптоз, вызванный АЕР
АЕР	ССРСШУЬОС	+ 12	Полная остановка
(апоцикли
н-А)
АЕР	СОКССУЬОС	-12	Отсутствие эффекта
АГР	КСОУЬЭ	+ 10	Отсутствие эффекта
НЗА	ССНООЬЬЕС	+ 18	Полная остановка
НЗА	НСЭЬЬЕ	+20	Отсутствие эффекта

* Цикличные пептиды.

^Непосредственное влияние петпида при дозе 1 мМ на пролиферацию клеток и-937 (в %) от контроля без добавок.

Пример 6. Апоциклин-А действует совместно с низкими субоптимальными дозами эндогенного цитохрома С для того, чтобы вызвать активацию каспазы в бесклеточной системе.

Для того чтобы определить может ли апоциклин-А действовать подобно целой молекуле АРР для обеспечения активации каспазы в бесклеточной системе, авторы изобретения создали такую же бесклеточную систему, как описано выше, но вместо АРР использовали цикличный пептид апоциклин-А. На фиг. 8 продемонстрировано, что апоциклин-А синергично увеличивает общую активность каспазы-3 в бесклеточной системе в присутствии низких субоптимальных доз эндогенного цитохрома С и дАТФ. Без добавления дАТФ апоциклин-А был не способен вызывать протеолитическую активность в отношении ЭРУЭ в тех же самых экспериментальных условиях. Такой же эффект наблюдали для полной молекулы АРР в молчащих бесклеточных экстрактах. Эти данные показывают, что авторам изобретения удалось идентифицировать активные участки АРР и альбумина, ответственные за их стимулирующую апоптоз активность.

Пример 7. АРР действует синергично с низкими субоптимальными дозами цитохрома С и дАТФ при активации каспазы-3 в цитозольных клеточных экстрактах.

Авторы изобретения далее проверяли способность АРР вызывать активацию каспазы в бесклеточной системе. Добавление АРР в цитозольный экстракт 8-100 инициировало зависимую от дАТФ индукцию специфичной для каспазы-3 протеолитической активности в отношении ΏΕνϋ, которая постепенно увеличивалась в течение по крайней мере 2 ч (фиг. 7А). В качестве контроля равное количество альбумина сыворотки человека (Н8А) добавляли в такую же бесклеточную систему и показали отсутствие его влияния на уровень ΠΕνϋ-протеолизной активности. Низкая степень ΠΕνϋ-протеолизной активности также была вызвана одним дАТФ и происходила, очевидно, вследствие наличия небольшого количества эндогенного СуЕС в препаратах. При отсутствии дАТФ АРР совсем не вызывает никакой активации каспазы. Для того чтобы определить, может ли АРР непосредственно вызывать активацию каспазы в цитозольных экстрактах клеток или для этого необходимо присутствие низкого уровня СуЕС, авторы изобретения исследовали ΠΕνϋ-протеолизную активность после добавления экзогенного СуЕС в молчащий цитозольный экстракт с неподдающимся определению уровнем эндогенного цитохрома С. На фиг. 7В показано, что никакой ΠΕνϋ-протеолизной активности не выявлено в данном типе цитозольного лизата после 2 ч обработки в присутствии дАТФ и низкой субоптимальной дозы СуЕС. Тем не менее, добавление АРР (7 мкМ) в эту же самую реакционную систему инициировало процесс активации каспазы, которая постепенно увеличивалась зависимым от времени образом (фиг. 7В).

Пример 8. Отмена апоциклином-А опосредованной СуЕС/АРР активации каспазы в бесклеточной системе.

На фиг. 8 показано, что эффекты апоциклина-А на активацию каспазы-3 опосредованы различными дозами цитохрома С и АРР. Высокая доза пептида (750 мкМ) значительно (50-70%) ингибировала активацию каспазы, вызванной высокими дозами эндогенного цитохрома С (фиг. 8А). Комбинированная обработка цитозольной фракции цитохромом С/АРР приводила к значительному повышению общей ΠΕνϋ-протеолизной активности (фиг. 8А и В). Добавление апоциклина-А ингибировало опосредованную СуЕС/АРР активацию каспазы на 60-80%. Эти данные указывают на то, что апоциклин-А действует в бесклеточной системе обратным образом по сравнению с целой молекулой АРР, отменяя общий эффект активации каспазы, вызванный одним только СуЕС или в комбинации с АРР. Следовательно, апоциклин-А представляет собой последовательность молекулы АРР, которая ответственна за его апоптотическую активность и за взаимодействие с членами апоптосомного комплекса.

- 9 010058

Пример 9. Влияние полученных из АРР и полученных из Н8А пептидов на от дАТФ-зависимую опосредованную Су!-С активацию каспазы в бесклеточных цитозольных экстрактах.

Для того чтобы проверить способность различных пептидов влиять на активацию каспазы, вызванную экзогенным цитохромом-С в бесклеточной системе, авторы изобретения использовали цитозольные клеточные экстракты клеток НерС2. Аликвоты клеточных экстрактов предварительно обрабатывали пептидами в концентрации 750 мкМ в течение 15 мин и после этого вводили в реакционную смесь различные дозы цитохрома-С, чтобы вызвать активацию каспазы. Экстракты для контроля инкубировали с дАТФ без пептидов и цитохрома-С, но они не проявляли никакой каспазной активности. На фиг. 9 А видно, что пептиды из АРР, 9-членный пептид апоциклин-А и 6-членный пептид Κ(.ιΙ)νΐ.[), а также и 6-членный пептид из Н8А, I Ι(.ιΙ)Ι.Ι.Ε, вызывали значительное ингибирование опосредованной высокими дозами цитохрома-С активации каспазы. С другой стороны, цикличный мономерный 9-членный пептид с единичной аминокислотной заменой *(''(.ιΚ(.ι[)νΐ,[)('’*, а также и цикличный мультимерный пептид из Н8А *СС1 КЮЕЕЕС*, не показали никакой ингибирующей апоптоз активности ни в целых клетках, ни в бесклеточной системе. Следовательно, самый эффективный пептид апоциклин-А действительно воспроизводит активный участок АРР, который ответственен за передачу сигналов апоптоза. Определенно отличающийся эффект получили для активации каспазы, вызванной низкой дозой цитохрома С. На фиг. 9В показано, что апоциклин-А приводит к такой же стимуляции, как и полноразмерная молекула АРР, при вызванной низкой дозой цитохрома С активации каспазы. Пептиды *С(ЖЮ\^;1.[)С* и *СС1 КЮЕЕЕС* не влияли на активность при низкой дозе цитохрома С, но пептиды К(Ю\'1.1) и IКЮЕЕЕ демонстрировали значительную отмену вызванной цитохромом С активации каспазы.

В табл. 2 просуммированы экспериментальные данные, характеризующие активность пептидов в бесклеточных цитозольных экстрактах.

Таблица 2

Модуляция различными пептидами опосредованной Су!-С активности ΏΕνΏ-азы в бесклеточной системе

Последовательность

Влияние на

Способность

Влияние на вызванную влиять на вызванную высокой вызванную АРР низкой дозой дозой Суб-С зависимую от

Суб-С активацию

Суб-С активацию активацию каспазы каспазы каспазы

30% стимуляция

Отсутствие

НСЦШЕ

Целый АЕР *Цикличный пептид.

кта 'мена •мена твие

Отсутствие

Пример 10. Получение антиидиотипических антител против биологически активного участка АРР.

Для иммунизации, объединения клеток и получения асцитной жидкости использовали мышей ВАЬВ/С. Двадцать мышей иммунизировали эмульсией высоко очищенного АРР человека (40 мкг) в полном адъюванте Фрейнда. Мышей стимулировали с интервалом в 2 недели тем же самым количеством АРР, эмульгированного в неполном адъюванте Фрейнда. Мышей с самым высоким ответом против АРР человека отбирали и внутривенно вводили им в хвосты 80 мкг АРР в 100 мкл раствора АРР, содержащего 50 мкл неполного адъюванта Фрейнда. Через три дня готовили клетки селезенки и смешивали с клетками миеломы мыши N8-1, после чего следовала обработка РЕО в среде КС, содержащей РС8. Объединенные клетки выращивали в среде НАТ, содержащей РС8, после чего следовало культивирование в среде НТ. Гибридомы проверяли на их способность производить антитела при помощи анализа ТК-Р1А, вовлекая поликлональное антитело кролика в качестве иммобилизированного захватывающего антитела

- 10 010058 и меченное европием антитело против человека в качестве антитела для мониторинга (для технических деталей и реактивов, см. публикацию Реигауцоп, Н. апй Когре1а, Т. с1 а1. Сйп.Сйет. 1993, 39, р. 847-848). Среди клонов, продуцирующих антитела, клоны, которые не были чувствительны к введению пептида *ССЯСПУЬПС* и его циклических форм, отбрасывали. Клоны, показывающие хороший ответ, выращивали до достаточного количества для того, чтобы можно было ввести их мышам для получения асцитной жидкости. Подготавливали асцитную жидкость и выделяли из нее моноклональные антитела против ЛЕР. Очищенные антитела подвергали протеолизу для того, чтобы получить ЕаЬ-фрагменты из выбранных клонов общеизвестными способами (для знакомства с методиками см. статью Мигопе1х апй Когре1а,

1. СНгота1одг. 2003, 790, рр. 53-66). С ЕаЬ-фрагментами производили ту же процедуру, что и для АЕР, как описанно выше, для того чтобы получить моноспецифичные антитела против ЕаЬ-фрагментов. С данными антиидиотипическими антителами против активного участка АЕР проводили скрининг клонов на их чувствительность к пептидам активного участка АЕР.

Антиидиотипическое антитело против активного участка альбумина человека в положении по последовательности 246-254 можно было бы сделать, по существу, теми же самыми методиками, что и против АЕР, описанными выше.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Пептид, представляющий собой фрагмент белка, который распознается антиидиотипическим антителом против апоптотически активного участка α-фетопротеина человека, соответствующего аминокислотной последовательности 251-259 данного белка, или антиидиотипическим антителом против альбумина человека к последовательности 246-254 альбумина человека.
2. Пептид, соответствующий активному центру α-фетопротеина или альбумина человека, имеющий аминокислотную последовательность ΟΟΡΟΌνΕΌΟ,Χ,,Υ. или ССНОПЕЬЕС_пХ_т¥, в которой X обозначает любую гидрофобную аминокислоту и Υ обозначает любую гидрофильную аминокислоту, индекс п равен 0, 1, 2 или 3 и индекс т равен 0, 1, 2 или 3.
3. Пептид по п.2, где пептид дополнительно содержит на Ν-конце 0, 1, 2 или 3 фланкирующих остатка цистеина и 0, 1, 2 или 3 фланкирующих остатка цистеина на С-конце.
4. Пептид по п.2, имеющий полимеризованную или цикличную структуру, где циклизование или полимеризация осуществляется посредством химического взаимодействия аминокислотных остатков цистеина или других аминокислотных остатков, способных образовывать межмолекулярные сшивки.
5. Пептид по любому из пп.2-4, отличающийся одновременным наличием последовательностей ΚΟΌ и ΌΧΧΌ в одной и той же молекуле, в которой X обозначает любой гидрофобный аминокислотный остаток и К, О и Ό обозначают Агд, О1у и Акр соответственно.
6. Пептид по п.5, в котором Ό в последовательности ΚΟΌ является общим с последовательностью ΌΧΧΌ.
7. Пептид по любому из пп.2-6, где любой из X обозначает независимо V, Ь или и Υ обозначает Ό, Е или О.
8. Пептид по п.2, включающий последовательность 0*0*ΚΟΌνΕΌΟ*, представленный в линейной, полимеризованной или цикличной форме, где аминокислотные остатки, отмеченные звездочкой, обозначают места образования возможных дисульфидных связей.
9. Пептид по п.2, включающий последовательность С*С*НОПЕЬЕС*, представленный в линейной, полимеризованной или цикличной форме, где аминокислотные остатки, отмеченные звездочкой, обозначают места образования возможных дисульфидных связей.
10. Применение пептида по любому из пп.1-9 для подавления апоптотических регуляторных метаболических путей в клетках животных и человека.
11. Применение пептида по любому из пп.1-9 для увеличения сохранности органов или клеток при их трансплантации.
12. Применение пептида по любому из пп.1-9 для предотвращения возникновения аутоиммунных нарушений и синдрома иммунодефицита, вызванного вирусной инфекцией.
13. Применение пептида по любому из пп.1-9 для снижения цитотоксических эффектов после химио- и лучевой терапии.
14. Применение пептида по любому из пп.1-9 для ингибирования апоптоза нейронных клеток, неспецифичного вызванного лекарственными средствами апоптоза или опосредованного окислительным стрессом апоптоза.
15. Применение пептида по любому из пп.1-9 для предотвращения апоптоза культивируемых клеток, в том числе стволовых клеток костного мозга, мезинхимальных стволовых клеток, эмбриональных стволовых клеток, получаемых для научных, медицинских или технических целей.
16. Косметическая композиция для омоложения кожи и профилактики старения кожи, содержащая пептид по любому из пп.1-9, приемлемые в косметологии носители и наполнители и, необязательно, производные витаминов А, Е, Д, антиоксиданты, стероидные гормоны, изофлавиноиды растительного происхождения.

- 11 010058
17. Применение косметической композиции по п.16 для омоложения кожи и профилактики старения кожи, в том числе вызванного ультрафиолетовым облучением и профилактики солнечной радиации, путем нанесения указанной композиции на кожу индивидуума.
18. Антиидиотипическое антитело или фрагмент антиидиотипического антитела, имеющий паратоп с молекулярной структурой, обеспечивающей распознавание апоптотически активного участка α-фетопротеина человека или альбумина сыворотки человека, состоящего из аминокислотных остатков 251-259 последовательности α-фетопротеина или аминокислотных остатков 246-254 альбумина.
19. Пептид, имеющий эпитоп или участок связывания с антителами или их фрагментами, определенными в п.18.
20. Белок, содержащий в своей структуре аминокислотную последовательность пептида, определенного в п.19.